JPH0436187A - 抗腫瘍性デキストランの製造法 - Google Patents

抗腫瘍性デキストランの製造法

Info

Publication number
JPH0436187A
JPH0436187A JP2139906A JP13990690A JPH0436187A JP H0436187 A JPH0436187 A JP H0436187A JP 2139906 A JP2139906 A JP 2139906A JP 13990690 A JP13990690 A JP 13990690A JP H0436187 A JPH0436187 A JP H0436187A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dextran
antitumor
strain
fermbp
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2139906A
Other languages
English (en)
Inventor
Hisao Kato
久生 加戸
Yasuichi Nakakita
保一 中北
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sapporo Breweries Ltd
Original Assignee
Sapporo Breweries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sapporo Breweries Ltd filed Critical Sapporo Breweries Ltd
Priority to JP2139906A priority Critical patent/JPH0436187A/ja
Priority to CA002042536A priority patent/CA2042536A1/en
Priority to KR1019910008633A priority patent/KR910020172A/ko
Priority to DE69116601T priority patent/DE69116601T2/de
Priority to ES91108628T priority patent/ES2085377T3/es
Priority to EP91108628A priority patent/EP0459367B1/en
Publication of JPH0436187A publication Critical patent/JPH0436187A/ja
Priority to US08/212,295 priority patent/US5424201A/en
Priority to US08/369,884 priority patent/US5484715A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C12P19/08—Dextran
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/823—Acetobacter

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、優れた抗腫瘍性等の生理活性を有するデキス
トラン生産能を有する微生物または該微生物が生産する
デキストラン合成酵素を用いて該デキストランを製造す
る方法及び抗腫瘍性デキストラン生産性等を有する新規
微生物に関する。
［従来の技術］ ラクトバチルス属に属する菌株により抗腫瘍性多糖を製
造する方法はすてに特開平１−２８１０７３．特開平１
−２７７４８４．特開平２−４７１４公報等に開示され
ているが、これらはいずれも菌体自体、夾膜多糖あるい
は培養物などの粗精製物である。
［発明が解決しようする課題］ 上記従来法は微生物としてラクトバチルス属に属するが
、デキストラン産生能を有しない種の微生物を提供する
ものであった。そこで、本発明者らはデキストラン産生
能を有する種であるラクトバチルス・コンヒューサスか
産生ずるデキストランか抗腫瘍能を有することを見出し
、鋭意検討を重ねた結果、その製造法を確立し、本発明
を完成するに至ったのである。
［課題を解決するための手段］ すなわち、本発明はラクトバチルス・コンヒューサスに
属し、下記の性質を有するデキストランを生産する能力
を有する微生物、または該微生物か生産するデキストラ
ン合成酵素により該物質を産生せしめ、採取することを
特徴とする抗腫瘍性デキストランの製造法及び優れた抗
腫瘍性デキストラン生産性等を有する新規微生物に関す
る。
（１）性状：白色の無晶性粉末て無味無臭（２）溶解性
：水、ホルムアミド、ジメチルスルホキシドに可溶、ア
ルコール、アセトン、ベンゼン。
酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム、四塩化炭素に不
溶 （３）水溶液のｐＨ：中性ないし弱酸性（４）構成糖：
グルコースのみ （５）元素分析値：Ｃ：４３〜４５％、Ｈ二６，０〜６
．３％ （６）構造：α−１，６結合を主結合とするα−グルカ
ン（７）蛋白質二ローリー法によると検出されない。
（８）分子量：透析膜を通過せず、分子量１万以上と推
定される。
（９）呈色反応：アンスロン硫酸反応、フェノール硫酸
反応が陽性、ビウレット反応、ローリー・フォーリン反
応、エルソン・モルガン反応、ヨード反応が陰性。
ＱＯ）融点：明確な融点を示さない。
αυ紫外部吸収スペクトル：特徴的吸収を有さす。
αの赤外部吸収スペクトル：α−グルカンに特徴的な吸
収を示す。
α３”Ｃ−ＮＭＲスペクトル：α−１，６グルカンに特
徴的なスペクトルを示す。
（１４）抗腫瘍作用を示す。
本発明において、上記抗腫瘍性デキストランは、ラクト
