RU2192873C1 - Препарат, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба pleurotus 1137 для его получения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается препарата, влияющего на тканевой обмен и обладающего противоопухолевой активностью, и продуцента физиологически активных веществ с противоопухолевой активностью. Сущность изобретения включает глубинное культивирование гриба Pleurotus ostreatus 1137 (ВКМП-F 819) с последующим отделением мицелия от культуральной жидкости и выделением из мицелия экстракцией этанолом при кислом или нейтральном значениях рН среды биологически активных веществ с антимикробной активностью, содержащих аминокислоты (глицин, аланин, теронин, серин, лейцин) и углеводы (глюкозу, глюкозамин, арабинозу, ксилозу). Изобретение также касается применения штамма Pleurotus ostreatus 1137 (ВКМП-F 819) в качестве продуцента физиологически активных веществ с противоопухолевой активностью. Преимущество изобретения заключается в разработке такого препарата, который наряду с противоопухолевой активностью способен модулировать проявления гематологической токсичности цитостатиков. 2 с. и 1 з.п.ф-лы, 12 табл., 7 ил.

Description

Изобретение относится к медицине, медицинской и биотехнической промышленностям, в частности к штаммам грибов-продуцентов биологически активных веществ и препаратов на их основе, и может быть использовано при производстве и применении физиологически активных препаратов и пищевых добавок на основе грибных продуцентов.

Исследованием лечебных свойств высших базидиальных грибов и практическим их применением в области медицины занимаются ученые ряда стран на протяжении последних 40 лет. Результаты этих исследований особо широко используются в Китае, России, Японии, Корее, США и Канаде. Среди метаболитов высших грибов выделены и идентифицированы вещества из шляпочных грибов, которые являются иммуномодуляторами и проявляют существенные противоопухолевые, кардиоваскулярные, противовирусные, противобактериальные, противопаразитарные, гепатозащитные и противодиабетические свойства /Материалы IV Международной конференции. "Наука и практика грибоводства" (М., Межрегиональная Ассоциация Грибоводов. ) 1997 г. - 92с.; Перспективы использования в медицине веществ, образуемых базидиальными грибами. Обзор (International Journal of Medicinal Mushrooms, Vol. 3,31-62, 1999)/.

Известно примерно 200 видов шляпочных грибов, которые обладают ярковыраженным эффектом ингибирования роста различных опухолей. Однако большинство веществ, входящих в состав грибов, полностью не определены.

Несмотря на относительно большое число установленных лечебных эффектов базидиомицетов, только около 10 видов используются для получения лекарственных средств.

Так, например, в Японии, России, Китае и США несколько цитостатиков-полисахаридов были разработаны и используются как лекарственные препараты. Их получают при культивировании в погруженных условиях Trametes versicolor (PSK, Krestin; Japan).

Из плодовых тел Lentinus edodes (лентинан, Япония), из Jnonotus obliguus (бефунгин, Россия), Agaricus diazei (США), получены продукты из культуральной жидкости Schizophyllum commune (сонифилан, PSG; шизофиллан, Япония) (Mizuno. 1996, Miles, Chang, 1997).

Создание новых препаратов во многом сдерживается сложной дорогостоящей технологией выделения из базидиомицстов чистых культур и веществ, обладающих стабильностью требуемых лечебных свойств. Прежде всего это обосновывается тем, что образование ценных для фармакологии метаболитов зависит от условий культивирования продуцента и, по мнению большинства авторов, носит нестабильный штаммоспсцифический характер. Поэтому в настоящее время мы не располагаем специфическими противоопухолевыми средствами, получаемыми из высших базидиомицентов, широко применяемыми в медицинской практике для профилактики и лечения онкологических заболеваний.

Для лечения онкологических заболеваний широко применяется противоопухолевая химиотерапия с использованием целого ряда цитостатиков. К наиболее эффективным и широко используемым относятся: циклофосфан, доксорубицин, вепезид, таксаны, метотрексат, 5-фторурацил, используемые на практике как отдельно, так и в сочетании друг с другом. В частности циклофосфан, доксорубицин, 5-фторурацил и таксаны являются препаратами выбора при лечении опухолей молочной железы.

Между тем, существенным ограничением в достижении максимальной эффективности противоопухолевой химиотерапии является высокая токсичность цитостатиков, в том числе и вышеупомянутых. Именно токсические проявления противоопухолевых препаратов и наиболее часто гематологическая токсичность ограничивают проведение адекватного лечения. Терапия проводится сниженными дозами лекарств с увеличением интервалов между курсами и как результат лечение бывает неудовлетворительным.

Именно поэтому активно разрабатываются подходы к снижению токсических проявлений противоопухолевых препаратов, но не один из них нельзя признать достаточно эффективным и пригодным для широкого применения.

