CN103772407A - 一种基于膜过滤技术的埃博霉素b分离提取方法 - Google Patents
一种基于膜过滤技术的埃博霉素b分离提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103772407A CN103772407A CN201410032266.4A CN201410032266A CN103772407A CN 103772407 A CN103772407 A CN 103772407A CN 201410032266 A CN201410032266 A CN 201410032266A CN 103772407 A CN103772407 A CN 103772407A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- epothilone
- separating
- membrane filtration
- method based
- extracting method
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 63
- QXRSDHAAWVKZLJ-OXZHEXMSSA-N Epothilone B Natural products O=C1[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)CCC[C@@]2(C)O[C@H]2C[C@@H](/C(=C\c2nc(C)sc2)/C)OC(=O)C[C@H](O)C1(C)C QXRSDHAAWVKZLJ-OXZHEXMSSA-N 0.000 title claims abstract description 54
- HESCAJZNRMSMJG-HGYUPSKWSA-N epothilone A Natural products O=C1[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)CCC[C@H]2O[C@H]2C[C@@H](/C(=C\c2nc(C)sc2)/C)OC(=O)C[C@H](O)C1(C)C HESCAJZNRMSMJG-HGYUPSKWSA-N 0.000 title claims abstract description 54
- QXRSDHAAWVKZLJ-PVYNADRNSA-N epothilone B Chemical compound C/C([C@@H]1C[C@@H]2O[C@]2(C)CCC[C@@H]([C@@H]([C@@H](C)C(=O)C(C)(C)[C@@H](O)CC(=O)O1)O)C)=C\C1=CSC(C)=N1 QXRSDHAAWVKZLJ-PVYNADRNSA-N 0.000 title claims abstract description 54
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title abstract description 5
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 54
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 38
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 38
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 111
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 11
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 10
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 10
- 241000862997 Sorangium cellulosum Species 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 5
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 5
- 230000009514 concussion Effects 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- 238000007654 immersion Methods 0.000 claims description 5
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 5
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 5
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 claims description 5
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 5
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 5
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 3
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 claims description 3
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002386 leaching Methods 0.000 abstract 4
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 abstract 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 10
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical class O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 9
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 8
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 2
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- MQLACMBJVPINKE-UHFFFAOYSA-N 10-[(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)methylidene]anthracen-9-one Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1C=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=CC=CC=C21 MQLACMBJVPINKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033350 ATP-dependent translocase ABCB1 Human genes 0.000 description 1
- 108010047230 Member 1 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 1
- 238000010266 Sephadex chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000007888 toxin activity Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
- C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D493/04—Ortho-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，用大孔树脂对发酵液进行吸附，然后再将乙酸乙酯浸提吸附后的大孔树脂，收集浸提液；用超滤膜过滤浸提液：并用乙酸乙酯洗滤，合并滤液，浓缩后，使用制备型HPLC检测，对分离得到的埃博霉素B组分进行结晶，得到埃博霉素B。本发明条件温和，操作简便，分离步骤少，选择性好，可显著提高埃博霉素B的得率，能够提供更有利于工业化生产的条件。采用膜过滤和结晶相结合的方法，可有效地去除一些大分子杂质，同时避免使用有机试剂减少工业生产污染，避免了埃博霉素B在其它复杂制备流程中的损失，并且结晶使制得的埃博霉素B具有较高的纯度，具有更广阔的应用前景和经济效益。
Description
技术领域
本发明属于抗生素分离提取领域，涉及一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法。
背景技术
埃博霉素B(epothilone B)是一类大环内酯类化合物，分子式为C27H41NO6S，相对分子量为506.25，熔点为93℃-94℃，具有多种生物活性，可以作为抗生素药物，由德国国家生物技术中心(GBF)的G.
