CN112672731A - Pedf衍生的短肽在治疗骨关节炎中的应用 - Google Patents

Pedf衍生的短肽在治疗骨关节炎中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明是关于一种治疗和/或预防骨关节炎的方法，其包括向有需要的个体给予包含PEDF衍生的短肽(PDSP)或该PDSP的变体的药物组合物，该PDSP包含人类色素上皮衍生因子(PEDF)的残基93至106，且其中该PDSP的变体含有该PDSP的丝氨酸‑93、丙氨酸‑96、谷氨酰胺‑98、异亮氨酸‑103、异亮氨酸‑104及精氨酸106且在其他位置处含有一个或多个氨基酸取代，其中，残基位置编号基于人类PEDF。

Description

PEDF衍生的短肽在治疗骨关节炎中的应用
技术领域
本发明是关于PEDF衍生的肽及其在损伤后的肌腱愈合中的用途。
背景技术
骨关节炎(OA)是最常见的关节疾病类型，其是由滑膜关节中的关节软骨的断裂所引起的退化性病症。随着年龄增长，关节软骨在细胞层级(如，软骨细胞)下退化。存在软骨细胞及蛋白聚糖的数量降低，致使软骨厚度的整体降低。关节软骨细胞(AC)的结构及功能的断裂致使骨关节炎，其影响全球数百万人。然而，由于关节软骨细胞没有血管及静止性，AC在较大外伤中的自我愈合的能力具有局限性(Khan等人，2008，软骨整合：软骨修复过程中整合失败原因的评估“Cartilage integration:evaluation of the reasons forfailure of integration during cartilage repair”Eur.Cell.Mater.，2008年9月3日；16:26-39)。另外，软骨频繁损伤，诸如与运动相关的外伤。因此，软骨缺损及早期骨关节炎对于整形外科医生而言是主要的挑战。
骨关节炎为进行性、异质性、退化性关节疾病，且为关节炎的最常见形式，尤其在老年人中。骨关节炎与关节中软骨的断裂有关且可在体内的几乎任何关节中发生。其通常发生在髋、膝和脊柱的承重关节，但也可影响手指、颈部及大脚趾。然而，骨关节炎很少影响其他关节，除非涉及先前的损伤或过度的压力。由于损伤或疾病造成的关节软骨缺损是主要的临床挑战。
在胚胎发育期间，软骨中的软骨细胞分化自间叶细胞。经分化软骨细胞是正常成熟软骨中所发现的唯一细胞类型，其合成足量的软骨特异细胞外基质(ECM)以维持基质整合性。ECM的主要组分为阻碍经由底层骨骼的移动所产生的外加压缩力的II型胶原蛋白、水和聚集蛋白聚糖。
对于OA的治疗选项非常有限。这些治疗包括镇痛剂、非类固醇抗炎药(NSAID)和类固醇或玻尿酸(HA；以改善关节润滑)的关节内注射。物理疗法是一种选项。手术选项范围自关节镜操作至全关节关节造形术。另外，正在研发通过手术操作的同种异体移植体。这些有限的治疗选项可提供一些缓解。然而，仍然存在对用于骨关节炎的较好治疗的需求。
发明内容
本发明的实施方式涉及使用色素上皮衍生因子(PEDF)衍生的短肽用于治疗和/或预防骨关节炎的方法。本发明的一些实施方式涉及用于促进软骨生成的方法。
本发明的一个方面是关于用于治疗和/或预防骨关节炎的药物组合物或方法。根据本发明的实施方式的方法包括向有需要的个体给予包含PEDF衍生的短肽(PDSP)或PDSP的变体的药物组合物，其中，PDSP包含人类色素上皮衍生因子(PEDF)的残基93-106，且其中PDSP的变体含有PDSP的丝氨酸-93、丙氨酸-96、谷氨酰胺-98、异亮氨酸-103、异亮氨酸-104和精氨酸106且在其他位置处含有一个或多个氨基酸取代，其中，残基位置编号基于人类PEDF。PDSP包含SEQ ID NO:1至75中的任一者所示序列。
本发明的一个方面是关于用于促进软骨生成的药物组合物或方法。根据本发明的实施方式的方法包含使多能间叶干细胞与包含PEDF衍生的短肽(PDSP)或PDSP的变体的组合物接触，其中，PDSP包含人类色素上皮衍生因子(PEDF)的残基93-106，且其中PDSP的变体含有PDSP的丝氨酸-93、丙氨酸-96、谷氨酰胺-98、异亮氨酸-103、异亮氨酸-104及精氨酸106且在其他位置处含有一个或多个氨基酸取代，其中，残基位置编号基于人类PEDF。PDSP包含SEQ ID NO:1至75中的任一者所示序列。
