CN110541004B - 一种生产1,3-丙二醇的方法 - Google Patents

一种生产1,3-丙二醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生产1,3‑丙二醇的方法，属于发酵技术领域以及生物技术领域。本发明提供了一种可用于发酵生产1,3‑丙二醇的培养基，此培养基在满足可生产1,3‑丙二醇的菌株在生产1,3‑丙二醇过程中对无机盐的需求的前提下，使用少量(NH4)2HPO4替代了传统的用于发酵生产1,3‑丙二醇的培养基中所有的如KH2PO4、(NH4)2SO4和MgSO4等的其他硫酸盐和磷酸盐，这大大降低了1,3‑丙二醇生产过程中对硫酸盐和磷酸盐的消耗量，进而降低了1,3‑丙二醇的生产成本，同时，降低了1,3‑丙二醇生产过程中下游脱盐的压力。

Description

一种生产1,3-丙二醇的方法
技术领域
本发明涉及一种生产1,3-丙二醇的方法，属于发酵技术领域以及生物技术领域。
背景技术
1,3-丙二醇(1,3-propanediol，1,3-PDO)为无色、无臭，具有咸味和吸湿性的黏稠液体。它是生产不饱和聚酯、增塑剂、表面活性剂、乳化剂和破乳剂的原料；在聚氨酯行业中，其常用作聚酯多元醇的原料、聚醚多元醇的起始剂和聚氨酯扩链剂等；在有机化工行业中，其也是重要的单体和中间体，最主要的用途是作为聚合物单体，合成聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)。预计到2020年，1,3-丙二醇的潜在市场容量可达227万吨。
目前，工业上常通过先将可生产1,3-丙二醇的肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae)接种至发酵培养基中进行发酵，然后从发酵液中提取1,3-丙二醇来生产1,3-丙二醇。但是，由于肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)在生长过程中对SO4 2-和PO4 3-等离子的需求较大，因此，用于培养肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)的发酵培养基中常含有大量的为肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)提供SO4 2-和PO4 3-等离子的无机盐，这不仅大大增加了1,3-丙二醇的生产成本，而且，这些无机盐在发酵结束时会残留在发酵液中(约16～20％的无机盐会残留)，大大增加了1,3-丙二醇生产过程中下游脱盐的压力。
因此，急需找到一种无机盐消耗低的生产1,3-丙二醇的方法以降低1,3-丙二醇的生产成本，同时，降低1,3-丙二醇生产过程中下游脱盐的压力。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种硫酸盐和/或磷酸盐消耗低的生产1,3-丙二醇的方法。
[技术方案]
为解决本发明的技术问题，本发明提供了一种培养基，所述培养基的成分包含酵母膏6～8g/L、葡萄糖6～15g/L、甘油35～45g/L、(NH4)2HPO40.5～4.5g/L、FeSO4·7H2O0.003～0.008g/L、VB120.01～0.02g/L以及微量元素溶液0.08～0.12mL/L；所述微量元素溶液的成分包含Na2MoO4·2H2O 0.30～0.4g/L、CoCl2·6H2O 1.8～2.2g/L、NiCl2·6H2O 0.20～0.3g/L、H3BO30.5～0.7g/L、MnCl2·4H2O 0.8～1.2g/L、CuCl20.18～0.22g/L以及ZnCl20.6～0.8g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的成分包含酵母膏6g/L、葡萄糖12g/L、甘油40g/L、(NH4)2HPO41.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.005g/L、VB120.015 g/L以及微量元素溶液0.1mL/L；所述微量元素溶液的成分包含Na2MoO4·2H2O 0.35g/L、CoCl2·6H2O 2g/L、NiCl2·6H2O 0.25g/L、H3BO30.6 g/L、MnCl2·4H2O 1g/L、CuCl20.2 g/L以及ZnCl20.7 g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的pH为7.3～7.6。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的pH为7.5。
本发明还提供了一种生产1,3-丙二醇的方法，所述方法为先将可生产1,3-丙二醇的菌株接种至上述培养基中进行发酵，获得发酵液，然后将发酵液进行提取，获得1,3-丙二醇。
在本发明的一种实施方式中，所述可生产1,3-丙二醇的菌株为肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、柠檬酸杆菌(Citrobacter fruendii)和/或丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridia butyricum)。
在本发明的一种实施方式中，所述可生产1,3-丙二醇的菌株为肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为35～38℃。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为37℃。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的转速为80～120rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的转速为100rpm。
本发明还提供了上述培养基或上述方法在生产1,3-丙二醇方面的应用。
[有益效果]
