CN102690344B - 色素上皮衍生因子衍生的多肽对于促进干细胞增殖与伤口愈合的用途 - Google Patents

色素上皮衍生因子衍生的多肽对于促进干细胞增殖与伤口愈合的用途 Download PDF

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Abstract

本说明书公开了色素上皮衍生因子衍生的多肽对于促进干细胞增殖与伤口愈合的用途，揭示一种合成多肽，其具有20–39个氨基酸残基，且其序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少80%的氨基酸序列相似度。此合成多肽有至少20个连续氨基酸残基，其与SEQ ID NO:1所示的第11–30个氨基酸残基具有至少90%的氨基酸序列相似度。本说明书揭示含有此合成多肽的组合物及其用途。根据本说明书所载的多种实施方式，此合成多肽可用以促进干细胞生长或伤口愈合。

Description

色素上皮衍生因子衍生的多肽对于促进干细胞增殖与伤口愈 合的用途
相关申请
本申请案要求台湾专利申请案第100109945号(申请日2011年3月23日)的国内优先权，此处将该申请案的完整内容纳入为本说明书的一部分。
技术领域
本发明是有关于干细胞的增殖，且特别是有关于轮部上皮干细胞(limbalepithelial stem cells，简称LSCs)或毛囊干细胞(hair follicle stem cells，简称HFSCs)的增殖。
背景技术
干细胞与胚胎发生(embryogenesis)以及成体动物受伤与老化过程中所涉及的组织形成、修复与维护等机制息息相关。干细胞的独特性在于具有自我更新(self-renewal)的能力以及分化(differentiation)的潜能。自我更新能力使得干细胞能够产生出其自身的复本，而分化潜能使得干细胞可分化成为多种或所有的细胞谱系(lineages)。这些特性统称为干细胞的“干细胞性”(stemness)。
哺乳类动物的干细胞可概略地分为胚胎干细胞(embryonic stem cells)与成体干细胞(adult stem cells)。胚胎干细胞是来自哺乳类动物胚胎发生早期所形成的囊胚(blastocysts)的内细胞团(inner cell mass)。这些胚胎干细胞为全能(totipotent)干细胞，意指其能够形成一完整生物体的所有组织。可在培养系统中培养胚胎干细胞，以保持其未分化的细胞系(cell lines)，或诱导其分化成多种不同的细胞谱系；因此目前在分子生物学与医药领域已大量地使用干细胞来进行研究。然而，此种应用的缺点之一在于培养于培养系统中的胚胎干细胞有自动分化的倾向，而因此会随着时间逐渐丧失其增殖能力。
已在成体动物的多种组织内发现到干细胞的存在，此种干细胞称为“成体干细胞”。和胚胎干细胞相较之下，成体干细胞的分化能力较为有限，且通常与特定细胞谱系相关。这些成体干细胞通常都与组织的修复与维护相关；譬如骨髓干细胞会在动物受伤后迁移到多种不同的组织，而位于骨髓以外的组织干细胞则可修复所处部位的相关组织。
在解剖学上，轮部位于角膜与巩膜交界处。轮部表皮基底层(basal layer)中富含一种特殊的细胞群，称为轮部上皮干细胞。角膜是分层的鳞状上皮组织，其具有快速更新的特性，以维持角膜的透明度及视觉清晰度。角膜表皮的更新是由快速增生细胞(transientamplifying cells，简称TACs)来负责，此种快速增生细胞是由轮部上皮干细胞的不对称分裂所生。在一般情形下，轮部上皮干细胞的细胞分裂较慢，但当角膜受损时会活化轮部上皮干细胞，以进行角膜损伤的修复。
临床上，将部分或完全丧失轮部上皮干细胞或其功能不全等状况称为轮部上皮干细胞不全症(LSC deficiency)，此症状往往伴随着角膜血管新生、持续性上皮缺损、角膜结疤、溃疡等情形，并进一步导致视力丧失。LSC不全症的成因很多，包括化学或热灼伤所造成的伤害以及各种疾病，譬如先天的无虹彩症(aniridia)、慢性感染(如砂眼(trachoma))、霉菌性角膜炎(mycotic keratitis)与史蒂文琼森症候群(Stevens Johnson syndrome)等。
目前在治疗LSC不全症最常用的方法是移植在活体外(ex vivo)扩增的轮部上皮组织。简单来说，此方法会先将取自患者或捐赠者的小片轮部切片放置在移植用载体(transplantable carriers，如去细胞核的人类羊膜)上，以承载由切片中迁移出来的轮部细胞，并使这些细胞在其上生长而形成似轮部的上皮薄层。此外，可采用悬浮培养系统(suspension culture system)并以酶方法自轮部组织中分离出轮部细胞与其扩增细胞，藉以降低轮部上皮干细胞的自发性分化。然而，在移植后经常会发生轮部上皮干细胞耗尽的情形，而导致移植失败。因此，需要更有效率的培养方法，以便在移植前于活体外或试管内(in vitro)有效扩增轮部上皮干细胞的数量。
成体哺乳类动物的表皮层是由毛囊(hair follicles，简称HFs)、皮脂腺(sebaceous glands，简称SGs)与毛囊间表皮(interfollicular epidermis)所组成。这三种表皮成分之间的动态平衡(homeostasis)分别是由其各自的干细胞族群来调节。毛囊干细胞位于毛囊外根鞘隆突部(bulge，或称发突)中，属于多能(multipotent)干细胞，能够分化成各种表皮谱系的细胞。一般情形中，毛囊干细胞主要负责与动态平衡相关的毛囊重建，而非表皮层的形成。然而，当皮肤受伤时，毛囊干细胞就会参与毛囊间表皮的修复。所以成功扩展毛囊干细胞可以减少皮肤的损伤，促进伤口愈合。更有甚者，在表皮大量损失的情形中(譬如因为感染、手术切除与烧烫伤等因素所致)，可能没有可用的毛囊干细胞能够参与伤口愈合。
有鉴于此，相关领域亟需提出一种干细胞的增殖方法，藉以促进伤口愈合。
发明内容
发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。
本说明书至少部分是基于发现来自色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，简称PEDF)的合成多肽能够促进轮部上皮干细胞或毛囊干细胞的增殖，且因而能够促进与这两种干细胞相关的伤口愈合过程。因此，根据本发明的PEDF衍生合成多肽可作为治疗伤口的制剂或药剂。
有鉴于上述，本发明的一方式是关于一种用以促进干细胞增殖的合成多肽。
根据本说明书多个实施例，所述的合成多肽长度为20-39个氨基酸残基，且其序列至少80％与SEQ ID NO：1相同。此外，上述氨基酸序列包含至少20个连续氨基酸残基，其序列至少90％与SEQ ID NO：1的氨基酸残基11-30相同，而使得此合成多肽可用于促进轮部上皮干细胞或毛囊干细胞的增殖。此种合成多肽的非限制性例示包括氨基酸序列如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示者。
本发明的另一方式是关于用以促进干细胞增殖的组合物。此种组合物适用以促进干细胞于活体内(in vivo)、活体外(ex vivo)或试管内(in vitro)的增殖，所述干细胞特别是轮部上皮干细胞或毛囊干细胞。
根据本发明一实施例，此组合物包含任一根据本发明上述方式/实施例的合成多肽，且此合成多肽的含量足以促进干细胞增殖。此组合物亦包含可用以携带该合成多肽的一载体。
在试管内增殖的情形中，所述的载体可以是一种适用以培养干细胞的粉末状培养基。根据本说明书多个实施例，此培养基中合成多肽的有效含量为约1-100nM，且较佳为约25-50nM。在体内增殖的情形中，所述载体可以是药学上可接受的载体，此载体可供施用于一活体哺乳类动物，包括人类。举例来说，药学上可接受载体可以是液体、胶体、乳霜、乳膏、黏着剂、羊膜、皮肤替代物、人工皮肤或其它皮肤均等物。
