CN110312732A - 包含pedf-衍生的短肽的组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
一种用于治疗对象眼科疾病的药物组合物,其包含肽和药学上可接受的赋形剂,其中所述肽含有SEQ ID NO:1:S‑X‑X‑A‑X‑Q/H‑X‑X‑X‑X‑I/V‑I‑X‑R的序列,其中各X独立地为任何氨基酸。
Description
交叉引用相关申请
要求申请日为2016年10月7日,申请号为62/405,522的美国专利申请的优先权,且其公开内容通过引用整体并入。
发明背景
技术领域
本发明涉及PEDF-衍生的短肽及其在治疗和/或改善眼科疾病(尤其是干眼病)中的用途。
背景技术
干眼病或干眼综合征(DED或DES)也称为干燥性角膜结膜炎(Keratoconjunctivitis Sicca),是一种复杂的疾病,会导致不适、视觉障碍及泪膜不稳定的症状,从而可能产生眼表损伤。干眼会伴随着泪膜渗透压的升高及眼表发炎。患者之间的干眼征兆/症状的严重程度差异大。一些患者仅遭受轻微的刺激,而另一些却经历会导致重度角膜损伤及视觉障碍的严重并发症。
干眼病(DED)或干眼综合征(DES),又称为干燥性角膜结膜炎,是一种多因素眼表病症,会影响泪膜组成(脂质、水和粘蛋白)、眼表或泪液产生,导致眼干燥,异物感、刺激及疼痛。DED可源自多种原因,从而影响任何泪液成分的产生或泪膜的稳定性(例如,泪液的快速蒸发)。此外,泪液高渗、泪膜不稳定、眼表上皮完整性的不充分支撑也可引起干眼。
泪液高渗状况可潜在地损伤和刺激眼部上皮细胞的炎症级联,引起表面上皮细胞(包括结膜杯状细胞)的损失。杯状细胞的损失减少粘蛋白分泌,随后导致对表面上皮的保护减损及泪膜不稳定,且最终引起干眼症状的发展以及角膜上皮细胞的损伤。此随后发生的泪膜不稳定往往导致慢性发炎周期及对眼表的损伤,从而引起DED。
DED患者中的多因素眼部病况的治疗需求远未被满足。目前,可用于DED患者的几个治疗方案包括人工泪液、消炎药及镇痛剂。尽管这些治疗可以缓解一些患者的一些症状,然而仍广泛需要更好的治疗和预防DED的手段。
发明内容
本发明实施例有关预防和/或治疗干眼的试剂和方法。
本发明的一个方面是关于用于治疗对象眼科疾病的药物组合物。根据本发明的一个实施例的一种药物组合物包括肽和药学上可接受的赋形剂,其中所述的肽包括SEQ IDNO:1:S-X-X-A-X-Q/H-X-X-X-X-I/V-I-X-R的序列,其中各X独立地为任何氨基酸,条件是该肽不包括分别对应于人及小鼠PDSP序列的SLGAEQRTESIIHR(SEQ ID NO:2)或SLGAEHRTESVIHR(SEQ ID NO:3)。该组合物可以是溶液、软膏或凝胶形式。
根据本发明的一些实施例,该肽包括SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:75中之任一序列。根据本发明的一些实施例,该肽的长度由20、22、24或29个氨基酸残基构成。
根据本发明的一些实施例,所述眼科疾病为角膜损伤相关的疾病,其可能为干眼综合征(DES)。
本发明的一个方面是关于治疗眼科疾病的方法。根据本发明的一个实施例的方法包括向有需要的对象施用含有上述肽中的任一者的组合物。所述眼科疾病为角膜损伤相关的疾病,其可能为干眼综合征(DES)。
本发明的其他方式将由以下的描述和所附的图谱显明。
附图说明
图1(A)显示了通过角膜荧光素染色所揭示的PEDF-衍生的短肽(PDSP)在干燥应力诱导的干眼中的作用,可用于评估角膜损伤。在受控环境室(CEC)中圈养C57BL6小鼠达14天以诱发眼表破裂(第0天),随后用PDSP或媒介物再处理5天(第5天)。图1(B)显示由酚红线试验评估的水性泪液的产生量。NS:圈养在正常环境条件下的未受应力小鼠。UT:圈养在CEC中14天的未经处理的小鼠。
图2(A)显示穹窿结膜中的杯状细胞的高碘酸希夫试剂(Periodic Acid Schiffreagent,PAS)染色的代表性图像。原始放大×100。在CEC中圈养C57BL6小鼠14天,随后用PDSP或媒介物再处理5天(第5天)。图2(B)PAS染色阳性细胞的平均数目在PDSP处理之后显著增加。数据以平均值±SD形式呈现。
图3显示了局部施用PDSP的结果,证实了对由干燥应力引起的眼表障碍破坏的预防。在CEC中圈养小鼠14天,并自开始在CEC中圈养便按100μM PDSP的剂量施药。数值表达为平均值±SD。
图4显示局部施用PDSP对干燥应力诱导的眼部发炎的影响。在CEC中圈养C57BL6小鼠14天(第0天),随后用PDSP或媒介物再处理5天(第5天)。通过定量实时PCR评估不同发炎因子的mRNA含量。各组的数值表达为平均值±SE。*P<0.05对比于NS:未受应力小鼠。**P<0.05对比于媒介物处理组。
图5显示局部施用PDSP预防氧化应力诱导的脂质过氧化。在CEC中圈养小鼠14天,并自开始在CEC中圈养便按100μM PDSP的剂量施药。图5(A)显示在干眼角膜上皮中氧化应力标记物4-HNE的代表性免疫组织化学。图5(B)显示阳性4-HNE细胞的定量分析结果。值数值表达为平均值±SD。*P<0.00002对比于媒介物处理组。(C)干眼结膜上皮中的o 4-HNE的代表性免疫组织化学。
图6显示PDSP对经NaCl处理的兔角膜上皮细胞中细胞内ROS及GSH水平的影响。用10μM PDSP或对照肽(ConP,PEDF的残基93-110)预处理兔角膜上皮细胞20小时,随后用NaCl处理以诱发高渗应力。经NaCl再处理24小时后,利用H2DCFDA探针(A)对细胞进行ROS检测或利用OPA探针(B)对细胞进行谷胱甘肽(GSH)检测。*P<0.002对比于未经处理细胞(等渗介质中的细胞)。#P<0.05对比于经ContP/NaCl处理的细胞(高渗介质中的细胞)。
图7显示PDSP对经NaCl处理的兔角膜上皮细胞中MMP-9mRNA表达及活性的影响。图7(A)显示MMP-9mRNA水平,由定量实时PCR所评估。各组中的数值表达为平均值±SE。*P<0.005对比于未经处理的细胞。#P<0.02对比于经ContP/NaCl处理的细胞。图7(B)显示了通过明胶酶谱法评估的MMP-9活性。各组中的数值表达为平均值±SE。*P<0.0001对比于未经处理的细胞。#P<0.0003对比于经ContP/NaCl处理的细胞。
