CN101537172A

CN101537172A - 一种含有重组人角质细胞生长因子-2滴眼液及其制备方法

Info

Publication number: CN101537172A
Application number: CN200810030154A
Authority: CN
Inventors: 李校堃; 王晓杰; 田海山; 王会岩; 马吉胜; 黄志锋; 黄亚东; 肖健; 周鑫; 朱佳男; 项琪
Original assignee: Guangdong Jida Genetic Pharmaceutical Engineering Research Center Co Ltd; JILIN AGRICULTURAL UNIVERSITY BIOREACTOR ENGINEERING Co Ltd; Wenzhou Medical College
Current assignee: Guangzhou Lixin Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2008-08-14
Filing date: 2008-08-14
Publication date: 2009-09-23
Anticipated expiration: 2028-08-14
Also published as: CN101537172B

Abstract

本发明公开了一种具有角膜上皮损伤修复作用的滴眼液，其特征在于，它由重组人角质细胞生长因子－2与一定比例的抗氧化剂、螯合剂、稳定剂、渗透压调解剂、表面活性剂和合适的缓冲体系组成；本发明还公开了上述滴眼液的制备方法。药理实验表明，本发明的滴眼液能很好的促进角膜上皮损伤的修复。

Description

一种含有重组人角质细胞生长因子-2滴眼液及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种重组人角质细胞生长因子-2滴眼液及其制备方法，特别是一种适用于治疗各种原因引起的角膜上皮损伤的重组人角质细胞生长因子-2的滴眼液及其制备方法。

背景技术

人眼角膜共分5层，最外面那层厚约50微米的非角化鳞状上皮叫做角膜上皮。角膜上皮经常暴露于恶劣的环境中，容易受到物理、化学、微生物、寄生虫、免疫等多种因素的损害，常导致角膜上皮愈合延迟或不愈，严重的可造成角膜溃疡、穿孔等严重并发症，临床治疗颇感棘手。此外，眼科手术和创伤后快速而完整的角膜上皮修复对维持正常视力也是必要的。目前，临床上可供选用的促角膜上皮损伤的有效药物并不多见，常用的药物是进口的小牛血清眼膏。国内市场上唯一基因工程药物贝复舒(重组牛bFGF滴眼剂)的问世，开创了国内治疗角膜上皮损伤药物的新纪元，主药是重组牛bFGF，但是对于人的适应性差并且对角膜新生血管有促进作用。正常角膜无血管，这是维持角膜透明的重要因素，同时也是角膜能够处于相对免疫赦免状态的一个必要条件。但是在眼部感染性疾病、化学伤以及长期配戴角膜接触镜的患者，角巩膜缘部的血管会侵入角膜并向中央生长，形成角膜新生血管。角膜新生血管的结构往往比较脆弱，渗透性强，易发生出血和继发纤维化，从而严重影响视力乃至失明。同时，角膜新生血管也破坏了角膜的免疫赦免状态，使角膜移植术后免疫排斥的发生率明显升高。

角质细胞生长因子-2(KGF-2)是成纤维细胞生长因子家族中第10个成员，是机体内自身存在的多肽生长因子，KGF-2为单拷贝基因，由3个外显子和2个内含子组成，定位于15号染色体，是一条单链多肽，含有5个半胱氨酸残基，其中4个半胱氨酸形成2对二硫键，另一个在折叠的肽中，为β2三叶草型。其编码的蛋白由208个氨基酸残基组成，N端有约40个氨基酸残基的信号肽序列，成熟蛋白为169个氨基酸(40～208氨基酸残基)，理论分子质量为19.3×103，相对分子质量约为24×103。KGF-2不同于FGFs家族其他成员的最重要一点是KGF-2由成纤维细胞及其他间质细胞分泌产生，对肝素具有很强的亲和力，特异性作用于上皮细胞表面的酪氨酸激酶受体FGFR2IIIb(KGFR)和FGFR1IIIb。KGF-2与FGFR2IIIb的亲和力很高，而与FGFR1IIIb的亲和力很低，只有在高浓度KGF-2存在时才与FGFR1IIIb结合。KGF-2特异的促上皮细胞增殖作用主要通过FGFR2IIIb介导，而FGFR2IIIb仅在上皮细胞中表达。KGF-2与受体结合后，促使受体胞内的C端酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的受体具有酪氨酸激酶活性，并与一系列的靶蛋白发生作用，引发信号级联反应，其生理作用主要承担间质细胞-上皮细胞之间的信号转导，是体内上皮细胞增殖的重要旁分泌介质，有广泛的生物学功能。目前证实，KGF-2不仅起着维持正常组织的结构和功能，而且参与组织的损伤修复，对烧伤、溃疡、切割伤的修复、再生比其他生长因子具有更显著的促进愈合、减少瘢痕的作用。FGFs家族中各成员之间功能具有一定的交叉，其中KGF-2对上皮组织具有高度特异性，对比目前上市的生长因子类滴眼液具有修复角膜上皮细胞的同时并不促进损伤引起的角膜新生血管的生长。

