CN103275098B - 用动态轴向压缩柱分离纯化埃博霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物化学领域，公开了一种用动态轴向压缩柱分离纯化埃博霉素的方法，包括以下步骤：流动相配制、溶解过滤、动态轴向压缩柱装填、系统平衡、正相分离纯化、反相洗脱分离。本发明制备所得埃博霉素的纯度在98.8%以上，收率在98%以上；工艺简单，所用有机溶剂价格便宜，消耗量少，且均可以回收再用，有效降低生产成本；紫外检测器在线监测，操作简单，效率高，产品质量容易控制；等度洗脱，对设备性能要求低，生产周期短，连续进样可大大节省制备时间，实现从实验室到工业化埃博霉素的高效分离纯化。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体涉及用动态轴向压缩柱分离纯化埃博霉素的方法。
背景技术
埃博霉素（epothilones）是由黏细菌纤维素堆囊菌分泌的以16元内酯大环为中心体，噻唑环配基为侧链的一类细胞毒性化合物，是一种具有类似紫杉醇微管蛋白聚合和微管稳定作用的新抗肿瘤药物，CAS号：152044-54-7，分子式：C27H41NO6S，分子量：507.68，主要成分为埃博霉素A和B，它们在该菌中以2:1的比例产生，被认为是一类新型天然存在的微管解聚抑制剂。
目前已经有多种埃博霉素类化合物进入了临床试验：百美时施贵宝（Squibb）公司的埃博霉素B的另一个半合成类似物BMS-310750；诺华（Novartis）公司的埃博霉素B（EPO906）及其类似物（ABJ879）；还有罗氏（Roche）公司的埃博霉素D(KOS-862)和埃博霉素D的类似物 KOS-1584；以及先灵（Schering）公司的埃博霉素B的类似物ZK-Epo。与紫杉醇相比，埃博霉素不但具有水溶性好，注射、口服均可的特点，而且在P-糖蛋白表达型的多药耐药性（MDR）细胞中也维持很大的细胞毒性，被公认为本世纪将取代紫杉醇的最有效的抗癌药物。
2007年，美国食品药品管理局(FDA)批准ix-abepilone上市，是第一个批准上市的epothilones类似物，主要作为晚期乳腺癌的用药，能够与卡培他滨联合用于蒽环类抗生素和紫杉烷治疗失败后的转移或局部恶性乳腺癌的治疗，也可单独用于蒽环类、紫杉烷和卡培他滨治疗失败后的转移或局部恶性乳腺癌的治疗。
目前我国针对埃博霉素分离纯化研究还处于起步阶段，采用液液萃取技术，以甲醇、异丙醇、丙酮等溶剂进行萃取，此方法溶剂消耗量大，环境污染严重，很难实现工业方法生产。
公开号为CN102093378A的中国发明专利公开了一种从吸附树脂上高效解吸埃博霉素的方法，此方法只能作为发酵后埃博霉素的粗提取，高效液相色谱检测纯度只能达到81%，很难再进一步提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用动态轴向压缩柱分离纯化埃博霉素的方法，可以解决现有技术采用液液萃取技术提取埃博霉素，溶剂消耗量大，环境污染严重，而且埃博霉素的高效液相色谱检测纯度较低的问题。
本发明通过以下技术方案实现：
用动态轴向压缩柱分离纯化埃博霉素的方法，包括以下步骤：
（1）流动相配制：用弱极性溶剂配制正相流动相，作为样品正相洗脱液；用强极性溶剂配制反向流动相，作为样品反相洗脱液；