图8显示了由荧光素染色所揭示的,各种丙氨酸取代的肽在预防或治疗干燥诱发的角膜损伤中的作用。在CEC环境中圈养小鼠14天以诱发干眼,且在眼上施用各种的肽5天。5天后,用荧光素染色角膜以评估表面的损伤。
图9显示了由酚红线方法所揭示的,各种丙氨酸取代的肽在增强泪液产生中的作用。
图10显示各种丙氨酸取代的肽对所培养的C2C12细胞的细胞存活率的影响。利用MTT分析法评估细胞存活率。
图11显示人PDSP 29聚体及moPDSP 29聚体变异体在干燥应力诱导的干眼中的治疗作用。在受控环境室(CEC)中圈养C57BL6小鼠14天以诱发眼表破裂(第0天),然后开始用肽或媒介物处理3天(第3天)。通过角膜荧光素染色评估角膜损伤情况。小鼠对不同肽持续3天起反应的平均角膜染色评分。*P<0.05对比于第0天。
图12显示了通过酚红线试验评估的泪液产生结果。在受控环境室(CEC)中圈养C57BL6小鼠14天以诱发眼表破裂(第0天),然后开始用肽或媒介物处理3天(第3天)。NS:圈养在正常环境条件下的未受应力小鼠。*P<0.05对比于第0天。
具体实施方式
人色素上皮衍生因子(Pigment Epithelium-derived Factor,PEDF)是一含有418个氨基酸的分泌蛋白,分子量约50kDa。PEDF是一具有多种生物学功能的多功能蛋白(参见例如,公开号2010/0047212的美国专利申请)。已发现PEDF的不同肽区具有不同的功能。举例而言,34聚体片段(PEDF的残基44-77)已被鉴定出具有抗血管生成活性,而44聚体片段(PEDF的残基78-121)已被鉴定出具有神经营养特性。
公开号2010/0047212的美国专利申请记载PEDF可以促进干细胞的自我更新。美国专利9,051,547及美国专利9,617,311公开长度有20至39个氨基酸的PEDF片段(PEDF的残基93-121)可以促进干细胞增殖及伤口愈合,尤其是角膜缘上皮干细胞的增殖。
本发明的实施例涉及衍生自PEDF的短肽片段及其变异体。本发明的实施例还涉及这些肽在预防和/或治疗干眼综合征(DES)中的用途。
当眼睛未产生足够的泪液或当泪液蒸发过快时出现干眼。眼睛干涩一段时间会导致眼睛表面的磨损。在进一步的情况下,上皮可能发生病理性改变,诸如鳞状化生或杯状细胞损失。在严重的情况下,患者最终可能会受到角膜损伤,包括角膜表面的增厚、角膜糜烂、点状角膜病变、上皮缺损、角膜溃疡、角膜新血管生成、角膜瘢痕形成、角膜变薄以及甚至角膜穿孔。
本发明的发明人已发现某些衍生自PEDF的肽片段可预防和/或治疗干燥引起的角膜损伤。
关于干眼病的动物模型,如先前所述(Barabino等人,2005),是将小鼠放入受控环境室(CEC)中以诱发干眼。每天小鼠被放置在CEC中12小时,并暴露于相对湿度(relativehumidity,RH)<25%、温度20℃至22℃、气流15L/min(升/分钟)的环境下。在相同的时间段,使未受应力小鼠处于正常的环境(RH>50%,无气流,21℃至23℃的温度)下。14天后,用媒介物处理未受应力小鼠,而用测试肽(例如29聚体PDSP)或媒介物溶液(媒介物组)处理受应力小鼠5天。然后,通过荧光素染色检查角膜。
如图1(A)中所示,在第14天,荧光素染色显示未受应力组和测试组都有明显的角膜损伤。用PEDF-衍生的短肽(PDSP,PEDF的残基93-121)处理5天后,角膜表面上的损伤基本消失,而对照组(用媒介物处理)的角膜仍显现损伤。
另外,本发明发现具有不同长度(20至29个氨基酸,自PEDF残基93开始)的PDSP能够在10μM至200μM的浓度下修复干眼病动物模型中的角膜损伤。
图1(B)显示通过酚红线试验揭示的泪液产生效果(随后部分中有详细的描述)。在图1(B)中,NS代表未受应力小鼠,UT代表受到应力且未经处理的小鼠。如图1(B)中所示,相较于UT及媒介物处理组,用PDSP处理的,泪液产生显著增加。
在人类中,泪膜涂覆在眼睛上,称为前角膜,具有三个不同的层:脂质层(由睑腺分泌)、水层(由泪腺分泌)、和黏膜层(由结膜杯状细胞分泌)。这些成分中的任一或全部的减少可能造成应力诱导的干眼。
杯状细胞减少可导致粘蛋白产生的减少。本发明显示PDSP可防止因干眼所致的杯状细胞的减少。图2(A)显示高碘酸希夫(PAS)试剂对小鼠眼睛的染色结果。简言之,在CEC中圈养C57BL6小鼠14天后用PDSP或媒介物再处理5天。包括未受应力的眼睛作为未受应力对照(NS)。图2(A)显示未受应力的眼睛(NS)、经媒介物处理的眼睛,和经PDSP处理的眼睛中的杯状细胞的代表性染色。图2(B)显示与未经处理的受应力眼睛和经媒介物处理的眼睛相比,经PDSP处理的眼睛具有更多杯状细胞(更多PAS阳性细胞)。
除了能够逆转或治愈干眼综合征,本明人还发现PDSP可预防由干眼病况引起的损伤。实验中,将浓度为100μM的PDSP或媒介物(作为对照)施用于C57BL6小鼠的眼睛上,然后将小鼠保持在受控环境室(具有较低的湿度及气流)中14天。随后,用荧光素染色可观测到由干燥应力引起的眼表障碍破坏。基于眼表损伤的程度,将由干燥应力引起的眼表障碍破坏记为0至3分。如图3中所示,与媒介物处理组相比,PDSP有效预防了眼表损伤。
干眼与前角膜泪膜异常及整个眼表(包括附件、结膜及角膜)后续的发炎变化相关。(参见,Hessen等人,“Dry eye:An Inflammatory Ocular Disease”,J.OphthalmicVis.Res.,2014,9(2):240-250)。因此,接下来检查PDSP在角膜炎症反应中的作用。简言之,在CEC中圈养C57BL6小鼠14天(第0天),然后用PDSP或媒介物再处理5天(第5天)。随后,通过定量实时PCR评估发炎因子的mRNA水平。
如图4中所示,在应力诱发的干眼中(参见未经处理的UT组),如IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1(单核球化学引诱蛋白-1(MCP-1/CCL2)是关键的炎性趋化因子,其控制发炎及组织反应中的白血球的募集)的各种炎症相关因子的表达增加了。与未经处理的UT组或媒介物处理组相比,用PDSP处理显著降低了这些发炎因子的表达。因此,PDSP可有效减少应力诱导干眼中的发炎。