本发明的其他方面通过以下详细描述及所附权利要求将变得显而易见。
附图说明
图1展示29-聚体及玻尿酸对MIA诱导的大鼠后爪承重分布变化模型的效应。大鼠右(骨关节炎)膝经注射1mg单碘乙酸盐(MIA)且左(对侧对照组)膝经注射生理盐水。29-聚体及1％HA治疗在MIA注射后第8天进行，进一步持续2周。后爪重量分布(承重)的变化通过使用失能测试仪来评估。给出的值表示各治疗组的至少3只大鼠的平均值±SE。与未经治疗组相比，*P<0.05。
图2展示29-聚体PDSP(PEDF衍生的短肽)对MIA损伤关节软骨影响的组织学分析结果。大鼠膝关节注射一次MIA。载剂/HA及29-聚体/HA治疗在MIA注射后第8天进行，进一步持续2周。来自三个独立实验的关节软骨的H&E染色切片的代表性显微照片。F：股骨髁；T：胫骨髁，M：半月板。*指示股骨胫骨关节及右图中的外侧胫骨软骨的放大视图。箭头指示坏死软骨细胞。
图3展示大鼠MSC的软骨生成分化持续3周后，富含葡糖胺聚糖的细胞外基质通过艾尔逊(Alcian)蓝染色的半定量分析结果。MSC在补充有不同29-聚体变体(10μM)的软骨生成分化培养基中培育14天。通过氯化胍萃取的艾尔逊蓝的OD值显示与微团的总DNA含量相关。数据表示为平均值±SE。分别表示OD值≤0.16及0.25的黑色及灰色柱指示完全及部分地损害29-聚体的促进软骨生成活性的突变。
图4展示29-聚体变体对MIA诱导的大鼠后爪承重分布变化模型的效应。大鼠右(骨关节炎)膝经注射1mg MIA且左(对侧对照组)膝经注射生理盐水。29-聚体/HA、29-聚体变体/HA及载剂/HA治疗在MIA注射后第8天进行，进一步持续2周。后爪承重变化通过使用失能测试仪来评估。给出的值表示各治疗组的至少3只大鼠的平均值±SE。
图5展示PDSP诱导的软骨生成细胞在损伤关节软骨中以剂量依赖型方式增殖的结果。(A)上部图：在29-聚体治疗后第14天的细胞复制的组织学分析。标本经BrdU染色以指示DNA复制(深棕色)。初始放大率，200×。下部图：代表性图像展示Sox9的表达(绿色；软骨细胞的标记)且通过双重免疫染色分析来检定关节软骨中的BrdU(红)。初始放大率，1000×。(B)评估每一软骨区域范围的BrdU阳性细胞的数量。与载剂/HA组相比，*P<0.001。
图6展示29-聚体变体对MIA诱导OA的大鼠模型中的损伤关节软骨的细胞分裂效应。大鼠右(骨关节炎)膝经注射1mg MIA且左(对侧对照组)膝经注射生理盐水。29-聚体/HA、29-聚体变体/HA及载剂/HA治疗在MIA注射后第8天进行，进一步持续2周。膝关节经BrdU染色以识别增殖性细胞。计数膝关节切片的软骨区域上的各视野的BrdU阳性细胞(初始放大率×100)。自6个切片/膝关节标本评估总BrdU+细胞，各组中具有3只大鼠。
具体实施方式
本发明的实施方式是关于使用PEDF衍生的短肽(PDSP)预防和/或治疗骨关节炎的方法。本发明是基于出人意料的发现：由色素上皮衍生因子(PEDF)衍生的某些短肽可通过诱导间叶细胞分化以形成软骨细胞来减轻骨关节炎中的疼痛且赋予关节软骨修复。
骨关节炎为一种由滑膜关节中的关节软骨(AC)的断裂所引起的退化性病症。然而，由于关节软骨细胞没有血管及静止性，AC自愈的能力具有局限性。正常成熟软骨包含在胚胎发育期间由间叶细胞分化的软骨细胞。作为正常成熟软骨中发现的唯一细胞类型的经分化软骨细胞会合成足量的软骨特异细胞外基质(ECM)以维持基质整合性。
人类色素上皮衍生因子(PEDF)为含有418个氨基酸、分子量为约50kDa的分泌蛋白。PEDF为具有许多生物功能的多功能蛋白(参见例如，美国专利申请公开号2010/0047212)。发现PEDF的不同肽区域负责不同功能。举例而言，已鉴定34-聚体片段(PEDF的残基44-77)具有抗血管生成活性，同时已鉴定44-聚体片段(PEDF的残基78-121)具有神经营养特性。
本发明的发明人发现PEDF的某些短肽可减轻骨关节炎中的疼痛。进一步发现疼痛减轻起因于这些PDSP诱导软骨再生的能力。发明人展示PDSP可诱导软骨中或周围存在的多能间叶干细胞(MSC)分化成软骨细胞。即，这些PDSP可促进软骨生成。此可解释PDSP诱导软骨再生及疼痛减轻的能力。
