CN103772407A - 一种基于膜过滤技术的埃博霉素b分离提取方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，用大孔树脂对发酵液进行吸附，然后再将乙酸乙酯浸提吸附后的大孔树脂，收集浸提液；用超滤膜过滤浸提液：并用乙酸乙酯洗滤，合并滤液，浓缩后，使用制备型HPLC检测，对分离得到的埃博霉素B组分进行结晶，得到埃博霉素B。本发明条件温和，操作简便，分离步骤少，选择性好，可显著提高埃博霉素B的得率，能够提供更有利于工业化生产的条件。采用膜过滤和结晶相结合的方法，可有效地去除一些大分子杂质，同时避免使用有机试剂减少工业生产污染，避免了埃博霉素B在其它复杂制备流程中的损失，并且结晶使制得的埃博霉素B具有较高的纯度，具有更广阔的应用前景和经济效益。
Description
技术领域
本发明属于抗生素分离提取领域，涉及一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法。
背景技术
埃博霉素B(epothilone B)是一类大环内酯类化合物，分子式为C27H41NO6S，相对分子量为506.25，熔点为93℃-94℃，具有多种生物活性，可以作为抗生素药物，由德国国家生物技术中心(GBF)的G.
等人于1993年首次报道。
不久以后，Merck实验室在对7000种天然提取产物筛选紫杉醇类似物实验中，再次发现了埃博霉素。并且发现它具有与紫杉醇相同的作用机制，可以促进GTP(三磷酸鸟苷)依赖性微管蛋白聚合形成微管，并且对微管有稳定作用。证明了埃博霉素对肿瘤细胞有抑制作用的这个事实。进一步研究发现，埃博霉素具有比紫杉醇优越的抗肿瘤特性。①埃博霉素比紫杉醇水溶性好，结构简单，有利于化学合成埃博霉素及结构衍生化。②埃搏霉素没有紫杉醇细胞内毒素活性。③与紫杉醇不同，埃博霉素在P糖蛋白表达型的多药耐药性细胞中也维持很大的细胞毒性。④在Richard等研究的紫杉醇敏感的人类细胞系中，埃博霉素B比埃博霉素A和紫杉醇具有更大的抗增殖活性。所以，此抗癌药物可能成为紫杉醇更新换代的新产品，对其开发研究具有重要的意义。
目前已有一些对埃博霉素B分离提取报道的相关文献，如中国专利CN201310143836.2公开了一种发酵法制取埃博霉素B的方法，中国专利CN200610091035.6公开了埃博霉素B的制备方法和用途，等等。但都存在着一定的缺陷：其中用到的葡聚糖凝胶色谱（LH-20）等需要装柱，平衡，上样，洗脱等注意事项，步骤过于繁琐，使得操作的效率较低而过程费用较高，分离一次需要较长的时间，产物的得率较低。
随着生化分离技术的进步，各种先进的设备和工艺在生产中发挥越来越大的作用，特别是膜技术的发展和应用，使各种生化分离工艺大为改观。膜过滤技术用于发酵产品的分离精制已有成功的先例。但是利用膜分离技术分离提取埃博霉素B的方法，经检索还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，该方法具有条件温和，操作简便，分离步骤少，选择性好的特点，克服了现有技术存在的步骤繁琐，收率不高等缺陷，并且使制得的埃博霉素B具有较高的纯度。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌在液体培养基中进行发酵，并向液体培养基中加入经过处理的大孔树脂，发酵120-150h后过滤得到吸附树脂，然后用蒸馏水清洗除去吸附树脂表面粘附的菌体；其中，大孔树脂的加入量为液体培养基体积的2-5%；
（2）乙酸乙酯浸提：用乙酸乙酯浸提步骤（1）中经过蒸馏水清洗的吸附树脂，收集浸提液；
（3）用超滤膜过滤浸提液：将浸提液采用截留分子量为1000-5000的超滤膜过滤，去除大分子杂质得到粗提物；再将粗提物进行浓缩，得到浓缩液A；
（4）使用制备型HPLC检测：将浓缩液A进行离心，收集上清液，再用HPLC检测并合并埃博霉素B组分；
（5）结晶：将埃博霉素B组分进行真空浓缩，得到浓缩液B，将浓缩液B于-20～-10℃下进行低温结晶，得到白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。
所述步骤（1）中纤维堆囊菌菌株号为ATCC25532或ATCC25569。
所述步骤（1）中大孔树脂为XAD-16型大孔树脂，并且采用如下方法进行处理：首先，用3～5倍大孔树脂体积的甲醇浸泡大孔树脂，摇床震荡12h-16h后，除去甲醇，水洗至无甲醇味；再用甲醇浸泡12h-16h后，除去甲醇并水洗至无甲醇味。
