KR20040075922A - 증식 억제 물질을 생성하는 급속 성장성 제한 세포의조성물 및 이들을 사용하는 방법 - Google Patents

증식 억제 물질을 생성하는 급속 성장성 제한 세포의조성물 및 이들을 사용하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20040075922A
KR20040075922A KR10-2004-7010695A KR20047010695A KR20040075922A KR 20040075922 A KR20040075922 A KR 20040075922A KR 20047010695 A KR20047010695 A KR 20047010695A KR 20040075922 A KR20040075922 A KR 20040075922A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cell
beads
proliferation
subject
Prior art date
Application number
KR10-2004-7010695A
Other languages
English (en)
Inventor
아시나쉬린
자인칸티
루빈알버트엘.
스미스배리
스텐젤커트
Original Assignee
로고신 인스티튜트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 로고신 인스티튜트 filed Critical 로고신 인스티튜트
Publication of KR20040075922A publication Critical patent/KR20040075922A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/13—Tumour cells, irrespective of tissue of origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/36—Skin; Hair; Nails; Sebaceous glands; Cerumen; Epidermis; Epithelial cells; Keratinocytes; Langerhans cells; Ectodermal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

본 발명은 제한된 증식 세포를 포함하는 물질의 조성물에 관한 것이다. 제한시, 상기 세포는 세포 증식 억제 물질을 예상밖의 다량으로 생성한다. 이러한 현상은 세포 유형과 종 계통을 초월한다. 본 발명은 또한 상기 조성물을 제조하는 방법 및 이들의 용도에 관한 것이기도 하다.

