CN109055455A - 一种生产埃博霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产埃博霉素的方法，将埃博霉素生产菌经过平板培养、种子培养后，接种到发酵培养基中发酵生产埃博霉素，在发酵培养基中添加纤维素、半胱氨酸和埃博霉素特异性靶向吸附聚合物，解除发酵过程累积埃博霉素而产生的反馈抑制作用，提高埃博霉素的产量，所述发酵培养基中纤维素的添加量为0.1‑2.0g/L，半胱氨酸在发酵48h后加入，半胱氨酸的加入量为0.01‑0.5g/L，所述埃博霉素特异性靶向吸附聚合物为分子印迹聚合物。通过对埃博霉素发酵条件的优化，使得菌株加大埃博霉素的产量，对于大规模，低成本生产埃博霉素提供了很大的参考价值和社会意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种生产埃博霉素的方法。
背景技术
埃博霉素(epothilone)是一类大环内酯类化合物，由德国国家生物技术中心(GBF)的G. Höfle等人于1993年首次报道。从粘细菌亚目的纤维堆囊菌菌株发酵液中可以分离埃博霉素，其主要组分为Epothilone A和B。埃博霉素Ａ、Ｂ和Ｄ对癌细胞的生物活性与紫杉醇相当，甚至更强，尤其是埃博霉素Ｂ，其活性比紫杉醇强10-100倍．在Ｃ12位上的有甲基取代，以及Ｃ12-Ｃ13双键换成环氧基团后，埃博霉素的活性将极大提高。埃博霉素具有比紫杉醇优越的抗肿瘤特性：①埃博霉素比紫杉醇水溶性好，结构简单，有利于化学合成埃博霉素及结构衍生化。②埃博霉素没有紫杉醇细胞内毒素活性。 ③与紫杉醇不同，埃博霉素在P糖蛋白表达型的多药耐药性细胞中也维持很大的细胞毒性。
埃博霉素对细胞有强烈的细胞毒活性，其中埃搏霉素B的作用效果更强，能够诱导微管蛋白在低浓度和GTP（三磷酸鸟苷酸）及微管蛋白不存在的条件下聚合形成微管，抑制癌细胞的分裂，从而导致癌细胞的死亡。作用机制和紫杉醇相似：结合在微管上的紫杉醇的结合位点，通过增加原丝间的作用强度而增加微管的稳定性，使细胞的纺锤体不能形成。埃博霉素是H紫杉醇与微管蛋白多聚体结合的竞争的抑制剂。
埃博霉素作为极其有潜力的抗癌新药，引起了全世界的化学家、生物学家及药学家的极大兴趣和研究热情。从1993年发现至今十多年时间，有关埃博霉素的研究报告达500多篇，天然的埃博霉素Ａ和Ｂ已经进入了临床Ⅱ期试验，化学合成的埃博霉索Ｂ内酰胺已经进入了临床Ⅲ期试验。埃博霉素D，埃博霉素B及埃博霉素B的半合成类似物MBS-247550，均己进入临床研究阶段，有望成为新型的抗肿瘤药物。
生产埃博霉素的的方法有化学合成法和生物合成法。由于化学合成杂质多，效率低，所以现今主要应用的方法是生物合成法。生物合成法主要是通过粘细菌发酵产生埃博霉素。发酵法产生的主要是埃博霉素A和B，目前国际上通过粘细菌发酵合成埃博霉素的产量较低，美国施贵宝达到228mg/L（A:B=1:6），国内李越中等人通过研究改良能达到180mg/L（A:B=2），但是这个产量并不能达到现在实际需求，所以在发酵产埃博霉素方面还有很大的空间前进。
发明内容
本发明的目的是在对埃博霉素高产菌发酵产埃博霉素过程中存在的一些瑕疵进行优化改良，以达到成本低产率大的一种高效产埃博霉素的方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术手段如下：
一种生产埃博霉素的方法，将埃博霉素生产菌经过平板培养、种子培养后，接种到发酵培养基中发酵生产埃博霉素，在发酵培养基中添加纤维素、半胱氨酸和埃博霉素特异性靶向吸附聚合物，解除发酵过程累积埃博霉素而产生的反馈抑制作用，提高埃博霉素的产量。
所述发酵培养基中纤维素的添加量为0.1-2g/L。
所述半胱氨酸在发酵48h后加入，半胱氨酸的加入量为0.01-0.5g/L。
所述埃博霉素特异性靶向吸附聚合物为分子印迹聚合物，其制备方法为：取0.1mmol模板分子，0.1-1.0mmol功能单体，0.5-3.0mmol交联剂混合后，加入50mL致孔剂静置2h，加入30mg引发剂，超声振荡20min后，立即通入氮气20min ；然后在40-55℃下聚合反应12 h，再在55-65℃下聚合反应12h ；聚合反应完成后将反应产物破碎、研磨、过筛后得到粒径为40-60μm的聚合反应物，再用200mL乙酸/甲醇=2:5混合液连续冲洗数次后，真空干燥得埃博霉素分子印迹聚合物。
所述埃博霉素特异性靶向吸附聚合物的加入量为1-10%（质量体积比）。
所述模板分子为埃博霉素A~D中的一种或者多种混合。优选为埃博霉素D与埃博霉素A以1:1的比例混合的混合物。
所述功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、烯丙胺或2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸中的至少一种。
所述交联剂为2-甲基丙烯酸乙二醇酯、4-咪唑丙烯酸乙酯、N, N-亚甲基双丙烯酰胺或4-咪唑丙烯酸中的至少一种。
所述引发剂为偶氮二异丁腈或过氧化二苯甲酰；致孔剂为乙酸乙酯、丙酮或二者混合物。
