CN115807044B - 一种高效提取并纯化高纯度聚羟基脂肪酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效提取并纯化高纯度聚羟基脂肪酸酯的方法，相对于传统技术，本发明的有益效果包括：本申请从产PHA菌中提取PHA的过程中，采用合适的表面活性剂进行破壁处理，制备得到的PHA粗产品经合适的预处理，再配合采用合适的萃取方式进行萃取，最终得到的PHA纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及聚羟基脂肪酸酯的制备领域，特别涉及一种高效提取并纯化高纯度聚羟基脂肪酸酯的方法。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一种由微生物合成的天然高分子聚酯，具有良好的生物可降解性和生物相容性，且应用场景广泛，发展潜力巨大。然而，受原料和下游处理损耗等的影响，PHA的生产成本居高不下。
传统的PHA提取方法有：有机溶剂法、酶法、水相分离法、机械破碎法等。有机溶剂法，其基本原理是有机溶剂，一方面可以改变细胞壁和膜的通透性，另一方面能使PHA溶解到溶剂中而非PHA的细胞物质(NPCM)不能溶解，从而将PHA与其他物质分离开来；酶法的原理即让大量的NPCM溶解，但不会溶解PHA，从而达到分离、提纯的目的；水相分离法是将含PHA的微生物在溶液中加入酸碱等物质，实现菌体细胞的破碎，最后加入有机溶剂/酶进行PHA的回收；机械破碎法则是通过机械运动所产生的剪切力将细胞破碎，使PHA被释放出。
目前，应用比较广泛的是水相分离法，它主要分为次氯酸盐法、氯仿-次氯酸盐法、碱法、热水-蛋白酶法等。次氯酸盐法、氯仿-次氯酸盐法中，氯仿、次氯酸盐等常用的有机溶剂对于PHA和细胞杂质的溶解能力均较强，提纯纯度不佳，且不是所有的有机溶剂能溶解PHA；碱法采用碱液提取PHA的纯度低，对材料分子量损失较大，且对于碱液的加入量需要严格控制；热水-蛋白酶法提取PHA纯度较低。
有鉴于此，特提出本申请。
发明内容
本申请实施例的目的包括提供一种高效提取并纯化高纯度聚羟基脂肪酸酯的方法，采用本申请的提取方法从假单胞菌中提取的聚羟基脂肪酸酯纯度高。
本申请实施例提供一种聚羟基脂肪酸酯的提取方法，所述提取方法包括如下步骤：
提供产PHA细菌的菌悬液，加入表面活性剂、蛋白酶或者溶菌酶进行破壁处理，收集PHA粗产品；
对所述PHA粗产品进行纯化，纯化采用(a)或者(b)所示的方法；
其中，
(a)所述的方法包括如下步骤：
用有机溶剂A对所述PHA粗产品进行萃取，收集萃取液，去溶剂，制备产物a1；
用有机溶剂A溶解所述产物a1，向所得溶液中加入有机溶剂B进行置换，去置换液，收集产物a2，去溶剂，制备产物a3；
用有机溶剂A溶解所述产物a3，收集溶液，去溶剂，提取得到聚羟基脂肪酸酯；
所述有机溶剂A选自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯或者其组合，所述有机溶剂B选自无水乙醇、丙醇、正己烷或者其组合，所述有机溶剂B和溶解所述产物a1采用的有机溶剂A的体积比不低于5：1；
(b)所示的方法包括如下步骤：
用有机溶剂C浸泡所述PHA粗产品，去溶剂，收集产物b1；
重复浸泡、去溶剂的步骤至少一次，制备产物b2；
用有机溶剂D对所述产物b2进行萃取，收集萃取液，去溶剂，制备产物b3；
用所述有机溶剂D溶解所述产物b3，收集溶液，去溶剂，提取得到聚羟基脂肪酸酯；
所述有机溶剂C选自无水乙醇、丙醇、正己烷、乙醚、乙腈、苯、乙二醇或者其组合，所述有机溶剂D选自氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸丁酯或者其组合。
在其中一些实施例中，所述PHA粗产品的制备步骤满足如下条件中的一个或者多个：
(1)破壁处理的温度为37℃～100℃；
(2)破壁处理的时间为15min～120min；
(3)破壁处理的pH为7～12；
(4)每1mL所述菌悬液对应的所述表面活性剂的用量为0.5mg～5mg，蛋白酶0.5mg～5mg，溶菌酶0.5mg～5mg，所述菌悬液中菌体的浓度为5g/L～80g/L；和，
(5)所述表面活性剂选自SDS、Triton X-100、Tween-80或者其组合。
在其中一些实施例中，(b)所示的方法具有如下技术特征中的一个或者多个：
(1)浸泡的时间为5h～30h；
(2)浸泡的条件包括：温度为-40℃～-60℃，真空度为100Pa～1000Pa；或者，温度为20℃～30℃，压力为100.5～101.5kPa；
(3)每1g所述PHA粗产品对应的所述有机溶剂C的用量为10mL～20mL；
(4)每1g所述产物b2对应的所述有机溶剂D的用量为2mL～20mL；
(5)萃取的条件包括：温度为20℃～30℃，时间为4h～12h；和，
(6)每1g所述产物b3对应的所述有机溶剂D的用量为10mL～20mL。
在其中一些实施例中，(b)所示的方法具有如下技术特征中的一个或者多个：
(1)所述产物b1或/和产物b2的制备步骤中，去溶剂的步骤包括：抽滤并将所得滤渣热烘；
(2)所述产物b3的制备步骤中，收集所述萃取液的方式包括抽滤；
(3)所述产物b3的制备步骤中，去溶剂的方式包括：自然挥发；和，
(4)提取得到聚羟基脂肪酸酯的步骤中，去溶剂的方式包括：自然挥发。
在其中一些实施例中，(a)所示的方法具有如下技术特征中的一个或者多个：
(1)萃取的步骤中，每1g所述PHA粗产品对应的所述有机溶剂A的用量为5mL～20mL；和，
(2)所述有机溶剂B和溶解所述产物a1采用的有机溶剂A的体积比为(5～10)：1；
(3)萃取的条件包括：温度为20℃～30℃，时间为4h～12h；
(4)置换的条件包括：温度为20℃～30℃，时间为5h～12h；和，
(5)置换的步骤中，每1g所述产物a1对应的所述有机溶剂A的用量为10mL～15mL以及对应的所述有机溶剂B的用量为50mL～150mL。
在其中一些实施例中，(a)所示的方法具有如下技术特征中的一个或者多个：
(1)所述产物a1的制备步骤中，收集所述萃取液的方式包括抽滤；
(2)所述产物a1的制备步骤中，去溶剂的方式包括自然挥发；
