JPH01277484A - 抗腫瘍活性を有する乳酸菌株およびその培養物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、抗腫瘍活性を有する新規な乳酸菌株及び該乳
酸菌株を用いて得た抗腫瘍活性を有する培養物に関する
。

［従来の技術］ 従来よりヨーグルト等の発酵乳製品に抗腫瘍活性がある
ことか知られており、その医薬や、腫瘍発生予防の分野
などへの利用が注目されつつある。

抗腫瘍活性を有する、すなわち抗腫瘍活性成分を菌体内
あるいは菌体外に産生ずる乳酸菌としては、ラクトバチ
ルス　カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ　１ｌｕｓ靜且叫）
、ラクトバチルス　ヘルペチカス　ハ　−ユーグルティ
（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ
　ｖａｒｊｕｇｒｕｔｉ）、ラクトバチルス　ブルカリ
カス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｌｇａｒｉｃ
ｕｓ）、スタフィロコッカスサーモフィラス（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、
ストレプトコッカス　ピオゲネス（針μｍ切−ｃｏｃｃ
ｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）などが知られている。

［発明が解決しようと１−る諜Ｕ］ 上述のように、発酵乳製品に抗腫瘍活性があることが注
目され、その医薬や、腫瘍発生予防の分野への利用が検
討されているが、十分に満足できる結果がこれまでに得
られていないのが現状である。

例えば、先に挙げた各微生物についての抗腫瘍活性の応
用が検討されているが、これらの菌から得られる抗腫瘍
活性成分は実用上必すしも満足すべきものではない。

そこで、本発明者らは、上述したような発酵乳製品の抗
腫瘍活性の応用のために、実用上高い抗腫瘍活性を有す
る乳酸菌を得るべく鋭意検討を重ねた。

その結果、北欧系のヨーグルト中に高い抗腫瘍活性を有
する乳酸菌株の存在を見い出し、それを単離・同定する
ことに成功し本発明を完成した。

本発明の目的は、実用上高い抗腫瘍活性を有する新規な
乳酸菌株及び該乳酸菌株を用いて調製された抗腫瘍活性
培養物を提供することにある。

［課題を解決するだめの手段］ 本発明の抗腫瘍活性を有する乳酸菌は、ラクトコッカス
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　、旧名ストレプトコッカス
（Ｓｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ）　）属に属するラクト
コッカスラクチス　サブスペシー　ラクチス（１山−ｃ
ｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　５ｕｂｓｐ、Ｉａｃｔｉｓ
）及びラクトコッカス　ラクチス　サブスペシー　り　
レモ　リ　ス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉａｃｔｉｓ
　５ｕｂｓｐ、ｃｒｃｍｏｒｉｓ）である。

これらの本発明の乳酸菌は、主にスウェーデンにおいて
生産されている粘質タイプのヨーグルトであるロングフ
ィル（ｒＬＡＮＧＦ　Ｉ　ＬＪという一般名で販売され
ている）から単離されたものであり、表３及び表４に示
したような蘭学的性質を有する。

特に、これらの菌は、粘着性の莢膜多糖を生産する点に
おいて特徴的てあり、これは顕微鏡によって容易に観察
できる。例えば、第１図の顕微鏡写真では、菌体の周辺
に白く見える部分が粘着性の莢膜多糖の生産を示してい
る。

これら本発明の乳酸菌は、Ｓａｒｃｏｍａ　１８０の腹
水腫瘍及び固型腫瘍に対し高い腫瘍抑制効果を示し、更
に肺転移性のルイス肺癌に対しても抑制効果があるなど
優れた抗腫瘍活性を有する。

本発明の乳酸菌の優れた抗腫瘍活性を利用することによ
り、医薬や、腫瘍発生予防等において有用な抗腫瘍活性
成分を提供てきる。

本発明の乳酸菌を利用する形態としては、該菌体自体ま
たは該菌の培養から得られる培養物、あるいは菌体や培
養物から分解、抽出、精製等の各種処理を経て得られる
調製物としての利用が挙げられる。

例えば、菌体自体あるいは菌の培養物を利用する場合に
は、適当な培地でこれらの菌をそれぞれ個別に、あるい
は混合して培養し、得られた培養菌体あるいは培養物を
、直接あるいは例えば製剤化などの必要に応じた処理を
して利用することができる。

その際の培地や培養条件は、所望の抗腫瘍活性が得られ
ように設定し、また得られる培養物の所望の形態に応じ
て適宜変更すれば良い。

例えば、菌体自体や培養物を利用する場合には、菌の良
好な増殖及び所望の抗腫瘍活性が得られる条件を設定す
れば良く、また培養物を発酵乳、乳酸飲料等の食品の形
態で利用する場合には、得られる製品の風味、テクスチ
ャー等を考慮した条件を設定すれば良い。