本发明又一方式是关于促进轮部上皮干细胞或毛囊干细胞增殖的方法。
根据本发明一实施例，所述方法包含以一有效量的根据本发明上述方式/实施例的合成多肽来处理干细胞，藉以促进干细胞之增殖。在多种实施例中，上述干细胞的增殖可于活体内(invivo)、活体外(ex vivo)或试管内(in vitro)进行。
在本发明又另一方式中，提出一种用以促进一个体/患者体内角膜或上皮伤口愈合的方法。所述的个体/患者可以是任何哺乳类动物，包括人类。
在本发明一实施例中，此方法包含对该个体投予一治疗有效量的根据本发明上述方式/实施例的合成多肽，以促进该个体体内与该角膜或上皮伤口相关的干细胞(如轮部上皮干细胞或毛囊干细胞)的增殖。在实际操作时，可透过局部施用(topicaladministration)、角膜下注射(subconjunctival injection)、皮下注射(subcutaneousinjection)或肌肉内注射(intradermal injection)的方式来投予该组合物。
根据本发明不同实施例，所述的角膜伤口是由以下任一种状况所引起的：翳状片(pterygium)手术、复发性角膜糜烂(recurrent corneal erosion)、干眼症引起的角膜轮部细胞缺陷、药物毒性引起的角膜轮部细胞缺陷、化学灼伤或烧烫伤引起的角膜缺损、疱疹病毒(herpes virus)引起的角膜缺损、隐形眼镜引起的角膜病变(contact lens-inducedkeratopathy)、史帝文琼森症候群引起的角膜病变、眼部瘢痕性类天疱疮(ocularcicatricial pemphigoid，简称OCP)、先天性无虹膜症、角膜轮部细胞肿瘤(limbaltumors)、辐射性角膜病变和角膜轮部细胞功能不全引起的角膜血管新生或由糖尿病所造成的角膜伤口愈合困难。
根据本发明另一些实施例，所述的上皮伤口是由以下任一种状况所引起的：手术切除、皮肤感染造成的溃疡、化学灼伤或烧烫伤、皮肤移植的供皮区、褥疮、缺血性皮肤坏死(ischemic necrosis)或糖尿病或老化所造成的上皮伤口愈合困难。
在参阅下文实施方式后，本领域技术人员当可轻易了解本发明的基本精神及其它发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。
附图说明
为让本发明的上述与其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：
图1A提供了免疫荧光显微照片，而图1B为一柱状图；这些图式说明了根据本发明一实验例，不同处置组别的LSC的试管内增殖情形。利用BrdU染色2小时来观察LSC增殖。其后利用免疫荧光显微镜(原始放大倍率：400倍)来侦测LSCs(ΔNp63α，绿色)与BrdU(红色)。每一处理组别中随机选取10个区域进行照相，并计算全体ΔNp63α阳性细胞中，BrdU与ΔNp63α双阳性细胞(淡粉色)的百分比。*P＜0.002，相较于对照组细胞。
图2A提供了照片，且图2B为柱状图；这些图式说明了根据本发明另一实验例，不同处理组别的小鼠角膜伤口愈合的情形。在小鼠眼睛上形成直径约2mm的角膜伤口，接着以局部荧光素(fluorescein)将小鼠眼睛染色，其后利用电荷耦合组件相机(Olympus)撷取荧光素染色的角膜照片。本实验例包含九种处理组别，其中对照组每日一次给予20μl含DMSO(低于0.05μL)的眼药膏，而其它实验组分别每日一次给予20μl含合成多肽(50μM)的眼药膏。利用Adobe Photoshop CS3 10.0来测量伤口面积。柱状图中，将小鼠角膜中残余上皮缺损(residual epithelial defect)表示成相对于原始伤口的百分比。在24小时与48小时，相对于对照组皆有显著差异。*P＜0.05，相较于对照组。
图3A提供了免疫荧光显微照片，且图3B为柱状图；这些图式说明了根据本发明又一实验例，于角膜受伤后24小时活体内轮部增殖的情形。分别利用对BrdU与ΔNp63α具专一性的抗体来进行双重免疫染色，以观察经对照组眼药膏与含合成多肽(29-mer、20-mer与18-mer)的眼药膏处理的小鼠眼睛切片。经Hoechst 33258对比染色确认ΔNp63α于细胞核中表现。*P＜0.005相较于对照组小鼠眼睛。
图4A提供了组织切片照片(图左，苏木色素与伊红(Hematoxylin and Eosin，简称H&E)染色，放大倍率：400倍)、免疫荧光显微照片(图中，放大倍率：1000倍)以及合并照片(图右)；这些照片显示根据本发明前述实验例，小鼠于角膜受伤后第5天的轮部表皮分层结构。免疫荧光分析呈现出轮部中ΔNp63α阳性细胞的分布与表现量。“正常”表示未受伤的眼睛。正常眼睛的角膜没有ΔNp63α阳性细胞，在此作为ΔNp63α的阴性免疫染色对照。图4B为柱状图，阐明在轮部的ΔNp63α阳性细胞的表现量。每一处理组中取六只小鼠，且在每一小鼠轮部取六个区域来进行免疫荧光评估。将经标记细胞除以经Hoechst 33258荧光核染色所观察到的细胞总数，以计算标记指数(labeling index)。*P＜0.005；相较于对照组小鼠眼睛。
图5A提供了免疫荧光显微照片，且图5B为柱状图；这些图式说明了根据本发明一实验例，不同处置组别的HFSC的试管内增殖情形。利用BrdU染色2小时来观察HFSC增殖。其后利用免疫荧光显微镜(原始放大倍率：1000倍)来侦测HFSCs(Lgr6，绿色)与BrdU(红色)。每一处理组别中随机选取20个区域进行照相，并计算全体Lgr6阳性细胞中，BrdU与Lgr6双阳性细胞(淡粉色)的百分比。*P＜0.001，相较于对照组细胞。
图6A提供了照片，而图6B为柱状图；这些图式说明了根据本发明另一实验例，不同处理组别的小鼠皮肤(表皮)伤口愈合的情形。于C57BL/6小鼠背部形成直径约4mm的穿孔创伤，并每日一次涂抹皮肤软膏。利用电荷耦合组件相机(Olympus)撷取伤口部位与尺标(单位10mm)的影像。残余上皮缺损(％)是表示成相对于原始伤口的百分比。所示数据为平均值±标准误差(SE)。在受伤后4天与7天，相对于对照组皆有显著差异(*P＜0.05)。
图7A至7E中的照片与数据显示根据本发明上述实验例，在受伤后第4天的伤口愈合情形。图7A为经过曼森氏三色(Masson trichrome)染色后的皮肤样本的代表照片(原始放大倍率：100倍)，如图所示，经29-mer与20-mer处理的伤口愈合情形较佳。倒三角形与箭号(↓)分别标记初始伤口边缘以及高度增生上皮组织(hyperproliferativeepithelium)的最远程。图中过度增生上皮组织(HE)为红色；肉芽组织(granulationtissue，GT)为蓝色；痂(eschar，ES)为暗红色。所示照片为每一处理组中10-16个伤口(每只小鼠两个伤口)的代表性照片。图7B为柱状图，阐明了每一处理组中小鼠的残余上皮缺损(％)；进行定量分析时仅采用位于伤口中间部位的切片。所示数据为平均值±标准误差(SE)。*P＜0.02；相较于对照组小鼠伤口。图7C为伤口边缘的代表性照片，其中肉芽组织(GT)为蓝色；痂(ES)为暗红色。在经29-mer处理的伤口中可观察到较厚的HE。图7D与7E所示的柱状图提供了利用Adobe Photoshop CS3 10.0所得之HE与GT面积的定量分析。*P＜0.02；相较于对照组小鼠伤口。
图8A与8B提出了根据本发明上述实验例，在受伤后第7天的伤口愈合情形。图8A为经过曼森氏三色染色后的皮肤样本的代表照片(原始放大倍率：100倍)，如图所示，经29-mer、Mo 29-mer与20-mer处理的伤口愈合情形较佳。倒三角形与箭号(↓)分别标记初始伤口边缘以及高度增生上皮组织(hyperproliferative epithelium)的最远程。图8B为柱状图，阐明了每一处理组中小鼠的残余上皮缺陷(％)；进行定量分析时仅采用位于伤口中间部位的切片。所示数据为平均值±标准误差(SE)。*P＜0.05；相较于对照组小鼠伤口。