(1)本发明提供了一种可用于发酵生产1,3-丙二醇的培养基，此培养基在满足可生产1,3-丙二醇的菌株在生产1,3-丙二醇过程中对无机盐的需求的前提下，使用少量(NH4)2HPO4替代了传统的用于发酵生产1,3-丙二醇的培养基中所有的如KH2PO4、(NH4)2SO4和MgSO4等的其他硫酸盐和磷酸盐，这大大降低了1,3-丙二醇生产过程中对硫酸盐和磷酸盐的消耗量，进而降低了1,3-丙二醇的生产成本，同时，降低了1,3-丙二醇生产过程中下游脱盐的压力；使用本发明的培养基发酵生产1,3-丙二醇的硫酸盐和磷酸盐消耗量较使用传统培养基发酵生产1,3-丙二醇的硫酸盐和磷酸盐消耗量降低了87％。
(2)本发明提供了一种生产1,3-丙二醇的方法，此方法通过使用除1.5g/L(NH4)2HPO4以及0.005g/L FeSO4·7H2O外，不含有任何其他硫酸盐和磷酸盐的培养基，大大降低了1,3-丙二醇生产过程中对硫酸盐和磷酸盐的消耗量，进而降低了1,3-丙二醇的生产成本，同时，降低了1,3-丙二醇生产过程中下游脱盐的压力。
附图说明
图1：肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)在磷酸盐缺失下的代谢产物变化情况。
图2：肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)在不同磷酸盐下的代谢产物变化情况。
图3：肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)的budA、budB、budC、phoA、phoB基因在无磷酸盐条件下的转录水平变化情况。
图4：肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)在硫酸盐缺失下的代谢产物变化情况。
图5：肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)在磷酸盐和硫酸盐共同缺失下的代谢产物变化情况。
图6：肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)在不同浓度玉米浆下的代谢产物变化情况。
图7：肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)在不同浓度(NH4)2HPO4下的代谢产物变化情况。
具体实施方式
下述实施例中涉及的肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)购自北纳生物，产品编号为BNCC107352；下述实施例中涉及的玉米浆购自江阴酶制剂厂。
下述实施例中涉及的培养基如下：
斜面培养基：酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L、蛋白胨10g/L、琼脂粉20g/L。
种子培养基：酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L、蛋白胨10g/L。
原始发酵培养基：酵母膏6g/L、葡萄糖12g/L、甘油40g/L、MgSO42 g/L、(NH4)2SO42g/L、KH2PO47.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.005g/L、VB120.015 g/L以及微量元素溶液0.1mL/L，pH用浓度为10mol/L的KOH调节至7.5；其中，微量元素溶液的成分包含Na2MoO4·2H2O0.35g/L、CoCl2·6H2O 2g/L、NiCl2·6H2O 0.25g/L、H3BO30.6 g/L、MnCl2·4H2O 1g/L、CuCl20.2 g/L以及ZnCl20.7 g/L(此培养基为工业上以及实验室中最常用的用于发酵生产1,3-丙二醇的发酵培养基)。
下述实施例中涉及的发酵方法如下：
将肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)划线接种于试管斜面培养基中，于37℃培养12～14h，形成单菌落；挑取单菌落接种到种子培养基中，37℃、100rpm下培养11h，得到一级种子液；按照1％(v/v)的接种量将一级种子液转接到新的种子培养基中，37℃、100rpm下培养8h，得到二级种子液；按照4％(v/v)的接种量将二级种子液转接到发酵培养基中，37℃、100rpm下震荡培养48h，得到发酵液。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
生物量的测定：通过紫外分光光度计检测发酵液的OD600值，细胞干重(DCW)与测得的OD600值的对应关系公式为0.36g/L＝1OD600。
代谢产物含量的测定：将发酵液经10000g离心15min，取500μL上清液经0.22μm水系微孔滤膜处理，利用HPLC法检测发酵液中的1,3-PDO、2,3-BDO、乙酸、甘油、琥珀酸及乳酸的浓度；其中，色谱柱为Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm，9μm)，流动相为5mmol/L H2SO4，柱温为60℃，流速为0.6mL·min-1，进样体积为20μL，检测器为示差折光检测器。
基因相对转录水平的测定：qRT-PCR方法：
(1)在qPCR管中配置如表1体系：
表1 qRT-PCR的体系
2×AceQ Universal SYBR qPCR Mster Mix 10μL
上游引物(10μmol/L) 0.4μL
下游引物(10μmol/L) 0.4μL
cDNA(100μg/L) 1μL
ddH<sub>2</sub>O to20μL
(2)按表2的条件进行qPCR反应：
表2 qRT-PCR的反应条件
Figure BDA0002223265430000041
以使用原始发酵培养基发酵得到的发酵液作为对照组，所有qRT-PCR反应均重复3次，相对转录水平采用2-ΔΔCt计算方式。
实施例1：磷酸盐缺失对肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)生长和代谢的影响
具体步骤如下：
KH2PO4是原始发酵培养基中主要的PO4 3-的来源，以使用原始发酵培养基发酵得到的发酵液作为对照组，去除原始发酵培养基中的KH2PO4，将肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae)接种至去除了KH2PO4的原始发酵培养基中进行发酵，获得发酵液。