なお２、莢膜多糖を生産させる場合には、培養温度をｌ
Ｏ℃〜３７℃の範囲に設定するのが好ましく、特に１５
℃〜２５℃が好ましい。

また、本発明の乳酸菌に粘着性の莢膜多糖を生産させる
ことにより、得られる発酵乳等の食品に独特の粘着性の
テクスチャーを付与することができる。

本発明の乳酸菌の培養に用いる培地や培養条件としては
、通常乳酸菌を培養する際に用いられている培地などか
ら選択して用いることができる。

また、発酵乳等の食品の製造に用いる原料や製造工程と
しても、通常の発酵乳等の製造に用いられているものな
どが利用できる。

例えは、原料に用いる乳成分としては、ウシ、ヤギ、ヒ
ツジ等に由来する乳や、脱脂粉乳、粉乳、製乳などを用
いて調整された乳などが利用できる。

なお、得られる培養物の形態に応じては、他の菌との混
合状態で本発明の乳酸菌を用いてもよい。例えは、発酵
乳の製造においては、スターターに、本発明の乳酸菌の
他に、得られる製品の風味やテクスチャーの調製のため
の他の乳酸菌等を含むものを利用しても良い。また、通
常用いられているスターターに本発明の乳酸菌を追加し
て発酵乳を得ることによって本発明の発酵乳を得ること
かてきる。

［実施例］ 以下参考例および実施例により本発明を更に詳細に説明
する。

なお、以下において用いられる「％」は特に断わらない
限り重量／容量％を示す。

参考例１ １０％のスキムミルク培地（１１５℃、１５分加熱滅菌
処理したもの）　１８０ｍ１に、ロングフィルの２０ｍ
１を無菌的に加え、２０℃で４８時間培養し、得られた
発酵乳を凍結乾燥し、−３０℃で保存した。

また、同様の加熱滅菌処理スキムミルクに、ロツピーヨ
ーグルト［メンケン（ＭＥＮＫＥＮ）社（オランダ）製
］の２０ｍ１を無菌的に加え、４０℃で５時間培養し、
得られた発酵乳を凍結乾燥し、−３０℃で保存した。

次に、Ｃ５７ＢＬ／６　（Ｂ６）マウス（雄、５週齢、
静岡県実験動物農業協同組合より人手）の腋下部皮下に
２　Ｘ　１０”個のルイス肺癌細胞（東北大学附属抗酸
菌病研究所より人手）を移植し、上記のようにして得ら
れた２種の発酵乳の凍結乾燥試料をそれぞれ個々に用い
、９日間第１日目から毎日（５０ｍｇ／ｋｇ１０．１ｍ
ｌ生理食塩水）腹腔内投与した。

なお、対照マウスには、生理食塩水のみを投与した。

用いた試料の抗腫瘍活性は、以下の項目において対照群
と投与群を比較することによって評価した。得られた結
果を表１及び表２に示す。

移植局所腫瘍体積； 下記式（１）により移植局所腫瘍体積を算出した。

移植局所腫瘍体積Ｖ　（ｃｍ”）　＝＝　１　／　２　
ａ　ｂ２・・・（Ｉ） （ａ・腫瘍巣長径　　ｂ　腫瘍巣短径）移植局所腫瘍湿
重量及び肺への転移腫瘍巣数：投与後２１ローに移植局
所腫瘍及び肺を摘出し、移植局所腫瘍湿重量及び肺への
転移腫瘍単数を測定した。

表　　１ 亀 表　　２ のマウスを用いた（Ｎ＝６）。

実施例１ （本発明の乳酸菌の単離・同定） ロングフィルを試料として用い以下の操作を行なった。

１）試料中の総画数の測定 ブリート（Ｂｒｅｅｄ）法を用いて菌塊法により測定し
た。その結果、総画数は４．３］Ｘ　１０８個／ｍｌで
あった。

２）試料中の生菌数の測定 以下の組成のＭ１７培地に寒天（八ｇａｒ　Ｎｏ、ｌ、
０ｘｏｉｄ社製）を１．５重量／容量％の割合で加えた
Ｍ１７寒天培地、及びに、生理食塩水で希釈したロング
フィル（希釈率：　１０−’、１Ｏ−５及びＩ（１−６
）を塗抹し、３０℃、２日間、ガスバック法（ＢＢＬ社
製）で嫌気培養し、生じたコロニーの数と希釈倍率から
生菌数を算出した。その結果、生菌数は２．９５Ｘ　１
０８個／ｍｌであった。

Ｍ１７１７培地： ポリペプトン （Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｏｎｅ、Ｂ　Ｂ　Ｌ社製）　　　　
　・５．［１ｇヒュトンペプトン （Ｐｈｙｔｏｎｅ　ｐｅｐｔｏｎｅ、　Ｂ　Ｂ　Ｌ社製
）　　　・５．０ｇ酵母エキストラクト （Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、大玉栄養化学社製）・
５．０ｇビーフエキストラクト （Ｂｅｅｆ　ｅｘｔｒａｃｔ、極東社製）　　　　　−
２、５ｇＤ−グルコース　　　　　　　　　　　　　　
・・・５．０ｇアスコルビン酸　　　　　　　　　　　
・・・０．５ｇβ−ジソディウム　ダリセロホスフェー
ト（β−Ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ　）　＝４９．０１、ＯＭ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ
２０＝弓、Ｏｍｕ水　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　・・・１　立（ｐＨ７，１） ３）菌株の分離 生菌数の測定において得られた寒天培地上のコロニーか
ら性状（コロニー形状は円形で半円形状に盛り上がって
おり、またその表面にツヤを有し、更に乳白色で糸を引
く粘性を有する）の同じ孤立コロニーを、釣菌分離した
。

