CN113354802B - 聚羟基脂肪酸酯的高纯度提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从菌体中提取聚羟基脂肪酸酯的方法，具体的，将来源于细菌发酵获得的聚羟基脂肪酸酯PHA，通过优化破壁条件(温度、pH、菌液浓度、破壁助剂及保护剂等)进行高效破壁，并进行酶解实现PHA的高回收率和高纯度提取。用该方法获得的多种PHA产品回收率达96％以上，纯度达95％以上，分子量达到初始分子量的30％以上。

Description

聚羟基脂肪酸酯的高纯度提取方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术及生物化工技术领域，具体涉及一种聚羟基脂肪酸酯(PHA)的高纯度提取方法，包括高效破壁技术及高纯度酶解的提取工艺。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯作为一种可降解的生物新材料，在医药、化工、农业、日用等领域具有广阔的应用前景。可用于开发医用器械、医用微球、手术缝合线、补片、一次性包装材料、纺织纤维等，由于其优异的生物可降解性与生物相容性，是公认最具潜力的绿色环保型高分子材料。

尽管聚羟基脂肪酸酯在应用方面有诸多优势，且经过代谢工程改造，细菌可合成占细胞干重高达70％以上的PHA，但因为下游分离提取工艺复杂、对分子量破坏大，极大影响了材料的使用和推广。

目前已有的PHA提取方法包括有机提取法和水相提取法两大类。有机提取法常用的试剂包括氯仿(例如参考文献：PHA的提取及其复合中药多糖的免疫作用初探[D]，侯玉芳，东北农业大学硕士论文，2009)、碳酸二甲酯和正丁醇(例如参考文献：Optimization ofGreen Extraction and Purification of PHA Produced by Mixed Microbial Culturesfrom Sludge，Guilherme A，et al，Water，2020)、环己酮和γ-丁内酯(例如参考文献：Biomass Extraction Using Non-Chlorinated Solvents for BiocompatibilityImprovement of Polyhydroxyalkanoates，Guozhan Jiang，et al，Polymers，2018)，尽管有机提取法提取纯度高，且对PHA分子量破坏较小，但因其高昂的成本和对环境的高破坏性不利于产业化应用。目前研究较多的为水相提取法，其重点在于提高产品的纯度。如利用高温、高压、高pH等极端的理化条件使富含PHA的细胞破裂，再利用大量清水多次洗涤获得较高纯度的产品(例如参考文献：聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯的发酵和提取工艺改进[D]，张晓军，汕头大学硕士论文，2011)。这种极端条件不仅消耗很多能源和化学试剂(SDS、EDTA、NaClO)，并产生大量的洗涤废水(超过放罐体积的5倍)，且对设备的要求较高(例如参考文献：极端嗜盐菌XMQ19菌株发酵生产聚羟基烷酸酯(PHA)的提取工艺研究[D]，陈柳清，华中农业大学硕士论文，2008以及参考文献：圆褐固氮菌G-3菌株聚羟基烷酸(PHA)的提取研究[D]，彭菊芳，西北大学硕士论文，2001)。此外获得的PHA由于在极端条件下发生降解，其分子量损失严重难以满足应用市场的要求。

进一步的，专利文献CN109504715A公开了一种制备聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法，包括发酵液固液分离后洗涤，然后破壁。该方法虽然提取工艺简单，但是依然需要加入阴离子表面活性剂。

专利文献CN111019108B公开了一种提取并纯化聚羟基脂肪酸酯的方法，包括采用过热水进行破壁，但是由于在极端条件下发生降解，其分子量损失严重难以满足应用市场的要求。

发明内容

为解决上述技术问题，本申请提供了一种聚羟基脂肪酸酯(PHA)的高纯度提取方法，包括高效破壁技术及高纯度酶解的提取工艺，其不加入任何有机溶剂、条件温和、成本低、污染小，获得的产品纯度、回收率高，且分子量高适合下游市场更全面的应用，适合产业化生产，更重要的是提取过程中产生的洗涤废水少，减轻固液分离的压力并降低化工试剂的使用(如强酸、强碱及有机试剂)，实现绿色生产。