バチルス・コンヒューサスに属し、上記の性質を有する
デキストランを生産する能力を有する微生物を培地に培
養することにより培養液中にデキストランを蓄積させ、
これを採取することにより得られる。また、該微生物が
生産するデキストラン合成酵素を蔗糖に作用させて抗腫
瘍性デキストランを生成せしめ、採取することによって
も得られる。
抗腫瘍性デキストラン生産能を有する微生物としては、
果物、乳製品等より分離されたラクトバチルス・コンヒ
ューサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｏｎｆｕ
ｓｕｓ）４０−１株、同４０−３株、同７７−１株、同
７８−１株及び同８０−１株があり、その菌学的性質は
以下のとおりである。
以上の性質を要約すると次のとおりになる。すわち、ｌ
ニゲラム染色陽性で通性嫌気性である。
２：形態は短桿菌である。３ニドレバロースからの酸産
生は陰性である。４：乳酸発酵のタイプかへテロ型であ
り、Ｄ、　　Ｌ画体の乳酸を産生ずる。
５：アルギニン分解が陽性である。６：デキストラン産
生が陽性である。
そこで、［パージエイズ・マニュアル・オプ・シスマチ
イック・バクテリオロジー、第２巻」（Ｂｅｒｇｅｙ’
ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙＶｏｌ、２）　（１９８６）及び
「メソッド・イン・マイクロバイオロジー１６巻Ｊ　（
Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｌ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＶｏｌ
、１６）　１４７−１７８頁（１９８４）　、によれば
、上記の諸性質によりこれらの菌株はラクトバチルス・
コンヒューサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｏ
ｎｆｕｓｕｓ）と同定された。本発明者らはそれぞれラ
クトバチルス・コンヒューサス４０−１株（ＦＥＲＭ　
ＢＰ−２８６５）、同４〇−３株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２
８６６）、同７７−１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２８６７）
。
同７８−１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２８６８）、同８０−
１株（ＦＥＲＭＢＰ−２８６９）として命名し、工業技
術院微生物工業研究所に寄託した。
上記のラクトバチルス・コンヒューサス４〇−１株、同
４０−３株、同７７−１株、同７８−１株。
同８０−１株は当該抗腫瘍性デキストランを製造する上
で、その生産性等の点て有効である。
抗腫瘍性デキストラン生産能を有する微生物を培養する
方法は、原則的には一般の微生物の培養方法に準ずれば
よいが、ラクトバチルス・コンピユーサスは特に酸素を
要求しない通性嫌気性菌であることから、通常は液体培
地による静置培養あるいは温度分布を均一にする目的で
緩和な条件での撹拌培養が有利である。直接培養により
抗腫瘍性デキストランを得る場合、培養に用いる培地と
しては、炭素源として蔗糖が抗腫瘍性デキストランの蓄
積のために必須であるほかは、抗腫瘍性デキストラン生
産菌が利用できる栄養源を含む培地であればよく、合成
培地、半合成培地、天然培地のいずれも用いられる。
炭素源として必須である蔗糖としては、粗製品から精製
品まで任意に使用てき、例えば、上白糖。
黒糖、糖蜜、廃糖蜜、試薬用サッカロース等いずれも利
用できる。蔗糖の濃度は０．５〜７０％、好ましくは５
〜５０％か望ましい。窒素源としては肉エキス、ペプト
ン、グルテンミール、大豆粉。
コーンステイープリカー、乾燥酵母、酵母エキス。
硫酸アンモニウム、尿素等か用いられ、これらの窒素源
を単独あるいは混合して０，５〜５％、好ましくは１〜
３％の割合で培地中に添加する。その他、必要に応じて
リン酸塩９食塩、マグネシウム塩、コバルト塩、鉄塩等
を適宜添加することかできる。
培養温度は通常の中温菌の培養温度に準ずれば良く、１
５〜４５°Ｃ１好ましくは２０〜３０°Ｃてあり、培養
ｐＨは５〜７、培養時間は５〜９６時間、好ましくは１
０〜２４時間であり、このような条件で培養することに
より、培養液中に抗腫瘍性デキストランを蓄積させるこ
とができる。
デキストラン合成酵素により抗腫瘍性デキストランを得
る場合には、培養に用いる培地としては、抗腫瘍性デキ
ストラン合成酵素蓄積のために炭素源として蔗糖か必須
であり、蔗糖の濃度は０．１〜５％か望ましく、他の条
件は培養ｐＨ，培養温度培養時間共に直接培養により抗
腫瘍性デキストランを得る場合と同様である。
以上の如くして得られた培養液中、抗腫瘍性デキストラ
ン合成酵素は、菌体内にも菌体外にも蓄積される。従っ
て、菌体中からの本酵素の回収を行う場合は、培養液を
超音波処理等により菌体を破砕し、あるいは界面活性剤
等により菌体中から抽出した後、遠心分離等により不溶
物を除去すればよい。また、培養液中より回収する場合
は、遠心分離等により菌体、不溶物の除去を行えばよい
。
本酵素は、このままでも十分に、粗酵素液として抗腫瘍
性デキストラン生成のために使用できるか、必要に応じ
透析、限外濾過、ゲル濾過等の分子量分画あるいは硫酸
アンモニウム等による塩析、イオン交換樹脂による処理
等を単独あるいは組み合わせて行うことにより更に精製
することかてきる。
該粗酵素液を蔗糖に作用させることにより抗腫瘍性デキ
ストランを生成せしめることかできる。
作用させる温度は２０〜４５°Ｃ１好ましくは２５〜３
５℃、時間は５〜５０時間、ｐＨは５〜７が適当である
。
生産された抗腫瘍性デキストランは通常培養液中または