分離した株を構成する菌を顕微鏡で観察したところ、桿
菌の存在は認められず、いずれも第１図に示すように球
菌であった。

得られた各株を個々に上述のＭ］７培地で３０℃、７２
時間培養し、更にＭ１７培地を用いた３０℃、２週間の
継代培養を行ない保存株とした。

４）菌株の同定 上記３）項て分離した各株のそれぞれを以下の同定試験
に供した。

なお、試験はすべて二連で行なった。また、以下におけ
る各培養における温度は特に断らないかきり、分離の際
の培養と同じ温度（３０℃）で行なった。更に、培地の
オートクレーブでの滅菌処理条件は、還元脱脂乳培地て
は、１１５℃、１５分間、その他の培地では１２１℃、
１５分間とし、液体培養は静置培養で行なった。

同定のための基準株は以下のとおりである。

ａ　）　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　５ｕ
ｂｓｐ、　１ａｃｔｉｓ　ＧＩＦＬＩ８５９１”　　　
（−ＮＣＤＤ　　８０４−八ＴＣＣ：　　］９４３５）
ｂ　）　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　５ｕ
ｂｓｐ、ｃｒｅｍｏｒｉｓ　ＧＩＦｕ８５９０”　（＝
ＮＣＤＯ６０７） ｃ　）Ｓｔｒｅ　　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　　５ａｌｉｖａ
ｒｊｓ　　５ｕｂｓｐ、ｔｈｅｒｍｏ−１川１↓旦下　
ＧＩＦＵ　　８５９３”　　（＝ＮＣＤ０　５７３−八
ＴＧＣ１９２５８）［ａ　”−ｃはいずれも岐阜大学医
学部微生物教室から人手］ ｄ　）　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　５ｕ
ｂｓｐ、　１ａｃｔｉｓ　ＮＣＤ０１７ｔｉ　（＝Ｓｔ
ｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　５ｕｂｓｐ、
　ｄｉ−基ａ刃Ａ晧Ｕ） ［ＡＦＲＣＩｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ、ＲｅａｄｊｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、
　５ｈｉｎｆｉｅｌｄ、　Ｒｅａｄｉｎｇ　、　Ｅｎｇ
ｌａｎｄから人手］ ｅ　）　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅ
ｃｋｉｉ　５ｕｂｓｐ。

ｂｕｌａｒｉｃｕｓ　ＪＣＩ４１００２Ｔ（＝ＡＴＣＣ
１１８４２）　［理化学研究所微生物系統保存施設から
入手１ なお、ｌ”Ｔ］はｔｙｐｅ　５ｔｒａｉｎを示す。ａと
ｅの培養は３７℃て、またｂ−ｄは３０℃で行なった。

（１）ダラム染色 保存株から採取した菌体を、Ｍ１７培地て、７２時間培
養して得られた培養液から菌体をスライドグラスに一白
金耳取り、Ｈｕｃｋｅｒの変力性によるグラム染色を行
なった。なお、比較対照のため、ダラム陰性菌（−）で
あるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ並旦を用いて同様の操作を
行なった。

（２）カタラーゼ試験 スライドグラスに３％過酸化水素水を取り、これに保存
株から採取した菌体をＭ１７培地で７２時間培養して得
た培養液から菌体を一白金耳加え、気泡の発生の有無を
観察し、気泡を発生した場合をカタラーゼ陽性菌性（＋
）と判定した。

なお、比較対照のため、カタラーゼ陽性菌（＋）である
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉを用いて同様の操作
を行なった。

（３）　Ｈａｕｇｈ−ＬａｉｆｓｏｎのＯ−Ｆ試験以下
に示ず組成のＹｅａｓｔ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｌｅｍｃｏ
　Ａｇａｒを５ｍｌずつ１５０　ｘ　１６ｍｍの試験管
２本に入れ滅菌後、これらの試験管を直ちに氷水に入れ
て冷却し、培地を凝固させた。

次に、これら凝固培地に、保存株から採取した菌体なＭ
１７培地で７２時培養して得た培養液から菌体を白金線
に取り、穿刺植菌した。

更に、２本の試験管の一方には、滅菌した流動パラフィ
ンを培地上に１〜２ｃｒｒｌの厚さの層となるように注
加した。

７日間の培養後、菌体の生育及び培地の色の変化を観察
した。

培地の色が紫色から黄色に変化した場合に酸の生成あり
、パラフィンを注加した試験管及び注加しない試験管の
両方で生育するものを発酵を行なう菌（Ｆ）、またパラ
フィンを注加していない試験管のみで生育するものを酸
化を行なう菌（０）と判定した。

Ｙｅａｓｔ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｌｅｍｃｏ　Ａｇａｒ組
成：ペプトン（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ　ｐｅｐｔｏｎｅ
、　　　−１０，ＯｇＢＢＬ社製） Ｌａｂ−Ｌｅｍｃｏ　ｍｅａｔ　ｅｘｔｒａｃｔ（Ｌａ
ｂ−Ｌｅｍｃ。

