CN113046399A - 一种添加微粒促进牛樟芝液态发酵生产活性物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进牛樟芝液态发酵生产活性物质的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明接种牛樟芝种子培养液于液态发酵培养液后，在20‑35℃发酵7‑21d，其在发酵后的第0h向发酵培养液中添加2g/L的滑石粉，以促进牛樟芝在生长过程中合成活性物质Antrodin C和Antroquinonol。本发明通过这种有效调控，可以提高牛樟芝液态发酵Antrodin C和Antroquinonol的生物合成能力，仅通过较低的成本投入，就可显著提高发酵合成目标产物的浓度，方便实用，且具有很高的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种添加微粒促进牛樟芝液态发酵生产活性物质的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
牛樟芝，又名樟芝、牛樟菇等，是一种中国台湾特有的珍稀食药两用真菌，素有森林红宝石之称。在民间，牛樟芝作为传统珍贵药材，具有解酒保肝，治疗中毒及肿瘤疾病等功效。近年来，学者已从牛樟芝中分离纯化出了近百种生理活性物质，主要可分为三萜类化合物、多糖类化合物、泛醌类衍生物以及马来酸和琥珀酸衍生物等几大类。
Antrodin C属于马来酸以及琥珀酸衍生物，具有很好的抗癌和保肝的活性，是继1968年 Wagner发现水飞蓟素以来，在天然物中发现的具有超过水飞蓟素保肝活性的物质。Antroquinonol是牛樟芝中最重要的泛醌衍生物之一，具有很强的生物活性，可用于治疗多种癌细胞，包括肝癌，白血病，肺癌，乳腺癌和胰腺癌等，已完成FDA二期临床实验，因此它们都具有很好的应用前景，但由于Antrodin C和Antroquinonol是牛樟芝胞内产物且不易透过细胞膜分泌至胞外，存在产物抑制作用，普通液态发酵中它们的产量较低。已有研究者通过液态发酵条件优化、添加原位萃取剂、氧化胁迫等调控方式，在一定程度上提高了Antrodin C 和Antroquinonol的产量，但仍存在产物后处理困难，添加成本较高，及产量依旧较低等问题。
虽然，记载于公开号为CN108374029B的中国发明专利文本中，以添加氧化胁迫剂以提高Antrodin C的产量，但是，氧化胁迫剂有些存在一定的细胞毒性，有些易燃易爆，在使用过程存在安全性问题。
因此，关于如何进一步提高牛樟芝液态发酵中活性物质的产量并减小发酵成本，仍有很多问题需要进一步解决。
发明内容
技术问题：
本发明要解决的技术问题是：提供一种提高牛樟芝液态发酵中活性物质的产量并减小发酵成本。
技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种采用牛樟芝发酵生产活性物质的方法，将牛樟芝接种至发酵培养基中，在发酵0-168h添加微粒；所述微粒包括四氧化三铁、滑石粉、二氧化钛、二氧化硅、氧化铝。
本发明的原理为：微粒的添加可以使发酵过程存在菌体-粒子碰撞，会影响菌体的形态，影响细胞完整性和通透性等方面，最终影响代谢产物的合成，并且，添加微粒比较的安全。
在本发明的一种实施方式中，所述活性物质为Antrodin C或Antroquinonol。
在本发明的一种实施方式中，所述微粒的粒径为2-38μm。
在本发明的一种实施方式中，所述微粒的添加量为1-12g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基包括：葡萄糖20～120g/L、大豆水解液 20～80mL/L、玉米浆粉5～26g/L、硫酸镁0.5～1.5g/L，磷酸氢二钾0.5～1.5g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述大豆水解液为质量分数为10-30％w/v的大豆，40～50℃水解3～5h后所制备得到的。
在本发明的一种实施方式中，发酵条件为100～180r/min，20～35℃培养7～21d，初始pH 3～8。
在本发明的一种实施方式中，是将牛樟芝种子液接种至发酵培养基中，所述种子液按照 10～30％(v/v)的接种比例接种至发酵培养基中。
在本发明的一种实施方式中，所述牛樟芝种子液的制备方法如下：
(1)牛樟芝菌种活化：牛樟芝接种于PDA加富培养基斜面，28℃避光培养7-14d。
(2)牛樟芝种子液制备：用50mL无菌水将PDA加富培养基斜面上的牛樟芝孢子洗下，用玻璃珠打散后镜检，使孢子数达1×106个/mL；吸取15mL牛樟芝孢子悬浮液到装有135mL 的液态种子培养基中，在130r/min，28℃，培养4d得牛樟芝种子液。
在本发明的一种实施方式中，所述PDA加富培养基的成分为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、鱼粉蛋白胨5g、MgSO4 0.5g、K2HPO4 0.5g。
在本发明的一种实施方式中，所述液态种子培养基：葡萄糖20g/L、大豆水解液20mL/L、玉米浆粉16g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、柠檬酸0.5g/L。