如上文所提及，间叶细胞分化成软骨细胞通常发生在胚胎发育中。在软骨中，间叶干细胞失去其多能性且增殖以形成软骨生成细胞的密集型聚集体，该密集型聚集体随后分化成软骨原细胞，该软骨原细胞合成软骨细胞外基质(ECM)。软骨原细胞变为成熟软骨细胞，该成熟软骨细胞通常不活动但仍可根据条件分泌且降解基质。因此，PDSP可诱导间叶细胞(软骨中或周围)以在软骨中产生软骨细胞的发现是真正出人意料的。
本发明的PDSP是基于对应于人类PEDF残基93-121(93SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT121；SEQ ID NO:1)的肽区域。基于此29-聚体，发明人鉴定丝氨酸-93、丙氨酸-96、谷氨酰胺-98、异亮氨酸-103、异亮氨酸-104和精氨酸-106对于活性而言是至关重要的，如由当这些残基单独地经丙氨酸(或丙氨酸-96的甘氨酸)替换时活性显著降低证实。相反，29-聚体中的其他残基的丙氨酸(或甘氨酸)替代并未明显地改变活性，从而表明在这些其他残基(如，残基94、95、97、99-102、105和107-121)处具有氨基酸取代(特定地，同源氨基酸取代)的PDSP变体也可用于预防和/或治疗骨关节炎，或用于诱导软骨生成。
这些结果表明含有镇痛作用的核心肽位于包含残基93-106(93SLGAEQRTESIIHR106；SEQ ID NO：2)的区域中。因此，具有抗伤害感受活性的最短PDSP肽可为14聚体。本领域技术人员将了解在C和/或N端向此核心肽添加额外氨基酸不应影响此活性。即，本发明的PDSP可为包含人类PEDF的残基93-106的任何肽。因此，用于本发明的PDSP肽可为14-聚体、15-聚体、16-聚体等，包括实验中使用的29-聚体。
此外，如上文所提及，这些短肽内的取代可保留活性，只要保留关键残基(丝氨酸-93、丙氨酸-96、谷氨酰胺-98、异亮氨酸-103、异亮氨酸-104和精氨酸-106)即可。另外，小鼠变体(其具有两个取代：组氨酸-98及缬氨酸-103，与人类序列相比)也为活性的。相应的小鼠序列为：mo-29聚体(SLGAEHRTESVIHRALYYDLITNPDIHST，SEQ ID NO:3)及mo-14聚体(SLGAEHRTESVIHR，SEQ ID NO:4)。因此，活性核心的通用序列为(93S-X-X-A-X-Q/H-X-X-X-X-I/V-I-X-R106，其中，X表示任何氨基酸残基；SEQ ID NO:5)。
本发明的PDSP肽可使用蛋白质/肽表达系统化学方式合成或表达。这些PDSP肽可用于预防和/或治疗骨关节炎的药物组合物中。药物组合物可包含任何药学上可接受的赋形剂，且药物组合物可配制为适用于给予的形式，诸如局部施用、口服施用、注射等。用于此类应用的各种制剂为本领域中已知的且可用于本发明的实施方式。
本发明的一些实施方式是关于用于治疗和/或预防受试个体(例如，人、宠物或其他个体)的骨关节炎的方法。如本文所使用，术语“治疗(treat/treating)”包括病况的部分或完全好转，其可包括或可不包括完全治愈。该方法包含向个体给予药物组合物，其中，药物组合物包含有效量的本发明的PDSP(包括PDSP的活性变体)。本领域技术人员将了解有效量将取决于个体的状态(例如，体重、年龄等)、投药途径及其他因素。发现此类有效量仅涉及常规技术且本领域技术人员将不需要创造性的努力或过度实验以发现有效量。
本发明的实施方式将通过以下具体实施例以说明。在具体实施例中，使用29聚体(SEQ ID NO:1)。然而，其他PDSP(例如，14聚体，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3等)也可用于实现相同结果。本领域技术人员将了解，这些实施例仅用于说明且变化及修改在不背离本发明的范围的情况下是可能的。
材料及方法