所述发酵培养基配方为：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉 5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，纤维素0.1-2g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min，质量分数0.1-1%半胱氨酸，质量分数1-10 %埃博霉素特异性靶向吸附聚合物。
所述发酵生产埃博霉素的发酵条件为：发酵温度为32℃，发酵罐转速250rpm，通气量1.0VVM，PH 7.6。
本发明中所述埃博霉素生产菌可以为目前公开的任意能够通过发酵获得埃博霉素的菌株。本发明的实施例中采用的埃博霉素生产菌来自中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2014144，分类命名为溶纤维素黏细菌（Sporangium cellulosum）YU-970。通过改良发酵培养基使得更易于菌种生长以及提供-S-基团达到提高埃博霉素产量的目的。在发酵前期优化了埃博霉素特异性靶向吸附聚合物加入量，不仅保证埃博霉素的高吸附量，同时避免了发酵过程中由于吸附剂而带来的不必要的麻烦。
本发明采用溶纤维素黏细菌（Sporangium cellulosum）YU-970菌株发酵生产埃博霉素的方法，包括如下步骤：
A、菌种活化：取1mL溶纤维素黏细菌（Sporangium cellulosum）YU-970接种于种子培养基内，培养时间3-6d，培养温度为27-33℃，摇床转速150-300rpm；
B、中间培养：取A步骤的菌液自然分离后接种于平板培养基内，培养温度为32℃，培养4d后取一菌环接种于18*18斜面培养基内培养4d，培养温度为32℃，然后按照10%接种量接种于装液量为10%的500mL摇瓶内作为原始种子液培养4d，培养温度为32℃，摇床转速200rpm，按10%接种量继续转接到下一级种子液内作为一级种子液，培养温度为32℃，摇床转速200rpm，培养4d后10%接种量接种于50L种子罐，作为二级种子液，培养4d，培养温度为32℃，发酵罐转速200rpm，通气量0.5VVM，PH 7.2。
C、发酵培养：将处于对数生长期的二级菌种液接种于加入1-10 %体积分数埃博霉素特异性靶向吸附聚合物的优化后的发酵培养基CF1内，按照接种量为15%接种于500L加入已灭菌CF1培养基的发酵罐内，并且在培养48h后加入0.1%的半胱氨酸，培养温度32℃，转速250rpm，通气量1.0VVM，间隔4h取样检测发酵液内的埃博霉素浓度，直到发酵液内埃博霉素浓度不再上升为截止点停止继续发酵。
CF1培养基为：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢 二 钾2g/L，ＮａＣL 10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，纤维素1g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min。
D、含量检测：将发酵液过滤后收集埃博霉素特异性靶向吸附聚合物，埃博霉素特异性靶向吸附聚合物使用去离子水洗涤干净，置于烘箱内30℃烘干，加入5~6倍异丙醇浸泡过夜，过滤取浸提液定容，取适量经过有机膜过滤后进行HPLC检测埃博霉素含量；
经过发酵后通过HPLC检测发酵液内埃博霉素含量，在500L发酵罐内，埃博霉素A的产量由原始的332.51mg/L提升到了644.94mg/L，相比于发酵条件未优化前提升了1.94倍；埃博霉素B的产量由原始的306.45mg/L提升到了664.68mg/L，相比于发酵条件未优化前提升了2.17倍。对于大规模，低成本生产埃博霉素提供了很大的参考价值和社会意义。
本发明中在发酵培养基中加入纤维素主要为菌株提供更好的生长环境；半胱氨酸主要为菌株合成埃博霉素提供氮源和合成前体；埃博霉素特异性靶向吸附聚合物使得埃博霉素被吸附利于分离同时降低解除产物对菌株的反馈抑制作用。
所述的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物为分子印迹聚合物，其制备方法为：取0.1mmol模板分子，0.1-1.0mmol功能单体，0.5-3.0mmol交联剂混合后，加入50mL致孔剂静止2h，加入30mg引发剂。超声振荡20min后，立即通入氮气20min ；然后在40-55°C下聚合反应12 h，再在55-65°C下聚合反应12h ；聚合反应完成后将反应产物破碎、研磨、过筛后得到粒径为40-60μm的聚合反应物。再用去离子水200mL乙酸/甲醇=2:5混合液连续冲洗数次后，真空干燥得埃博霉素分子印迹聚合物。