Что касается биологически активных модуляторов токсичности, выделяемых из высших базидиомицетов, то сведения о подобного рода соединениях в литературе отсутствуют.

Известен "Препарат, влияющий на тканевой обмен и моделирующий процессы иммунитета в биологических системах, и биологически активная пищевая добавка "Мипро-ВИТ" (патент РФ 2092179, кл. А 61 К 35/84, A 23 L 1/054, 1996 г.), используемый в биотехнологии и медицине для профилактики и лечения заболеваний, связанных с нарушениями обмена веществ и функционирования иммунной системы организма, в частности способный стимулировать активность антиоксидантных систем организма и, как следствие, связывать и выводить из организма радионуклиды, кардинально нарушающие тканевый обмен в организме за счет инактивации ферментных белков. Известный препарат не применяется в медицине как модулятор токсических проявлений цитостатиков и в данном направлении не исследован.

Известен "Препарат, влияющий на тканевой обмен и применение штамма гриба Fusarium Sambucinum Fuskel var. ossicolum (berk. etciurf) bilai для его получения" (патент РФ 2040932, кл. А 61 К 35/70, 1993 г.), используемый в медицине и медицинской промышленности для профилактики и лечения заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ, обладающий адаптогенным и иммуномодулирующим действием.

Известный препарат оказывает нормализующее действие на нарушенные обменные процессы в организме, приводящие к сердечно-сосудистым заболеваниям, ожирению, диабету, иммунодефицитным состояниям, авитаминозам, а также сочетается с традиционными терапевтическими средствами, усиливая их действие на организм и снижая побочные неблагоприятные эффекты, в частности при проведении радиотерапии онкологическим больным. Однако данный препарат также не применяется в медицине как модулятор токсических проявлений противоопухолевых препаратов, так как в этом направлении не исследован.

Задачей настоящего изобретения является разработка биологически активного препарата с эффективной антимикробной активностью, влияющего на тканевой обмен и модулирующего проявление гематологической токсичности эффективных и широко применяемых в клинике противоопухолевых препаратов.

Технический результат состоит в снижении токсичности препаратов противоопухолевой химиотерапии за счет одновременного применения вместе с ними заявленного препарата с антимикробной активностью, модулирующего проявления их гематологической токсичности.

Результат достигается тем, что препарат, влияющий на тканевой обмен, получен в результате глубинного культивирования гриба Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ - F 819) с отделением от культуральной жидкости и последующим выделением из мицелия экстракцией этанолом при кислом или нейтральном значениях рН среды биологически активных веществ с антимикробной активностью, находящихся в естественных соотношениях и содержащих аминокислоты (глицин, аланин, треонин, серии, лейцин) и углеводы (глюкозу, глюкозамин, арабинозу, ксилозу) и обладает противоопухолевой активностью и способностью модулировать проявления гематологической токсичности цитостатиков. Обезвоженный продукт может производиться гранулированым, или таблетированным, или в виде гелеобразного сиропа.

Готовый продукт выполнен в виде биологически активной пищевой добавки "ОВО-Д", обладающей способностью влиять на тканевой обмен и модулировать проявление гематологической токсичности цитостатиков и проявлять противоопухолевую активность.

Штамм гриба Pleurotus ostrеаtus 1137 (ВКПМ - F 819) применяют для получения препарата, влияющего на тканевой обмен.

Штамм культуры Pleurotus ostreatus 1137 хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов, Гос. НИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ - F 819 и характеризуется следующими признаками.

Культурно-морфологическая характеристика
1. Рост на агаризованных средах
Агаризованное сусло
Мицелий хорошо развит, ватообразный. Растущий мицелий стелющийся, край колонии войлочный, ровный. Скорость роста высокая: за 7-9 суток после высева в центр чашки Петри диаметром 10 см наблюдается полное обрастание агаровой среды. Цвет мицелия белый. Экзопигмент отсутствует. При длительном культивировании (до 30 суток) цвет мицелия не меняется.

Гифы септированныс, ветвление частое, под острым или прямым углом, тип ветвления моноподиальный. Образуются пряжки. Диаметр большинства гиф от 2 до 4 мкм; также присутствуют гифы с диаметром от 1 до 8 мкм.

Пептонно-триптонный агар
Мицелий хорошо развит, войлочный, Рост стелющийся, растущий край паутинный, ровный. Скорость роста высокая. Цвет мицелия белый, при длительном культивировании (более 21 суток) возможны палевые или светло-коричневые участки. Экзопигмент отсутствует.