反応液中に含有されるため、直接培養により抗腫瘍性デ
キストランを得た場合は、遠心分離、濾過等の方法によ
り菌体や不溶物を除去した後、メタノール、エタノール
、プロパツール、アセトン等の極性有機溶媒による沈澱
操作を繰り返すことにより精製される。更に、半透膜を
用いた透析、ゲル濾過、限外濾過、イオン交換樹脂、活
性炭等による処理を必要に応じて単独あるいは組み合わ
せて行うことによって純度の高い抗腫瘍性デキストラン
を得ることかできる。更に、噴霧乾燥、凍結乾燥、極性
有機溶媒による沈澱などを行って乾燥させることにより
、白色粉末の抗腫瘍性デキストランを得ることができる
。
以上の方法により得られた抗腫瘍性デキストランの諸性
質を以下に示す。
（１）性状：白色の無晶性粉末で無味無臭（２）溶解性
：水、ホルムアミド、ジメチルスルホキシドに可溶、ア
ルコール、アセトン、ベンゼン。
酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム、四塩化炭素に不
溶 （３）水溶液のｐＨ：中性ないし弱酸性（４）構成糖：
グルコースのみ （５ン元素分析値：Ｃ：４３〜４５％、Ｈ：　６．　０
〜６．３％ （６）構造：α−１，６結合を主結合とするα−グルカ
ン（７）蛋白質二〇−リー法によると検出されない。
（８）分子量：透析膜を通過せず、分子量１万以上と推
定される。
（９）呈色反応：アンスロン硫酸反応、フェノール硫酸
反応が陽性、ビウレット反応、ローリー・フォーリン反
応、エルソン・モルガン反応、ヨード反応が陰性 （１０）融点：明確な融点を示さない。
（１１）紫外部吸収スペクトル：第１図に示すごとく特
徴的吸収を育さず。
αり赤外部吸収スペクトル：第２図に示すごとくα−グ
ルカンに特徴的な吸収を示す。
（１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：第３図に示すごとくα−
１，６グルガンに特徴的なスペクトルを示す。
０４）抗腫瘍作用を示す。
本発明により得られる抗腫瘍性デキストランは硫酸、塩
酸、ギ酸等の希薄溶液中で穏やかに加温することによる
酸加水分解、デキストラン分解酵素による酵素分解、超
音波処理等により低分子化することかできる。低分子化
した抗腫瘍性デキストランはゲル濾過、限外濾過等によ
り分画することにより分子量を揃えることがてきる。低
分子化した抗腫瘍性デキストランのうち分子量１万以上
のものは、抗腫瘍活性等の生理活性を有していることか
判明した。
以下に、抗腫瘍活性の検定法及び後述する実施例１て得
られた抗腫瘍性デキストラン、実施例４て得られた抗腫
瘍性デキストランの低分子化物Ｌｌ（分子量１００万以
上）、Ｌ２（分子量１０万〜１００万）、Ｌ３（分子量
り万〜１０万）を投与した実験での検定結果について述
べる。
（イ）同系腫瘍メス−Ａに対する抗腫瘍性デキストラン
の腹腔内投与の効果 ６週令メス、平均体重２０ｇのＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ
−ＣＲＪマウスに１週間、同系のマウスの腹腔内で継代
した癌細胞メス−Ａをマウス１匹あたりｌ×１０５個腹
腔内に移植し、対照群２０匹（１群）、試験群１０匹（
３群）の計４群に分けた。癌細胞を移植した翌日から連
続５日間、試験群には生理食塩水に溶解した抗腫瘍性デ
キストランをマウス１匹の体重１ｋｇあたり各１０．３
０．１０ｍｇを０．１ｍｆずつ腹腔内に投与し、対照群
には同様にして生理食塩水のみを投与した。以降、生存
日数を観察し、延命効果を次式により算出した。
（ロ）同系腫瘍メス−Ａに対する抗腫瘍性デキストラン
の経口投与の効果 ６週令メス、平均体重２０ｇのＢＡＬＢ／ｃ−ＣＲＪマ
ウスに１週間、同系のマウスの腹腔内で継代した癌細胞
メス−Ａをマウス１匹あたり６Ｘ１０’個を右腋下皮下
に移植し、対照群２０匹（１群）、試験群１０匹（３群
）の計４群に分けた。癌細胞を移植した翌日から連続１
０日間、試験群には生理食塩水に溶解した抗腫瘍性デキ
ストランをマウス１匹の体重１ｋｇあたり各１０．３０
，１００ｍｇを０．２ｍｆずつ経口ゾンデを用いて胃内
に投与し、対照群には同様にして生理食塩水のみを投与
した。癌細胞を移植してから３５日後に各マウスを層殺
し、増殖した腫瘍を切り出し重量を測定した。なお、阻
止率は次式により算出した。
上記（イ）、（ロ）の方法により検定した抗腫瘍性デキ
ストランの効果は表■の通りであった。
上表より明らかなように腹膣内投与、経口投与共に３ｏ
ｍｇ／ｋｇ付近を至適投与量として抗腫瘍性デキストラ
ンは強い抗腫瘍活性を有していることが判明した。
次に、抗腫瘍性デキストランの低分子化物Ｌｌ。
Ｌ２．Ｌ３について投与量をマウスの体重１ｋｇあたり
３０ｍｇとして、上記（イ）及び（ロ）と同様の実験を
行った。結果は表■のとおりであった。
／ ／ ／ ／ ／ ／ ／ 上表から明らかなように、部分加水分解を行い低分子化
した抗腫瘍性デキストランにも加水分解前にほぼ匹敵す
る抗腫瘍活性を有することか判明した。
その他に抗腫瘍活性デキストラン及びその加水分解物は
同系腫瘍ルイス肺癌、メラノーマＢ−１６゜同種腫瘍ザ
ルコーマ１８０．エールリッヒ腫瘍等に対し投与量ｌ０
〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲で脂腺投与又は経口投与によ
り優れた抗腫瘍効果を示すことが確認されている。
次に、抗腫瘍性デキストラン及びその低分子化物Ｌ１．
Ｌ２．Ｌ３の急性毒性について言及する。
５週令のオスの５Ｄ−ＣＲＪラット、体重１２０〜１５
０ｇ、１群１０匹を用いて抗腫瘍性デキストラン、　Ｌ
ｌ、　Ｌ２．及びＬ３の物理的投与限界である１５ｇ／
ｋｇを経口投与し観察を続けたところ、金側死亡例がな
く体重増加も対照と変わらず、しかも外観上や剖検上も