图9A与9B为根据本发明上述实施例，在受伤后第4天之细胞复制情形的组织学分析。图9A呈现了以BrdU进行免疫组织学染色的样本照片，藉以观察DNA复制(深咖啡色)，并以苏木色素进行对比染色以观察细胞核。代表性的照片中显示细胞复制主要发生在HE组织的基底层，如图中箭号(↓)所示。(原始放大倍率：200倍)。图9B为柱状图，阐明HE组织的基底层的BrdU阳性细胞数目。将经标记细胞除以位于HE组织的基底层的细胞总数，以计算标记指数。*P＜0.05；相较于对照组小鼠伤口。
图10A与10B为根据本发明上述实施例，在受伤后第4天之HFSCs分布的组织学分析。图10A呈现了以Lgr6进行免疫组织学染色的样本照片，藉以观察位于HE组织的衍生自HFSC的细胞，并以苏木色素进行对比染色以观察细胞核。(原始放大倍率：400倍)。图10B所示的照片显示了经含20-mer的药膏处理的伤口以BrdU-与Lgr6-专一性抗体染色的结果。经Hoechst33258对比染色确认Lgr6于细胞核中表现。
具体实施方式
为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本领域技术人员所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数界是约略的数值，已尽可能精确地呈现具体实施例的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本领域技术人员的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其它相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随权利要求书所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。
在此处“多肽”(peptide)一词是指氨基酸残基所组成的高分子。“合成多肽”(synthetic peptide)一词则代表此多肽并未包含存在于自然界的完整蛋白质分子。此种肽之所以是“合成的”，表示其乃是由人类利用技术手段所得，譬如化学合成、重组遗传技术或将整个抗原切段。于本说明书中，任何氨基酸残基于一多肽中的位置是由该多肽的N端起算。
“干细胞”(stem cell)一词在此是指此细胞在某些条件下保有能够增殖而不实质分化的能力，且亦能够在某些条件下分化成更专一或分化程度较高的细胞。如上文所述，本说明书特别是有关于两种成体组织干细胞，即轮部上皮干细胞与毛囊干细胞。组织干细胞位于各自的利基(niches)部位中，此利基部位的位置随着组织种类而不同。举例来说，轮部上皮干细胞主要分布于周边角膜的轮部表皮基底层内；而毛囊干细胞多位在毛囊发突(follicle bulge)中。
在此处“增殖”的各种词性(如proliferate或proliferation)是指族群中的细胞数目透过细胞分裂而增加的情形。
“促进”及其各种时态(如promote或promoting)在此是指一种正面的改变；特别是指在统计上具有显著意义的正面改变。在一实施例中，正面的改变是指相较于一参考标准，增加了至少10％。
此处针对合成多肽序列所述的“氨基酸序列相似度百分比”(Percent ％ aminoacid sequence identity)是指该候选合成多肽的氨基酸残基与一参考多肽的氨基酸残基完全相同的百分比。于进行上述比对时，可将该候选合成多肽与该参考多肽并排，并于必要时引入间隙，以使二序列形成最高的序列相似度，且在计算相似度时，并未将保守性置换的氨基酸残基纳入考虑。相关领域已有多种方法可供进行上述并排，譬如可公开取得的软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本领域技术人员在进行并排时，可选择适当的参数与计算方式，以得到最佳的排列方式。在本说明书中，二氨基酸序列间的序列比较是采用美国国家生物科技信息中心(Nation Center for Biotechnology Information，简称NCBI)所提供的蛋白质-蛋白质BLAST分析软件Blastp来进行。一候选氨基酸序列A相较于一参考氨基酸序列B的氨基酸序列相似度(在本说明书中亦称之为序列A与序列B具有特定百分比(％)的氨基酸序列相似度)的计算方式如下：
其中X是利用Blastp软件对序列A、B进行排列后所得到的相同氨基酸残基数目(identical matches)，而Y是A、B二序列中较短者的氨基酸残基总数。
在此处“药学上可接受载体”(pharmaceutically acceptable carrier)是指一种药学上可接受的材料、组合物或媒剂(vehicle)，诸如液体或固体填充物(liquid or solidfiller)、稀释剂(diluent)、赋型剂(excipient)、溶剂(solvent)或包覆材料(encapsulatingmaterial)，其可用以携带或运送标的成分由身体的一器官或部分到达身体的另一器官或部份。“可接受”的载体是指其可含组合物中的其它成分兼容。载体可为固态、半固态、液态、乳霜或胶囊等形式。
于本说明书中，“治疗”一词的各种词性与时态(如treat、treating或treatment)是指预防性(如，预防用药)、疗愈性或缓和性的处置。“治疗”一词可用以指称将此处提出的组合物投予或施用于一个体，此个体可能有一医疗疾患、症状、疾病或与疾患相关的异常或易于罹患一疾患，以期能部分地或完全地缓和、改善、减轻一特定异常和/或病症的一或多种症状或特征，或延缓其发生、阻碍其进展、减轻其严重性和/或减低发生率。亦可对并未表出现疾病、异常和/或病症之征兆的个体和/或呈现早期征兆的个体进行治疗，以期降低发展出与该疾病、异常和/或病症相关的病理变化的风险。在本说明书中，当一或更多种症状或临床指标减少时，通常认为该治疗是“有效”的。或者是，有效的治疗意味着一疾病的进展减少或暂停。亦即，“治疗”不仅包含改善症状或降低疾病指标，还涵盖了使得原本在不进行治疗的情形下，极有可能发生的疾病进展或症状恶化等情形停止或减缓。有益的或的临床结果包括，但不限于：一或多种症状的缓解、疾病程度的缩减、疾病状态的稳定(如，并未恶化)、疾病进程的延迟或延缓、疾病状态的部分或完全改善或缓和，以上所述包含可侦测或不可侦测的症状、程度、状态或进程。
在此处，“有效量”一词是指一成分的用量足以招致所欲的反应或效果。“治疗有效量”一词则是指药学组合物中的治疗药剂的含量足以产生上文定义的所欲“有效治疗”。具体的治疗有效量取决于多种因素，诸如欲治疗的特定状况、个体的生理条件(如，个体体重、年龄或性别)、接受治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗持续时间、目前疗法(如果有的话)的本质以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。治疗有效量亦指于此用量下，该化合物或组合物的毒性或负面效果不及于其所带来的正面疗效。
“患者”或“个体”等词在此是指可接受本发明的组合物或方法来进行治疗的哺乳类动物，包括人类。除非另有指明，“个体”一般包含雄性与雌性。
色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor，简称PEDF)是一种多功能的分泌性蛋白质，其具有抗血管新生(anti-angiogenic)、抗肿瘤生成(anti-tumorigenic)与神经滋养(neurotrophic)等功能。人类PEDF蛋白质是一种大小约50kDa的分泌性蛋白质，具有418个氨基酸。已知PEDF的34-mer片段(相当于PEDF的第44-77号残基)与44-mer片段(相当于PEDF的第78-121号残基)分别具有抗血管新生与神经滋养性质。