Соевый агар
Мицелий скудный, паутинный, сквозь мицелий видна агаровая среда. Характер роста стелющийся, растущий край ровный, паутинный. Скорость роста низкая: после высева в центр чашки Петри диаметром 10 см наблюдается полное обрастание агаровой среды только на 12-14 сутки роста. Цвет мицелия белый. Экзопигмент отсутствует.

2. Глубинное культивирование
Глубинное культивирование осуществляется в колбах емкостью 750 мл с объемом среды 40..150 мл на качалке с 200 оборотами в минуту. Засев проводили кусочками агара с мицелием.

Среда с суслом
Число колоний зависит от нагрузки посевного материала. За 10-14 суток роста образуется несколько плотных колоний округлой формы, сформировавшихся вокруг посевного материала и/или много мелких дочерних колоний. Цвет мицелия от белого до светло-бежевого. Цвет среды в процессе культивирования осветляется. Прозрачность среды не меняется. Вес мицелия находится в прямой зависимости от концентрации сусла в среде (от 0,6 до 3 баллингов).

Среда с соевой мукой
Число точек роста значительное, что связано с иммобилизацией мицелия на частицах соевой муки в среде. Рост густой кашицеобразный. При отстаивании мицелий практически не оседает.

Физиолого-биохимическая характеристика
Штамм, как и другие представители рода Pleurotus, растет на различных источниках растительного сырья, содержащих целлюлозу.

Штамм утилизирует глюкозу, сахарозу, декстрин, крахмал, целлюлозу, глицерин.

В качестве источника азота штамм использует пептон, триптон, соевую и овсяную муку.

Растет в диапазоне температур от 8 до 34^oС, сохраняет жизнеспособность при температуре от 0 до 40^oС, оптимальная температура для роста 24^oС.

Растет при значениях рН от 4 до 8, при оптимуме от 6 до 7.

Строгий аэроб
Патогенность
Штамм не патогенен для людей и животных, но, как представитель вида Pleurotus ostreatus, фитопатогенен для ослабленных лиственных деревьев. Базидиоспоры могут вызывать аллергические реакции у людей.

Антагонистические свойства
В условиях глубинного культивирования проявляется антимикробная активность в отношении грамположительных, грамотрицательных бактерий и грибов.

Новое назначение штамма Pleurotus ostreatus 1137 заключается в применении его в качестве продуцента физиологически активных веществ профилактического и лечебного назначения.

В основу изобретения положено применение штамма Pleurotus ostreatus 1137 для создания на его основе препарата, обладающего широким спектром физиологического действия в организме и не имеющего противопоказаний к применению.

Для поверхностного культивирования Pleurotus ostreatus 1137 и тест штаммов использовали триптозный агар, а также соевую агаровую среду, овсяную агаровую среду и сусло-агар.

Глубинное культивирование мицелия проводили в колбах объемом 750 мл на среде, содержащей 0,65 баллинга сусла; вода водопроводная, рН не корректировали. Также использовали среду Эттера, среду 2663, мясопептонный бульон и их модификации. Объем среды в колбах составлял 40...150 мл. Для аэрирования колбы помещали на роторную качалку с 200 об/мин. Инкубирование проводили от 7 до 24 суток при температуре 26...28^oС.

Тест-штаммы инкубировали при температуре 28...37^oС в течение 17...24 ч.

Установлено, что из числа испытанных питательных сред наиболее оптимальной для роста мицелия по биомассе и антимикробной активности является 0,65 баллинговое сусло.

Для получения препарата вначале мицелий отделяли от нативного раствора центрифугированием.

Выделение веществ из нативного раствора производили методом сорбции на амберлите с последующей элюцией смесью органических растворителей ацетон/бутанол/вода 1/1/1 при нейтральном или кислом значениях рН.

Из мицелия биологически активные вещества выделяли экстракцией этанолом при нейтральном или кислом значениях рН.

Экстракты упаривали в вакууме до сухого остатка. Сухой остаток растворяли в водном растворе этанола.

Для биологических испытаний использовали следующие фракции:
фр.1 - концентрат, выделенный из мицелия, при нейтральном значении рН;
фр.2 - концентрат, выделенный из мицелия, при кислом значении рН.

Препарат представляет собой сухую смесь или гелеобразный биологически активный препарат, обладающий антимикробной активностью.

Для определения антимикробной активности препарата в качестве тест-культур использовали грамположительные и грамотрицательные бактерии.

Грамположительные бактерии:
Bacillus mycoides 537;
Bacillus pumilis NCTC 8241;
Leuconostoc mesenteroides ВКПМ B-4177;
Micrococcus luteus NCTC 8340;
Staphylococcus aureus FDA 209P (MSSA);
Staphylococcus aureus UHA 00761 (MRSA);
Грамотрицательные бактерии:
Escherichia coli ATCC 25922;
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853;
Coimamonas terrigena ВКПМ В-7571.