全く異常か認められなかった。従って、ＬＤ、。＞１５
ｇ／ｋｇと考えられ、急性毒性はないものと判断される
。
一方、抗腫瘍性デキストランを静脈内に注射した場合の
急性毒性はＬＤｉｏ＝２８０ｍｇ／ｋｇであるのに対し
、Ｌｌ、Ｌ２．Ｌ３は分子量が小さくなるに従い、毒性
を減じ、Ｌ３ではＬＤ、。〉５ｇ／ｋｇであり、全く毒
性が見られなかった。従って、低分子化した抗腫瘍性デ
キストランは注射剤として用いる場合に大変有利な性質
を有している。
実際の製剤化については抗腫瘍性デキストラン。
Ｌｌ、Ｌ２．Ｌ３を単独で、あるいは各種賦形剤（水、
生理食塩水、ポリエチレングリコール、グリセロール、
ゼラチン、澱粉、デキストリン、セルロース、乳糖、マ
ンニトールなど）と組み合わせて、水剤、火剤１錠剤、
散剤、顆粒剤、坐剤などの剤型にて製造することができ
る。
更に、抗腫瘍性デキストランは医薬品用途のほか、毒性
が認められないこと、経口投与で健康維持に有用な種々
の生理活性を有すること、無味無臭で加工しやすいこと
などから、疾病予防用又は機能性食品等の保健用途の飲
料９食品または食品添加物として使用することもできる
。
［実施例］ 次に、本発明を実施例により更に詳しく説明する。
実施例１ （培養） ラクトバチルス・コンヒューサス４０−１株（ＦＥＲＭ
　ＢＰ−２８６５）を穿刺培養したものから５ｍｌの培
地（蔗糖２．０％、酵母エキス０．５％、リン酸水素二
カリウム２．０％、　　ｐ、Ｈ７，４）を入れた直径１
５ｍｍの試験管に菌を接種し、２６°Ｃて２４時間静置
培養した。次いて、この培養液５ｍｌを同組成の培地４
００ｍ１７を入れた５　００　ｍｌ容の三角フラスコに
いれ、２６°Ｃで２４時間培養した。
得られた培養液４００ｍｆを２０１のＳＭＩ培地（蔗糖
ｌＯ％、酵母エキス０．０５％、リン酸水素ニカリウム
０．５％、塩化ナトリウムＯ０１％、ｐＨ７，４）を入
れた３０１容ジャーファーメンタ−に接種し、２６℃で
１５時間窒素通気下で穏やかに撹拌（０，２ｖ／ｖ／ｍ
、撹拌１０ｒｐｍ）Ｌ培養を行った。
（精製） 上記培養にて得られた培養液２ＯｆをｐＨ７に調整した
後、殺菌の目的で１００℃に加熱した。
次いで、連続遠心分離機により、菌体及び不溶物の除去
を行い培養上清１８．６１！を得た。
得られた培養上清に終濃度４５％（Ｖ／Ｖ）となるよう
にメタノールを徐々に撹拌しながら添加して静置した。
傾倒して上溝液を除去後、得られた沈澱を６０％（Ｖ／
Ｖ）メタノールで洗浄した。この沈澱を再度２０Ｉ！の
イオン交換水に溶解し、メタノールによる沈澱と６０％
メタノール（Ｖ／Ｖ）による洗浄を計３回行い、噴霧乾
燥することにより２７０ｇの抗腫瘍性デキストランの白
色粉末を得た。
実施例２ 実施例１でＳＭＩ培地に蔗糖の代わりに廃糖蜜を１０％
の濃度になるように添加したこと以外は実施例１と同様
の方法で培養、精製を行い、得られた沈澱を３１のイオ
ン交換水に溶かし、凍結乾燥することにより２５１ｇの
抗腫瘍性デキストランの白色粉末を得た。
実施例３ 実施例１で得られた培養上清１００ｍ１にメタノールを
終濃度で４５％（Ｖ／Ｖ）になるように徐々に撹拌しな
がら添加して得られたモチ状の沈澱を６０％（ｖ／ｖ）
メタノールで洗浄後、１００ｍｊ７のイオン交換水に再
溶解し、水で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ
■にとおし、素通りする両分を集め、濃縮、脱塩後凍結
乾燥することにより１、１　ｇの抗腫瘍性デキストラン
を得た。
実施例４ 実施例１で得られた抗腫瘍性デキストランの粉末５．０
ｇを２％硫酸５０　Ｏｍｆに溶解し、６０°Ｃで４時間
、部分加水分解を行った。これを炭酸バリウムで中和後
、沈澱を遠心分離で除き、分画分子量１００万、１０万
、１万の膜にて限外濾過を順次行い、３両分Ｌｌ、Ｌ２
．Ｌ３、すなわち、Ｌｌ（分子量１００万以上）、Ｌ２
（分子量ｌＯＯｍｆ００万）、Ｌ３（分子量１万〜１０
万）を得た。それぞれの画分を凍結乾燥することにより
、Ｌｌ　；１．６ｇ、　Ｌ２　；１．２ｇ、　　Ｌ３　
；０．９ｇの抗腫瘍性デキストランの低分子化物の白色
粉末を得た。
実施例５ 実施例１において、ラクトバチルス・コンヒューサス４
０−１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ〜２８６５）の代わりにラク
トバチルス・コンヒューサス４０−３株（ＦＥＲＭ　Ｂ
Ｐ−２８６６）に変えたこと以外は同様の操作を行い、
抗腫瘍性デキストランの白色粉末２６３ｇを得た。
実施例６ 実施例１において、ラクトバチルス・コンヒューサス４
０−１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２８６５）の代わりにラク
トバチルス・コンヒューサス７７−１株（ＦＢＲＭ　Ｂ
Ｐ−２８６７）に変えたこと以外は同様の操作を行い、
抗腫瘍性デキストランの白色粉末２１２ｇを得た。
実施例７ 実施例１において、ラクトバチルス・コンヒューサス４
０−１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２８６５）の代わりにラク
トバチルス・コンヒューサス７８−１株（ＦＥＲＭ　Ｂ
Ｐ−２８６８）に変えたこと以外は同様の操作を行い、
抗腫瘍性デキストランの白色粉末２５０ｇを得た。
実施例８ 実施例１において、ラクトバチルス・コンヒューサス４
０−１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２８６５）の代わりにラク
トバチルス・コンヒューサス８０−１株（ＦＥＲＭ　Ｂ
Ｐ−２８６９）に変えたこと以外は同様の操作を行い、
抗腫瘍性デキストランの白色粉末２０９ｇを得た。
実施例９ ラクトバチルス・コンヒューサス４０−１株（ＦＥｌ？
Ｍ　ＢＰ−２８６５）を穿刺培養したものから５ｍｌの