Description

증식 억제 물질을 생성하는 급속 성장성 제한 세포의 조성물 및 이들을 사용하는 방법{Compositions of restricted cells capable of rapid growth which produce proliferation suppressive materials, and uses thereof}
본 발명은 증식 과정이 생체적합성의 반투과성 물질내에서 물리적으로 제한될때, 동일 또는 상이한 유형 및/또는 기원의 다른 급속 증식 세포의 성장을 억제할 수 있는 정상적으로 미발현된 인자(들) 또는 과량의 정상적으로 발현된 인자(들)을 생성하는 급속 대수기(log phase) 성장중에 있거나 성장가능성이 있는 세포의 증식 제한에 관한 것이다. 상기한 제한 세포를 이후 본 명세서에서는 증식성 세포로 언급한다. 상기한 카테고리에 속하는 증식성 세포로는 종양 세포, 암 세포, 및 비-암 세포, 예를 들면 태아 세포, 간 세포(stem cells) 및 간세포 (hepatocytes), 섬유아세포(fibroblast)와 표피 세포를 비롯하여 조직 손상후 재생기에 있는 세포를 들 수 있으나, 이들로만 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 특징중 하나인 이들 구조체들은, 암과 같은 질환이나 증세와 연관된 급속 증식성 세포에 대해 항-증식성 효과를 나타내는 소정 분자량의 농축물과 같은 물질로서 사용되거나 이를 생성하기 위한 목적으로 또는 수술후 반흔 형성과 같은 비제어 세포 성장으로 야기될 수 있는 의료상의 문제를 방지하기 위해 세포 성장을 조절할 목적으로 사용될 수 있다.
본 출원은 1996년 4월 3일자로 출원되어 포기된 미국 특허 출원 일련번호 제08/625,595호의 일부 계속 출원인 1996년 11월 7일자 미국 특허 출원 일련번호 제08/745,063호(현 미국 특허 제5,888,497호)의 일부 계속 출원이 되는 1998년 11월 9일자 미국 특허 출원 일련번호 제09/188,476호의 일부 계속 출원이며, 상기한 출원들은 모두 본 명세서에 참고로 인용된 것이다.
각종 생체 물질을 생체적합성 물질내에 캡슐화시키는 기술은 문헌상에 잘 정립되어 있으며, 한동안 자주 사용된 기술로서, 제한적이기는 하나 성공을 거두기도 하였다. 그러한 예로 미국 특허 제5,227,298호(Weber, et al.); 제5,053,332호 (Cook, et al.); 제4,997,443호(Walthall, et al.); 제4,971,833호(Larsson, et al.); 제4,902,295호(Walthall, et al.); 제4,798,786호(Tice, et al.); 제4,673,566호(Goosen, et al.); 제4,647,536호(Mosbach, et al.); 제4,409,331호 (Lim); 제4,392,909호(Lim); 제4,352,883호(Lim); 및 제4,663,286호(Tsang, et al.)가 있다. 또한 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된 미국 특허 제5,643,569호 (Jain, et al.)는 각종 생체적합성 물질내 섬(islets)의 캡슐화에 대해 어느 정도 상세히 기술하고 있다. 상기 문헌에서는, 상기 섬들이 인슐린을 생성하며, 당뇨병 치료에 이들을 사용할 수 있음을 교시하고 있다. 미국 특허 제5,888,497호(Jain, et al.)에는 동수의 동일한 비제한 암 세포에 비해 많은 양의 비제한 암 세포 성장 억제 물질을 생성하는 암 세포를 내부에 포함하고 있는 이식가능한 아가로즈 코팅된, 아가로즈 비드에 대해 기술하고 있다.
상기 특허(Jain, et al.)에는 이식 요법상의 선행 기술에 대해 상술되어 있으며, 이또한 본 명세서에 요약되어 있다.
숙주의 면역 반응으로부터 이식된 조직을 보호하기 위한 주요 방안으로 5 가지 정도가 공지되어 있다. 이들 모두 숙주의 면역 체계로부터 이식된 조직을 단리시키고자 하는 것이다. 지금까지 사용된 면역단리 기법으로는 혈관외 확산 챔버, 혈관내 확산 챔버, 혈관내 한외여과 챔버, 마이크로캡슐화 및 마크로캡슐화 기법이 있다. 이러한 공지의 방법들은 이식 물질에 대한 숙주 섬유 반응, 이식 물질의 불안정성, 반투막을 통한 영양분확산 제한, 분비촉진물질과 생성물의 투과 및 반투막 장벽에 대한 확산 지체 시간 등의 많은 문제점을 가지고 있다.
예를 들어, 생존 세포, 조직 및 기타 불안정 막을 반투막내로 포획하는 마이크로캡슐화 과정은 1978년도에 림(Lim)에 의해 개발되었다(Lim, Damon Corporation의 연구 보고서, 1978). 이때 림은 랑게르한스섬(이하, "섬"으로 표기)을 캡슐화시키기 위해 알기네이트 및 폴리 L-리신의 마이크로캡슐을 사용하였다. 1980년도에는, 당뇨병에 대한 연구과정에서 이 신기술을 생체내에서 최초로 성공적으로 적용하였다.(Lim, et al.,Science210:908(1980)). 이러한 마이크로캡슐화된 섬의 이식으로 당뇨병 동물 환자를 정상혈당 상태로 유지시키는 결과를 얻을 수 있었다. 그러나, 다른 연구에 의하면, 반복 실험 결과, 알기네이트가 조직 반응을 야기시키는 것으로 밝혀졌으며, 림과 그의 동료들이 얻었던 바와 동일한 결과를 재현할 수 없었다(Lamberti, et al.Applied Biochemistry and Biotechnology10:101(1984); Dupuy, et al.,J. Biomed. Material and Res.22:1061(1988); Weber, et al.,Transplantation49:396(1990); 및 Doon-shiong, et al.,Transplantation Proceedings22:754(1990)). 오늘날에는 이들 중합체의 수용성이 생체내 마이크로캡슐의 안정성 및 생체적합성을 제한하는 것으로 간주되고 있다(Dupuy, et al.,supra, Weber et al.,supra, Doon-shiong, et al.,supra, and Smidsrod,Faraday Discussion of Chemical Society57:263(1974)).
이와타와 그의 동료들(Iwata, et al.,Jour. Biomedical Material and Res.26:967(1992))은 동종이형 췌장섬의 마이크로캡슐화에 아가로즈를 이용하여 마이크로비드용 매질로서 이에 대한 이용가능성을 새로이 발견하였다. 이들의 연구에서는, 개별적으로 1500 내지 2000개의 섬들을 5% 아가로즈내에 마이크로캡슐화시켜 스트렙토조토신(streptozotocin)-유도된 당뇨병 생쥐 내부로 이식하였다. 장기간 동안 이식체가 생존하였으며, 수혜자가 계속 정상혈당치를 유지하였다.
그러나, 이러한 방법은 번거롭고 정확성이 떨어지는 등의 많은 단점을 가지고 있다. 예를 들면, 많은 비드들이 부분 코팅상태로 남게 되고, 수백 비드가 공(empty) 아가로즈 형태를 갖는다. 따라서, 공 비드에서 캡슐화된 섬들을 분리해내기 위한 별도의 시간이 필요하게 된다. 또한 이식된 마이크로비드의 대부분이 골반강(pelvic cavity)에 모이게 되어 정상혈당상태를 달성하기 위해서는 많은 수의 완전 코팅된 개별 비드내 섬들이 필요하게 된다. 게다가, 이식된 비드는 회수가 어렵고, 파손되기 쉬우며, 경미한 손상으로도 쉽게 섬들을 방출시킨다.
마크로캡슐화 과정 또한 시험된 바 있다. 폴리-2-하이드록시에틸-메타크릴레이트, 폴리비닐클로라이드-c-아크릴산 및 셀룰로즈 아세테이트 같은 각종 상이한 물질의 마크로캡슐들이 섬의 면역단리용으로 제조되었다[참조: Altman, et al.,Diabetes35:625(1986); Altman, et al.,Transplantation: American Society of Artificial Internal Organs30:382(1984); Ronel, et al.,Jour. Biomedical Material Research17:855(1983); Klomp, et al.,Jour. Biomedical Material Research17: 865-871(1983)]. 상기 모든 연구에서는 일시적인 혈당 정상화만이 달성되었다.
아처 및 그의 동료들은(Archer, et al.,Journal of Surgical Research28:77(1980))들은 섬 이종이식편의 거부반응을 일시적으로나마 방지하기 위해 아크릴계 공중합체 중공 섬유를 사용하였다. 이들에 의하면, 중공 섬유내에 분산된 신생 쥐의 췌장 이식편이 당뇨병 햄스터내 이식후 장기간 생존하는 것으로 보고되었다. 최근 들어 문헌[Lacy, et al.,Science254:1782-1784(1991)]을 통해 상기한 사실을 확인한 결과, 정상혈당 상태가 일시적인 상태였던 것으로 밝혀졌다. 또한 섬유내로 이식하였을때, 섬들이 중공 튜브내에 응집하여 섬 덩어리의 중앙 부분에 괴사현상이 나타나는 것으로 밝혀졌다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 알기네이트를 사용하여 섬유내 섬들을 분산시켰다. 그러나, 이러한 실험은 전반적으로 반복실시되지 못하였다. 따라서, 인체내 섬 이식 매체로서 막의 기능과 관련하여서는 여러 가지 의문이 많은 상태이다.
전술된 제인 및 그의 동료들의 특허에서는 투과성의 친수성 겔 물질내로의 분비성 세포의 캡슐화를 통해, 동물내로 이식가능하고, 장기간 저장도 가능하며,생체내에서 치료용으로 사용가능한 작용성의 비-면역원성 물질을 만들 수 있음을 보고하고 있다. 분비성 세포의 마크로캡슐화는 분비성 세포 이식을 위한 더욱 효과적이고 취급용이한 기법이다.
상기 특허는 급속 증식 가능한 세포의 혼입에 대해서 전혀 논의하지 않고 있다.
세포의 캡슐화 관련 문헌에 대한 조사 결과, 캡슐화후 거의 모든 세포는 비캡슐화 상태에서 생성하는 것에 비해 적은 양의 물질을 생성하는 것으로 밝혀졌다[참조; Lloyd-George, et al.,Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech.21(3):323-333(1993); Schinstine, et al.,Cell Transplant4(1):93-102(1995); Chicheportiche, et al.,Diabetologica31:54-57(1988); Jaeger, et al.,Progress In Brain Research82:41-46(1990); Zekorn, et al.,Diabetologica29:99-106(1992); Zhou, et al.,Am. J. Physiol. 274:C1356-1362(1998); Darquy, et al.,Diabetologica28:776-780(1985); Tse, et al.,Biotech. & Bioeng. 51:271-280(1996); Jaeger, et al.,J. Neurol.21:469-480(1992); Hortelano, et al.,Blood87(12):5095-5103(1996); Gardiner, et al.,Transp. Proc. 29:2019-2020(1997)]. 이들 문헌중 급속 증식 가능한 세포를 특정 구조체내로 혼입시켜 포획하고 이들의 성장을 제한하되, 구조체 안팎으로의 물질 확산은 허용하는 것에 대해 논의한 것은 없었다.
암 덩어리의 성장과 관련한 이론중 하나는 종양과 같은 덩어리를 정상 기관에 비유한 것이다. 간과 같이 건강한 기관은 소정의 크기만큼 성장한 후에는 더이상 커지지 않으나, 그 일부를 제거하는 경우, 간은 어느 정도로 재생된다. 이러한 현상이 종양에서도 관찰된다. 요약하면, 종양의 일부분을 제거하는 경우에 있어서도, 남아있는 종양 부분의 세포가 아주 급속하게 증식하기 시작하여 소정의 크기에 도달하게 되면, 이후에는 증식 속도가 저하되거나 중지되는 것을 말한다. 이는 암 세포의 내부 조절 기능이 존재함을 암시한다.
본 발명은 급속 증식 가능 세포를 포획과 같은 방법에 의해 물리적으로 제한하였을 때, 증식율이 현저하게 감소한다는 것과, 이를 비-제한 급속 증식 세포에 적용시킨 경우, 이들 비-제한 세포의 증식을 억제하는 물질을 다량으로 생성한다는 것에 관한 것이다.
암 세포의 증식 지연 능력에 대한 개발은 종양학의 목표가 되어 왔다. 암 및 급속 세포 증식에 의해 야기되는 기타의 질환 및 증세의 치료와 관련하여 본 발명의 치료적 효능은 확실하며, 이에 대해서는 이하 더욱 상세히 기술하고자 한다. 상기 물질 생성은 사용된 급속 증식 세포의 유형(type)이나 급속 증식 세포의 기원이 되는 동물종에 의해 한정되지 않는다. 그 효과 또한 제 1 종으로부터의 제한 세포가 제 2 종으로부터의 비제한 세포의 증식을 억제하는 물질을 생성하는 것과 같이, 종별 특이성이 없는 것으로 보인다. 또한, 암과 관련하여서도, 제 1의 암 유형으로부터의 제한 세포가 다른 암 유형으로부터의 비제한 세포의 증식을 억제하는 물질을 생성하는 것과 같이, 항암 효과도 암의 유형에 대해 특이성이 없는 것으로 나타났다.
그 효과는 면역 반응을 필요로 하지 않는 것으로 보인다. 면역 세포가 사용되지 않은 생체외 체계에서도 항증식 효과가 나타났다. 따라서 항증식 효과는 표준적인 면역 반응에 기인한 것으로 볼 수 없다.
즉, 본 발명의 바람직한 구현예는 생체적합성의 증식-제한적, 선택-투과성 구조체를 가진 물질의 조성물에 관한 것이다. 이 구조체는 급속 증식 세포를 제한하여, 비제한시 동수의 동일한 급속 증식 세포에 비해 많은 양의 급속 세포 증식 억제 물질을 생성한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예는 급속 증식 세포를 생체적합성의, 증식-제한 물질과 접촉시켜 구조체를 형성하고, 이 구조체를 급속 증식 세포를 제한하기에 충분한 시간 동안 배양하여, 급속 증식하는 동수의 비제한 동일 유형 세포에 비해 많은 양의 급속 증식 세포 증식 억제 물질이 생성되도록 함으로써, 생체적합성의, 증식-제한적, 선택-투과성 구조체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
그외 다른 바람직한 구현예는 급속 증식 세포를 생체적합성의, 증식-제한적, 선택-투과성 구조체내에 제한하고, 이들 급속 증식 세포를 배양하여 급속 증식 세포에 의해 세포 성장 억제 물질이 생성되도록 하는 것을 포함하여, 상기 물질의 생산을 증대시키는 방법에 관한 것이다. 상기 구조체가 배양 배지에 위치하게 되면, 상기 물질은 구조체로부터 이탈하여 배양 배지내로 진입하게 된다. 그 결과 수득되는 배양 배지 또한 본 발명의 특징을 구성한다.
본 발명의 구조체를 배양 배지에서 배양하여 수득된 조정 배지(conditionedmedium)를 여과함으로써 강력한 항증식 효과가 달성될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그 결과 수득되는 농축물은 아주 강력한 항증식 효과를 가진다.
상기 물질, 조정 배지 및/또는 이들로부터 유래된 농축물도 또한 다른 비-제한 급속 증식 세포에 의한 항-증식성 물질의 생성을 유도하는데 사용할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 제한 세포는 암 세포를 이르지만, 암 및 기타의 증세를 치료하는데 비-암 세포를 사용하는 것에 따른 여러 가지 부가적인 잇점을 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 알 수 있다.
본 발명의 이러한 잇점 및 기타의 특징은 하기에서 설명하도록 한다.
[실시예]
실시예 1
본 실시예 및 이하 실시예에서는 RENCA 세포를 사용한다. 이들은 BALB/C 생쥐의 자발성 신장 선암(adenocarcinoma) 세포로서, 생체외 배양 및 생체내 모두에서 광범위하게 이용되고 있는 것이다[참조: Franco, et al.,Cytokine Induced Tumor Immunogenecity, 181-193(1994)].
동결된 RENCA 세포 샘플을 37℃에서 해동시킨 후, 10% 소 혈청, 페니실린 (100 u/㎖) 및 스트렙토마이신(50 ㎍/㎖)이 보강된 둘베코 변형 배지(D-MEM; 이후 "완전 배지"로 지칭)를 포함하는 조직 배양 플라스크내에 위치시켰다.
세포를 합류시까지 성장시킨 후, 트립신분해시키고, 행크스 균형 염 용액 (Hank's Balanced Salt Solution)으로 세척한 다음, 상기 완전 배지로 세척하였다.