ｐｏｗｄｅｒ、　ｏｘｉｏｄ社製）　　　　　　　−１
０，０ｇ塩化ナトリウム　　　　　　　　　・・・　５
．ＯｇＤ−グルコース　　　　　　　　　　　・・・　
５．０ｇイースト　エキストラクト （大玉栄養化学社製）　　　　　　・・・　３．０ｇ１
％ブロムクレゾール　パープル （Ｂｒｏｍｃｒｅｓｏｌ　ｐｕｒｐｌｅ）溶ｔｅｌ　　
　−４ｍＪＺ寒天 （Ａｇａｒ　Ｎｏ、１，０ｘｏｉｄ社製）　　　　　・
２．０ｇ水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　・・・　ＩＪ２（ｐｉ（７，０） （４）　ｌｌｏｍｏＨｏｍｏ型発酵Ｉ　ｅ　ｔ　ｅ　ｒ
　ｏ型発酵の判定１５０　Ｘ　１６ｍｍの試験管に、５
ｍｌの以下に示す組成のＧｉｂｓｏｎ’　ｓ　　Ｓｅｍ
１−５ｏｌｉｄ　Ｔｏｍａｔｏ　Ｊｕｉｃｅ　Ｍｅｄｉ
ｕｍを入れて滅菌し、滅菌後は培地が凝固しないように
これを４５℃に保温した。

Ｇｉｂｓｏｎ’　ｓ　　Ｓｅｍ１−５ｏｌｉｄ　Ｔｏｍ
ａｔｏ　Ｊｕｉｃｅ　Ｍｅｄｉｕｍ組成： イースト　エキストラクト （大玉栄養化学社製）　　　　　・・・２．５ｇＤ−グ
ルコース　　　　　　　　　　　・・・５Ｑ、０ｇトマ
トジュース（ｐＨ６，５）　　　　　　　−１００ｍｊ
ｌ！１０％還元脱脂乳 （Ｒｅｃｏｎｓｔ、１ｔｕｔｅｄ　ｓｋｉｍ　ｍ１ｌｋ
）　　　−・・８００ｍｕＮｕｔｒｉｅｎｔ　ａｇａｒ
　　　　　　　　　　−−−２００＋ｎＪ２（ｐＨ６，
５） 次に、保存株から採取した菌体のＭ１７培地ての７２時
間前培養液（約０．５ｍｌ　）を、上記の試験管中の培
地に加え攪拌後、冷水でこれを急冷した。

更に、試験管内の菌体が加えられた凝固培地上に以下の
組成のＮｕｔｒｉｅｎｔ　八ｇａｒを２〜３ｃｍの層厚
となるように注加した。

７日間の培養後、培地に亀裂や気泡の発生が認められる
場合をＨｅｔｅｒｏ型発酵、亀裂や気泡の発生が認めら
れない場合をＨｏｍｏ型発酵と判定した。

Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ組成； ペプトン（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ　ｐｅｐｔｏｎｅ、　
　　・・・１０．ＯｇＢＢＬ社製） Ｌａｂ−Ｌｅｎ＋ｃｏ　ｍｅａｔ　ｅｘｔｒａｃｔ（Ｌ
ａｂ−１、ｅｍｃ。

ｐｏｗｄｅｒ、　ｏｘｉｏｄ社製）　　　　　　　−１
０，０ｇ塩化ナトリウム　　　　　　　　　・・・　５
．０ｇ寒天 （八ｇａｒ　Ｎｏ、ｌ、０ｘｏｉｄ社製）　　　　　・
１５．０ｇ水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　・・・　１ｋ（ｐＨ７，２） （５）生育温度 以下に示ずＹｅａｓｔ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｌｅｍｃｏ　
Ｂｒｏｔｈ　　（１５０Ｘ１６ｍｍ試験管中、５ｍ１）
に保存株から採取した菌体を接種して７２時間の前培養
を行ない、得られた培養液から菌体を三白金耳同様の培
地（１５０Ｘ１Ｂｍｍ試験管中、５ｍ１）に接種し、１
０±０．］℃で７日間培養した。

Ｙｅａｓｔ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｌｅｍｃｏ　Ｂｒｏｔｈ
組成；ペプトン（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ　ｐｅｐｔｏｎ
ｅ、　　　＝・１０．ＯｇＢＢＬ社製） Ｌａｂ−Ｌｅｍｃｏ　　ｍｅａｔ　　ｅｘｔｒａｃｔ（
Ｌａｂ−Ｌｅ＋ｎｃ。

ｐｏｗｄｅｒ、　ｏｘ　ｉｏｄ社製）　　　　　　　・
１０．０ｇ塩化ナトリウム　　　　　　　　　・・・　
５．ＯｇＤ−グルコース　　　　　　　　　　　・・・
　５．０ｇイースト　エキストラクト　　　　・・・　
３．０ｇ（大玉栄養化学社製） 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・
　１ｕ（ｐＨ７，０） 培養終了後、培養液の５２０ｎｍでの濁度を測定し、対
照（菌体を接種していない培地）よりも０．２７以上高
い場合に菌生育あり（つ　と判定した。