所述的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物为分子印迹聚合物，其功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、烯丙胺或2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸；交联剂为2-甲基丙烯酸乙二醇酯、4-咪唑丙烯酸乙酯、N, N-亚甲基双丙烯酰胺或4-咪唑丙烯酸；引发剂为偶氮二异丁腈或过氧化二苯甲酰；其致孔剂为乙酸乙酯、丙酮或二者混合物（乙酸乙酯与丙酮混合物的体积比为V:V=1:1、1:3、2:3、3:2、3:1）。
有益效果：
本发明通过对埃博霉素发酵条件的优化，使得菌株加大埃博霉素的产量，对于大规模，低成本生产埃博霉素提供了很大的参考价值和社会意义。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然后，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体物料比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应该也不会限制本发明。
以下实施例中所采用的埃博霉素生产菌来自中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2014144，分类命名为溶纤维素黏细菌（Sporangium cellulosum）YU-970。
实施例1
本实施例说明添加半胱氨酸可提升摇床发酵埃博霉素产量的方法，所涉及到的步骤如下：
本实施例营养基配方：
平板培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min；
斜面培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min；
种子培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min；
发酵培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉 5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min。
取活化后的菌种接种于平板培养基内，培养温度为32℃，培养4d后取一菌环接种于18*18斜面培养基内培养4d，培养温度为32℃，然后按照10%接种量接种于装液量为10%的500mL摇瓶内作为种子液培养4d，培养温度为32℃，摇床转速200rpm，取对数生长期菌种按15%接种量接种于装液量为10%的含有0.2g/L半胱氨酸发酵瓶内，培养60h后加入7 %体积分数灭菌的大孔吸附树脂XD-16，培养温度为32℃，摇床转速250rpm，间隔4h取样检测埃博霉素含量，直到其含量不再增加时停止发酵。发酵结束后检测到埃博霉素A的产量由原始的312.18mg/L提升到了474.94mg/L，相比于发酵条件未优化前提升了约1.52倍；埃博霉素B的产量由原始的302.45mg/L提升到了428.58mg/L，相比于发酵条件未优化前提升了1.42倍。
实施例2
本实例说明添加纤维素对埃博霉素生产菌发酵罐发酵产埃博霉素的意义。所涉及到的步骤如下：
本实施例营养基配方：
平板培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢 二钾2g/L，ＮａＣL ５g/L，酵母粉 ２g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
斜面培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二 钾2g/L，ＮａＣL ５g/L，酵母粉 ２g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
种子培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二 钾2g/L，ＮａＣL 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
发酵培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二 钾2g/L，ＮａＣL 10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉 5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，纤维素1g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min。