Gomez等人提出的美国专利申请案(公开号：2010/0047212)指出全长人类PEDF分子可用以促进神经干细胞的对称性自我更新(symmetrical self-renewal)。此申请案亦揭示C端PEDF(第195-400号残基)无法促进神经干细胞的自我更新。这些结果暗示在N端前194个氨基酸残基中，可能含有与神经干细胞自我更新相关的必要区域；然而，该申请案中未提出或试验任何具体的N端片段。Gomez等人进一步教示上述C端PEDF能够竞争性地亦指全长PEDF对神经干细胞的自我更新效果，由此一结果可以推知，C端PEDF在全长天然PEDF的自我更新活性中，亦有一定的重要性。尽管如此，Gomez等人并未明白或隐喻地教示或建议任何特定的PEDF片段能够促进神经干细胞的对称性自我更新。此外，除了神经干细胞之外，现有技术并未揭示或试验PEDF(全长或其片段)对其他种类或来源的干细胞的自我更新的效果。有鉴于各种组织干细胞所处的利基环境各不相同，且对称与非对称干细胞增殖的诱导与调控机制非常复杂，Gomez等人并未提供任何方向或指引，来指出其它在全长PEDF分子作用下能有较佳效果的干细胞种类。
本说明书至少部分是基于发现来自PEDF的合成多肽能够促进轮部上皮干细胞或毛囊干细胞的增殖。本发明的一创新特征在于此处所提出的合成多肽最长只有39个氨基酸残基，比起现有技术所述的全长PEDF短了许多；因此，本发明克服了传统蛋白质在临床使用上经常面临的困境，诸如制造成本高昂、生体可用率(bioavailability)低落与药物动力学(pharmacokinetics)表现不佳等。此外，本说明书提出的实验例显示此种合成多肽能够经皮膜(transdermal)传送，因而可避免采用先前传送蛋白质药物通常必须使用的侵入性给药途径(如注射)。再者，本说明书所载的结果证实这些合成多肽能够有效地在活体内与试管内促进轮部上皮干细胞与毛囊干细胞增殖。因此，这些合成多肽可用以治疗角膜与上皮伤口。且因而能够促进与这两种干细胞相关的伤口愈合过程。因此，根据本发明的PEDF衍生合成多肽可作为治疗伤口的制剂或药剂。
根据本发明一方式，提出一种用以促进干细胞增殖的合成多肽。
根据本说明书多个实施例，此合成多肽有20-39个氨基酸残基，且其氨基酸序列与SEQ ID NO：1(LSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)有至少80％的氨基酸序列相似度。举例来说，此合成多肽与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相似度可为约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。另外，此合成多肽包含至少20个连续的氨基酸残基，其与SEQ ID NO：1第11-30个残基有至少90％的氨基酸序列相似度。具体来说，这20个连续氨基酸残基与SEQ ID NO：1第11-30个残基的氨基酸序列相似度可为约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。
在本发明一实施例中，所述的合成多肽有39个氨基酸残基，其序列即如SEQ IDNO：1所示。在下文实验例中，亦将此合成多肽称为39-mer。此种39-mer多肽是来自人类PEDF的已知44-mer片段(PEDF第78-121号残基)的一种较短的变形。
下文提出的实验例证实还有其它数种来自此39-mer的短、合成PEDF序列能够有效促进轮部上皮干细胞或毛囊干细胞的增殖。
举例来说，下文一实验例证明了如SEQ ID NO：2(ALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)所示的34-mer合成多肽能够有效促进HFSC与LSC增殖。根据上文所述的氨基酸序列相似度的计算方法，此34-mer与39-mer的氨基酸序列相似度为100％，且34-mer的第6-25号氨基酸残基与39-mer的第11-30号氨基酸残基的氨基酸序列相似度也是100％。
此外，下文多个实验例证明如SEQ ID NO：3(SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)所示的29-mer合成多肽能够有效促进LSC与HFSC增殖，还能促进角膜与上皮伤口愈合。此29-mer与39-mer的氨基酸序列相似度为100％，且29-mer的第1-20号氨基酸残基与39-mer的第11-30号氨基酸残基的氨基酸序列相似度亦为100％。
某些实验例证实，如SEQ ID NO：5(SLGAEQRTESIIHRALYYDL)所示的20-mer亦可有效促进LSC与LFSC增殖。此20-mer的序列与39-mer的第11-30号氨基酸残基完全相同(氨基酸序列相似度：100％)且其相较于39-mer的氨基酸序列相似度同样也是100％。
另外有两种衍生自小鼠PEDF的短、合成多肽同样也能够有效地促进LSC与LFSC增殖以及角膜与上皮伤口愈合。第一种衍生自小鼠的合成多肽在本说明书中亦称为Mo 29-mer，其序列如SEQ ID NO：7(SLGAEHRTESVIHRALYYDLITNPDIHST)所示，其序列与39-mer的氨基酸序列相似度为83％，且其前20个氨基酸残基与39-mer第11-30个残基的氨基酸序列相似度为90％。另一种衍生自小鼠PEDF的合成多肽是Mo 20-mer，其序列如SEQ ID NO：8(SLGAEHRTESVIHRALYYDL)所示。Mo 20-mer与39-mer或39-mer的第11-30号氨基酸残基的氨基酸序列相似度皆为90％。
可利用任何习用的技术来合成此处所述的合成多肽，譬如t-BOC或FMOC来保护α-氨基(alpha-amino groups)。这两种方法都采用了逐步合成法，其系由该胜肽的C端开始，每次加上一个氨基酸。亦可利用其它已知的固态胜肽合成(solid phase peptidesynthesis，简称SPPS)法来合成此处所述的合成多肽。
本发明的范围亦涵盖了其它相较于39-mer具有保守性置换的合成多肽。在此处，“保守性置换”一词是指利用另一种在生物学上相似的残基来取代某一残基。保守性置换的例示包括亲水性残基(如亮氨酸异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸与甲硫氨酸)彼此间的置换，或相近极性残基(如精氨酸与赖氨酸；或谷氨酸与天冬氨酸)彼此间的置换，以及其它类似的置换模式。“保守性置换”在此亦指利用一具有取代基的氨基酸来取代一不具有取代基的原始氨基酸，只要可和此具有取代基的氨基酸反应的抗体亦可和原始氨基酸进行免疫反应即可。
亦可将上述实施方式所述的各种合成多肽调制成用以促进干细胞增殖的组合物，此组合物即属于本发明另一方式之范围。在本发明多种实施方式中，此组合物可用以促进活体内(in vivo)、活体外(ex vivo)或试管内(in vitro)的干细胞增殖，特别是LSC与HFSC。
根据本发明一实施例，上述组合物包含根据本发明上述方式/实施方式所述的任一种合成多肽，且此合成多肽的含量足以促进干细胞增殖。此组合物亦包适用于该合成多肽的载体。
当用于试管内增殖时，所述的载体可以是粉末状的培养基，此培养基于复水(reconstitution)后，可用以培养干细胞。所述的复水一般是先将粉末状的培养基溶解于无热源(pyrogen-free)的水、等渗等渗食盐水或磷酸盐缓冲液中；且之后将复水培养基的酸碱值调整到适当的范围，如pH值6.8至7.4之间。根据本说明书多个实施例，此合成多肽于该培养基中的量约为1-100nM，且较佳为约25-50nM。在下文提出的实验例中，此合成多肽于用以培养LSC与HFSC的培养基中的浓度分别是25nM与50nM。
