CN112630369A - 一种埃博霉素b含量的高效液相色谱检测分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种埃博霉素B含量的高效液相色谱检测分析方法，其包括：S1、供试品溶液的制备：将埃博霉素B原料药与稀释剂混合；S2、对照品溶液的制备：将埃博霉素B对照品与稀释剂混合；S3、采用反相液相色谱分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测，检测条件为：色谱柱为C18色谱柱，流动相由水、缓冲液和有机溶剂组成，按体积分数设置等度洗脱；以及采用外标法进行定量分析。
Description
领域
本发明涉及药物分析技术领域，特别涉及一种埃博霉素B含量的高效液相色谱检测分析方法。
背景
埃博霉素B(epothilone)是一类大环内酯类化合物，从粘细菌亚目的纤维堆囊菌菌株发酵液中可以分离埃博霉素，其主要组分为EpothiloneA和B。它们具有的类似紫杉醇微管蛋白聚合和抑制微管解聚的活性使它成为了新一代抗有丝分裂药物，其作用机制与紫杉醇类药物类似，可与微管蛋白结合导致癌细胞无法顺利进行有丝分裂，进而使癌细胞产生凋亡。埃博霉素在抗肿瘤谱、抗肿瘤活性、安全性、水溶性及合成方法等方面均优于紫杉醇,有望发展成为比紫杉醇更有效的抗肿瘤药物。
除具有活性方面的优势之外，埃博霉素具有较紫杉醇简单的化学结构和良好的水溶性，而且可以发酵法生产。因此从1995年发现埃博霉素的微管解聚抑制活性以来，其相关研究已引起全球的极大的热情和关注。科学研究发现，虽然埃博霉素的作用机理与紫杉醇相似，但埃博霉素在许多方面优于紫杉醇：抗癌活性比紫杉醇高；能抑制所有的对紫杉醇过敏的或对紫杉醇抗药的肿瘤细胞；对有多种抗药性的癌症有较好的治疗效果；对一些多种药物治疗未果的癌症病人依然有治疗效果；不受细胞排毒蛋白(PhosphoglycoproteinEffluxPump)的作用，故没有紫杉醇类的抗药性问题。此外，由于化学结构比紫杉醇简单，埃博霉素B具有更好的化学修饰与优化潜力。在国外，埃博霉素B及其某些类似物已经进入三期临床试验。这个事实也验证了上述结论。不过，研究还发现，埃博霉素B仍然存在一些毒副作用。要解决埃博霉素B本身作为药物的某些缺陷，必须对埃博霉素B进行更多更广的结构优化，以期得到药性更为优异的抗癌新药。因此，以埃博霉素B为先导药物分子进行新药开发，具有极大的潜力。
为了保证埃博霉素B后续的研发和生产质量，需要对原料药及其制剂的质量进行控制。因此，研究获得一种埃博霉素B的含量测定的检测方法，这对医药生产企业来说显得尤为迫切。通过查阅中外文献及专利，目前对埃博霉素B含量的检测方法并不完善，不利于企业对产品质量的把控，所以亟需一种有效测定埃博霉素B含量的分析方法。
概述
本公开涉及一种埃博霉素B含量的高效液相色谱检测分析方法，其包括：
S1、供试品溶液的制备：将埃博霉素B原料药与稀释剂混合；
S2、对照品溶液的制备：将埃博霉素B对照品与稀释剂混合；
S3、采用反相液相色谱分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测，检测条件为：
色谱柱为C18色谱柱，流动相由水、缓冲液和有机溶剂组成，按体积分数设置等度洗脱；以及
采用外标法进行定量分析。
附图简要说明
图1示出了本公开的空白溶液(流动相)的色谱图；
图2示出了本公开的埃博霉素B对照品溶液的色谱图；
图3示出了本公开的埃博霉素B供试品溶液的色谱图。
详述
在以下的说明中，包括某些具体的细节以对各个公开的实施方案提供全面的理解。然而，相关领域的技术人员会认识到，不采用一个或多个这些具体的细节，而采用其他方法、部件、材料等的情况下仍实现实施方案。
除非本公开中另有要求，在整体说明书和所附的权利要求中，词语“包括”、“包含”、“含有”和“具有”应解释为开放式的、含括式的意义，即“包括但不限于”。
在整体说明书中提到的“一实施方案”、“实施方案”、“在另一实施方案中”或“在某些实施方案中”意指在至少一实施方案中包括与该实施方案所述的相关的具体参考要素、结构或特征。因此，在整个说明书中不同位置出现的短语“在一实施方案中”或“在实施方案中”或“在另一实施方案中”或“在某些实施方案中”不必全部指同一实施方案，此外，具体要素、结构或特征可以任何适当的方式在一个或多个实施方案中结合。
定义
在本公开中，术语“反相液相色谱”是指流动相为极性、固定相为非极性的液相色谱。反相色谱法是以表面非极性载体为固定相，以比固定相极性强的溶剂为流动相的一种液相色谱分离模式。反相色谱柱是指以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
在本公开中，术语“外标法”是指用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法。