(3)所述产物a3的制备步骤中，去置换液的方式包括抽滤；
(4)所述产物a3的制备步骤中，去溶剂的方式包括自然挥发；和，
(5)提取得到聚羟基脂肪酸酯的步骤中，去溶剂的方式包括自然挥发。
在其中一些实施例中，收集所述PHA粗产品的方式包括：离心收集上清液并去除所述上清液中的溶剂。
在其中一些实施例中，离心的条件包括：转速为7000rpm～9000rpm，时间为5min～7min。
在其中一些实施例中，去除所述上清液中的溶剂的方式包括：冷冻干燥。
在其中一些实施例中，所述菌悬液所含菌体中的聚羟基脂肪酸酯的含量为20wt％～90wt％。
在其中一些实施例中，所述产PHA细菌选自假单胞菌、盐单胞菌、大肠杆菌、罗氏真养菌或者其组合。
相对于传统技术，本申请的有益效果包括：
本申请从产PHA菌中提取PHA的过程中，采用合适的表面活性剂进行破壁处理，制备得到的PHA粗产品经合适的预处理，再配合采用合适的萃取方式进行萃取，最终得到的PHA纯度高。
本申请涉及的Halomonas sp.LY01，其分类命名为Halomonas sp.，已于2022年7月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No.62635；该菌株于2022年7月19日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2022年7月19日检测为存活菌株。
具体实施方式
下面结合实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
本申请实施例提供一种聚羟基脂肪酸酯的提取方法，所述提取方法包括如下步骤：
提供产PHA细菌的菌悬液，加入表面活性剂、蛋白酶或者溶菌酶进行破壁处理，收集PHA粗产品；
对所述PHA粗产品进行纯化，纯化采用(a)或者(b)所示的方法；
其中，
(a)所述的方法包括如下步骤：
用有机溶剂A对所述PHA粗产品进行萃取，收集萃取液，去溶剂，制备产物a1；
用有机溶剂A溶解所述产物a1，向所得溶液中加入有机溶剂B进行置换，去置换液，收集产物a2，去溶剂，制备产物a3；
用有机溶剂A溶解所述产物a3，收集溶液，去溶剂，提取得到聚羟基脂肪酸酯；
所述有机溶剂A选自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯或者其组合，所述有机溶剂B选自无水乙醇、丙醇、正己烷或者其组合，所述有机溶剂B和溶解所述产物a1采用的有机溶剂A的体积比不低于5：1；
(b)所示的方法包括如下步骤：
用有机溶剂C浸泡所述PHA粗产品，去溶剂，收集产物b1；
重复浸泡、去溶剂的步骤至少一次，制备产物b2；
用有机溶剂D对所述产物b2进行萃取，收集萃取液，去溶剂，制备产物b3；
用所述有机溶剂D溶解所述产物b3，收集溶液，去溶剂，提取得到聚羟基脂肪酸酯；
所述有机溶剂C选自无水乙醇、丙醇、正己烷、乙醚、乙腈、苯、乙二醇或者其组合，所述有机溶剂D选自氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸丁酯或者其组合。
本申请的(a)所述的方法中：可选地，所述有机溶剂A为氯仿，所述有机溶剂B为无水乙醇、丙醇或者正己烷；可选地，所述有机溶剂A为乙酸乙酯，所述有机溶剂B为无水乙醇；可选地，所述有机溶剂A为二氯甲烷，所述有机溶剂B为无水乙醇或者丙醇；可选地，所述有机溶剂A为乙酸乙酯，所述有机溶剂B为无水乙醇或者丙醇。可选地，所述PHA粗产品的制备步骤满足如下条件中的一个或者多个：
(1)破壁处理的温度为37℃～100℃(例如为37、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100℃)；
(2)破壁处理的时间为15min～120min(例如为15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120min；
(3)破壁处理的pH为7～12(例如为7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12)；
(4)每1mL所述菌悬液对应的所述表面活性剂的用量为0.5mg～5mg(例如为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5mg)，蛋白酶0.5mg～5mg，溶菌酶0.5mg～5mg，所述菌悬液中菌体的浓度为5g/L～80g/L；和，
(5)所述表面活性剂选自SDS、Triton X-100、Tween-80或者其组合。
可选地，加入表面活性剂进行破壁处理，该条件下的破壁处理的温度可以为45℃～85℃。可选地，加入蛋白酶或者溶菌酶进行破壁处理，该条件下的破壁处理的温度可以选择适合蛋白酶或者溶菌酶的温度，例如为37℃～55℃。
可选地，(b)所示的方法具有如下技术特征中的一个或者多个：
(1)浸泡的时间为5h～30h(例如为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30h)；
(2)浸泡的条件包括：温度为-40℃～-60℃(例如为-40℃、-42℃、-44℃、-46℃、-48℃、-50℃、-52℃、-54℃、-56℃、-58℃、-60℃)，真空度为100Pa～1000Pa(例如为100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000Pa)；或者，温度为20℃～30℃(例如为20、22、24、26、28、30℃)，压力为100.5～101.5kPa(例如为100.5、101、101.5kPa)；
(3)每1g所述PHA粗产品对应的所述有机溶剂C的用量为10mL～20mL(例如为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20mL)；
(4)每1g所述产物b2对应的所述有机溶剂D的用量为2mL～20mL(例如为2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20mL)；
