WO2009100571A1 - 一种分离和提纯埃博霉素的方法 - Google Patents

一种分离和提纯埃博霉素的方法 Download PDF

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WO2009100571A1
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epothilone
silica gel
normal phase
gel column
phase silica
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Jidong Wang
Hui Zhang
Haibin Wang
Lingping Ying
Sheng Wang
Xufang Guan
Hua Bai
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Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the invention relates to a method for separating and purifying epothilone, in particular to a method for separating and purifying epothilone B and A. Background technique
  • Epothi lone is a new type of natural cytotoxic compound produced by microbial mucinous bacteria. It is a new class of cytotoxic active components that stabilize microtubules (see Gerth, K. et al., J. Ant ibiot. (Antibiotics Journal) 49, pp. 560-563 (1966)). It is biologically similar to paclitaxel, which has significant antitumor activity against human solid tumor cells. It induces tubulin multimers to form an ultra-stable state in the same way, hinders mitosis and prevents tumor cell proliferation.
  • Epothilone is superior to paclitaxel in terms of source, synthetic method, hydrophilicity, antitumor activity and anti-tumor profile, and has been resistant to treatment with paclitaxel, especially in established tumors.
  • epothilone especially epothilone A and most preferably epothilone B has various advantages, is a new class of anti-tumor drugs, is considered to be a replacement product of paclitaxel, and has a market.
  • the potential of new anticancer drugs in which the chemical structures of epothilone B and A are shown in the figure.
  • Epothilone A H
  • Ebzomycin especially the extraction and purification process of epothilone B and A, has done a lot of work at home and abroad. For example, ZL01820141.
  • epothilone 5 relates to a method for separating and purifying epothilone, which discloses a method for desorbing epothilone, especially epothilone A and/or epothilone B, from a resin; ZL02110067.
  • a method for separating and purifying epothilone from a viscous bacterial fermentation broth which discloses fermentation by a viscous bacteria by means of mixed resin adsorption, solid-liquid fractionation extraction, molecular sieve chromatography, crystallization, and high-performance liquid phase separation. Separation and extraction of epothilone in liquid; the method for final purification of epothilone B and A disclosed in Patent ZL99803121. 6 is achieved by reverse phase preparation of high pressure liquid phase; and patent CN03822662. High pressure liquid phase to achieve separation of epothilone B and A.
  • the present invention aims to provide a novel separation and purification method for epothilone B and A by normal phase silica gel chromatography. .
  • the method comprises: dissolving a sample containing epothilone B and A with an alkyl halide compound of dC 7 , loading or loading the sample with silica gel; and then eluting the solvent gradient eluting silica gel column with a normal phase silica gel column; , collect the eluent, and finally get the product.
  • the method for separating and purifying the epothilone B and A by normal phase silica gel column chromatography of the present invention further preferably comprises the steps of:
  • the first normal phase silica gel column After dissolving the sample containing the epothilone B and A or the silica gel of the first normal phase silica gel column with an alkyl halide compound of dC 7 , the first normal phase silica gel column is used, and then the normal phase silica gel is used.
  • the column elutes the solvent for gradient elution; the fractions containing the epothilone B and A are separately collected, and the fractions containing the epothilone B and A are combined, concentrated, and crystallized to obtain the epothilone B and A. Crystallized crude product;
  • Dissolving crystals containing epothilone B and A with dC 7 alkyl ⁇ 3 ⁇ 4 compound organic solvent After mixing with the silica gel of the second normal phase silica gel column, the second normal phase silica gel column is used, and then the solvent is eluted with a normal phase silica gel column to carry out a gradient elution, and the fractions containing the epothilone B are separately collected. And fractions containing epothilone A.
  • the epothilone B is dissolved in t-butanol and lyophilized to obtain a high-purity amorphous powder; the epothilone A is further dissolved in t-butanol and lyophilized to obtain a high-purity amorphous powder.
  • the first normal phase silica gel column and the second normal phase silica gel column are all normal phase silica gel columns commonly used in the art, and the first aspect of the invention
  • the silica gel used in a normal phase silica gel column and a second normal phase silica gel column may be the same normal phase silica gel or different silica gel.
  • the present invention is preferably a silica gel of the same specification.
  • the amount of silica gel of the first normal phase silica gel column is preferably: the mass ratio of the amount of silica gel to the amount of the sample is 5-10:1;
  • the amount of the silica gel of the second normal phase silica gel column is as follows: the mass ratio of the silica gel to the crystal sample is 50-200:1.
  • the present invention preferably uses a dC 7 alkylated solvent to balance the normal phase silica gel before use in a normal phase silica gel column.
  • the alkyl i3 ⁇ 4 compound of dC 7 is preferably one or more of dichlorosilane, chloroform and ethyl bromide, and more preferably dichloromethane, chloroform or a combination thereof.
  • the gradient elution solvent of the normal phase silica gel column in the present invention is C “C 7 hydrocarbon compound, C “C 7 alkyl halogenated compound, C “C 7 ketone compound or C “C 7 " An ester compound or any combination thereof, wherein
  • the hydrocarbon compound of d-C is selected from one or more of petroleum ether, n-hexane, cyclohexane and n-heptane, further preferably petroleum ether;
  • the alkyl ⁇ 3 ⁇ 4 compound of dC 7 is one or more selected from the group consisting of dichlorosilane, chloroform and ethyl bromide, and more preferably dichloromethane;
  • the C ketone compound of C 7 is selected from the group consisting of acetone, methyl ethyl ketone or a combination thereof, preferably acetone;
  • the ester compound of CfC 7 is selected from the group consisting of ethyl acetate, isobutyl acetate or a combination thereof, preferably ethyl acetate;
  • the gradient elution solvent of the normal phase silica gel column of the present invention is further preferably one selected from the group consisting of petroleum ether, ethyl acetate, acetone, chloroform and dichlorosilane, or a combination of two or more.
  • the elution solvent of the first normal phase silica gel column of the present invention is preferably a combination of acetone and petroleum ether or a combination of ethyl acetate and petroleum ether; wherein, in the combination of acetone and petroleum ether, the volume of acetone and petroleum ether The ratio is preferably 1:3-9; in the combination of ethyl acetate and petroleum ether, the volume ratio of ethyl acetate to petroleum ether is preferably 1:1-9.
  • the elution solvent of the second normal phase silica gel column is preferably a combination of acetone and petroleum ether or a combination of petroleum ether and acetone with dichloromethane or chloroform, wherein in the combination of acetone and petroleum ether, acetone and The volume ratio of petroleum ether is 1: 3-9; in the combination of petroleum ether and acetone with dichlorosilane or chloroform, the volume ratio of acetone to petroleum ether is 1: 3-9, and the volume of dichloromethane or chloroform is 5 ° / of the total volume. -50%.
  • the crystals of epothilone B and A can be crystallized by conventional crystallization techniques in the art, in order to achieve better technology in the present invention.
  • the effect of the invention is preferably to crystallize the epothilone B and A by using n-heptane or ethyl acetate or a combination of the two as a crystallization solvent.