（2）溶解过滤：将纯度大于60%的埃博霉素粗品用正己烷、乙酸乙酯、异丙醇中的一种物质或两种或两种以上混合溶液溶解，超声过滤后，将滤液用步骤（1）配制的正相流动相稀释成样品；
（3）动态轴向压缩柱装填：将正相色谱填料和反相色谱填料分别用步骤（1）配制的正相流动相和反相流动相匀浆得到正相匀浆液和反相匀浆液，将正相匀浆液和反相匀浆液分别送入正相动态轴向压缩柱和反相动态轴向压缩柱，排出正相流动相和反相流动相后压实色谱填料，完成正、反相动态轴向压缩柱的装填；
（4）系统平衡：用步骤（1）配制的正相流动相和反相流动相分别冲洗步骤（3）装填的正相动态轴向压缩柱和反相动态轴向压缩柱，持续10-20min，直到高效液相色谱仪检测的色谱基线平稳，达到平衡状态；
（5）正相分离纯化：将步骤（2）所得样品注入步骤（4）平衡后的正相动态轴向压缩柱，用紫外检测器检测样品分离情况，根据保留时间和峰高确定埃博霉素的分段切割点，收集峰顶物质，并将收集到的物质浓缩；
（6）反相洗脱分离：将步骤（5）所得浓缩后的物质用反向流动相稀释后注入反相动态轴向压缩柱，用紫外检测器检测样品分离情况，根据保留时间和峰高确定埃博霉素的分段切割点，收集峰顶物质，并将收集到的物质浓缩，得到埃博霉素。
本发明的进一步改进方案是，步骤（1）配制正相流动相的弱极性溶剂为正己烷和乙酸乙酯，体积比例为20~80:20~80；配制反向流动相的强极性溶剂为甲醇和水，体积比例为40~90:10~60。
本发明的进一步改进方案是，步骤（2）采用0.45μm有机滤膜对溶解有埃博霉素粗品的正己烷、乙酸乙酯、异丙醇混合溶液进行过滤。
本发明的进一步改进方案是，步骤（2）稀释后的样品浓度为0.1~0.5g/ml。
本发明的进一步改进方案是，步骤（3）的正相色谱填料为200~800目极性硅胶填料，反相色谱填料为40~75um非极性硅胶键合C18色谱填料。
本发明的进一步改进方案是，步骤（3）的正相动态轴向压缩柱和反相动态轴向压缩柱的填料高度均为250mm。
本发明的进一步改进方案是，步骤（6）将步骤（5）所得物质用反相流动相稀释至浓度为0.2~0.5g/ml。
本发明的进一步改进方案是，步骤（5）和步骤（6）的紫外检测器的检测波长为249nm。
取本发明制备得到的埃博霉素0.05g，用甲醇溶解后定容至100ml，从中取20ul，采用液相色谱法检测纯度。
本发明与现有技术相比的优点在于：
一、制备所得埃博霉素的纯度在98.8%以上，收率在98%以上；
二、工艺简单，所用有机溶剂价格便宜，消耗量少，且均可以回收再用，有效降低生产成本；
三、紫外检测器在线监测，操作简单，效率高，产品质量容易控制；
四、等度洗脱，对设备性能要求低，生产周期短，连续进样可大大节省制备时间，实现从实验室到工业化埃博霉素的高效分离纯化。
附图说明
图1为步骤5检测样品分离情况的HPLC图谱。
图2为步骤6检测样品分离情况的HPLC图谱。
图3为检测步骤6所得埃博霉素纯度的HPLC图谱。
图4为动态轴向压缩柱结构示意图。
具体实施方式
实施例1
用动态轴向压缩柱分离纯化埃博霉素的方法，包括以下步骤：
（1）流动相配制：用正己烷和乙酸乙酯配制正相流动相，作为样品正相洗脱液，所述正己烷和乙酸乙酯的体积比例为80:20；用甲醇和水配制反向流动相，作为样品反相洗脱液，所述甲醇和水的体积比例为90:10；
（2）溶解过滤：将30g纯度大于60%的埃博霉素粗品用体积比例为1：1：1的正己烷、乙酸乙酯、异丙醇混合溶液溶解，超声后用0.45μm有机滤膜过滤，滤液进一步用步骤（1）配制的正相流动相稀释成浓度为0.5g/ml的样品；