(5)萃取的条件包括：温度为20℃～30℃(例如为20、22、24、26、28、30℃)，时间为4h～12h(例如为4、5、6、7、8、90、10、11、12h)；和，
(6)每1g所述产物b3对应的所述有机溶剂D的用量为10mL～20mL(例如为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20mL)。
可选地，(b)所示的方法具有如下技术特征中的一个或者多个：
(1)所述产物b1或/和产物b2的制备步骤中，去溶剂的步骤包括：抽滤并将所得滤渣热烘；
(2)所述产物b3的制备步骤中，收集所述萃取液的方式包括抽滤；
(3)所述产物b3的制备步骤中，去溶剂的方式包括：自然挥发；和，
(4)提取得到聚羟基脂肪酸酯的步骤中，去溶剂的方式包括：自然挥发。
可选地，(a)所示的方法具有如下技术特征中的一个或者多个：
(1)萃取的步骤中，每1g所述PHA粗产品对应的所述有机溶剂A的用量为5mL～20mL(例如为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20mL)；和，
(2)所述有机溶剂B和溶解所述产物a1采用的有机溶剂A的体积比为(5～10)：1(例如为5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1)；
(3)萃取的条件包括：温度为20℃～30℃(例如为20、22、24、26、28、30℃)，时间为4h～12h(例如为4、5、6、7、8、9、10、11、12h)；
(4)置换的条件包括：温度为20℃～30℃(例如为20、22、24、26、28、30℃)，时间为5h～12h(例如为5、6、7、8、9、10、11、12h)；和，
(5)置换的步骤中，每1g所述产物a1对应的所述有机溶剂A的用量为10mL～15mL(例如为10、11、12、13、14、15mL)以及对应的所述有机溶剂B的用量为50mL～150mL(例如为50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150mL)。
可选地，(a)所示的方法具有如下技术特征中的一个或者多个：
(1)所述产物a1的制备步骤中，收集所述萃取液的方式包括抽滤；
(2)所述产物a1的制备步骤中，去溶剂的方式包括自然挥发；
(3)所述产物a3的制备步骤中，去置换液的方式包括抽滤；
(4)所述产物a3的制备步骤中，去溶剂的方式包括自然挥发；和，
(5)提取得到聚羟基脂肪酸酯的步骤中，去溶剂的方式包括自然挥发。
可选地，收集所述PHA粗产品的方式包括：离心收集上清液并去除所述上清液中的溶剂。
可选地，离心的条件包括：转速为7000rpm～9000rpm(例如为7000、7500、8000、8500、9000rpm)，时间为5min～7min(例如为5、5.5、6、6.5、7min)。
可选地，去除所述上清液中的溶剂的方式包括：冷冻干燥。
可选地，所述菌悬液所含菌体中的聚羟基脂肪酸酯的含量为20wt％～90wt％(例如为20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90wt％)。
可选地，所述产PHA细菌选自假单胞菌、盐单胞菌、大肠杆菌、罗氏真养菌或者其组合。
需要说明的是，以上本申请方法中，所述有机溶剂A和有机溶剂B分别对应实施例4中的有机溶剂1和有机溶剂2，所述有机溶剂C和有机溶剂D分别对应实施例5、6、7中的有机溶剂3和有机溶剂1。
具体实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1：不同表面活性剂在不同条件下的破壁效果
采用表面活性剂不仅改变细胞壁及膜的通透性，破坏菌体细胞的结构性能来破碎细胞释放胞内物质；同时还能使蛋白质变性。表面活性剂广泛应用的是SDS、Triton X-100和Tween-80，破壁的影响因素有：破壁温度、破壁时间、pH、表面活性剂的添加量及菌体浓度。
(1)菌体的收集及菌体浓度测定
1)菌体收集：收集适量的产PHA的假单胞菌(Li M,MaY,Zhang X,Zhang L,Chen X,Ye JW,Chen GQ.Tailor-Made Polyhydroxyalkanoatesby Reconstructing PseudomonasEntomophila.Adv Mater.2021Oct；33(41):e2102766.doi:10.1002/adma.202102766.Epub2021Jul 28.)，室温离心6分钟，转速为8000rpm，倒掉上清，尽量不要损失沉淀；然后加适量的去离子水恢复体积，重悬(确保沉淀完全溶解)，同等条件离心后，倒掉上清；随后加入适量的去离子水恢复体积，重悬(确保沉淀完全溶解)，准备破壁。
2)菌体浓度(g/L)测定：将35mL发酵后菌液置于50mL离心管中,室温离心6分钟，转速为8000rpm，倒掉上清，尽量减少沉淀损失；加入25mL去离子水，重悬，确保沉淀完全溶解，室温离心6分钟，转速为8000rpm，倒掉上清；将离心管封口，置于-80℃冰箱冻存0.5h以上；真空冷冻干燥机冷冻干燥15h左右，确保菌体被冻干；称重。
(2)细胞破壁
将上述收集的菌体浓度为8g/L的准备破壁菌液置于不同适宜容量的烧杯中，进行加热。选择不同的破壁温度及破壁时间，分别加入5mg/mL的表面活性剂SDS、Triton X-100和Tween-80，并用5M NaOH保持pH在9之间。
(3)PHA粗产品收集
将步骤(2)中破壁处理后所得的混合溶液倒入到50mL离心管中，室温离心6分钟，转速为8000rpm，倒掉上清，尽量不要损失PHA材料；然后加入25mL去离子水进行重悬(沉淀完全溶解)，室温离心6分钟，转速为8000rpm，倒掉上清(此过程重复2-3次，减少NaOH的影响)；随后将固体材料置于-80℃冰箱中，放置0.5h以上，最后用真空冷冻干燥机冻干12h左右，确保粗产品被冻干。
(4)PHA含量的测定
1)原料中PHA含量测定(原料纯度)