发明内容

本发明的目的，是公开一种具有角膜修复并不促进角膜新生血管生长的滴眼液，特别是一种适用于治疗各种原因引起的角膜上皮损伤的重组人角质细胞生长因子-2的滴眼液。

本发明的另一个目的是公开上述滴眼液的制备方法。

本发明所研制的重组人角质细胞生长因子-2滴眼液，主要由重组人角质细胞生长因子-2和基质两部分组成。其中重组人角质细胞生长因子-2是利用基因工程方法表达后纯化得到的。基质部分由一定比例的抗氧化剂、螯合剂、稳定剂、渗透压调解剂、表面活性剂组成和合适的缓冲体系组成。其中抗氧化剂的种类以及各自的浓度分别为0.1％～5％甲硫氨酸；0.1％～5％组氨酸；螯合剂为0.01～1％EDTA；稳定剂的种类以及各自的浓度分别为0.5％～10％甘露醇；1％～10％甘油；0.1％～5％L-组氨酸盐酸盐；0.1％～5％PEG-300；表面活性剂的种类以及各自的浓度为0.01％～0.5％泊洛沙姆188；0.001～0.5％吐温80；渗透压调解剂为0.1％～0.7％氯化钠；合适的缓冲体系为5mM～100mM磷酸盐缓冲液，缓冲体系的pH范围是6.0～7.5。

本发明所述的重组人角质细胞生长因子-2滴眼液的制备过程是：将抗氧化剂、螯合剂、稳定剂、表面活性剂用处方量磷酸盐缓冲液溶解，测定渗透压，用渗透压调节剂调解渗透压，加入1μg/ml～1mg/ml人角质细胞生长因子-2，除菌过滤，分装。

蛋白质类滴眼液的研制，关键是解决这类药物的稳定性问题，在一定溶液条件下，KGF-2分子中Met、Cys、His、Trp及Tyr的某些基团由于与各种活泼氧具有很高的反应性易受到氧化，从而导致蛋白质的活性下降，因此需要加入抗氧剂；本发明制备方法采用甲硫氨酸、组氨酸作为抗氧化剂，用量为0.1％～5％。KGF-2蛋白在一定溶液条件下，容易发生水不溶性聚集而沉淀，非离子型表面活性剂泊洛沙姆188、吐温80能防止蛋白质吸附于表面，而抑制其凝聚和沉淀，阻止其变性；高浓度的聚乙二醇类常作为蛋白质的低温保护剂和沉淀结晶剂。本发明研究人员经过大量试验，确定0.01％～0.5％泊洛沙姆188、0.01％～0.5％吐温80、0.5％～2％PEG300，0.1％～5％赖氨酸的盐酸盐可抑制10mM磷酸盐缓冲液KGF-2的聚集。

本发明的优点在于提高了KGF-2液体制剂的稳定性，可在常温条件下放置，使应用更为方便。

具体实施例

一、处方实施例

处方：

KGF-2 100μg

甘油 2g

甲硫氨酸 0.2g

组氨酸盐酸盐 1g

EDTA 0.2g

吐温80 0.01g

氯化钠 0.5g

50mM磷酸盐缓冲液加至100ml

制备：

称取处方量甘油、甲硫氨酸、组氨酸盐酸盐、EDTA、吐温80和氯化钠溶于50mM磷酸盐缓冲液60ml中，流通蒸汽灭菌(115℃，30分钟)。冷却后，在局部百级环境下加入处方量KGF-2，搅匀后加入50mM磷酸盐缓冲液至约90ml，调节pH至7.0，补充50mM磷酸盐缓冲液至100ml。0.22μm滤膜过滤，分装即得。