培地（蔗糖２．０％、酵母エキス０．５％、リン酸水素
二カリウム２．０％、　　ｐＨ７，４）を入れた直径１
５ｍｍの試験管に菌を接種し、２６°Ｃで２４時間静置
培養した。
次いて、この培養液５ｍＩ！を同組成の培地４００ｍＩ
！を入れた５　０　Ｏｍｆ容の三角フラスコに入れ、２
６°Ｃで１７時間培養した。得られた培養物を遠心分離
（１０，０ＯＯＧ、１５分間）し、上清液３６０ｍＩ！
を得た。この上清液を限外濾過膜（アミコン■、ホロー
ファイバー、分画分子量１万）で濃縮し、さらに５ｍＭ
酢酸緩衝液　ｐＨ５，５と置換し、ｌ　ＯＯｍｆの粗酵
素液を得た。粗酵素液はトルエンを少量添加し、４°Ｃ
で保存した。
得られた粗酵素液２　Ｏｍｆを８ｇの蔗糖を溶解した５
０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）６０ｍＩ！に混ぜ合
わせ、トルエンを少量添加し、３０°Ｃで１５時間、緩
やかに攪拌させた。得られた粘稠な液に、メタノールを
終濃度４０％（Ｖ／Ｖ）になるように添加し、抗腫瘍性
デキストランを沈澱させた。
得られた沈澱は６０％（Ｖ／Ｖ）メタノールで洗浄後、
再度イオン交換水８　Ｏｍｆに溶解し、メタノール沈澱
、６０％（Ｖ／Ｖ）メタノールによる洗浄を繰り返し、
イオン交換水に溶解後、凍結乾燥することにより抗腫瘍
性デキストランの白色粉末３．２ｇを得た。
実施例１０ 実施例９で得られた培養上清液１０　Ｏｍｆに蔗糖を１
０ｇ添加し、溶解後トルエンを少量加え、穏やかに撹拌
しなから、３０°Ｃて１８時間保ち、得られた粘稠な液
にメタノールを１５　Ｏｍｆを撹拌しなから徐々に添加
しく終濃度４３％）モチ状の沈澱を得た。この沈澱を６
０％（Ｖ／Ｖ）メタノールで洗浄後再度、イオン交換水
１０　Ｏｍｆに溶解し、メタノール沈澱、６０％（Ｖ／
Ｖ）メタノールによる洗浄を繰り返し、イオン交換水に
溶解後、凍結乾燥することにより抗腫瘍性デキストラン
の白色粉末３．９ｇを得た。
実施例１１ 実施例９と同様にラクトバチルス・コンヒューサス４０
−１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２８６５）を穿刺培養したも
のから５ｍｆの培地（蔗糖２．０％、酵母エキス０．５
％、リン酸水素二カリウム２．０％、　　ｐＨ７，４）
を入れた直径１５ｍｍの試験管に菌を接種し、２６°Ｃ
で２４時間静置培養した。次いて、この培養液５ｍ７を
同組成の培地４００ｍＩ！を入れた５００ｍ１容の三角
フラスコに入れ、２６℃で１７時間培養した。
得られた培養液（３５０ｍｌりの菌体を超音波破砕機に
より破砕後、遠心分離により不溶物を除去し、遠心上溝
液３３０ｍｆを得た。得られた上溝液を実施例９と同様
に処理し、粗酵素液８〇−を得た。得られた粗酵素液２
０−を１２ｇの蔗糖を溶解した５０ｍＭの酢酸緩衝液（
ｐ　Ｈ５，５）１００イに混ぜ合わせ、トルエンを少量
添加し、３０°Ｃで１５分間、緩やかに撹拌させた。得
られた粘稠な液に、メタノールを終濃度４０％（Ｖ／Ｖ
）になるように添加し、抗腫瘍性デキストランを沈澱さ
せた。得られた沈澱は６０％（Ｖ／Ｖ）メタノールで洗
浄後、再度イオン交換水１２０ｍｆに溶解し、メタノー
ル沈澱、６０％　（Ｖ／Ｖ）メタノールによる洗浄を繰
り返し、イオン交換水に溶解後、凍結乾燥することによ
り抗腫瘍性デキストランの白色粉末５．０ｇを得た。
実施例１２ 実施例９で、ラクトバチルス・コンヒューサス４０−１
株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２８６５）の代わりにラクトバチ
ルス・コンヒューサス４０−３株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２
８６６）に変えたこと以外は同様の操作を行い、抗腫瘍
性デキストランの白色粉末２．７ｇを得た。
実施例１３ 実施例９で、ラクトバチルス・コンヒューサス４０−１
株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２８６５）の代わりにラクトバチ
ルス・コンヒューサス７７−１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２
８６７）に変えたこと以外は同様の操作を行い、抗腫瘍
性デキストランの白色粉末２．１ｇを得た。
実施例１４ 実施例９で、ラクトバチルス・コンヒューサス４０−１
株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２８６５）の代わりにラクトバチ
ルス・コンヒューサス７８−１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２
８６８）に変えたこと以外は同様の操作を行い、抗腫瘍
性デキストランの白色粉末２．４ｇを得た。
実施例１５ 実施例９て、ラクトバチルス・コンヒューサス４０−１
株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２８６５）の代わりにラクトバチ
ルス・コンヒューサス８０−１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２
８６９）に変えたこと以外は同様の操作を行い、抗腫瘍
性デキストランの白色粉末３．４ｇを得た。
［発明の効果］ 本発明によれば、純粋なグルカンであり、優れた抗腫瘍
活性等の生理活性を有し、しかも毒性の認められない抗
腫瘍性デキストランを安定に、簡便かつ効率の良い方法
で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明で得られた抗腫瘍性デキストランの紫外
部吸収スペクトル、第２図は同物質の赤外部吸収スペク
トル、第３図は同物質の”　Ｃ−ＭＮＲスペクトルであ
