CN102321684A

CN102321684A - 一种促进樟芝活性产物Antrodin C生物合成的发酵方法

Info

Publication number: CN102321684A
Application number: CN201110303813A
Authority: CN
Inventors: 许赣荣; 夏永军; 喻学淳
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2011-10-09
Filing date: 2011-10-09
Publication date: 2012-01-18
Anticipated expiration: 2031-10-09
Also published as: CN102321684B

Abstract

本发明公开了一种促进樟芝活性产物Antrodin C生物合成的发酵方法包括：斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵，其中深层液态发酵采用两阶段控制，第一阶段控制溶氧在20％以上，第二阶段控制溶氧在6-15％，发酵温度为18℃-28℃；此外，还可采用溶氧与pH相协同的发酵方法，通过两阶段pH及溶氧混合控制，能显著促进樟芝活性产物Antrodin C的合成，最高含量达271.8mg/L。本发明所提供控制技术工艺简单、高效，有着重要的工业应用价值，同时对樟芝其他活性代谢产物的生产具有一定的启迪意义。

Description

一种促进樟芝活性产物Antrodin C生物合成的发酵方法

技术领域

本发明涉及一种促进樟芝活性产物Antrodin C生物合成的发酵方法，尤其是一种通过两阶段溶氧或溶氧与pH相结合的策略提高活性产物Antrodin C生物合成的方法。

技术背景

樟芝(Antrodia camphorata)属于多孔菌科、薄孔菌属，是我国台湾特有的珍稀药用真菌。长期以来，樟芝被用作解酒保肝的传统药，用于治疗肝脏疾病，食物和药物所引起的中毒症状以及腹泻，腹痛，高血压，皮肤发庠和肿瘤疾病等。大量文献研究表明，樟芝具有保肝、保护神经系统、抗高血压高血脂、抗病毒、抗炎症、抗肿瘤、调节免疫等生物活性。

由于樟芝的寄主专一性特别强，而其唯一寄主牛樟树非常稀少且生长缓慢，樟芝野生子实体非常难得，而椴木栽培法生长周期长，产量低，难以弥补市场的巨大需求。因此，发酵法生产樟芝活性产物将是一种有效地方法。目前通过樟芝细胞深层液态发酵已较成功的实现了樟芝菌体快速人工培养。现代研究表明，樟芝液态发酵产物在治疗各种肝病方面具有较好的功效。Nakamura(NAKAMURA N，HIRAKAWA A，SHEU C C，et al.Five New Maleic and Succinic Acid Derivatives from the Mycelium of Antrodia camphorata and Their Cytotoxic Effects on LLC Tumor Cell Line[J].Journal of Nature product，67：46-48.)等人从樟芝液态发酵菌体中分离得到五种新的马来酸和琥珀酸衍生物(Antrodin A-E)，是液态发酵樟芝菌体中的主要活性成分，具有显著的抗肝炎活性，其中Antrodin B和Antrodin C对LLC癌症细胞具有良好的抑制效果。Phuong(PHUONG T，MA C M，HATTORI M，et al.Inhibitory effects of antrodins A-E from Antrodia camphorata and their metabolites on hepatitis C virus protease[J].Phytother Res，2009，23(4)：582-584.)研究结果显示樟芝菌丝体中含有的Antrodin A-E对HCV病毒都具有很好的抑制活性，其中Antrodin A抑制能力最高；研究同时发现在体内Antrodin C可以转化为Antrodin A，从而展现良好的保肝活性。Lee(Lee TH，Lee CK，Tsou WL，et al.A New Cytotoxic Agent from Solid-state Fermented Mycelium of Antrodia camphorata[J].Planta Letter，2007.)等人用正己烷萃取樟芝固态发酵粉末，得到一个新化合物(Antroquinonol)，属于泛醌类化合物，实验表明对乳腺癌、肝癌和前列腺癌等多种癌细胞具有良好的抗癌效果，同时具有抑制HBsAg和HBeAg合成的潜力，从而抑制HBV的复制。

Shu(SHU C H，LUNG M Y.Effect of pH on the production and molecular weight distribution of exopolysaccharide by Antrodia camphorata in batch cultures[J].Process Biochemistry，2004，39：

931-937.)等人报道了两阶段pH控制对樟芝液态发酵的影响，但该方法只报道了胞外多糖的生产情况，所公开的最大胞外多糖产量为148mg/L。Shih(SHIH I L，PAN K，HSIEH C.Influence of nutritional components and oxygen supply on the mycelial growth and bioactive metabolites production in submerged culture of Antrodia cinnamomea[J].Process Biochemistry，2006，41：1129-1135.)等报道了培养基组成和溶氧对樟芝液态发酵的影响，但是该方法主要研究了对樟芝胞内多糖和胞外多糖合成的影响。同时，上述方法并没有根据樟芝细胞生长和产外核层所需要的环境条件(如pH和溶氧)的差异性，采用相应的组合控制策略分别促进樟芝细胞生长和产物合成。