RENCA 세포가 효율적으로 종양을 발생시켰는지의 여부를 확인하기 위해, 2마리의 BALB/C 생쥐에게 106개의 상기 세포를 복강내 주사하였다. 생쥐를 3-4주에 걸쳐 관찰하였다. 임상적으로 이들은 처음 2주간은 건강하게 보였고, 정상적인 활동을 나타냈다. 이후, 암의 임상적 현상이 나타나기 시작했다. 23일 후에는 1 마리의 생쥐가 사망하였으며, 25일 후에는 두번째 생쥐도 사망하였다. 사망후, 생쥐를 검시한 결과, 각종 크기의 수많은 종양이 관찰되었다. 일부 종양은 출혈을 나타내기도 하였다.
1 마리의 생쥐로부터 채취한 한 종양 샘플을 이후 조직 검사를 위해 10% 포르말린중에 고정시켰다.
실시예 2
RENCA 세포가 생체내에서 성장하였음을 확인한 이후에는, 이들 세포가 본 발명의 구조체내 제한 환경에서 성장하는지에 대한 연구를 수행하였다.
RENCA 세포를 합류시까지 성장시킨 후, 전술한 바와 같이 트립신분해시키고, 세척하였다. 그 결과 60,000 내지 90,000개의 세포 샘플이 준비되었다. 세포를 750 rpm에서 원심분리시켜, 상등액을 제거하였다. 세포를 인산염 완충 식염 용액(pH 6.5)중 1% 아텔로콜라겐(atelocollagen) 용액중에 현탁시켰다.
저 점도의 1% 아가로즈 용액을 최소 필수 배지(MEM)중에 준비하여, 60℃에서 유지시킨 후, 이중 100 ㎕ 를 상기 RENCA 세포와 아텔로콜라겐의 현탁액에 첨가하였다. 이후, 생성된 물질을 하나의 커다란 점적 형태로 실온의 멸균 미네랄유로 직접 옮겼다. 그 결과, 혼합물은 하나의, 평활한 반-고체 비드를 형성하였다. 다수의비드가 생성될 때까지 상기한 절차를 반복 실시하였다.
1분 후, 비드들을 37℃에서 상기 완전 배지로 옮겼다. 이후, 이 비드들을 상기 항생제가 함유된 최소 필수 배지(MEM)중에서 3회 세척하였다. 비드들을 공기와 5% CO2의 습윤 대기하에 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양후, 고체 형태로 된 비드들을 MEM중 5% 아가로즈 1 ㎖를 포함하는 멸균 스푼으로 옮겼다. 비드들을 용액중에서 2-3회 굴리면서 아가로즈가 균일하게 피복되도록 하였다. 아가로즈가 고화되기 전에 비드들을 미네랄유로 옮겨 외표면이 평활하게 되도록 만들었다. 60초 후, 비드들을 37℃에서 완전 배지로 5회 세척하여 미네랄유를 제거하였다. 이후, 밤새 배양(37℃, 공기 및 5% CO2의 습윤 대기)하였다.
이렇게 수득한 RENCA 함유 비드들을 하기 실험에서 사용하였다.
실시예 3
생체내 연구 수행에 앞서, 상기 방식으로 제조한 비드내에서 RENCA 세포가 성장할 수 있는지를 확인하는 것이 필요하다.
이를 위해, 실시예 2에서 제시된 바와 같이 제조된 비드들을 상기 실시예 2에 기술된 배지중에서 3주 동안 전술한 조건하에 배양하였다. 그중 3개의 비드들이 작은 조각들로 분할되면, 이들을 표준 배양 플라스크에서 배양하여 플라스크와 배양 배지에 직접 접촉하도록 하였다.
이들 배양물 관찰 결과, 세포가 성장하여 표준 RENCA 콜로니를 형성하는 것으로 나타났다.이는 세포가 비드내에서도 생존가능함을 의미한다.
실시예 4
이후, 생체내 실험을 수행하였다. 이 실험에서는, 비드들을 37℃에서 7일 동안 배양하였다. 피검체 생쥐에게 비드를 주입하였다. 이를 위해, 4 마리의 생쥐 각각을, 복강내로 중간선 절개를 하였다. 각기 60,000개의 RENCA 세포를 포함하는 3개의 비드를 이식하였다. 이후, 피흡수성의 봉합사를 이용하여 절개선을 봉합(2층 봉합)하였다. 이용된 4 마리의 생쥐(BALB/C)는 체중이 24-26g이고 외관상 건강해 보이는 정상의 수컷 생쥐였다. 대조용으로 2 세트의 생쥐를 사용하였다. 첫 번째 세트로, 2 마리의 생쥐에게 RENCA 세포를 함유하지 않은 3개의 비드들을 주입하였으며, 두 번째 세트에서는 2 마리의 생쥐에게 아무런 처리도 하지 않았다.
이식 3주 후, 모든 생쥐에게 106개의 RENCA 세포를 복강내로 주사하였다. 18일후, 1 마리의 대조용 생쥐가 사망하였다. 이후 남아있는 모든 생쥐도 죽여 종양 유무에 대해 조사하였다.
그 결과, 대조용 생쥐가 수많은 종양을 가지고 있는데 반해, 비드-캡슐화 세포를 이식한 생쥐는 공동 전체에 걸쳐 분리된 작은 노둘만을 가지고 있었다.
이러한 결과는 하기 실시예에 제시된 실험에 대한 기초를 제공한다.
실시예 5
본 실험에서는, 6 마리의 BALB/C 생쥐 각각의 한 신장 캡슐 아래에 RENCA 세포를 주사하여 암 발생을 유도하였다. 15일후 생쥐를 2개의 군으로 분류하였다. 1군에 속하는 3 마리의 생쥐들에게는 각각 상기 실시예 4에서와 같이 3개의 비드를제공하였다. 2군(대조군)에는 RENCA 세포를 포함하지 않는 비드를 제공하였다.
최초 4-5일 동안, RENCA 세포를 포함하는 이식편을 제공받았던 생쥐는 혼수상태를 보였으며, 첨모 현상이 나타났다. 이후, 이들은 정상상태로 회복되었다. 반면, 대조군은 활기찬 상태로 유지되었으며, 털의 상태에도 변화가 없었다.
그러나 이식 10일 후(RENCA 세포 주사 25일 후), 대조용 생쥐는 행동이 느려지기 시작했으며, 복부 팽창 현상이 나타났다. 3 마리의 대조용 생쥐중 1 마리가 비드 이식후 14일째에 사망하였다. 이후 생쥐들을 죽였다.
대조용 생쥐의 체강에서 엄청난 출혈이 있었으며, 식도, 간, 위 및 폐 전역에 걸쳐 수많은 종양이 목격되었다. 종양 성장 확산으로 인해 복강의 모든 기관은 구별이 불가능할 정도였다. 그러나 캡슐화된 RENCA 세포를 가진 비드를 제공받은 생쥐의 경우에서는 출혈이 나타나지 않았으며, 식도상에 약간의 노둘만이 관찰되었다. 또한, 시험군과 대조군을 비교한 결과, 시험군에서는 신장 캡슐 아래 마크로비드 이식전까지 초기 관찰되었던 노둘의 성장이 더이상 진행되지 않았다.
실시예 6
생체외에서는, 자유 접종한 RENCA 세포를 마크로비드 캡슐화된 RENCA 세포와 함께 배양하였을 때 그 성장이 억제된다. 또다른 실험을 통해 그 효과가 다른 세포에서도 관찰될 수 있는지에 대해 알아 보았다.
선암 세포주 즉, MMT(생쥐 유방 종양)를 미국 종양균 배양 수집소(American Type Culture Collection)로부터 입수하였다. 상기에서와 같은 방법으로 MMT 세포를 사용하여 비드당 120,000 또는 240,000개의 세포를 함유하는 비드를 생성하도록캡슐화된 MMT 세포를 제조하였다. 비드 제조후, 이들을 사용하여 생체외에서 RENCA 세포의 증식을 억제하는지에 대해 조사하였다. 6-웰 페트리 플레이트를 특별히 2개 제작하여, 웰당 4 ㎖의 배지중에 1 ×104개의 RENCA 세포를 접종하였다. 각 플레이트에 대해, 대조군으로 3개의 웰을 사용하고, 나머지 3개는 시험군으로 사용하였다. 각 플레이트의 3개의 대조용 웰중 하나에는 1개의 공 비드를 제공하였다. 다른 웰 각각에는 2 또는 3개의 공 비드를 제공하였다. 두 번째 세트의 웰들에는 웰당 120,000 또는 240,000개의 MMT 세포를 포함하는 1, 2 또는 3개의 비드를 제공하는 방식으로 유사하게 처리하였다. 웰들을 37℃에서 1주일 동안 배양한 후, RENCA 세포를 트립신분해하고, 세척한 후, 혈구계를 사용하여 계수하였다. 그 결과가 하기 표 1에 제시되어 있다:
1번 접시1 주일후 회수된 세포의 갯수 2번 접시1 주일후 회수된 세포의 갯수
웰 번호 대조군(공 마크로비드) 120,000 MMT 세포 대조군(공 마크로비드) 240,000MMT 세포
1 2.4 ×105 1.4 ×105 2.8 ×105 1 ×105
2 2.0 ×105 1.2 ×105 3.6 ×105 7 ×104
3 4.4 ×105 1.25 ×105 2.5 ×105 9 ×104
실시예 7
상기 실시예 6의 결과를 얻은 후, 접종체로서 RENCA 세포가 아닌 1 ×104개의 MMT 세포(즉, 유리 세포)를 사용하여 동일한 실험을 수행하였다. 실시예 6에서와 같이 실험을 수행하였다. 그 결과가 하기 표 2에 제시되어 있다.
1번 접시 2번 접시
웰 번호 대조군(공 마크로비드) 마크로비드내 120,000 MMT 세포 대조군(공 마크로비드) 마크로비드내 240,000 MMT 세포
1 3.1 ×106 1.6 ×106 2.8 ×106 1.3 ×106
2 3.3 ×106 1.0 ×106 2.6 ×106 1.1 ×106
3 3.0 ×106 6.0 ×105 2.8 ×106 5.0 ×105
이러한 결과는 실시예 8에 제시된 생체내 실험의 기초가 되었다.
실시예 8
본 실시예에서도 전술한 생쥐 유선 종양 세포주(MMT)를 사용하였다. 상기의 프로토콜을 이용하여 비드당 120,000개의 세포를 함유하는 이식편과 비드당 240,000개의 세포를 함유하는 이식편을 제조하였다.
실험 모델로는 상기 생쥐 모델을 사용하였다. 22 마리의 생쥐를 4 마리(대조군), 9 마리 및 9 마리의 군으로 분류하였다. 1군 즉, 대조군은 3개의 군으로 세분하여: 2 마리에게는 하나의 공 비드 이식편을 제공하고, 1 마리에게는 2개의 공 비드를 그리고 다른 1 마리에게는 3개의 공 비드를 제공하였다.
실험군 A(9 마리의 동물)의 비드에는 120,000개의 세포를 포함시킨 반면, 실험군 B의 비드에는 240,000개의 세포를 포함시켰다. A군 및 B군을 각기 3 마리의 생쥐군을 포함하는 3개의 소그룹으로 세분하였다. 각 소그룹에는 MMT 세포를 포함하는 1, 2 또는 3개의 비드를 제공하였다.
처음 며칠 동안, A군 및 B군의 생쥐들은 혼수상태로, 첨모 현상을 나타냈다. 이러한 현상은 약 5일 동안 지속되었으나, 이후 정상적인 상태로 회복되었다. 이식후 21일째에, 모든 동물에게 40,000개의 RENCA 세포를 주사하였다.
또다시 20일 후, 대조군 생쥐에게서 복부 팽창과 극도의 첨모 현상이 나타났다. 1 마리의 대조군 생쥐는 주사후 25일째에 사망하였으며, 나머지 대조군 생쥐도 임종 상태를 나타냈다. 모든 생쥐를 죽여 종양 발생을 관찰하였다. 그 관찰 결과가 하기 표 3에 제시되어 있다:
생쥐내 마크로비드의 갯수 대조군 실험군 A 실험군 B
1 ++++ - -
1 ++++ - -
1 + ++
2 ++++ - -
2 - -
2 ++ ++
3 ++++ - -
3 - -
3 - +++
상기 결과에 의하면, 18 마리의 처리 생쥐중 13 마리에게서 발병이 일어나지 않았다. A군의 생쥐중 한 마리의 생쥐에게서 약간의 작은 노둘(+)이 나타났으며, 다른 생쥐에게서는 약간의 종양(++)이 나타났다.
B군에서는, 1개의 비드를 제공받은 1 마리의 생쥐와 2개의 비드를 제공받은 1 마리의 생쥐가 장에 엉켜져 있는 약간의 종양을 나타냈다. 3개의 비드를 제공받은 생쥐중 1 마리에게서는 크고 딱딱한 종양이 발견되었으며, 외관상으로도 아주 병약(+++)한 상태로 보였다. 모든 대조군 생쥐에게서 수많은 종양(++++)이 발견되었다. 상기한 결과를 통해, 캡슐화된 생쥐 유방 종양 세포가 종양 형성을 억제함을알 수 있다.
실시예 9
상기 제시된 바와 같이, 본 발명에 의하면 종양 세포 증식을 억제 및/또는 예방하는 물질이 생성된다. 이는 후술되는 실험을 통해 더욱 연구되었다.
상기 실시예 2에 설명된 바와 같이 추가의 비드를 제조하되, 이 때에는 아텔로콜라겐을 포함시키지 않았다. 따라서, 이들 비드는 아가로즈/아가로즈 비드로 하였다. 전술한 RENCA 세포를 상기와 같이 다시 상기 비드내로 혼입시켰다.
이후, 6-웰 플레이트 3개로 구성된 2개의 세트를 대조군과 실험군으로 사용하였다. 대조군에서는, 웰을 4 ㎖의 RPMI 완전 배지(10% 소 태자 혈청 및 11 ㎖/ℓ의 페니실린)로 채웠다. 각 대조군 웰을 이후 10,000개의 RENCA 세포로 접종하였다.
실험군에서는, 50 ㎖의 RPMI 완전 배지를 포함하는 35 ×100 mm 페트리 플레이트에서 10개의 RENCA 함유 비드(비드당 120,000개의 세포)를 배양함으로써 수득된 물질을 RPMI 완전 배지에 첨가하여 조정 배지를 제조하였다. 배양 5일 후, 상기 플레이트로부터 배지를 수거하고, 그중 4 ㎖를 각 시험 웰중에 위치시켰다. 이후 이들 웰을 각각에 대해 10,000개의 RENCA 세포로 접종하였다.
모든 플레이트(대조군 및 시험군 모두)를 37℃에서 5일 동안 배양하였다. 배양 기간후, 세포를 트립신분해하고, 세척한 후, 모아서 혈구계로 계수하였다. 그 결과가 하기 표 4에 제시되어 있다:
시험 웰 번호 기준 배지의 RENCA 세포 조정 배지의 RENCA 세포
1 7 ×105 3 ×105
2 8 ×105 2.5 ×105
3 7 ×105 3.4 ×105
이들 결과로부터, 상기 실시예의 비드와 같이 제한된 상황하에서 세포가 종양 세포 증식을 억제하는 특정 물질을 생성함을 알 수 있다.
실시예 10
상기 실험 결과, 조정 배지하에서의 RENCA 세포 성장이 기준 배지하에서의 세포 성장의 절반 정도인 것으로 나타났다. 본 실험을 통해 조정 배지 동결후에도 증식 억제가 지속되는지에 대해 시험하였다.
10개의 RENCA 함유 비드를 5일 동안 배양하여 RENCA 조정 배지를 제조하였다. 37℃에서 50 ㎖의 RPMI 완전 배지가 포함된 35 ×100 mm 페트리 플레이트중에서 배양을 실시하였다. 배양후, 배지를 수거하고 -20℃에서 보관하였다. MMT(생쥐 유방 종양) 세포 함유 비드를 배양하여 조정 배지를 제조하였다. 이 비드들은 비드당 240,000개의 세포를 포함하고 있으며; 다른 모든 조건은 동일하였다.
동결 배지를 37℃에서 해동시킨 후, 하기 시험에서 사용하였다. 매 처리시 즉, (1) RPMI 기준 배지, (2) RENCA 동결 조정 배지 및 (3) MMT 동결 조정 배지에 6-웰 플레이트 3개씩을 사용하였다. 각 웰에 총 4 ㎖의 배지를 분배하였다. 모든 웰에 10,000개의 RENCA 세포를 접종시킨 후, 37℃에서 5일 동안 배양하였다. 배양후, 각 웰로부터 2개의 플레이트 샘플을 채취하여, 트립신분해하고, 세척한 후, 모아서 혈구계로 계수하였다. 8일째에 나머지 3개의 웰 플레이트를 동일한 방식으로 시험하였다.
그 결과는 하기 표 5와 같다:
5일된 접시 기준 배지 동결 RENCA 조정 배지 동결 MMT 조정 배지
1 6 ×105 5 ×105 8 ×104
2 6.8 ×105 4.2 ×105 8.5 ×104
8일된 접시
3 2.8 ×106 2 ×106 8 ×104
이들 결과를 상기 실시예 6의 결과와 비교해 볼때, 동결/해동된 RENCA 조정 배지가 동결/해동된 MMT 조정 배지만큼 증식을 억제시키지는 않지만(실시예 6 및 7 비교), 어느 정도는 증식을 억제시킨다는 것을 알 수 있다.
실시예 11
상기 실험들을 통해, RENCA- 또는 MMT-함유 마크로비드로부터의 동결 조정 배지가 생체외에서 RENCA 세포의 증식을 억제함을 확인할 수 있었다. 본 실험에서는 여과 과정에 의해 30 kd 또는 50 kd 농축물 형태로 제조된 RENCA- 또는 MMT-마크로비드 조정 배지도 생체외에서 RENCA 세포의 증식을 억제하는지에 대해 조사하고자 한다. 마크로비드 조정 배지의 효과를 단층 배양물에서 성장하는 비제한 RENCA 및 MMT 세포의 존재하에서 조정된 배지의 효과와 비교함으로써, 합류시까지 성장시킨 비제한 종양 세포 또한 증식 조절 물질을 생성할 수 있는지에 대해 판정하였다.
이들 실험에서는, 각기 120,000개의 RENCA 또는 MMT 세포를 포함하는 10개의 마크로비드(즉, 총 1.2 ×106개의 세포)를 사용하여 5일에 걸쳐 배지(완전 RPMI)를 조정하였다. 병행하여, 배양 접시에 1.2 ×106개의 RENCA 또는 MMT 세포 즉, 동일 수의 세포를 도말하고, 완전 RPMI 배지중에서 4일에 걸쳐 단층으로 증식되도록 하였다. 배지를 교체한 후, 이 배지를 24시간 후에 수거하였다. 비드와 비제한 세포의 노출 시간을 다르게 한 이유는 5일 기간의 말기에는 단층과 비드에서의 세포 수에 차이가 있기 때문이다(단층에서 3 내지 5배 세포수가 더 많음). 다르게 말하면, 비제한 세포가 캡슐화된 세포에 비해 3-5배 정도로 훨씬 더 급속하게 성장함을 의미한다.
30 kd 및 50 kd 필터를 사용하여 활성 물질을 포함하되, 실험에서 혼동을 줄 소지가 있는 인자인 독성 대사 물질 및/또는 폐기물은 제거된 조정 배지 농축물을 제조하였다. 잘 알려진 이러한 오염물질들은 그 크기가 작아서 30 kd 필터상에 남지 않게 된다. 여과물에 대해서도 시험을 하였으나, 세포 폐기물의 존재로 인해 본 물질에 의한 결과 해석이 복잡해질 뿐이다. 혈청 자체의 효과가 제어되었는지에 대해 확인하기 위한 목적으로 특정 실험에서는 무 혈청 배지(AIM V)를 사용하기도 하였다.