本发明的第一方面，提供了一种从菌体中提取聚羟基脂肪酸酯的方法，包括从发酵液中分离获得菌体，将菌体重悬于水中获得细胞液，加入山梨醇进行破壁，获得破壁裂解液，向破壁裂解液中加入酶进行酶解，获得酶解液，对酶解液进行固液分离获得聚羟基脂肪酸酯。

优选的，所述的方法包括按照体积比0.1-1％向细胞液中加入山梨醇。

在本发明的一个具体实施方式中，按照体积比0.5％向细胞液中加入山梨醇。

优选的，所述的聚羟基脂肪酸酯选自单体为C3-C5的羟基脂肪酸的短链PHA、单体为C6-C18的羟基脂肪酸的中长链PHA、以及短链和中长链PHA共聚物。进一步优选的，所述的短链PHA为聚羟基丙酸酯、聚羟基丁酸酯PHB或聚羟基戊酸酯。

在本发明的一个具体实施方式中为3-羟基丁酸、4-羟基丁酸或者其组合。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的聚羟基脂肪酸酯包括聚3-羟基丁酸脂(PHB)、3-羟基丁酸和4-羟基丁酸二元共聚物(P34HB)和3-羟基丁酸和3-羟基己酸二元共聚物(PHBHHx)等多种PHA。

优选的，所述的菌体为可以产聚羟基脂肪酸酯的任何野生型菌或者工程改造菌种，包括但不限于嗜盐菌、盐单胞菌(优选Halomonassp.TD01)、兽气单胞菌(优选Aeromonasbestiarum)、卡巴耶罗氏菌株(Caballeroniasp.Y5702)、木质素降解细菌(Cupriavidusbasilensis)或巨大产碱杆菌DSM(Alcaligenes latus DSM)。

优选的，所述的酶选自蛋白酶、溶菌酶和/或核酸降解酶。

优选的，所述的蛋白酶可以是不同来源的中性蛋白酶、碱性蛋白酶或其它能起到相同水解作用的任意单一或复合蛋白酶。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的蛋白酶为碱性蛋白酶。

优选的，所述的溶菌酶可以是天然提取或微生物发酵获得的任意单一或复合溶菌酶。

优选的，所述的核酸降解酶可以是任意单一或复合的核酸降解酶或可降解核酸链的其它酶种。

优选的，所述的发酵液为将产PHA的菌体经摇瓶或不同规模的发酵罐进行分批式或连续发酵获得。其中发酵的条件根据不同的菌体而适当调整。

优选的，所述的从发酵液中分离可以采用离心(优选转子离心机、碟式离心机)或其他常规固液分离的方式例如过滤(优选板框)、絮凝等等。

优选的，重悬获得的细胞液中干细胞物质含量为1％-50％。

优选的，所述的调节pH可以采用NaOH、HCl、氨水等等，具体可以根据何种菌体生产聚羟基脂肪酸酯后的发酵液酸碱度调整使用的pH调节剂。

所述破壁的时间、破壁的温度以及破壁的pH的选择具体取决于PHA的含量。

优选的，破壁pH调节至5-11.5。进一步优选的，所述的破壁pH调节至5-9、8.5-11.5或8.5-10.5。

优选的，破壁的温度40℃～121℃。进一步优选的，破壁的温度为60-90℃。更进一步优选为60-85℃。

优选的，破壁的时间1min-48h。进一步优选的，所述的破壁的时间为10～200min。更进一步优选为50-120min。

优选的，在加入酶之前，首先调节破壁裂解液的pH及温度。

所述酶解的温度为10℃～90℃。优选的，所述酶解的温度为40-60℃，进一步优选为45-50℃。

所述酶解的时间为0.01-48h。优选的，所述酶解的时间为10-200min。进一步优选为50-120min。

优选的，按照质量比0.1％加入酶。

进行酶解时可以是任意顺序的多步单一酶解，不同酶解单元之间可以进行离心或不离心，也可以是多酶种的同步酶解或异步酶解，酶解过程中可以选择调整酶解液的理化条件(如底物浓度、温度、pH、激活剂或抑制剂等)来控制酶解程度及酶解终点。其中，所述的酶解步骤可以使其中的PHA与蛋白质、核酸、细胞壁碎片及其它杂质分开。