PHA含量测定：取40mg干菌体[本实施例的步骤(1)中第②步冻干后所得的菌体]置于干净的酯化管中，加入2mL酯化液(包含甲醇、3％(v/v)浓硫酸(98％,w/w)和1g/L苯甲酸)及2mL氯仿，100℃下酯化约4h。PHA标品称20mg采用同样处理为参照；随后使用GC-2014气相色谱仪(日本岛津)测定PHA含量。测试方法是：初始温度维持在80℃，1.5min；第一阶段，温度以30℃/min的速度增加到140℃；第二阶段，以40℃/min的速度增加到240℃，此过程耗时2min；总的分析时间是8min；注射温度为240℃和检测器温度为250℃。
2)粗产品中PHA含量测定
取40mg的PHA粗产品，PHA含量测定同“①原料中PHA含量测定(原料纯度)”。
(5)测定结果：将不同条件处理后的数据汇总，结果如表1(表中含量均为均值加方差)所示。
表1、不同破壁条件下的数据结果
数据表明，采用同一种表面活性剂，破壁温度固定，随着破壁时间的增加，粗产品PHA含量会有所增加；当破壁时间固定时，破壁温度越高，粗产品PHA含量越高。当选择相同的破壁条件时，不同的表面剂破壁效果不同，其中SDS的破壁效果相对较好。
实施例2：不同破壁方法对破壁效果的影响
对于细胞破壁，除了添加表面活性剂，还可以加入酶进行细胞破碎，释放得到PHA粗产品。酶解法包含溶菌酶、蛋白酶、核酸降解酶、糖苷酶等。通过改变表面活性剂/酶的加入量，比较破壁后粗产品中PHA的含量。
(1)菌体的收集及菌体浓度测定：具体操作同实施例1。
(2)细胞破壁：将上述收集的菌体浓度为10g/L的准备破壁菌液置于不同适宜容量的烧杯中，进行加热。，分别加入不同量的表面活性剂(SDS、Triton X-100、Tween-80)及酶(溶菌酶、蛋白酶)，用5M NaOH调节不同pH，破壁时间为90min，破壁温度：表面活性剂选择60℃，蛋白酶及溶菌酶选择适宜温度。
(3)PHA粗产品收集：具体操作同实施例1。
(4)PHA含量的测定：具体操作同实施例1。
(5)测定结果：将不同条件处理下的测定数据汇总，结果如表2(表中含量均为均值加方差)所示。
表2、不同加入量的表面活性剂/酶的数据结果
数据表明，当采用同一种表面活性剂/酶时，加入量的越多，粗产品PHA含量越高；当添加量相同时，表面活性剂的SDS的破壁效果最好，另外两种活性剂与酶的效果相近。
实施例3：利用不同的表面活性剂进行细胞破壁以获得PHA粗产品
(1)菌体的收集及菌体浓度测定：具体操作同实施例1。
(2)细胞破壁：将上述收集的菌体置于不同适宜容量的烧杯中，进行加热。当温度达到65℃的条件下，分别加入3mg/mL表面活性剂SDS、Triton X-100和Tween-80，并用5MNaOH保持pH在8-12之间，此过程时间维持30分钟。
(3)PHA粗产品收集：具体操作同实施例1。
(4)PHA含量的测定：具体操作同实施例1。
(5)测定结果：将不同条件处理后的数据汇总，结果如表3(表中含量均为均值加方差)所示。
表3、采用不同表面活性剂破壁结果
结果表明：当使用相同的表面活性剂时，pH对于细胞破壁影响较为显著，特别地，当pH＝10时，破壁后的粗产品中PHA含量最高；而当pH值相同时，采用不同表面活性剂粗产品中PHA含量不同，尤其是表面活性剂选择SDS时，粗产品中PHA含量最高。
实施例4：粗产品中PHA的提取和纯化
(1)使用萃取溶剂(有机溶剂-1)萃取PHA：将实施例3中处理得到的粗产品(实验序号为3-3中的粗产品进行如下处理)分别加入不同的萃取溶剂(有机溶剂-1)，包括氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯，进行粗产品的直接萃取，有机溶剂的添加量是10mL/g。抽滤，保留滤液于烧杯，室温静置24h，直至有机溶剂全部挥发。该步骤中，萃取在常温下进行，萃取的时间为5h。
(2)使用置换溶剂(有机溶剂-2)置换出PHA：加入步骤(1)中的萃取溶剂(有机溶剂-1加入量可减半，确保材料复溶即可)进行溶解。根据溶解度不同，使用不同的置换溶剂(有机溶剂-2)，包括无水乙醇、丙醇、正己烷，其中，置换溶剂(有机溶剂-2)与萃取溶剂(有机溶剂-1)的添加量之比不低于5：1，过滤，滤除滤液，室温静置12h，直至有机溶剂全部挥发，获得PHA材料。该步骤中的有机溶剂-1和步骤(1)中的有机溶剂-1选择的种类相同，置换在常温下进行5h。
(3)PHA纯化：将步骤(2)提取的PHA材料，采用(1)中加入的萃取溶剂(有机溶剂-1)重新溶解(注：有机溶剂-1的添加量只要确保材料完全溶解即可)，抽滤，保留滤液，室温静置24h，直至有机溶剂全部挥发。
(4)PHA含量的测定：取纯化好的40mg步骤(3)制备的PHA材料，按实施例1中的方法进行PHA含量检测。
(5)检测结果：将不同组合的有机溶剂提取纯化后的PHA数据整理汇总，结果如表4(表中含量均为均值加方差)所示。
表4、粗产品直接提取纯化结果
结果表明：采用不同种类的有机溶剂组合的形式进行PHA的提取纯化时，会使PHA的纯度增大。其中，提取纯化效果最好的有机溶剂组合为氯仿和无水乙醇，PHA纯度最高可达约93.56％。
实施例5：PHA粗产品预处理后进行PHA提取和纯化
(1)粗产品用有机溶剂-3进行预处理：将实施例3中的PHA粗产品(实验序号为3-3中的粗产品进行如下处理)采用有机溶剂-3(无水乙醇、丙醇、正己烷)进行预处理，目的是去除蛋白质等其他非PHA物质。有机溶剂-3的添加量按15mL/g添加至实施例3中粗产品，预处理时间为6-24h。
(2)预处理后材料中PHA含量测定：材料中PHA含量测定同实施例1。
(3)预处理结果分析：将不同有机溶剂-3及处理时间下的处理结果进行整理，结果如表5(表中含量均为均值加方差)所示。
表5、不同预处理时间对PHA纯度的影响
结果表明：当采用不同有机溶剂-3进行预处理时，预处理时间越长，对于后续提取纯化PHA材料越有利。其中，当使用乙醇进行预处理时，并且处理时间为24h，可使PHA含量达到84.635％。
(4)预处理后的产品(按24小时的处理时间，5-4，5-8，5-12进行后续处理)采用有机溶剂提取PHA：将浸泡后的材料抽滤，保留滤渣，烘箱内干燥滤渣；加入实施例4的中的萃取溶剂即有机溶剂-1(氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸丁酯)进行PHA的萃取，有机溶剂-1的添加量为15mL/g；抽滤，保留滤液，同时仍需室温下等待有机溶剂挥发24h，直至有机溶剂挥发完全。