（3）动态轴向压缩柱装填：将960g的200~800目极性硅胶填料和280克的40~75um非极性硅胶键合C18色谱填料分别用步骤（1）配制的正相流动相和反相流动相匀浆得到正相匀浆液和反相匀浆液，将正相匀浆液和反相匀浆液分别送入直径为100mm的正相动态轴向压缩柱和直径为50mm的反相动态轴向压缩柱，排出正相流动相和反相流动后压实色谱填料，完成正、反相动态轴向压缩柱的装填，所述正、反相动态轴向压缩柱的填料高度都是250mm；
（4）系统平衡：用步骤（1）配制的正相流动相和反相流动相分别冲洗步骤（3）装填的正相动态轴向压缩柱和反相动态轴向压缩柱，持续10-20min，直到高效液相色谱仪检测的色谱基线平稳，达到平衡状态；
（5）正相分离纯化：设定紫外检测器的波长为249nm，正相制备泵的流速为380ml/min，启动数据采集，将步骤（2）所得样品注入步骤（4）平衡后的正相动态轴向压缩柱，当有物质通过时，检测器将色谱信号传递到电脑上的色谱工作站，实时检测物质分离情况，根据保留时间和峰高确定埃博霉素的分段切割点，收集峰顶纯度最高的物质，其余部分合并，将收集到的物质浓缩，合并部分再次进入系统循环；
（6）反相洗脱分离：设定紫外检测器的波长为249nm，反相制备泵的流速为100ml/min，开启数据采集，将步骤（5）所得浓缩后的物质用反向流动相稀释至浓度为0.2g/ml后注入反相动态轴向压缩柱，当有物质通过时，检测器将色谱信号传递到电脑上的色谱工作站，实时检测物质分离情况，根据保留时间和峰高确定埃博霉素的分段切割点，收集峰顶纯度最高的物质并浓缩得到高纯度的埃博霉素。
从收集到的埃博霉素产品中取0.05g，用甲醇溶解后定容至100ml，从中取20ul，通过高效液相色谱仪检测，纯度达到99.5%以上。
如图4所示的动态轴向压缩柱，包括柱管9，所述柱管9上、下两端分别通过A法兰4和B法兰11连接有上盖板3、下盖板10，所述上盖板3上设有孔5，所述下盖板10上设有出料口12，还包括活塞7和活塞7的驱动装置，所述活塞7设置于柱管9内腔，所述活塞7上设有A流体分配装置15，所述A流体分配装置15的流动相入口8通过弹簧形盘管与孔5连通，所述A流体分配装置15的分配口位于活塞7的下端面；所述活塞7与上盖板3之间设有限位柱13，所述限位柱13的一端垂直连接于活塞7，另一端朝向上盖板3；所述柱管9在活塞7与下盖板10之间的壁上设有连通内腔的进料口14；所述下盖板10上设有B流体分配装置16，所述B流体分配装置16的分配口设于下盖板10朝向活塞7的一端，所述B流体分配装置16的流动相出口连通于出料口12。
实施例2
用动态轴向压缩柱分离纯化埃博霉素的方法，包括以下步骤：
（1）流动相配制：用正己烷和乙酸乙酯配制正相流动相，作为样品正相洗脱液，所述正己烷和乙酸乙酯的体积比例为40:60；用甲醇和水配制反向流动相，作为样品反相洗脱液，所述甲醇和水的体积比例为70:30；
（2）溶解过滤：将120g纯度大于60%的埃博霉素粗品用体积比例为3:2的乙酸乙酯、异丙醇混合溶液溶解，超声后用0.45μm有机滤膜过滤，滤液进一步用步骤（1）配制的正相流动相稀释成浓度为0.3g/ml的样品；