优选的，所述的加入酶之前还包括离心、洗涤的步骤，优选的，洗涤1-10次，进一步优选的，洗涤2-5次。

优选的，所述的对酶解液进行固液分离步骤包括一次或多次的固液分离、一次或多次的加水洗涤以及一次或多次的固液分离，获得的沉淀经干燥后即为聚羟基脂肪酸酯，其中，所述的干燥选自冷冻干燥、喷雾干燥、流化床、转鼓干燥或沸腾床。其中，所述的固液分离可以采用离心(优选转子离心机、碟式离心机)或其他常规固液分离的方式例如过滤(优选板框)、絮凝等等。所述的多次可以为2-15次，优选2-10次，进一步优选为2-5次。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法包括以下步骤：

A)从发酵液中分离获得菌体，将菌体重悬于水中获得细胞液，按照质量体积比0.1-1％(优选为0.5％)加入山梨醇，调节pH值为5-11.5(优选为10.5)，加热至60℃～90℃(优选为85℃)进行破壁10-200min(优选为120min)，获得破壁裂解液；

B)离心、洗涤1-10次；

C)向破壁裂解液中按照质量比0.1％加入酶进行酶解，获得酶解液，所述的酶选自蛋白酶、溶菌酶和/或核酸降解酶(优选为蛋白酶(进一步优选为碱性蛋白酶)、溶菌酶和核酸降解酶)，所述酶解的温度为40-60℃，所述酶解的时间为10-200min；

D)对酶解液进行一次或多次的固液分离、一次或多次的加水洗涤以及一次或多次的固液分离，获得的沉淀经干燥后即为聚羟基脂肪酸酯。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法包括如下步骤：

(1)用产PHA菌株在平板上活化3次后接种摇瓶或经过扩培后接种不同规模发酵罐(5L、10L、5T、20T、200T)，培养30～48h，即可获得OD₆₀₀约为350～550的发酵液；

(2)发酵液根据不同的发酵体积采用转子式离心机(8000×g～12000×g离心5～10min)、碟式离心机(4500×g～7000×g)、或板框过滤等不同形式进行固液分离1～5次，并添加水后洗涤浓缩，使OD₆₀₀达到600～1500即可，干物质含量约为100g/L～300g/L。不同的分离设备、方法及分离效率会影响洗涤废水的使用量，但不会对产品纯度及分子量产生影响；

(3)获得的细胞悬液添加0.1％～1％的提纯助剂(可利于细胞破壁并降低PHA分子降解)后升到相应温度(40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、121℃)，待温度稳定后调节pH至(7.0～12.0)恒温破壁10～120min，破壁温度、pH及时间可根据生产菌株及初始PHA浓度、能耗、设备要求及产品要求进行相应调整，pH调节使用NaOH溶液、磷酸或其它物质；

(4)获得的破壁溶液经自然冷却或物理冷却后，可直接添加适宜的复合酶(蛋白酶、溶菌酶和/或核酸降解酶)进行同步酶解，对于高纯度产品也可经过固液分离、加水重悬后添加酶进行同步或异步酶解。酶解的目的在于使蛋白质、细胞壁多糖等难溶杂质降解为多肽、寡糖或其它可溶性单体，从而在后续的分离、洗涤中实现与不溶于水的PHA分离目的。