る。 （ｎｍ）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）ラクトバチルス・コンヒューサスに属し、下記の性
    質を有するデキストランを生産する能力を有する微生物
    を培養し、培養物から該物質を採取することを特徴とす
    る抗腫瘍性デキストランの製造法。 （１）性状：白色の無晶性粉末で無味無臭 （２）溶解性：水、ホルムアミド、ジメチルスルホキシ
    ドに可溶、アルコール、アセトン、ベンゼン、酢酸エチ
    ル、ヘキサン、クロロホルム、四塩化炭素に不溶 （３）水溶液のｐＨ：中性ないし弱酸性 （４）構成糖：グルコースのみ （５）元素分析値：Ｃ：４３〜４５％、Ｈ：６．０〜６
    ．３％ （６）構造：α−１，６結合を主結合とするα−グルカ
    ン （７）蛋白質：ローリー法によると検出されない。 （８）分子量：透析膜を通過せず、分子量１万以上と推
    定される。 （９）呈色反応：アンスロン硫酸反応、フェノール硫酸
    反応が陽性、ビウレット反応、ローリー・フォーリン反
    応、エルソン・モルガン反応、ヨード反応が陰性 （１０）融点：明確な融点を示さない。 （１１）紫外部吸収スペクトル：特徴的吸収を有さず。 （１２）赤外部吸収スペクトル：α−グルカンに特徴的
    な吸収を示す。 （１３）＾１＾３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：α−１，６グ
    ルカンに特徴的なスペクトルを示す。 （１４）抗腫瘍作用を示す。 ２）抗腫瘍性デキストラン生産能を有する微生物がラク
    トバチルス・コンヒューサス４０−１株（ＦＥＲＭＢＰ
    −２８６５）、同４０−３株（ＦＥＲＭＢＰ−２８６６
    ）、同７７−１株（ＦＥＲＭＢＰ−２８６７）、同７８
    −１株（ＦＥＲＭＢＰ−２８６８）、同８０−１株（Ｆ
    ＥＲＭＢＰ−２８６９）及びそれらの変異株からなる群
    から選ばれる１種の微生物である請求項１記載の製造法
    。 ３）ラクトバチルス・コンヒューサスに属し、下記の性
    質を有するデキストランを生産する能力を有する微生物
    を培養し、生産された抗腫瘍性デキストラン合成酵素を
    回収し、該酵素を蔗糖に作用させることを特徴とする抗
    腫瘍性デキストランの製造法。 （１）性状：白色の無晶性粉末で無味無臭 （２）溶解性：水、ホルムアミド、ジメチルスルホキシ
    ドに可溶、アルコール、アセトン、ベンゼン、酢酸エチ
    ル、ヘキサン、クロロホルム、四塩化炭素に不溶 （３）水溶液のｐＨ：中性ないし弱酸性 （４）構成糖：グルコースのみ （５）元素分析値：Ｃ：４３〜４５％、Ｈ：６．０〜６
    ．３％ （６）構造：α−１，６結合を主結合とするα−グルカ
    ン （７）蛋白質：ローリー法によると検出されない。 （８）分子量：透析膜を通過せず、分子量１万以上と推
    定される。 （９）呈色反応：アンスロン硫酸反応、フェノール硫酸
    反応が陽性、ビウレット反応、ローリー・フォーリン反
    応、エルソン・モルガン反応、ヨード反応が陰性。 （１０）融点：明確な融点を示さない。 （１１）紫外部吸収スペクトル：特徴的吸収を有さず。 （１２）赤外部吸収スペクトル：α−グルカンに特徴的
    な吸収を示す。 （１３）＾１＾３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：α−１，６グ
    ルカンに特徴的なスペクトルを示す。 （１４）抗腫瘍作用を示す。 ４）抗腫瘍性デキストラン生産能を有する微生物がラク
    トバチルス・コンヒューサス４０−１株（ＦＥＲＭＢＰ
    −２８６５）、同４０−３株（ＦＥＲＭＢＰ−２８６６
    ）、同７７−１株（ＦＥＲＭＢＰ−２８６７）、同７８
    −１株（ＦＥＲＭＢＰ−２８６８）、同８０−１株（Ｆ
    ＥＲＭＢＰ−２８６９）及びそれらの変異株からなる群
    から選ばれる１種の微生物である請求項３記載の製造法
    。 ５）ラクトバチルス・コンヒューサス４０−１株（ＦＥ
    ＲＭＢＰ−２８６５）、同４０−３株（ＦＥＲＭＢＰ−
    ２８６６）、同７７−１株（ＦＥＲＭＢＰ−２８６７）
    、同７８−１株（ＦＥＲＭＢＰ−２８６８）、同８０−
    １株（ＦＥＲＭＢＰ−２８６９）
JP2139906A 1990-05-31 1990-05-31 抗腫瘍性デキストランの製造法 Pending JPH0436187A (ja)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2139906A JPH0436187A (ja) 1990-05-31 1990-05-31 抗腫瘍性デキストランの製造法
CA002042536A CA2042536A1 (en) 1990-05-31 1991-05-14 Method for preparing an antitumor dextran
KR1019910008633A KR910020172A (ko) 1990-05-31 1991-05-27 항 종양성 덱스트란의 제조법
DE69116601T DE69116601T2 (de) 1990-05-31 1991-05-28 Verfahren zur Herstellung von Antitumordextran
ES91108628T ES2085377T3 (es) 1990-05-31 1991-05-28 Metodo de produccion de dextrano antitumoral.
EP91108628A EP0459367B1 (en) 1990-05-31 1991-05-28 Method for preparing an antitumor dextran