取活化后的菌种接种于平板培养基内，培养温度为32℃，培养4d后取一菌环接种于18*18斜面培养基内培养4d，培养温度为32℃，然后按照10%接种量接种于装液量为10%的500mL摇瓶内作为原始种子液培养4d，培养温度为32℃，摇床转速200rpm，培养温度为32℃，摇床转速200rpm，按10%接种量继续转接到下一级种子液内作为一级种子液，培养温度为32℃，摇床转速200rpm，培养4d后10%接种量接种于50L种子罐，作为二级种子液，培养4d，培养温度为32℃，发酵罐转速200rpm，通气量0.5VVM，PH 7.2。将处于对数生长期的二级菌种液接种于优化后的发酵培养基CF1内，按照接种量为15%接种于500L加入已灭菌CF1培养基的发酵罐内，培养60h后加入7%体积分数的大孔吸附树脂XD-16，培养温度32℃，转速250rpm，通气量1.0VVM，间隔4h取样检测发酵液内的埃博霉素浓度，直到发酵液内埃博霉素浓度不再上升为截止点停止继续发酵。发酵结束后检测到埃博霉素A的产量由原始的347.09mg/L提升到了488.27mg/L，相比于发酵条件未优化前提升了约1.48；埃博霉素B的产量由原始的351.31mg/L提升到了494.69mg/L，相比于发酵条件未优化前提升了1.41倍。
实施例3
本实例说明优化后的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物加入量有提高埃博霉素产量的作用。所涉及到的步骤如下：
本实施例营养基配方：
平板培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢 二钾2g/L，ＮａＣL ５g/L，酵母粉 ２g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
斜面培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二 钾2g/L，ＮａＣL ５g/L，酵母粉 ２g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
种子培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二 钾2g/L，ＮａＣL 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
发酵培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二 钾2g/L，ＮａＣL 10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉 5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min。
取活化后的菌种接种于平板培养基内，培养温度为32℃，培养4d后取一菌环接种于18*18斜面培养基内培养4d，培养温度为32℃，然后按照10%接种量接种于装液量为10%的500mL摇瓶内作为种子液培养4d，培养温度为32℃，摇床转速200rpm，取对数生长期菌种按15%接种量接种于装液量为10%的发酵瓶内，培养60h后加入1-10 %体积分数灭菌的吸附剂（XD-16型大孔吸附树脂和埃博霉素特异性靶向吸附聚合物），培养温度为32℃，摇床转速250rpm，间隔4h取样检测埃博霉素含量，直到其含量不再增加时停止发酵。发酵结束后检测到埃博霉素A的产量分别为：Amax8%XD-16 =392.52mg/L，Amin1%XD-16 =143.76mg/L，A10%XD-16=326.84mg/L；Amax7%聚合物=465.72mg/L，Amin1%聚合物 =297.59mg/L，Amin10%聚合物 =410.68mg/L。埃博霉素B的产量分别为：Bmax8%XD-16 =372.45mg/L，Bmin1%XD-16 =163.47mg/L，B10%XD-16=307.19mg/L；Bmax7%聚合物=457.36mg/L，Bmin1%聚合物 =312.78mg/L，Bmin10%聚合物 =401.21mg/L。以上结果表明选择加入体积分数为7%的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物为最佳吸附剂。
所述的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物为分子印迹聚合物，其制备方法为：取0.1mmol模板分子，0.50mmol功能单体，2.0mmol交联剂混合后，加入50mL致孔剂静止2h，加入30mg引发剂。超声振荡20min后，立即通入氮气20min ；然后在55°C下聚合反应12 h，再在65°C下聚合反应12h ；聚合反应完成后将反应产物破碎、研磨、过筛后得到粒径为40-60μm的聚合反应物。再用去离子水200mL乙酸/甲醇=2:5混合液连续冲洗数次后，真空干燥既得埃博霉素分子印迹聚合物。
所述的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物为分子印迹聚合物，其功能单体为2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸；交联剂为2-甲基丙烯酸乙二醇酯；引发剂为过氧化二苯甲酰；其致孔剂为乙酸乙酯、丙酮二者混合物（V:V=1:3）。
实施例4
本实例说明添加半胱氨酸和埃博霉素特异性靶向吸附聚合物有提高埃博霉素产量的作用。所涉及到的步骤如下：
本实施例营养基配方：