更に、前培養を１０９６還元脱脂乳培地で４８時間行な
い、得られた培養液から菌体を三白金耳生育試験用培地
としての以下の組成のＬｉｔｍｕｓ　Ｍｉｌｋ１５０　
Ｘ　１８ｍｍ試験管中、５１Ｔ１１）に接種したものを
３種用意し、それぞれを３７±０．１．４８時間；　３
９．５±０．１．４８時間及び４５±０．１℃、２４時
間の各条件で培養した。

Ｌｉｔｍｕｓ　Ｍｉｌｋ組成： ＩＯ主還元脱脂乳 （Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ　　ｓｋｉｍ　　ｍ１ｌ
ｋ）　　　−１ｆ１４主リドマス（Ｌｉ　ｔｍｕｓ）溶
液　　　−１０１［１１培養終了後、酸凝固が観察され
る場合を菌の生育あり（つ　と判定した。

（６）　Ｎａ１ｌ存在下での生育 Ｍ１７培地にＮａ１ｌを２％、４％及び６．５％（いず
れも重量／容量％）となるように加えた培地（１５０Ｘ
　１６ｍｍ試験管中、５ｍ１）を用意し、それぞわに保
存株から採取した菌体のＭ１７培地での７２時間の前培
養液の２００μｌを接種した。

３日間の培養後、培養液の５２０ｎｍでの濁度を測定し
、対照（菌体を接種していない培地）よりも０．２７以
上高い場合に菌生育あり（＋）と判定した。

（７）　ｐＨ９，２での生育 Ｍ１７培地と、緩衝７？！（グリシン　７．５０５ｇ及
びＮａＣｌ　’　５．８５ｇに水を加え、全量を１０１
００Ｏとしたもの）とを６対４０割合て混合し、更に該
混合液のｐＨを０．ＩＮ　ＮａＯＨで９．２±０．０２
に調整した。

次に、ｐＨ調整した混合液をＬＡＢＯＤＩＳＣ−５０Ｊ
Ｐ　（０２μｍ、東洋化学社製）で濾過滅菌し、その５
ｍｌを１５ＣＩＸｌ釦ｍ試験管に入れた。

これに、保存株から採取した菌体のＭ１７培地での７２
時間前培養液の２００μｍを接種し、３日間培養した。

培養終了後、培養液の５２０ｎｍでの濁度を測定し、対
照（菌体を接種していない培地て同様に上記培養条件下
に置いたもの）よりも０．２７以上高い場合に菌生育あ
り（＋）と判定した。

なお、調製した培地は４８時間以内に使用し、対照培地
は３０℃の条件下に３日間置く前と、置いた後のｐＨを
測定し、そのｐＨが０．０４以上に下がっていないこと
を確認した。

（８）アルギニンからのＮＨ３の生成 Ｌ−アルギニン　モノハイドロクロライド（Ｌ−Ａｒｇ
ｉｎｉｎｅ　ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を
０．３％の濃度となるようにＭ１７培地に加え、そのｐ
Ｈを７．１に再調整した溶液の５ｍｌを１５０　Ｘ　１
Ｂｍｍ試験管に入れ、滅菌処理した。

次に、保存株から採取した菌体のＭ１７培地での７２時
間前培養液の２００μ（を上記Ｍ１？培地を用いて調製
した溶液に接種し、２日間の培養を行な）た。

培養終了後、培養液１ｍｌにＮｅ５ｓｌｅｒ試薬１ｍｌ
を加え、赤褐色の沈殿が生じた場合を陽性（つとした。

（９）クエン酸からのガス産生 ■θ％還元脱脂乳を試験管（１５０ｘ　１６＋＋＋＋ｎ
、スクリューキャップ付き）に１０．５ｍｌ入れ滅菌し
た。これに滅菌した１０％Ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔ
ｅ　ｄｉｈｙｄｒａｔｅ溶液（ｐ１１７．０）を０．５
ｍｌ加え混合した後、３０分間放置した。

次に、保存株から採取した菌体のＭ］７培地での７２時
間前培養液の１００μｍを上記試験管内の溶液に加え、
更に加温した２％寒天（Ａｇａｒ　Ｎｏ、］　、０ｘｏ
ｉｄ社製）溶液を加え加温下てよ〈混合した後冷却した
。

これを３日間培養し、培地に亀裂や気泡の発生が認めら
れた場合を陽性（＋）とした。

（１０）乳酸の旋光性 乳酸の旋光性は、保存株から採取した菌体のＭ１７培地
ての７２時間前培養菌体及びＩｌｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−
Ｍａｎｎｈａｉｍ・山之内のＦ−ｋｉｔ　１ａｃｔ、ｉ
ｃ　ａｃｉｄ　　（製品番号１３９０８４）を用いて判
定した。

なお、Ｄ−乳酸の定量は、Ｄ−ＬＤＨ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ−Ｍａｎｎｈａｉｍ・山之内、製品番号１０６９
４１）を用いて行なった。

（１１）莢膜多糖生産性 先に述べた生菌数の測定において得られた寒天培地上の
コロニーから単一に釣菌分離した菌を顕微鏡で観察し、
第１図に示すように球菌の周囲に莢膜多糖の生産を示す
白い部分が存在するかどうかを観察した。