达尔伯克(Dulbecco)改良的伊格尔(Eagle)培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、0.25％胰蛋白酶及抗生素购自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)。玻尿酸(HA)、单碘乙酸盐(MIA)、二甲亚砜(DMSO)、珀可(Percoll)、胰岛素、氢化可的松、牛血清白蛋白(BSA)、5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)、赫斯特(Hoechst)33258染料和艾尔逊蓝8-GX均来自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。抗BrdU及抗SOX9抗体来自GeneTex。所有荧光染料结合的二抗购自BioLegend(San Diego，CA，USA)。苏木精及曙红(H&E)染料购自Merck(Rayway，NJ，USA)。合成性PEDF肽经合成，且为了维持稳定性，通过在NH2端乙酰化和/或在COOH端酰胺化加以修饰。合成性PEDF肽在GenScript(Piscataway，NJ)用质谱(>95％纯度)表征。各PEDF衍生的合成肽在DMSO中重构成原液(5mM)。
本研究中使用的所有动物圈养于在温度控制(24℃至25℃)及12:12明暗循环下的动物房中。标准实验室食物及自来水可任意获得。实验程序经麦凯恩纪念医院审查委员会(Mackay Memorial Hospital Review Board)批准，且按照台湾地区相关动物福利法规进行。
动物骨关节炎模型及治疗
10周龄的成年雄性史泊格多利(Sprague-Dawley)大鼠(初始体重＝312±11g)通过腹膜内注射甲苯噻嗪(10mg/kg)进行麻醉。之后，其右膝各自通过单独关节内注射含1mgMIA的25μl无菌生理盐水来治疗。在腿在膝骨处弯曲90°的情况下，使用27G针头经由髌骨韧带注射溶液。在MIA注射之后七天，小鼠经随机分配至不同实验组(各组n≥3)。为治疗MIA诱导OA的大鼠模型，将PDSP肽溶解于25μl的1％HA中，且肽溶剂DMSO用作载剂/HA对照。
评估后爪重量分布的变化
右(骨关节炎)及左(对侧对照)肢之间的后爪重量分布的变化用作骨关节炎膝中关节不适的指标。采用失能测试仪以测定后爪重量分布，如先前所描述(Bove等人，负重作为一种疾病进展的测量方法和抗炎化合物在碘乙酸单钠诱导的骨关节炎模型中的疗效“Weight bearing as a measure of disease progression and efficacy of anti-inflammatory compounds in a model of monosodium iodoacetate-inducedosteoarthritis”.Osteoarth Cart.，2003；11:821-830)。大鼠经置放于成角度置放的塑料玻璃腔室中，使得各后爪静置在单独的力板上。通过各后肢施加的力(以克为单位)在5秒时间段内为平均。各数据点为三个5秒读数的平均值。后爪重量分布的变化通过测定施加在测试者左肢与右肢之间的重量(g)差来计算。结果呈现为左(对侧对照组)肢与右(骨关节炎)肢之间的承重差或为基线读数与治疗后读数之间的百分比差，如使用以下等式计算：
(1-(治疗组的平均Δ重量/载剂组的平均Δ重量))×(100)
间叶干细胞(MSC)的分离及培养
8周龄的成年雄性史泊格多利(Sprague-Dawley)大鼠通过腹膜内注射甲苯噻嗪(10mg/kg)进行麻醉。之后，以无菌方式采集其股骨，在PBS及抗生素的混合物中洗涤5分钟，且随后将该多个股骨自所有软组织上剥离，在其骺处横切，且用肝素(AGGLUTEX INJ5000U/ML 5ML；工作浓度100U/ml)及DMEM的混合物反复地冲洗其骨髓空腔。收集所采集的细胞，通过吸液分散且于室温下以1000×g离心5分钟。用DMEM使细胞集结粒再悬浮，且随后将细胞悬浮液转移至含有5ml珀可(Percoll)(1.073g/ml)的15ml离心管。以1500×g离心30分钟之后，获得中间层中的单核细胞，用PBS洗涤三次，且随后用10％热灭活FBS及1％青霉素/链霉素悬浮于低葡萄糖DMEM中。随后将细胞置放于75-cm2烧瓶(Corning，MA，USA)中且在37℃下在95％空气及5％CO2下培育。每4天更换培养基。丢弃未附着细胞且保留粘附细胞。初级MSC在培养1周之后生长至大约80％至90％汇合。