在本发明的一种实施方式中芝已于2020年在论文《Oxidative stress inductionis a rational strategy to enhance the productivity of Antrodia cinnamomeafermentations for the antioxidant secondary metabolite Antrodin C》中公开，申请人承诺自申请日起20年内向公众发放该菌株。
本发明还提供了一种微粒在促进牛樟芝发酵生产活性物质中的应用，所述应用为，在牛樟芝发酵过程中添加微粒，所述微粒包括四氧化三铁、滑石粉、二氧化钛、二氧化硅、氧化铝。
在本发明的一种实施方式中，所述活性物质为Antrodin C或Antroquinonol。
本发明还提供所述方法在制备以牛樟芝为发酵微生物的产品方面的应用。
有益效果
(1)本发明是通过外加一定浓度的微粒，刺激牛樟芝摇瓶发酵过程中产生次级代谢产物 Antrodin C，相比普通摇瓶发酵而言，能够使Antrodin C的产量由541.7mg/L提高至1615.7 mg/L，提升了198.3％；使Antroquinonol的产量由5.5mg/L提高至35.8mg/L，提升了582.7％。此外，本发明具有成本低，操作性简便等优点。
(2)本发明针对常规液态发酵产Antrodin C及Antroquinonol产量低的问题，提供了一种新的代谢调控方式，在提升Antrodin C及Antroquinonol产量的同时减少了因使用原位萃取剂以及氧载体所产生的外加费用，具有良好的应用性。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的培养基如下：
液态种子液培养基：葡萄糖20g/L、大豆水解液20mL/L、玉米浆粉16g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、柠檬酸0.5g/L。
PDA加富培养基：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L、鱼粉蛋白胨5g/L、MgSO40.5g/L、K2HPO4 0.5g/L。
下述实施例中所涉及的提取及检测方法如下：
Antrodin C和Antroquinonol提取方法：将发酵所得牛樟芝球用4层纱布过滤，用去离子水洗至无色，在45℃烘箱中烘干至恒重，用研磨将其磨成粉末状，用50mL具塞试管中添加95％乙醇至刻度线并于55℃水浴锅中振荡萃取90min后取出，上下振荡2～3次，冷却至室温后取1mL用0.22μm的有机微孔滤膜过滤，作为待测液。
Antrodin C和Antroquinonol测定方法：将待测液进行高效液相色谱(HPLC)法检测，具体检测条件如下：
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6mm×25mm，5μm)；流速：1mL/min；柱温:28℃；进样量：20μL；紫外检测波长：254nm；流动相A：水/乙酸＝100/0.5(v/v)，流动相B：已腈；洗脱梯度：0-10min，流动相B：35-50％；10-25min，流动相B：50-57％；25-50min，流动相B：57-70％；50-55min，流动相B：70-90％；55-70min，流动相B：90-100％。Antrodin C的保留时间：30-33min，Antroquinonol的保留时间：55-58min。
实施例1：牛樟芝种子液的制备
具体步骤如下：
(1)牛樟芝菌种活化：
将牛樟芝接种于PDA加富培养基斜面，28℃避光培养7-14d；
(2)牛樟芝种子液制备：
用50mL无菌水将PDA加富培养基斜面上的牛樟芝孢子洗下，用玻璃珠打散后镜检，使孢子数达1×106个/mL，制备得到牛樟芝孢子悬浮液；
吸取15mL牛樟芝孢子悬浮液到装有135mL的液态种子培养基中，在130r/min，28℃，培养4d，培养至对数生长期，镜检孢子数达1×106个/mL，得牛樟芝的种子液。
实施例2：添加不同微粒发酵生产Antrodin C
(1)将实施例1制备得到的牛樟芝种子液，按照体积比10％的接种量接入装有90mL发酵培养基的500mL三角瓶中；
发酵培养基为：葡萄糖70g/L、大豆水解液60mL/L、玉米浆粉8g/L、硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，初始pH为5.6，其中大豆水解液为质量分数为10-30％w/v的大豆，40～50℃水解3～5h后所制备得到的。
(2)分别向步骤(1)的装有发酵培养基的三角瓶中添加终浓度均为4g/L的四氧化三铁(粒径为5μm)、滑石粉(粒径为5μm)、二氧化钛(粒径为5μm)、二氧化硅(粒径为5μm)、氧化铝(粒径为5-6μm)，分别得到发酵体系；
(3)分别将上述发酵体系在转速为130r/min，温度28℃条件下培养，摇瓶发酵培养10 d后收集菌体，提取并测定Antrodin C含量；结果如表1所示，其中，对照组为除了不添加微粒之外，其他条件相同的组。
结果显示，Antrodin C含量分别为816.0mg/L、918.3mg/L、772.4mg/L、868.8mg/L、650.5mg/L，对比对照组产量分别提高了40.6％、58.2％、33.1％、49.7％、12.1％。