在本公开中，术语“等度洗脱”是指在样品组分的分析周期中，流动相的组成和流速恒定不变的洗脱方式。
在本公开中，术语“空白溶液”是指在高效液相色谱检测分析方法中，为消除干扰，用与测定试样时完全一致的条件进行测定的溶液。测得结果称为"空白值"，应从试样测定结果中扣除，以此提高测定的准确性。
在本公开中，术语“供试品溶液”是指在高效液相色谱检测分析方法中，待测样品的溶液。
在本公开中，术语“对照品溶液”是在指在高效液相色谱检测分析方法中，标准样品的溶液。
在本公开中，术语“流动相”是指在液相色谱过程中携带待测组分向前移动的物质。
具体实施方式
本公开涉及一种埃博霉素B含量的高效液相色谱检测分析方法，其包括：
S1、供试品溶液的制备：将埃博霉素B原料药与稀释剂混合；
S2、对照品溶液的制备：将埃博霉素B对照品与稀释剂混合；
S3、采用反相液相色谱分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测，检测条件为：
色谱柱为C18色谱柱，流动相由水、缓冲液和有机溶剂组成，按体积分数设置等度洗脱；以及
采用外标法进行定量分析。
在某些实施方案中，其还包括空白溶液的制备，所述空白溶液由稀释剂组成。
在某些实施方案中，对照品溶液的制备：精密称取埃博霉素B对照品适量，加入流动相溶解并稀释制成每1ml中各约含0.2mg的混合溶液，作为对照品溶液。
在某些实施方案中，供试品溶液的配制：精密称取埃博霉素B供试品制成每1ml中约含0.2mg埃博霉素B的溶液，作为供试品溶液。
在某些实施方案中，稀释剂为流动相。
在某些实施方案中，流动相的pH值为8.5。
在某些实施方案中，pH值通过磷酸盐缓冲液进行调节。
在某些实施方案中，磷酸盐缓冲液选自磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠或其混合物。
在某些实施方案中，磷酸盐缓冲液选自磷酸二氢钾。
在某些实施方案中，有机溶剂选自乙腈、乙醇、甲醇或其混合物。
在某些实施方案中，有机溶剂选自甲醇。
在某些实施方案中，将6.5g磷酸二氢钾和800mL甲醇溶于1200mL水中，得到所述流动相。
在某些实施方案中，色谱柱的检测波长为245至255nm。
在某些实施方案中，色谱柱的检测波长为249nm。
在某些实施方案中，色谱柱的柱温为25至35℃。
在某些实施方案中，色谱柱的柱温为25℃。
在某些实施方案中，色谱柱的流速为1.0至1.5mL/min。
在某些实施方案中，色谱柱的流速为1.0ml/min。
在某些实施方案中，色谱柱的进样量为10至20μL。
在某些实施方案中，色谱柱的进样量为10μL。
在某些实施方案中，精密吸取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液各10至20μL，注入高效液相色谱仪进行测定，得到色谱图，根据色谱图，采用外标法计算埃博霉素B的含量。
实施例1
高效液相色谱法测定埃博霉素B发酵液的浓度。
检测方法的色谱条件：
所用的仪器为：安捷伦Agilent1260高效液相色谱仪；色谱柱：Phenomenex luna5u C18，规格为250mm×4.6mm；
流动相的制备：将6.5g磷酸二氢钾和800mL甲醇溶于1200mL水中，得到所述流动相，其中：流动相的pH为8.5，空白溶液(稀释剂)为流动相；
流速为1.0mL/min；柱温为25℃；检测波长为249nm；进样体积为10μL。
实验步骤：
1、溶液配制：
(1)对照品的制备：精密称取埃博霉素B对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中各约含0.2mg的混合溶液，作为对照品溶液。
(2)供试品溶液的配制：取埃博霉素B发酵液作为供试品溶液。
2、精密吸取对照品溶液、空白溶液、供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪进行测定，得到色谱图。
3、根据色谱图，采用外标法计算埃博霉素B发酵液的浓度。
其中：埃博霉素B发酵液的浓度＝(对照品的浓度×埃博霉素B发酵液的峰面积)/对照品的峰面积
理论塔板数＝16×(保留时间/峰宽)2或者理论塔板数＝5.54×(保留时间/半峰宽)2
其中：对照品的称样量为20.27mg定容至100ml，因此对照品浓度为0.2027mg/ml。埃博霉素B发酵液的峰面积为312.5452、对照品的峰面积为1673.5534。经计算，埃博霉素B发酵液的浓度为0.0379mg/ml；
对照品溶液中，主峰保留时间为13.950min、峰宽为1.017、理论塔板数为3010。
4、结果表明，空白溶剂不干扰埃博霉素B的含量检测。对照品溶液中，埃博霉素B分离度符合要求，峰形良好，峰纯度良好，理论塔板数大于3000，拖尾因子小于1.5，符合标准。如果有必要的话，调整流动相中甲醇的体积，每升流动相可以加入50ml的甲醇。