MSC的软骨生成分化
将5×103个经扩展MSCs置放于96孔板的各孔中，且暴露于补充有10ng/ml TGF-β3(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)及10μM PDSP肽的150μl软骨生成培养基(较高葡萄糖DMEM，含有100nM地塞米松、0.17mM抗坏血酸-2磷酸盐、10μg/ml胰岛素、5μg/ml转铁蛋白、5ng/ml硒、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺和2％FBS)中。培养基每3天更换，且将细胞培养2周。
膝关节的组织学研究
剥离膝关节且切除周围软组织。标本经固定在4％多聚甲醛(PFA)溶液中，且随后用Shandon TBD-2脱钙剂(Thermo Scientific，Logan，UT)脱钙。随后将关节以正中矢状地方式切开且嵌设于石蜡块中。切片(5μm厚)为纵向切割且用苏木精及曙红(H&E)染色或用于免疫组织化学研究。每膝20个切片经仔细制作以便包括大部分严重退化区域。
DNA合成的活体内检测
为检测细胞增殖，将BrdU在DMSO中重构成原液(80mM)。在MIA注射7天(如，将MIA注射后的第7天设定为第0天)后的第1天、第4天、和第8天，与350μl PBS混合的150μl BrdU经腹膜内注射至大鼠。DNA合成是通过BrdU标记来评估，如用抗BrdU抗体检测。
免疫荧光法及BrdU染色
为检测活体内的DNA合成，石蜡包埋关节标本在二甲苯中脱蜡且在分级的乙醇系列中再水合，且随后于室温下暴露于1N HCl中1小时，以用于后续的免疫组织化学。随后用10％山羊血清及5％BSA封闭组织切片1小时。免疫染色使用抗SOX9(1:100稀释)及BrdU(1:100稀释)的一抗在37℃下进行2小时，随后于室温下与适合的若丹明(rhodamine)或FITC偶联驴IgG一起培育1小时。通过用赫斯特(Hoechst)33258对比染色7分钟来定位细胞核。使用具有CCD摄影机的Zeiss落射荧光显微镜来捕获影像且自各样本中的20个任意选择的区域进行测量，且通过在各切片内的手动计数重复三次执行盲定量。
脱蜡的膝关节标本也用10％山羊血清封闭60分钟，且随后与抗BrdU的抗体一起培育。随后，将切片与适合的过氧化酶标记的山羊免疫球蛋白(1:500稀释；Chemicon，Temecula，CA)一起培育20分钟，且随后在用苏木精对比染色之前与色素原基质(3,3'-二氨基联苯胺)一起培育2分钟。
艾尔逊蓝(Alcian)染色及定量
对于艾尔逊蓝染色，将培养基用PBS冲洗两次，在4％(w/v)多聚甲醛中固定15分钟，且随后如先前所描述在含1％(w/v)艾尔逊蓝8-GX(Sigma)的0.1N HCl(pH1.0)中培育隔夜(Ji Y.H.等人，iTRAQ标记结合在线二维LC/MS/MS定量蛋白质组学分析C3H10T1/2间充质干细胞向软骨分化“Quantitative proteomics analysis of chondrogenicdifferentiation of C3H10T1/2mesenchymal stem cells by iTRAQ labeling coupledwith on-line two-dimensional LC/MS/MS”，Mol.Cell.Proteom.，2010，9(3)：550-564.)。对于半定量分析，在室温下用6M盐酸胍萃取经艾尔逊蓝染色培养物2小时。所萃取染料的吸收在酶标仪(Bio-Rad)中在650nm处测量。为测量DNA含量，将100μL萃取物与100μL 0.7μg/ml赫斯特33258(Sigma-Aldrich)在水中混合。在Ex/Em：340nm/465nm下读取荧光，且与经认证的小牛胸腺超声处理DNA标准(Sigma-Aldrich)的荧光相比较。
统计
结果表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。使用单因子变异数分析以进行统计比较。除非另外规定，否则P<0.05视为显著的。
PDSP展现镇痛作用以改善OA动物的关节不适