US08/212,295 US5424201A (en) 1990-05-31 1994-03-11 Method for preparing an antitumor dextran using Lactobacillus confusus
US08/369,884 US5484715A (en) 1990-05-31 1995-01-06 Method for preparing an antitumor dextran using a dextran synthetase from Lactobacillus confusus

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2139906A JPH0436187A (ja) 1990-05-31 1990-05-31 抗腫瘍性デキストランの製造法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH0436187A true JPH0436187A (ja) 1992-02-06

Family

ID=15256385

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2139906A Pending JPH0436187A (ja) 1990-05-31 1990-05-31 抗腫瘍性デキストランの製造法

Country Status (7)

Country Link
US (2) US5424201A (ja)
EP (1) EP0459367B1 (ja)
JP (1) JPH0436187A (ja)
KR (1) KR910020172A (ja)
CA (1) CA2042536A1 (ja)
DE (1) DE69116601T2 (ja)
ES (1) ES2085377T3 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008023664A1 (fr) * 2006-08-21 2008-02-28 Sapporo Breweries Limited Souche bactérienne possédant une activité anti-allergique, et boisson, aliment et agent anti-allergique comprenant la souche bactérienne

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5744111A (en) * 1992-07-03 1998-04-28 Kabushiki Kaisha Riken Method for cleaning exhaust gas
CA2160082C (en) * 1994-10-07 1998-11-10 Melvin E. Klegerman Mixture having antitumor activities
JP4042813B2 (ja) * 1997-10-09 2008-02-06 名糖産業株式会社 ホウ素の含有量が低減されたデキストランの製造方法
US5869645A (en) * 1997-10-15 1999-02-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Method for isolating high molecular weight antineoplastic glycans using urea
US6975892B2 (en) * 2003-10-21 2005-12-13 Oculir, Inc. Methods for non-invasive analyte measurement from the conjunctiva
US6968222B2 (en) 2003-05-02 2005-11-22 Oculir, Inc. Methods and device for non-invasive analyte measurement
US6958039B2 (en) * 2003-05-02 2005-10-25 Oculir, Inc. Method and instruments for non-invasive analyte measurement
US20060224057A1 (en) * 2003-10-21 2006-10-05 Oculir, Inc. Methods for non-invasive analyte measurement
US20080009688A1 (en) * 2004-04-14 2008-01-10 Oculir, Inc. Methods for non-invasive analyte measurement
US20060258919A1 (en) * 2004-04-14 2006-11-16 Oculir, Inc. Non-Invasive Analyte Measurement Device for Measuring Tears and Other Ocular Elements Using Electromagnetic Radiation and Method of Using the Same
CN110178897A (zh) * 2019-05-27 2019-08-30 安徽工程大学 一种低血糖生成指数的谷物发酵乳及其制备方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4396763A (en) * 1981-01-14 1983-08-02 Meiji Milk Products Company Limited High molecular polysaccharide MPS-80