所述步骤（1）中液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO4·7H2O2.3～2.5g/L，CaCl23.0～3.5g/L，EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2。
所述步骤（2）中乙酸乙酯的用量为大孔树脂体积的3～5倍，浸提的时间为24-48h。
所述步骤（3）中超滤膜的材质为聚砜、聚丙烯腈或聚酰胺。
所述步骤（3）中超滤膜过滤的操作压力为0.1-0.6MPa，温度为0-40℃，控制流速为5-10mL/min。
所述步骤（3）中真空浓缩的条件为：温度为40-45℃，真空度为-0.085～-0.09MPa。
所述步骤（4）中HPLC检测的参数:分析柱为反相C18，规格为4.6mm×250mm，填料粒径为5um；流动相:甲醇与水的体积比为65％:35％；流速:1mL/min；进样体积:20uL；检测波长:249nm；检测时间:25min。
所述步骤（4）中离心是在室温下以8000-10000rpm的转速离心10-15min。
所述步骤（3）中浓缩和步骤（5）中浓缩的温度为40～45℃，真空度为-0.085～-0.09MPa。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明采用膜过滤技术分离提取埃博霉素B，其条件温和，操作简便，分离步骤少，选择性好，可显著提高埃博霉素B的得率，能够提供更有利于工业化生产的条件，并且克服了现有技术存在的步骤繁琐，收率不高等缺陷。另外基于埃博霉素B这样一个分子量仅为506.25的小分子的特点，采用膜过滤和结晶相结合的方法，可有效地去除一些大分子杂质，同时避免使用有机试剂减少工业生产污染，更重要的是避免了埃博霉素B在其它复杂制备流程中的损失，并且结晶使制得的埃博霉素B具有较高的纯度，具有更广阔的应用前景和经济效益。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌菌株ATCC25532在液体培养基中进行发酵，并向2000mL液体培养基中加入液体培养基体积2%的经过处理的大孔树脂XAD-16，大孔树脂XAD-16存在于整个发酵流程之中，发酵150h后，过滤得到吸附树脂，然后用蒸馏水清洗除去吸附树脂表面粘附的菌体；其中，大孔树脂XAD-16采用如下方法进行处理：首先，用3倍大孔树脂XAD-16体积的甲醇浸泡大孔树脂XAD-16，摇床震荡12h后，除去甲醇，水洗至无甲醇味；再用甲醇浸泡16h后，除去甲醇并水洗至无甲醇味；液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO4·7H2O2.3～2.5g/L，CaCl23.0～3.5g/L，EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2。
（2）乙酸乙酯浸提：用3倍吸附树脂体积的乙酸乙酯浸提步骤（1）中经过蒸馏水清洗的吸附树脂24h，收集浸提液。
（3）用超滤膜过滤浸提液：将浸提液采用截留分子量为1000的超滤膜过滤，去除大分子杂质；并用50mL的乙酸乙酯洗滤1次，合并滤液，得粗提物；再将粗提物进行真空浓缩，得到浓缩液A；其中，其中超滤膜的材质为聚丙烯腈，超滤膜过滤的操作压力为0.6MPa，温度为20℃，控制流速为5mL/min；真空浓缩的条件为：温度为40℃，真空度为-0.085MPa。
（4）使用制备型HPLC检测：将浓缩液A进行在室温下以8000rpm的转速离心10min，收集上清液，对上清液再用HPLC检测并合并埃博霉素B组分；其中HPLC分析的基本参数:分析柱为反相C18(4.6mm×250mm;填料粒径5um)；流动相:甲醇与水的体积比为65％:35％（甲醇/水=65：35）；流速:1mL/min；进样体积:20uL；检测波长:249nm；检测时间:25min。
（5）结晶：将埃博霉素B组分在温度为40℃、真空度为-0.085MPa下进行真空浓缩，得到浓缩液B；将浓缩液B放入洁净的结晶器中于-20℃下进行低温结晶，在结晶皿底部可获得大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。
实施例2