膝骨关节炎(OA)为常见的慢性退化性疾病，特征为关节软骨的缺失。据报导将糖酵解的抑制剂MIA注射至啮齿动物的股骨胫骨关节间隙以诱导类似于人类OA中所发现的AC缺失(Bove等人，2003)。另外，已确定将MIA注射至大鼠膝关节引起关节不适的剂量及时间依赖增加，其由MIA注射肢的后爪负重移位界定。
为研究PDSP(PEDF短肽)是否具有镇痛作用以改善关节不适，对10周龄雄性史泊格多利(Sprague-Dawley)大鼠(n＝15)进行关节内注射1mg MIA(溶解于25μl无菌生理盐水中)至右关节中以诱导最大程度的重量转移(自右腿至左腿)且随后用于研究29-聚体PDSP(SEQ ID NO:1)的药理学反应。在MIA注射7天(设定为第0天)之后，将小鼠随机分配至4个实验组(各组n＝3)且按以下进一步治疗14天：(I)PDSP载剂溶解于混合有PDSP载剂的25μl1％玻尿酸(HA)中，(II)PDSP 29-聚体/HA(最终浓度0.2mM PDSP与1％HA)，(III)仅PDSP29-聚体(推注)。在第1天、第4天、第8天和第12天(每周两次)借助于单关节内注射一次来施加治疗。为测试在治疗频率降低的情况下的治疗效果，在第1天及第8天对第IV组(29-聚体/HA)进行关节内注射一次(如，每周一次)。
如图1中所示，结果显示与载剂/HA组相比较，29-聚体PDSP治疗显著减小MIA诱导的重量转移(第II组及第IV组与第I组相比：63.3±12.5％及58.1±4.6％对比75.9±4.7％；P<0.05)。在另一方面，快速注射组不能降低MIA诱导的后爪承重分布变化(77.2±1.2％)。这些结果表明与玻尿酸组合的29-聚体PDSP对大鼠中的MIA诱导的关节不适展现出镇痛作用。29-聚体PDSP推注结果也暗示在不存在玻尿酸的情况下，29-聚体PDSP可迅速渗入至体循环。
已确定注射MIA的大鼠膝关节可在MIA治疗后第7天以迅速及可复制的方式引起广泛的软骨细胞变性/坏死。因此，我们进一步研究自载剂/HA治疗组及29-聚体/HA治疗组的大鼠股骨胫骨关节的组织病理学特征。
如图2中所描绘，载剂/HA治疗组展示外侧胫骨中的软骨整合性的缺失及软骨下骨骼塌陷，而29-聚体/HA治疗组显示良好的表面连续性。在显微镜下，载剂/HA治疗组展示软骨细胞自软骨的表面区域消失，且分散的细胞丛广泛地出现在移动区域及辐射状区域中。相反，29-聚体/HA治疗组展示大量新生成的软骨细胞占据整个软骨。组织学数据表明29-聚体PDSP诱导软骨再生的能力可部分归因于减轻OA疼痛。
29-聚体促进MSC的软骨生成活性及活体内软骨生成细胞增殖
多能间叶干细胞(MSCs)的软骨生成潜能使其为用于软骨缺损的基于细胞的疗法的有前景来源(M.F.Pittenger等人，1999，成人骨髓间充质干细胞的多向分化潜能“Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells”，Science，284(5411)：143-7)。此外，可诱导常驻MSC对软骨损伤的反应以进行软骨愈合的软骨生成分化(T.B.Kurth等人，2011，成年小鼠膝关节滑膜间充质干细胞功能龛位的研究“Functionalmesenchymal stem cell niches in adult mouse knee joint synovium in vivo”，Arthritis Rheum.，63(5)：1289-300)。在培养基中，我们的数据展示色素上皮衍生因子(PEDF)衍生的短肽(29-聚体；位置Ser93-Thr121)在存在含有100nM地塞米松及10ng/mlTGF-β3的限定培养基下，展现出对MSC的体外软骨生成促进活性。
具有单个丙氨酸或甘氨酸变异的29-聚体PDSP的丙氨酸扫描数据
在此研究中，设计且合成沿29-聚体序列对丙氨酸或甘氨酸的单个残基取代以仔细分析29-聚体中的用于软骨生成促进活性的关键残基。基于位于93-121的PEDF的氨基酸序列总共合成29个肽变体，其包括具有单个丙氨酸变异的27个变体及具有单个甘氨酸变异(A96G及A107G)的2个变体。为评估大鼠MSC在经地塞米松(dexamethason)、TGF-β3及29-聚体变体处理的培养基中的软骨生成，通过艾尔逊蓝染色检测葡糖胺聚糖(GAG)(成熟软骨细胞的标记)的表达水平。
