JP7481261B2 - 腱治癒に対するpedf由来短鎖ペプチドの使用 - Google Patents
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Description
ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、ウシ胎児血清(FBS)、抗生物質-抗真菌剤溶液およびトリプシンをInvitrogen(Carlsbad,CA,USA)から購入した。5-ブロモ-2’-デオキシウリジン(BrdU)、インスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウム(ITSE)培地サプリメント、ヘキスト33258色素、アルギン酸ナトリウム塩およびあらゆる化学物質をSigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)から入手した。ディスパーゼIIおよびコラゲナーゼIをRoche(Indianapolis,IN,USA)から入手した。抗BrdU抗体(GTX42641)をGeneTex(Taipei,Taiwan)から入手した。抗ヌクレオステミン(ab70346)抗体をAbcam(Cambridge,MA,USA)から入手した。蛍光色素コンジュゲート二次抗体はいずれも、BioLegend(San Diego,CA,USA)から購入した。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)色素をMerck(Rayway,NJ,USA)から購入した。PDSP 29量体および29量体変異体を合成し、安定性のためにNH2末端でのアセチル化と、COOH末端でのアミド化とによって修飾し、GenScript(Piscataway,NJ,USA)での質量分析(純度>90%)によって特性評価した。DMSO中でストック(10mM)として、各PEDF由来合成ペプチドを再構成した。
温度制御(24~25℃)および12:12の明暗サイクルの下で、全動物を動物室に収容した。標準的な飼料および水道水を自由に摂取させた。実験手順は、Mackay Memorial Hospital Review Board(New Taipei City,Taiwan,R.O.C.)によって承認され、国の動物福祉規制に準拠して実施した。
この試験では、ニュージーランドホワイトウサギ(6~8月齢、3.0~4.0kg)から得られたアキレス腱を使用した。50μg/mlのゲンタマイシンを含有する滅菌リン酸緩衝食塩水(PBS)を用いて、アキレス腱を2回洗浄した。腱および腱鞘を小片に切断した(1~2mm3)。次いで、1mlの平衡塩溶液(BSS;Alcone)中に3mg/mlのI型コラゲナーゼおよび4mg/mlのディスパーゼを含有する溶液中で、各100mgの断片を37°Cで4時間消化させた。消化された組織をPBSで3回洗浄し、遠心分離(800g、10分間)によって収集した。消化された組織を組織培養プレート(Falcon Labware;NJ,USA)に置き、10%FBSおよび50μg/mlゲンタマイシンを補充した高グルコースDMEM中に再懸濁し、5%CO2、37℃に維持した。5日後、緩んだ組織残留物を除去するために培地を交換した。続いて、腱細胞を10%FBS培地と2日間インキュベートし、次いで、基礎培地(2%FBS、1%ITSE、300μg/ml L-グルタミン、1%抗生物質-抗真菌剤溶液)を用いてさらに10日間培養した。3日ごとに培地を交換した。継代のために、0.25%トリプシン/EDTAを用いて腱細胞を回収し、血球計算器により細胞を計数し、24時間かけて、96ウェル細胞培養プレートの各ウェルに約5×103個の細胞を播種するか、6ウェル細胞培養プレートの各ウェルに2×105個の細胞を播種した。次いで、これらの増殖した腱細胞を、新鮮な基礎培地中の10μMの29量体またはその変異体を用いてさらに24時間処理し、それぞれ細胞増殖アッセイおよびウエスタンブロット分析に供した。
BioVision(カタログ番号:K307)から細胞増殖アッセイキット(Fluorometric)を購入し、製造業者の推奨に従って細胞増殖を評価するために使用した。SPECTRAmax GEMINI XS蛍光マイクロプレート分光光度計(Molecular Devices、Sunnyvale,CA,USA)を用いて、励起について480nm、発光について538nmで蛍光を読み取った。
4%パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定した後、4°Cでメタノールにより1分間処理し、1%ヤギ血清および5%BSAを用いて1時間ブロックした。ヌクレオステミンに対する抗体(1:100希釈)を用いて、細胞を室温で3時間染色した。続いて、スライドをFITC-ロバ抗ウサギIgG(1:500希釈;BioLegend、San Diego,CA)と20分間インキュベートし、次いで、ヘキスト33258を用いて6分間対比染色した。Triton X100(0.5%)を含むPBSを用いてスライドを3回リンスした。最後に、FluorSave(商標)試薬(Calbiochem)とともに切片をマウントし、Zeiss落射蛍光顕微鏡を用いて観察した。