  • the crystallization solvent of the present invention is preferably a mixed solvent of n-heptane and ethyl acetate. The ratio is 1:1.
  • the sample containing the epothilone B and A used in the first normal phase silica gel column was prepared by conventional methods.
  • a fermentation broth of a myxobacterial strain of botomycin was treated to remove impurities and samples containing epothilone B and A were obtained.
  • the sample containing the epothilone B and A used in the first normal phase silica gel column of the present invention is a non-polar bacterium fermentation broth containing epothilone B and A.
  • the primary product obtained by separating the macroporous adsorption resin is specifically prepared by:
  • the first non-polar macroporous resin and the second non-polar macroporous resin are non-polar macroporous adsorption resins for separating the fermentation liquid, and they may be the same non-polar macroporous resin.
  • the resin may also be a different non-polar macroporous adsorption resin.
  • the first non-polar macroporous adsorption resin of the present invention is preferably XAD-1600 or HP-20, such as Amber li te XAD-1600 (Rohm & Haas, USA), Dia ion HP-20 (Mi tsubi shi Chemica l , Japan), further preferred is a non-polar macroporous adsorption resin of the XAD-1600 model.
  • the second non-polar macroporous adsorption resin in the present invention is preferably a non-polar macroporous adsorption resin of the H41 or H60 model (produced by the Nanjing Chemical Technology Development Corporation of Jiangsu province, Jiangsu province), and further preferably of the H41 model.
  • Non-polar macroporous adsorption resin is preferably a non-polar macroporous adsorption resin of the H41 or H60 model (produced by the Nanjing Chemical Technology Development Corporation of Jiangsu province, Jiangsu province), and further preferably of the H41 model.
  • the elution solvent used in the first non-polar macroporous adsorption resin and the second non-polar macroporous adsorption resin in the present invention is an alcohol solution, such as a solution of ethanol or decyl alcohol, and the present invention is preferably an ethanol solution, wherein
  • the elution solvent used for the first nonpolar macroporous adsorption resin is further preferably 30°/. - 100% by volume of ethanol solution; the second non-polar macroporous adsorption resin used is an elution solvent of 30% - 80% by volume of ethanol solution.
  • the fraction eluted from the resin or the fraction eluted from the normal phase silica gel column should be The HPLC detection method is carried out, and it is preferred to collect the fractions which satisfy the following conditions: wherein the fraction obtained from the first non-polar macroporous adsorption resin is analyzed by HPLC, and the total unit of the epothilone B and A fermentation units is 50 or more. The flow is divided into the fractions that need to be collected.
  • the fraction obtained from the second non-polar macroporous adsorption resin was subjected to HPLC analysis, and the flow of the epothilone B and A fermentation units in excess of 50 was divided into fractions to be collected.
  • the fraction obtained from the first normal phase silica gel column was subjected to HPLC analysis, and the flow of the total chromatographic purity of the epothilone B and A to 80% or more was classified into the fraction to be collected.
  • the chromatographic purity of the epothilone A is 92.5.
  • the chromatographic purity of the epothilone A is 92.5. Flows above % are divided into fractions that need to be collected.
  • the fermentation broth added with XAD-1600 resin is passed through the vibrating screen, washed with water, then packed, and the gradient elution is carried out with a volume percentage of 30%-100% ethanol solution, and the elution fraction is collected in stages.
  • HPLC analysis fractions containing epothilone B and A were separately collected, and fractions containing epothilone B and A were combined;
  • the combined fraction containing epothilone B and A is diluted to a suitable concentration of alcohol solution, or concentrated to a suitable volume by vacuum evaporation, and then diluted to a suitable concentration of alcohol solution, on the H41 resin column
  • the gradient was eluted with a gradient of 30%-80% ethanol solution, and the eluted fractions were collected in stages.
  • the fractions containing epothilone B and A were separately collected and combined with epothilone B.
  • the fraction of A, concentrated in vacuo to dryness that is, a sample containing epothilone B and A;
  • the fraction of epothilone B is crystallized by ethyl acetate/n-heptane, and then dissolved in tert-butanol.
  • the solution is lyophilized to obtain a pure product of high purity amorphous powder;
  • Epothilone A is dissolved in tert-butyl alcohol and lyophilized to obtain a pure product of high purity amorphous powder.
  • the epothilone B or epothilone A obtained in the invention (5) can be further purified according to the actual purity requirement, for example, the epothilone B can be purified by the recrystallization method described in the present invention.
  • Epothilone A can be eluted by using the second normal phase silica gel column of the present invention to obtain higher purity epothilone B or epothilone A, such as to achieve a purity of 99.0% or purity. Higher Epothilone B or Epothilone A.
  • Epothilone A ESIMS m/z 494 [M+ H] + ; ] H NMR (CDC1 3 , 400 MHz) ⁇
  • epothilone B and epothilone A the separation and purification flowchart of epothilone B and epothilone A is shown in Fig. 1.
  • the method of the invention not only can well separate epothilone B and A, but also makes the purity of epothilone B and A reach 95.0% or more, preferably can reach 99.0% or more, and is compared with the existing isolated epothilone B.
  • Solvents such as sterol and acetonitrile.
  • Figure 1 Flow chart of separation and purification of epothilone B and A;
  • FIG. 2 HPLC chromatogram of epothilone B with chromatographic purity above 99.0% after separation and purification;
  • Figure 3 HPLC chromatogram of epothilone A with purity of 99.0% or more after separation and purification;
  • the above 10 L of the above solution was mixed into a 30% ethanol solution, and an H41 resin column (20 cm * 300 cm, column volume 70 L) was used, respectively, at 30 ° /. , 40%, 50%, 60% ethanol solution, eluted in 2 column volumes per concentration, and finally eluted with 70% ethanol.
  • the eluted fractions were collected in stages. After HPLC analysis, the required Ebsite was collected.
  • the fractions of B and A were combined, and the fractions containing the epothilone B and A were combined and concentrated to dryness to obtain a sample containing the epothilone B and A.
  • the first normal phase silica gel column (5:1 silica gel to sample ratio) was first eluted with 80:20 petroleum ether/ethyl acetate. 3 column volumes, then eluted with a volume ratio of (85:15) in a petroleum ether/acetone gradient of 2 column volumes and eluted with a volume ratio of (80:20) in a petroleum ether/acetone gradient of 4 column volumes, segmented
  • the eluted fractions were collected, and after HPLC analysis, the fractions containing the epothilone B and A were collected, and the fractions containing the epothilone B and A were combined and concentrated to dryness;
  • the epothilone B and A concentrates were crystallized twice with ethyl acetate/n-heptane in a ratio of 1:1 to obtain a crude crystal containing epothilone B and A, which was analyzed by HPLC (external standard method). 9% ⁇ The total chromatographic purity of the e.g.
  • the epothilone B obtained according to Examples 2-4 was obtained by recrystallization to obtain high-purity epothilone B; the obtained pure epothilone A was obtained by re-silica gel to obtain high-purity epothilone A.