表1添加不同微粒对牛樟芝液态发酵产Antrodin C的影响
实施例3：添加不同粒径的微粒发酵生产Antrodin C
(1)将实施例1制备得到的牛樟芝种子液，按照体积比10％的接种量接入装有90mL发酵培养基的500mL三角瓶中；
发酵培养基为：葡萄糖70g/L、大豆水解液60mL/L、玉米浆粉8g/L、硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，初始pH为5.6，其中大豆水解液为质量分数为10-30％w/v的大豆，40～50℃水解3～5h后所制备得到的。
(2)分别向步骤(1)的装有发酵培养基的三角瓶中添加终浓度为4g/L的SiO2，粒径分别为2μm、5μm、10μm、18-23μm，分别得到发酵体系；
分别向步骤(1)的装有发酵培养基的三角瓶中添加终浓度为4g/L的滑石粉，粒径分别为2.6μm、5μm、6.5μm、18μm、38μm，分别得到发酵体系；
(3)分别将上述发酵体系在转速为130r/min，温度28℃条件下培养，摇瓶发酵培养10 d后收集菌体，提取并测定AntrodinC含量，结果如表2～3所示，其中，对照组为除了不添加微粒之外，其他条件相同的组。
结果显示，添加SiO2的发酵组AntrodinC产量分别为770.3mg/L、866.7mg/L、729.0mg/L、820.0mg/L，对比对照组Antrodin C产量分别提高了34.8％、51.6％、27.5％、43.5％；
添加滑石粉的发酵组Antrodin C产量分别为979.8mg/L、921.3mg/L、885.8mg/L、1221.3 mg/L、1149.0mg/L，对比对照组Antrodin C产量分别提高了71.4％、61.2％、55.0％、113.7％、 101.0％。
表2添加不同粒径的SiO2对牛樟芝液态发酵产Antrodin C的影响
表3添加不同粒径的滑石粉对牛樟芝液态发酵产Antrodin C的影响
实施例4：添加不同浓度的滑石粉发酵生产Antrodin C
(1)将实施例1制备得到的牛樟芝种子液，按照体积比10％的接种量接入装有90mL发酵培养基的500mL三角瓶中；
发酵培养基为：葡萄糖70g/L、大豆水解液60mL/L、玉米浆粉8g/L、硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，初始pH为5.6，其中大豆水解液为质量分数为10-30％w/v的大豆，40～50℃水解3～5h后所制备得到的。
(2)分别向步骤(1)的装有发酵培养基的三角瓶中添加18μm的滑石粉，终浓度分别为1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L、12g/L，得到发酵体系；
(3)将上述发酵体系在转速为130r/min，温度28℃条件下培养，摇瓶发酵培养10d后收集菌体，提取并测定Antrodin C含量；结果如表4所示，其中，对照组为除了不添加微粒之外，其他条件相同的组。
结果显示，Antrodin C含量分别为595.6mg/L、1608.5mg/L、1268.1mg/L、1197.0mg/L、 1214.3mg/L、1048.7mg/L、1048.9mg/L，对比对照组，Antrodin C产量分别提高了0.8％、172.3％、114.7％、102.6％、105.6％、77.5％、77.6％。
表4添加不同浓度的18μm滑石粉对牛樟芝液态发酵产Antrodin C的影响
实施例5：不同添加时间添加滑石粉发酵生产Antrodin C
(1)将实施例1制备得到的牛樟芝种子液，按照体积比10％的接种量接入装有90mLmL发酵培养基的500mL三角瓶中；
发酵培养基为：葡萄糖70g/L、大豆水解液60mL/L、玉米浆粉8g/L、硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，初始pH为5.6，其中大豆水解液为质量分数为10-30％w/v的大豆，40～50℃水解3～5h后所制备得到的。
(2)分别向步骤(1)的装有发酵培养基的三角瓶中在发酵开始后的第0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h添加终浓度为2g/L的18μm的滑石粉，分别得到发酵体系；
(3)分别将上述发酵体系在转速为130r/min，温度28℃条件下培养，摇瓶发酵培养10 d后收集菌体，提取并测定Antrodin C含量，结果如表5所示，其中，对照组为除了不添加微粒之外，其他条件相同的组。
结果显示，Antrodin C含量分别为1615.7mg/L、1032.2mg/L、1032.2mg/L、830.3mg/L、 729.2mg/L、762.2mg/L、933.0mg/L、877.5mg/L，对比对照组Antrodin C产量分别提高了 198.3％、90.5％、53.3％、34.6％、40.7％、72.2％、62.0％。
表5滑石粉的不同添加时间对牛樟芝液态发酵产Antrodin C的影响
实施例6：添加滑石粉对牛樟芝液态发酵产Antrodin C和Antroquinonol的影响
(1)将实施例1制备得到的牛樟芝种子液，按照体积比10％的接种量接入装有90mLmL发酵培养基的500mL三角瓶中；