公开号为CN1456661A(发明名称：樟芝大规模液体深层发酵生产工艺)、CN101803528A(一种樟芝菌丝体的新颖培养方法)等专利文献公开了一系列的通过发酵法生产樟芝的细胞培养方法，但上述文献中所公开的细胞培养产物均为樟芝菌丝体或是多糖，并没有关于樟芝菌丝体特征活性产物Antrodin(A-E)类化合物的生产方法报道，也没有关于诱导产生Antroquinonol类化合物的调控方法报道。由于富含生理活性物质的樟芝产品的需求与日俱增，急需一种特殊的大规模人工培养樟芝的方法，该方法可以有针对性地提高樟芝特征活性产物Antrodins和Antroquinonol类化合物的含量，以提高樟芝产品品质，满足市场的不断更新发展。而根据我们查新报告表明，目前并没有关于樟芝特征活性产物Antrodins和Antroquinonol的培养方法及过程优化的报道。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是提供一种促进樟芝活性产物Antrodin C生物合成的发酵方法，以显著提高樟芝特征活性产物Antrodin C的产量。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案包括：斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵，其中深层液态发酵采用两阶段控制，第一阶段控制溶氧在20％以上，第二阶段控制溶氧在6-15％，发酵温度为18℃-28℃。

所述第一阶段的培养时间为0-5天。

为更好的解决技术问题，还可将溶氧两阶段控制策略与pH两阶段控制相结合，第一阶段pH值控制为3.0-4.5，第二阶段pH值控制为4.5-7.0，优选为4.5-6.0。

本发明中，所述的樟芝斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养可以是已知的任何一种适合樟芝生长的培养基和培养条件，液体深层发酵所用到的培养基组成成分也是适合樟芝培养的培养基。

作为参考：

所述的斜面培养基是PDA(potato dextrose agar)：樟芝斜面菌种培养条件是：培养温度28℃，培养时间为12天。

所述的一级液体种子培养基为(g/L)：葡萄糖20，Na₂HPO₄ 0.5，MgSO₄0.5，柠檬酸0.5，黄豆粉4，玉米浆粉2。一级液体种子培养条件为：培养温度28℃，摇床转速100r/min，培养时间4d。

所述的二级液体种子培养基为(g/L)：葡萄糖20，Na₂HPO₄ 0.5，MgSO₄0.5，柠檬酸0.5，黄豆粉4，玉米浆粉2。二级液体种子培养条件为：培养温度28℃，摇床转速100r/min。

所述的液体深层发酵培养基为(g/L)：葡萄糖60，Na₂HPO₄ 0.5，MgSO₄0.5，黄豆粉8，玉米浆粉2。液体深层发酵温度条件：28℃。

所述的樟芝菌株来源于台资企业上海福茂食用菌有限公司。菌种来源可参考中国专利：201010164142.3，已公开。

Antrodin C采用高效液相色谱法(HPLC)进行分析。取粉碎的樟芝固态发酵粉末0.5g，加入60ml乙醇，50℃，振荡萃取1.5h，静置后取上清经过0.22μm滤膜微滤，进行HPLC分析。分析条件如下：色谱柱：Sepax Amethyst C18(4.6mm×250mm)；流速：1mL/min；检测波长：254nm；流动相A：水/乙酸＝100/0.5，流动相B：乙腈；洗脱梯度如下：0-10min，流动相B 35％-50％；10-35min，流动相B 50％-60％；35-50min，流动相B 60％-80％；50-60min，流动相B 80％-100％。

本发明提供的技术方案技术工艺简单、高效，能显著提高樟芝菌体特征活性产物AntrodinC的产量，同时可诱导Antroquinonol类化合物合成，有着重要的工业应用价值，同时对樟芝其他活性代谢产物的生产具有一定的启迪意义。

具体实施方式：

实施例1

本实验旨在考察樟芝液态发酵过程中不控制溶氧浓度和pH值时，其对樟芝细胞生长及活性产物合成的影响。

1、樟芝斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养按照以下培养基和培养条件进行：

所述的斜面培养基是PDA(potato dextrose agar)；樟芝斜面菌种培养条件是：培养温度28℃，培养时间为12天。

所述的一级液体种子培养基为(g/L)：葡萄糖20，Na₂HPO₄ 0.5，MgSO₄ 0.5，柠檬酸0.5，黄豆粉4，玉米浆粉2。一级液体种子培养条件为：培养温度28℃，摇床转速100r/min，培养时间4d。

所述的二级液体种子培养基为(g/L)：葡萄糖20，Na₂HPO₄ 0.5，MgSO₄ 0.5，柠檬酸0.5，黄豆粉4，玉米浆粉2。二级液体种子培养条件为：培养温度28℃，摇床转速100r/min。