  • the purity of the epothilone A obtained in Example 2-4 is 97.5% of the epothilone A sample is dissolved in 5 ml of dichlorosilane, and the second normal phase silica gel column is obtained. (The amount of silica gel is 300 g), the silica gel column is equilibrated with dichlorosilane, and then the volume ratios are (90: 10: 40), (85: 15: 30), (83: 17: 20) and (80: 20: 10) Gradient elution of petroleum ether/acetone/dichloromethane, fractional collection of elution fractions, after HPLC analysis, collect and combine the required fractions containing epothilone A to concentrate; 99. ⁇ A.
  • the high-purity epothilone B and epothilone A obtained in Example 5 were each dissolved in t-butanol and lyophilized to obtain an amorphous powder.
  • epothilone B 0.5 g was dissolved in 50 ml of t-butanol, placed at room temperature and then placed in a VIRTIS Genes is freeze dryer and lyophilized at - 20 ° C for 48 hours, and then the resulting freeze-dried product was obtained. Further drying was carried out at 30 ° C for 96 hours under high vacuum. Further drying at 52 ° C for 48 hours under high vacuum. The obtained lyophilized powder was measured by a powder X-ray diffraction method.
  • epothilone A 0.4 g was dissolved in 30 ml of t-butanol, placed at room temperature, placed in a VIRTIS Genes is freeze dryer and lyophilized at -20 ° C for 48 hours, and then the resulting freeze-dried product was obtained. Further drying was carried out at 30 ° C for 96 hours under high vacuum and further drying at 50 ° C for 48 hours under high vacuum. The resulting lyophilized powder was measured by a powder X-ray diffraction method.
  • Petroleum ether / dichloromethane 1 : 1 equilibrium, then use ( 90: 10: 10 ), ( 85: 15: 10 ), (83: 17: 10), (80: 20: 10), petroleum ether/acetone/chloroform gradient elution, fractional collection of elution fractions, after HPLC analysis, separately collected and combined the required epothilone
  • the fraction of B and the fraction containing epothilone A were separately concentrated to dryness; the final yield was 98.4% of 9.7 g of epothilone B (yield 36%) and 95.7% of 0. 83 g of epothilone A (yield 40%).
  • the silica gel column is dry-filled and vacuum-rigided, and then (90:10:10), (85:15:10), (83:17:10), (80:20:10) oil Ether/acetone/dichloromethane gradient elution, fractional collection of elution fractions, after HPLC analysis, separately collect and combine the fractions containing epothilone B and the fractions containing epothilone A Concentrated to dryness; finally obtained 98.7% of 0.81 g of epothilone B (yield 30°/») and 95.4% of 0. 70 g of epothilone A (yield 34%) ).

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Description

一种分离和提纯埃博霉素的方法 技术领域
本发明涉及一种埃博霉素的分离和提纯方法， 具体涉及埃博霉素 B 和 A的分离和提纯方法。 背景技术
埃博霉素 （Epothi lone )是由微生物粘细菌产生的一种新型天然细 胞毒化合物， 是一类新的稳定微管的细胞毒活性成分（参见 Gerth, K.等 人， J. Ant ibiot. (抗生素杂志）49， 第 560-563 页 （ 1966 ) )。 它与对人 类不同实体瘤细胞有明显抗肿瘤活性的紫杉醇在生物学上具有相似性， 其以同样方式诱导微管蛋白多聚体形成超稳定态， 阻碍有丝分裂， 阻止 肿瘤细胞繁殖。
埃博霉素在来源、 合成方法、 亲水性、 抗肿瘤活性和抗肿瘤谱等方 面均优于紫杉醇类药物， 与已经确立的治疗相比， 尤其是在肿瘤对用紫 杉醇治疗已经产生耐药性的情况下， 埃博霉素， 尤其是埃博霉素 A且最 优选埃博霉素 B具有各种优势， 是一类新型抗肿瘤药物， 被认为是紫杉 醇的更新换代产品， 是具有市场潜力的新型抗癌药物， 其中埃博霉素 B 和 A的化学结构如图所示。
Figure imgf000002_0001
Epothilone A (R = H); Epothilone B (R = CH3) 自 1995年发现埃博霉素的抗癌活性后，其得到了包括化学、生物学、 医药学等多方面的广泛而深入的研究， 并取得了一定的成果。 随着研究的深入， 对高纯度埃博霉素样品的需求不断增加， 如何分 离和提纯埃博霉素就成为一个急需解决的问题。 埃博霉素， 尤其埃博霉 素 B和 A的提取和纯化工艺， 国内外已做了很多工作。 如 ZL01820141. 5 涉及分离和提纯埃坡霉素的方法， 该专利披露了从树脂中解吸埃博霉素， 尤其埃博霉素 A和 /或埃博霉素 B的方法； ZL02110067. 5则涉及一种从粘 细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的方法， 该专利披露了利用混合树脂吸 附、 固液分步萃取、 分子筛层析、 结晶和高效液相分离等技术手段， 从 粘细菌发酵液中分离提取埃博霉素； 专利 ZL99803121. 6中所公布的最终 纯化埃博霉素 B 和 A 的方法是用反相制备高压液相来实现的； 而专利 CN03822662. 6中是用正相高压液相来达到埃博霉素 B和 A的分离。
就目前已有的技术来看， 埃博霉素 B和 A的分离和纯化主要还是通 过制备色谱柱来实现的， 这不但需要昂贵的设备， 而且消耗大量的曱醇 或乙腈， 一次所能制备的样品量也有限。 发明内容
针对现有分离和提纯埃博霉素 B和 A工艺中存在的技术缺陷， 本发 明的目的在于提供一种新的利用正相硅胶层析法进行埃博霉素 B和 A的 分离和提纯方法。
该方法包括： 用 d-C7的烷基卤代化合物溶解含有埃博霉素 B和 A样 品后， 上样或用硅胶拌样品后上样； 然后用正相硅胶柱洗脱溶剂梯度洗 脱硅胶柱， 收集洗脱液， 最后得到产品。
本发明采用正相硅胶柱层析法进行埃博霉素 B和 A分离和提纯的方 法进一步优选为包括如下步骤：
用 d-C7的烷基卤代化合物有机溶剂溶解含有埃博霉素 B和 A样品或 用第一种正相硅胶柱的硅胶拌样后， 上第一种正相硅胶柱， 然后用正相 硅胶柱洗脱溶剂进行梯度洗脱； 分别收集含有埃博霉素 B和 A的流分， 合并含有埃博霉素 B和 A的流分， 浓缩， 结晶， 得含有埃博霉素 B和 A 的结晶粗品；
用 d-C7的烷基 ι¾代化合物有机溶剂溶解含埃博霉素 B和 A的结晶粗 品或用第二种正相硅胶柱的硅胶拌样后， 上第二种正相硅胶柱, 然后用 正相硅胶柱洗脱溶剂进行梯度洗脱， 分别收集含有埃博霉素 B的流分和 含有埃博霉素 A的流分。
埃博霉素 B经结晶后， 再用叔丁醇溶解并冻干， 得到高纯度无定形 粉末； 埃博霉素 A再用叔丁醇溶解并冻干， 得到高纯度的无定形粉末。
本发明正相硅胶色谱法分离埃博霉素 B和 A的方法中， 第一种正相 硅胶柱和第二种正相硅胶柱均为本领域常用的正相硅胶柱， 本发明中的 第一种正相硅胶柱和第二种正相硅胶柱所使用的硅胶可以是同一种正相 硅胶也可以是不同的硅胶， 其中， 本发明优选为同一种规格的硅胶。
在本发明的正相硅胶色谱法分离埃博霉素 B和 A的方法中， 第一种 正相硅胶柱的硅胶用量优选为： 硅胶用量与样品量的质量比为 5-10: 1 ; 本发明第二种正相硅胶柱的硅胶用量为：硅胶用量与结晶样品的质量比 为 50-200: 1。
为了使本发明所得的埃博霉素 B和埃博霉素 A获得更高的收率， 本 发明优选在正相硅胶色谱柱使用之前， 优选采用 d-C7的烷基 代化合物 溶剂平衡正相硅胶色谱柱。 d-C7的烷基 i¾代化合物优选为二氯曱烷、 氯 仿和溴乙烷中的一种或多种， 更进一步优选为二氯甲烷、 氯仿或其组合。
本发明中的正相硅胶色语柱的梯度洗脱溶剂为 C「 C7的烃类化合物、 C「C7的烷基卤代化合物、 C「C7的酮类化合物或 C「C7的酯类化合物或它们 的任意组合， 其中，
d-C 的烃类化合物选自石油醚、 正己烷、 环己烷和正庚烷中的一种 或多种， 进一步优选为石油醚；
d-C7的烷基 ι¾代化合物选自二氯曱烷、 氯仿和溴乙烷中的一种或多 种， 进一步优选为二氯曱烷；
C「C7的酮类化合物选自丙酮、 丁酮或其组合， 优选为丙酮；
CfC7的酯类化合物选自乙酸乙酯、 醋酸异丁酯或其组合， 优选为乙 酸乙酯；
其中， 本发明正相硅胶色语柱的梯度洗脱溶剂进一步优选为石油醚、 乙酸乙酯、 丙酮、 氯仿和二氯曱烷中的一种、 两种或两种以上组合。 其中， 本发明第一种正相硅胶柱的洗脱溶剂优选为丙酮与石油醚的 组合或乙酸乙酯与石油醚的组合； 其中， 在丙酮与石油醚的组合中， 丙 酮与石油醚的体积比优选为 1 : 3-9; 在乙酸乙酯与石油醚的组合中， 乙 酸乙酯与石油醚的体积比优选为 1 : 1-9。
本发明中， 第二种正相硅胶柱的洗脱溶剂优选为丙酮与石油醚的组 合或石油醚与丙酮与二氯甲烷或氯仿的组合， 其中， 在丙酮与石油醚的 组合中， 丙酮与石油醚的体积比为 1 : 3-9; 在石油醚与丙酮与二氯曱烷 或氯仿的组合中， 丙酮与石油醚的体积比为 1 : 3-9 , 二氯甲烷或氯仿的 体积为占总体积的 5°/。-50%。
在采用正相硅胶色谱法进行埃博霉素 B和 A的分离和纯化过程中， 埃博霉素 B和 A的结晶可以采用本领域常规结晶技术进行结晶， 为了使 本发明实现更好的技术效果， 发明优选采用正庚烷或乙酸乙酯或两者的 组合作为结晶溶剂对埃博霉素 B和 A进行结晶， 本发明结晶溶剂优选为 正庚烷和乙酸乙酯的混合溶剂， 其体积比为 1 : 1。 并优选采用如下方法 结晶： 将含有埃博霉素 B和 A的粗品或埃博霉素 B的粗品用适量的乙酸 乙酯溶解， 然后加入正庚烷， 室温放置， 然后降温至 4 °C， 结晶即得。
在采用正相硅胶色谱法进行埃博霉素 B和 A的分离和纯化过程中， 上第一种正相硅胶柱所使用的含有埃博霉素 B和 A的样品为采用常规方 法对产埃博霉素的一株粘细菌菌株的发酵液进行处理， 除去杂质后获得 的含有埃博霉素 B和 A的样品。
为了更好实现本发明目的， 本发明中上第一种正相硅胶柱使用的含 有埃博霉素 B和 A的样品为将含埃博霉素 B和 A的粘细菌发酵液经过非 极性大孔吸附树脂分离得到的初产物， 其具体的制备方法为：
向粘细菌发酵液中加入第一种非极性大孔吸附树脂柱的树脂， 过振 动筛， 同时水洗除杂， 然后将树脂装柱， 用醇溶液进行梯度洗脱， 合并 含有埃博霉素 B和 A的流分；
将合并的含有埃博霉素 B和 A流分的洗脱液稀释到适宜浓度， 上第 二种非极性大孔吸附树脂柱， 用醇溶液进行梯度洗脱， 收集含有埃博霉 素 B和 A的流分，合并含有埃博霉素 B和 A的流分， 即得含有埃博霉素 B 和 A的样品。
本发明中， 上述第一种非极性大孔树脂和第二种非极性大孔树脂为 用于发酵液分离的非极性大孔吸附树脂， 它们可以是同一种非极性大孔 树脂树脂， 也可以为不同的非极性大孔吸附树脂。
其中，本发明第一种非极性大孔吸附树脂优选为 XAD-1600或 HP- 20， 如 Amber l i te XAD-1600( Rohm & Haas，美国）、Dia ion HP- 20( Mi tsubi shi Chemica l,日本）， 进一步优选为 XAD-1600型号的非极性大孔吸附树脂。
本发明中的第二种非极性大孔吸附树脂优选为 H41或 H60型号的非 极性大孔吸附树脂（江苏省， 林化所南京科技开发总公司所产）， 进一步 优选为 H41型号的非极性大孔吸附树脂。
本发明中第一种非极性大孔吸附树脂和第二种非极性大孔吸附树脂 所使用的洗脱溶剂为醇溶液， 如乙醇、 曱醇的溶液， 本发明优选为乙醇 溶液， 其中， 第一种非极性大孔吸附树脂所使用的洗脱溶剂进一步优选 30°/。-100%体积百分比的乙醇溶液; 第二种非极性大孔吸附树脂所使用的 洗脱溶剂为 30%-80%体积百分比的乙醇溶液。
本发明采用正相硅胶层析法分离和纯化埃博霉素 B和 A的工艺过程 中， 不论是从树脂洗脱下来的流分、 还是从正相硅胶柱洗脱下来的流分， 都应经过 HPLC检测的方法进行检测， 并优选收集符合以下条件的流分： 其中第一种非极性大孔吸附树脂所得的流分经过 HPLC分析， 埃博霉素 B 和 A发酵单位总和在 50以上的流分为需要收集的流分。
第二种非极性大孔吸附树脂所得的流分经过 HPLC分析， 埃博霉素 B 和 A发酵单位总和在 50以上的流分为需要收集的流分。
第一种正相硅胶柱所得的流分经过 HPLC分析， 埃博霉素 B和 A的总 色谱纯度达到 80%以上的流分为需要收集的流分。
第二种正相硅胶柱所得的流分经过 HPLC分析， 埃博霉素 B的色谱纯 度达到 97. 5%以上的流分为需要收集流分； 埃博霉素 A 的色谱纯度达到 92. 5%以上的流分为需要收集的流分。
其中，
但本发明优选采用以下方法： 反相半制备柱 ( Ag i lent ZORBAX Ec l ipse XDB-C18 ) ，规格为 250*9· 4mm，填料粒径为 5 μ ιη, 流速为 1. 5mL/min， 249mn检测， 流动相为 曱醇：水 =80: 20。 或
分析柱（ SHIMADZU X0D-C18 )， 规格为 150*6. 0mm,填料粒径为 5 μ ιη， 流速为 1. OmL/min, 249nm检测， 流动相为乙腈： 甲醇：水 =40: 20： 50。
按照本发明采用正相硅胶层析法进行埃博霉素 B和 A的分离和纯化 方法的一个优选方案， 具体包含以下步骤：
( 1 )、 将加入 XAD-1600型树脂的发酵液过振动筛， 同时水洗除杂， 然后装柱， 用体积百分比为 30%-100%乙醇溶液进行梯度洗脱， 分段收集 洗脱流分， 经过 HPLC分析后， 分别收集含有埃博霉素 B和 A的流分， 合 并含有埃博霉素 B和 A的流分；
( 2 )、 将合并后的含埃博霉素 B和 A的流分稀释成适宜浓度的醇溶 液， 或者经过真空蒸发浓缩至适当体积后再稀释成适宜浓度的醇溶液， 上 H41型树脂柱， 用体积百分比为 30%-80%乙醇溶液梯度洗脱， 分段收集 洗脱流分， 经过 HPLC分析后， 分别收集含有埃博霉素 B和 A的流分， 合 并含有埃博霉素 B和 A的流分，真空浓缩至干， 即得含有埃博霉素 B和 A 的样品；
( 3 )、 用氯仿或二氯曱烷溶解含有埃博霉素 B和 A的样品或硅胶拌 样后， 上第一种正相硅胶柱， 用石油醚 /丙酮混合溶液或石油醚 /乙酸乙 酯混合溶剂进行梯度洗脱， 分段收集洗脱流分， 经过 HPLC分析后， 分别 收集含有埃博霉素 B和 A的流分， 合并含有埃博霉素 B和 A的流分， 浓 缩至干， 用乙酸乙酯 /正庚烷的混合溶剂结晶， 得含埃博霉素 B和 A的结 晶粗品;
( 4 )、 用氯仿或二氯曱烷溶解含埃博霉素 B和 A的结晶粗品或用第 二种正相硅胶柱的硅胶拌样后， 上第二种正相硅胶柱， 用石油醚 /丙酮或 石油醚 /丙酮 /二氯甲烷或石油醚 /丙酮 /氯仿的混合溶剂进行梯度洗脱， 分段收集洗脱流分， 经过 HPLC分析后， 分别收集含有埃博霉素 B的流分 和含有埃博霉素 A的流分；
( 5 )、 埃博霉素 B的流分经过乙酸乙酯 /正庚烷结晶后， 用叔丁醇溶 解并冻干， 得高纯度无定形粉末纯品； 埃博霉素 A用叔丁醇溶解并冻干， ,得到得高纯度无定形粉末纯品。
根据实际的纯度需要， 可以对本发明 （5 ) 中所获得的埃博霉素 B或 埃博霉素 A再进行纯化， 如埃博霉素 B可以釆用本发明所述的重结晶方 法进行纯化； 埃博霉素 A可以采用本发明中的第二种正相硅胶柱再进行 洗脱， 以得到更高纯度的埃博霉素 B或埃博霉素 A， 如达到纯度为 99.0% 或纯度更高的埃博霉素 B或埃博霉素 A。
其中， 埃博霉素 B: ESIMS z?/ 508 [Μ+Η]+; 'Η NMR (CDC13, 400 MHz) δ: 6.98 (1H, s， H— 19)， 6.60 (1H, bs， H-17), 5.42 (1H, dd, /= 7.9, 2.8 Hz, H-15), 4.24 (1H, ra, H—3)， 3.77 (1H, dd, J= 8.4， 4.2 Hz, H-7), 3.30 (1H, m, H-6)， 2.82 (1H, dd, /= 7.7， 4.5 Hz, H-13), 2.70 (3H， s， H-21), 2.54 (1H, dd, J= 14.1, 10.6 Hz, H-2a) , 2.38 (1H， dd, J= 14.1， 3.0 Hz, H-2b) , 2.10 (1H， m, H-14a), 2.09 (3H, d, J= 1.0 Hz, H-27), 1.90 (1H， m, H— 14b), 1.72 (2H， m， H- 8， H-lla), 1.49 (2H, ra, H— 10)， 1.41 (3H， m, H-9, and H-llb), 1.39 (3H, s， H-23), 1.28 (3H, s， H-26), 1.17 (3H, d, J= 6.8 Hz, H— 24)， 1.08 (3H， s, H-22), 1.00 (3H, d, /= 7.0 Hz, H-25); 13C NMR (CDC13, 100 MHz) δ 220.6 (s， C-5), 170.6 (s, C-l) , 165.2 (s, C-20), 151.8 (s, C— 18)， 137.6 (s， C-16), 119.6 (d, C-l 7), 116.1 (d, C-19), 76.7 (d, C-l 5), 74.1 (d, C-7), 72.8 (d, C-3) , 61.7 (d, C-12), 61.4 (s， C-l 3), 53.1 (s， C-4), 42.9 (d, C-6), 39.2 (t, C-2) , 36.4 (d, C—8)， 32.4 (t， C-ll) , 32.1 (t， C-14), 30.7 (t, C— 9)， 22.7 (q, C-26), 22.3 (t, C—10): 21.5 (q, C-23), 19.5 (q, C— 22)， 19.1 (q, C-21), 17.1 (q, C— 25)， 15.9 (q, C-27), 13.6 (q， C—24)。
埃博霉素 A ： ESIMS m/z 494 [M+ H] +; ]H NMR (CDC13, 400 MHz) δ
6.98 (1H， s， H-19), 6.60 (1H, bs, H-17), 5.44 (1H, dd, /= 8.7, 2.1 Hz, H-15), 4.20 (1H, m， H—3), 4.10 (1H, br s， 3-OH) , 3.79 (1H, dd, /= 8.4, 4.2 Hz, H-7), 3.22 (1H, m, H-6), 3.04 (1H, m, H-13), 2.92 (1H, m, H-12), 2.70 (3H, s， H-21), 2.52 (1H, dd, /= 14.5, 10.6 Hz, H-2a)， 2.42 (1H， dd, /= 14.5, 3.2 Hz, H-2b) , 2.12 (1H, ra, H-14a), 2.09 (3H， d, J= 1.0 Hz, H-27), 1.88 (1H, m, H-14b), 1.75 (2H， m, H-8, H-lla), 1.56 (1H, m， H-lOa), 1.44 (4H， m, H-9, H-lOb and H-llb) 1.41 (3H， s， H-23), 1.17 (3H, d, J= 6.8 Hz, H-24) , 1.10 (3H, s， H- 22)， 1.00 (3H, d, /= 7.0 Hz, H-25); 13C NMR (CDC13, 75 MHz) δ 220.1 (s, C-5), 170.6 (s， C-l), 165.1 (s， C-20), 151.8 (s， C- 18)， 137.5 (s， C-l 6), 119.8 (d, C-l 7), 116.2 (d, C— 19)， 76.5 (d, C-15), 74.5 (d, C-7), 73.0 (d, C-3), 57.5 (d, C-12), 54.7 (d, C-l 3), 53.0 (s， C-4), 43.3 (d, C-6), 39.0 (t, C— 2)， 36.2 (d, C— 8)， 31.5 (t， C-14), 30.5 (t， C-9), 27.2 (t， C-ll), 23.4 (t, C-10), 21.7 (q, C-23), 20.1 (q, C-22), 19.1 (q， C—21), 17.1 (q, C-25) , 15.8 (q, C-27), 14.1 (q, C-24)。
按照本发明， 埃博霉素 B和埃博霉素 A的分离纯化流程图见图 1。 本发明方法不仅能够很好地分离埃博霉素 B和 A, 使埃博霉素 B和 A 的纯度达到 95.0%以上， 优选可以达到 99.0%以上， 而且相对于现有分离 埃博霉素 B和 A的分离技术而言， 具有收率高、 工艺筒单， 可操作性强, 不需要昂贵的制备色谱柱等设备、 更加适于工业化生产， 且本发明不需 要消耗大量的毒性较高的溶剂， 如曱醇和乙腈。 附图说明
图 1 埃博霉素 B和 A的分离、 纯化流程图；
图 2 分离纯化后色谱纯度达 99.0%以上的埃博霉素 B的 HPLC色谱图； 图 3 分离纯化后色语纯度达 99.0%以上的埃博霉素 A的 HPLC色谱图； 图 4 埃博霉素 B冻干所得无定形粉末的 PXRD图（2Θ (度）应用 Cuka, λ=0.154056nm) ；
图 5 埃博霉素 A冻干所得无定形粉末的 PXRD图（2 Θ (度）应用 Cuka， λ=0.154056nm) 。 具体实施方式 实施例 1
将加入了 XAD- 1600树脂的 3吨产埃博霉素的发酵液过振动筛， 并用 水洗树脂。 树脂用 30%乙醇溶液上柱， 然后用 95%乙醇溶液洗脱， 分段收 集洗脱流分，经过 HPLC分析后，收集并合并含有埃博霉素 B和 A的流分， 浓缩至约 10L的料液， 经 HPLC (外标法）分析含有 54. 38g的埃博霉素 B 和 110. 5Gg埃博霉素人。
将上述 10L的料液配成 30%乙醇溶液， 上 H41树脂柱 ( 20cm* 300cm, 柱体积为 70L )， 分别用 30°/。， 40%, 50%, 60%的乙醇溶液， 每浓度 2柱体 积洗脱， 最后用 70%的乙醇洗脱， 分段收集洗脱流分， 经过 HPLC分析后， 收集需要的含有埃博霉素 B和 A的流分， 合并含埃博霉素 B和 A的流分 浓缩至干， 即得含有埃博霉素 B和 A的样品。
用 CHCL3溶解含有埃博霉素 B和 A的样品后，上第一种正相硅胶柱（硅 胶和样品的比例为 5: 1 ),先用 80: 20的石油醚 /乙酸乙酯洗脱 3柱体积， 然后分别用体积比为 （85: 15 )的石油醚 /丙酮梯度洗脱 2柱体积和用体 积比为（ 80: 20 )的石油醚 /丙酮梯度洗脱 4柱体积， 分段收集洗脱流分， 经过 HPLC分析后， 收集需要的含有埃博霉素 B和 A的流分， 合并含有埃 博霉素 B和 A的流分， 浓缩至干；
将含有埃博霉素 B和 A浓缩物用比例为 1: 1的乙酸乙酯 /正庚烷结 晶 2次， 得到含有埃博霉素 B和 A的结晶粗品， 经 HPLC (外标法）分析 含有 40. 26g的埃博霉素 B和 31. 81g埃博霉素 A，埃博霉素 B和埃博霉素 A的总色谱纯度为 97. 9%。
实施例 2
取实施斜 1所得埃博霉素 B和 A的混合结晶粗品 5克用 5毫升二氯 曱烷溶解后， 上第二种正相硅胶柱（4cm*80cm,硅胶量为 300克）， 硅胶 柱用二氯曱烷平衡， 然后分别用 （90: 10 )、 （85: 15 )、（83: 17 )和（80: 20 ) 的石油醚 /丙酮进行梯度洗脱， 分段收集洗脱流分， 经过 HPLC分析 后， 分别收集并合并需要的含有埃博霉素 B的流分和含有埃博霉素 A的 流分， 分别浓缩至干; 最后得到 98. 7%的 2. 40克埃博霉素 B (收率 89% ) 和 95. 8%的 1. 90克埃博霉素 A (收率 92% )。 实施例 3