細胞溶解、SDS-PAGE、およびイムノブロッティングに使用される抗体は、記載されているように実施した(Ho et al.,15-deoxy-Delta(12,14)-prostaglandin J2 induces vascular endothelial cell apoptosis through the sequential activation of MAPKS and p53.J Biol.Chem.,2008;283(44):30273-30288)。モデルGS-700イメージングデンシトメーター(Bio-Rad Laboratories、Hercules,CA)を用いてイムノブロットのバンド強度を評価し、Labworks 4.0ソフトウェアを使用して分析した。
腱治癒に対する29量体ペプチドの効果を検討するために、Orhanらによって報告されたようにアキレス腱損傷のラットモデルを確立した(The effect of extracorporeal shock waves on a rat model of injury to tendon Achilles.A histological and biomechanical study.J.Bone Joint Surg.Br.2004;.86(4):.613-618)。キシラジン(10mg/kg)の腹腔内注射によって、成体の10週齢のオスのスプラーグドーリーラット(初期体重=312±11g)を麻酔した。次いで、踵骨付着部位の1cm近位のアキレス腱を通して18G針を全層挿入することによって、左アキレス腱損傷を作成した。これにより、切断された端の収縮を防ぐために無傷の腱組織に隣接する水平の創傷を作成した。創傷を滅菌生理食塩水で洗浄した後、皮膚切開を閉じた。100μMの29量体またはDMSOビヒクルと混合した150μlのアルジネートゲルを皮下注射することにより、腱病変の周囲の領域に処置を適用した(1実験条件当たりラット6匹)。
細胞増殖を検出するために、DMSO中でストック(80mM)としてBrdUを再構成した。手術後0、3、5日目に、350μlのPBSと混合した150μlのBrdUをラットに腹腔内注射した。抗BrdU抗体を用いたBrdU標識によってDNA合成を評価した。
腱と周囲の軟組織とを切開した。標本を4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液中に固定し、次いで、パラフィンブロックに包埋した。切片(厚さ5μm)を縦方向に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)を用いて染色するか、免疫組織化学的検査に使用した。最も重度に変性した領域を含むように、1つの腱当たり36の切片を注意深く調製した。Leica DC 500カメラ(Leica Microsystems、Wetzlar,Germany)を備えたNikon Eclipse 80i顕微鏡(Nikon Corporation、Tokyo,Japan)を使用して画像を取得した。損傷した腱組織を含む各試料の4つの切片を選択し、2名の盲検観察者により評価して、Chenらによって提案された0から3の改変された半定量的評価スコアに従って腱の形態を評価した(Tendon derived stem cells promote platelet-rich plasma healing in collagenase-induced rat Achilles tendinopathy.Cell Physiol.Biochem.,2014;34(6):2153-68)。スコアにより、線維構造(0~3)、線維配列(0~3)、核の丸み(0~3)、常在細胞密度(0~3)、および炎症(0~3;炎症細胞の浸潤、血管新生および脂肪沈着)を分析した。この評価系によれば、完全に正常な腱は0のスコアを取得したが、最大に異常な腱には15のスコアが割り当てられた。
ホルマリン固定パラフィン包埋腱標本をキシレン中で脱パラフィン化し、段階的な一連のエタノール濃度で再水和した。10%ヤギ血清を用いてスライドを60分間ブロックした後、CD146に対する一次抗体(1:50希釈)と室温(RT)で2時間インキュベートした。続いて、スライドを適切なペルオキシダーゼ標識ヤギ免疫グロブリン(1:500希釈;Chemicon、Temecula,CA)と20分間インキュベートし、次いで、色素原基質(3,3’-ジアミノベンジジン)と2分間インキュベートした後、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。