마크로비드 첨가후 3 내지 5일째에 또는 새로운 배지를 비제한 세포에 첨가한 후 24시간째에, 조정 배지를 수거하였다. 이후, 적절한 필터(30 kd 또는 50 kd 필터)를 구비한 시험관 필터내에 배지를 위치시키고, 90분 동안 원심분리시켰다. 필터상에 잔류하고 있는 물질은 "농축물"로 규정하고, 반면에 필터를 통과하여 시험관 바닥에 모인 물질을 여과물로 지칭한다.
하기 표 6, 7 및 8에 요약된 결과에 의하면, 마크로비드내 제한 RENCA 세포로부터 수득된 조정 배지 사용시, 이것이 2 차례에 걸친 별도의 실험에서 약 52% 가까이 RENCA 세포의 증식을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 50 kd 농축물이 두 경우 모두에서 약 99% 가까이 증식을 억제하는 반면에, 30 kd 농축물은 약 97% 정도 증식을 억제하였다.
RENCA 마크로비드 조정 배지 및 재구성 농축물에서의 RENCA 세포 성장 억제
플레이트번호 비조정 RPMI 배지 RENCA 마크로비드조정 배지 30 kd 배지 농축물 50 kd 배지 농축물
세포수 세포수 억제율 세포수 억제율 세포수 억제율
1 1.6 ×106 7.8 ×105 51.3% 4.2 ×104 97% 2.0 ×104 99%
2 1.65 ×106 8.0 ×105 51.5% 5.0 ×104 97% 2.0 ×104 99%
RENCA 세포 배양 조정 배지 및 재구성 농축물에서의 RENCA 세포 성장 억제
플레이트번호 비조정배지 RENCA 세포 배양조정 배지 30 kd 배지 농축물 50 kd 배지 농축물
세포수 세포수 억제율 세포수 억제율 세포수 억제율
1 1.6 ×106 1.3 ×106 18.8% 1.1 ×106 31.3% 9.0 ×105 43.8%
2 1.6 ×106 1.2 ×106 25.0% 1.0 ×106 37.5% 9.5 ×105 40.6%
RENCA 마크로비드 조정 배지 및 농축물(AIM V 배지)에서의 RENCA 세포 성장 억제
플레이트번호 AIM V 기준 배지 조정 배지 30 kd 농축물 50 kd 농축물
세포수 세포수 억제율 세포수 억제율 세포수 억제율
1 1.3 ×106 6.0 ×105 54% ~5.0 ×104 96% ~4.0 ×104 97%
2 1.3 ×106 5.5 ×105 58% ~5.0 ×104 96% ~4.0 ×104 97%
본 실험에서 중요한 점은 MMT 세포와 RENCA 세포가 마크로비드내에 포획되어 제한되었을 때, 모두 RENCA 세포의 증식을 억제한다는 것으로, 이는 증식 제한 효과가 종양 유형에 대해 특이성을 가지지 않음을 의미한다. 이러한 실험들로부터, 실시예 8의 MMT-함유 마크로비드가 생체내에서 RENCA 세포의 증식을 억제함을 확인할 수 있다. 또한, 마크로비드로부터 배지로 배출된 물질이 부분적이라도 증식-제한 효과에 관여하는 분자량 30 kd 이상의 물질을 포함하고 있음을 암시한다. 최종적으로, 이들 실험을 통해, 마크로비드-제한 RENCA 및 MMT 세포가 단층 배양물에서 합류시까지 성장한 동일 세포에 비해 훨씬 많은 양의 증식-억제 물질을 생성한다는 것을 알 수 있다.
실시예 12
상기 실험들을 통해, MMT- 및 RENCA-마크로비드 조정 배지 양자 모두 생체내 및 생체외 마크로비드내 증식-제한 세포로부터 방출된 RENCA 세포 증식 억제 물질을 포함하고 있음을 확인할 수 있었다. 중요한 사실은, 실험 결과 증식-억제 효과가 종양 유형에 대해 특이성이 없다는 것이다. 본 실험에서는, 그 효과가 종양이유래된 종의 종류와 무관한지에 대해 조사하고자 한다. 특히, 생체외에서 RENCA 세포(마크로비드 및 마크로비드-조정 배지 이용) 및 MMT 세포(마크로비드-조정 배지만을 이용)에 미치는 인체 유방암-유래된 세포주의 종양 세포 증식-억제 효과에 대해 시험하였다.
생체외 연구 방법은 전술한 실시예에 기술된 바와 유사하게 실시하였다. 100,000개의 MCF-7 세포(인체 유방암 세포)를 마크로비드내에 캡슐화시키고, 수득된 MCF-7 마크로비드를 RENCA 세포(웰당 10,000개)와 함께 5일 동안 배양하여 마크로비드의 증식-억제 효과에 대한 평가를 수행하였다. 또한, MCF-7 마크로비드-조정 배지를 5일 배양 기간에 걸쳐 제조한 후, RENCA 및 MMT 세포 모두에 대해 시험하였다. 세포 증식을 5일에 걸쳐 측정하였다.
그 결과가 하기 표로서 제시되어 있다:
RENCA 표적 세포에 대한 MCF-7 마크로비드의 결과
웰 번호 기준 배지(공 마크로비드) MCF-7 마크로비드
1 8.4 ×105 4.4 ×105
2 8.0 ×105 4.4 ×105
3 7.4 ×105 3.8 ×105
RENCA 표적 세포에 대한 MCF-7 조정 배지의 결과
플레이트 번호 RPMI 기준 배지 RPMI 조정 배지: MCF-7
1 9.0 ×105 5.0 ×105
2 8.8 ×105 4.8 ×105
MMT 표적 세포에 대한 MCF-7 조정 배지의 결과
플레이트 번호 RPMI 기준 배지 RPMI 조정 배지: MCF-7
1 5.0 ×105 1.5 ×105
2 6.0 ×105 1.8 ×105
상기 결과로부터, MCF-7, 인체 유방 선암 세포주가 마크로비드내에 증식-제한되었을 경우에 잇어서도, 마크로비드 자체 및 이로부터 유래된 조정 배지의 경우에서와 같이, 생쥐 신장 선암 세포와 생쥐 유방암 종양 세포의 증식을 상당 정도(30-70%)로 억제하는 물질을 생성한다는 것을 알 수 있다. 이는 성장-제한 암 세포의 증식-억제 효과가 종양 유형 및 종양 기원의 종 즉, 생쥐 및 인체 양자 모두에 대해 무관함을 암시한다.
실시예 13
상기 실험들을 통해, 인체-유래의 유방 선암 세포주(MCF-7)가 마크로비드내에 성장-제한되었을 경우, 생쥐 신장 및 생쥐 유방 선암 세포의 증식을 생체외에서 억제함을 확인할 수 있었다. 본 실험에서는, RENCA 세포 종양 성장에 대한 MCF-7-함유 마크로비드 효과가 생체내에서도 마찬가지로 존재하는지에 대해 조사하고자한다.
18 마리의 Balb/c 생쥐에게 20,000개의 RENCA 세포를 복강내 주사하였다. 3일 후, 생쥐를 2개의 군으로 분류하였다. 1군은 6 마리의 생쥐로 구성하고, 2군은 나머지 12마리의 생쥐로 구성하였다. 1군의 생쥐는 대조용으로서 각각에 3개의 공 마크로비드를 이식하였다. 2군의 생쥐에게는 각각 3개의 MCF-7-함유 마크로비드(비드당 100,000개의 세포)를 제공하였다. 25일 후, 1군에서 2마리의 생쥐를 2군에서 3마리의 생쥐를 죽였다. 26일 째에 동수의 생쥐를 죽이고, 나머지 생쥐들은 27일 째에 죽였다.
부검 결과, 대조용 생쥐의 복강은 완전히 종양으로 채워져 있는 것으로 관찰되었으며, 정상 조직은 확인이 어려울 정도였다. 이를 ++++(100%) 종양 정도로 분류하였다. 처치 생쥐에서는, 종양 정도가 +(10-20%)로 나타났다.
이러한 결과로부터, 인체 유방 선암 세포를 함유하는 마크로비드가 생쥐에게서 신장 세포 선암 종양의 성장을 억제하는 능력을 가지고 있음을 알 수 있으며, 암-세포 증식/종양 성장-억제 효과가 유형-특이적이거나 종-특이적이지 않음을 재차 확인할 수 있었다.
실시예 14
상기 실험들을 통해, 마크로비드 성장-제한 종양의 세포 증식/종양 성장 억제 효과가 종양-유형이나 종에 대해 특이성이 없음을 확인할 수 있었다. 본 실험에서는, (마크로비드) 증식-제한 생쥐 유방 선암 세포가 자생적인 유방 종양 및 MMT 세포의 주입으로 발생된 종양 모두의 성장을 억제할 수 있는지에 대해 조사하고자한다.
C3H 생쥐는 생존 기간중에 극히 높은 유방 종양 발생율을 나타낸다. 7 마리의 유방 종양 발병 생쥐들은 16월령에 종양이 발견되었다. 이 때, 7 마리의 생쥐중 5 마리에게 각각 100,000개의 세포를 함유하는 4개의 MMT 마크로비드를 이식하였다. 나머지 2 마리의 대조용 생쥐에게는 각각 4개의 공 마크로비드를 제공하였다. 2 마리의 대조용 생쥐에게서 커다란 종양이 발생되었으며, 비드 이식후 3 개월 이내에 사망하였다. MMT 마크로비드 이식후 11개월되었을 때 처치 생쥐를 죽였다. 마크로비드, 기관 및 종양들을 회수하여 개략적으로 조직 검사를 실시하였다. MMT 마크로비드의 헤마톡실린 앤드 에오신(Hermatoxylin & Eosin) 염색을 통해 생존 세포를 관찰하였다. 기존의 종양들은 크기 변화가 없었으며, 새로운 종양 발생의 흔적도 발견되지 않았다.
MMT 종양 세포를 흉부에 피하 주사하여 실험을 수행하였다. 14 마리의 C3H 생쥐를 2개의 rns으로 분류하였다. 5 마리의 대조군 생쥐에게는 각각 3개의 공 마크로비드를 이식하였다. 9 마리의 처치 생쥐에게는 각각 3개의 MMT-함유 마크로비드(240,000개의 세포)를 제공하였다. 이식후 3주째에, 14 마리의 모든 생쥐의 유방 부위에 각각 20,000개의 MMT 세포를 피하 주사하였다.
25 내지 30일 이내에, 5 마리의 대조군 생쥐에게서 종양 형성과 함께 병색이 나타나기 시작했으며, 주사후 35일 이내에 모두 사망하였다. 9 마리의 처치 생쥐를 주단위로 관찰하였으나, 이 기간 동안에 종양 형성이나 병색이 전혀 나타나지 않았다. 종양 주사 10 내지 12개월 후, 9 마리의 처치 생쥐중 4 마리에게서 덩어리 발생이 관찰되었으며, 반점 모양으로 탈모 현상이 나타났다. 최초 종양 주사후 13개월 째에, 나머지 5 마리의 생쥐에게 3개의 MMT 마크로비드를 재차 이식하였다. 1 마리의 생쥐가 상기한 작업후, 3일 째에 사망하였으나, 부검 결과, 종양은 전혀 발견되지 않았다. 4 마리의 생존 생쥐를 2차 마크로비드 이식후 8 개월째에 죽였다. 부검 결과, 최소한의 종양 증식도 전혀 나타나지 않았다.
상기 실험후 계속 관찰한 결과, 1차 이식시 회수한 비드가 조직적 측면 그리고 비드 제거후 조직 배양시 활발한 종양 성장 패턴을 재개할 수 있는 능력면 모두에서 생존가능한 종양 세포를 포함하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 실험을 통해, 마크로비드-제한 암 세포, 본 경우에 있어서는 생쥐 유방 선암 세포의 세포 증식/종양 성장-억제 효과가 자생 종양 및 종양 세포를 유방 부위에 주사하여 발생된 실험상 유도된 종양 모두의 발생 및 성장에 영향을 미칠 수 있음이 입증되었다.
실시예 15
상기 실험들 통해, 자생 종양 및 인공적으로 유도된 종양에 있어 종양 유형과 종으로 효능이 특화된 마크로비드 증식-제한 암 세포의 종양 세포 증식/종양 성장-억제 효과를 확인할 수 있었다. 본 실험에서는, 누드(Nu/Nu) 생쥐에 있어, 마크로비드-포획된, 증식-제한된 인체 전립선암-유도된 세포(ARCaP10), 생쥐(Balb/c) 신장 선암 세포(RENCA 세포) 및 생쥐(C3H) 유방 선암 세포(MMT)가 ARCaP10 종양 세포 및 ARCaP10 종양 성장의 증식에 미치는 효과에 대해 조사하고자 한다.
첫번째 실험으로, 15 마리의 Nu/Nu 생쥐의 측복부에 2.5 ×106개의 ARCaP10 세포를 피하 주사하였다. 주사후 20일 째에, 최대 종양 직경의 평균치가 0.5 ㎝로 되자, 생쥐를 2개의 군으로 분류하였다. 9 마리에게 각각 4개의 ARCaP10 마크로비드(마크로비드당 1.0 ×105개의 세포)를 이식하고, 6 마리의 대조용 생쥐에게는 각각 4개의 공 마크로비드를 제공하였다.
이식후 10주째에, 대조용 생쥐중 5 마리에게서 아주 커다란 혈관성 종양(평균 직경 2.5 ㎝)이 나타났으며, 1 마리의 생쥐에게서는 다소 작은 종양(0.5 ㎝ 미만)이 발견되었다. 처치군에 있어서는, 5 마리의 생쥐에게서 초기 종양의 퇴행이 관찰되었으며, 8 개월째에 죽이기 전까지 모두 무종양 상태로 생존하였다. 2 마리의 생쥐에게서는 종양이 전혀 성장되지 않은 상태 즉, 종양이 마크로비드 이식 시점에서와 동일한 최대 직경을 가지는 상태로 나타났으며, 2 마리의 생쥐에게서는 마크로비드 이식이래 종양 팽창 현상이 나타났다.
4 마리의 Nu/Nu 생쥐 측복부에 동물 1 마리당 3.0 ×106개의 ARCaP10 종양 세포를 피하 주사한 후 18일 째에 RENCA-함유 마크로비드(1.2 ×105)를 이식하여 실험을 실시한 결과(종양 용적 및 크기(l ×w ×h))가 하기에 제시되어 있다.
처치 생쥐의 종양 크기(mm) 관찰 결과
처치생쥐번호 이식 3일전(3/3/98) 이식일(3/6/98) 이식 3일후(3/9/98) 이식 6일후(3/12/98) 이식 10일후(3/16/98) 이식 14일후(3/20/98)
1 3.5 ×3(평면) 6.2 ×5.4(평면) 4 ×4(평면) 소멸 0 0
2 3 ×3 ×1.5 5.1 ×2.2 ×2 4 ×2 ×0.5 3 ×3 ×0.4 2 ×2 ×0.3 2 ×2 ×0.3
3 3 ×2.5 ×1 3.1 ×3.3 ×1 3 ×2 ×0.5 3 ×2 ×0.2 3 ×2 ×0.2 3 ×2 ×0.2
4 2.5 ×2.5(평면) 3.2 ×3.4 ×0.5 피하 반점 0 0 0
처치 생쥐의 종양 용적 관찰 결과
처치 생쥐번호 이식 3일전(3/3/98) 이식일(3/6/98) 이식 3일후(3/9/98) 이식 6일후(3/12/98) 이식 10일후(3/16/98) 이식 14일후(3/20/98)
1 2.76 8.81 1.68 0 0 0
2 7.10 11.81 2.10 1.89 0.63 0.63
3 3.95 5.38 1.58 0.63 0.63 0.63
4 1.64 2.86 0 0 0 0
별도의 실험으로, 10 마리의 Nu/Nu 생쥐에게 2.5 ×106개의 APCaP10 세포를 주입한 결과, 6 마리의 생쥐에게서 주입후 64일째에 종양 발생이 목격되었다. 이들 생쥐중 3 마리에게 각각 4개의 MMT 마크로비드(2.4 ×105개의 세포)를 주입하고, 3 마리에게는 공 마크로비드를 제공하였다. 하기에 제시된 바와 같은 결과가 나타났다.
처치 생쥐의 종양 크기(mm) 관찰 결과
처치 생쥐번호 이식 5일전(2/5/98) 이식일(2/10/98) 이식 18일후(2/28/98) 이식 22일후(3/4/98) 이식 27일후(3/9/98) 이식 30일후(3/12/98)
1 2 ×2 ×1 3 ×3 ×1.5 1 ×1 ×0.5 0 0 0
2 3 ×2 ×1 3 ×2.5 ×1 2 ×2(평면) <1 mm <0.8 mm <0.8 mm
3 4 ×4 ×1.5 6 ×6 ×1.5 6 ×2(평면) 4 ×1(평면) 3 ×1(평면) 3 ×1(평면)
대조용 생쥐의 종양 크기(mm) 관찰 결과
대조용 생쥐번호 이식 5일전(2/5/98) 이식일(2/10/98) 이식 18일후(2/28/98) 이식 22일후(3/4/98) 이식 27일후(3/9/98) 이식 30일후(3/12/98)
1 4 ×4 ×1.5 5 ×5 ×2 6.5 ×6 ×3 6.5 ×6 ×3 6.5 ×6 ×3 7 ×7 ×3
2 3 ×2 ×1 4 ×6 ×3 4.5 ×7 ×3 5 ×8 ×3 11 ×12 ×5 13.3 ×13.3 ×6.52차 종양 :6 ×6 ×1
3 5 ×4 ×1 5 ×4 ×2 5 ×4.6 ×2.5(다수엽) 5 ×5 ×2.5 6 ×6 ×2.52차 종양 :2 ×2 ×1 7 ×7 ×2.52차 종양 :3 ×3 ×0.5
이들 실험의 결과들로부터, 각종 종양에 미치는 증식 제한의 종양 성장-억제 효과가 교차-종(cross-species), 교차-종양(cross-tumor) 특성을 가짐을 더욱 확인할 수 있었다. 또한, 이들 실험들을 통해, 증식-제한 암 세포가 종양의 성장을 억제하고 종양의 형성을 방지하는 것 뿐만이 아니라 생체내 종양의 실제 소멸을 야기시키는 능력을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 16
상기 실험들을 통해, 여러 유형의 종양 및 종으로부터의 증식-제한 암 세포가 생체외에서 동일 또는 상이한 암 세포 유형의 증식을 억제하고, 자생 종양 및유도 종양 모두의 형성을 방해하며, 종양의 성장을 방해하며, 또한 종과 암 유형과는 무관하게 생체내에서 종양의 소멸을 야기시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 본 실험에서는, 상기한 사실들을 다른 종(토끼) 및 바이러스(VX2)에 의해 유도되는 것으로 공지된 토끼 종양으로 확장 적용하고자 한다.