(5)纯化PHA：待有机溶剂挥发后的材料再次采用(4)中的有机溶剂-1进行复溶，有机溶剂的添加量只要确保材料完全溶解即可，抽滤，保留滤液于烧杯或者玻璃皿底部，室温下挥发24h，直至有机溶剂挥发完全。
(6)纯化后PHA含量的测定：材料中PHA含量测定同实施例1。
(7)结果对比：将预处理之后的材料提取纯化后进行PHA纯度分析，结果如表6(表中含量均为均值加方差)所示。
表6、采用预处理法后材料纯化结果表
| 实验序号 | 有机溶剂-3 | 有机溶剂-1 | 粗产品PHA含量(％) | PHA纯度(％) |
| 6-1 | 无水乙醇 | 氯仿 | 82.35±0.167 | 98.989±0.133 |
| 6-2 | 无水乙醇 | 乙酸乙酯 | 82.35±0.167 | 94.314±0.713 |
| 6-3 | 无水乙醇 | 二氯甲烷 | 82.35±0.167 | 95.478±0.173 |
| 6-4 | 无水乙醇 | 乙酸丁酯 | 82.35±0.167 | 92.345±0.152 |
| 6-5 | 丙醇 | 氯仿 | 82.35±0.167 | 95.896±0.154 |
| 6-6 | 丙醇 | 乙酸乙酯 | 82.35±0.167 | 90.843±0.267 |
| 6-7 | 丙醇 | 二氯甲烷 | 82.35±0.167 | 94.186±0.415 |
| 6-8 | 丙醇 | 乙酸丁酯 | 82.35±0.167 | 91.644±0.331 |
| 6-9 | 正己烷 | 氯仿 | 82.35±0.167 | 94.785±0.037 |
| 6-10 | 正己烷 | 乙酸乙酯 | 82.35±0.167 | 90.803±0.644 |
| 6-11 | 正己烷 | 二氯甲烷 | 82.35±0.167 | 93.756±0.073 |
| 6-12 | 正己烷 | 乙酸丁酯 | 82.35±0.167 | 89.331±0.438 |
结果表明：采用预处理的方法，提取纯化后PHA含量明显提高；不同有机溶剂组合中采用无水乙醇进行预处理氯仿进行提取纯化，得到的PHA纯度可以达到98.99％。
实施例6：PHA粗产品预处理后进行PHA提取和纯化
实施例3中采用预处理将破壁之后PHA粗产品中的蛋白质、色素等非材料物质去除，进而便于后续PHA材料的提取纯化。在本实施例中采用实施例3中实验序号为3-3的破壁方式对菌悬液进行破壁，然后将所得材料按照实施例5中的有机溶剂浸泡进行预处理，并且材料进行预处理两次，然后进行PHA材料的提取纯化。
(1)粗产品采用有机溶剂-3进行预处理：采用实施例5中的有机溶剂-3(无水乙醇、丙醇、正己烷)按表5中预处理时间24h进行处理实施例3中的粗产品(实验序号为3-3中的粗产品进行如下处理)，有机溶剂-3的添加量按15mL/g，预处理时间为24h。将浸泡完成后的材料抽滤，保留滤渣，烘箱内干燥滤渣；然后再采用此有机溶剂-3进行重复预处理操作。
(2)预处理后的材料用有机溶剂提取纯化PHA：萃取溶剂(有机溶剂-1)选择氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸丁酯，提取纯化PHA材料操作同实施例5。
(3)纯化后PHA含量的测定：材料中PHA含量测定同实施例1。
(4)结果对比：将两次预处理之后的材料提取纯化后进行PHA纯度分析，结果如表7(表中含量均为均值加方差)所示。
表7、两次预处理之后PHA纯化结果表
| 实验序号 | 有机溶剂-3 | 有机溶剂-1 | 粗产品PHA含量(％) | PHA纯度(％) |
| 7-1 | 无水乙醇 | 氯仿 | 82.35±0.167 | 99.998±0.081 |
| 7-2 | 无水乙醇 | 乙酸乙酯 | 82.35±0.167 | 99.478±0.162 |
| 7-3 | 无水乙醇 | 二氯甲烷 | 82.35±0.167 | 99.972±0.606 |
| 7-4 | 无水乙醇 | 乙酸丁酯 | 82.35±0.167 | 99.628±0.409 |
| 7-5 | 丙醇 | 氯仿 | 82.35±0.167 | 99.542±0.648 |
| 7-6 | 丙醇 | 乙酸乙酯 | 82.35±0.167 | 98.004±0.556 |
| 7-7 | 丙醇 | 二氯甲烷 | 82.35±0.167 | 98.405±0.882 |
| 7-8 | 丙醇 | 乙酸丁酯 | 82.35±0.167 | 98.266±0.404 |
| 7-9 | 正己烷 | 氯仿 | 82.35±0.167 | 99.059±0.145 |
| 7-10 | 正己烷 | 乙酸乙酯 | 82.35±0.167 | 97.812±0.198 |
| 7-11 | 正己烷 | 二氯甲烷 | 82.35±0.167 | 98.363±0.371 |
| 7-12 | 正己烷 | 乙酸丁酯 | 82.35±0.167 | 97.188±0.886 |
数据表明：当采用两次预处理的方法，提取纯化后PHA含量明显比采用一次预处理方法得到的PHA含量高，PHA纯度可以达到99.998％；并且采用两次预处理方法之后，再进行材料的提取纯化，使用不同的有机试剂-1均能保证PHA纯度在97％以上。
实施例7：PHA湿粗产品的提取和纯化
(1)菌体的收集及菌体浓度测定：具体操作同实施例1。
(2)细胞破壁：具体操作同实施例3中表3的3-3进行操作。
(3)PHA粗产品收集：
PHA粗产品采用冻干和非冻干两种方式。
冻干的具体操作为：将(2)中破壁后的混合溶液倒入到50mL离心管中，室温离心6分钟，转速为8000rpm，倒掉上清，尽量不要损失PHA材料；然后加入25mL去离子水进行重悬(沉淀完全溶解)，室温离心6分钟，转速为8000rpm，倒掉上清(此过程重复2-3次，减少NaOH的影响)。将此时离心管内的固体取出少量用于冻干，冻干操作同实施例1；
非冻干的具体操作为：离心管内剩余的部分加入25mL有机溶剂-3进行重悬(沉淀完全溶解)，室温离心6分钟，转速为8000rpm，倒掉上清(此过程重复2次)之后进行PHA的提取和纯化。
(4)PHA含量的测定：具体操作同实施例1。