等人于1993年首次报道。
不久以后，Merck实验室在对7000种天然提取产物筛选紫杉醇类似物实验中，再次发现了埃博霉素。并且发现它具有与紫杉醇相同的作用机制，可以促进GTP(三磷酸鸟苷)依赖性微管蛋白聚合形成微管，并且对微管有稳定作用。证明了埃博霉素对肿瘤细胞有抑制作用的这个事实。进一步研究发现，埃博霉素具有比紫杉醇优越的抗肿瘤特性。①埃博霉素比紫杉醇水溶性好，结构简单，有利于化学合成埃博霉素及结构衍生化。②埃搏霉素没有紫杉醇细胞内毒素活性。③与紫杉醇不同，埃博霉素在P糖蛋白表达型的多药耐药性细胞中也维持很大的细胞毒性。④在Richard等研究的紫杉醇敏感的人类细胞系中，埃博霉素B比埃博霉素A和紫杉醇具有更大的抗增殖活性。所以，此抗癌药物可能成为紫杉醇更新换代的新产品，对其开发研究具有重要的意义。
目前已有一些对埃博霉素B分离提取报道的相关文献，如中国专利CN201310143836.2公开了一种发酵法制取埃博霉素B的方法，中国专利CN200610091035.6公开了埃博霉素B的制备方法和用途，等等。但都存在着一定的缺陷：其中用到的葡聚糖凝胶色谱（LH-20）等需要装柱，平衡，上样，洗脱等注意事项，步骤过于繁琐，使得操作的效率较低而过程费用较高，分离一次需要较长的时间，产物的得率较低。
随着生化分离技术的进步，各种先进的设备和工艺在生产中发挥越来越大的作用，特别是膜技术的发展和应用，使各种生化分离工艺大为改观。膜过滤技术用于发酵产品的分离精制已有成功的先例。但是利用膜分离技术分离提取埃博霉素B的方法，经检索还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，该方法具有条件温和，操作简便，分离步骤少，选择性好的特点，克服了现有技术存在的步骤繁琐，收率不高等缺陷，并且使制得的埃博霉素B具有较高的纯度。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌在液体培养基中进行发酵，并向液体培养基中加入经过处理的大孔树脂，发酵120-150h后过滤得到吸附树脂，然后用蒸馏水清洗除去吸附树脂表面粘附的菌体；其中，大孔树脂的加入量为液体培养基体积的2-5%；
（2）乙酸乙酯浸提：用乙酸乙酯浸提步骤（1）中经过蒸馏水清洗的吸附树脂，收集浸提液；
（3）用超滤膜过滤浸提液：将浸提液采用截留分子量为1000-5000的超滤膜过滤，去除大分子杂质得到粗提物；再将粗提物进行浓缩，得到浓缩液A；
（4）使用制备型HPLC检测：将浓缩液A进行离心，收集上清液，再用HPLC检测并合并埃博霉素B组分；
（5）结晶：将埃博霉素B组分进行真空浓缩，得到浓缩液B，将浓缩液B于-20～-10℃下进行低温结晶，得到白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。
所述步骤（1）中纤维堆囊菌菌株号为ATCC25532或ATCC25569。
所述步骤（1）中大孔树脂为XAD-16型大孔树脂，并且采用如下方法进行处理：首先，用3～5倍大孔树脂体积的甲醇浸泡大孔树脂，摇床震荡12h-16h后，除去甲醇，水洗至无甲醇味；再用甲醇浸泡12h-16h后，除去甲醇并水洗至无甲醇味。
所述步骤（1）中液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO4·7H2O2.3～2.5g/L，CaCl23.0～3.5g/L，EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2。
所述步骤（2）中乙酸乙酯的用量为大孔树脂体积的3～5倍，浸提的时间为24-48h。
所述步骤（3）中超滤膜的材质为聚砜、聚丙烯腈或聚酰胺。
所述步骤（3）中超滤膜过滤的操作压力为0.1-0.6MPa，温度为0-40℃，控制流速为5-10mL/min。
所述步骤（3）中真空浓缩的条件为：温度为40-45℃，真空度为-0.085～-0.09MPa。
所述步骤（4）中HPLC检测的参数:分析柱为反相C18，规格为4.6mm×250mm，填料粒径为5um；流动相:甲醇与水的体积比为65％:35％；流速:1mL/min；进样体积:20uL；检测波长:249nm；检测时间:25min。
所述步骤（4）中离心是在室温下以8000-10000rpm的转速离心10-15min。