此外,已推测在干眼综合征与氧化应力的积累之间存在联系。(参见,Nakamura等人Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,2007,48(4):1552-8)。因此,还研究了PDSP是否可以减少或预防干眼中的氧化应力。
就此测试,在CEC中圈养小鼠14天且自开始在CEC中圈养时开始PDSP处理。随后,检查氧化应力产物(例如,4-羟基-2-壬烯醛,4-HNE)的产生。4-HNE遍及动物组织,且由于脂质过氧化的增加而在氧化应力期间的量更高。4-HNE含有的反应性醛可修饰蛋白质。可用对4-HNE部分特异的抗体检测4-HNE修饰的蛋白质。
如图5(A)中所示,未受应力的眼睛具有极少4-HNE。应力诱导的干眼具有增加的4-HNE染色(媒介物处理组)。相反,经PDSP处理的应力诱导的干眼的4-HNE的产生明显减少。图5(B)显示对阳性4-HNE细胞定量分析的结果。图5(C)显示干眼中结膜上皮中的4-HNE的代表性免疫组织化学染色。
普遍认为泪液的高渗透压(high osmotic pressure,HOP)是眼部发炎及损伤的原因。HOP可促使活性含氧物(ROS)(为细胞代谢副产物)的产生。据报导在圆锥形角膜患者的角膜纤维母细胞及干眼动物模型的角膜上皮细胞中,ROS的生成增加。此观察结果提示ROS可能在干眼的角膜损伤中扮演一定的角色。另一方面,谷胱甘肽(GSH)是能对抗自由基或ROS的天然物,并能减轻或预防由自由基或ROS引起的损伤。
因此,我们检查了PDSP对经NaCl处理(HOP)的兔角膜上皮细胞中的细胞内ROS和GSH水平的影响。简言之,用10μM PDSP或阴性对照肽(ConP)预处理兔角膜上皮细胞20小时,接着用NaCl处理以诱发高渗应力。在用NaCl再处理24小时后,使用2',7'-二氯二氢荧光黄二乙酸酯(H2DCFDA)探针(即ROS指示剂染料)评估细胞的ROS。H2DCFDA可扩散进入细胞,其乙酸酯键被细胞内酯酶分解且被ROS氧化,ROS将非荧光二氯二氢荧光黄二乙酸酯(H2DCFDA)转化为强荧光的2',7'-二氯二氢荧光黄二乙酸酯(DCF)。
如图6(A)中所示,与未经处理的小鼠相比,在没有HOP的情况下,单独的PDSP并未增加DCF荧光。当用NaCl诱发HOP时,如相较于用阴性对照肽(ConP)预处理,用PDSP预处理导致ROS产生减少(即较低DC荧光)。此结果表明PDSP可减少HOP诱发的ROS形成。
图6(B)显示不同的处理组中的相对GSH水平。有趣的是,与未经处理的小鼠相比,在没有HOP应力的情况下,单独的PDSP只引发GSH水平的略微增加。增加的GSH(一抗氧化剂)水平能使细胞更好地耐受氧化应力。如相较于使用对照肽(ConP)的处理,在HOP下,PDSP处理也引起GSH增加。这些结果表明PDSP处理在使ROS的产生最小化的同时提高GSH水平。综合效应使细胞更耐受于氧化应力或高渗应力。
干眼综合征(DES)包括泪膜的渗透压增加及眼表发炎。泪液的高渗透压造成发炎级联,使受损上皮细胞产生升高的细胞介素MMP-9水平。干眼中的MMP-9活性增加可能会造成角膜上皮障碍功能紊乱、角膜上皮脱落增加及角膜表面不规则。(Chotikavanich等人,“Production and activity of matrix metalloproteinase-9 on the ocular surfaceincrease in dysfunctional tear syndrome”,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.2009;50:3203-3209)。
因此,我们还查考PDSP对经NaCl处理的兔角膜上皮细胞的MMP-9 mRNA表达及活性的影响。简言之,如上文所述处理兔角膜上皮细胞。图7(A)显示,通过定量实时PCR评估,在无高渗应力的情况下,单独的PDSP不影响MMP-9 mRNA水平。高渗应力引发MMP-9 mRNA水平大幅(约2倍)增加(阴性对照肽,ConP,然后用NaCl处理)。相比而言,PDSP处理有效地抑制高渗应力(PDSP处理后用NaCl)下大部分MMP-9 mRNA水平的增加。如图7(B)中所示,用SDS凝胶及酶活性测量,MMP-9 mRNA水平的增加与MMP-9蛋白的表达基本相关。
上述结果明确显示本发明的PDSP可预防和治疗干眼病(DED)或干眼综合征(DES)。具体而言,本发明PDSP预防和治疗DED的作用包括:(1)预防和治愈由干眼应力诱发的角膜表面损伤;(2)增加泪液产生;(3)维持或保护结膜杯状细胞;(4)抑制干眼诱发的发炎;(5)使氧化应力诱导的脂质过氧化缓解或降至最低;(6)抑制细胞内活性含氧物(ROS)的形成及增加细胞内谷胱甘肽(GSH)水平;和(7)抑制MMP-9表达。
由于本发明的PDSP是预防和治疗DED的有效药剂,因此我们通过丙氨酸扫描进一步研究了PDSP的结构-活性关系。在丙氨酸扫描实验中,我们使用来自人PEDF的残基93-121的29聚体:93SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT121(SEQ ID NO:4)。29聚体中的每一个氨基酸经丙氨酸(或在残基为丙氨酸时用甘氨酸)置换,并评估经丙氨酸取代或经甘氨酸取代的突变体的活性。
图8显示来自眼部染色分析的示例性结果。在这些测试中,在CEC中诱发干燥引发的角膜表面损伤(通过荧光素染色评估),具体如上文及后续部分的实验详述。这些结果显示在29聚体中的残基1(L93A)、4(A96G)、6(Q98A)、11(I103A)、12(I104A)、和及14(R106A)处的丙氨酸或甘氨酸取代导致PDSP活性的大幅损失,表明这些残基为PDSP活性所必需的。
图9显示来自泪液产生分析的示例性结果,相关操作如上文及后续详述。基于图9中所示的泪液产生结果与基于图8中所示荧光素染色结果一致。也就是说,在29聚体中残基1(S93A)、4(A96G)、6(Q98A)、11(I103A)、12(I104A)、和14(R106A)处的丙氨酸或甘氨酸取代引起PDSP诱发泪液产生的能力大幅损失,表明这些残基为PDSP活性所必需的。
本发明的PDSP能够预防角膜表面损伤、减少细胞中的氧化应力和使炎症反应减至最小的事实表明PDSP可能具有总体上维持细胞存活率的能力。这通过细胞培养中的细胞存活率进行了测试。图10显示使用C2C12细胞培养物进行丙氨酸扫描实验的结果。细胞存活率可通过染色及细胞计数或MTT分析法进行评估。这些技术为本领域所熟知。