欲进行活体内增殖时，所述的载体可以是药学上可接受的载体，其可施用于一活体哺乳类动物，包括人类。举例来说，药学上可接受载体可以是液体、胶体、乳霜、乳膏、黏着剂、羊膜、皮肤替代物、人工皮肤或皮肤均等物。
可作为药学上可接受载体的例示性物质包括动物胶(gelatin)、赋型剂、无热源水、等渗等渗食盐水与磷酸盐缓冲液。在本发明一实施例中，药学上可接受载体包括一眼科上可接受的药学赋型剂。
在选择适用于投递合成多肽的药学上可接受载体时，主要需考虑该组合物的给药途径。本发明的组合物可发挥区域性效用(如，局部、结膜下或肌肉内给药)或全身性效用(如，皮下给药)。
在本说明书中，“局部给药”(topical administration)是指施用于人类或动物体表任何可接触的部位，譬如皮肤或眼睛外表面。适用于局部给药的药学上可接受载体包括可用于液体(包括溶液与乳液)、乳霜、胶体及其类似物中者。较佳地，此组合物为无菌的，且可制成一剂型，以供用于局部眼部施用。可将所述组合物包装成适合量度给药的包装，譬如备有滴管的容器内。
在本发明一实施例中，所述组合物为一溶液，其可利用生理实验水为载体。在另一实施例中，该组合物为乳膏，其中含有约50μM的合成多肽。在较佳的情形中，可利用适当的缓冲系统，将所述溶液或乳膏的pH值调整于约4.5至8.0之间；一般来说，中性pH值更佳。或者是，可将合成多肽添加于能够直接施覆伤口部位的材料中，譬如羊膜、皮肤替代物、人工皮肤或其它皮肤均等物。
在结膜下、肌肉内或皮下注射的情形中，可将合成多肽和如无菌水溶液之类的药学上可接受载体一起调制，在较佳的情形中，所用的水溶液和受体的血液应为等渗。在配置此类配方时，可将固态的活性成分溶解或悬浮于含有生理可兼容物质的水中，所述的生理可兼容物质如氯化钠、甘氨酸及与其相似者，且其pH值经缓冲可与生理条件兼容，以得到一水溶液，而后再进行灭菌。
本发明的组合物亦可包含各种本领域习知的添加物。举例来说，可使用溶剂(包括少量乙醇)来稳定某些药物。其它可任选的药学上可接受添加物包括：乳白剂、抗氧化剂、香料、色素、胶化剂、增稠剂、稳定剂、表面活性剂及与其相似者。亦可添加其它物质以防止组合物因储存而变质，譬如可添加抗菌剂来抑制微生物(如酵母菌与霉菌)的生长。本发明的组合物中亦可包括渗透促进剂和/或降低刺激性的添加物。
在另一方式中，本发明提出了一种用以促进干细胞增殖的方法。
根据本发明一实施例，上述方法包含以有效量的如本发明上述方式/实施例所述的合成多肽来处理干细胞，藉以促进干细胞增殖。在多种实施例中，此方法可于活体内、活体外或试管内促进干细胞增殖。
在又一方式中，本发明提出了一种用以促进一个体/患者的角膜或上皮伤口愈合的方法。所述个体/患者可以是任何哺乳类动物，包括人类。
在本发明一实施例中，此方法包含对该个体投予一治疗有效量的根据本发明上述方式/实施例所述的组合物，以促进与该角膜或上皮伤口相关的干细胞增殖。在实际应用时，此组合物可经由局部给药、结膜下注射、皮下注射或肌肉内注射等方式给药。
根据本发明某些实施例，所述的角膜伤口可能是由以下任一种状况所引起的：翳状片手术、复发性角膜糜烂、干眼症引起之角膜轮部细胞缺陷、药物毒性引起的角膜轮部细胞缺陷、化学灼伤或烧烫伤引起的角膜缺损、疱疹病毒引起的角膜缺损、隐形眼镜引起的角膜病变、史帝文琼森症候群引起的角膜病变、眼部瘢痕性类天疱疮、先天性无虹膜症、角膜轮部细胞肿瘤、辐射性角膜病变和角膜轮部细胞功能不全引起的角膜血管新生或由糖尿病所造成的角膜伤口愈合困难。
根据本发明另一些实施例，所述的上皮伤口是由以下任一种状况所引起的：手术切除、皮肤感染造成之溃疡、化学灼伤或烧烫伤、皮肤移植的供皮区、褥疮、缺血性皮肤坏死或糖尿病或老化所造成的上皮伤口愈合困难。
下文提出多个实验例来说明本发明的某些方式，以利本领域技术人员实践本发明。不应将这些实施例视为对本发明范围的限制。据信本领域技术人员在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献，其全文皆视为本说明书的一部分。
实验例
材料与方法
材料
经HEPES缓冲的DMEM培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)、Ham’s/F12培养基、胰蛋白-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、综合抗生素(antibiotic-antimycotic)溶液与抗-BrdU抗体皆购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。皮质醇(hydrocortisone)、二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、胰岛素-运铁蛋白-亚硒酸钠(insulin-transferrin-sodium selenite，ITSE)培养基补充物、丝裂霉素C(mitomycin C，MMC)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、5-溴-2’-脱氧尿苷(5-bromo-2’-deoxyuridine，BrdU)、表面活性剂Triton X-100、Hoechst 33258染料、甲醛(formalin)与曼森氏三色染剂(Masson’s Trichrome)皆购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。蛋白酶Dispase II与上皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)皆购自Roche(Indianapolis，IN)。ΔNp63α多株抗体与各种荧光染料-共轭二级抗体皆购自BioLegend(San Diego，CA)。角蛋白-3(keratin-3；AE5株；CBL218)是购自Millipore Corporation(Bedford，MA)。Lgr6抗体(sc-48236)是购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。
根据Petersen等人所述的方法，利用第一型胶原蛋白-琼脂糖树脂(collagen I-sepharose resin)由人类血浆中纯化出天然人类PEDF(SEQ ID NO：9；参见Pigment-epithelium-derived factor(PEDF)occurs at a physiologically relevantconcentration in human blood：purification and characterization.Biochem J2003；374(Pt1)：199-206)。接着利用抗-PEDF抗体，以SDS/PAGE与西方墨点法进行分析。短合成多肽(39-mer、34-mer、29-mer、25-mer、20-mer、18-mer、Mo 29-mer与Mo 20-mer)系购自GenScript(Piscataway，NJ)，于合成后，将其N端酰化(acetylated)并将C端酰胺化(amidated)以提升稳定性，并以质谱仪定性(纯度＞95％)。除了上文所述的SEQ ID NO：1-3、5与7-8之外，以下实验例中尚使用了SEQ ID NO：4(EQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT，亦称为25-mer)以及SEQ ID NO：6(EQRTESIIHRALYYDLIS，亦称为18-mer)的合成多肽。