본 실험에서는, 뉴질랜드산 화이트 토끼(2.5 lbs.)의 한쪽 허벅지(2 군데)에 각기 0.5 ㎖의 VX2 종양 슬러리(#26 게이지 바늘을 통과할 수 있는 것)를 근육내 주사하였다. 3.5주가 되자, 배측 허벅지상에 5 ㎝ ×2.5 ㎝(lxw)의 종양이 나타났으며, 복측 허벅지상에 2개의 3 ㎝-직경의 종양이 존재하였다. 이 때, 211개의 마크로비드(108개의 RENCA 세포 비드, 63개의 MMT 세포 비드 및 40개의 MCF-7 인체 유방암 세포-함유 비드)를 복강내로 이식하였다. 2일 이내에, 배측 하벅지상의 종양은 대략 50% 정도로 수축하였으나, 2개의 복측 종양은 변화가 없었다. 마크로비드 이식후 10일 째에 동물을 죽였다. 부검 결과, 배측 종양은 마크로비드 이식 시점에 비해 훨씬 작아진 반면에, 복측의 2개의 종양은 출혈 및 괴사를 나타내는 등, 배측 종양과 복측 종양간에 현저한 차이를 나타냈다.
본 실험을 통해, 생쥐 신장암, 생쥐 유방암 및 인체 유방암 세포-함유 마크로비드 혼합물을 사용함으로 해서, 종양 성장의 방지, 방해 및 소멸과 관련하여 각종 암 세포의 증식 제한에 대한 효능을 다른 종 즉, 토끼에까지 확장하고, 암 유형의 리스트에 공지된 바이러스 기원의 종양을 추가하며, 또한 성장 억제 효과의 교차-종양 및 교차-종 특성을 입증할 수 있었다. 또한, 본 실험은 암 치료를 위한 암 세포의 증식-제한 효능의 생체내 시험에 있어 보다 큰 동물 모델을 제시하고 있다.
실시예 17
상기 실험들을 통해, 각종 종양 세포의 증식-제한으로 생체외에서 동일 또는 상이한 유형의 세포에 대한 성장이 억제되고, 생체내에서 각종 종양의 형성이 방해되거나 그 성장이 억제되거나 또는 소멸이 일어난다는 사실과 그 효과가 종양 유형 및 종과는 무관하다는 사실을 확인할 수 있었다. 본 실험에서는, 조직학적, 배양 및 생체내 기술을 이용하여 1개월, 6개월, 2년 및 3년의 기간에 걸쳐 배양액내에서 유지된 아가로즈-아가로즈 마크로비드내 증식-제한된 RENCA 암 세포의 장-기간 생존가능성을 평가하고자 한다. MMT-함유 마크로비드를 6개월까지의 기간 동안 배양액중에서 유지시켰다. 또한, 이식후 2 내지 8개월의 기간이 지난 다음, Balb/c 및 C3H 생쥐 각각으로부터 회수된 RENCA- 및 MMT-함유 마크로비드를 조직학적 및 배양 기술 모두를 이용하여 생존가능한 종양 세포를 대상으로 실험하였다.
본 실험을 위해, 1.2 ×105개의 RENCA 세포 또는 2.4 ×105개의 MMT 세포를 사용해서 아가로즈-아가로즈 마크로비드를 제조하였다. 이들을 가지고, 조직학적으로(헤마톡실린 앤드 에오신 염색) 그리고 배양 기술에 의해 세포 생존가능성 및 종양 특성에 대해 전술반 간격을 두고 시험하였다. RENCA 마크로비드의 경우에 있어서는, 1 개월째에 대략 세포 수가 3- 내지 5-배 증가하였으며, 이후 6개월 동안 2배수씩 증가하였다. 1년후에는, 세포 증량이 계속되었으나, 세포 증식율은 감소하였다. 2년후, 비드 중앙부에 비정형 물질이 나타나기 시작하였으며, 세포 중량/갯수는 증가하지 않은 것으로 보였으나, 유사분열적 특징을 여전히 나타내고 있었다.3년 후에는, 비드 중앙부에서 다소 많은 양의 비정형 물질이 나타났으나, 세포 중량/갯수에는 변함이 없었다. MMT 마크로비드의 경우에는 단지 6개월 동안만 상기 현상이 나타났을 뿐이며, 세포 증식 및 비드 출현의 초기 패턴은 RENCA의 경우와 유사하였다.
전술한 간격을 두고 RENCA 및 MMT 세포의 생존성과 생체 활동에 대한 평가를 하기 위해 10개의 비드를 분쇄하여 RPMI 완전 배지중 2개 이상의 25 ㎠ 조직 배양 플라스크내에 위치시켰다. 이후 세포 성장에 대해 플라스크 관찰을 실시하였다. 1개월 및 6개월 간격에서, 비드로부터 회수가능한 생존 세포의 수가 증가하였다. 1년째에는, 분쇄 비드로부터 성장하는 RENCA 세포의 수가 6개월때와 유사한 것으로 나타났다. 2년 및 3년째에는, 생존 세포의 비율이 다소 감소하여, 배양 3년후에는 비드내에서(즉, 제한 상태내에서) 도달가능한 최대 수치의 대략 20% 정도로 떨어졌다.
생체내 이식후(RENCA 마크로비드의 경우 1-4년의 기간 동안 및 MMT 마크로비드의 경우는 8개월까지) 회수된 RENCA 및 MMT 마크로비드의 평가를 위해, 지금까지는 조직학적 기술을 이용해 왔다. 세포 증식 패턴과 중량은 대응 기간 동안 배양액중에서 유지된 비드의 경우와 아주 유사하여, RENCA의 경우 최소 4개월까지 그리고 MMT의 경우는 8개월까지 세포수가 증가하였다.
MCF-7 및 ARCaP10 같은 다른 암 세포주를 사용한 경우에 있어서는, 마크로비드내 생존 패턴이 RENCA 및 MMT에서 관찰된 것과 유사하게 나타났다.
본 실험을 통해, 생체외에서는 3년까지의 기간 동안 그리고 생체내에서는 최소 8개월의 기간 동안 증식-제한 환경에서 암 세포가 유지될 수 있으며, 이 기간 동안 생존이 지속되어 최소 1년까지는 세포수가 증가함이 명백히 입증되었다. 이는 암 치료 물질의 창출 및 보관 능력면에서 뿐아니라, 실험적 또는 자생적 암의 성공적인 치료를 위해 필요한 지속 기간 동안 온혈 동물내에서 종양 성장 억제 물질을 생성하는 증식-제한 세포의 능력면에서도 중요하다.
실시예 18
상기 실험들을 통해, 각종 암 세포가 증식-제한 조건하에서는 장기간 동안(3년 까지) 종양 증식, 종양 형성 및 세포-증식-억제와 종양-성장 방해, 중지 및 소멸 물질의 방출 능력을 유지할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 본 실험에서는 Balb/c 생쥐내에서의 암 세포-함유 아가로즈-아가로즈 마크로비드의 장기간(1년) 이식체의 독성 가능성에 대해 평가하고자 한다.
7 마리의 Balb/c 생쥐에게 각각 3개의 RENCA 마크로비드(비드당 1.2 ×105개의 세포)를 이식하였다. 수술 직후, 며칠 동안 생쥐에게서 병색(첨모 및 혼수상태)이 나타났으나, 이후에는 다시 건강해졌다. 모든 생쥐가 최소 1년 동안은 외관상 건강해 보였으며, 1 마리의 생쥐는 노환으로 그리고 다른 생쥐는 무관한 원인으로 죽었다. 모든 생쥐를 죽였다. 부검 결과, 섬유증, 복막염 또는 종양 성장 같은 이상증세가 전혀 관찰되지 않았다. 관찰된 모든 조직은 정상으로 보였으며, 단지 장의 장막 표면, 특히 장의 루프에 일부 비드가 부착되어 있는 것이 목격되었을 뿐이다. 장의 정상적인 기능과 구조에는 전혀 이상이 나타나지 않았다.
이러한 결과는 1년에 걸쳐 암 세포-함유 아가로즈-아가로즈 마크로비드가 실험 동물내에서 무난히 허용되고 있음을 의미한다. 상기한 사실로부터, 각종 생체내 종양을 비롯한 세포의 증식 방해, 억제 및 소멸에 증식-제한 암-세포 비드를 생체내에서도 이용할 수 있다는 것을 알 수 있다.
상기 실시예들은 급속 증식 세포의 증식을 억제하거나 제어하는, 특히 암 세포를 억제하는 물질을 생성할 수 있는 조성물과 관련하여 본 발명을 설명하기 위한 것이다. 이들 조성물은 선택-투과성의 물질내에 대수기 성장(급속 증식기)의 세포가 포획되어 형성된 세포 증식 제한 구조체를 포함한다. 제한의 결과로, 세포는 암 세포와 같은 급속 증식 세포의 증식을 억제하는 물질을 예상밖의 다량으로 생성한다. 제한 세포는 비-제한 세포의 양에 비해 많은 양의 물질을 생성한다.
본 발명의 구조체를 제조하는데 사용되는 물질로는 급속 증식 세포의 성장을 제한함으로써, 다량의 세포 증식/성장-억제 물질을 생성하도록 유도하는 생체적합성 물질이라면 어떠한 것도 사용이 무방하다. 이 구조체는 적절한 공극 크기를 가지고 있어서, 상기 억제성 물질이 외부 환경으로 확산되어 구조체 진입시 암 세포의 거부반응 또는 목적하는 물질의 지속적인 생성과 생존 능력에 손상을 줄 수 있는 숙주의 면역 체계로부터 생성물 또는 세포를 보호할 수 있도로 한다. 구조체 형성에 사용된 물질은 생체외 및 생체내 모두에서, 바람직하게는 수년까지의 기간 동안 적정 영양분의 진입, 세포 폐기물의 배출 및 적정 물리-화학적 구조체내 환경을 제공함으로써, 생존가능한(증식-제한된 또는 생존하는) 세포를 유지시키게 된다. 구조체 제조에 사용된 물질은 바람직하게는 생체내에 이식시, 가장 바람직하게는숙주내 전체 이식 기간중에 무난히 허용되는 것이 좋다.
이용가능한 물질 및 그 배합물의 비-제한적 리스트에는 알기네이트-폴리-(L-리신); 알기네이트-폴리-(L-리신)-알기네이트; 알기네이트-폴리-(L-리신)-폴리에틸렌이민; 키토산-알기네이트; 폴리하이드록시에틸-메타크릴레이트-메틸 메타크릴레이트; 카르보닐메틸셀룰로즈; K-카라기난; 키토산; 아가로즈-폴리에테르설폰-헥사디-메티린-브로마이드(폴리브렌); 에틸-셀룰로즈; 실리카 겔; 및 이들의 배합물들이 포함된다.
목적하는 조성물을 포함하는 구조체는 비드, 구체, 원통형, 캡슐, 시트 또는 피검체 및/또는 생체외 환경의 배양물에 있어 이식에 적합한 다른 형태 등 많은 형태를 취할 수 있다. 구조체의 크기는 최종 용도에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 잘 알 수 있을 것이다.
본 발명의 구조체는 구조체내로 영양분이 진입하고 증식-억제 물질 뿐아니라 세포 폐기물도 구조체로부터 배출될 수 있도록 선택 투과성으로 되어 있다. 생체내 사용을 위해서는, 제한 세포의 거부반응을 유발시키거나 세포의 증식-억제성 물질 생산 능력에 손상을 줄 수 있는 숙주 면역계의 생성물 또는 세포 진입을 구조체가 방해하도록 되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태로서, 암 세포 증식을 억제하는데 유용한 조성물이 포함된다. 이 조성물은 전술한 제한 세포를 적합한 배양 배지내에서 배양한 후, 생성된 조정 배지를 회수함으로써 제조된다. 이후, 이 조정 배지로부터 암 세포에 대해 높은 항-증식 효과를 지닌 분자량 30 kd 또는 50 kd 이상의 분획들을 분리해냄으로써농축물을 형성할 수 있다.
본 발명은 특정 유형의 증식 세포로만 국한되지 않는다. 신생물 세포, 태아 세포, 간 세포, 상해 또는 외상후와 같은 재생기에 있는 세포, 특히 혈구, 섬유아세포 및 표피 세포를 비롯하여 전술한 어떠한 급속 증식 세포도 본 발명에 사용가능하나, 이들로만 국한되지는 않는다. 암 세포가 바람직한 세포 유형의 일종으로, 사용가능한 암 세포의 예로는 신장암 세포, 유방암 세포, 전립선암 세포, 융모막암 세포 등을 들 수 있다. 암 세포로 또한 표피, 중피, 내피 또는 배아 세포 기원의 암 세포가 가능하며, 일반적으로 백혈병 세포 같은 고형 종양을 형성하지 않는 암 세포도 포함된다.
본 명세서로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 또다른 양태는 암, 염증, 섬유증 및 영양세포증 같은 과증식성 질환을 앓고 있는 개체를 치유하는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 한 양태는 증식기의 세포를 제어 방식을 통해 재생산함으로써 그 성장을 조절하는 것이다. 이는 특히 켈로이드(keloid) 및 반흔 조직의 생성을 제어하고, 복부 수술후 부착을 예방하고, 가능하게는 건선 같은 과증식성 피부 질환을 치료하는데 유용하다. 치료 목적으로 사용하는 경우에 있어서는, 하기에 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 구조체내에 제한된 세포의 유형이 환자의 질환을 야기시키는(또는 야기시킬 수 있는) 세포의 유형과 동일할 수도 있으나, 반드시 동일할 필요까지는 없다. 상기한 한 방법은 하나 이상의 본 발명의 구조체를 피검체내로, 피검체내 세포 증식 억제를 유발시키기에 충분한 양으로 삽입시키는 과정으로 이루어진다. 이 방법은 암 치료의 목적으로 사용하는 것이 바람직하며, 이때 피검체로는 인체가 적당하나, 가축, 축산 동물 같은 암으로 고생하는 기타의 동물에도 적용가능하다.
본 발명의 조성물은 과증식성 질환의 치료에 1차 요법으로 그리고 타 요법에 병행되는 보조 치료로 이용될 수 있다. 예를 들어, 방사선 요법, 화학요법, 사이토킨, 안티-센스 분자, 스테로이드 호르몬 같은 다른 생체 활성 물질을 사용한 치료, 유전자 요법 등과 같은 공지의 치료법과 함께 본 발명의 조성물과 방법을 이용하여 환자를 치료할 수 있는 것이다. 본 발명의 조성물과 방법은 재성장 및 전이 방지를 위한 종양 절제후 마크로비드를 이식하는 것과 같이 암을 치료하는 외과적 과정과 병행할 수도 있다. 수술불가능 상태의 암도 본 발명의 항-증식성 조성물을 사용하여 치료함으로써 수술가능 상태로 만들 수 있다.
본 발명의 조성물은 암 발병 위기에 있는, 예를 들면 개별적 위험 인자의 존재, 일반적으로 암의 가계 병력, 특정 유형의 암(예, 유방암)의 가계 병력 및 직업적으로 또는 기타 발암물질이나 암 촉진제로의 노출 등의 요인을 가진 개체에게 있어 예방목적으로 사용될 수도 있다. 암 예방용으로 사용되는 경우에 있어서는, 하나 이상의 위험 요인이 확인된 개체에게 예방 유효량의 본 발명 구조체를 투여한다.
상기 실시예에서 제시한 바와 같이, 항증식 효과는 사용된 증식 세포의 유형이나 증식 세포의 기원이 되는 종에 의해 한정되지 않는다. 따라서, 예를 들면 특정 유형의 암 세포를 포함하는 구조체를 상이한 유형의 또다른 암을 가진 피검체에게 투여하는 것이 가능하다. 또한, 치료받는 종과는 상이한 종의 증식성 세포를 투여용 구조체에 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 구조체내에 생쥐 암 세포를 제한시킨 후, 이를 인체에 투여하는 것이 가능하다. 물론, 치료받고자 하는 종과 동일한 종으로부터 채취한 암 세포를 구조체내에 포함시킬 수도 있다. 치료받고자 하는 개체로부터 증식성 세포를 채취하고, 포획하여 제한시킨 후, 이를 동일 개체에게 투여할 수도 있다. 다시 말하면, 환자 자신의 암 세포를 제한하여 동일 암을 억제하는데 사용할 수도 있다는 것이다.
본 발명의 다른 양태는 치료제로서 본 명세서에서 설명된 농축물을 사용하는 것이다. 이들 농축물은 본 명세서에서 설명된 바와 같이 제조한 후, 암 같은 과증식성 질환을 앓고 있는 피검체 또는 세포 성장 속도 제어를 요하는 환자, 예를 들면 유해하거나 단순히 목적하지 않는 과도한 반흔 조직의 특정 부위에 상처를 입은 수술후 환자에게 투여할 수 있다. 전술한 모든 구체예들은 농축물 제조에도 적용할 수 있다. 예를 들면, 생쥐 암 세포를 함유하는 구조체를 생체외 배양하여, 농축물을 제조한 후, 이를 인체에게 투여할 수 있다. 유사한 방식으로, 구조체에 인체 세포 및 동일 개체로부터 얻은 세포를 포함시킬 수 있다. 전술한 바와 같이, 농축물 제조에 사용된 암 세포 유형은 피검체가 앓고 있는 암과 동일한 유형일 수도 있으나, 반드시 동일할 필요까지는 없다. 따라서, 예컨대, 흑색종 환자를 치료하기 위한 목적으로 농축물을 제조하는데에, 쥐의 유방암 세포를 사용하는 것도 가능하며, 전리선 암 환자가 자신의 일부 전립선 암 세포를 제거하여, 본 발명의 구조체내에 포획시켜 적정 배지에서 배양 후, 수득된 조정 배지를 여과하여 농축물을 제조하는 것도 가능하다. 본 발명 구조체의 생체외 배양물로부터 수득되는 조정 배지 또한본 발명의 일부를 구성한다.
본 발명의 구조체 및 본 발명의 농축물을 제조하는 방법 또한 본 발명의 일부이다. 농축물의 경우, 충분량의 항증식성 물질을 생성하기에 충분한 시간 동안 본 발명의 구조체를 배양한 후, 수득된 조정 배지로부터 목적 부분을, 예를 들면 30 kd 또는 50 kd 같은 적정 컷 오프점(cut off point)을 가진 필터를 사용하여 여과함으로써 분리시킨다.
당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 다른 특징들에 대해 명확히 알 수 있을 것이므로, 본 명세서에서는 더이상 설명하지 않도록 하겠다.
본 명세서에서 사용된 용어와 표현들은 한정이 아닌 설명을 위해 사용된 것으로, 이러한 용어와 표현을 사용함으로 해서 본 명세서에서 제시되고 설명된 특징 또는 그 일부와 동등한 의미가 배제되어서는 아니되며, 본 발명의 범주내에서의 다양한 변형 또한 가능하다.
본 발명의 특징중 하나인 구조체들은, 암과 같은 질환이나 증세와 연관된 급속 증식성 세포에 대해 항-증식성 효과를 나타내는 소정 분자량의 농축물과 같은 물질로서 사용되거나 이를 생성하기 위한 목적으로 또는 수술후 반흔 형성과 같은 비제어 세포 성장으로 야기될 수 있는 의료상의 문제를 방지하기 위해 세포 성장을 조절할 목적으로 사용될 수 있다.