2、液体深层发酵：

在5L机械搅拌式生物反应器中进行液体深层发酵。所述的液体深层发酵培养基为(g/L)：葡萄糖60，Na₂HPO₄ 0.5，MgSO₄ 0.5，黄豆粉8，玉米浆粉2。液体深层发酵温度条件：28℃。实验结果显示，最大生物量为14.2g/L，Antrodin C最大含量为169.5mg/L，没有检测得到Antroquinonol。

实施例2

本实验旨在考察液态发酵体系采用溶氧两阶段控制时对樟芝细胞生长及活性产物合成的影响。

本实施例中，樟芝斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养以及深层液态发酵完全同实施例1；在发酵的第一阶段(前5天)控制溶氧浓度在20％，在发酵的第二阶段(第5天起)控制溶氧浓度在10％，控制发酵温度为28℃。用此溶氧两阶段控制培养樟芝，最大生物量为13.7g/L，Antrodin C最大含量为217.3mg/L，检测诱导产生Antroquinonol，其含量为13.4mg/L。

实施例3

本实施例中，樟芝斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养以及深层液态发酵完全同实施例1；在发酵的第一阶段(前5天)控制溶氧浓度在20％以上，在发酵的第二阶段(第5天起)控制溶氧浓度在6％，控制发酵温度为18℃。用此溶氧两阶段控制培养樟芝，最大生物量为11.2g/L，Antrodin C最大含量为173.6mg/L，检测诱导产生Antroquinonol，其含量为5.3mg/L。

实施例4

本实施例中，樟芝斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养以及深层液态发酵完全同实施例1；在发酵的第一阶段(前5天)控制溶氧浓度在20％，在发酵的第二阶段(第5天起)控制溶氧浓度在15％，控制发酵温度为28℃。用此溶氧两阶段控制培养樟芝，最大生物量为12.6g/L，Antrodin C最大含量为239.7g/L，检测诱导产生Antroquinonol，其含量为11.5mg/L。

实施例5

本实验旨在考察液态发酵体系采用pH两阶段控制时对樟芝细胞生长及活性产物合成的影响。

本实施例中，樟芝斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养以及深层液态发酵完全同实施例1；在发酵的第一阶段(前5天)控制发酵液pH在4.0，在发酵的第二阶段(第5天起)控制发酵液pH在4.5，控制发酵温度为25℃。用此pH两阶段控制培养樟芝，最大生物量为12.4g/L，Antrodin C最大含量为197.3mg/L，检测诱导产生Antroquinonol，其含量为6.4mg/L。

实施例6

本实验旨在考察液态发酵体系将溶氧两阶段和pH两阶段控制协同在一起时对樟芝细胞生长及活性产物合成的影响。

本实施例中，樟芝斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养以及深层液态发酵完全同实施例1；在发酵的第一阶段(前5天)控制发酵液pH在4.0，同时控制发酵液的溶氧浓度为20％；在发酵的第二阶段(第5天起)控制发酵液pH在4.5，同时控制发酵液的溶氧浓度为10％，控制发酵温度为20℃。用此溶氧两阶段和pH两阶段协同控制培养樟芝，最大生物量为12.7g/L，Antrodin C最大含量为243.6mg/L，检测诱导产生Antroquinonol，其含量为16.3mg/L。

实施例7

本实施例中，樟芝斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养以及深层液态发酵完全同实施例1；在发酵的第一阶段(前5天)控制发酵液pH在4.0，同时控制发酵液的溶氧浓度为20％；在发酵的第二阶段(第5天起)控制发酵液pH在6.0，同时控制发酵液的溶氧浓度为10％，控制发酵温度为27℃。用此溶氧两阶段和pH两阶段协同控制培养樟芝，最大生物量为12.1g/L，Antrodin C最大含量为271.8mg/L，检测诱导产生Antroquinonol，其含量为12.2mg/L。

实施例8

本实施例中，樟芝斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养以及深层液态发酵完全同实施例1；在发酵的第一阶段(前5天)控制发酵液pH在4.0，同时控制发酵液的溶氧浓度为20％；在发酵的第二阶段(第5天起)控制发酵液pH在7.0，同时控制发酵液的溶氧浓度为10％，控制发酵温度为18℃。用此溶氧两阶段和pH两阶段协同控制培养樟芝，最大生物量为10.3g/L，Antrodin C最大含量为229.4mg/L，检测诱导产生Antroquinonol，其含量为9.3mg/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种促进樟芝活性产物Antrodin C生物合成的发酵方法，其特征在于采用溶氧两阶段控制的液体深层发酵，第一阶段控制溶氧在20％以上，第二阶段控制溶氧在6-15％，发酵温度为18℃-28℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于第一阶段的培养时间为0-5天。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于还包括pH两阶段控制，第一阶段pH值控制为3.0-4.5，第二阶段pH值控制为4.5-7.0。

4.权利要求3所述的方法，其特征在于所述第二阶段pH值优选为4.5-6.0。

5.权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述液体深层发酵的培养基组成为(g/L)：葡萄糖60，Na₂HPO₄0.5，MgSO₄0.5，黄豆粉8，玉米浆粉2。