(5)经过复合酶的处理后，除培养基本身存在的盐沉淀、尘土或难溶大分子色素等物质外，其它主要为大分子PHA及可溶性杂质，经过固液分离、加水洗涤、再固液分离等操作，即可获得高纯度的PHA原液。分离次数根据分离设备性能、发酵液杂质含量等因素确认，并直接决定洗涤水使用量，一般分离次数为2～6优选2～5次，一般洗涤液上清为透亮的淡黄色即可认为分离完成。

(6)获得的PHA原液经过浓缩(如三效浓缩)或直接干燥(流化床干燥、喷雾干燥、滚筒式干燥、冷冻干燥等)获得PHA成品，经气相色谱(GC)和凝胶色谱(GPC)检测PHA含量和分子量。

本发明的第二方面，提供了一种产聚羟基脂肪酸酯的菌体的高效破壁方法，所述的方法包括从发酵液中分离获得菌体，将菌体重悬于水中获得细胞液，加入山梨醇，进行破壁，获得破壁裂解液。

所述的高效破壁方法包括按照体积比0.1-1％向细胞液中加入山梨醇，优选按照体积比0.5％向细胞液中加入山梨醇。

所述破壁的pH值为5-11.5，优选为8.5-10.5。

所述破壁的温度为60-90℃，优选为60-85℃。

所述破壁的时间为10-200min，优选为50-120min。

该方法兼顾成本低、污染小且对分子量损伤较低的优势。

本发明的第三方面，提供了一种对破壁裂解液中PHA分离提取的方法，所述的方法包括对破壁裂解液进行离心、洗涤1-10次，加入酶进行酶解，获得酶解液；对酶解液进行一次或多次的固液分离、一次或多次的加水洗涤以及一次或多次的固液分离，获得的沉淀经干燥后即为聚羟基脂肪酸酯。

所述的酶选自蛋白酶、溶菌酶和/或核酸降解酶，其中，所述的蛋白酶为碱性蛋白酶。

优选的，按照质量比0.1％加入酶。

优选的，所述酶解的温度为40-60℃，进一步优选为45-50℃。

优选的，所述酶解的时间为10-200min，进一步优选为50-120min。

该方法将PHA与蛋白质、核酸、细胞壁碎片及其它杂质分开，为适应产业化需要，该方法具备低成本、高回收率及高纯度的优势。

本发明的第四方面，提供了一种上述的方法获得的聚羟基脂肪酸酯在制备可降解的生物新材料中的应用。优选在开发医用器械、医用微球、手术缝合线、补片、一次性包装材料或纺织纤维中的应用。

采用本发明所述的方法从菌体中提取PHA，回收率高(96％以上)、纯度高(95％及以上)、分子量高，满足工业化应用的需求。在破壁的过程中添加山梨醇作为保护剂后，利用较低的温度及pH即可实现产PHA菌株的高效破壁且分子量损失低于初始分子量的30％(PHA初始分子量在1kDa～5000kDa之间，经过本申请所述的方法进行提取后获得的PHA分子量最少可达到初始分子量的30％)；在整个提取的过程中，最优组合固液分离的次数不超过5次，不使用SDS等污染环境的化学试剂，操作简单，不需要高温高压，设备投入较低，实现了低成本、绿色生产以及适用于大宗PHA产品的工业化应用以及高纯度PHA的制备。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：GC检测P34HB样品色谱峰图，其中，P34HB即为3-羟基丁酸甲酯与4-羟基丁酸甲酯的和，苯甲酸甲酯为内标，γ丁内酯为外标。

图2：破壁温度对PHA分子量的影响。

图3：GPC测定分子量标准品峰图及标准曲线，其中，图3A为标准曲线，图3B为分子量结果。

图4：PHA成品分子量GPC峰图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

实施例中使用的多株产PHA菌株，均由本研究室筛选、改造及保藏，在摇瓶水平细胞中的PHA含量占细胞干重的80％左右。

实施例中使用的蛋白酶具体为碧云天的蛋白酶。

实施例中使用的溶菌酶具体为天根生化的溶菌酶。

实施例中使用的核酸降解酶具体为源叶生物的核酸降解酶。

实施例1

聚羟基脂肪酸酯含量测定(可参考文献Unsterile and continuous productionofpolyhydroxybutyrate by Halomonas TD01，Tan D，et al，Bioresource Technology，2011，102(17)：8130-8136)：