（3）动态轴向压缩柱装填：将4000g的200~800目极性硅胶填料和1200克的40~75um非极性硅胶键合C18色谱填料分别用步骤（1）配制的正相流动相和反相流动相匀浆得到正相匀浆液和反相匀浆液，将正相匀浆液和反相匀浆液分别送入直径为200mm的正相动态轴向压缩柱和直径为100mm的反相动态轴向压缩柱，排出正相流动相和反相流动后压实色谱填料，完成正、反相动态轴向压缩柱的装填，所述正、反相动态轴向压缩柱的填料高度都是250mm；
（4）系统平衡：用步骤（1）配制的正相流动相和反相流动相分别冲洗步骤（3）装填的正相动态轴向压缩柱和反相动态轴向压缩柱，持续10-20min，直到高效液相色谱仪检测的色谱基线平稳，达到平衡状态；
（5）正相分离纯化：设定紫外检测器的波长为249nm，正相制备泵的流速为1500ml/min，启动数据采集，将步骤（2）所得样品注入步骤（4）平衡后的正相动态轴向压缩柱，当有物质通过时，检测器将色谱信号传递到电脑上的色谱工作站，实时检测物质分离情况，根据保留时间和峰高确定埃博霉素的分段切割点，收集峰顶纯度最高的物质，其余部分合并，并将收集到的物质浓缩，合并部分再次进入系统循环；
（6）反相洗脱分离：设定紫外检测器的波长为249nm，反相制备泵的流速为380ml/min，开启数据采集，将步骤（5）所得浓缩后的物质用反向流动相稀释至浓度为0.3g/ml后注入反相动态轴向压缩柱，当有物质通过时，检测器将色谱信号传递到电脑上的色谱工作站，实时检测物质分离情况，根据保留时间和峰高确定埃博霉素的分段切割点，收集峰顶纯度最高的物质并浓缩得到高纯度的埃博霉素。
从收集到的埃博霉素产品中取0.05g，用甲醇溶解后定容至100ml，从中取20ul，通过高效液相色谱仪检测，纯度达到99.3%以上。
其余实施如实施例1。
实施例3
用动态轴向压缩柱分离纯化埃博霉素的方法，包括以下步骤：
（1）流动相配制：用正己烷和乙酸乙酯配制正相流动相，作为样品正相洗脱液，所述正己烷和乙酸乙酯的体积比例为20:80；用甲醇和水配制反向流动相，作为样品反相洗脱液，所述甲醇和水的体积比例为40:60；
（2）溶解过滤：将500g纯度大于60%的埃博霉素粗品用正己烷溶液溶解，超声后用0.45μm有机滤膜过滤，滤液进一步用步骤（1）配制的正相流动相稀释成浓度为0.1g/ml的样品；
（3）动态轴向压缩柱装填：将18000g的200~800目极性硅胶填料和4500克的40~75um非极性硅胶键合C18色谱填料分别用步骤（1）配制的正相流动相和反相流动相匀浆得到正相匀浆液和反相匀浆液，将正相匀浆液和反相匀浆液分别送入直径为400mm的正相动态轴向压缩柱和直径为200mm的反相动态轴向压缩柱，排出正相流动相和反相流动后压实色谱填料，完成正、反相动态轴向压缩柱的装填，所述正、反相动态轴向压缩柱的填料高度都是250mm；
（4）系统平衡：用步骤（1）配制的正相流动相和反相流动相分别冲洗步骤（3）装填的正相动态轴向压缩柱和反相动态轴向压缩柱，持续10-20min，直到高效液相色谱仪检测的色谱基线平稳，达到平衡状态；
（5）正相分离纯化：设定紫外检测器的波长为249nm，正相制备泵的流速为5500ml/min，启动数据采集，将步骤（2）所得样品注入步骤（4）平衡后的正相动态轴向压缩柱，当有物质通过时，检测器将色谱信号传递到电脑上的色谱工作站，实时检测物质分离情况，根据保留时间和峰高确定埃博霉素的分段切割点，收集峰顶纯度最高的物质，其余部分合并，并将收集到的物质浓缩，合并部分再次进入系统循环；