第１図に示すように球菌の周囲に白い部分が存在する場
合を莢膜多糖生産性あり（＋）とした。

以上の各試験を行なった結果、分離された株の７５木は
表３に示すように基準菌としての陸且ニーｃｏｃｃｕｓ
　１ａｃｔｉｓ　５ｕｂｓｐ、ｃｒｅｍｏｒｉｓ　ＧＩ
ＦＵ　８５９０Ｔとの対比からＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
　１ａｃｔｉｓ　５ｕｂｓｐ、　ｃｒｅｍｏｒｉｓであ
り、残りの２５亀は表４に示すように基準菌としてのＬ
ａｃｔｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　５ｕｂｓｐ、１ａ
ｃｔｉｓ　　ＧＴＦＵ８５９］Ｔとの対比からＬａｃｔ
ｃｏｃｃｕｓ　Ｉａｃｔｉｓ　５ｕｂｓｐｌａｃｔｉｓ
であることが同定された。

そこで、これらをＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉ
ｓ　５ｕｂｓｐ。

ｃｒｅｍｏｒｉｓ　　８ａ−１８ｂＭ（ＦＥＲＭ　Ｐ−
９９８６）、　Ｌａｃｔｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ　５
ｕｂｓｐ、１ａｃｔｉｓ　Ｌｆ；Ｓ５−２（ＦＥＲＰ−
９９８７）と命名した。

これらの乳酸菌株は、通産省工業技術院微生物工業技術
研究所に、上記のＦＥＲＭ　Ｐ一番号で昭和６３年４月
１２日付で寄託されている。

表　　３ 試験項目　　　　　　　　　　　　分離株　　　　Ｔｙ
ｐｅ　５ｔｒａｉｎ　ＧＩＦｔｌ　８５９０Ｔり′ラム
染色　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　
　　十カタラーゼ試験　　　　　　　　　　−−０−Ｆ
試験　　　　　　　　　　　　Ｆ　　　　　　　　　　
　Ｆグルコースの発酵　　　　　　　　１１ｏｍｏ　　
　　　　　　　　　Ｈｏｍ。

生育温度 １０　　℃　　　　　　　　　　　　　士　　　　　　
　　　　士３７　　℃　　　　　　　　　　　　　＋　
　　　　　　　　　＋３９．５℃　　　　　　　　　　
　　　−−４５℃　　　　　　　　　　　　　−−Ｎａ
Ｃ］存在下での生育 ２Ｘ　ＮａＣ１＋　　　　　　　　　　　　　　　　＋
ａ　ＮａＣ１＋　　　　　　　　　　　　　　　−６，
５％　ＮａＣ１−− ｐＨ９，２での生育　　　　　　　　　　−−アルキニ
ンからのＮＨ３の生成　　　　−−クエン酸からのカス
産生　　　　　　−−乳酸の旋光性　　　　　　　　　
　　　Ｌ　　　　　　　　　　　　Ｌ表　　４ 試験ｆｆＵ目　　　　　　　　　　　　　分離株　　　
　Ｔｙｐｅ　５ｔｒａｉｎ　ＧＩＦＵ　８５９］Ｔグラ
ム染色　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　
　　　＋カタラーゼ試験　　　　　　　　　　−−生育
温度 １０　　℃　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　
　　　　や３９．５℃　　　　　　　　　　　　　＋　
　　　　　　　　　＋４５　　℃　　　　　　　　　　
　　　−−ＮａＣ１存在下での生育 ２％　Ｎａ１ｌ　　　　　　　　　　　　　＋　　　　
　　　　　　　＋４％Ｎａ１ｌ　　＋　十 ６、！Ａ；　ＮａＣ１−− アルギニンからのＮＨ３の生成　　　　＋　　　　　　
　　　　＋クエン酸からのＣＯ２の生成　　　　　−−
ｐＨ！ｉ、２ての生育　　　　　　　　　　＋　　　　
　　　　　　＋乳酸の旋光性　　　　　　　　　　Ｌ　
（＋）　　　　　　　　　　　　Ｌ（＋）グルコースか
らの００２の生成　　　　−−運動性　　　　　　　　
　　　　　　−−莢膜多糖の生産性　　　　　　　　　
十　　　　　　　　　　　−分離株の同定　　　　　　
　　　１、Ｉａｃｔｉｓり６ 実施例２ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉａｃｔｉｓ　５ｕｂｓｐ、
ｃｒｅｍｏｒｉｓ　８ａ−１８ｂＭ及びＬａｃｔｃｏｃ
ｃｕｓ　Ｉａｃｔｊｓ　５ｕｂｓｐ、Ｉａｃｔｉｓ　Ｌ
Ｃ５−２をそれぞれ個々に、２０％還元脱脂乳の透析外
液（還元脱脂乳の透析内液と透析外液としての蒸留水と
の比は１：１）に１％トリプチケースペプトンを添加し
た培地で２０℃、２日間培養した後、培養液を遠心分離
（１２，ＯＯＯｒｐｍ　、３０分）し、得られた沈殿物
（菌体を含む）を蒸留水て洗浄後、直ちに凍結乾燥した
。以下の抗腫瘍試験の試料とした。