Антимикробную активность препарата определяли методом диффузии в агаре.

В чашки Петри диаметром 10 см разливали по 15 мл триптозного агара. На застывшую поверхность среды высевали сплошным газоном тест-культуры.

Концентрат препарата в количестве 10 мл наносили на диски фильтровальной бумаги диаметром 6 мм. Диски помещали на поверхность агаровой среды, засеянной тест-культурами.

После суток инкубирования выявляли зоны задержки роста тест-штамма.

В результате установлено, что исследуемый штамм Pleurotus ostreatus 1137 проявляет антимикробную активность в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий (табл.1).

На основе вышеописанного штамма получен препарат, обладающий широким спектром лечебно-профилактического действия за счет содержащихся в нем различных физиологически активных веществ с антимикробной активностью.

Задача медико-биологических исследований препарата состояла в получении данных, гарантирующих безопасность его использования в лечебно-профилактических целях.

Изучены:
a) химический состав препарата;
b) влияние препарата на общие токсические проявления циклофосфана, доксорубицина, 5-фторурацила, метотрексата, в том числе:
- на клинические проявления токсичности после введения высокотоксичной дозы циклофосфана (300 мг/кг);
- на уменьшение массы тела мышей после введения высокотоксичной дозы циклофосфана (300 мг/кг); доксорубицина (10 мг/кг), 5-фторурацила (200 мг/кг), метотрексата (6 мг/кг);
- на уменьшение количества лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови мышей после введения высокотоксичной дозы циклофосфана, доксорубицина, 5-фторурацила, метотрексата;
- на уменьшение количества лейкоцитов в периферической крови мышей после введения эффективной лечебной дозы циклофосфана (100 мг/кг) и фр.1 препарата в дозе 50 мг/кг внутрибрюшинно и перорально;
c) противоопухолевая активность препарата у мышей с трансплантированным асцитным раком молочной железы Эрлиха.

Физиологическая активность заявляемого препарата изучена на мышах-самцах гибридах первого поколения f₁ (СВА/C₅₇В1) и линии ICR с массой тела 22...28 г.

На основании проведения экспериментальных исследований получены следующие результаты.

Изучение химического состава препарата производилось после упаривания этанольного экстракта в вакууме при t=40...50^oС, состоящего из смеси липофильных и гидрофильных соединений.

Растворимый в водном спирте препарат дает положительные реакции с нингидрином и анилинфтолатом, что указывает на наличие аминосодержащих и углеводных соединений (фрагментов).

В условиях кислотного гидролиза и последующего хроматографирования гидролизатов на бумаге Ф14 в системе бутанол/уксусная кислота/вода в соотношении 4/1/1 (для аминокислот) и в системе бензол/бутанол/пиридин/вода в соотношении 10/50/30/35 (для углеводов) были обнаружены следующие аминокислоты: глицин, аланин, треонин, серин, лейцин, и следующие углеводы: глюкоза, глюкозамин, арабиноза, ксилоза, находящиеся в естественных соотношениях.

В связи с обнаружением в составе биомассы штамма Pleurotus ostreatus 1137 комплекса биологически активных веществ на его основе создан препарат, влияющий на тканевой обмен, в том числе модулирующий проявления гематологической токсичности известных противоопухолевых препаратов, а также проявление противоопухолевой активности в биологических системах.

Исследование общетоксического действия препарата проводили с 2-мя фракциями препарата (фр.1, фр.2).

Каждую фракцию препарата перед применением растворяли в физиологическом растворе (0,9% раствор NaCl) и вводили мышам внутрибрюшинно в дозах 10, 20, 50, 75, 100 мг/кг ежедневно в течение 10 суток.

Критериями токсического действия исследуемых фракций препарата служили: количество павших животных, сроки гибели животных, средняя продолжительность жизни павших животных, клиническая картина интоксикации, изменение массы тела в течение всего срока наблюдения, поведение животных, данные аутопсии. При этом изменение массы тела мышей служило показателем желудочно-кишечной токсичности. Контроль за массой тела и другими вышеперечисленными показателями производили в течение 30 суток наблюдения.

Результаты общетоксического действия фракций препарата представлены на фиг.1, 2, где за нулевое значение массы принята масса мышей группы интактного контроля.

В результате проведения указанной серии экспериментов установлено следующее.