（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌菌株ATCC25569在液体培养基中进行发酵，并向液体培养基中加入液体培养基体积4%的大孔树脂XAD-16，大孔树脂XAD-16存在于整个发酵流程之中，发酵120h后，过滤得到吸附树脂，然后用蒸馏水清洗除去吸附树脂表面粘附的菌体；其中，大孔树脂XAD-16采用如下方法进行处理：首先，用5倍大孔树脂XAD-16体积的甲醇浸泡大孔树脂XAD-16，摇床震荡14h后，除去甲醇，水洗至无甲醇味；再用甲醇浸泡12h后，除去甲醇并水洗至无甲醇味；所述步骤（1）中液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO4·7H2O2.3～2.5g/L，CaCl23.0～3.5g/L，EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2。
（2）乙酸乙酯浸提：用5倍吸附树脂体积的乙酸乙酯浸提步骤（1）中经过蒸馏水清洗的吸附树脂48h，收集浸提液。
（3）用超滤膜过滤浸提液：将浸提液采用截留分子量为2000的超滤膜过滤，去除大分子杂质；并用乙酸乙酯洗滤3次，每次50mL，合并滤液，得粗提物；再将粗提物进行真空浓缩，得到浓缩液A；其中超滤膜的材质为聚酰胺，超滤膜过滤的操作压力为0.4MPa，温度为40℃，控制流速为10mL/min；真空浓缩的条件为：温度为45℃，真空度为-0.09MPa。
（4）使用制备型HPLC检测：将浓缩液A在室温下以10000rpm的转速离心15min，收集上清液，再用HPLC检测并合并埃博霉素B组分；其中HPLC分析的基本参数:分析柱为反相C18(4.6mm×250mm;填料粒径5um)；流动相:甲醇与水的体积比为65％:35％；流速:1mL/min；进样体积:20uL；检测波长:249nm；检测时间:25min。
（5）结晶：将埃博霉素B组分在温度为45℃、真空度为-0.09MPa下进行真空浓缩，得到浓缩液B；将浓缩液B放入洁净的结晶器中于-15℃下进行低温结晶，在结晶皿底部可获得大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。
实施例3
（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌菌株ATCC25532在液体培养基中进行发酵，并向2000mL液体培养基中加入液体培养基体积5%的大孔树脂XAD-16，大孔树脂XAD-16存在于整个发酵流程之中，发酵130h后，过滤得到吸附树脂，然后用蒸馏水清洗除去吸附树脂表面粘附的菌体；其中，大孔树脂XAD-16采用如下方法进行处理：首先，用4倍大孔树脂XAD-16体积的甲醇浸泡大孔树脂XAD-16，摇床震荡16h后，除去甲醇，水洗至无甲醇味；再用甲醇浸泡14h后，除去甲醇并水洗至无甲醇味；所述步骤（1）中液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO4·7H2O2.3～2.5g/L，CaCl23.0～3.5g/L，EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2。
（2）乙酸乙酯浸提：用4倍吸附树脂体积的乙酸乙酯浸提步骤（1）中经过蒸馏水清洗的吸附树脂35h，收集浸提液。
（3）用超滤膜过滤浸提液：将浸提液采用截留分子量为5000的超滤膜过滤，去除大分子杂质；并用乙酸乙酯洗滤2次，每次50mL，合并滤液，得粗提物；再将粗提物进行真空浓缩，得到浓缩液A；其中，其中超滤膜的材质为聚砜，超滤膜过滤的操作压力为0.1MPa，温度为0℃，控制流速为7mL/min；真空浓缩的条件为：温度为42℃，真空度为-0.085MPa。
（4）使用制备型HPLC检测：将浓缩液A进行在室温下以9000rpm的转速离心12min，收集上清液，对上清液再用HPLC检测并合并埃博霉素B组分；其中HPLC分析的基本参数:分析柱为反相C18(4.6mm×250mm;填料粒径5um)；流动相:甲醇与水的体积比为65％:35％（甲醇/水=65：35）；流速:1mL/min；进样体积:20uL；检测波长:249nm；检测时间:25min。
（5）结晶：将埃博霉素B组分在温度为40℃、真空度为-0.085MPa下进行真空浓缩，得到浓缩液B；将浓缩液B放入洁净的结晶器中于-10℃下进行低温结晶，在结晶皿底部可获得大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。
膜过滤技术是一项新兴的高效分离技术，已被国际公认为20世纪末到21实际中期最有发展前途的一项重大高新生产技术。其中的超滤技术是用多孔性半透膜为介质，以错流方式进行过滤。超滤膜的孔径极小，能阻拦溶液中的各种微粒、胶体以及大分子溶质，已达到浓缩或净化除杂的目的。与通常的方法相比，超滤具有不经过相的转换、不需要添加化学试剂、滤膜不易堵塞和耐用等优点。