根据样品的不同单体成分，分别选用PHB及丁内酯等作为外标，并利用苯甲酸作为内标。标样及样品经过酸解形成单体，并与甲醇酯化生成相应的甲酯，之后利用气相色谱进行检测，如P34HB的含量3HB与4HB的含量总和(见附图1)。

GPC测定聚羟基脂肪酸酯分子量方法：

将不同分子量(20000Da～1800000Da)的聚苯乙烯为标准品，用三氯甲烷配制成浓度为1mg/mL的溶液，做标准曲线。流动相为色谱级三氯甲烷，流速为1mL/min，根据标准曲线计算样品分子量(可参考文献Engineering Pseudomonas entomophila for synthesis ofcopolymers with defined fractions of 3-hydroxybutyrate and medium-chain-length 3-hydroxyalkanoates[J]，Mengyi.Li，et al，Metabolic Engineering，2019，52：253-262)，标准曲线见附图3A，具体为Y＝-1.179097X+12.98911，其中，X为时间，Y为分子量(R²＝0.9964410，R＝0.9982189，离差为0.038)，分子量见附图3B，标准曲线中各点值见表1。

表1.标准曲线中各点值

标样	出峰时间(min)	分子量(Da)
			1	5.733	1800000
2	6.094	700000
			3	6.313	300000
4	6.610	150000
			5	6.895	70000
6	7.398	20000

实施例2固液分离方式及次数对PHA含量的影响

分别取嗜盐菌放罐发酵液200mL，进行8000rpm离心10min、清水洗涤不同次数处理，获得的菌体沉淀冷冻干燥48小时检测PHA含量。结果表明在破壁之前离心1次完全去除上清后，进行破壁效果最佳。而过多的洗涤次数虽然可以去除部分可溶性杂质小幅度提升产品纯度，但消耗大量的洗涤水，不利于工业化应用。

进一步通过模拟工业化碟式离心机，即取发酵液200mL，8000rpm离心10min后去除65％上清液，剩余部分混匀即为一次工业化离心。分别加入0.5％的提纯助剂山梨醇，pH9.5温度90℃处理120min。采用实施例1的测定方法和标准曲线进行聚羟基脂肪酸酯含量测定，实验结果表明(见表2)，碟式离心机离心两次的效果略优于实验室一次高速离心完全去除上清的效果。

表2.固液分离方式及次数对PHA含量的影响

实施例3破壁温度及时间对PHA含量的影响

选取同一批次放罐的发酵液在其它条件不变的前提下(洗涤3次、200g/L细胞浓度、破壁pH为10.0、处理时间为120min等)进行破壁，但设计不同的破壁温度，研究温度对PHA含量的影响。分子量检测结果表明，低于40℃时分子量不变，随着破壁温度继续升高PHA成品的分子量迅速下降(见附图2)。

对不同破壁温度样品的GC检测结果表明，在温度过高时，成品的PHA含量反而会下降，说明过高的温度会使蛋白质等杂质发生不可逆的变性沉淀，使得在后期的固液分离过程中反而难以通过常规方式去除。破壁时间与温度的结果类似，破壁温度较低时，时间越长破壁效果越好，但同时消耗的能源也较多，而适当的增高破壁温度可明显改善破壁效率从而有效缩短破壁时间，如在85℃时破壁时间120min具有最佳效果。