轮部上皮干细胞的分离与培养
根据Cheng等人与Wang等人提出的方法并略加修改后，由六个月大的新西兰白兔中分离出LSC，并利用细胞悬浮培养系统进行培养(参见：The growth-promoting effectof KGF on limbal epithelial cells is mediated by upregulation ofDeltaNp63alpha through the p38 pathway.J Cell Sci 2009；122(Pt 24)：4473-4480；以及Importin 13 serves as a potential marker for corneal epithelialprogenitor cells.Stem Cells 2009；27：2516-2526)。在含有100U/ml盘尼西林(penicillin)与50μg/ml建它霉素(gentamicin)的PBS溶液中清洗兔子轮部组织。于仔细移除虹膜以及多余的巩膜之后，在4℃下使轮部环(limbal rings)与蛋白酶dispase II(1.2IU/ml，溶于不含镁离子与钙离子的汉克氏平衡盐溶液(Hanks’balanced saltsolution)中)接触16小时。利用细胞刮刀移除脱落的上皮层，进行酶分解(0.05％胰蛋白与0.01％EDTA)以将其分离成单一细胞，反应条件：37℃，15分钟，轻度摇晃。之后将细胞转移至停止培养基(9毫升经HEPES缓冲之DMEM，含10％FBS)中。透过离心收集细胞(400xg，5分钟)。
在六孔盘的每一孔中植入约1×105个细胞，并培育于DMEM/Ham’s F-12基本培养基(10mM HEPES、5ng/ml人类EGF、1％SITE液体培养基、综合抗生素溶液、0.5％DMSO与0.5μg/ml皮质醇)中，培养基中添加了10％FBS，于培育两天后转移到一基本培养基或含有4.5nMPEDF、25nM 39-mer、25nM34-mer、25nM 29-mer、25nM 25-mer、25nM 20-mer、25nM18-mer、25nM Mo 29-mer或25-nM Mo 20-mer的基本培养基中。在37℃与5％二氧化碳的条件下，将细胞持续培养3天，直到细胞生长至满(confluence)为止，此即继代0(passage0)。将LSC和位于trans-well共培养盘(0.4μm pore；购自BD Biosciences(Bedford，MA))的经MMC处理的NIH-3T3纤维母细胞滋养细胞(feeder cells)共同培养。欲进行继代时，再次利用酶处理(0.25％胰蛋白)来收集几近长满的细胞，且之后将密度1×105的传代培养细胞培养于个别的培养基中，于持续进行传代培养时，每隔四天观察细胞的增殖能力。
制备滋养细胞
在37℃、5％二氧化碳的环境下，将生长至满的NIH-3T3细胞和4μg/ml的MMC培育2小时，并于胰蛋白处理(trypsinized)后以每平方公分2.2×104个细胞的密度植于trans-well培养盘(BD Biosciences)上。滋养细胞于植盘后可使用约4至24小时。
免疫荧光分析
脱腊(deparaffinized)的组织切片或经4％三聚甲醛(paraformaldehyde)固定的LSC以溶于PBST(PBS含有0.1％Tween-20)中的10％山羊血清及5％BSA处理约1小时以进行阻断。在37℃下利用抗ΔNp63α(稀释比例1∶150)、BrdU(稀释比例1∶250)、角蛋白-3(稀释比例1∶250)、ABCG2(稀释比例1∶150)与Bmi-1(稀释比例1∶150)的初级抗体染色约2小时，之后和适当的玫红(rhodamine)-或FITC-结合抗体(稀释比例1∶500)在室温下一起反应约1小时。利用Hoechst33258对细胞核进行对比染色(约7分钟)。利用带有CCD相机的蔡司(Zeiss)荧光显微镜来撷取影像，并利用Axiovert软件照相。
BrdU标记
将2×105个轮部细胞(继代第1代)植于经FNC COATING溶液(购自AthenaEnzyme Systems(Baltimore，MD))涂覆的玻片上，并以培养基培育1天。将BrdU(最终，10μM)加入培养系统中约2小时。在以4％三聚甲醛固定后，将细胞置于冷的甲醇中约2分钟，而后在室温下以1N氯化氢处理约1小时，而后再进行免疫荧光分析。进行动物实验时，以DMSO将BrdU(80mM)复水备用。将10μl的BrdU和90μl的PBS混合后，在小鼠安乐死前3小时将其经腹膜内注射至小鼠体内。
角膜伤口与治疗
本实验采用八周大的雌性C57BL/6小鼠，实验过程经马偕纪念医院审查委员会同意并遵循国家动物实验相关规定。动物经腹腔内注射舒泰(zoletil，用量为每公斤体重6毫克)与若朋(xylazine，用量为每公斤体重3毫克)混合液，以进行麻醉。将一滤纸(直径0.9mm)浸泡于20％乙醇中后，放置于小鼠右眼角膜中间部位约1分钟，之后以PBS清洗小鼠眼部。其后透过解剖显微镜利用穿孔器在小鼠眼睛的整个角膜区域上形成一个圆形伤口(机械性括除直径约2mm的角膜)，在不触及角膜基质、轮部或结膜的情况下形成一机械性的角膜伤口。
以DMSO分别将每一合成多肽(39-mer、34-mer、29-mer、25-mer、20-mer、18-mer、Mo29-mer或Mo 20-mer)复水备用(5mM)；而后将合成多肽混合于眼药膏(Alcon；含0.3％泰百霉素(Tobramycin)与0.5％氯丁醇(Chlorobutanol))中，添加浓度约50μM。在每一实验组中(样本数为6-10)，于受伤后，每日一次在小鼠右眼上涂抹20μl含合成多肽的眼药膏。对于对照组小鼠(样本数为20)，在小鼠右眼涂抹20μl含有媒剂DMSO的眼药膏。以局部荧光素(Fluor-I-Strip，购自Ayerst Laboratories(Philadelphia，PA))来染色小鼠角膜以观察伤口愈合情形，并以数字相机拍摄照片。利用计算机协助的影像分析器(AdobePhotoshop CS3 10.0)由相片计算缺陷面积，并据以计算在每一时间点相较于初始伤口面积的残余上皮缺损百分比。
毛囊干细胞的培养
人类毛囊组织取自健康捐赠者的毛发。在显微镜下以镊子分解毛囊，并移除大部分的脂肪与结缔组织。将位于皮脂腺下方的毛囊发突区域(包括中央狭长区域(centralisthmus))剪下，并将发突碎片移到含有1毫升胶原蛋白酶(1mg/ml；购自Roche)的35-mm培养盘中并于约37℃下培育约1.5小时，以分解胶原蛋白鞘(collagen capsule)。其后，将发突碎片移到含有蛋白酶dispase II(2.4U/ml)/0.05％胰蛋白的新鲜细胞培养盘中，并于约37℃下培育约1.5小时，以得到一单一细胞悬浮液。
在上述的机械解剖与酶分解后，在12孔培养盘的每一孔中，植入分离自五个发突碎片的悬浮发突细胞，并以基本培养基培养5天，以利细胞吸附。上述基本培养基包含4重量份的Gibco无钙DMEM培养基与1重量份的Ham’s F12培养基(钙离子浓度达约0.25mM)，并添加了10％FBS、10ng/ml人类上皮生长因子、500mg/l的L-谷氨酰胺(L-glutamine)、0.2％牛脑下垂体萃出物(bovine pituitary extract)、0.18g/ml皮质醇、1％ITSE以及综合抗生素溶液。所用的培养方法与Blazejewska等人所述相似(请参见Stem Cells 2009；27：642)。于培育5天候，将细胞培育于不含血清的基本培养基中或分别含PEDF(4.5nM)、29-mer(50nM)或20-mer(50nM)的基本培养基中，直到细胞生长至满(约2周；继代0)。期间每隔2至3天更换培养基。将发突细胞与3T3纤维母细胞滋养细胞共同培养。欲进行传代培养时，利用酶处理(0.25％胰蛋白；37℃、5分钟)来收获生长至满的细胞。将约1×105个人类发突细胞转移到新的培养盘中，并让细胞生长约14天以使细胞生长至满(传代1)。