(5)粗产品采用有机溶剂-3进行预处理：具体操作同实施例6。
(6)预处理后的材料用有机溶剂提取纯化PHA：具体操作同实施例6。
(7)纯化后PHA含量的测定：材料中PHA含量测定同实施例1。
(8)纯化结果：将两次预处理之后的材料提取纯化后进行PHA纯度分析，结果如表8(表中含量均为均值加方差)所示。
表8、两次预处理之后PHA纯化结果表
| 实验序号 | 有机溶剂-3 | 有机溶剂-1 | 粗产品PHA含量(％) | PHA纯度(％) |
| 8-1 | 无水乙醇 | 氯仿 | 82.35±0.167 | 99.999±0.176 |
| 8-2 | 无水乙醇 | 乙酸乙酯 | 82.35±0.167 | 99.802±0.299 |
| 8-3 | 无水乙醇 | 二氯甲烷 | 82.35±0.167 | 99.983±0.109 |
| 8-4 | 无水乙醇 | 乙酸丁酯 | 82.35±0.167 | 99.722±0.488 |
| 8-5 | 丙醇 | 氯仿 | 82.35±0.167 | 99.607±0.422 |
| 8-6 | 丙醇 | 乙酸乙酯 | 82.35±0.167 | 98.621±0.089 |
| 8-7 | 丙醇 | 二氯甲烷 | 82.35±0.167 | 98.956±0.118 |
| 8-8 | 丙醇 | 乙酸丁酯 | 82.35±0.167 | 99.111±0.501 |
| 8-9 | 正己烷 | 氯仿 | 82.35±0.167 | 99.123±0.255 |
| 8-10 | 正己烷 | 乙酸乙酯 | 82.35±0.167 | 98.611±0.532 |
| 8-11 | 正己烷 | 二氯甲烷 | 82.35±0.167 | 99.087±0.558 |
| 8-12 | 正己烷 | 乙酸丁酯 | 82.35±0.167 | 98.499±0.621 |
数据表明，对PHA湿粗产品(非冻干操作的产物)直接进行提取纯化，得到的PHA纯度均在98％以上，其中效果最好的组合为无水乙醇和氯仿，纯化后的PHA含量可高达99.999％，其次是无水乙醇与二氯甲烷的组合。
实施例8：更换实施例6中表面活性剂为Tween-80进行破壁
当表面活性剂由Tween-80替换SDS，破壁后的粗产品PHA含量(％)为79.678±0.533(对应实施例3中的3-13)，后续预处理及PHA材料提取纯化采用与实施例6相同的试剂及操作，最终的PHA纯度如表9(表中含量均为均值加方差)。
表9、更换表面活性剂的数据结果
| 实验序号 | 有机溶剂-3 | 有机溶剂-1 | 粗产品PHA含量(％) | PHA纯度(％) |
| 9-1 | 无水乙醇 | 氯仿 | 79.678±0.533 | 99.898±0.163 |
| 9-2 | 无水乙醇 | 乙酸乙酯 | 79.678±0.533 | 99.392±0.446 |
| 9-3 | 无水乙醇 | 二氯甲烷 | 79.678±0.533 | 99.773±0.443 |
| 9-4 | 无水乙醇 | 乙酸丁酯 | 79.678±0.533 | 99.284±0.230 |
| 9-5 | 丙醇 | 氯仿 | 79.678±0.533 | 99.313±0.293 |
| 9-6 | 丙醇 | 乙酸乙酯 | 79.678±0.533 | 98.142±0.723 |
| 9-7 | 丙醇 | 二氯甲烷 | 79.678±0.533 | 98.234±0.028 |
| 9-8 | 丙醇 | 乙酸丁酯 | 79.678±0.533 | 98.144±0.576 |
| 9-9 | 正己烷 | 氯仿 | 79.678±0.533 | 99.042±0.365 |
| 9-10 | 正己烷 | 乙酸乙酯 | 79.678±0.533 | 97.584±0.338 |
| 9-11 | 正己烷 | 二氯甲烷 | 79.678±0.533 | 99.059±0.861 |
| 9-12 | 正己烷 | 乙酸丁酯 | 79.678±0.533 | 97.794±0.387 |
对比例1：更换实施例6中的萃取溶剂
实施例6中对于PHA产品萃取和纯化选择的萃取溶剂为氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸丁酯，将其更换为有机溶剂-1’(苯、吡啶、二甲基亚砜、环己烷)，其余操作步骤同实施例6，得出的结果如表10(表中含量均为均值加方差)。
表10、更换有机溶剂-1为有机溶剂-1’的数据结果
| 实验序号 | 有机溶剂-3 | 有机溶剂-1’ | 粗产品PHA含量(％) | PHA纯度(％) |
| 10-1 | 无水乙醇 | 苯 | 82.35±0.167 | 83.421±0.341 |
| 10-2 | 无水乙醇 | 吡啶 | 82.35±0.167 | 82.558±0.251 |
| 10-3 | 无水乙醇 | 二甲基亚砜 | 82.35±0.167 | 82.755±0.127 |
| 10-4 | 无水乙醇 | 环己烷 | 82.35±0.167 | 82.341±0.194 |
| 10-5 | 丙醇 | 苯 | 82.35±0.167 | 83.022±0.193 |
| 10-6 | 丙醇 | 吡啶 | 82.35±0.167 | 82.728±0.934 |
| 10-7 | 丙醇 | 二甲基亚砜 | 82.35±0.167 | 83.293±0.083 |
| 10-8 | 丙醇 | 环己烷 | 82.35±0.167 | 83.133±0.653 |
| 10-9 | 正己烷 | 苯 | 82.35±0.167 | 82.983±0.355 |
| 10-10 | 正己烷 | 吡啶 | 82.35±0.167 | 83.954±0.732 |
| 10-11 | 正己烷 | 二甲基亚砜 | 82.35±0.167 | 83.294±0.351 |
| 10-12 | 正己烷 | 环己烷 | 82.35±0.167 | 82.983±0.773 |
实施例9：更换实施例6中预处理中的有机溶剂-3
实施例6中对于PHA粗产品的预处理操作选择的是有机溶剂-3(无水乙醇、丙醇、正己烷)，将其更换为有机溶剂-3’(乙醚、乙腈、苯、乙二醇)其余操作步骤同实施例6，得出的结果如表11(表中含量均为均值加方差)。