检测发酵液中肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)的生物量以及各代谢产物的含量变化，检测结果见图1。
由图1可知，当培养基中缺失PO4 3-时，虽然发酵液中乙酸的积累量较对照组降低了70.5％，但是，肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)的生物量较对照组降低了47.8％，1,3-PDO产量较对照组降低了63.9％，甘油残余量较对照组增加了433％，2,3-BDO、乳酸、琥珀酸、乙醇的积累量较对照组分别增加了426％、39.6％、205％和15.5％，其中，2,3-BDO积累量由对照组的1.94g/L增加到了10.2g/L，这说明，培养基中PO4 3-的缺失严重抑制了菌体生长，阻碍了细胞对甘油的消耗，导致碳流更多流向其他副产物，不利于目的产物的合成。
为了确认这一现象是PO4 3-的缺失所造成的，以使用原始发酵培养基发酵得到的发酵液作为对照组，在保持所添加的K+量与KH2PO4相同的前提下，将原始发酵培养基中的KH2PO4分别替换为KCl、K2CO3和柠檬酸钾，并将肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)接种至将KH2PO4分别替换为KCl、K2CO3和柠檬酸钾的原始发酵培养基中进行发酵，获得发酵液。
检测发酵液中肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)的生物量以及各代谢产物的含量变化，检测结果见图2。
由图2可知，尽管菌体生长和1,3-PDO合成与使用去除了KH2PO4的原始发酵培养基时相比有所恢复，但仍然存在着菌体生物量和1,3-PDO产量较对照组下降，2,3-BDO积累量较对照组大幅度增加的现象。因此，猜测编码2,3-BDO合成路径的bud操纵子基因是磷调节子PHO的一部分，受到磷酸盐调控蛋白PHOB的调控。
为了证明这一猜想，以使用原始发酵培养基发酵得到的发酵液作为对照组，去除原始发酵培养基中的KH2PO4，将肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)接种至去除了KH2PO4的原始发酵培养基中进行发酵12h，获得发酵液。
检测发酵12h时肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)体内phoA、phoB、budA、budB、budC基因的转录水平变化，检测结果见图3。
由图3可知，与对照组相比，肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)体内受到磷酸盐调控蛋白PHOB调控的phoA、phoB基因转录水平显著提高，而budA、budB、budC基因的转录水平变化并未有明显变化，可见bud操纵子并非磷调节子PHO的一部分。
实施例2：硫酸盐缺失对肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)生长和代谢的影响
具体步骤如下：
SO4 2-是大多数生物体优选的硫的来源，以使用原始发酵培养基发酵得到的发酵液作为对照组，去除原始发酵培养基中的MgSO4以及(NH4)2SO4，将肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae)接种至去除了MgSO4以及(NH4)2SO4的原始发酵培养基中进行发酵，获得发酵液。
检测发酵液中肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)的生物量以及各代谢产物的含量变化，检测结果见图4。
由图4可知，尽管发酵液中各肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)代谢产物的积累量较对照组未有明显变化，但肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)的生物量和1,3-PDO产量分别较对照组下降了10.1％和8.73％。可见，培养基中SO4 2-的缺失不利于菌株生长和1,3-PDO的合成。
实施例3：磷酸盐和硫酸盐同时缺失对肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)生长和代谢的影响
具体步骤如下：
以使用原始发酵培养基发酵得到的发酵液作为对照组，去除原始发酵培养基中的KH2PO4、MgSO4以及(NH4)2SO4，将肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)接种至去除了KH2PO4、MgSO4以及(NH4)2SO4的原始发酵培养基中进行发酵，获得发酵液。
检测发酵液中肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)的生物量以及各代谢产物的含量变化，检测结果见图5。
由图5可知，PO4 3-和SO4 2-缺失后，肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)的生物量较对照组显著下降，仅为对照组的31.7％，1,3-PDO产量较对照组降低了92.6％，仅为1.4g/L，肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)几乎不利用甘油，残余甘油量达到了35.8g/L。
综上所述，作为培养基重要营养成分的PO4 3-和SO4 2-的缺失不利于肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)的生长和1,3-PDO合成，其中，PO4 3-对菌株的生长和甘油代谢尤为重要。
实施例4：原始发酵培养基的优化
具体步骤如下：
以使用原始发酵培养基发酵得到的发酵液作为对照组A，以使用去除了KH2PO4、MgSO4以及(NH4)2SO4的原始发酵培养基发酵得到的发酵液作为对照组B(无PI)，在去除了KH2PO4、MgSO4以及(NH4)2SO4的原始发酵培养基中分别添加浓度为2g/L的玉米浆、浓度为10g/L的玉米浆、浓度为0.5g/L的(NH4)2HPO4、1.5g/L的(NH4)2HPO4、2.5g/L的(NH4)2HPO4、3.5g/L的(NH4)2HPO4或浓度为4.5g/L的(NH4)2HPO4，将肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae)接种至去除了KH2PO4、MgSO4以及(NH4)2SO4且分别添加浓度为2g/L的玉米浆、浓度为10g/L的玉米浆、浓度为0.5g/L的(NH4)2HPO4、1.5g/L的(NH4)2HPO4、2.5g/L的(NH4)2HPO4、3.5g/L的(NH4)2HPO4以及浓度为4.5g/L的(NH4)2HPO4的原始发酵培养基中进行发酵，获得发酵液。
检测发酵液中肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)的生物量以及各代谢产物的含量变化，检测结果见图6-7。
由图6可知，添加不同浓度的玉米浆可以恢复肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae)的生长并减少残余甘油的积累量，其中，添加2g/L的玉米浆时，肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)的生物量相较于对照组B提高了13.3％、甘油残余量相较于对照组B减少了71.9％，添加10g·L-1的玉米浆时，肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)的生物量相较于对照组B提高了24.8％、甘油残余量相较于对照组B减少了73.3％；添加不同浓度玉米浆时，肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)的2,3-BDO的积累量相较于对照组B未有明显变化，分别为13.5g/L和13g/L；添加不同浓度玉米浆时，肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)的1,3-PDO的积累量相较于对照组B有了明显的降低，仅有对照组B的不到一半。在此基础上使用pH测量仪测定发酵结束后发酵液的pH值，发现，添加2g/L的玉米浆时和添加10g/L的玉米浆时，发酵液的pH分别为4.5和4.7，而原始培养基的pH值为6.2。可见，添加不同浓度的玉米浆虽然可以恢复菌体生长和甘油利用，但是不能代替PO4 3-对培养基中有机酸起缓冲作用，致使碳流偏向2,3-BDO合成，而1,3-PDO产量未有所恢复。
由图7可知，添加不同浓度的(NH4)2HPO4可以恢复肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae)的生长和甘油利用，且可以恢复肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)的1,3-PDO的产量；并且，随着培养基中(NH4)2HPO4浓度的减少，肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae)的生物量逐渐减小，残余甘油含量增多，1,3-PDO产量在(NH4)2HPO4浓度下降到1.5g/L以下时急剧下降，因此，可以确定最适的(NH4)2HPO4添加量为1.5g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种培养基，其特征在于，所述培养基的成分为：酵母膏6~8g/L、葡萄糖6~15g/L、甘油35~45g/L、(NH4)2HPO41.5~4.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.003~0.008g/L、VB12 0.01~0.02g/L以及微量元素溶液0.08~0.12mL/L；所述微量元素溶液的成分为Na2MoO4·2H2O 0.30~0.4g/L、CoCl2·6H2O 1.8~2.2g/L、NiCl2·6H2O 0.20~0.3g/L、H3BO3 0.5~0.7g/L、MnCl2·4H2O 0.8~1.2g/L、CuCl20.18~0.22g/L以及ZnCl2 0.6~0.8g/L。
2.如权利要求1所述的一种培养基，其特征在于，所述培养基的成分为酵母膏6 g/L、葡萄糖12 g/L、甘油40 g/L、(NH4)2HPO41.5 g/L、FeSO4·7H2O0.005 g/L、VB120.015 g/L以及微量元素溶液0.1 mL/L；所述微量元素溶液的成分为Na2MoO4·2H2O 0.35 g/L、CoCl2·6H2O2 g/L、NiCl2·6H2O 0.25 g/L、H3BO3 0.6 g/L、MnCl2·4H2O 1 g/L、CuCl2 0.2 g/L以及ZnCl2 0.7 g/L。
3.如权利要求1或2所述的一种培养基，其特征在于，所述培养基的pH为7.3~7.6。
4.如权利要求1~3任一所述的一种培养基，其特征在于，所述培养基的pH为7.5。
5.一种生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，所述方法为先将可生产1,3-丙二醇的菌株接种至权利要求1~4任一所述的培养基中进行发酵，获得发酵液，然后将发酵液进行提取，获得1,3-丙二醇。
6.如权利要求5所述的一种生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，所述可生产1,3-丙二醇的菌株为肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae）。
7.如权利要求5~6任一所述的一种生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，所述发酵的温度为35~38℃。
8.如权利要求5~7任一所述的一种生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，所述发酵的转速为80~120 rpm。
9.权利要求1~4任一所述的培养基或权利要求5~8任一所述的方法在生产1,3-丙二醇方面的应用。
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