本发明提供了一种利用膜过滤技术分离提取埃博霉素B的新方法，其步骤是经大孔树脂吸附，蒸馏水清洗除去树脂表面粘附的菌体，乙酸乙酯解析后，得粗品；粗品首先经超滤膜除去大分子等杂质；再经制备型HPLC分析得埃博霉素B的组分；最后经过结晶得到埃博霉素B的晶体。本发明的方法具有：分离步骤少，选择性好等特点，克服了现有技术存在的步骤繁琐，收率不高等缺陷，具有更广阔的应用前景和经济效益。
本发明所提供的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法操作步骤简单易行，具有高效率，低成本，低污染，高纯度的优势，为埃博霉素B的分离提取奠定了实验基础。
Claims (10)
1.一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌在液体培养基中进行发酵，并向液体培养基中加入经过处理的大孔树脂，发酵120-150h后过滤得到吸附树脂，然后用蒸馏水清洗除去吸附树脂表面粘附的菌体；其中，大孔树脂的加入量为液体培养基体积的2-5%；
（2）乙酸乙酯浸提：用乙酸乙酯浸提步骤（1）中经过蒸馏水清洗的吸附树脂，收集浸提液；
（3）用超滤膜过滤浸提液：将浸提液采用截留分子量为1000-5000的超滤膜过滤以去除大分子杂质，得到粗提物；再将粗提物进行浓缩，得到浓缩液A；
（4）使用制备型HPLC检测：将浓缩液A进行离心，收集上清液，再用HPLC检测并合并埃博霉素B组分；
（5）结晶：将埃博霉素B组分进行真空浓缩，得到浓缩液B，将浓缩液B于-20～-10℃下进行低温结晶，得到白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。
2.根据权利要求1所述的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（1）中纤维堆囊菌菌株号为ATCC25532或ATCC25569。
3.根据权利要求1所述的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（1）中大孔树脂为XAD-16型大孔树脂，并且采用如下方法进行处理：首先，用3～5倍大孔树脂体积的甲醇浸泡大孔树脂，摇床震荡12h-16h后，除去甲醇，水洗至无甲醇味；再用甲醇浸泡12h-16h后，除去甲醇并水洗至无甲醇味。
4.根据权利要求1所述的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（1）中液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO4·7H2O2.3～2.5g/L，CaCl23.0～3.5g/L，EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2。
5.根据权利要求1所述的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（2）中乙酸乙酯的用量为大孔树脂体积的3～5倍，浸提的时间为24-48h。
6.根据权利要求1所述的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（3）中超滤膜的材质为聚砜、聚丙烯腈或聚酰胺。
7.根据权利要求1所述的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（3）中超滤膜过滤的操作压力为0.1-0.6MPa，温度为0-40℃，控制流速为5-10mL/min。
8.根据权利要求1所述的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（4）中HPLC检测的参数:分析柱为反相C18，规格为4.6mm×250mm，填料粒径为5um；流动相:甲醇与水的体积比为65％:35％；流速:1mL/min；进样体积:20uL；检测波长:249nm；检测时间:25min。
9.根据权利要求1所述的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（4）中离心是在室温下以8000-10000rpm的转速离心10-15min。
10.根据权利要求1所述的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（3）中浓缩和步骤（5）中浓缩的温度均为40～45℃，真空度均为-0.085～-0.09MPa。
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