稳定性实验：

按照《中国药典》(2005年版)进行稳定性加速实验。温度25℃±2℃，相对湿度60％RH±5％。在0个月、1个月、2个月、3个月、6个月末取样进行外观、澄明度、pH值和KGF-2含量测定，结果见下表。

表1KGF-2加速稳定性考察结果

由上表可见，KGF-2滴眼剂在考察期内稳定，预计可在常温下避光存放N年。

在温度4℃±2℃，相对湿度60％±10％条件下进行长期实验24个月。在0个月、3个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月末取样进行外观、色泽、pH值和KGF-2含量测定，结果见下表。

表2KGF-2长期稳定性考察结果

由上表可见，KGF-2滴眼剂在考察期内稳定。

二、药理实施例

为了充分证明由重组人角质细胞生长因子-2为原料制备的本发明滴眼液的药理作用，本发明研究人员以重组人表皮生长因子衍生物滴眼剂为阳性对照，进行了以下药效学试验。

1.实验动物

1.1健康新西兰白兔130只，体重1.5～2.0kg，雌雄兼有。实验前用裂隙灯显微镜检查眼前段无病变。

2.药物

2.1受试药物重组人角质细胞生长因子滴眼液由吉林农大生物反应器工程有限公司提供。

2.2滴眼剂基质由吉林农大生物反应器工程有限公司提供。

2.3阳性对照药采用重组人表皮生长因子衍生物滴眼剂。

2.4其他试验用药物均为市售品。

3.角膜碱烧伤模型的制作

动物以20mg/kg戊巴比妥钠静脉麻醉，用1％丁卡因表面麻醉，开睑器开眼，暴露角膜，取直径为8mm的单层滤纸，浸入1mol/L的NaOH溶液中10秒，取出后除去多于NaOH，将其贴于角膜中央60秒，即用60ml生理盐水冲洗眼表及结膜囊。

4.分组及治疗方法

将130只新西兰大白兔，分成5组，每组26只，其中3组为受试药物角质细胞生长因子滴眼液高，中，低剂组，另外两组分别为角膜损伤模型对照组及阳性药物对照组，为排除兔的个体差异对治疗效果的影响，本实验随机抽取每只兔的左右眼为实验眼和空白对照眼。试验组眼滴角质细胞生长因子滴眼液每日3次，每次3滴。空白组滴平衡盐溶液作对照。分组情况如下：

①角质细胞生长因子大剂量组 26

②角质细胞生长因子中剂量组 26

③角质细胞生长因子小剂量组 26

④阳性药对照组 26

⑤阴性对照组 26

5观察指标

5.1活体观察

分别于烧伤前及给药后1、2、7、14d第一次滴眼前用裂隙灯显微镜观察眼前段的大体情况。

5.2上皮愈合面积及愈合率

分别于碱烧伤后的0、1、3、5、7、9、14d对兔眼行荧光染色，用裂隙灯显微镜观察角膜着色的情况。测定角膜表面荧光染色的面积。计算角膜上皮愈合面积和角膜上皮愈合率。用SAS软件对所有数据进行统计学处理，所有数据均表为X±SD，差异显著性定为P＜0.05。

角膜上皮愈合面积(mm2)＝给药前荧光素着色面积-给药后荧光素着色面积按角膜上皮愈合率＝(0d着色面积-观察时着色面积)/0d着色面积×100％公式计算角膜上皮愈合率。

5.3角膜新生血管的影响

分别于碱烧伤后的7、11、14、21d用裂隙灯显微镜观察测量、照相。以长入新生血管的垂直长度为准。新生血管的形成面积按Robert电脑教学模型公式：S＝C/12X3.14X[r2-(r-L)2]，其中C为圆周钟点数，r为角膜半径，L为新生血管的长度。