所述步骤（3）中浓缩和步骤（5）中浓缩的温度为40～45℃，真空度为-0.085～-0.09MPa。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明采用膜过滤技术分离提取埃博霉素B，其条件温和，操作简便，分离步骤少，选择性好，可显著提高埃博霉素B的得率，能够提供更有利于工业化生产的条件，并且克服了现有技术存在的步骤繁琐，收率不高等缺陷。另外基于埃博霉素B这样一个分子量仅为506.25的小分子的特点，采用膜过滤和结晶相结合的方法，可有效地去除一些大分子杂质，同时避免使用有机试剂减少工业生产污染，更重要的是避免了埃博霉素B在其它复杂制备流程中的损失，并且结晶使制得的埃博霉素B具有较高的纯度，具有更广阔的应用前景和经济效益。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌菌株ATCC25532在液体培养基中进行发酵，并向2000mL液体培养基中加入液体培养基体积2%的经过处理的大孔树脂XAD-16，大孔树脂XAD-16存在于整个发酵流程之中，发酵150h后，过滤得到吸附树脂，然后用蒸馏水清洗除去吸附树脂表面粘附的菌体；其中，大孔树脂XAD-16采用如下方法进行处理：首先，用3倍大孔树脂XAD-16体积的甲醇浸泡大孔树脂XAD-16，摇床震荡12h后，除去甲醇，水洗至无甲醇味；再用甲醇浸泡16h后，除去甲醇并水洗至无甲醇味；液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO4·7H2O2.3～2.5g/L，CaCl23.0～3.5g/L，EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2。
（2）乙酸乙酯浸提：用3倍吸附树脂体积的乙酸乙酯浸提步骤（1）中经过蒸馏水清洗的吸附树脂24h，收集浸提液。
（3）用超滤膜过滤浸提液：将浸提液采用截留分子量为1000的超滤膜过滤，去除大分子杂质；并用50mL的乙酸乙酯洗滤1次，合并滤液，得粗提物；再将粗提物进行真空浓缩，得到浓缩液A；其中，其中超滤膜的材质为聚丙烯腈，超滤膜过滤的操作压力为0.6MPa，温度为20℃，控制流速为5mL/min；真空浓缩的条件为：温度为40℃，真空度为-0.085MPa。
（4）使用制备型HPLC检测：将浓缩液A进行在室温下以8000rpm的转速离心10min，收集上清液，对上清液再用HPLC检测并合并埃博霉素B组分；其中HPLC分析的基本参数:分析柱为反相C18(4.6mm×250mm;填料粒径5um)；流动相:甲醇与水的体积比为65％:35％（甲醇/水=65：35）；流速:1mL/min；进样体积:20uL；检测波长:249nm；检测时间:25min。
（5）结晶：将埃博霉素B组分在温度为40℃、真空度为-0.085MPa下进行真空浓缩，得到浓缩液B；将浓缩液B放入洁净的结晶器中于-20℃下进行低温结晶，在结晶皿底部可获得大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。
实施例2
（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌菌株ATCC25569在液体培养基中进行发酵，并向液体培养基中加入液体培养基体积4%的大孔树脂XAD-16，大孔树脂XAD-16存在于整个发酵流程之中，发酵120h后，过滤得到吸附树脂，然后用蒸馏水清洗除去吸附树脂表面粘附的菌体；其中，大孔树脂XAD-16采用如下方法进行处理：首先，用5倍大孔树脂XAD-16体积的甲醇浸泡大孔树脂XAD-16，摇床震荡14h后，除去甲醇，水洗至无甲醇味；再用甲醇浸泡12h后，除去甲醇并水洗至无甲醇味；所述步骤（1）中液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO4·7H2O2.3～2.5g/L，CaCl23.0～3.5g/L，EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2。
（2）乙酸乙酯浸提：用5倍吸附树脂体积的乙酸乙酯浸提步骤（1）中经过蒸馏水清洗的吸附树脂48h，收集浸提液。
（3）用超滤膜过滤浸提液：将浸提液采用截留分子量为2000的超滤膜过滤，去除大分子杂质；并用乙酸乙酯洗滤3次，每次50mL，合并滤液，得粗提物；再将粗提物进行真空浓缩，得到浓缩液A；其中超滤膜的材质为聚酰胺，超滤膜过滤的操作压力为0.4MPa，温度为40℃，控制流速为10mL/min；真空浓缩的条件为：温度为45℃，真空度为-0.09MPa。
（4）使用制备型HPLC检测：将浓缩液A在室温下以10000rpm的转速离心15min，收集上清液，再用HPLC检测并合并埃博霉素B组分；其中HPLC分析的基本参数:分析柱为反相C18(4.6mm×250mm;填料粒径5um)；流动相:甲醇与水的体积比为65％:35％；流速:1mL/min；进样体积:20uL；检测波长:249nm；检测时间:25min。
（5）结晶：将埃博霉素B组分在温度为45℃、真空度为-0.09MPa下进行真空浓缩，得到浓缩液B；将浓缩液B放入洁净的结晶器中于-15℃下进行低温结晶，在结晶皿底部可获得大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。
实施例3