При внутрибрюшинном ежедневном 10-кратном применении фр.1 и фр.2 (см. фиг. 1, 2) во всех исследуемых дозах: 10, 20, 50, 75 и 100 мг/кг - внешних клинических проявлений не наблюдалось. При введении фр.1 и фр.2 в дозах: 10, 20 и 50 мг/кг масса тела по сравнению с интактным контролем в течение всего срока введения препарата оставалась без изменения, а после окончания введения - постепенно увеличивалась, достигнув прироста массы тела в среднем на 20%. При введении препаратов в дозах 75 и 100 мг/кг отмечены слабые токсические проявления, выразившееся в том, что масса тела животных в течение первых шести суток введения препарата незначительно транзиторно снижалась.

У животных не отмечали ухудшение аппетита, шерстный покров был гладким. Стул оформлен, обычного цвета.

При аутопсии мышей по окончании опыта (после 30 суток наблюдения) макроскопические внутренние органы без патологии.

Учитывая данные токсических исследований, дальнейшее изучение влияния препарата на токсические проявления цитостатиков было спланировано следующим образом.

А. Принимая во внимание несколько меньшую токсичность фр.1, чем токсичность фр.2, эта фракция препарата использована во всех дальнейших экспериментах.

В. Принимая во внимание эффективность, широкое использование в онкологической клинике и высокую гематологическую токсичность цитостатиков, опыты проведены с циклофосфаном, доксорубицином, 5-фторурацилом, метотрексатом.

С. При изучении влияния фр.1 препарата на общие токсические проявления высокотоксичной дозы циклофосфана (300 мг/кг), доксорубицина (10 мг/кг), 5-фторурацила (200 мг/кг), метотрексата (6 мг/кг) в каждом отдельном опыте эксперимента принимали 3 группы мышей (по 8 мышей в каждой группе). 1-ой группе цитостатик вводился однократно внутрибрюшинно в вышеуказанных дозах. Исследуемую фр. 1 препарата вводили 2-ой группе мышей в дозе 50 мг/кг пятикратно: первый раз - через 2 часа после введения цитостатика и затем, начиная со следующего дня после введения цитостатика, 1 раз в день в течение 4 суток. 3-я группа мышей в эксперименте принимала участие как интактный контроль.

Влияние фр. 1 препарата на общие токсические проявления высокотоксичной дозы циклофосфана (300 мг/кг) оценивали по количеству павших животных и продолжительности их жизни, а также по изменению массы тела мышей. Влияние фр. 1 препарата на гематоксичность высокотоксичной дозы циклофосфана (300 мг/кг) оценивали по содержанию лейкоцитов в периферической крови, которую забирали из хвостовой вены.

Контроль за массой тела проводился в течение 21 суток, в том числе в течение 5 суток введения фр.1 препарата, далее - через каждые сутки в течение двух недель. Количество лейкоцитов в периферической крови животных определяли на 1, 3 и 7 сутки после введения циклофосфана.

Внешние токсические проявления оценивали при ежедневном осмотре животных. Результаты этой серии опытов представлены в табл.2 и показаны на фиг.3, 4.

Анализируя данные, представленные в табл.2 и на фиг.3, можно отметить следующее.

Введение 1-й группе мышей циклофосфана в дозе 300 мг/кг вызвало гибель 2 из 8 мышей (ЛД₂₅). При этом у оставшихся животных на фоне нарастающей потери массы тела при осмотре отмечены взъерошенность шерсти и вялость. Эти симптомы не наблюдали на протяжении всего срока при сочетанием введении животным циклофосфана и фр.1 препарата.

В течение 12 суток после введения циклофосфана в сочетании с фр.1 отмечено меньшее падение массы тела мышей, чем при введении одного противоопухолевого препарата. Максимальная потеря массы тела в течение этого срока наблюдения составила:
при введении циклофосфана - 16,3%;
при введении циклофосфана в сочетании с фр.1 препарата - 9,2%.

При введении фр.1 препарата скорость увеличения массы тела, начиная с 13 суток после введения циклофосфана, была заметно ниже по сравнению с таковой у животных, получивших только циклофосфан, и практически совпадала с группой контрольных животных.

Таким образом, судя по уменьшению массы тела после введения высокотоксичной дозы циклофосфана (ЛД₂₅), заявляемый препарат проявляет антитоксическую активность.

Анализируя данные, представленные на фиг.4, можно отметить следующее.

При введении животным заявляемого препарата в сочетании с высокотоксичной дозой циклофосфана кривые, отражающие содержание лейкоцитов в периферической крови, в разные сроки после воздействия циклофосфана всегда во всех опытах располагались выше. По абсолютным показателям содержание лейкоцитов в крови в дни выраженной лейкопении эта разница составляет 2...5 и более раз. При этом содержание лейкоцитов в периферической крови после сочетанного применения циклофосфана и заявляемого препарата достигало физиологической нормы на 7 сутки, в то время как после введения только циклофосфана на этот срок наблюдения у мышей еще сохранялась слабо выраженная лейкопения.