如图10中所示,在29聚体中的位置1(S93A)、4(A96G)、6(Q98A)、11(I103A)、12(I104A)、和14(R106A)处的残基的丙氨酸(或甘氨酸)取代基本上消除这些肽维持/增强细胞存活率的能力。使用干眼动物模型,这些丙氨酸扫描结果与图8及图9中所示的结果一致。
上述实验用人PDSP序列(PDSP 29聚体:SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT,SEQ IDNO:4)进行,而我们发现相对应的小鼠序列(moPDSP 29聚体:SLGAEHRTESVIHRALYYDLITNPDIHST,SEQ ID NO:5)功能相当。例如,由眼部染色揭示,图11显示人(PDSP 29聚体)及小鼠(moPDSP 29聚体)都有保护免受由干燥诱发的角膜表面损伤的结果。显然小鼠序列具有与人序列类似的作用。类似地,图12显示人PDSP及小鼠PDSP均在相同程度上改善泪液产生。这些结果证实,在预防和/或治疗DES的能力方面,人PDSP与小鼠PDSP之间没有可辨别的功能差异。
此区域中人PEDF与小鼠PEDF之间的氨基酸残基差异由两种同源取代构成,即,人序列中的Q-98相当于小鼠序列中的H-98,及人序列中的I-103相当于小鼠序列中的V-103。因此,在这两个位置(98及103)处的必需残基可经相对应的残基(98Q/H和103I/V)置换。
本领域技术人员理解,同源氨基酸取代通常不会明显地影响生物活性,即使已发现此两个残基对干眼治疗及预防至关重要。此外,本领域技术人员理解,在非必需位置处的类似同源取代甚至可被更好地耐受。何种氨基酸取代视为同源属本领域熟知的技术。一些实例有:(I,V,L,M)、(Q,N,H)、(D,E)、(R,K,H)、(S,T,C)及(F,Y,W),其中相同括号组中的氨基酸通常可以彼此取代而不显著影响肽或蛋白质的生物活性。
基于这些结果,能够得出结论,对于PDSP预防或治疗DED必需的肽序列可以表示如下:1S-2X-3X-4A-5X-6Q/H-7X-8X-9X-10X-11I/V-12I-13X-14R(SEQ ID NO:1),其中各X表示非必需残基且可为任何氨基酸,较佳地为天然氨基酸。人PDSP的对应序列为:SLGAEQRTESIIHR(SEQ ID NO:2)且小鼠PDSP的相对应序列为:SLGAEHRTESVIHR(SEQ ID NO:3)。
本领域技术人员应理解,包含这些必需残基的肽可用于预防或治疗干眼。此类肽总体上可称作PDSP(即,PEDF衍生的短肽)。这些PDSP中的一些实例在下表中说明:
本领域技术人员应理解,上表所列的肽序列仅用于说明,在不背离本发明范围的情况下其他排列也为可能。此外,尽管上文可表示在预防和/或治疗干眼综合征方面有效的短肽或极小肽,但也可使用较长的肽。特别是,较长的肽可能提供更有利的药代动力学和/或生物利用度。
对于较长的肽,可在上述任一肽的N端和/或C端包括额外的氨基酸。额外的氨基酸可为任何适合的残基,诸如侧接上述肽的区域的来自人或小鼠PEDF的残基。较长肽的特定实例可包括20聚体(PEDF的残基93-112;SEQ ID NO:76),22聚体(PEDF的残基93-114;SEQID NO:77),24聚体(PEDF的残基93-116;SEQ ID NO:78),和29聚体(PEDF的残基93-121;SEQID NO:4)。
本发明的实施例也涉及预防和/或治疗对象的干眼的方法。根据本发明的实施例,对象可为人或动物。根据本发明的一实施例的方法,可包括将包含选自上述的任一肽的组合物施用于需要预防或治疗干眼的对象。根据本发明的实例,所述组合物可包括本发明的肽或其盐,以及药学上可接受的载体或赋形剂,诸如蒸馏水、生理盐水、油或凝胶。
本发明的组合物可以任何适合的剂型配制,诸如溶液、软膏、悬浮液、凝胶或乳液,其可以任何适合的浓度配制,诸如10-200μM。本领域技术人员应能够以适合的浓度配制这些剂型以递送有效剂量而无需创造性努力。这些剂型可配制成局部施用于眼睛或其他合适的给药途径(如口服或注射)。
本发明的实施例将用以下实验细节及实例进一步说明。本领域技术人员应理解,这些实验细节及实例仅用于说明,而其他修改及变化形式在不背离本发明范围的情况下为可能的。
原料及方法
羧甲基纤维素钠(CMC)、高碘酸希夫(PAS)试剂及地塞米松(dexamethasone)皆来自Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO,USA))。将含CMC(1%w/v)的平衡盐溶液(BSS;Alcone)用作PDSP的媒介物。合成PDSP及阴性对照肽(ConP),并在NH2端乙酰化及在COOH端酰胺化进行修饰以达成稳定,且通过质谱表征(>95%纯度)以在GenScript(美国新泽西州(Piscataway,NJ,USA))定购。
动物
7至8周龄雌性C57BL/6小鼠用于这些实验。实验程序由Mackay MemorialHospital评审委员会批准且根据“眼科及视觉研究中的动物使用”(Use of Animals inOphthalmic and Vision Research)ARVO声明进行。
干眼模型
如先前所述(Barabino等人,2005),通过将小鼠放入受控环境室(CEC)中来诱发干眼。简言之,被放入CEC中的小鼠暴露于相对湿度(RH)<25%、20℃至22℃的温度及15公升/分钟的气流下,每天12小时。将不患有应力诱发干眼的未受应力(NS)小鼠保持在正常的环境(RH>50%,无气流,21℃至23℃的温度)下持续相同时间。
角膜荧光素染色及
腹膜内注射舒泰(zoletil)(6mg/kg)与甲苯噻嗪(3mg/kg)的混合物来麻醉动物。用局部荧光素(Fluor-I-Strip,Ayerst Laboratories,Philadelphia,PA)染色来测定角膜上皮损伤。角膜荧光素染色用裂隙灯生物显微镜在钴蓝光下检查且用数字相机摄影。角膜染料染色评分方式如下:无斑点染色记0分;当少于三分之一的角膜染色时记1分;当三分之二或更少染色时记2分;当超过三分之二染色时记3分(Horwath-Winter J 2013)。
泪液产生的测量