皮肤伤口愈合
进行皮肤全层切除(full-thickness skin excision)试验时采用8至10周大的C57BL/6小鼠，先以腹腔内注射舒泰(用量为每公斤体重6毫克)与若朋(用量为每公斤体重3毫克)混合液，以进行麻醉。利用Sklar Tru-Punch抛弃式组织穿孔器(购自Sklar(WestChester，PA))在每一小鼠背侧中线的两侧各形成直径约4mm的全层皮肤切除伤口。在每一处理组别(样本数为6)中，于皮肤伤口形成后，每日涂抹一次25μl的皮肤乳膏(含有50μM合成多肽与0.006μl的DMSO媒剂)。在对照组小鼠(样本数为6)中，于皮肤伤口形成后，每日涂抹一次25μl的皮肤乳膏(含有0.006μl的DMSO媒剂)。上述乳膏每克含有5mg的硫酸新霉素(neomycin sulfate)与12.5mg的枯草菌素锌盐(Bacitracin Zinc)。在不覆盖伤口的情况下，分别于受伤后4天与7天进行取样。在伤口愈合期间中，每只小鼠饲育于独立的饲养笼中。
利用计算机协助的影像分析器(Adobe Photoshop CS310.0)由相片计算伤口面积，并据以计算在每一时间点相较于初始伤口面积的残余上皮缺损百分比。
进行组织学分析时，将完整伤口(包含直径2mm的上皮伤口边缘)分离后以含4％PFA的PBS溶液固定一夜，并以石蜡包埋。根据制造商所述方法，利用曼森氏三色染剂将伤口中间部位的切片(5μm)染色，以将上皮组织染成红色，并将结缔组织染成蓝色。利用莱卡(Leica)DC 500相机(Leica Microsystems)拍照。
统计分析
实验结果表示成平均值±平均值标准误差(standard error of mean，简称SEM)。利用单向ANOVA分析进行统计比较。除非另有说明，否则P＜0.05时具有统计学上的显著意义。
实验例I
衍生自PEDF的短合成多肽可促进试管内LSC增殖
为了确认与活化LSC增殖相关的功能区域，首先分析了PEDF蛋白质片段(来自人类PEDF分子第78-200号氨基酸残基的123个氨基酸残基；GenBank编号U29953)的表面可能性(surface probability)与亲水性，并发现最多样化的区域位在第83-121号氨基酸残基(以下称为39-mer)内。分别合成了一系列涵盖来自第83-121号氨基酸残基的短胜肽及其变异体，并分别探究其于促进培养中LSC增殖活性的效果。
利用BrdU脉冲标记染色体DNA的合成(2小时；红色)来观察衍生自PEDF的短胜肽对LSC自我更新能力的影响，并利用ΔNp63α(绿色)进行免疫染色来观察LSC表现型。
如图1A所示，培养于含有全长PEDF、39-mer、34-mer、29-mer或20-mer的培养基中之LSC的增殖情形明显优于对照组培养基(图1B；22.0±1.5％、30.1±1.9％、30.0±3.4％、33.9±2.6％与31.8±1.7％；相对于3.0±0.5％)。相较之下，在含有25-mer或18-mer合成多肽的培养基中，则未观察到LSC扩增有明显的提升。
衍生自小鼠PEDF的胜肽，如Mo 29-mer与Mo 20-mer，和人类29-mer与20-mer分别只有4个与2个氨基酸残基的差异；这些衍生自小鼠PEDF的短胜肽促进LSC有丝分裂活性的效果与其同源的人类短胜肽相近(图1B；27.1±1.8％与26.3±2.2％)。总结来看，在添加全长PEDF、39-mer、34-mer、29-mer、20-mer、Mo 29-mer或Mo 20-mer的培养基中，LSC扩增皆有明显的提升。
实验例II
衍生自PEDF的短合成多肽可促进活体内角膜伤口愈合
为了探究衍生自PEDF的短胜肽对小鼠角膜伤口愈合的效果，利用圆形穿孔器(直径约2mm)在小鼠角膜形成伤口，之后将对照组眼药膏或含根据本发明的PEDF短合成多肽的眼药膏涂抹至受伤的眼部，接着利用荧光素染色来评估伤口愈合情形。在接受PEDF短合成多肽治疗的小鼠与对照小鼠之间，其初始伤口的大小没有显著差异。经48小时后，可在接受39-mer、34-mer、29-mer、20-mer、Mo 29-mer或Mo 20-mer治疗的小鼠中观察到完整的角膜上皮再形成(re-epithelialization)；而对照组或接受25-mer与18-mer治疗的小鼠伤口愈合则不完整(图2A)。相较于对照组小鼠，接受39-mer、34-mer、29-mer、20-mer、Mo 29-mer或Mo 20-mer治疗的小鼠的残余上皮缺损百分比明显较小。具体来说，在24小时后，上述各处理各组的残余上皮缺损百分比分别是37.2±4.3％、40.6±7.2％、36.5±6.4％、42.2±4.3％、33.8±5.2％与43.9±7.6％，而对照组则为84.9±5.1％；且在48小时后，各处理组的残余上皮缺损百分比分别为4.8±2.7％、4.6±2.1％、3.7±2.9％、5.0±3.7％、4.6±2.3％与6.2±3.5％，而对照组是39.5±3.1％(第2B图)。
实验例III
衍生自PEDF的短合成多肽于角膜受伤后可促进活体内LSC增殖
为了探究本发明提出的合成多肽是否能在角膜愈合过程中促进LSC增殖，于角膜受伤后24小时，将BrdU透过腹腔内注射至小鼠体内，而后进行安乐死。对眼部切片进行ΔNp63α(绿色)与BrdU(红色)双重免疫染色后可观察到，接受29-mer与20-mer治疗的小鼠眼睛轮部具有较多的BrdU-与ΔNp63α-双重阳性细胞，相较于对照组小鼠眼睛(图3A与3B；43.2±4.6％与42.4±4.3％相对于15.0±7.6％)；而接受18-mer治疗的小鼠眼部中，LSC增殖的情形则与对照组小鼠相近。
在受伤后第5天，透过眼部切片的ΔNp63α(绿色)免疫染色与HE染色可以观察到接受29-mer、20-mer、Mo 20-mer治疗的小鼠眼部皆已回复各分层原本的厚度(相较于正常、未受伤的眼部)；而接受18-mer与对照处理的眼睛之轮部上皮则较薄，且具有较少的ΔNp63α-阳性LSC(图4A)。平均来看，在正常、未受伤眼睛轮部中的ΔNp63α-阳性LSC百分比约为74.8±6.3％；而受伤的角膜经过对照组药膏或29-mer、20-mer、18-mer或Mo 20-mer药膏处理后的ΔNp63α-阳性LSC百分比分别是38.9±2.8％、77.0±4.1％、73.1±8.6％、39.4±2.6％与76.3±6.2％(图4B)。总结来说，29-mer或20-mer处理能够活化活体内LSC增殖，且相较于自然伤口愈合过程中的角膜再生，29-mer或20-mer处理可造成更为明显的角膜上皮再形成。
以上实施例的结果显示，此处提出的合成PEDF序列(譬如29-mer、20-mer、Mo 29-mer与Mo 20-mer)在培养系统中能够促进LSC增殖，同时可抑制LSC的自发分化。此一特征可大幅提升轮部移植均等物的质量，且因而有利于角膜再生医学。直接刺激轮部原祖细胞(progenitor cells)的增殖以及后续使角膜上皮再形成加速，意味着此处提出的PEDF合成多肽可作为活性成分以治疗与LSC不全症相关的各种异常。
实验例IV
衍生自PEDF的短合成多肽可促进试管内HFSC的增殖
本实验例中，利用BrdU脉冲染色(2小时；红色)来探究全长PEDF与其短胜肽对HFSC增殖的影响，并利用Lgr6免疫染色(绿色)来观察HFSC表现型。如图5A所示，培养于含有20-mer的培养基中的人类HFSC的扩增比起对照组的培养基更为显著。图5B所示的数据显示，接受全长PEDF、29-mer与20-mer处理的组别中，全体Lgr6-阳性细胞中，BrdU与Lgr6-双阳性细胞的百分比分别为73.8±6.0％、86.2±3.9％与79.3±3.1％，相较之下，对照组与接受18-mer处理的百分比是31.4±5.2％与30.1±6.3％。