Таким образом, заявляемый препарат снижает гематоксичность (выраженность и продолжительность лейкопении при введении животным высокотоксичной дозы циклофосфана).

Влияние фр.1 препарата на общие токсические проявления лечебных доз доксорубицина, 5-фторурацила и метотрексата оценивали по изменению массы тела мышей линии ICR и массы отдельных органов: печени, почек, селезенки, сердца в течение 15 суток. Результаты этой серии опытов представлены в табл. 3, 4, 5, 6, 7, 8.

При изучении влияния фр.1 препарата на общие токсические проявления цитостатиков было установлено следующее. Пятикратное введение фр.1 препарата в дозе 50 мг/кг на фоне доксорубицина показало, что изменение массы тела мышей не такое выраженное, как у животных, получавших только доксорубицин. Наоборот, мыши, получавшие фр.1 препарата совместно с доксорубицином, прибавляли в весе и по сравнению с группой мышей, которым был введен доксорубицин, прирост массы составлял от 2% до 7% и был всегда положительным. К 15 суткам у животных, принимавших фр.1 препарата совместно с доксорубицином, масса тела была такая же, как в контрольной группе, в то время как у животных, принимавших только доксорубицин, масса тела была на 10% меньше массы тела контрольной группы мышей (см. табл.3).

Пятикратное введение фр.1 препарата в дозе 50 мг/кг на фоне 5-фторурацила показало, что на 15 сутки прирост массы тела животных составлял на 14% больше массы тела контрольной группы мышей, в то время как у животных, принявших только 5-фторурацил, масса тела была на 30% меньше массы тела контрольной группы мышей (см. табл.4).

Пятикратное введение фр.1 препарата в дозе 50 мг/кг на фоне метотрексата показало, что на 15 сутки общее состояние и масса тела животных не отличалась от животных контрольной группы, в то время как у животных, принявших только метотрексат, масса тела была на 10% меньше массы тела контрольной группы мышей (см. табл.5).

При анализе результатов изменения массы органов мышей было установлено следующее. Пятикратное введение фр.1 препарата в дозе 50 мг/кг на фоне доксорубицина показало, что на 15 сутки индекс печени увеличился на 24%, почек - на 12%, селезенки - на 7%, сердца - на 20% по отношению к группе мышей, принявших только доксорубицин, и достиг значений индексов органов контрольной группы мышей (см. табл.6).

Пятикратное введение фр.1 препарата в дозе 50 мг/кг на фоне 5-фторурацила показало, что на 15 сутки индекс печени увеличился на 18%, почек - на 21%, селезенки - на 13%, сердца - на 12% по отношению к группе мышей, принявших только 5-фторурацил, при этом превысив также значения индексов органов контрольной группы мышей от 1 до 90% (см. табл.7).

Пятикратное введение фр.1 препарата в дозе 50 мг/кг на фоне метотрексата показало, что уже на 10 сутки индекс всех изучаемых органов практически не отличался от индексов органов контрольной группы мышей. Аналогичная картина наблюдалась и на 15 сутки опыта (см. табл.8).

По результатам проведения вышерассмотренной серии опытов можно заключить, что заявляемый препарат обладает защитным эффектом в отношении токсических проявлений известных противоопухолевых препаратов - циклофосфана, доксорубицина, 5-фторурацила, метотрексата - и способствует более быстрому восстановлению изученных органов (печени, почек, селезенки, сердца).

При изучении влияния фр.1 препарата на уменьшение количества лейкоцитов в периферической крови мышей после введения эффективной лечебной дозы (100 мг/кг) циклофосфана в эксперименте принимали участие 4 группы мышей (по 6 мышей в каждой группе). 1-й, 2-й и 3-й группам циклофосфан вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг.

Исследуемую фр. 1 препарата вводили в дозе 50 мг/кг пятикратно (2-й группе - внутрибрюшинно, 3-й - перорально): первый раз - через 2 часа после введения циклофосфана и затем, начиная со следующих суток после введения циклофосфана, вводили 1 раз в день в течение 4-х суток.

4-ая группа мышей в эксперименте принимала участие как интактный контроль.

Влияние фр.1 препарата на гематотоксичность циклофосфана оценивали на 1, 2, 3, 4 и 7 сутки после введения цитостатика.

Контроль за массой тела проводили ежедневно в течение 5 суток введения фр.1, далее - через сутки в течение двух недель.

Внешние токсические проявления оценивали при ежедневном осмотре животных.

Анализируя данные результатов, представленных на фиг.5 и 6, можно отметить следующее.