（6）反相洗脱分离：设定紫外检测器的波长为249nm，反相制备泵的流速为1500ml/min，开启数据采集，将步骤（5）所得浓缩后的物质用反向流动相稀释至浓度为0.5g/ml后注入反相动态轴向压缩柱，当有物质通过时，检测器将色谱信号传递到电脑上的色谱工作站，实时检测物质分离情况，根据保留时间和峰高确定埃博霉素的分段切割点，收集峰顶纯度最高的物质并浓缩得到高纯度的埃博霉素。
从收集到的埃博霉素产品中取0.05g，用甲醇溶解后定容至100ml，从中取20ul，通过高效液相色谱仪检测，确定最终纯度达到达到99.1%以上。
其余实施如实施例1。
Claims (6)
1.用动态轴向压缩柱分离纯化埃博霉素的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）流动相配制：用体积比例为20~80:20~80的正己烷和乙酸乙酯配制正相流动相，作为样品正相洗脱液；用体积比例为40~90:10~60甲醇和水配制反向流动相，作为样品反相洗脱液；
（2）溶解过滤：将埃博霉素粗品用正己烷、乙酸乙酯、异丙醇中的一种物质或两种或两种以上混合溶液溶解，超声过滤后，将滤液用步骤（1）配制的正相流动相稀释成样品；
（3）动态轴向压缩柱装填：将正相色谱填料和反相色谱填料分别用步骤（1）配制的正相流动相和反相流动相匀浆得到正相匀浆液和反相匀浆液，将正相匀浆液和反相匀浆液分别送入正相动态轴向压缩柱和反相动态轴向压缩柱，排出正相流动相和反相流动相后压实色谱填料，完成正、反相动态轴向压缩柱的装填；
（4）系统平衡：用步骤（1）配制的正相流动相和反相流动相分别冲洗步骤（3）装填的正相动态轴向压缩柱和反相动态轴向压缩柱，持续10-20min，直到高效液相色谱仪检测的色谱基线平稳，达到平衡状态；
（5）正相分离纯化：将步骤（2）所得样品注入步骤（4）平衡后的正相动态轴向压缩柱，用波长为249nm的紫外检测器检测样品分离情况，根据保留时间和峰高确定埃博霉素的分段切割点，收集峰顶物质，并将收集到的物质浓缩；
（6）反相洗脱分离：将步骤（5）所得浓缩后的物质用步骤（1）反向流动相稀释后注入反相动态轴向压缩柱，用波长为249nm的紫外检测器检测样品分离情况，根据保留时间和峰高确定埃博霉素的分段切割点，收集峰顶物质，并将收集到的物质浓缩，得到埃博霉素。
2.如权利要求1所述的用动态轴向压缩柱分离纯化埃博霉素的方法，其特征在于：步骤（2）采用0.45μm有机滤膜对溶解有埃博霉素粗品的正己烷、乙酸乙酯、异丙醇混合溶液进行过滤。
3.如权利要求1所述的用动态轴向压缩柱分离纯化埃博霉素的方法，其特征在于：步骤（2）稀释后的样品浓度为0.1~0.5g/ml。
4.如权利要求1所述的用动态轴向压缩柱分离纯化埃博霉素的方法，其特征在于：步骤（3）的正相色谱填料为200~800目极性硅胶填料，反相色谱填料为40~75um非极性硅胶键合C18色谱填料。
5.如权利要求1所述的用动态轴向压缩柱分离纯化埃博霉素的方法，其特征在于：步骤（3）的正相动态轴向压缩柱和反相动态轴向压缩柱的填料高度均为250mm。
6.如权利要求1所述的用动态轴向压缩柱分离纯化埃博霉素的方法，其特征在于：步骤（6）将步骤（5）所得物质用反相流动相稀释至浓度为0.2~0.5g/ml。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |