CN103627650A - 一株粘质沙雷氏菌菌株及其同步萃取发酵方法 - Google Patents

一株粘质沙雷氏菌菌株及其同步萃取发酵方法 Download PDF

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Abstract

粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Xd-1菌株，保藏号为CGMCC No.7734。以及利用该菌株进行同步萃取发酵生产灵菌红素的方法，其特征在于，包括以下步骤：制备菌株的一级种子液；制备菌株的二级种子液；将一定体积V的液态发酵培养基与体积为1～8%V的二级种子液在容器中混合，在转速为130-200r/min，通氧量为0.5-1.5v/(v.m)，发酵温度为25-30℃的发酵条件下，发酵6～18小时；向容器中加入体积为8～20%V的萃取剂，在发酵条件下继续发酵，发酵总时间为32～64小时。

Description

一株粘质沙雷氏菌菌株及其同步萃取发酵方法
技术领域
本发明涉及一株高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌及其同步萃取发酵方法，尤其是一种灵菌红素的同步萃取发酵生产方法，属于发酵工业领域。 
背景技术
灵菌红素（prodigiosins）是一类具有多个吡咯环结构的天然红色素家族，1929年由Amak等研究发现的，Harashimak等首次分离并纯化鉴定出来。早期的研究主要集中在抗微生物、抗疟疾和其他生物活性。近年来，因为灵菌红素表现出的抗肿瘤、免疫抑制等优良的生物活性，受到许多国内外研究者的广泛关注，是一种十分有潜力的生物制剂。 
灵菌红素对多种恶性肿瘤具有细胞毒活性，如对人肝癌细胞、原发性癌细胞、人胰腺癌细胞、人结肠腺癌细胞以及人胃癌细胞具有靶向性和诱导凋亡作用。目前关于灵菌红素抗癌活性方面的热点主要集中在细胞凋亡、细胞周期阻断、防侵染和防转移方面。灵菌红素能够加强白细胞的活性，提高其吞噬免疫活性。研究表明与当前器官移植和治疗自体免疫性疾病常用的免疫抑制药物表现的很大毒性不同，灵菌红素是一种低毒的、潜在的新型免疫抑制药物。此外，灵菌红素还具有很好的抗疟疾、抗锥虫和抗菌活性。 
目前，灵菌红素生产研究的热点是微生物发酵法，主要是液态发酵法。国内在这方面研究较为落后，发酵水平较低，菌株的灵菌红素产量低，而且大部分研究还处于实验室摇瓶阶段。由于灵菌红素合成受群体效应的影响，因此其产量很大程度上局限于菌体量和产物抑制；同时，由于液态发酵过程中灵菌红素在胞内和胞外均有分布，导致灵菌红素提 取过程复杂、能量消耗大。 
公开号为CN101392227B（一种粘质沙雷氏菌及生产的灵菌红素）、CN102002469A（发明名称：生产灵菌红素的菌株及其方法）、CN102277323A（发明名称：高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Sm-128菌株及其应用）等专利公布了一系列产灵菌红素的粘质沙雷氏菌株及其生产灵菌红素的方法，生产方法均为常规液态发酵法，没有同步萃取发酵方面的报道。 
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种高产灵菌红素的菌株，同时提供一种同步萃取发酵的方法，提高灵菌红素的产量。为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案。 
粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Xd-1菌株，该菌株于2013年6月19日提交到中国普通微生物菌种保藏管理中心（简称CGMCC）保藏，并验证活性，于2013年6月28日获得活性检测证明，保藏号为CGMCCNo.7734。 
进一步，提供一种利用粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Xd-1菌株进行同步萃取发酵生产灵菌红素的方法，其特征在于，包括以下步骤：制备所述菌株的一级种子液；制备所述菌株的二级种子液；将一定体积V的液态发酵培养基与体积为1～8%V的所述二级种子液在容器中混合，在转速为130-200r/min，通氧量为0.5-1.5v/(v.m)，发酵温度为25-30℃的发酵条件下，发酵6～18小时；向所述容器中加入体积为8～20%V的萃取剂，在所述发酵条件下继续发酵，发酵总时间为32～64小时。 
本发明涉及的粘质沙雷氏菌的保藏信息: 
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 
保藏日期：2013年6月19日 
保藏编号：CGMCC No.7734 
分类命名：粘质沙雷氏菌Serratia marcescens 
发明的作用与效果 
本发明提供的同步萃取发酵生产灵菌红素的方法在发酵的过程中， 将灵菌红素从水相中萃取出来，减低了产物抑制，有利于提高灵菌红素的产量。同时，萃取剂相中的活性产物可以通过乙醇方便的萃取到乙醇相中，使得灵菌红素的纯化回收工艺简单快捷；回收灵菌红素之后的萃取剂可以重复利用，从而降低了生产成本。本发明提供的灵菌红素同步萃取发酵过程简单，可以实现大规模工业化应用。 
具体实施方式
下面以实例对本发明的技术方案进行详细阐述。在本发明的实施例2～6中，发酵结束后，在混匀后的发酵液5ml中，加入无水乙醇至50ml，45℃萃取1h；取出冷却至室温后取上清微滤后，以高效液相色谱（HPLC）检测灵菌红素含量，HPLC检测条件如下：HPLC仪器为Agilent1200Series；色谱柱为Sepax Bio-C18（3μm，4.6mm×150mm）；流速为0.6mL/min；检测波长为535nm；流动相A为水/三氟乙酸（TFA）=100/0.1，流动相B为乙腈/三氟乙酸（TFA）=100/0.09；柱温为28℃；进样量为10μL。其中，HPLC洗脱梯度如下：0-15min，流动相B25-90%；15-15.5min，流动相B90-25%；15.5-21min，流动相B25%。 
<实施例1>：从霉豆腐中筛选分离粘质沙雷氏菌Xd-1。 
（1）培养基：脱脂乳培养基：脱脂乳粉100g/L，琼脂粉20g/L，自然pH。 
（2）菌种筛选分离：取霉豆腐表层样品2g，加入100mL无菌水中，30℃，150r/min振荡30min。采用浓度梯度稀释法（10-1-10-4），取稀释液100uL涂布于脱脂乳培养基平板上，30℃培养24h。挑取早期为白色，后期为红色的单菌落，经过5次连续划线分离，得到性状单一的Xd-1菌株。对Xd-1进行形态学、生理生化以及16S核糖体RNA基因（16S rDNA）序列鉴定。 
（3）菌落及菌体形态 
该菌在LB培养基上，30℃培养12h后，菌落表面光滑、湿润，呈圆形，随着培养时间延长，菌落颜色有白色逐渐变为红色直至紫红色，所产色素不能扩散到培养基中。 
显微镜下观察菌体细胞呈椭圆柱形及短杆状，大小为（0.8～0.9）×（1.1～1.3）um，无芽孢、无荚膜、无鞭毛，无运动，革兰氏阴性细菌。 
（4）生理生化鉴定及16S rDNA测序鉴定 
依据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株Xd-1在发酵类型、代谢底物、营养依赖型等方面进行实验，该菌株主要生理生化特征如表1。 
表1菌株Xd-1生理生化实验结果 
将菌株Xd-1的菌体与通用引物（SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2)放入杜RiboPrinte全自动微生物指纹鉴定系统，结果显示菌株Xd-1与粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的16S rDNA序列相似度高达99%，说明两者同源性高，因此判断Xd-1菌株为粘质沙雷氏菌。 
<实施例2>：灵菌红素发酵空白对照实验 
（1）本实施例的培养基配方为： 
LB斜面培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10，琼脂粉15。 
液体种子培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10，即LB液体培养基。 
液体发酵培养基（g/L）：甘油15，蛋白胨6。 
（2）将粘质沙雷氏菌Xd-1接种在LB斜面培养基上，培养温度为30℃，培养24h，之后接种于液态种子培养基中。液态种子培养条件为：培养温度30℃，摇床转速180r/min，培养时间12h，得到一级种子液。 
按照10%接种量将一级种子液接入3L种子罐中，3L种子罐加入2L种子培养基。培养温度30℃，摇床转速180r/min，通风量1.5v/(v.m)，培养时间6h。 
（3）将二级种子液接入10L发酵罐中，10L种子罐加入7L液体发酵培养基。培养条件为：搅拌转速180r/min，通气量1.2v/(v.m)，培养温度28℃，接种量4%。发酵培养至45h，结束发酵。HPLC测定发酵液中灵菌红素产量为3.4g/L。 
<实施例3>：灵菌红素同步萃取发酵 
（1）本实施例的培养基配方为： 
LB斜面培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10，琼脂粉15。 
液体种子培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10，即LB液体培养基。 
液体发酵培养基（g/L）：甘油8，蛋白胨3。 
（2）将粘质沙雷氏菌Xd-1接种在LB斜面培养基上，培养温度为30℃，培养24h，之后接种于液态种子培养基中。液态种子培养条件为：培养温度30℃，摇床转速180r/min，培养时间12h。 
按照10%接种量将一级种子液接入3L种子罐中，3L种子罐加入2L种子培养基。培养温度30℃，摇床转速180r/min，通风量1.5v/(v.m)，培养时间6h。 
（3）将二级种子液接入10L发酵罐中，10L种子罐加入7L液体发酵培养基。培养条件为：搅拌转速130r/min，通气量0.5v/(v.m)，培养温度25℃，接种量1%。发酵培养6h之后加入8%体积，即560ml正十二烷作为萃取剂，继续发酵至32h，结束发酵。HPLC测定发酵液中灵菌红素产量为5.2g/L。 
<实施例4>：灵菌红素同步萃取发酵 
（1）本实施例的培养基配方为： 
LB斜面培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10，琼脂粉15。 
液体种子培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10，即LB液体培养基。 
液体发酵培养基（g/L）：甘油15，蛋白胨6。 
（2）将粘质沙雷氏菌Xd-1接种在LB斜面培养基上，培养温度为 30℃，培养24h，之后接种于液态种子培养基中。液态种子培养条件为：培养温度30℃，摇床转速180r/min，培养时间12h。 
按照10%接种量将一级种子液接入3L种子罐中，3L种子罐加入2L种子培养基。培养温度30℃，摇床转速180r/min，通风量1.5v/(v.m)，培养时间6h。 
（3）将二级种子液接入10L发酵罐中，10L种子罐加入7L液体发酵培养基。培养条件为：搅拌转速180r/min，通气量1.2v/(v.m)，培养温度28℃，接种量4%。发酵培养12h之后加入14%体积，即980ml正十二烷作为萃取剂，继续发酵至45h，结束发酵。HPLC测定发酵液中灵菌红素产量为9.7g/L。 
<实施例5>：灵菌红素同步萃取发酵 
（1）本实施例的培养基配方为： 
LB斜面培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10，琼脂粉15。 
液体种子培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10，即LB液体培养基。 
液体发酵培养基（g/L）：甘油30，蛋白胨10。 
（2）将粘质沙雷氏菌Xd-1接种在LB斜面培养基上，培养温度为30℃，培养24h，之后接种于液态种子培养基中。液态种子培养条件为：培养温度30℃，摇床转速180r/min，培养时间12h。 
按照10%接种量将一级种子液接入3L种子罐中，3L种子罐加入2L种子培养基。培养温度30℃，摇床转速180r/min，通风量1.5v/(v.m)，培养时间6h。 
（3）将二级种子液接入10L发酵罐中，10L种子罐加入7L液体发酵培养基。培养条件为：搅拌转速200r/min，通气量1.5v/(v.m)，培养温度30℃，接种量8%。发酵培养18h之后加入20%体积，即1.4L正十二烷作为萃取剂，继续发酵至64h，结束发酵。HPLC测定发酵液中灵菌红素产量为8.0g/L。 
<实施例6>：灵菌红素同步萃取发酵 
（1）本实施例的培养基配方为： 
LB斜面培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10，琼脂粉15。 
液体种子培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10，即LB液体培养基。 
液体发酵培养基（g/L）：甘油15，蛋白胨6。 
（2）将粘质沙雷氏菌Xd-1接种在LB斜面培养基上，培养温度为30℃，培养24h，之后接种于液态种子培养基中。液态种子培养条件为：培养温度30℃，摇床转速180r/min，培养时间12h。 
按照10%接种量将一级种子液接入3L种子罐中，3L种子罐加入2L种子培养基。培养温度30℃，摇床转速180r/min，通风量1.5v/(v.m)，培养时间6h。 
（3）将二级种子液接入10L发酵罐中，10L种子罐加入7L液体发酵培养基。培养条件为：搅拌转速180r/min，通气量1.2v/(v.m)，培养温度28℃，接种量4%。发酵培养12h之后加入14%体积，即980ml植物油作为萃取剂，继续发酵至45h，结束发酵。HPLC测定发酵液中灵菌红素产量为8.6g/L。 
实施例的作用与效果 
根据以上实施例3～6的同步萃取发酵技术，因为将灵菌红素萃取进入萃取剂中，所以减低了产物抑制，灵菌红素的产量达到5-10g/L，比对照组不加萃取剂的液态发酵方法的产量提高了200-300%，极大地提高了灵菌红素的产量。 
以上，仅为本发明的六个具体实施方式而已，并非用来限定本发明的实施范围，即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。 
Figure IDA0000367190740000011