（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌菌株ATCC25532在液体培养基中进行发酵，并向2000mL液体培养基中加入液体培养基体积5%的大孔树脂XAD-16，大孔树脂XAD-16存在于整个发酵流程之中，发酵130h后，过滤得到吸附树脂，然后用蒸馏水清洗除去吸附树脂表面粘附的菌体；其中，大孔树脂XAD-16采用如下方法进行处理：首先，用4倍大孔树脂XAD-16体积的甲醇浸泡大孔树脂XAD-16，摇床震荡16h后，除去甲醇，水洗至无甲醇味；再用甲醇浸泡14h后，除去甲醇并水洗至无甲醇味；所述步骤（1）中液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO4·7H2O2.3～2.5g/L，CaCl23.0～3.5g/L，EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2。
（2）乙酸乙酯浸提：用4倍吸附树脂体积的乙酸乙酯浸提步骤（1）中经过蒸馏水清洗的吸附树脂35h，收集浸提液。
（3）用超滤膜过滤浸提液：将浸提液采用截留分子量为5000的超滤膜过滤，去除大分子杂质；并用乙酸乙酯洗滤2次，每次50mL，合并滤液，得粗提物；再将粗提物进行真空浓缩，得到浓缩液A；其中，其中超滤膜的材质为聚砜，超滤膜过滤的操作压力为0.1MPa，温度为0℃，控制流速为7mL/min；真空浓缩的条件为：温度为42℃，真空度为-0.085MPa。
（4）使用制备型HPLC检测：将浓缩液A进行在室温下以9000rpm的转速离心12min，收集上清液，对上清液再用HPLC检测并合并埃博霉素B组分；其中HPLC分析的基本参数:分析柱为反相C18(4.6mm×250mm;填料粒径5um)；流动相:甲醇与水的体积比为65％:35％（甲醇/水=65：35）；流速:1mL/min；进样体积:20uL；检测波长:249nm；检测时间:25min。
（5）结晶：将埃博霉素B组分在温度为40℃、真空度为-0.085MPa下进行真空浓缩，得到浓缩液B；将浓缩液B放入洁净的结晶器中于-10℃下进行低温结晶，在结晶皿底部可获得大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。
膜过滤技术是一项新兴的高效分离技术，已被国际公认为20世纪末到21实际中期最有发展前途的一项重大高新生产技术。其中的超滤技术是用多孔性半透膜为介质，以错流方式进行过滤。超滤膜的孔径极小，能阻拦溶液中的各种微粒、胶体以及大分子溶质，已达到浓缩或净化除杂的目的。与通常的方法相比，超滤具有不经过相的转换、不需要添加化学试剂、滤膜不易堵塞和耐用等优点。
本发明提供了一种利用膜过滤技术分离提取埃博霉素B的新方法，其步骤是经大孔树脂吸附，蒸馏水清洗除去树脂表面粘附的菌体，乙酸乙酯解析后，得粗品；粗品首先经超滤膜除去大分子等杂质；再经制备型HPLC分析得埃博霉素B的组分；最后经过结晶得到埃博霉素B的晶体。本发明的方法具有：分离步骤少，选择性好等特点，克服了现有技术存在的步骤繁琐，收率不高等缺陷，具有更广阔的应用前景和经济效益。
本发明所提供的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法操作步骤简单易行，具有高效率，低成本，低污染，高纯度的优势，为埃博霉素B的分离提取奠定了实验基础。
Claims (10)
1.一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌在液体培养基中进行发酵，并向液体培养基中加入经过处理的大孔树脂，发酵120-150h后过滤得到吸附树脂，然后用蒸馏水清洗除去吸附树脂表面粘附的菌体；其中，大孔树脂的加入量为液体培养基体积的2-5%；
（2）乙酸乙酯浸提：用乙酸乙酯浸提步骤（1）中经过蒸馏水清洗的吸附树脂，收集浸提液；
（3）用超滤膜过滤浸提液：将浸提液采用截留分子量为1000-5000的超滤膜过滤以去除大分子杂质，得到粗提物；再将粗提物进行浓缩，得到浓缩液A；
（4）使用制备型HPLC检测：将浓缩液A进行离心，收集上清液，再用HPLC检测并合并埃博霉素B组分；
（5）结晶：将埃博霉素B组分进行真空浓缩，得到浓缩液B，将浓缩液B于-20～-10℃下进行低温结晶，得到白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。
2.根据权利要求1所述的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（1）中纤维堆囊菌菌株号为ATCC25532或ATCC25569。
3.根据权利要求1所述的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（1）中大孔树脂为XAD-16型大孔树脂，并且采用如下方法进行处理：首先，用3～5倍大孔树脂体积的甲醇浸泡大孔树脂，摇床震荡12h-16h后，除去甲醇，水洗至无甲醇味；再用甲醇浸泡12h-16h后，除去甲醇并水洗至无甲醇味。
4.根据权利要求1所述的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（1）中液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO4·7H2O2.3～2.5g/L，CaCl23.0～3.5g/L，EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2。