得られた凍結乾燥試料を以下に示す抗腫瘍活性試験に用
いた。

〔固型Ｓａｒｃｏｍａ−１８０を使用した抗腫瘍試験〕
固型Ｓａｒｃｏｍｓ−１８０（Ｉ　Ｘ　１０”個／匹、
０日月、東北大学附属抗酸菌病研究所より人手）を腋下
部皮下に移植したＭａｌｅ　（雄）　　ＩＣＲマウス［
船橋農場（千葉）より人手、５週齢、ｌＯ匹／群］に上
記の凍結乾燥試料をそれぞれ個々に１日日から９日間毎
日その腹腔内に投与した（２．１０及び５０ｍｇ／ｋｇ
／ｐｅｒ　ｄｏｓｅ　、０．１ｍｌ生理食塩水）。

２１日目に固体腫瘍を各マウスから摘出し、その重量を
測定することにより、以下の式から増殖抑制（＊）を算
定した。

〔腹水系Ｓａｒｃｏｍａ−１８０を使用した抗腫瘍試験
〕１復水系Ｓａｒｃｏｍａ−１８０（Ｉ　Ｘ　１０６個
／匹、０日月、東北大学附属抗酸菌病研究所より人手）
を腹腔内に移植したＭａｌｅ　（雄）　ＴＣＲマウス〔
船橋農場（千葉）より人手、５週齢、１０匹／群〕に上
記で得た凍結乾燥試料を１日日から９日間毎日その腹腔
内に投与した（５０ｍｇ／Ｋｇ／ｐｅｒ、ｄｏｓｅ、　
Ｏ，１ｍｌ、生理食塩水） 対照群（投与しないもの）と投与群のそれぞれの生存日
数から対照群に対する投与群の延命効果（＊）（投与群
の生存日数／対照群の生存日数）を算出して各試料の抗
腫瘍活性を評価した。

得られた結果を表５及び６に示す。

表５ 投与量　　Ｓａｒｃｏｍｓ−１８０固形腫瘍の増殖抑制
　（％） ＬＣ５−２］　Ｏｍｇ／ｋｇ　　　　　　４６５０ｍｇ
／ｋｇ　　　　　　５２ ８ａ−１８ｂＭ　　　　２ｍｇ／ｋｇ　　　　　　４７
５０ｍｇ／ｋｇ５５ 表６ 投与量　　Ｓａｒｃｏｍａ−１８０腹水腫瘍での延命効
果（％） ＬＣ５−２５０ｍｇ／ｋｇ１４２ ８ａ−１８ｂＭ　　　５０ｍｇ／ｋｇ１８０実施例３ １８００ｍｌの温水に対して脱脂粉乳２００ｇの割合と
なるようにこれらを混合溶解した溶液を加熱状態にある
容器内に入れて、約９０℃にて１５分間煮沸殺菌した。

殺菌終了後、約２５℃になるまで溶液を冷却したところ
で、この溶液に以下に示す操作で調製したスターター約
３０ｇを攪拌下で加えた後、２０℃で２０時間放置して
発酵させて発酵乳とした。

スターターの調製； 脱脂粉乳１０％溶液を調製し、これを１２１℃で１０分
間滅菌処理した。

この滅菌処理した溶液に、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１
ａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ、　１ａｃｔｉｓ　ＬＣ５−２を
接種し、２０℃で４８時間の培養を行ないスターターを
得た。

得られたスターターは、０．０５％となるようにＬ−ア
スコルビン酸ナトリウムを添加して、窒素ガスの封入を
行なフて５℃て保存した。

実施例４ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　５ｕｂｓｐ、
　１ａｃｔｉｓ　ＬＣ５−２の代りにＬａｃｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　５ｕｂｓｐ、　ｃｒｅｍｏｒｉ
ｓ　８ａ−１８ｂＭをスターターの調製に用いる以外は
実施例３と同様にして発酵乳を得た。

実施例５ １０００ｍｌの温水に対して脱脂粉乳２００ｇの割合と
なるようにこれらを混合溶解した溶液を加熱状態にある
容器内に入れて、約９０℃にて１５分間煮沸殺菌した。

殺菌終了後、約２５℃になるまで溶液を冷却したところ
で、この溶液に以下に示す操作で調製したスターター約
３０ｇを攪拌下で加えた後、２０℃で１８時間放置して
発酵させて発酵乳とした。

こうして得られた発酵乳に、別途調製したシロップ（１
震のショ糖水溶液を９０℃、２０分の条件て殺菌処理し
、２０℃に冷却したもの）を、発酵乳：シロップ−３０
：　７０　（重量）の割合で混合して発酵乳製品を得た
。

スターターの調製： 脱脂粉乳１０％溶液を調製し、これに蛋白分解酸素を０
．０５％の濃度となるように加え、５０℃で３．５時間
反応させて蛋白質を分解させた後、これにショ糖オレイ
ン酸エステルを０゜１％の濃度となるように加え、　１
２１℃で１０分間殺菌処理した。

この滅菌処理した溶液に、１、ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　
１ａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ、　１ａｃｔｉｓ　ＬＣ５−２
及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ
、ｃｒｅｍｏｒｉｓ　８ａ−１８ｂＭ　　（１：　１混
合）を接種し、２０℃で４８時間の培養を行ないスター
ターを得た。