結果は、平均±平均の標準誤差(SEM)として表した。統計的比較に一元配置分散分析を使用した。特に指定がない限り、P<0.05が有意であると考えられた。
ラットモデルによって証明されるように、色素上皮由来因子(PEDF)由来短鎖ペプチドの断片(29量体;残基Ser93~Thr121、24量体;Ser93~Pro、および20量体;Ser93~Leu112)が、腱断裂の治癒を促進することを示した。以前の試験の結果はまた、培地に添加された29量体、24量体および20量体が、培養された腱幹/前駆細胞(TSPC)の増殖を誘発することができることを示した。本明細書では、29量体の配列に沿ったアラニンまたはグリシンによる単一残基の置換を設計および合成して、29量体の細胞分裂活性に関与する重要な残基を解明した。PEDF残基93~121のアミノ酸配列に基づいて合計で29個のペプチド変異体を合成し、そのうち27個は単一のアラニン変化を伴い、2個は単一のグリシン変化を伴う(A96GおよびA107G)。まず、TSPCの増殖に対する29量体変異体の影響を検討した。
損傷した腱に対する29量体ペプチドの治療効果を検討するために、アキレス腱に18G針を全層挿入することによって、アキレス腱損傷のラットモデルを確立した。以前のプロトコルで説明したように、5日間で90%の負荷の29量体を放出する、150μlのアルジネートゲル中の29量体を送達した(Ho et al.,PEDF-derived peptide promotes skeletal muscle regeneration through its mitogenic effect on muscle progenitor cells.Am J Physiol.Cell Physiol.2015 Aug 1;309(3):C159-68)。図3、術後1週間でのH&E染色による組織学的分析に示すように、ビヒクル/アルジネートゲル処置は、線維組織の損失を示し、治癒領域内の炎症性マトリックス(黄色の矢印によって示される)および脂肪沈着および/または壊死領域(黒色の矢印によって示される)の実質的な存在を示したのに対して、29量体/アルジネートゲル群は、良好に整列したコラーゲン線維の均一な外観を示し、29量体が腱治癒を促進することを示した。特に、術後1週間で、ビヒクル群によって処置された損傷した腱は、多数の丸い細胞(線維芽細胞および炎症細胞;図4A)の存在を示した。対照的に、29量体処置は細胞密度の大幅な増加を示し、それらの核の形態は、コラーゲン線維に平行に配置された正常な紡錘形の腱細胞と、わずかに丸い常在細胞とを示した。顕微鏡的には、T100A変異体またはH105A変異体を含有するアルジネートゲルによって処置された損傷した腱も、良好に整列したコラーゲン線維の均一な外観を示し、29量体処置と同様に変性事象は示さなかった。重要なことに、S93A、A96G、Q98A、I103A、I104AおよびR106Aによる処置は、線維組織の損失を示し、腱損傷領域内の炎症性マトリックス、脂肪沈着および血管増生(アスタリスクによって示される)の著しい増加を伴った(図3)。
CD146はTSPCマーカーの1つである。CD146+TSPCはラット腱の末梢領域に分布し、CD146+TSPCはラット膝蓋腱の創傷治癒を促進することが分かっている。29量体によって誘発される腱修復の機序を試験するために、負傷後1週間の時点で、損傷した腱に位置するTSPCのCD146免疫染色を測定した。結果から、29量体/アルジネートゲル処置腱の治癒領域では多数のCD146+TSPCが検出可能であったのに対して、ビヒクル/アルジネートゲル処置腱ではCD146+TSPCが少なかったことが明らかにされた(図5;200倍視野当たり86.8±6.0細胞対38.3±7.8細胞)。したがって、29量体処置によるTSPC増殖の活性化は、迅速な腱創傷治癒を促進する。
Claims (3)
- PEDF由来短鎖ペプチド(PDSP)、または前記PDSPの変異体を含む、腱損傷の治療に使用するための医薬組成物であって、
前記PDSP、または前記PDSPの変異体が、14-29アミノ酸長を有し、S-X-X-A-X-Q/H-X-X-X-X-I/V-I-X-R(配列番号5)の配列からなるヒト色素上皮由来因子(PEDF)由来コアペプチドフラグメントを有し、前記PEDF由来コアペプチドフラグメントのC末端及びN末端のいずれか又は両方にはPEDFに由来しない延長部分が付加してもよい
医薬組成物。 - 前記PEDF由来コアペプチドフラグメントが、SLGAEQRTESIIHR(配列番号2)の配列からなる
請求項1に記載の医薬組成物。 - 前記PEDF由来コアペプチドフラグメントが、配列番号6~75のいずれか1つの配列の配列からなる
請求項1に記載の医薬組成物。
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