取实施例 1所得埃博霉素 B和 A的混合结晶粗品 5克用 5亳升氯仿 溶解后， 上第二种正相硅胶柱（4cm*80cm，硅胶量为 300克）， 硅胶柱用 氯仿平衡， 然后分别用 ( 90: 10： 10 )、 ( 85： 15： 10 )、 ( 83: 17： 10 ) 和（ 80: 20: 10 ) 的石油醚 /丙酮 /氯仿进行梯度洗脱， 分段收集洗脱流 分， 经过 HPLC分析后， 分别收集并合并需要的含有埃博霉素 B的流分和 含有埃博霉素 A的流分， 分别浓缩至干； 最后得到 98. 9%的 2. 48克埃博 霉素 B (收率 92% )和 96. 7%的 1. 88克埃博霉素 A (收率 90% )。
实施例 4
取实施例 1所得埃博霉素 B和 A的混合结晶粗品 5克用 5毫升二氯 曱烷溶解后， 上第二种正相硅胶柱（6cm*100cm，硅胶量为 800克）， 硅胶 柱用二氯曱烷平衡， 然后分别用 （90: 10： 40 )、 ( 85: 15: 30 )、 ( 83: 17： 20 )和 （ 80: 20： 10 ) 的石油醚 /丙酮 /二氯曱烷梯度洗脱， 分段收 集洗脱流分， 经过 HPLC分析后， 分别收集并合并需要的含有埃博霉素 B 的流分和含有埃博霉素 A的流分，分别浓缩至干；最后得到 98. 5%的 2. 53 克埃博霉素 B (收率 94% )和 97. 8%的 1. 94克埃博霉素 A (收率 92% )。
实施例 5
按实施例 2-4所得埃博霉素 B通过重结晶得到高纯度的埃博霉素 B; 所得较纯埃博霉素 A通过再次硅胶得到高纯度的埃博霉素 A。
取色谱纯度为 98. 5%的埃博霉素 B样品 10克用 15mL乙酸乙酯加热至 52 °C溶解然后加入 15mL正庚烷，室温放置，然后降温至 4 °C保持 24小时， 结晶过滤重复上述操作， 最后得到 8. 7克 99. 4%的埃博霉素 B结晶纯品。
取按实施例 2-4所得埃博霉素 A的较纯色语纯度为 97. 5%的埃博霉素 A样品 5克用 5毫升二氯曱烷溶解后， 上第二种正相硅胶柱（硅胶量为 300克）， 硅胶柱用二氯曱烷平衡， 然后分别用体积比为 （ 90: 10: 40 )、 ( 85: 15： 30 )、 ( 83: 17： 20 )和（ 80: 20： 10 ) 的石油醚 /丙酮 /二氯 曱烷梯度洗脱， 分段收集洗脱流分， 经过 HPLC分析后， 收集并合并需要 的含有埃博霉素 A的流分浓缩至干；最后得到 99. 5%的 4. 3克埃博霉素 A。
按照上述方法得到的埃博霉素 B和埃博霉素 A的纯品的 HPLC色谱图 分别如图 2和图 3所示。
实施例 6
埃博霉素 B和埃博霉素 A无定形粉末的制备
通过实施例 5所得高纯度的埃博霉素 B和埃博霉素 A分别用叔丁醇 溶解并冻干， 得无定形粉末纯品。
取 0. 52克埃博霉素 B加热溶解于 50毫升叔丁醇中， 放置室温然后 放入 VIRTIS Genes i s 冷冻干燥器中在- 20°C下冷冻干燥 48小时， 然后将 所得的冷冻干燥产品在 30°C , 在高真空下进一步干燥 96小时。 在 52 °C 下，在高真空下进一步干燥 48小时。所得冻干粉末通过粉末 X-射线衍射 法测定。
取 0. 41克埃博霉素 A加热溶解于 30毫升叔丁醇中， 放置室温然后 放入 VIRTIS Genes i s 冷冻干燥器中在 -20°C下冷冻干燥 48小时， 然后将 所得的冷冻干燥产品在 30°C下， 在高真空下进一步干燥 96小时， 在 50 °C下，在高真空下进一步干燥 48小时。所得冻干粉末通过粉末 X-射线衍 射法测定。
按照上述方法得到的埃博霉素 B和埃博霉素 A的无定形粉末的 PXRD 图分别如图 4和 5所示。（粉末 X-射线衍射法测定用 Rigaku D/max-2200 ) 对比实施例 1
取实施例 1所得埃博霉素 B和 A的混合结晶粗品 5克用 5毫升二氯 甲烷溶解后， 上第二种正相硅胶柱（4cm*80cm，硅胶量为 300克）， 硅胶 柱用石油醚 /丙酮 =90: 10平衡， 然后用 （ 90: 10 ), ( 85： 15 )， ( 83: 17 ), ( 80： 20 ) 的石油醚 /丙酮梯度洗脱， 分段收集洗脱流分， 经过 HPLC分 析后， 分别收集并合并需要的含有埃博霉素 B的流分和含有埃博霉素 A 的流分，分别浓缩至干；最后得到 98. 3%的 0. 94克埃博霉素 B (收率 35% ) 和 95. 2%的 0. 72克埃博霉素 A (收率 35% )。
对比实施例 1
取实施例 1所得埃博霉素 B和 A的混合结晶粗品 5克用 5毫升二氯 甲烷溶解后， 上第二种正相硅胶柱（4cm*80cm，硅胶量为 300克）， 硅胶 柱用石油醚 /二氯甲烷 =1 : 1平衡， 然后用 （ 90: 10: 10 ), ( 85: 15: 10 )， ( 83: 17: 10 ), ( 80: 20: 10 ) 的石油醚 /丙酮 /氯仿梯度洗脱， 分段收 集洗脱流分， 经过 HPLC分析后， 分别收集并合并需要的含有埃博霉素 B 的流分和含有埃博霉素 A的流分，分别浓缩至干；最后得到 98. 4%的 0. 97 克埃博霉素 B (收率 36% )和 95. 7%的 0. 83克埃博霉素 A (收率 40% )。
对比实施例 3
取实施例 1所得埃博霉素 B和 A的混合结晶粗品 5克用 5毫升二氯 曱垸溶解后， 硅胶拌样， 真空抽干， 上第二种正相硅胶柱（4cm*80cm，硅 胶量为 300克），硅胶柱干法装填真空抽严实，然后用（ 90: 10: 10 ), ( 85： 15： 10 )， ( 83: 17： 10 )， ( 80: 20: 10 ) 的石油醚 /丙酮 /二氯曱烷梯度 洗脱， 分段收集洗脱流分， 经过 HPLC分析后， 分别收集并合并需要的含 有埃博霉素 B的流分和含有埃博霉素 A的流分， 分别浓缩至干； 最后得 到 98. 7%的 0. 81克埃博霉素 B (收率 30°/» )和 95. 4%的 0. 70克埃博霉素 A (收率 34% )。

Claims

权利 要 求
1、 一种分离和提纯埃博霉素的方法， 其特征在于， 采用正相硅胶柱 层析法进行埃博霉素 B和 A的分离和纯化， 包括： 用 - C7的烷基卤代化 合物溶解含有埃博霉素 B和 A的样品后上样或用硅胶拌样品后上样； 然 后用正相硅胶柱洗脱溶剂洗脱硅胶柱， 收集洗脱液， 最后得到产品。