得られたスターターは、００５％となるようにＬ−アス
コルビン酸ナトリウムを添加して、窒素カスの封入を行
なって５℃で保存した。

実施例６ 以下の組成を有する組成物を加圧滅菌処理（１２１℃、
１０分間）し、これにＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉａｃ
ｔｉｓｓｕｂｓｐ、　ｃｒｅｍｏｒｉｓ　８ａ−１８ｂ
Ｍを接種し、２０℃、６０時間の培養を行なった。

組成物組成： 脱脂粉乳　　　　　　　１５０ｇ ブドウ糖　　　　　　　　　３０ｇ ＮａＣ１３ｇ に２ＨＰＯ４１ｇ 酵母エキストラクト　　　　２ｇ Ｍｇ５［］４・７１１２０　　　　　　　　１ｇＦｅ５
０．＋・７Ｈ２００，０３ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　　１　立　（ｐＨ７
，０）得られた培養物８００ｍ１に対し、ショ糖２００
ｇ、Ｎａ１ｌ　２ｇ　、香料１５ｍ１及び酸味料（コハ
ク酸、クエン酸及びヒタミンＣの混合物）２ｍｌを添加
し、更に滅菌水を加えて全体を］０００ｍ１として原液
を得た。

得られた原液に、該原液の２倍容量の滅菌水を更に加え
て、ミキサーて細粉・混和して、乳酸菌飲料を得た。

実施例７ 脱脂乳（無脂乳固形分含量８％）　３００ｋｇに水１０
０ｋｇを加え、無脂乳固形分含量を６％に調整し、これ
を８５℃で１５分間殺菌処理し、４０℃まで冷却した。

これとは別に、１２ｋｇの殺菌した脱脂乳（無脂乳固形
分含量８％）にＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉａｃｔｉｓ
　５ｕｂｓｐ。

ｃｒｅｍｏｒｉｓ　８ａ−１８ｂＭを接種し、２０℃、
１８時間培養して前培養液を調整した。

次に、先に調製した脱脂乳にこの前培養液の全量を加え
、約２０分間攪拌して均一に混合した後、２０℃で４８
時間発酵を行ない、発酵乳約４００ｇを得た。得られた
発酵乳の乳酸酸度は１．４８％であフた。

更に、水９４０　ＩＬに砂糖１８０ｇを添加し、８０℃
で１０分間殺菌し、３０℃に冷却してシロップを調製し
た。

このシロップに先に得た発酵乳３７５ｋｇを加え、攪拌
して均一に混合し、更に香料１．５ｋｇを添加した後、
］００ｋｇ／ｃｍ２の圧力下て無菌的に均質化し、無脂
乳固形分を１．５％含有する乳酸菌飲料約１４５０ｋｇ
を得た。

［試験結果］ 実施例３、実施例４及び実施例５で調製した発酵乳を凍
結乾燥し、−３０℃で保存し、これを以下の試験に供与
するサンプルとした。

次に、固型Ｓａｒｃｏｍｓ−１８０（１ｘ　１０６個／
匹、０１目、東北大学附属抗酸菌病研究所より人手）を
腋下部皮下に移植したＭａｌｅ　（雄）　　ＩＧＲマウ
ス［船橋農場（千葉）より人手、５週齢、１０匹／群］
に上記の凍結乾燥試料をそれぞれ個々に１白目から１５
日間毎日経口投与した（８００ｍｇ／ｋｇ／ｐｅｒ　ｄ
ｏｓｅ、０．１ｍｌ生理食塩水）。

２１日ロー固体腫瘍を各マウスから摘出し、その重量を
測定することにより、下記式から増殖抑制を求めた。

得られた結果を表７に示す。

表　　７ ［発明の効果］ 本発明により抗腫瘍活性を有する新たな乳酸菌株が提供
された。

これらの乳酸菌株の抗腫瘍活性は、例えば抗腫瘍剤や腫
瘍発生予防等の分野において、あるいは抗腫瘍活性のあ
る乳酸飲料や発酵乳の製造に好適に利用でき、本発明に
よって乳酸菌の抗腫瘍活性の各種分野での実用化が促進
され得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は図面代用のロンクツイル由来の球菌の顕微鏡写
真である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）抗腫瘍活性成分を産生することを特徴とする乳酸菌
   ラクトコッカスラクチスサブスペ シーラクチス。 ２）抗腫瘍活性成分を産生することを特徴とする乳酸菌
   ラクトコッカスラクチスサブスペ シークレモリス。 ３）請求項１及び／または請求項２に記載の乳酸菌を培
   養して得たことを特徴とする抗腫瘍活性を有する培養物
   。 ４）乳成分を含む培地に請求項１及び／または請求項２
   に記載の乳酸菌を含むスターターを加えて発酵させた発
   酵乳である請求項３記載の培養物。 ５）請求項１及び／または請求項２に記載の乳酸菌を培
   養する過程を含むことを特徴とする抗腫瘍活性を有する
   培養物の製造方法。 ６）前記乳酸菌の培養過程が乳成分を含む培地に請求項
   １及び／または請求項２に記載の乳酸菌を含むスタータ
   ーを加えて発酵を行なう過程である請求項５記載の培養
   物の製造方法。