5.根据权利要求1所述的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（2）中乙酸乙酯的用量为大孔树脂体积的3～5倍，浸提的时间为24-48h。
6.根据权利要求1所述的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（3）中超滤膜的材质为聚砜、聚丙烯腈或聚酰胺。
7.根据权利要求1所述的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（3）中超滤膜过滤的操作压力为0.1-0.6MPa，温度为0-40℃，控制流速为5-10mL/min。
8.根据权利要求1所述的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（4）中HPLC检测的参数:分析柱为反相C18，规格为4.6mm×250mm，填料粒径为5um；流动相:甲醇与水的体积比为65％:35％；流速:1mL/min；进样体积:20uL；检测波长:249nm；检测时间:25min。
9.根据权利要求1所述的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（4）中离心是在室温下以8000-10000rpm的转速离心10-15min。
10.根据权利要求1所述的一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（3）中浓缩和步骤（5）中浓缩的温度均为40～45℃，真空度均为-0.085～-0.09MPa。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410032266.4A CN103772407B (zh) | 2014-01-23 | 2014-01-23 | 一种基于膜过滤技术的埃博霉素b分离提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410032266.4A CN103772407B (zh) | 2014-01-23 | 2014-01-23 | 一种基于膜过滤技术的埃博霉素b分离提取方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103772407A true CN103772407A (zh) | 2014-05-07 |
| CN103772407B CN103772407B (zh) | 2016-05-18 |
Family
ID=50565222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410032266.4A Expired - Fee Related CN103772407B (zh) | 2014-01-23 | 2014-01-23 | 一种基于膜过滤技术的埃博霉素b分离提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103772407B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106905338A (zh) * | 2017-03-07 | 2017-06-30 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种埃博霉素b的提纯方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106834377B (zh) * | 2017-03-07 | 2020-05-05 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种生产埃博霉素b的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006098585A1 (en) * | 2005-03-15 | 2006-09-21 | Sungkyunkwan University Foundation Corporate Collaboration | Method for preparing a useful secondary metabolite by effective elimination of biological by-products |
| CN102373252A (zh) * | 2011-11-04 | 2012-03-14 | 陕西科技大学 | 一种埃博霉素b的发酵生产工艺 |
| CN102586358A (zh) * | 2012-01-11 | 2012-07-18 | 湖北宏中药业有限公司 | 一种提高埃博霉素b产率的生物合成方法 |
| CN103243134A (zh) * | 2013-04-15 | 2013-08-14 | 陕西科技大学 | 一种基于埃博霉素b代谢途径的发酵生产方法 |