实验例V
衍生自PEDF的短合成多肽可加速上皮伤口愈合
参照图6A，在受伤后第4天，接受39-mer、34-mer、29-mer、20-mer、Mo 29-mer或Mo20-mer治疗的小鼠的伤口愈合情形较佳。上述处理组别在第4天的残余上皮缺陷分别是48.1±3.2％、41.4±2.5％、46.3±3.7％、50.1±3.8％、47.8±4.3％与49.6±3.9％；相较之下对照组的残余上皮缺损为61.5±3.2％(图6B)。在受伤后第7天，接受上述短胜肽序列治疗的小鼠的上口几乎完全愈合，且疤痕较不明显(图6A)；且处理组的残余上皮缺损分别为18.4±5.7％、17.9±6.1％、18.2±4.3％、20.0±4.9％、16.8±6.6％与20.3±7.5％，相较于对照组的44.5±5.3％(图6B)。然而，25-mer与18-mer则未能促进伤口愈合(图6A与6B)。上述结果说明此处提出的衍生自PEDF的短胜肽(如39-mer、34-mer、29-mer、20-mer、Mo29-mer与Mo 20-mer)有助于皮肤上皮再形成。
为了进一步确认29-mer与20-mer对皮肤伤口修复的功效，对受伤后第4天的皮肤切片进行曼森氏三色染色。参照图7A，可以发现接受29-mer与20-mer治疗的动物之伤口愈合情形较佳(相较于对照组)。接受29-mer与20-mer治疗的动物之残余上皮缺陷分别为52.7±6.2％与49.7±5.6％；相较之下对照组动物的残余上皮缺陷是63.8±5.8％(图7B)。此外，参见图7C，可观察到接受29-mer治疗的小鼠在靠近伤口边缘处有较厚的高度增生上皮(hyper-proliferative epithelial，简称HE)组织与肉芽组织(granulation tissue，GT)。HE组织面积的定量结果显示接受29-mer及20-mer治疗的小鼠的皮肤厚度分别为对照组的约1.41±0.25倍与1.32±0.21倍(图7D)。此外，GT面积的定量结果显示接受29-mer及20-mer治疗的小鼠的皮肤厚度分别为对照组的约1.45±0.23倍与1.37±0.17倍(图7E)。
将受伤后第7天的皮肤切片进行曼森氏三色染色，以观察伤口复原情形。接受29-mer、Mo 29-mer或20-mer治疗的小鼠上口有较佳的上皮再形成作用，其残余上皮缺损小于接受对照组药膏处理的伤口(图8A与8B；17.9±3.3％、17.2±7.3％与20.8±6.1％，相较于43.5±6.5％).
实验例VI
衍生自PEDF的短合成多肽可藉由促进过度增生上皮组织的基底细胞的增殖而加速上皮伤口愈合
皮肤更新(skin resurfacing)通常涉及细胞复制，为了探究29-mer、Mo 29-mer、20-mer或Mo 20-mer是否可加速皮肤更新，分别以含有29-mer、Mo 29-mer、20-mer或Mo 20-mer的皮肤乳膏涂抹伤口，并于第4天将BrdU透过腹腔内注射至小鼠体内(3小时)，而后进行安乐死。利用抗BrdU抗体对皮肤样本进行免疫组织学分析，结果显示BrdU-阳性细胞主要分布于HE组织的基底层以及毛囊的发突区域(图9A)。相较于对照组伤口，在接受29-mer、Mo29-mer、20-mer或Mo 20-mer处理的小鼠伤口中，BrdU-阳性细胞的数量明显增加(图9B；47.9±5.0％、52.5±2.5％、53.1±6.5％与49.2±4.3％；相较于30.8±8.1％)。此一结果与前述实施例中，在接受29-mer或20-mer治疗小鼠中观察到较厚的HE组织相符。
实验例VII
衍生自PEDF的短合成多肽于皮肤受伤后可促进HFSC增殖
在皮肤伤口修复过程中，Lgr6-阳性HFSC是重要的前驱细胞。第10A图显示免疫组织分析的结果，如图所示，在受伤后第4天，接受20-mer治疗的小鼠HE组织中有明显较多的Lgr6-阳性细胞(相较于对照组伤口)。免疫组织分析亦显示Lgr6-阳性细胞部分位于HE组织的基底层。此一结果和上文实施例中观察到细胞增殖主要发生在HE组织的基底层一致。双重免疫染色进一步确认Lgr6-阳性基底细胞(绿色)与20-mer诱发的HE组织中的细胞增殖相关(图10B)。
以上实验例的结果显示本发明提出的PEDF合成多肽(如20-mer、29-mer、34-mer、39-mer、Mo 20-mer与Mo 29-mer)可促进培养系统中HFSC的增殖。具体来说，上述促进HFSC增殖与上皮再形成以及伤口愈合相关。因此，此处提出的PEDF合成序列可作为治疗药剂以促进伤口愈合，特别是大面积的伤口或是因为糖尿病或年迈而导致的伤口愈合困难。
虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本领域技术人员，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明的保护范围当以附随权利要求书所界定者为准。

Claims (11)

1.一种合成多肽在制备用以促进干细胞增殖的组合物的用途，其特征在于所述的干细胞为轮部上皮干细胞或毛囊干细胞，且所述的合成多肽是由一长度为20-39个氨基酸残基的氨基酸序列所组成，其中该氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％的氨基酸序列相似度，且该氨基酸序列包含至少20个连续氨基酸残基，其与SEQ ID NO:1的第11–30个氨基酸残基具有至少95％的氨基酸序列相似度，藉使该合成多肽能有效促进轮部上皮干细胞或毛囊干细胞的增殖。
2.如权利要求1所述的用途，其中该氨基酸序列是选自由：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:5所组成的群组。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述的组合物，包含：
一有效量的所述的合成多肽；以及
一载体。
4.如权利要求3所述的用途，其中该载体为一粉末状培养基，其可用以培养该干细胞。
5.如权利要求4所述的用途，其中该合成多肽在该组合物中的含量为1-100nM。
6.如权利要求5所述的用途，其中该合成多肽在该组合物中的含量为25-50nM。
7.如权利要求3所述的用途，其中该载体为一药学上可接受载体，其是选自由：一液体、胶体、乳霜、乳膏、黏着剂、皮肤替代物与皮肤均等物所组成的群组。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述皮肤替代物包括羊膜和人工皮肤。
9.如权利要求1所述的用途，其中所述的组合物是一种药学组合物，可用以促进角膜伤口愈合或上皮伤口愈合。
10.一种用以于活体外或试管内促进干细胞增殖的方法，于活体外或试管内使该干细胞接触一有效量的合成多肽，以促进该干细胞的增殖，其特征在于所述的合成多肽是由一长度为20-39个氨基酸残基的氨基酸序列所组成，其中该氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％的氨基酸序列相似度，且该氨基酸序列包含至少20个连续氨基酸残基，其与SEQ IDNO:1的第11–30个氨基酸残基具有至少95％的氨基酸序列相似度，且所述的干细胞为轮部上皮干细胞或毛囊干细胞。
11.如权利要求9所述的方法，其中该氨基酸序列是选自由：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:5所组成的群组。
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