Claims (48)

  1. 세포 증식을 억제할 필요가 있는 피검체에게 투여하기 위한, 상기 피검체와는 다른 종으로부터 수득된, 세포 증식 억제 물질을 생성하는 제한된 고 증식성 세포를 포함하는 생체적합성의, 증식-제한적, 선택-투과성 비드.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 제한된 세포가 상기 피검체가 앓고 있는 증세와 관련있는 세포와 상이한 세포인 것을 특징으로 하는 비드.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 제한된 세포가 상기 피검체가 앓고 있는 증세와 관련있는 세포와 동일한 세포인 것을 특징으로 하는 비드.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 비드가 약 10,000 내지 약 500,000개의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 비드.
  5. 제3 항에 있어서,
    상기 비드가 약 30,000 내지 약 250,000개의 세포를 포함하는 것을 특징으로하는 비드.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 제한된 세포가 신생물 세포, 암 세포, 태아 세포, 간 세포, 혈구, 섬유아세포 및 표피 세포로 구성된 군중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 비드.
  7. 제6 항에 있어서,
    상기 제한된 세포가 표피 세포인 것을 특징으로 하는 비드.
  8. 제6 항에 있어서,
    상기 제한된 세포가 암 세포인 것을 특징으로 하는 비드.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 암 세포가 유방암 세포, 전립선암 세포, 신장암 세포 및 융모막암 세포로 구성된 군중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 비드.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 피검체가 인체인 것을 특징으로 하는 비드.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 제한된 세포가 생쥐 세포인 것을 특징으로 하는 비드.
  12. 세포 증식을 억제할 필요가 있는 피검체에게 투여하기 위한, 상기 피검체와 동일한 종으로부터 수득된, 비드를 통해 확산되는 분자량 30 kd 이상의 세포 증식 억제 물질을 생성하는 제한된 고 증식성 세포를 포함하는 생체적합성의, 증식-제한적, 선택-투과성 비드.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 제한된 세포가 상기 피검체와는 상이한 개체로부터 채취한 것임을 특징으로 하는 비드.
  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 제한된 세포가 상기 비드 투여 대상이 되는 피검체로부터 채취한 것임을 특징으로 하는 비드.
  15. 제 12 항에 있어서,
    상기 피검체가 인체인 것을 특징으로 하는 비드
  16. 제 12 항에 있어서,
    상기 제한된 세포가 신생물 세포, 암 세포, 태아 세포, 간 세포, 혈구, 섬유아세포 및 표피 세포로 구성된 군중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 비드.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 제한된 세포가 표피 세포인 것을 특징으로 하는 비드.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 제한된 세포가 암 세포인 것을 특징으로 하는 비드.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 제한된 세포가 유방암 세포, 신장암 세포 및 전립선암 세포로 구성된 군중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 비드.
  20. 제 12 항에 있어서,
    상기 제한 세포가 상기 피검체가 앓고 있는 증세와 관련있는 증식 세포와는 상이한 유형의 세포인 것을 특징으로 하는 비드.
  21. 제 12 항에 있어서,
    상기 고 증식성 세포가 상기 피검체가 앓고 있는 증세를 유발시키는 세포와 동일한 유형의 세포인 것을 특징으로 하는 비드.
  22. 제 12 항에 있어서,
    상기 비드가 약 10,000 내지 약 500,000개의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 비드.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 비드가 약 30,000 내지 약 250,000개의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 비드.
  24. 급속 증식 세포의 샘플을 생체적합성의, 증식-제한적, 선택-투과성 비드내에 포획하고, 상기 포획된 세포의 증식을 제한하기에 충분한 시간 동안 상기 비드를 배양 배지중에서 배양하여, 상기 포획된 세포로부터 세포 증식 억제 물질이 생성되도록 한 후, 분자량이 30 kd 미만인 물질로부터 약 30 kd 이상의 분자량을 가진 물질을 분리해내는 필터를 통해 상기 배지를 여과하고, 약 30 kd 이상의 분자량을 가진 물질을 수득함으로써 제조된, 세포 증식 억제용 조성물을,
    세포 증식을 억제할 필요가 있는 인간을 제외한 동물에 속하는 피검체에게, 상기 피검체내에서 세포 증식을 억제하기에 충분한 양만큼 투여하는 것을 포함하여, 상기 피검체에서 세포 증식을 억제하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 포획된 세포가 신생물 세포, 암 세포, 태아 세포, 간 세포, 혈구, 섬유아세포 및 표피 세포로 구성된 군중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 포획된 세포가 표피 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25 항에 있어서,
    상기 포획된 세포가 암 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 포획된 세포가 신장암 세포, 융모막암 세포, 유방암 세포 및 전립선암 세포로 구성된 군중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 24 항에 있어서,
    상기 포획된 세포가 인체 세포가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 24 항에 있어서,
    상기 포획된 세포가 생쥐 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 24 항에 있어서,
    상기 포획된 세포가 인체 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 24 항에 있어서,
    상기 포획된 세포가 피검체가 앓고 있는 증세와 관련있는 증식 세포와 동일한 유형의 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 24 항에 있어서,
    상기 포획된 세포가 상기 비드 투여 대상이 되는 피검체로부터 채취한 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 24 항에 있어서,
    상기 비드가 약 10,000 내지 약 500,000개의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 24 항에 있어서,
    상기 비드가 약 30,000 내지 약 250,000개의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서,
    상기 비드가 약 30,000 내지 약 250,000개의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제한시에는 동수의 비제한 동일 세포에 비해 많은 양의, 비드를 통해 확산되는 분자량 30 kd 이상의 세포 증식 억제 물질을 생성하는 생체적합성의, 증식-제한적, 선택-투과성 비드를 포함하는 조성물.
  38. 세포를 생체적합성의, 증식-제한적 물질과 접촉시켜 비드를 형성하고, 동수의 동일 유형의 비제한 세포에 비해 많은 양의 상기 비드를 통해 확산되는 분자량 30 kd 이상의 세포 증식 억제 물질을 생성하도록 상기 세포를 제한하기에 충분한 시간 동안 상기 비드를 배양하는 단계를 포함하여, 생체적합성의, 증식-제한적, 선택-투과성 비드를 제조하는 방법.
  39. 고 증식성 세포를 비드-형성 물질을 사용하여 제한시켜 생체적합성의, 증식-제한적, 선택-투과성 증식 세포 함유 비드를 형성하고, 제한시 동수의 비제한 세포에 비해 많은 양의, 상기 비드를 통해 확산되는 30 kd 이상의 물질을 생성할 때까지 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 세포 성장을 억제하고 분자량이 30 kd 이상인 물질의 생성을 증대시키는 방법.
  40. 급속 증식 비-암 세포의 샘플을 생체적합성의, 증식-제한적, 선택-투과성 비드내에 포획하고, 상기 포획된 비-암 세포의 증식을 제한하여 세포 증식 억제 물질이 생성되도록 하는데 충분한 시간 동안 상기 비드를 배양 배지중에서 배양함으로써 생성된 세포 증식 억제용 조성물.
  41. 내부에 급속 증식 비-암 세포가 포획된 생체적합성의, 증식-제한적, 선택-투과성 비드를 상기 세포가 증식-억제 물질을 생성하도록 하는데 충분한 시간 동안 배지중에서 배양하는 것을 포함하여, 세포 증식-억제 효과를 가진 물질의 생성을 자극하는 방법.
  42. 세포 증식을 억제할 필요가 있는 피검체에게 투여하기 위한, 상기 피검체와 동일한 종으로부터 수득된, 비드를 통해 확산되는 세포 증식 억제 물질을 생성하는 제한된 고 증식성 비-암 세포를 포함하는 생체적합성의, 증식-제한적, 선택-투과성 비드.
  43. 세포 증식을 억제할 필요가 있는 인간을 제외한 동물에 속하는 피검체에게, 상기 피검체와는 다른 종으로부터 수득된, 세포 증식 억제 물질을 생성하는 제한된 고 증식성 세포를 포함하는 생체적합성의, 증식-제한적, 선택-투과성 비드를 상기 피검체내에서 세포 증식을 억제하기에 충분한 양의 치료 유효량만큼 투여하는 것을 포함하여, 상기 피검체내에서 세포증식을 억제하는 방법.
  44. 세포 증식을 억제할 필요가 있는 인간을 제외한 동물에 속하는 피검체에게, 상기 피검체와 동일한 종으로부터 수득된, 비드를 통해 확산되는 분자량 30 kd 이상의 세포 증식 억제 물질을 생성하는 제한된 고 증식성 세포를 포함하는 생체적합성의, 증식-제한적, 선택-투과성 비드를 상기 피검체내에서 세포 증식을 억제하기에 충분한 양의 치료 유효량만큼 투여하는 것을 포함하여, 상기 피검체에서 세포 증식을 억제하는 방법.
  45. 세포 증식을 억제할 필요가 있는, 인간을 제외한 동물에 속하는 피검체에게, 상기 피검체와 동일한 종으로부터 수득된, 비드를 통해 확산되는 세포 증식 억제 물질을 생성하는 제한된 고 증식성 비-암 세포를 포함하는 생체적합성의, 증식-제한적, 선택-투과성 비드를 상기 피검체내에서 세포 증식을 억제하기에 충분한 양의 치료 유효량만큼 투여하는 것을 포함하여, 상기 피검체에서 세포 증식을 억제하는 방법.
  46. 제37항 또는 제40항에 있어서, 비드는 아가로즈를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  47. 제1항 또는 제12항에 있어서, 비드는 아가로즈를 함유하는 것을 특징으로 하는 비드.
  48. 제24항, 제38항, 제39항, 제41항 및 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 비드는 아가로즈를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR10-2004-7010695A 1998-11-09 1999-11-09 증식 억제 물질을 생성하는 급속 성장성 제한 세포의조성물 및 이들을 사용하는 방법 KR20040075922A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/188,476 1998-11-09
US09/188,476 US6224912B1 (en) 1996-04-03 1998-11-09 Cancer-cell proliferation-suppressing material produced by cancer cells restricted by entrapment
PCT/US1999/026413 WO2000027207A1 (en) 1998-11-09 1999-11-09 Compositions of restricted cells capable of rapid growth which produce proliferation suppressive materials, and uses thereof