实施例2
埃博霉素B原料药的含量测定。
色谱条件：
所用的仪器为：安捷伦Agilent1260高效液相色谱仪；色谱柱：Phenomenex luna5u C18(2)，规格为250mm×4.6mm；
流动相的制备：将6.5g磷酸二氢钾和800mL甲醇溶于1200mL水中，得到所述流动相，其中：流动相的pH为8.5，空白溶液(稀释剂)为流动相；
流速为1.0mL/min；柱温为25℃；检测波长为249nm；进样体积为10μL。
实验步骤：
1、溶液配制：
(1)对照品的制备：精密称取埃博霉素B对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中各约含0.2mg的混合溶液，作为对照品溶液。
(2)供试品溶液的配制：精密移取一定量的埃博霉素B原料药，加稀释剂溶解并稀释成每1ml中约含0.2mg埃博霉素B的溶液，作为供试品溶液。
2、精密吸取对照品溶液、空白溶液、供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪进行测定，得到色谱图。
3、根据色谱图，按照不加校正因子的自身对照法计算其杂质，采用外标法计算埃博霉素B原料药的含量。
其中：埃博霉素B的含量＝(对照品的浓度×埃博霉素B原料药的峰面积×稀释体积)/(对照品的峰面积×埃博霉素B原料药的称样量)×100％
理论塔板数＝16×(保留时间/峰宽)2或者理论塔板数＝5.54×(保留时间/半峰宽)2
其中：对照品的称样量为20.27mg定容至100ml，因此对照品浓度为0.2027mg/ml。埃博霉素B原料药的峰面积为821.3118、称样量为20.12mg，稀释至200ml。对照品溶液中主峰的峰面积为1673.5534。经计算，埃博霉素B发酵液原料药的含量为98.88％；
对照品溶液中，主峰保留时间为13.950min、峰宽为1.017、理论塔板数为3010。
结果表明，空白溶剂不干扰埃博霉素B的含量检测。对照品溶液中，埃博霉素B分离度符合要求(均大于1.5)，峰形良好，峰纯度良好，理论塔板数大于3000，拖尾因子小于1.5，符合标准。如果有必要的话，调整流动相中甲醇的体积，每升流动相可以加入50ml的乙腈。
综上所述：
(1)本发明采高效液相色谱法对埃博霉素B的含量进行检测，适合检测机构等实验室中对于埃博霉素B的专门性检测工作，特别是可大批量检测，大大提高检测效率。此外，本发明所述方法可以为企业标准或者行业标准的建立提供重要的参考依据。
(2)该法具有操作简单、快速、准确度高、精密度高、稳定性好的优点。
从前述中可以理解，尽管为了示例性说明的目的描述了本公开的具体实施方案，但是在不偏离本公开的精神和范围的条件下，本领域所述技术人员可以作出各种变形或改进、这些变形或修改都应落入本公开所附权利要求的范围。
Claims (10)
1.一种埃博霉素B含量的高效液相色谱检测分析方法，其包括：
S1、供试品溶液的制备：将埃博霉素B原料药与稀释剂混合；
S2、对照品溶液的制备：将埃博霉素B对照品与稀释剂混合；
S3、采用反相液相色谱分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测，检测条件为：
色谱柱为C18色谱柱，流动相由水、缓冲液和有机溶剂组成，按体积分数设置等度洗脱；以及
采用外标法进行定量分析。
2.如权利要求1所述的高效液相色谱检测分析方法，其还包括空白溶液的制备，所述空白溶液由稀释剂组成。
3.如权利要求2所述的高效液相色谱检测分析方法，其中所述稀释剂为流动相。
4.如权利要求3所述的高效液相色谱检测分析方法，其中所述流动相的pH值为8.5，优选所述pH值通过磷酸盐缓冲液进行调节。
5.如权利要求4所述的高效液相色谱检测分析方法，其中所述磷酸盐缓冲液选自磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠或其混合物，更优选为磷酸二氢钾。
6.如权利要求5所述的高效液相色谱检测分析方法，其中所述有机溶剂选自乙腈、乙醇、甲醇或其混合物，优选为甲醇。
7.如权利要求6所述的高效液相色谱检测分析方法，其中：
将6.5g磷酸二氢钾和800mL甲醇溶于1200mL水中，得到所述流动相。
8.如权利要求1至7中任一权利要求所述的高效液相色谱检测分析方法，其中：所述色谱柱的检测波长为245至255nm，优选为249nm。
9.如权利要求8所述的高效液相色谱检测分析方法，其中所述色谱柱的柱温为25至35℃，优选为25℃。
10.如权利要求9所述的高效液相色谱检测分析方法，其中所述色谱柱的流速为1.0至1.5mL/min，优选为1.0ml/min；所述色谱柱的进样量为10至20μL，优选为10μL。
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