В опыте с 1-й группой мышей при введении 100 мг/кг циклофосфана отмечалась обычная, характерная для цитостатика гематотоксичность: уменьшение количества лейкоцитов, начиная с 1-х суток после введения циклофосфана вплоть до 4-х суток, с возвращением к нижней границе физиологической нормы к 7 суткам (немного ниже).

При введении фр. 1 препарата (2-й группе мышей внутрибрюшинно, а 3-й группе мышей перорально) в периоде нарастающей гематотоксичности циклофосфана отмечалось снижение количества лейкоцитов, однако, начиная с 1 суток после введения циклофосфана и до 7 суток, количество лейкоцитов в крови животных, получавших препарат, было выше. При этом уровень максимально выраженной лейкопении на 3 сутки у животных, получавших препарат, был меньше, чем при введении циклофосфана в 1,5...2 раза.

Таким образом, судя по полученным результатам, применение заявленного препарата при разных путях его введения уменьшает гематотоксичность циклофосфана и, следовательно, уменьшает выраженность лейкопении, проявляющейся при введении лечебных доз противоопухолевых препаратов.

При изучении влияния фр.1 препарата на уменьшение количества лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови мышей после введения эффективных лечебных доз доксорубицина (10 мг/кг), 5-фторурацила (200 мг/кг), метотрексата (6 мг/кг) в каждом опыте эксперимента принимали участие по 3 группы мышей (по 6 мышей в каждой группе). В каждом опыте 1-й и 2-й группам цитостатики вводили однократно в вышеуказанных дозах внутрибрюшинно.

Исследуемую фр.1 препарата вводили в дозе 50 мг/кг пятикратно 2-й группе мышей перорально: первый раз через 2 часа после введения цитостатиков и затем, начиная со следующих суток после введения каждого цитостатика, вводили 1 раз в день в течение 4 суток.

3-я группа мышей в каждом опыте эксперимента принимала участие как интактный контроль.

Количество лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови опытных и контрольных групп животных определяли на 5, 10 и 15 сутки после введения химиопрепаратов.

Результаты исследования рассматриваемой серии опытов представлены в табл.9, 10, 11.

При анализе данных полученных результатов было отмечено следующее.

Пятикратное введение фр.1 препарата в дозе 50 мг/кг на фоне доксорубицина показало, что во 2-й опытной группе мышей, принявших расчетную дозу препарата, на 5 сутки после введения доксорубицина произошло восстановление уровня лейкоцитов на 70% относительно 1-й группы мышей, которые получали только доксорубицин. Спустя 15 суток после введения химиопрепарата количество лейкоцитов в периферической крови данной группы мышей превысило на 30% количество лейкоцитов в периферической крови 3-й группы интактного контроля (см. табл.9).

Пятикратное введение фр.1 препарата в дозе 50 мг/кг на фоне 5-фторурацила и метотрексата показало, что во 2-й опытной группе мышей, принявших расчетную дозу препарата, на всем протяжении опыта наблюдалось увеличение количества лейкоцитов (от 9 до 77%) относительно восстановления количества лейкоцитов в 1-й группе мышей и к 10 суткам приблизилось к количеству лейкоцитов в 3-й группе мышей интактного контроля.

Аналогично наблюдалась также тенденция к активизации восстановления уровня тромбоцитов в периферической крови мышей 2-й опытной группы относительно 1-й группы мышей (см. табл.10, 11).

Таким образом, полученные данные рассматриваемой серии опытов показали, что заявляемый препарат обладает способностью уменьшать выраженность гематоксических эффектов доксорубицина, 5-фторурацила и метотрексата, что проявляется в ускорении нормализации лейкопении, развивающейся под влиянием цитостатиков.

Препарат также уменьшает миелодепрессивный эффект исследованных цитостатиков.

При изучении противоопухолевой активности препарата у мышей с трансплантированным асцитным раком молочной железы Эрлиха в эксперименте принимали участие 3 группы мышей (по 8 мышей в каждой группе):
1-я группа - трансплантированная опухоль Эрлиха с введением за месяц до этого мышам этой группы циклофосфана и фр.1 препарата. Через 2 часа после трансплантации опухоли животным вводили 100 мг/кг фр.1 препарата и затем в течение последующих 9 суток ежедневно по 100 мг/кг;
2-я группа - трансплантированная опухоль Эрлиха с введением за месяц до этого мышам этой группы циклофосфана;
3-я группа - интактный контроль с трансплантированной опухолью Эрлиха.

Ежедневно во всех 3-х группах проводили осмотр животных для оценки наличия и степени выраженности асцита (визуально и пальпатарно), а также признаков возможной интоксикации. Фиксировали сроки гибели животных. По окончании опыта рассчитывали среднюю продолжительность жизни павших животных. Противоопухолевую активность оценивали по увеличению продолжительности жизни животных экспериментальных групп относительно продолжительности жизни животных контрольной группы (в %).