用酚红浸渍棉线(Zone-Quick;Oasis,Glendora,加拿大)测量泪液产生。如先前所述(Dursun等人,2002)来验证该试验的有效性。用珠宝商镊子(jeweler forcep)固持棉线且放入外眦60秒。以被眼泪润湿后变红的棉线的毫米数来表示泪液产生。
杯状细胞的PAS染色
动物安乐死后,眼睛以手术方式切除,固定在10%福尔马林中,石蜡包埋,切成5-μm段。这些切段经高碘酸希夫试剂(PAS;Sigma-Aldrich)染色以测量上下结膜中的杯状细胞,且用配备有数字相机的显微镜检查及摄影。在来自各眼睛的五个切段中测量结膜中的PAS阳性杯状细胞。
RNA提取及定量实时PCR
用TRIzol(Invitrogen)自细胞提取总RNA,用不含RNA酶的DNA酶I(Qiagen,SantaClarita,CA)处理以去除染色体组DNA并随后用RNA纯化试剂盒(Dynabeads;Invitrogen)进行纯化。利用Superscript III(Invitrogen)进行cDNA合成。在GeneAmp 7700序列检测系统(Applied Biosystems,Foster City,CA)中进行定量实时PCR。在含有3pmol引子、连续稀释的RT产物及SYBR Green PCR核心试剂(Applied Biosystems)的40μl总体积中进行扩增。特异性PCR引子的序列为小鼠TNF-α(登记号码:NM_013693)有义,5'-CTACCTTGTTGCCTCCTCTTT-3'(SEQ ID NO:79),反义,5'-GAGCAGAGGTTCAGTGATGTAG-3'(SEQID NO:80);小鼠IL-1β(登记号码:NM_008361)有义,5'-GGTGTGTGACGTTCCCATTA-3'(SEQ IDNO:81),反义,5'-ATTGAGGTGGAGAGCTTTCAG-3'(SEQ ID NO:82);小鼠IL-6(登记号码:NM_031168)有义,5'-GTCTGTAGCTCATTCTGCTCTG-3'(SEQ ID NO:83),反义,5'-GAAGGCAACTGGATGGAAGT-3'(SEQ ID NO:84);小鼠MCP-1(登记号码:NM_011333)有义,5'-CTCGGACTGTGATGCCTTAAT-3'(SEQ ID NO:85),反义,5'-TGGATCCACACCTTGCATTTA-3'(SEQID NO:86);兔MMP-9(登记号码:NM_001082203)有义,5'-TGCGAGTTTCCGTTCATCTT-3'(SEQID NO:87),反义,5'-GTAGAGCTTGTCCTTGTCGTAG-3'(SEQ ID NO:88);设置步骤-循环程序为在95℃变性15秒,并在62℃退火及延伸1分钟,总共40个循环。所有测定一式三份测量。利用GeneAmp 7700SDS软件分析对应于在实时荧光发射达到高于基线发射的阈值时的PCR循环次数的循环阈值(Ct)。随后用所关注的PCR产物及对照mRNA(GAPDH)的Ct值计算样品之间的mRNA的相对数量。
免疫组织化学
通过角膜和结膜中的4-羟基-2-壬烯醛(4HNE)的免疫组织化学检测来评估氧化应力诱导的脂质过氧化。将经福尔马林固定、石蜡包埋的眼睛标本在二甲苯中脱蜡且在一系列梯度乙醇浓度中再水化。用10%山羊血清阻断载玻片60分钟,然后将其与抗4-HNE的初级抗体(1:100稀释)(ab46545,Abcam)在室温下培育4小时。随后将载玻片与适合的过氧化酶标记的山羊免疫球蛋白(1:500稀释;Chemicon,Temecula,CA)一起培育20分钟,接着将其与色原底物(3,3'-二氨基联苯胺)一起培育2分钟,随后用苏木精对比染色。
角膜上皮细胞培养及处理
自6个月大的纽西兰白兔分离角膜缘干细胞,且基于DMEM/F-12基础培养基的细胞悬浮培养连续培养14天以达成角膜样上皮细胞分化,如先前所述(Ho等人,2013)。为诱导由高渗应力引起的ROS或MMP-9活性,将细胞在通过添加90mMNaCl达成的高渗培养基(463mOsm)中培育隔夜。在DMEM/F-12基础培养基(309mOsm)中培养的细胞作阴性对照。为检测对高渗应力诱发的ROS或MMP-9活性的预防作用,细胞在NaCl处理前用10μM PDSP预处理20小时。
明胶酶谱法
为检测MMP-9活性,如先前所述的方法(Li等人,2004),使用10μL培养基进行明胶酶谱法。谱带强度用GS-700型号成像密度计(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)在酶谱法中评估并利用Labworks 4.0软件分析。
细胞内ROS及谷胱甘肽含量测定
使用2',7'-二氯二氢荧光黄二乙酸酯(H2DCFDA;Molecular Probes,Eugene,OR)分析细胞内ROS的产生,2',7'-二氯二氢荧光黄二乙酸酯经ROS氧化,会释放绿色荧光化合物2',7'-二氯荧光黄(DCF)。为了利用光谱荧光分析检测ROS,细胞用PBS洗涤后通过NP-40裂解缓冲液(10mM Tris-Cl,pH 7.4,10mM NaCl和0.5%NP-40)进行裂解,并在37℃下于黑暗中与含5μM H2DCFDA的PBS一起培育15分钟。用Spectra MAX GEMINI读取器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA USA)测量荧光(激发,488nm;发射,520nm)。从实验读数中减去来自不添加H2DCFDA的对照孔的背景荧光。
根据制造商的推荐,使用谷胱甘肽分析试剂盒定量GSH水平(BioVision ResearchProducts,Mountain View,CA)。简而言之,在室温下将经高氯酸处理的细胞裂解物与邻苯二醛(o-phthalaldehyde,OPA)探针及GSH缓冲液一起培育40分钟。在340nm(激发)及420nm(发射)下,从SPECTRAmax GEMINI XS荧光微孔板分光光度计(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)读取荧光。
局部PDSP处理恢复由干燥应力诱发的眼表损伤