6.实验结论

1)重组人角质细胞生长因子-2滴眼液对碱烧伤兔角膜上皮愈合的影响

本研究建立的新西兰大白兔角膜碱烧伤模型中，设计的角膜烧伤面积约为50mm2。烧伤后，烧伤区内的角膜组织立即呈灰白色混浊，角膜上皮坏死脱落，周围组织虽透明，但已有轻微水肿。经荧光素染色和裂隙灯检查可见，各试验组角膜原烧伤区的着色区面积均为47mm2左右，自给药后角膜原烧伤区逐渐由外周向中央愈合，重组人角质细胞生长因子-2组和重组人表皮生长因子衍生物组至伤后第4天时均可见到原烧伤区角膜上皮完全愈合的兔眼，随后随着用药天数的增加，完全愈合的眼数亦增加，到第14天时低、中、高剂量重组人角质细胞生长因子-2滴眼剂组和阳性对照组完全愈合的兔眼分别达到53％、78％、81％和72％，而阴性对照组在整个观察期内均未见到完全愈合的眼。实验结果表明重组人角质细胞生长因子-2滴眼液可减缓碱烧伤愈合过程中的角膜上皮细胞再脱落，三种剂量的重组人角质细胞生长因子-2滴眼剂均可显著促进碱烧伤兔角膜上皮的愈合，治疗效果与阳性对照组没有明显差异。

2)病理组织形态学变化

正常兔角膜由上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层组成，上皮细胞层由5-6层细胞组成，排列规则。角膜碱烧伤后，上皮层完全脱落，前弹力层模糊，角膜基质暴露、水肿、增厚，凝固性坏死，内皮细胞面见纤维素性渗出及少数炎性细胞浸润；至伤后第14天，重组人角质细胞生长因子2滴眼液3种剂量治疗组的角膜原烧伤区已被5-6层上皮细胞覆盖，上皮细胞极向明显，细胞间连接紧密，前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层基本恢复正常；阳性对照组表现出与实验组相似的促角膜上皮修复的作用；阴性对照组兔眼原烧伤区的角膜上皮细胞亦已有明显的增殖再生，但新生上皮层表面细胞部分脱落，大部分基质纤维变性和水肿。

3)重组人角质细胞生长因子-2滴眼液对碱烧伤兔角膜上皮新生血管面积的影响

*p＜0.05，各组与一组比较。

实验数据表明，KGF-2滴眼液碱烧伤后的7、11、14、21d高、中、低剂量组与模型组比较新生血管面积没有显著差异，阳性对照组碱烧伤后的7、11、14、21d高、中、低剂量组与模型组比较新生血管面积有显著差异。实验结果说明KGF-2不促进碱烧伤后兔角膜新生血管的生长。

Claims

1.一种重组人角质细胞生长因子-2(KGF-2)滴眼液，其特征在于，它由重组人角质细胞生长因子-2，抗氧化剂、螯合剂、稳定剂、渗透压调解剂、表面活性剂和合适的缓冲体系组成。

2.权利要求1所述的滴眼液，其中重组人角质细胞生长因子-2的浓度为1μg/ml～1mg/ml。

3.权利要求1所述的滴眼液，其中抗氧化剂的种类以及各自的浓度分别为0.1％～5％甲硫氨酸、0.1％～5％组氨酸；螯合剂为0.01～1％EDTA；稳定剂的种类以及各自的浓度分别为0.5％～10％甘露醇、1％～10％甘油、0.1％～5％L-组氨酸盐酸盐、0.1％～5％PEG-300；表面活性剂的种类以及各自的浓度为0.01％～0.5％泊洛沙姆188、0.001～0.5％吐温80；渗透压调解剂为0.1％～0.7％氯化钠；合适的缓冲体系为5mM～100mM磷酸盐缓冲液，缓冲体系的pH范围是6.0～7.5。

4.一种重组人角质细胞生长因子-2(KGF-2)滴眼液的制备方法，其特征在于，将抗氧化剂、螯合剂、稳定剂、表面活性剂用处方量磷酸盐缓冲液溶解，测定渗透压，用渗透压调节剂调解渗透压，加入1μg/ml～1mg/ml人角质细胞生长因子-2，除菌过滤，分装。