如图3中所示，在限定培养基(含有地塞米松及TGF-β3)中的MSC暴露于10μM 29-聚体变体21天，接着使用艾尔逊蓝染色来分析硫酸化GAG。结果展示与DMSO溶剂对照组相比，在用29-聚体PDSP处理的MSC培养基中染色强度明显提高，如由在OD 650nm下量化艾尔逊蓝阳性材料证实(0.34±0.013对比0.15±0.024)。结果还显示S93A(0.12±0.015)、A96G(0.14±0.023)、Q98A(0.14±0.017)、I103A(0.15±0.013)、I104A(0.15±0.027％)和R106A(0.16±0.029)突变严重减弱29-聚体PDSP在MSC上的软骨生成促进活性(0.12-0.16对比0.34)。这些结果表明29个氨基酸中的6个可能对于29-聚体活性为关键的。
另外，L94A(0.22±0.032)、E97A(0.25±0.023)、R99A(0.2±0.02)、A107G(0.23±0.035)和P116A(0.23±0.029)突变引起29-聚体PDSP(O.D.0.2～0.25对比0.34)的软骨生成促进活性的部分降低。其余取代并不显著影响29-聚体PDSP(O.D.>0.26)的软骨生成促进活性。
总体而言，丙氨酸扫描数据表明29-聚体(SEQ ID NO:1)对MSCs的软骨生成促进效应受到氨基酸取代的影响且核心肽为14聚体(SEQ ID NO:2)。此外，就诱导MSC软骨生成分化而言，处于位置93、96、98、103、104和106的29-聚体PDSP可不经取代而不影响其功能。在另一方面，29-聚体PDSP序列中的其余氨基酸残基在不影响29-聚体PDSP功能的情况下，相对于单个氨基酸取代显示更大的灵活性。因此，最小核心肽可表示为93S-X-X-A-X-Q/H-X-X-X-X-I/V-I-X-R106，其中，X表示任何氨基酸残基(SEQ ID NO:5)。可与本发明的实施方式一起使用的PDSP序列的几个实施例展示于下表中(位置编号是基于14聚体中的位置)。这些实施例并不意谓限制。
Figure GDA0002967401000000111
Figure GDA0002967401000000121
Figure GDA0002967401000000131
29-聚体变体在实验性OA的大鼠模型中的效应
29-聚体PDSP变体对MIA诱导的后爪负重移位的镇痛作用
在动物研究中，29-聚体PDSP变体经配制至1％HA中达至0.2mM的最终浓度，且随后在MIA注射后第1天及第8天各自借助于单个关节内注射来施用。在29-聚体变体治疗14天后，用失能测试仪评估29-聚体变体(各组n＝3)对MIA诱导的后爪负重移位的镇痛作用。
如图4中所示，与载剂/HA治疗组相比，29-聚体/HA治疗显著减小MIA诱导的负重移位(22.0±0.66％对比47.1±3.7％；P<0.0004)。H105A变体也能够减小MIA诱导的重量转移(21.4±1.4％)。重要地，用S93A、A96G、Q98A、I103A、I104A和R106A变体治疗对降低MIA诱导的后爪负重移位无效应(值在45％至51％之间)。动物研究结果表明那些关键残基在维持29-聚体PDSP的镇痛作用中起关键作用且在非关键性位点处的取代不影响PDSP的活性。
29-聚体变体对Sox9阳性软骨细胞增殖的效应
我们在MIA注射7天(设定为第0天)后的第1天开始BrdU治疗以在用0.2mM29-聚体/HA治疗时很快地监测细胞增殖。如图5A(上部图)中所示，在29-聚体/HA治疗组中几乎所有再生软骨样组织含有BrdU阳性细胞。然而，载剂/HA治疗膝的软骨表面上几乎不存在BrdU阳性细胞，进而表明在MIA治疗之后几乎所有软骨细胞都注定会导致坏死细胞死亡。
转录因子Sox9通过导引软骨细胞特异性基因的表达在干/祖细胞软骨生成中起重要作用。Sox9的免疫染色发现BrdU阳性细胞也为Sox9阳性，进而表明BrdU阳性细胞通过29-聚体潜在地朝向软骨细胞发育诱导(图5A；下部图)。与载剂/HA治疗相比，0.2mM 29-聚体治疗显示出诱导BrdU阳性软骨细胞在再生软骨中扩增的显著能力(图5B；346±57对比7±3；P<0.001)。总体而言，这些结果表明29-聚体可诱导软骨生成细胞增殖以愈合软骨。