实施例4不同破壁pH对PHA含量的影响

生产PHA的常见菌株如嗜盐菌的最适生长pH为8.5左右，较高pH有利于避免杂菌污染。考虑到初始pH为碱性的发酵液调到酸性需使用大量的HCl，不易操作且危险性高，且腐蚀极易设备，因此本实验设计了不同的实验组考察不同pH(5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5)对PHA产品纯度的影响，破壁温度为85℃，时间为120min，细胞浓度200g/L。结果表明温度较低时偏中性的pH(5.0～8.0)对细胞破壁作用效果较弱，在8.5～11.5之间pH越高细胞的破壁效果越好。

但过高的pH会使得PHA分子量迅速衰减，且NaOH会与PHA单体羟基脂肪酸结合形成脂肪酸盐，这一过程会消耗大量的NaOH，且最终PHA成品中含有一定量的脂肪酸盐从而影响产品纯度。因此适宜的破壁pH应根据破壁温度和破壁时间及提纯助剂等综合应用。本专利通过实验获得的较优工艺(pH在5.0～9.0之间)NaOH使用量质量比不超过成品质量的0.1～1％，且分子量不低于初始分子量的30％。

实施例5不同提纯助剂及浓度对PHA含量的影响

目前工业上常使用SDS等表面活性剂作为提纯助剂，通过与细胞膜蛋白结合达到促进细胞裂解的效果。尽管其生物降解度>90％，但依然具有一定毒性和刺激性，且会产生大量泡沫，需要大量清水洗涤以避免成品中的过多残留。本专利优选了多种无毒且100％可降解的提纯助剂，其他提取条件为pH10.5，破壁温度为85℃，时间为120min，细胞浓度200g/L。并对其使用量进行优化，结果表明0.5％(v/v)山梨醇可完全替代等量的SDS发挥作用，且与SDS相比更有价格优势及更利于在污废水中降解。此外分子量的结果表明添加该助剂的实验组与对照组相比分子量高40％～60％之间(见附图4)。

实施例6不同单酶及酶解方式对PHA含量及分子量的影响

PHA在氯仿中可完全溶解，因此高纯度的PHA(如标准品或医用材料)，往往采用索氏提取法获得。大量有机试剂的使用不仅与绿色理念不符造成环境污染，且成本高昂，不适用于大宗PHA产品的获得。因此考虑到提取成本和工业化应用，利用酶法对PHA破壁液进行处理，不仅不会带来环境污染，且条件温和不会对PHA分子量造成过大破坏。

本实施例针对实施例4中最佳条件下获得的细胞破壁液的不同组分选择相应的酶进行单酶实验，筛选出可有效提高PHA纯度的三种单酶(蛋白酶、核酸降解酶、溶菌酶)，并进行复配酶解，酶解条件为45℃水解120min，实现PHA的高效提取。针对高纯度(PHA含量≥98％)产品，可对酶解工艺(同步/异步酶解/增加洗涤次数)及部分单酶使用量进行理性调节，可获得高纯度PHA。此外分子量测定结果显示本专利开发的酶种及酶解条件对PHA分子量的无明显影响(结果见表3)。

表3.复合酶浓度及酶解时间对不同PHA分子量的影响

实施例7破壁前不同细胞浓度对PHA含量的影响

产PHA菌株在发酵罐水平目前可达到培养48h菌OD₆₀₀＝450以上，发酵液干物质含量约在200g/L左右。经过3次的离心洗涤可以去除发酵液中大量的无机盐及胞外可溶性物质，干物质降到50～150g/L。在破壁过程中，细胞浓度越高，所占用的设备体积和固液分离设备(如碟式离心机)的负荷越低。考虑到过高的细胞浓度(干重≥250g/L，湿重≥500g/L)会影响细胞悬液的流动性和传质，本实验选择不同的细胞干物质浓度(25g/L、50g/L、100g/L、150g/L、200g/L、250g/L)，进行破壁和酶解提取实验，所述的破壁条件完全相同(85℃时破壁时间120min)，添加质量比0.1％的复合酶(蛋白酶、核酸降解酶、溶菌酶)45℃处理120min，仅在酶解过程中根据底物总量相应调整复合酶用量。结果表明用最优的破壁和提取工艺，破壁前为100～250g/L的细胞浓度经过提取后仍然可以获得纯度在95％以上的PHA成品，说明该提取方法具有良好的通用性，这一技术对于节省破壁后的洗涤用水具有重要意义。