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020017002601A Division KR20020013465A (ko) 1998-11-09 1999-11-09 증식 억제 물질을 생성하는 급속 성장성 제한 세포의조성물 및 이들을 사용하는 방법

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057009800A Division KR20050055797A (ko) 1998-11-09 1999-11-09 증식 억제 물질을 생성하는 급속 성장성 제한 세포의조성물 및 이들을 사용하는 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20040075922A true KR20040075922A (ko) 2004-08-30

Family

ID=22693322

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057009800A KR20050055797A (ko) 1998-11-09 1999-11-09 증식 억제 물질을 생성하는 급속 성장성 제한 세포의조성물 및 이들을 사용하는 방법
KR10-2004-7010695A KR20040075922A (ko) 1998-11-09 1999-11-09 증식 억제 물질을 생성하는 급속 성장성 제한 세포의조성물 및 이들을 사용하는 방법
KR1020017002601A KR20020013465A (ko) 1998-11-09 1999-11-09 증식 억제 물질을 생성하는 급속 성장성 제한 세포의조성물 및 이들을 사용하는 방법

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057009800A KR20050055797A (ko) 1998-11-09 1999-11-09 증식 억제 물질을 생성하는 급속 성장성 제한 세포의조성물 및 이들을 사용하는 방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020017002601A KR20020013465A (ko) 1998-11-09 1999-11-09 증식 억제 물질을 생성하는 급속 성장성 제한 세포의조성물 및 이들을 사용하는 방법

Country Status (19)

Country Link
US (4) US6224912B1 (ko)
EP (1) EP1128731B1 (ko)
JP (2) JP4294223B2 (ko)
KR (3) KR20050055797A (ko)
CN (1) CN1325271A (ko)
AT (1) ATE446678T1 (ko)
AU (1) AU769411B2 (ko)
CA (1) CA2334483C (ko)
DE (1) DE69941599D1 (ko)
DK (1) DK1128731T3 (ko)
EG (1) EG24212A (ko)
ES (1) ES2335723T3 (ko)
HK (1) HK1039439A1 (ko)
IL (3) IL139704A0 (ko)
NO (2) NO20012152L (ko)
NZ (1) NZ511220A (ko)
PT (1) PT1128731E (ko)
RU (2) RU2236855C2 (ko)
WO (1) WO2000027207A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR200485213Y1 (ko) 2016-11-02 2017-12-07 고수한 높이 조절이 가능한 조립식평상