平板培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢 二钾2g/L，ＮａＣL ５g/L，酵母粉 ２g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
斜面培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二 钾2g/L，ＮａＣL ５g/L，酵母粉 ２g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
种子培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二 钾2g/L，ＮａＣL 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
发酵培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，ＮａCL 10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉 5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min。
取活化后的菌种接种于平板培养基内，培养温度为32℃，培养4d后取一菌环接种于18*18斜面培养基内培养4d，培养温度为32℃，然后按照10%接种量接种于装液量为10%的500mL摇瓶内作为原始种子液培养4d，培养温度为32℃，摇床转速200rpm，培养温度为32℃，摇床转速200rpm，按10%接种量继续转接到下一级种子液内作为一级种子液，培养温度为32℃，摇床转速200rpm，培养4d后10%接种量接种于50L种子罐，作为二级种子液，培养4d，培养温度为32℃，发酵罐转速200rpm，通气量0.5VVM，PH 7.2。将处于对数生长期的二级菌种液接种于优化后的发酵培养基CF1内，按照接种量为15%接种于500L加入有发酵培养基的发酵罐内，并且在培养48h后加入0.2g/L的半胱氨酸，培养60h后加入加入7 %体积分数的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物，培养温度32℃，转速250rpm，通气量1.0VVM，间隔4h取样检测发酵液内的埃博霉素浓度，直到发酵液内埃博霉素浓度不再上升为截止点停止继续发酵。发酵结束后检测到埃博霉素A的产量由原始的301.42mg/L提升到了525.36mg/L，相比于发酵条件未优化前提升了1.69倍；埃博霉素B的产量由原始的316.95mg/L提升到了551.25mg/L，相比于发酵条件未优化前提升了1.74倍。
所述的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物为分子印迹聚合物，其制备方法为：取0.1mmol模板分子，0.50mmol功能单体，2.0mmol交联剂混合后，加入50mL致孔剂静止2h，加入30mg引发剂。超声振荡20min后，立即通入氮气20min ；然后在55°C下聚合反应12 h，再在65°C下聚合反应12h ；聚合反应完成后将反应产物破碎、研磨、过筛后得到粒径为40-60μm的聚合反应物。再用去离子水200mL乙酸/甲醇=2:5混合液连续冲洗数次后，真空干燥既得埃博霉素分子印迹聚合物。
所述的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物为分子印迹聚合物，其功能单体为2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸；交联剂为2-甲基丙烯酸乙二醇酯；引发剂为过氧化二苯甲酰；其致孔剂为乙酸乙酯、丙酮二者混合物（V:V=1:3）。
实施例5
本实例说明优化后的发酵培养基有提高埃博霉素产量的作用。所涉及到的步骤如下：
本实施例营养基配方：
平板培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢 二钾2g/L，ＮａＣL ５g/L，酵母粉 ２g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
斜面培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二 钾2g/L，ＮａＣL ５g/L，酵母粉 ２g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
种子培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二 钾2g/L，ＮａＣL 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
发酵培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，ＮａＣL 10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉 5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min。
