EA037698B1 - Композиции, содержащие короткие пептиды, полученные из pedf, и их применение - Google Patents
Композиции, содержащие короткие пептиды, полученные из pedf, и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- EA037698B1 EA037698B1 EA201990885A EA201990885A EA037698B1 EA 037698 B1 EA037698 B1 EA 037698B1 EA 201990885 A EA201990885 A EA 201990885A EA 201990885 A EA201990885 A EA 201990885A EA 037698 B1 EA037698 B1 EA 037698B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- pdsp
- peptide
- cells
- stress
- mice
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims abstract description 4
- 208000003556 Dry Eye Syndromes Diseases 0.000 claims description 83
- 206010013774 Dry eye Diseases 0.000 claims description 64
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 39
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 28
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 208000028006 Corneal injury Diseases 0.000 claims description 11
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 11
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 claims 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 claims 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 claims 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 45
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 45
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 44
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 32
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 30
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 28
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 28
- 108090000102 pigment epithelium-derived factor Proteins 0.000 description 27
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 25
- JVJFIQYAHPMBBX-UHFFFAOYSA-N HNE Natural products CCCCCC(O)C=CC=O JVJFIQYAHPMBBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 24
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 23
- 102100035846 Pigment epithelium-derived factor Human genes 0.000 description 22
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 22
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 22
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 19
- JVJFIQYAHPMBBX-FNORWQNLSA-N (E)-4-hydroxynon-2-enal Chemical compound CCCCCC(O)\C=C\C=O JVJFIQYAHPMBBX-FNORWQNLSA-N 0.000 description 17
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 12
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 11
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 9
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 9
- 230000004489 tear production Effects 0.000 description 9
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 9
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 8
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 8
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 7
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 6
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 6
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 5
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 4
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 4
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 210000003560 epithelium corneal Anatomy 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 206010011026 Corneal lesion Diseases 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 3
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 3
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 3
- 102220610750 Thialysine N-epsilon-acetyltransferase_Q98A_mutation Human genes 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000007804 gelatin zymography Methods 0.000 description 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 102220037837 rs76224028 Human genes 0.000 description 3
- 238000004347 surface barrier Methods 0.000 description 3
- 238000007805 zymography Methods 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 2
- 206010023332 keratitis Diseases 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- VQVUBYASAICPFU-UHFFFAOYSA-N (6'-acetyloxy-2',7'-dichloro-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) acetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Cl)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(Cl)C(OC(=O)C)=C1 VQVUBYASAICPFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VFNKZQNIXUFLBC-UHFFFAOYSA-N 2',7'-dichlorofluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Cl)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(Cl)C(O)=C1 VFNKZQNIXUFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXEZTIWVRVSYOK-UHFFFAOYSA-N 2-(3,6-diacetyloxy-2,7-dichloro-9h-xanthen-9-yl)benzoic acid Chemical compound C1=2C=C(Cl)C(OC(=O)C)=CC=2OC2=CC(OC(C)=O)=C(Cl)C=C2C1C1=CC=CC=C1C(O)=O PXEZTIWVRVSYOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 206010011013 Corneal erosion Diseases 0.000 description 1
- 206010055665 Corneal neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 206010011039 Corneal perforation Diseases 0.000 description 1
- 206010054760 Corneal thinning Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 206010015943 Eye inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 101000668058 Infectious salmon anemia virus (isolate Atlantic salmon/Norway/810/9/99) RNA-directed RNA polymerase catalytic subunit Proteins 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 201000002287 Keratoconus Diseases 0.000 description 1
- 102000001776 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 206010054949 Metaplasia Diseases 0.000 description 1
- 101001076414 Mus musculus Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000648740 Mus musculus Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220465425 Protein arginine N-methyltransferase 1_L93A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 206010040844 Skin exfoliation Diseases 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010064996 Ulcerative keratitis Diseases 0.000 description 1
- 206010047513 Vision blurred Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 1
- 210000003239 corneal fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 201000000159 corneal neovascularization Diseases 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000035618 desquamation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- NJDNXYGOVLYJHP-UHFFFAOYSA-L disodium;2-(3-oxido-6-oxoxanthen-9-yl)benzoate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=O)C=C2OC2=CC([O-])=CC=C21 NJDNXYGOVLYJHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008378 epithelial damage Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000003960 inflammatory cascade Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 206010023365 keratopathy Diseases 0.000 description 1
- 210000004561 lacrimal apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004175 meibomian gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000015689 metaplastic ossification Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/55—Protease inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Фармацевтическая композиция для лечения офтальмологического заболевания у субъекта включает пептид и фармацевтически приемлемый наполнитель, где пептид содержит последовательность SEQ ID NO:1: S-X-X-A-X-Q/H-X-X-X-X-I/V-I-X-R, где каждый X независимо представляет собой любую аминокислоту.
Description
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно заявке на патент США № 62/405522, поданной 7 октября 2016 г., раскрытие которой включено во всей полноте посредством ссылки.
Известный уровень техники
Область техники, к которой относится изобретение.