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE39542E1 (en) * 1994-01-13 2007-04-03 The Rogosin Institute Preparation of agarose coated, solid agarose-collagen beads containing secretory cells
PT1418228E (pt) * 1994-01-13 2006-09-29 Rogosin Inst Processo de preparacao de uma biblioteca multicombinatoria de vectores de expressao de genes de anticorpos.
US7297331B2 (en) * 1996-04-03 2007-11-20 The Rogosin Institute Beads containing restricted cancer cells producing material suppressing cancer cell proliferation
US6224912B1 (en) * 1996-04-03 2001-05-01 The Rogo Institute Cancer-cell proliferation-suppressing material produced by cancer cells restricted by entrapment
US20050053586A1 (en) 2003-09-04 2005-03-10 Bryan Conn Entrapped stem cells and uses thereof
WO2006053052A2 (en) * 2004-11-11 2006-05-18 The Rogosin Institute Method for treating patients with implants of islets which have been kept in long term, in vitro culture
CA2622529C (en) * 2005-09-26 2014-02-18 Lawrence Gazda Secretory cell-containing macrobeads comprising seakem gold agarose, and uses thereof
WO2008149930A1 (ja) 2007-06-08 2008-12-11 Hamamatsu Photonics K.K. 分光モジュール
JP5094742B2 (ja) 2007-06-08 2012-12-12 浜松ホトニクス株式会社 分光器
EP2063239A4 (en) 2007-06-08 2013-12-25 Hamamatsu Photonics Kk SPECTROSCOPIC MODULE
JP4891841B2 (ja) 2007-06-08 2012-03-07 浜松ホトニクス株式会社 分光モジュール
JP4891840B2 (ja) 2007-06-08 2012-03-07 浜松ホトニクス株式会社 分光モジュール
EP2075555A4 (en) 2007-06-08 2014-01-01 Hamamatsu Photonics Kk SPECTROSCOPIC MODULE
JP4887221B2 (ja) 2007-06-08 2012-02-29 浜松ホトニクス株式会社 分光モジュール
MX2010001993A (es) 2007-08-23 2010-03-11 Intrexon Corp Metodos y composiciones para diagnosticar una enfermedad.
EP2205249B1 (en) 2007-09-28 2018-11-07 Intrexon Corporation Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof
EP2801802A1 (en) 2008-03-04 2014-11-12 Hamamatsu Photonics K.K. Spectroscopy module
JP5207938B2 (ja) 2008-05-15 2013-06-12 浜松ホトニクス株式会社 分光モジュール及び分光モジュールの製造方法
JP5205240B2 (ja) 2008-05-15 2013-06-05 浜松ホトニクス株式会社 分光モジュールの製造方法及び分光モジュール
JP5415060B2 (ja) 2008-05-15 2014-02-12 浜松ホトニクス株式会社 分光モジュール
JP5205241B2 (ja) 2008-05-15 2013-06-05 浜松ホトニクス株式会社 分光モジュール
JP2009300418A (ja) 2008-05-15 2009-12-24 Hamamatsu Photonics Kk 分光モジュール
JP5512961B2 (ja) 2008-05-15 2014-06-04 浜松ホトニクス株式会社 分光モジュール及びその製造方法
JP5205238B2 (ja) 2008-05-15 2013-06-05 浜松ホトニクス株式会社 分光モジュール
EP2412800A1 (en) * 2010-07-29 2012-02-01 Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Liver organoid, uses thereof and culture method for obtaining them
US8572921B2 (en) * 2009-03-27 2013-11-05 Davinci Roofscapes, Llc One piece hip and ridge shingle
KR101853418B1 (ko) * 2010-06-16 2018-05-02 미네르바 바이오테크놀로지 코포레이션 암 세포의 역분화
JP2013533319A (ja) * 2010-08-12 2013-08-22 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 膵内分泌腺前駆体細胞による糖尿病の治療
PL2777398T3 (pl) * 2010-11-23 2017-09-29 The Rogosin Institute, Inc. Sposób izolowania opornych na środek chemioterapeutyczny komórek rakowych o właściwościach komórek macierzystych
HUE034618T2 (en) 2012-01-31 2018-02-28 The Rogosin Inst Inc An improved process for producing macros
EP3403098B1 (en) 2016-01-12 2021-09-22 BioAtla, Inc. Diagnostics using conditionally active antibodies
US10697972B2 (en) 2016-01-12 2020-06-30 Bioatla, Llc Diagnostics using conditionally active antibodies
US20200363402A1 (en) * 2018-02-02 2020-11-19 Wake Forest University Health Sciences Organoids related to immunotherapy and methods of preparing and using the same

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3865689A (en) 1972-11-09 1975-02-11 Hoffmann La Roche Method of producing carcinoembryonic antigens
US4285930A (en) 1977-12-08 1981-08-25 Likhite Vilas V Antigens comprising immunostimulant adjuvants and their use in immunotherapy
US4409331A (en) 1979-03-28 1983-10-11 Damon Corporation Preparation of substances with encapsulated cells
US4391909A (en) 1979-03-28 1983-07-05 Damon Corporation Microcapsules containing viable tissue cells
US4352883A (en) 1979-03-28 1982-10-05 Damon Corporation Encapsulation of biological material
DE3032931C2 (de) 1980-09-02 1982-07-29 Robert Bürkle GmbH & Co, 7290 Freudenstadt Verfahren und Anordnung zur Herstellung von Mehrschicht-Leiterplatten
SE441009B (sv) 1982-03-08 1985-09-02 Kjell Nilsson Sett att immobilisera levande biomaterial i perlformiga polymerer
US4798786A (en) 1982-05-06 1989-01-17 Stolle Research And Development Corporation Living cells encapsulated in crosslinked protein
JPS5933223A (ja) 1982-08-20 1984-02-23 Koken Kk 人の悪性腫瘍細胞増殖抑制剤
CA1196862A (en) 1983-06-01 1985-11-19 Anthony M.F. Sun Microencapsulation of living tissue and cells
US4663286A (en) 1984-02-13 1987-05-05 Damon Biotech, Inc. Encapsulation of materials
US4680174A (en) 1984-05-24 1987-07-14 Damon Biotech, Inc. Induction of immune response by immunization with encapsulated antigen-producing cells
JPS6118721A (ja) 1984-07-06 1986-01-27 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規抗腫瘍性物質
US4997443A (en) 1985-08-26 1991-03-05 Hana Biologics, Inc. Transplantable artificial tissue and process
US4902295A (en) 1985-08-26 1990-02-20 Hana Biologics, Inc. Transplantable artificial tissue
US5618715A (en) 1985-12-20 1997-04-08 Oncogen Limited Partnership Oncostatin M and novel compositions having anti-neoplastic activity
SE8604684L (sv) 1986-11-03 1988-05-04 Excorim Kommanditbolag Sett att belegga fasta partiklar med en hydrofil gel samt genom settet belagda partiklar
JPS6463395A (en) 1987-05-04 1989-03-09 Oncogen Oncostatin m and novel composition having antitumor activity
JPH0216994A (ja) 1988-07-05 1990-01-19 Nippon Mining Co Ltd 細胞増殖阻害因子及びその製造方法
US5053332A (en) 1989-07-24 1991-10-01 Cook Richard B Agarose beads, preferably incorporating biological materials
US5227298A (en) 1990-08-17 1993-07-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for microencapuslation of cells or tissue
US5800829A (en) 1991-04-25 1998-09-01 Brown University Research Foundation Methods for coextruding immunoisolatory implantable vehicles with a biocompatible jacket and a biocompatible matrix core
JP4215273B2 (ja) 1991-04-25 2009-01-28 ブラウン ユニヴァーシティ リサーチ ファンデーション 選択された治療物質放出用の移植可能で生体適合性の免疫遮断性ビークル
NZ250363A (en) * 1992-12-04 1996-11-26 Susanna Elizabeth Chalmers A topical dressing containing a dessicant and an antimicrobial or antiseptic agent
AU7568094A (en) 1993-08-12 1995-03-14 Cytotherapeutics, Inc. Improved compositions and methods for the delivery of biologically active molecules using genetically altered cells contained in biocompatible immunoisolatory capsules
PT1418228E (pt) * 1994-01-13 2006-09-29 Rogosin Inst Processo de preparacao de uma biblioteca multicombinatoria de vectores de expressao de genes de anticorpos.
ES2125630T3 (es) 1994-07-08 1999-03-01 Baxter Int Dispositivo implantable que contiene celulas tumorales, para el tratamiento del cancer.
DE69725317T2 (de) 1996-04-03 2004-07-29 The Rogosin Institute Implantierbare agarose-kollagenkügelchen enthaltende zellen, die ein diffusionsfähiges biologisches produkt bilden und ihre verwendung
US5888497A (en) * 1996-04-03 1999-03-30 The Rogosin Institute Agarose coated agarose beads containing cancer cells that produce material which suppresses cancer cell proliferation
US6224912B1 (en) * 1996-04-03 2001-05-01 The Rogo Institute Cancer-cell proliferation-suppressing material produced by cancer cells restricted by entrapment

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR200485213Y1 (ko) 2016-11-02 2017-12-07 고수한 높이 조절이 가능한 조립식평상

Also Published As

Publication number Publication date
US6818230B2 (en) 2004-11-16
KR20020013465A (ko) 2002-02-20
NO20101615L (no) 2001-07-05
KR20050055797A (ko) 2005-06-13
DK1128731T3 (da) 2010-01-25
RU2268735C1 (ru) 2006-01-27
IL139704A0 (en) 2002-02-10
NO20012152L (no) 2001-07-05
AU1472600A (en) 2000-05-29
CA2334483A1 (en) 2000-05-18
CA2334483C (en) 2012-01-10
US7041504B2 (en) 2006-05-09
EG24212A (en) 2008-10-28
IL139704A (en) 2006-12-31
NO20012152D0 (no) 2001-05-02
WO2000027207A1 (en) 2000-05-18
AU769411B2 (en) 2004-01-29
JP4294223B2 (ja) 2009-07-08
US6224912B1 (en) 2001-05-01
US20030143739A1 (en) 2003-07-31
IL177967A (en) 2010-12-30
JP2002529060A (ja) 2002-09-10
EP1128731B1 (en) 2009-10-28
ATE446678T1 (de) 2009-11-15
US6808705B2 (en) 2004-10-26
EP1128731A4 (en) 2003-06-04
RU2004115040A (ru) 2005-10-27
PT1128731E (pt) 2010-02-02
HK1039439A1 (zh) 2002-04-26
EP1128731A1 (en) 2001-09-05
CN1325271A (zh) 2001-12-05
ES2335723T3 (es) 2010-03-31
RU2236855C2 (ru) 2004-09-27
NZ511220A (en) 2003-12-19
JP2005343899A (ja) 2005-12-15
IL177967A0 (en) 2006-12-31
US20030143281A1 (en) 2003-07-31
WO2000027207A8 (en) 2000-09-21
US20020168415A1 (en) 2002-11-14
DE69941599D1 (de) 2009-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20040075922A (ko) 증식 억제 물질을 생성하는 급속 성장성 제한 세포의조성물 및 이들을 사용하는 방법
US20070110773A1 (en) Composition of restricted cancer cells which produce cancer cell proliferation suppressive materials, and uses thereof
US5888497A (en) Agarose coated agarose beads containing cancer cells that produce material which suppresses cancer cell proliferation
EP0914043B1 (en) Implantable agarose-collagen beads containing cells which produce a diffusible biological product, and uses thereof
JP2005104987A5 (ko)
US6303151B1 (en) Cancer-cell proliferation-suppressing material produced by cancer cells restricted by entrapment
AU2003264652B2 (en) Compositions of restricted cells capable of rapid growth which produce proliferation suppressive materials, and uses thereof
KR100477296B1 (ko) 확산성의생물학적산물생산세포를함유하는이식가능한아가로오스-콜라겐비드,및그의용도
RU2173986C2 (ru) Имплантируемые агарозно-коллагеновые шарики, содержащие клетки, которые продуцируют способный к диффузии биологический продукт, и их применение
MXPA01002927A (en) Compositions of restricted cells capable of rapid growth which produce proliferation suppressive materials, and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
J201 Request for trial against refusal decision
A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
B601 Maintenance of original decision after re-examination before a trial
J301 Trial decision

Free format text: TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20050503

Effective date: 20070227

WITB Written withdrawal of application