为判定PDSP对干燥应力(DS)诱发的眼表缺陷是否具有治疗作用,在受控环境室(CEC)中圈养小鼠14天以形成眼表破裂。在CEC中14天后,我们使用荧光分数超过2的小鼠进行首次实验(图1A)。随后,在维持相同干燥应力方案的情况下,用25-200μM(3次/天)的PDSP或PDSP媒介物(含1%CMC的BSS)再局部干眼处理5天。
通过棉线试验的测量(3.8±0.5mm对比5.4±0.4mm;图1B),在第0天,与未受应力(NS)小鼠相比,小鼠的泪液体积平均值显著降低。与媒介物组相比,在用PDSP处理小鼠5天之后,眼睛中的泪液产生显著增加(5±0.3对比4.5±0.2)。
PDSP部分恢复结膜中的杯状细胞数量
杯状细胞主要存在于结膜穹窿的浅上皮中,并负责产生黏液性泪液。NS眼睛的高碘酸希夫(PAS)染色显示杯状细胞在结膜上皮呈连续均匀型态(图2A)。然而,14天的干燥应力后(第0天),结膜的PAS染色显示杯状细胞的数量相比于NS组明显减小(58±3.1对比38±3.2;图2B)。用含PDSP或媒介物的滴眼剂处理5天,与经媒介物处理的对照,经PDSP处理的眼睛中结膜的杯状细胞数显著增多(46±3.8对比37±1.1)。总之,PDSP处理确实挽救了杯状细胞的数量。
局部PDSP预防由干燥应力诱发的眼表损伤
为研究PDSP是否能够抑制DS诱发的角膜上皮破坏,我们对小鼠施加14天的干燥应力方案,并用PDSP一天3次局部处理这些小鼠。14天后,用荧光素染料染色评估角膜上皮缺陷(图3),结果表明,与经PDSP处理的眼睛相比,经媒介物处理的眼睛中的角膜荧光素染色分数显著升高(1.7±0.3对比0.7±0.2)。此结果提示,PDSP对眼表抗干燥应力也表现出预防作用。
干燥应力动物模型中的人及小鼠PDSP的可比功能
为研究人及小鼠中PEDF的相同区是否在治疗DED对象方面是可比的。在小鼠干燥应力诱发的干眼模型中查看人PDSP及鼠PDSP的活性。在应力诱发干眼的小鼠中显示,人及小鼠PDSP都能够恢复使干燥应力诱发的眼表损伤(图11)及泪液产生(图12)。
PDSP抑制干燥应力诱发的炎症反应
已经在实验动物中提出,在干燥应力诱发的干眼中,发炎会使眼表损伤增加(Luo等人,2004;De Paiva等人,2006)。在促炎介质中,已报导用TNF-α或白介素-1(IL-1)阻断剂预处理的小鼠,干燥应力诱发的干眼得到改善[Ji YW 2013;Okanobo A2012]。如图4所示,小鼠在CEC中圈养14天后(设定为第0天;未经处理的小鼠),与在未受应力(NS)环境中圈养的小鼠相比,促炎介质的mRNA水平,包括IL-1β、TNF-α、IL-6和MCP-1,分别显著上调了3.9倍、2.8倍、2.6倍和2.4倍。然而,与媒介物处理组相比,小鼠经局部PDSP处理5天,眼部IL-1β、TNF-α、IL-6和MCP-1的mRNA表达分别以2.4、1.9、2.0和1.7倍的因子被明显抑制。总之,我们的结果表明PDSP减轻DS诱发的眼部炎症反应。
PDSP部分预防脂质过氧化相关的眼表损伤
活性含氧物(ROS)过度产生造成的眼表处氧化损伤与干眼综合征的发病有关(Wakamatsu等人,2013)。我们经由4-HNE免疫组织化学染色研究PDSP是否能够抑制脂质过氧化相关的膜损伤。如图5A中所示,小鼠在CEC中圈养14天后,角膜上皮的4-HNE染色显示上皮之的翼状细胞上的细胞核和/或核周定位与先前的报导(Nakamura等人,2007)一致。NS、媒介物和PDSP组中的4-HNE染色阳性细胞的数目分别为1.9±0.6、20.1±1.4和5.3±1.0(图5B),提示PDSP能够预防脂质过氧化。此外,结膜中的DS诱发的脂质过氧化也利用4-HNE染色及免疫组织化学染色结果评估,这些结果显示4-HNE信号在经媒介物处理的眼睛中比在经PDSP处理的眼睛中明显更强,进一步支持关于PDSP抗氧化作用的发现(图5C)。总之,PDSP处理显著地抑制DS诱发的眼表的氧化损伤。
PDSP预防角膜上皮细胞中的高渗应力诱发的ROS累积及谷胱甘肽耗尽
升高的泪液渗透压被认为是干眼中引发炎症和眼表损伤的核心机制(Stahl等人,2012)。相较于正常眼睛的300-310mOsm,干眼诊断的当前截止值是316mOsm(Liu等人,2009)。然而,在角膜上皮细胞的高渗透压的体外研究中,需要将细胞长期暴露于较高水平的泪液渗透压(350mOsm至500mOsm)以诱导ROS及MMP-9活性(Li DQ 2004;Li J 2016)。
为研究高渗应力对细胞内ROS形成的影响,兔角膜上皮细胞在由添加90mM NaCl形成的高渗培养基(463mOsM)中培养24小时。用H2DCFDA探针检测细胞内ROS水平,并用荧光分光光度计测量DCF荧光的形成
如图6A所示,与细胞在等渗培养基(309mOsm)中培养相比,细胞在高渗培养基中培养24小时后,DCF荧光增加1.6倍。然而,与单独用NaCl处理的细胞相比,经PDSP预处理的兔角膜上皮细胞显示抑制DCF荧光水平1.3倍的因子(P<0.04)。对照肽(ContP)预处理无此作用。与等渗环境中的对照细胞相比,NaCl诱发的高渗应力也明显耗尽谷胱甘肽(GSH,一种抗氧化剂)的水平(图6B;46.7±15.4%对比100±7.0%),而经PDSP再处理的细胞显著增加GSH水平至70.5±11.4%。这些结果提示PDSP对经NaCl诱发的高渗应力(463mOsM)处理的角膜上皮细胞具有抗氧化作用,至少部分经由提高GSH的水平而达成。
PDSP抑制角膜上皮细胞中高渗应力诱发的MMP-9表现
为研究PDSP对角膜上皮细胞中高渗应力诱发的MMP-9表现的作用,用PDSP或对照肽(ConP)预处理细胞20小时,然后使细胞再暴露于高渗培养基(463mOsM)中24小时。如图7A中所示,与在等渗培养基中培养的细胞(未经处理的对照)相比,经ConP/高渗培养基处理的细胞的MMP-9的mRNA水平显著地上调了3倍。然而,PDSP预处理抑制了MMP-9mRNA表达2倍的因子。
明胶酶谱法也证明,与未经处理的对照相比,高渗应力诱发MMP-9活性2.7倍(大小接近90kDa;图7B)。酶谱法进一步显示PDSP预处理抑制MMP-9活性3倍。这些结果提示,PDSP抑制由高渗应力诱发的MMP-9表达和活性。
虽然已用有限数目的实例说明本发明的实施例。本领域技术人员应理解,在不背离本发明之范畴的情况下,其他修改或变型是可能的。因此,保护范围应由所附的权利要求书限定。
序列表
<110> 全福生物科技股份有限公司