CF1发酵培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，ＮａＣL 10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，纤维素1g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min。
取活化后的菌种接种于平板培养基内，培养温度为32℃，培养4d后取一菌环接种于18*18斜面培养基内培养4d，培养温度为32℃，然后按照10%接种量接种于装液量为10%的500mL摇瓶内作为原始种子液培养4d，培养温度为32℃，摇床转速200rpm，培养温度为32℃，摇床转速200rpm，按10%接种量继续转接到下一级种子液内作为一级种子液，培养温度为32℃，摇床转速200rpm，培养4d后10%接种量接种于50L种子罐，作为二级种子液，培养4d，培养温度为32℃，发酵罐转速200rpm，通气量0.5VVM，PH 7.2。将处于对数生长期的二级菌种液接种于优化后的发酵培养基CF1内，按照接种量为15%接种于500L加入已灭菌CF1培养基的发酵罐内，并且在培养48h后加入0.2g/L的半胱氨酸，培养60h后加入加入7 %体积分数的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物，培养温度32℃，转速250rpm，通气量1.0VVM，间隔4h取样检测发酵液内的埃博霉素浓度，直到发酵液内埃博霉素浓度不再上升为截止点停止继续发酵。发酵结束后检测到埃博霉素A的产量由原始的301.42mg/L提升到了625.36mg/L，相比于发酵条件未优化前提升了2.07倍；埃博霉素B的产量由原始的316.95mg/L提升到了651.25mg/L，相比于发酵条件未优化前提升了2.05倍。
所述的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物为分子印迹聚合物，其制备方法为：取0.1mmol模板分子，0.50mmol功能单体，2.0mmol交联剂混合后，加入50mL致孔剂静止2h，加入30mg引发剂。超声振荡20min后，立即通入氮气20min ；然后在55°C下聚合反应12 h，再在65°C下聚合反应12h ；聚合反应完成后将反应产物破碎、研磨、过筛后得到粒径为40-60μm的聚合反应物。再用去离子水200mL乙酸/甲醇=2:5混合液连续冲洗数次后，真空干燥既得埃博霉素分子印迹聚合物。
所述的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物为分子印迹聚合物，其功能单体为2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸；交联剂为2-甲基丙烯酸乙二醇酯；引发剂为过氧化二苯甲酰；其致孔剂为乙酸乙酯、丙酮二者混合物（V:V=1:3）。
实施例6
本实例说明一种高效生产埃博霉素的方法，所涉及到的步骤如下：
本实施例营养基配方：
平板培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢 二钾2g/L，ＮａＣL ５g/L，酵母粉 ２g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
斜面培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二 钾2g/L，ＮａＣL ５g/L，酵母粉 ２g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
种子培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二 钾2g/L，ＮａＣL 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
CF1培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二 钾2g/L，ＮａＣL 10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉 5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，纤维素1g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min。