JPS601877B2 (ja) * 1981-01-14 1985-01-17 明治乳業株式会社 高分子多糖類物質ｍｐｓ−８０及びその製造法
EP0103210B1 (de) * 1982-09-14 1987-11-25 Degussa Aktiengesellschaft L-2-Hydroxy-4-methylpentansäure-Dehydrogenase, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung
US4814273A (en) * 1985-03-20 1989-03-21 Michigan Biotechnology Institute Production of organic acids by an improved fermentation process
JPH01277484A (ja) * 1988-04-30 1989-11-07 Kanebo Ltd 抗腫瘍活性を有する乳酸菌株およびその培養物
JPH01281073A (ja) * 1988-05-06 1989-11-13 Kanebo Ltd 抗腫瘍活性を有する乳酸菌株およびその培養物
JP2555417B2 (ja) * 1988-06-24 1996-11-20 雪印乳業株式会社 乳酸菌培養物を有効成分とする抗腫瘍剤
JPH03291232A (ja) * 1990-04-09 1991-12-20 Sumitomo Heavy Ind Ltd 抗腫瘍、免疫賦活剤

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008023664A1 (fr) * 2006-08-21 2008-02-28 Sapporo Breweries Limited Souche bactérienne possédant une activité anti-allergique, et boisson, aliment et agent anti-allergique comprenant la souche bactérienne

Also Published As

Publication number Publication date
ES2085377T3 (es) 1996-06-01
KR910020172A (ko) 1991-12-19
US5424201A (en) 1995-06-13
CA2042536A1 (en) 1991-12-01
EP0459367B1 (en) 1996-01-24
DE69116601T2 (de) 1996-07-18
DE69116601D1 (de) 1996-03-07
EP0459367A1 (en) 1991-12-04
US5484715A (en) 1996-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH0436187A (ja) 抗腫瘍性デキストランの製造法
JPH0568580A (ja) 高級キトサンオリゴ糖乃び高級キチンオリゴ糖の製造方法
US5332667A (en) Method for producing biologically active polysaccharide RON substance
US4209507A (en) Novel anti-tumor substance and preparation thereof
US5565342A (en) Process for producing polysaccharide ron substance with a synthetase
JPH07102100B2 (ja) キチン分解物の食品素材
JPH0614792A (ja) イヌロオリゴ糖の製造法
US3044940A (en) Process for enzymatic synthesis of dextran
BE1007064A3 (fr) Enzyme de levane saccharase, procede pour sa preparation, micro-organismes qui le produisent et compositions le contenant.
JP2007306882A (ja) 酢酸菌型セラミドの製造方法
JPS6041483A (ja) 難消化性多糖類の分解能を有する菌体培養液の製造法
EP0382120B1 (en) Method for producing biologically active polysaccharide ron substance
JP2750993B2 (ja) Ｂｓ−５物質およびその製造方法
JPS62208277A (ja) イヌリナ−ゼの製造法
JP2009106278A (ja) 発酵法によるｄ−乳酸の製法
CH646873A5 (fr) Substance biologiquement active, sa preparation et les medicaments qui la contiennent.
JPH04237496A (ja) 環状イヌロオリゴ糖の製造方法
US6083927A (en) Hepatic disturbance improver
JPH0859681A (ja) ｃ−ＧＭＰ ＰＤＥ阻害物質ＦＲ９０１５２６
JP3704664B2 (ja) 新規微生物および微生物によるヘテロ多糖類の製造方法
JP3064061B2 (ja) 多糖類の製造方法
JPS6044918B2 (ja) 微生物による多糖類の製造法
JPS5912274B2 (ja) α−１．３−グルコシド結合を分解する酵素の製造法
JPH0823992A (ja) ヒアルロン酸の製造方法
KR960014108B1 (ko) 미생물 직접 발효에 의한 사이클로덱스트린(Cyclodexrin)의 제조방법