表11、更换有机溶剂-3为机溶剂-3’的数据结果
| 实验序号 | 有机溶剂-3’ | 有机溶剂-1 | 粗产品PHA含量(％) | PHA纯度(％) |
| 11-1 | 乙醚 | 氯仿 | 82.35±0.167 | 97.635±0.422 |
| 11-2 | 乙醚 | 乙酸乙酯 | 82.35±0.167 | 93.298±0.198 |
| 11-3 | 乙醚 | 二氯甲烷 | 82.35±0.167 | 95.013±0.886 |
| 11-4 | 乙醚 | 乙酸丁酯 | 82.35±0.167 | 91.786±0.342 |
| 11-5 | 乙腈 | 氯仿 | 82.35±0.167 | 94.856±0.754 |
| 11-6 | 乙腈 | 乙酸乙酯 | 82.35±0.167 | 92.873±0.966 |
| 11-7 | 乙腈 | 二氯甲烷 | 82.35±0.167 | 94.195±0.299 |
| 11-8 | 乙腈 | 乙酸丁酯 | 82.35±0.167 | 92.634±0.261 |
| 11-9 | 苯 | 氯仿 | 82.35±0.167 | 94.635±0.236 |
| 11-10 | 苯 | 乙酸乙酯 | 82.35±0.167 | 90.413±0.374 |
| 11-11 | 苯 | 二氯甲烷 | 82.35±0.167 | 93.846±0.476 |
| 11-12 | 苯 | 乙酸丁酯 | 82.35±0.167 | 89.171±0.384 |
| 11-13 | 乙二醇 | 氯仿 | 82.35±0.167 | 96.849±0.753 |
| 11-14 | 乙二醇 | 乙酸乙酯 | 82.35±0.167 | 93.087±0.653 |
| 11-15 | 乙二醇 | 二氯甲烷 | 82.35±0.167 | 93.076±0.733 |
| 11-16 | 乙二醇 | 乙酸丁酯 | 82.35±0.167 | 92.753±0.539 |
实施例10：更换实施例4中萃取溶剂与置换溶剂比例
实施例4中置换溶剂与萃取溶剂比例应该不低于5∶1，实施例4中选择的比例为10∶1，将其比例进行更换，其余操作步骤同实施例4，得出的结果如表12(表中含量均为均值加方差)。
表12、更换萃取溶剂与置换溶剂比例的数据结果
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实施例11：提取并纯化盐单胞菌中的聚羟基脂肪酸酯
(1)菌体收集及菌体浓度测定
①菌体收集：取保藏编号为GDMCC No:62635的嗜盐单胞菌Halomonas sp.LY01产PHA的发酵液，室温离心6分钟，转速为8000rpm，倒掉上清，尽量不要损失沉淀；然后加适量的去离子水恢复体积，重悬(确保沉淀完全溶解)，同等条件离心后，倒掉上清；随后加入适量的去离子水恢复体积，重悬(确保沉淀完全溶解)，准备破壁。
②菌体浓度(g/L)测定：具体操作同实施例1。
(2)细胞破壁
将上述收集的菌体浓度为10g/L的准备破壁菌液置于不同适宜容量的烧杯中，进行加热。加入3mg/mL的表面活性剂SDS，维持破壁时间为30分钟，破壁期间采用5M NaOH保持pH＝10。
(3)PHA粗产品收集
PHA粗产品收集采用冻干和非冻干两种方式。非冻干方式选用的有机溶剂-3为无水乙醇，具体操作步骤同实施例7。
(4)PHA含量的测定
①原料中PHA含量测定(原料纯度)：具体操作步骤同实施例1。
②粗产品中PHA含量测定：具体操作步骤同实施例1。
(5)PHA粗产品采用有机溶剂无水乙醇进行预处理：具体操作同实施例6。
(6)预处理后的材料用有机溶剂提取纯化PHA：具体操作同实施例6。
(7)纯化后PHA含量的测定：材料中PHA含量测定同实施例1。
(8)纯化结果：将两种收集方式获得的PHA粗产品提取纯化后进行PHA纯度分析，结果如表13(表中含量均为均值加方差)所示。
表13、盐单胞菌Halomonas sp.LY01的PHA纯化结果表
数据表明，采用3mg/mL的表面活性剂SDS，破壁时间维持30分钟，pH保持10的破壁条件，对于盐单胞菌破壁效果显著；采用两种方式收集粗产品，并进行PHA产品的提取纯化，均可使PHA纯度达到99％以上。
实施例12：提取并纯化大肠杆菌中的聚羟基脂肪酸酯
(1)菌体收集及菌体浓度测定
①菌体收集：收集适量产PHA的大肠杆菌(Meng DC,Wang Y,Wu LP,Shen R,ChenJC,Wu Q,Chen GQ.Production of poly(3-hydroxypropionate)and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxypropionate)from glucose by engineeringEscherichia coli.Metab Eng.2015May；29:189-195.doi:10.1016/j.ymben.2015.03.015.Epub 2015Apr 1.PMID:25842374.)发酵液，室温离心6分钟，转速为8000rpm，倒掉上清，尽量不要损失沉淀；然后加适量的去离子水恢复体积，重悬(确保沉淀完全溶解)，同等条件离心后，倒掉上清；随后加入适量的去离子水恢复体积，重悬(确保沉淀完全溶解)，准备破壁。
②菌体浓度(g/L)测定：具体操作同实施例1。
(2)细胞破壁
将上述收集的菌体浓度为5g/L的准备破壁菌液置于不同适宜容量的烧杯中，进行加热。加入3mg/mL的表面活性剂SDS、维持破壁时间为30分钟，破壁期间采用5M NaOH保持pH＝10。
(3)PHA粗产品收集
PHA粗产品收集采用冻干和非冻干两种方式。非冻干方式选用的有机溶剂-3为无水乙醇，具体操作步骤同实施例7。
(4)PHA含量的测定
1)原料中PHA含量测定(原料纯度)：具体操作步骤同实施例1。
2)粗产品中PHA含量测定：具体操作步骤同实施例1。
(5)PHA粗产品采用有机溶剂无水乙醇进行预处理：具体操作同实施例6。
(6)预处理后的材料用有机溶剂提取纯化PHA：具体操作同实施例6。