Результаты исследования этой серии экспериментов приведены на фиг, 7 и в табл.12.

При анализе данных динамики гибели мышей контрольной и экспериментальных групп отмечено, что средняя продолжительность жизни павших животных составила: в 3-й группе интактного контроля 18,0 ± 0,8; во 2-й группе 18,3 ± 0,9; в 1-й группе 30,8 ± 0,8.

При этом увеличение продолжительности жизни в 1-й группе по сравнению с продолжительностью жизни в 3-й группе интактного контроля составило 71%, а во 2-й группе 1,3%.

В результате проведения данной серии экспериментов установлено, что заявляемый препарат проявляет противоопухолевую активность.

Биологически активная пищевая добавка "ОВО-Д" может быть получена биотехническим способом с использованием культуры гриба Pleurotus ostreatus 1137. Указанная культура выращивается глубинным способом в жидкой стерильной питательной среде.

Процесс получения препарата включает следующие стадии:
- подготовку и стерилизацию жидкой питательной среды;
- приготовление посевного мицелия гриба;
- выращивание мицелия на роторной качалке;
- выделение, сгущение, сушку до сухого остатка или приготовление гелеобразного сиропа и расфасовку готового продукта.

Готовый продукт подвергается стандартизации и упаковке.

Срок хранения полученного таким образом препарата без потери активности составляет 12 месяцев при температуре 4-6^oС.

Возможность получения препарата промышленным способом и возможность использования для его получения культуры Pleurotus ostreatus 1137 по новому для него назначению, а именно в качестве продуцента физиологически активных веществ, влияющих на тканевой обмен и модулирующих проявления гематологической токсичности цитостатиков, а также проявление противоопухолевой активности, иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Культуру штамма Pleurotus ostreatus 1137 хранят в пробирках на скошенном сусло-агаре при температуре 4-6^oС.

Для приготовления посевной культуры 100 качалочных колб емкостью 750 мл с 40 мл стерильной питательной среды в каждой колбе состава: 0,65 баллинговое сусло засевают агаризованными блоками культуры из пробирок.

Посевную культуру выращивают на качалке при 26^oС в течение 10 суток.

Получение биологически активной пищевой добавки (выделение, сгущение, сушка до сухого остатка и приготовление гелеобразного сиропа) осуществляется вышеописанным способом. Количество полученного готового продукта 11,5 г.

После анализа качества препарат подвергают фасовке и упаковке.

Пример 2. Выращивание посевного материала в 100 мл 0,65 баллингового сусла в каждой колбе в течение 17 суток. Остальные условия культивирования посевной культуры и получения биологически активной пищевой добавки аналогичны описанным в примере 1.

Количество полученного готового продукта 35 мг.

Пример 3. Выращивание посевного материала в 100 колбах осуществляют в 150 мл, 0,65 баллингового сусла в каждой колбе в течение 24 суток. Остальные условия культивирования посевной культуры и получения биологически активной пищевой добавки аналогичны описанным в примере 1.

Количество полученного готового продукта 50 г.

Таким образом, проведенный комплекс лабораторных исследований заявляемого препарата подтвердил его высокую физиологическую активность к снижению общих токсических проявлений цитостатиков и проявлению противоопухолевой активности.

Физиологическое действие препарата заключается в его способности оказывать влияние на тканевой обмен и модулировать проявление гематологической токсичности эффективных и широко применяемых в клинике противоопухолевых препаратов. Применение заявляемого препарата с таким физическим проявлением свойств позволит повысить эффективность противоопухолевой химиотерапии путем увеличения дозы цитостатиков на фоне снижения их токсических проявлений при профилактике и лечении онкологических заболеваний.

Claims (3)

1. Препарат, обладающий противоопухолевой активностью и способностью модулировать проявление гематологической токсичности цитостатиков, включающий глубинное культивирование гриба Pleurotus ostreatus 1137 (ВКМП - F 819) с последующим отделением мицелия от культуральной жидкости, и выделением из мицелия экстракцией этанолом при кислом или нейтральном значениях рН среды биологически активных веществ с антимикробной активностью, содержащих аминокислоты (глицин, аланин, треонин, серин, лейцин) и углеводы (глюкозу, глюкозамин, арабинозу, ксилозу).

2. Препарат по п. 1, выполненный в виде обезвоженных гранул или таблеток, или в виде гелеобразного сиропа.

3. Применение штамма Pleurotus ostreatus 1137 (ВКМП - F 819) в качестве продуцента физиологически активных веществ с противоопухолевой активностью.

Images