取活化后的菌种接种于平板培养基内，培养温度为32℃，培养4d后取一菌环接种于18*18斜面培养基内培养4d，培养温度为32℃，然后按照10%接种量接种于装液量为10%的500mL摇瓶内作为种子液培养4d，培养温度为32℃，摇床转速200rpm，取对数生长期菌种按15%接种量接种于装液量为10%的CF1培养基（含有0.2g/L半胱氨酸的发酵培养基）发酵瓶内，培养60h后加入加入7 %体积分数的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物，培养温度为32℃，摇床转速250rpm，间隔4h取样检测埃博霉素含量，直到其含量不再增加时停止发酵。发酵结束后检测到埃博霉素A的产量由原始的308.01mg/L提升到了644.17mg/L，相比于发酵条件未优化前提升了2.09倍；埃博霉素B的产量由原始的325.45mg/L提升到了659.77mg/L，相比于发酵条件未优化前提升了2.03倍。
所述的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物为分子印迹聚合物，其制备方法为：取0.1mmol模板分子， 1.0mmol功能单体， 3.0mmol交联剂混合后，加入50mL致孔剂静止2h，加入30mg引发剂。超声振荡20min后，立即通入氮气20min ；然后在40°C下聚合反应12 h，再在65°C下聚合反应12h ；聚合反应完成后将反应产物破碎、研磨、过筛后得到粒径为40-60μm的聚合反应物。再用去离子水200mL乙酸/甲醇=2:5混合液连续冲洗数次后，真空干燥既得埃博霉素分子印迹聚合物。
所述的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物为分子印迹聚合物，其功能单体为2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸；交联剂为2-甲基丙烯酸乙二醇酯；引发剂为偶氮二异丁腈；其致孔剂为乙酸乙酯。
实施例7
本实例说明一种高效生产埃博霉素的方法，所涉及到的步骤如下：
本实施例营养基配方：
平板培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢 二钾2g/L，ＮａＣL ５g/L，酵母粉 ２g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
斜面培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二 钾2g/L，ＮａＣL ５g/L，酵母粉 ２g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
种子培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二 钾2g/L，ＮａＣL 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
CF1培养基：发酵培养基：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢 二 钾2g/L，ＮａＣL 10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉 5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，纤维素1g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min。
取活化后的菌种接种于平板培养基内，培养温度为32℃，培养4d后取一菌环接种于18*18斜面培养基内培养4d，培养温度为32℃，然后按照10%接种量接种于装液量为10%的500mL摇瓶内作为原始种子液培养4d，培养温度为32℃，摇床转速200rpm，培养温度为32℃，摇床转速200rpm，按10%接种量继续转接到下一级种子液内作为一级种子液，培养温度为32℃，摇床转速200rpm，培养4d后10%接种量接种于50L种子罐，作为二级种子液，培养4d，培养温度为32℃，发酵罐转速200rpm，通气量0.5VVM，PH 7.2。将处于对数生长期的二级菌种液接种于优化后的发酵培养基CF1内，按照接种量为15%接种于500L加入已灭菌CF1培养基的发酵罐内，并且在培养48h后加入0.2g/L的半胱氨酸，培养60h后加入加入7 %体积分数的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物，培养温度32℃，转速250rpm，通气量1.0VVM，间隔4h取样检测发酵液内的埃博霉素浓度，直到发酵液内埃博霉素浓度不再上升为截止点停止继续发酵。发酵结束后检测到埃博霉素A的产量由原始的323.15mg/L提升到了667.97mg/L，相比于发酵条件未优化前提升了2.07倍；埃博霉素B的产量由原始的309.42mg/L提升到了648.58mg/L，相比于发酵条件未优化前提升了2.1倍。
所述的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物为分子印迹聚合物，其制备方法为：取0.1mmol模板分子， 1.0mmol功能单体， 3.0mmol交联剂混合后，加入50mL致孔剂静止2h，加入30mg引发剂。超声振荡20min后，立即通入氮气20min ；然后在40°C下聚合反应12 h，再在65°C下聚合反应12h ；聚合反应完成后将反应产物破碎、研磨、过筛后得到粒径为40-60μm的聚合反应物。再用去离子水200mL乙酸/甲醇=2:5混合液连续冲洗数次后，真空干燥既得埃博霉素分子印迹聚合物。