李文机
<120> 包含PEDF-衍生的短肽的组合物及其用途
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<151> 2016-10-07
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<220>
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<221> misc_feature
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<212> PRT
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<221> misc_feature
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<212> PRT
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<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
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<212> PRT
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<223> 合成
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<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
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<221> misc_feature
<222> (9)..(11)
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<212> PRT
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<221> misc_feature
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<212> PRT
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<212> PRT
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<222> (6)..(6)
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
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<221> misc_feature
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<222> (11)..(11)
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<213> 人工序列
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<223> 合成
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<221> misc_feature
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Ser Leu Gly Ala Xaa Xaa Arg Thr Glu Ser Xaa Ile His Arg
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
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<222> (11)..(11)
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<400> 72
Ser Leu Xaa Ala Glu Xaa Arg Thr Glu Ser Xaa Ile His Arg
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可为任何天然产生的氨基酸
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<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa可为任何天然产生的氨基酸
<400> 73
Ser Leu Ala Ala Glu Xaa Arg Thr Glu Ser Xaa Ile His Arg
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<210> 74
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成
<220>
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<223> Xaa可为任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa可为任何天然产生的氨基酸
<400> 74
Ser Xaa Gly Ala Glu Xaa Arg Thr Glu Ser Xaa Ile His Arg
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可为任何天然产生的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa可为任何天然产生的氨基酸
<400> 75
Ser Ala Gly Ala Glu Xaa Arg Thr Glu Ser Xaa Ile His Arg