实施例8破壁后不同洗涤次数对PHA含量的影响

以破壁前干物质浓度约为200g/L的细胞悬液进行优选的破壁实验(破壁时间120min)，并经室温自然冷却和酶解(添加质量比0.1％的复合酶(蛋白酶、核酸降解酶、溶菌酶)45℃处理120min)后，分别进行离心、洗涤1～5次，并设置多个实验组。每次离心后选取单个样品体系总体积的50％弃置，添加等体积的清水进行洗涤，获得的不同洗涤倍数样品冷冻干燥后，粉碎过40目筛检测PHA含量。结果表明在前三次洗涤中PHA含量提升最明显，分别提高7.2％、3.5％、2.5％，进一步增加1～3洗涤次数在不同实验组中仅能提高纯度约0.3～1.5％之内，且平行性较差。说明破壁、酶解后离心洗涤3次即可基本去除主要的可溶性杂质，提高幅度最高的实验组从破壁前的61.21％提高到94.79％，收率高达98.5％。

利于以上方法优化的提取工艺对不同产PHA菌株进行验证，最终获得的PHA含量为95％～99％，洗涤用水与PHA产量的比值为8～15：1。结果见表4。

表4.产PHA不同菌株的提取实验结果

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (13)

1.一种从菌体中提取聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，包括从发酵液中分离获得菌体，将菌体重悬于水中获得细胞液，按照体积比0.1-1％向细胞液中加入山梨醇进行破壁，破壁的温度为60-90℃，破壁的pH值为5-11.5，获得破壁裂解液，向破壁裂解液中加入酶进行酶解，获得酶解液，对酶解液进行固液分离获得聚羟基脂肪酸酯，其中，所述的酶为蛋白酶、溶菌酶和核酸降解酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括按照体积比0.5％向细胞液中加入山梨醇。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述破壁的pH值为8.5-10.5；所述破壁的温度为60-85℃；所述破壁的时间为10-200min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的聚羟基脂肪酸酯选自单体为C3-C5的羟基脂肪酸的短链PHA、单体为C6-C18的羟基脂肪酸的中长链PHA、以及短链和中长链PHA共聚物。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的菌体选自嗜盐菌、盐单胞菌、兽气单胞菌、卡巴耶罗氏菌株、木质素降解细菌或巨大产碱杆菌DSM。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶为碱性蛋白酶。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按照质量比0.1％-0.3％加入酶。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解的温度为40-60℃。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解的时间为10-200min。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的加入酶之前还包括离心、洗涤的步骤。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的对酶解液进行固液分离步骤包括一次或多次的固液分离、一次或多次的加水洗涤以及一次或多次的固液分离，获得的沉淀经干燥后即为聚羟基脂肪酸酯，其中，所述的干燥选自冷冻干燥、喷雾干燥、流化床、转鼓干燥或沸腾床。

12.根据权利要求1-11任一所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

A)从发酵液中分离获得菌体，将菌体重悬于水中获得细胞液，按照体积比0.1-1％加入山梨醇，调节pH值为5-11.5，加热至60℃～90℃进行破壁10-200min，获得破壁裂解液；

B)离心、洗涤1-10次；

C)向破壁裂解液中按照质量比0.1％-0.3％加入酶进行酶解，获得酶解液，所述的酶为碱性蛋白酶、溶菌酶和核酸降解酶，所述酶解的温度为40-60℃，所述酶解的时间为10-200min；

D)对酶解液进行一次或多次的固液分离、一次或多次的加水洗涤以及一次或多次的固液分离，获得的沉淀经干燥后即为聚羟基脂肪酸酯。

13.一种权利要求1-12任一所述的方法获得的聚羟基脂肪酸酯在制备可降解的生物新材料中的应用。

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