所述的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物为分子印迹聚合物，其功能单体为2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸；交联剂为2-甲基丙烯酸乙二醇酯；引发剂为偶氮二异丁腈；其致孔剂为乙酸乙酯。
埃博霉素检测方法：
试剂：色谱纯异丙醇
检测条件：流动相为异丙醇:水=3:1(v:v)；流速为1.0mL/min；检测波长为249nm；进样量为20μL；柱温为25℃。
A、标准品制备：准确称量埃博霉素A和埃博霉素B标准品各20mg（精确至1mg）溶于50mL容量瓶内，用色谱纯异丙醇溶解并定容至刻度，再分别稀释成浓度梯度为0、0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40g/L的标准液备用。
B、样品制备：在发酵结束后将发酵液过滤后收集埃博霉素特异性靶向吸附聚合物，树脂使用去离子水洗涤干净，置于烘箱内30℃烘干，加入5倍异丙醇浸泡过夜，过滤取浸提液定容，取1mL浸提液离心，10000r/min，离心15min后，经过有机膜过滤后进行HPLC检测埃博霉素含量。
C、含量计算：用标准品绘制标准曲线（同一浓度重复三组取平均值），标准曲线线性方程为：
埃博霉素A浓度=1.2156 × 10-5 × 埃博霉素A峰面积（R2=0.99572）
埃博霉素B浓度=0.9326× 10-5 × 埃博霉素B峰面积（R2=0.99914）。
Claims (10)
1.一种生产埃博霉素的方法，将埃博霉素生产菌经过平板培养、种子培养后，接种到发酵培养基中发酵生产埃博霉素，其特征在于，在发酵培养基中添加纤维素、半胱氨酸和埃博霉素特异性靶向吸附聚合物，解除发酵过程累积埃博霉素而产生的反馈抑制作用，提高埃博霉素的产量。
2.根据权利要求1所述的生产埃博霉素的方法，其特征在于，所述发酵培养基中纤维素的添加量为0.1-2.0g/L。
3.根据权利要求1所述的生产埃博霉素的方法，其特征在于，所述半胱氨酸在发酵48h后加入，半胱氨酸的加入量为0.01-0.5g/L。
4.根据权利要求1所述的生产埃博霉素的方法，其特征在于，所述埃博霉素特异性靶向吸附聚合物为分子印迹聚合物，其制备方法为：取0.1mmol模板分子，0.1-1.0mmol功能单体，0.5-3.0mmol交联剂混合后，加入50mL致孔剂静置2h，加入30mg引发剂，超声振荡10-30min后，立即通入氮气10-30min ；然后在40-55℃下聚合反应10-15 h，再在55-65℃下聚合反应10-15h ；聚合反应完成后将反应产物破碎、研磨、过筛后得到粒径为40-60μm的聚合反应物，再用200-400mL乙酸/甲醇=2:5混合液连续冲洗数次后，真空干燥得埃博霉素分子印迹聚合物。
5.根据权利要求1所述的生产埃博霉素的方法，其特征在于，所述埃博霉素特异性靶向吸附聚合物的加入量为5-9%（质量体积比）。
6.根据权利要求4所述的生产埃博霉素的方法，其特征在于，所述功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、烯丙胺或2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸中的至少一种。
7.根据权利要求4所述的生产埃博霉素的方法，其特征在于，所述交联剂为2-甲基丙烯酸乙二醇酯、4-咪唑丙烯酸乙酯、N, N-亚甲基双丙烯酰胺或4-咪唑丙烯酸中的至少一种。
8.根据权利要求4所述的生产埃博霉素的方法，其特征在于，所述引发剂为偶氮二异丁腈或过氧化二苯甲酰；致孔剂为乙酸乙酯、丙酮或二者混合物。
9.根据权利要求1所述的生产埃博霉素的方法，其特征在于，所述发酵培养基配方为：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢 二 钾2g/L，NaCl10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉 5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，纤维素1g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min, 另外加入7%质量分数的埃博霉素特异性靶向吸附聚合物，0.1-2.0g/L纤维素，0.01-0.1g/L半胱氨酸。
10.根据权利要求1所述的生产埃博霉素的方法，其特征在于，所述发酵生产埃博霉素的发酵条件为：发酵温度为32℃，发酵罐转速250rpm，通气量1.0VVM，PH 7.6。
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