-
2014
- 2014-01-23 CN CN201410032266.4A patent/CN103772407B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006098585A1 (en) * | 2005-03-15 | 2006-09-21 | Sungkyunkwan University Foundation Corporate Collaboration | Method for preparing a useful secondary metabolite by effective elimination of biological by-products |
| CN102373252A (zh) * | 2011-11-04 | 2012-03-14 | 陕西科技大学 | 一种埃博霉素b的发酵生产工艺 |
| CN102586358A (zh) * | 2012-01-11 | 2012-07-18 | 湖北宏中药业有限公司 | 一种提高埃博霉素b产率的生物合成方法 |
| CN103243134A (zh) * | 2013-04-15 | 2013-08-14 | 陕西科技大学 | 一种基于埃博霉素b代谢途径的发酵生产方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 顾觉奋: "膜分离技术在微生物制药中的应用", 《中国抗生素杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106905338A (zh) * | 2017-03-07 | 2017-06-30 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种埃博霉素b的提纯方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103772407B (zh) | 2016-05-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101948450B (zh) | 一种生产制备奥利司他的方法 | |
| CN103333067A (zh) | 一种高纯度绿原酸的提取方法 | |
| CN102443012B (zh) | 一种从发酵液中提纯雷帕霉素的方法 | |
| CN109867663A (zh) | 一种用制备色谱分离金黄霉素a和金黄霉素b的方法 | |
| CN102070688A (zh) | 一种富集纯化淫羊藿中淫羊藿苷的方法 | |
| JP6592500B2 (ja) | フィダキソマイシンの精製方法 | |
| CN103772407B (zh) | 一种基于膜过滤技术的埃博霉素b分离提取方法 | |
| CN102093458A (zh) | 一种富集纯化桦树皮中白桦酯醇的方法 | |
| CN102093328B (zh) | 一种富集纯化松树皮中原花青素的方法 | |
| CN104557967A (zh) | 一种高纯度米尔贝霉素的生产方法 | |
| CN104402976B (zh) | 一种制备恩拉霉素精粉的方法 | |
| CN103815405B (zh) | 肉苁蓉提取物的生产系统 | |
| CN1321123C (zh) | 一种高纯度蛋黄脑磷脂的制备方法 | |
| CN103667387A (zh) | 一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素b的方法 | |
| CN103059159A (zh) | 一种啤酒酵母粉中甘露聚糖的提取工艺 | |
| CN102070685A (zh) | 一种富集纯化牛蒡中牛蒡苷的方法 | |
| CN105111286A (zh) | 一种高效制备纽莫康定b0的方法 | |
| CN108570016A (zh) | 一种pf1022a分离纯化的方法 | |
| CN109456146A (zh) | 一种从重组大肠杆菌发酵液中分离制备高纯度1,2,4-丁三醇的方法 | |
| CN101353294A (zh) | 高含量白藜芦醇分离纯化的方法 | |
| CN103772406B (zh) | 一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素b分离提取方法 | |
| CN102863433A (zh) | 莫匹罗星的一种纯化方法 | |
| CN101659692B (zh) | 制备棘球康定b的方法 | |
| CN101974014B (zh) | 一种从银杏树根皮中提取银杏内酯a、c的制作工艺 | |
| CN103788105B (zh) | 一种基于分子印迹吸附技术的埃博霉素b分离提取方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160518 |