发酵培养基为：葡萄糖70g/L、大豆水解液60mL/L、玉米浆粉8g/L、硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，初始pH为5.6，其中大豆水解液为质量分数为10-30％w/v的大豆，40～50℃水解3～5h后所制备得到的。
(2)分别向步骤(1)的装有发酵培养基的三角瓶中在发酵开始后的第0h添加终浓度为2g/L的18μm的滑石粉，得到发酵体系；
(3)将上述发酵体系在转速为130r/min，温度28℃条件下培养，摇瓶发酵培养10d后收集菌体，提取并测定Antrodin C和Antroquinonol含量，结果如表6所示，其中，对照组为除了不添加微粒之外，其他条件相同的组；
对照组Antrodin C产量为：561.2mg/L，Antroquinonol产量为：5.5mg/L。
表6添加2g/L 18μm滑石粉对牛樟芝液态发酵产Antrodin C和Antroquinonol的影响
结果显示，Antrodin C和Antroquinonol含量分别为1670.9mg/L和35.8mg/L，对比对照组Antrodin C和Antroquinonol含量分别提高了197.7％和582.7％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种采用牛樟芝发酵生产活性物质的方法，其特征在于，将牛樟芝接种至发酵培养基中，在发酵0～168h添加微粒；所述微粒包括四氧化三铁、滑石粉、二氧化钛、二氧化硅、氧化铝。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活性物质为Antrodin C或Antroquinonol。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述微粒的粒径为2～38μm。
4.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，所述微粒的添加量为1～12g/L。
5.如权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：葡萄糖20～120g/L、大豆水解液20～80mL/L、玉米浆粉5～26g/L、硫酸镁0.5～1.5g/L，磷酸氢二钾0.5～1.5g/L。
6.如权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，所述大豆水解液为质量分数为10～30％w/v的大豆，40～50℃水解3～5h后所制备得到的。
7.如权利要求1～6任一所述的方法，其特征在于，发酵条件为100～180r/min，20～35℃培养7～21d，初始pH 3～8。
8.一种微粒在促进牛樟芝发酵生产活性物质中的应用，其特征在于，在牛樟芝发酵过程中添加微粒，所述微粒包括四氧化三铁、滑石粉、二氧化钛、二氧化硅、氧化铝。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述活性物质为Antrodin C或Antroquinonol。
10.权利要求1-7任一所述方法在制备以牛樟芝为发酵微生物的产品方面的应用。
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| CN202110378923.0A CN113046399A (zh) | 2021-04-08 | 2021-04-08 | 一种添加微粒促进牛樟芝液态发酵生产活性物质的方法 |
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| CN102321684A (zh) * | 2011-10-09 | 2012-01-18 | 江南大学 | 一种促进樟芝活性产物Antrodin C生物合成的发酵方法 |
| US20170036986A1 (en) * | 2015-08-06 | 2017-02-09 | Ma Shen Kai Ruei Co., Ltd. | Method for extracting active principles from antrodia camphorata |
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2021
- 2021-04-08 CN CN202110378923.0A patent/CN113046399A/zh active Pending
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JING HUANG ET AL.: "Evaluating the effects of microparticle addition on mycelial morphology, natural yellow pigments productivity, and key genes regulation in submerged fermentation of Monascus purpureus", 《BIOTECHNOL BIOENG.》 * |
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