Claims (8)

1.粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Xd-1菌株，保藏号为CGMCCNo.7734。
2.利用粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Xd-1菌株进行同步萃取发酵生产灵菌红素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备所述菌株的一级种子液；
制备所述菌株的二级种子液；
将一定体积V的液体发酵培养基与体积为1～8%V的所述二级种子液在容器中混合，在转速为130-200r/min，通气量为0.5-1.5v/(v.m)，发酵温度为25-30℃的发酵条件下，发酵6～18小时；
向所述容器中加入体积为8～20%V的萃取剂，在所述发酵条件下继续发酵，发酵总时间为32～64小时。
3.根据权利要求2所述的利用粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Xd-1菌株进行同步萃取发酵生产灵菌红素的方法，其特征在于：
其中，所述液态发酵培养为甘油和蛋白胨的水溶液，甘油的浓度为8-30g/L，蛋白胨的浓度为3-10g/L。
4.根据权利要求2所述的利用粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Xd-1菌株进行同步萃取发酵生产灵菌红素的方法，其特征在于：
其中，所述萃取剂为植物油和液态烷烃中的任意一种。
5.根据权利要求2所述的利用粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Xd-1菌株进行同步萃取发酵生产灵菌红素的方法，其特征在于：
其中，将粘质沙雷氏菌Xd-1菌株接种在固体种子培养基上，培养温度为30℃，培养24h，之后接种于液体种子培养基中。在培养温度30℃、摇床转速180r/min的条件下，培养12h，得到一级种子液。
6.根据权利要求2所述的利用粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Xd-1菌株进行同步萃取发酵生产灵菌红素的方法，其特征在于：
其中，按照10%接种量将一级种子液接入3L种子罐中，3L种子罐加入2L液体种子培养基。在培养温度30℃、摇床转速180r/min、通风量1.5v/(v.m)的条件下，培养6h，得到二级种子液。
7.根据权利要求5-6所述的利用粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Xd-1菌株进行同步萃取发酵生产灵菌红素的方法，其特征在于：
其中，所述固体种子培养基为LB斜面培养基，
所述液体种子培养基为LB液体培养基。
8.根据权利要求2所述的利用粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Xd-1菌株进行同步萃取发酵生产灵菌红素的方法，其特征在于：
其中，优选的，将一定体积V的液体发酵培养基与体积为4%V的所述二级种子液在容器中混合，在转速为180r/min，通气量为1.2v/(v.m)，发酵温度为28℃的发酵条件下，发酵12小时，然后向所述容器中加入体积为14%V的正十二烷，在所述发酵条件下继续发酵，发酵总时间为45小时。
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