2、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述的方法包括： 用 d-C7的烷基 代化合物溶解含有埃博霉素 B和 A的样品或用第一种正相 硅胶柱的硅胶拌样后， 上第一种正相硅胶柱、 然后用正相硅胶柱洗脱溶 剂进行梯度洗脱， 分别收集含有埃博霉素 B和 A的流分， 合并含有埃博 霉素 B和 A的流分， 浓缩， 结晶， 得含埃博霉素 B和 A的结晶粗品； 用 d-C7的烷基 代化合物溶解埃博霉素 B和 A的结晶粗品或用第二 种正相硅胶柱的硅胶拌样后， 再上第二种正相硅胶柱， 然后用正相硅胶 柱洗脱溶剂进行梯度洗脱， 分别收集含有埃博霉素 B的流分和含有埃博 霉素 A的流分， 分别进行浓缩、 并将含有埃博霉素 B的流分结晶， 即得。
3、 根据权利要求 2所述的方法， 其特征在于， 所述第一种正相硅胶 柱的硅胶用量与样品量的质量比为 5-10: 1; 第二种正相硅胶柱的硅胶用 量与结晶样品量的质量比为 50-200: 1。
4、 根据权利要求 3所述的方法， 其特征在于， 所述正相硅胶柱在使 用之前采用 d-C7的烷基 1¾代化合物平衡。
5、 根据权利要求 4所述的方法， 其特征在于， 所述 d- ( 7的烷基卤 代化合物选自二氯曱烷、 氯仿或其组合。
6、 根据权利要求 5所述的方法， 其特征在于， 所述正相硅胶柱洗脱 溶剂为 d- C7的烃类化合物、 d- c7的烷基卤代化合物、 c「c7的酮类化合物 或 C「C7的酯类化合物或它们的任意组合， 其中， d-C7的烃类化合物选自 石油醚、 正己烷、 环己烷和正庚烷中的一种或多种； -( 7的烷基 1¾代化 合物选自二氯甲烷、 氯仿和溴乙烷中的一种或多种； d-C7的酮类化合物 选自丙酮， 丁酮或其组合； d-C7的酯类化合物选自乙酸乙酯、 醋酸异丁 酯或其组合。
7、 根据权利要求 6所述的方法， 其特征在于， 所述正相硅胶柱洗脱 溶剂为石油醚、 乙酸乙酯、 丙酮、 氯仿和二氯曱烷中的一种、 两种或两 种以上的组合。
8、 根据权利要求 7所述的方法， 其特征在于， 所述第一种正相硅胶 柱的洗脱溶剂为石油醚与丙酮的组合或石油醚与乙酸乙酯的组合， 其中 石油醚与丙酮的体积比为 3-9: 1，石油醚与乙酸乙酯的体积比为 1-9: 1。
9、 根据权利要求 8所述的方法， 其特征在于， 第二种正相硅胶柱的 洗脱溶剂为丙酮与石油醚的组合或石油醚与丙酮与二氯甲烷或氯仿的组 合， 其中， 丙酮与石油醚的组合中， 丙酮与石油醚的体积比为 1 : 3-9; 石油醚与丙酮与二氯曱烷或氯仿的组合中， 丙酮与石油醚的体积比为 1 : 3-9， 二氯曱烷或氯仿的体积为占总体积的 5%-50%。
10、 根据权利要求 9所述的方法， 其特征在于， 用 HPLC对从硅胶柱 洗脱下来的含埃博霉素 B和 A的流分进行检测。
11、 根据权利要求 10所述的方法， 其特征在于， 结晶使用的溶剂为 正庚烷或乙酸乙酯或两者的组合。
12、 根据权利要求 11所述的方法， 其特征在于， 结晶使用的溶剂为 正庚烷和乙酸乙酯的组合， 其体积比为 1 : 1。
1 3、根据权利要求 12所述的方法，其特征在于， 结晶采用如下方法： 将含有埃博霉素 B和 A的粗品或埃博霉素 B的粗品用适量的乙酸乙酯溶 解， 然后加入正庚烷， 室温放置， 然后降温至 4 °C， 结晶即得。
14、 根据权利要求 1-1 3任一所述的方法， 其特征在于， 所述含有埃 博霉素 B和 A的样品为粘细菌发酵液经过非极性大孔吸附树脂分离得到 的产物。
15、 根据权利要求 14所述的方法， 其特征在于， 含有埃博霉素 B和 A的样品采用如下方法制备：
向发酵液中加入第一种非极性大孔吸附树脂柱的树脂， 过振动筛， 同时水洗除杂， 然后将树脂装柱， 用醇溶液进行梯度洗脱， 分别收集含 有埃博霉素 B和 A的流分， 合并含有埃博霉素 B和 A的流分；
将合并后的含有埃博霉素 B和 A流分的洗脱液稀释到适宜浓度， 上 第二种非极性大孔吸附树脂柱， 用醇溶液进行梯度洗脱， 分别收集含有 埃博霉素 B和 A的流分， 合并含有埃博霉素 B和 A的流分， 即得含有埃 博霉素 B和 A的样品。
16、 根据权利要求 15所述的方法， 其特征在于， 第一种非极性大孔 吸附树脂为 XAD- 1600型树脂；第二种非极性大孔吸附树脂为 H41型树脂。
17、 根据权利要求 16所述的方法， 其特征在于， 洗脱第一种非极性 大孔吸附树脂柱采用的洗脱溶剂为 30%- 100%体积百分比的乙醇溶液； 洗 脱第二种非极性大孔吸附树脂柱采用的洗脱溶剂为 30%- 80%体积百分比 的乙醇溶液。
18、 根据权利要求 17所述的方法， 其特征在于， 用 HPLC对从对第 一种和第二种非极性大孔吸附树脂柱洗脱下来的含有埃博霉素 B和 A的 流分进行检测。
19、 根据权利要求 18所述的方法， 其特征在于， 采用正相硅胶柱层 析法进行埃博霉素 B和 A的分离和纯化， 包括：
( 1 )、 将加入 XAD- 1600型树脂的发酵液过振动筛， 同时水洗除杂， 然后装柱， 用体积百分比为 30%-100%乙醇溶液进行梯度洗脱， 分段收集 洗脱流分， 经过 HPLC分析后， 分别收集含有埃博霉素 B和 A的流分， 合 并含有埃博霉素 B和 A的流分；
( 2 )、 将合并后的含埃博霉素 B和 A流分的洗脱液稀释成适宜浓度 的醇溶液， 或者经过真空蒸发浓缩至适当体积后再稀释成适宜浓度的醇 溶液， 上 H41型树脂柱， 用体积百分比为 30%-80%乙醇溶液梯度洗脱， 分 段收集洗脱流分， 经过 HPLC分析后， 分别收集含有埃博霉素 B和 A的流 分， 合并含有埃博霉素 B和 A的流分， 真空浓缩至干， 即得含有埃博霉 素 B和 A的样品；
( 3 )、 用氯仿或二氯曱烷溶解含有埃博霉素 B和 A的样品或硅胶拌 样后， 上第一种正相硅胶柱， 用石油醚 /丙酮混合溶液或石油醚 /乙酸乙 酯混合溶剂进行梯度洗脱， 分段收集洗脱流分， 经过 HPLC分析后， 分别 收集含有埃博霉素 B和 A的流分， 合并含有埃博霉素 B和 A的流分， 浓 缩至干， 用乙酸乙酯 /正庚烷的混合溶剂结晶， 得含埃博霉素 B和 A的结 晶粗品;
( 4 )、 用氯仿或二氯曱烷溶解含埃博霉素 B和 A的结晶粗品或用第 二种正相硅胶柱的硅胶拌样后， 上第二种正相硅胶柱， 用石油醚 /丙酮或 石油醚 /丙酮 /二氯甲烷或石油醚 /丙酮 /氯仿的混合溶剂进行梯度洗脱， 分段收集洗脱流分， 经过 HPLC分析后， 分别收集含有埃博霉素 B的流分 和含有埃博霉素 A的流分；
( 5 )、 埃博霉素 B的流分经过乙酸乙酯 /正庚烷结晶后， 用叔丁醇溶 解并冻干， 得高纯度无定形粉末纯品； 埃博霉素 A用叔丁醇溶解并冻干， 得到高纯度无定形粉末纯品。
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