(7)纯化后PHA含量的测定：材料中PHA含量测定同实施例1。
(8)纯化结果：将两种收集方式获得的PHA粗产品提取纯化后进行PHA纯度分析，结果如表14(表中含量均为均值加方差)所示。
表14、大肠杆菌PHA纯化结果表
数据表明，3mg/mL的表面活性剂SDS，破壁时间维持30分钟，及pH保持10的破壁条件，适用于大肠杆菌破壁；采用两种方式收集粗产品，并进行PHA产品的提取纯化，均可使PHA纯度达到99.5％以上。
实施例13：提取并纯化罗氏真养杆菌中的聚羟基脂肪酸酯
(1)菌体收集及菌体浓度测定
1)菌体收集：收集适量产PHB的罗氏真氧杆菌(Ryu HW,Hahn SK,Chang YK,ChangHN.Production of poly(3-hydroxybutyrate)by high cell density fed-batchculture of Alcaligenes eutrophus with phospate limitation.BiotechnolBioeng.1997Jul 5；55(1):28-32.doi:10.1002/(SICI)1097-0290(19970705)55:1<28::AID-BIT4>3.0.CO；2-Z.PMID:18636441.)发酵液，室温离心6分钟，转速为8000rpm，倒掉上清，尽量不要损失沉淀；然后加适量的去离子水恢复体积，重悬(确保沉淀完全溶解)，同等条件离心后，倒掉上清；随后加入适量的去离子水恢复体积，重悬(确保沉淀完全溶解)，准备破壁。
2)菌体浓度(g/L)测定：具体操作同实施例1。
(2)细胞破壁
将上述收集的菌体浓度为15g/L的准备破壁菌液置于不同适宜容量的烧杯中，进行加热。加入3mg/mL的表面活性剂SDS、维持破壁时间为30分钟，破壁期间采用5M NaOH保持pH＝10。
(3)PHA粗产品收集
PHA粗产品收集采用冻干和非冻干两种方式。非冻干方式选用的有机溶剂-3为无水乙醇，具体操作步骤同实施例7。
(4)PHA含量的测定
1)原料中PHA含量测定(原料纯度)：具体操作步骤同实施例1。
2)粗产品中PHA含量测定：具体操作步骤同实施例1。
(5)PHA粗产品采用有机溶剂无水乙醇进行预处理：具体操作同实施例6。
(6)预处理后的材料用有机溶剂提取纯化PHA：具体操作同实施例6。
(7)纯化后PHA含量的测定：材料中PHA含量测定同实施例1。
(8)纯化结果：将两种收集方式获得的PHA粗产品提取纯化后进行PHA纯度分析，结果如表15(表中含量均为均值加方差)所示。
表15、罗氏真养杆菌的PHA纯化结果表
数据表明，采用3mg/mL的表面活性剂SDS、破壁时间维持30分钟，pH保持10的破壁条件，对于罗氏真养杆菌破壁效果显著；采用两种方式收集粗产品，并进行PHA产品的提取纯化，均可使PHA纯度达到99.2％以上。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。
Claims (8)
1.一种聚羟基脂肪酸酯的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括如下步骤：
提供产PHA细菌的菌悬液，加入表面活性剂进行破壁处理，收集PHA粗产品；
对所述PHA粗产品进行纯化，纯化采用(b)所示的方法；
其中，
(b)所示的方法包括如下步骤：
用有机溶剂C浸泡所述PHA粗产品，去溶剂，收集产物b1；浸泡时间为6h～24h；
重复浸泡、去溶剂的步骤至少一次，制备产物b2；
用有机溶剂D对所述产物b2进行萃取，收集萃取液，去溶剂，制备产物b3；
用所述有机溶剂D溶解所述产物b3，收集溶液，去溶剂，提取得到聚羟基脂肪酸酯；
所述有机溶剂C选自无水乙醇和丙醇中的一种，所述有机溶剂D选自氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷和乙酸丁酯中的一种；
PHA粗产品的制备步骤包括如下条件：
(1)破壁处理的温度为65℃；
(2)破壁处理的时间为30min；
(3)破壁处理的pH为10；
(4)每1mL所述菌悬液对应的所述表面活性剂的用量为3mg；和，
(5)所述表面活性剂为SDS。
2.根据权利要求1所述的聚羟基脂肪酸酯的提取方法，其特征在于，(b)所示的方法具有如下技术特征：
(1)浸泡的条件包括：温度为-40℃～-60℃，真空度为100Pa～1000Pa；或者，温度为20℃～30℃，压力为100.5～101.5kPa；
(2)每1g所述PHA粗产品对应的所述有机溶剂C的用量为10mL～20mL；
(3)每1g所述产物b2对应的所述有机溶剂D的用量为2mL～20mL；
(4)萃取的条件包括：温度为20℃～30℃，时间为4h～12h；和，
(5)每1g所述产物b3对应的所述有机溶剂D的用量为10mL～20mL。
3.根据权利要求2所述的聚羟基脂肪酸酯的提取方法，其特征在于，(b)所示的方法具有如下技术特征：
(1)所述产物b1或/和产物b2的制备步骤中，去溶剂的步骤包括：抽滤并将所得滤渣热烘；
(2)所述产物b3的制备步骤中，收集所述萃取液的方式包括抽滤；
(3)所述产物b3的制备步骤中，去溶剂的方式包括：自然挥发；和，
(4)提取得到聚羟基脂肪酸酯的步骤中，去溶剂的方式包括：自然挥发。
4.根据权利要求1或者3所述的聚羟基脂肪酸酯的提取方法，其特征在于，收集所述PHA粗产品的方式包括：离心收集上清液并去除所述上清液中的溶剂。
5.根据权利要求4所述的聚羟基脂肪酸酯的提取方法，其特征在于，离心的条件包括：转速为7000rpm～9000rpm，时间为5min～7min。
6.根据权利要求4所述的聚羟基脂肪酸酯的提取方法，其特征在于，去除所述上清液中的溶剂的方式包括：冷冻干燥。
7.根据权利要求1、3、5或者6所述的聚羟基脂肪酸酯的提取方法，其特征在于，所述菌悬液所含菌体中的聚羟基脂肪酸酯的含量为20wt％～80wt％。
8.根据权利要求1、3、5或者6所述的聚羟基脂肪酸酯的提取方法，其特征在于，所述产PHA细菌选自假单胞菌、盐单胞菌、大肠杆菌、罗氏真养菌或者其组合。
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