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<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu
1 5 10 15
Tyr Tyr Asp Leu
20
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<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<400> 77
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1 5 10 15
Tyr Tyr Asp Leu Ile Ser
20
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<211> 24
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu
1 5 10 15
Tyr Tyr Asp Leu Ile Ser Ser Pro
20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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ctaccttgtt gcctcctctt t 21
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成
<400> 80
gagcagaggt tcagtgatgt ag 22
<210> 81
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成
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ggtgtgtgac gttcccatta 20
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 82
attgaggtgg agagctttca g 21
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 83
gtctgtagct cattctgctc tg 22
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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gaaggcaact ggatggaagt 20
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 85
ctcggactgt gatgccttaa t 21
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 86
tggatccaca ccttgcattt a 21
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 87
tgcgagtttc cgttcatctt 20
<210> 88
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 88
gtagagcttg tccttgtcgt ag 22
Claims (16)
1.一种用于预防和/或治疗对象眼科疾病的药物组合物,包含肽和药学上可接受的赋形剂,其中所述的肽包括SEQ ID NO:1:S-X-X-A-X-Q/H-X-X-X-X-I/V-I-X-R的序列,其中各X独立地为任何氨基酸。
2.如权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述的肽不包括SLGAEQRTESIIHR(SEQID NO:2)或SLGAEHRTESVIHR(SEQ ID NO:3)的序列。
3.如权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述的肽包括SEQ ID NO:6至75中的任一序列。
4.如权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述的肽的长度由20、22、24或29个氨基酸残基构成。
5.如权利要求1-4中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述的肽在N端被乙酰化修饰或在C端被酰胺化修饰。
6.如权利要求1-4中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述眼科疾病是角膜损伤相关的疾病。
7.如权利要求6所述的药物组合物,其特征在于,所述角膜损伤相关的疾病是干眼综合征。
8.如权利要求5所述的药物组合物,其特征在于,所述肽的浓度为10至200μM。
9.如权利要求5所述的药物组合物,其特征在于,所述组合物为溶液、软膏或凝胶形式。
10.如权利要求5所述的药物组合物,其特征在于,所述对象是人类对象。
11.一种预防和/或治疗眼科疾病的方法,包括向有需要的对象施用如权利要求1-5任一项所述的组合物。
12.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述眼科疾病是角膜损伤相关的疾病。
13.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述角膜损伤相关的疾病是干眼综合征。
14.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述的肽的浓度为10至200μM。
15.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述组合物为溶液、软膏或凝胶形式。
16.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述对象是人类对象。
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