接下来，在29-聚体治疗14天之后，我们检测29-聚体变体对关节软骨诱导细胞增殖的能力。膝关节的BrdU免疫染色显示在29-聚体/HA及H105A/HA治疗组的软骨区域中可检测到大量BrdU阳性细胞，而来自载剂/HA治疗的那些含有较少BrdU阳性细胞(图6；346±57及297±22对比7±3)。在另一方面，用S93A、A96G、Q98A、I103A、I104A和R106A治疗并未增加软骨处的BrdU阳性细胞(值在30至62之间)。此动物研究证实，那些关键残基对维持29-聚体PDSP生物活性起关键作用。
综合而言，丙氨酸扫描数据表明29-聚体的治疗效应受到所选择的氨基酸取代影响，如骨关节炎的大鼠模型所证明的。此外，处于位置S93、A96、Q98、I103、I104和R106的29-聚体残基在OA治疗中对于29-聚体PDSP活性而言是重要的，而其他残基可经取代而不显著影响活性。
本发明的实施方式已经以有限数目的实施例来说明。本领域技术人员将了解在不背离本发明的范围下可进行变化或修改。因此，本发明的范围应仅由随附权利要求范围限制。

Claims (10)

1.一种用于治疗和/或预防骨关节炎的药物组合物，包含：PEDF衍生的短肽(PDSP)或其变体，其中，该PDSP包含人类色素上皮衍生因子(PEDF)的残基93-106，且其中该PDSP的变体含有该PDSP的丝氨酸-93、丙氨酸-96、谷氨酰胺-98、异亮氨酸-103、异亮氨酸-104和精氨酸-106，且在其他位置处含有一个或多个氨基酸取代，其中，残基位置编号基于人类PEDF。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，该PDSP包含S-X-X-A-X-Q/H-X-X-X-X-I/V-I-X-R(SEQ ID NO:5)的序列。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，该PDSP包含SLGAEQRTESIIHR(SEQ IDNO:2)的序列。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，该PDSP包含SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT(SEQ ID NO:1)的序列。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，该PDSP包含SEQ ID NO:6至75中的任一者所示序列。
6.一种用于促进软骨生成的药物组合物，其包含：PEDF衍生的短肽(PDSP)或其变体，其中，该PDSP包含人类色素上皮衍生因子(PEDF)的残基93-106，且其中该PDSP的变体含有该PDSP的丝氨酸-93、丙氨酸-96、谷氨酰胺-98、异亮氨酸-103、异亮氨酸-104和精氨酸106且在其他位置处含有一个或多个氨基酸取代，其中，残基位置编号基于人类PEDF。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，该PDSP包含S-X-X-A-X-Q/H-X-X-X-X-I/V-I-X-R(SEQ ID NO:5)的序列。
8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，该PDSP包含SLGAEQRTESIIHR(SEQ IDNO:2)的序列。
9.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，该PDSP包含SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT(SEQ ID NO:1)的序列。
10.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，该PDSP包含SEQ ID NO:6至75中的任一者所示序列。
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