Изобретение относится к коротким пептидам, полученным из PEDF, и их применению для лечения и/или улучшения течения глазных заболеваний, в частности заболеваний сухого глаза.
Предшествующий уровень техники.
Заболевание или синдром сухого глаза (DED или DES), также известное как сухой кератит, являются сложным заболеванием, которое вызывает симптомы дискомфорта, нарушения зрения и нестабильности слезной пленки, что создает потенциал для повреждения поверхности глаза. Сухие глаза сопровождаются повышенной осмоляльностью слезной пленки и воспалением поверхности глаза. Степень тяжести признаков/симптомов сухого глаза также очень варьируется среди пациентов. В то время как некоторые пациенты испытывают лишь незначительное раздражение, другие сталкиваются со значительными осложнениями, которые приводят к серьезным повреждениям роговицы и нарушению зрения.
Заболевание сухого глаза (DED) или синдром сухого глаза (DES), также известное как сухой кератит, представляет собой мультифакториальное заболевание поверхности глаза, которое влияет на составы слезной пленки (липидные, водные и муциновые), на поверхность глаза или выработку слезной жидкости, что приводит к глазной сухости, ощущению инородного тела, раздражению и боли. DED может возникать по разным причинам, которые влияют на выработку любого состава слезной жидкости или стабильность слезной пленки (например, быстрое испарение слез).
Кроме того, гиперосмолярность слезной жикости, нестабильность слезной пленки, недостаточная поддержка целостности эпителия поверхности глаза также могут вызывать сухие глаза.
Состояние гиперосмолярности слезной жидкости может потенциально повредить и стимулировать каскад воспаления эпителиальных клеток глаза, что приводит к потере поверхностных эпителиальных клеток, в том числе бокаловидных клеток конъюнктивы. Потеря бокаловидных клеток снижает секрецию муцина, что впоследствии приводит к потере защиты на поверхности эпителия и нестабильности слезной пленки, и, в конечном итоге, приводит к развитию симптомов сухого глаза, а также к повреждению клеток эпителия роговицы. Эта последующая нестабильность слезной пленки часто приводит к хроническому циклу воспаления и повреждению поверхности глаза, которые вызывают DED.
Существует колоссальная неудовлетворенная потребность в лечении этого многофакторного расстройства глаз у пациентов с DED. В настоящее время доступно несколько вариантов лечения для пациентов с DED, включая слезозаменитель, противовоспалительные препараты и анальгетики. Несмотря на то, что эти методы лечения могут облегчить некоторые симптомы у некоторых пациентов, крайне желательны более эффективные средства лечения и профилактики DED.
Сущность изобретения
Варианты осуществления изобретения относятся к реактивам и способу профилактики и/или лечения сухих глаз.
Один аспект изобретения относится к фармацевтическим композициям для лечения офтальмологического заболевания у субъекта. Фармацевтическая композиция по одному из вариантов осуществления изобретения содержит пептид и фармацевтически приемлемый наполнитель, где пептид содержит последовательность SEQ ID NO: 1:
S-X-X-A-X-Q/H-X-X-X-X-I/V-I-X-R , где каждый X независимо представляет собой любую аминокислоту, при условии, что пептид не содержит последовательность SLGAEQRTESIIHR (SEQ id NO:2) или SLGAEHRTESVIHR (SEQ ID NO:3), которые представляют собой последовательности PDSP человека и мыши соответственно. Композиция может быть в форме раствора, мази или геля.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения пептид содержит последовательности по любой из SEQ ID NO:6-75. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения пептид состоит из 20, 22, 24 или 29 аминокислотных остатков.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения офтальмологическое заболевание представляет собой заболевание, связанное с повреждением роговицы, которое может представлять собой синдром сухого глаза (DES).
Один аспект изобретения относится к способам лечения офтальмологического заболевания. Способ в соответствии с одним вариантом осуществления изобретения включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, композиции, содержащей любой из вышеописанных пептидов. Офтальмологическое заболевание представляет собой заболевание, связанное с повреждением роговицы, которое может представлять собой синдром сухого глаза (DES).
Другой аспект изобретения станет очевидным из следующего описания и прилагаемых чертежей.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1(А) показаны эффекты короткого пептида, полученного из PEDF (PDSP), при стрессе по
- 1 037698 тери влаги сухого глаза, выявленные окрашиванием флуоресцеином роговицы, которое используется для оценки повреждения роговицы. Мышей линии C57BL6 содержали в камере с контролируемой средой (СЕС) в течение 14 дней, чтобы вызвать разрушение поверхности глаз (день 0), а затем лечили PDSP или носителем в течение дополнительных 5 дней (день 5). На фиг. 1(В) показана величина выработки слезной жидкости, оцененная с помощью теста с фенольной красной нитью. NS: Мышей, не подвергавшихся стрессу, содержали в нормальных условиях окружающей среды. UT: не получавших лечение мышей содержали в СЕС в течение 14 дней;
на фиг. 2(А) - репрезентативные изображения окрашивания бокаловидных клеток реактивом Шиффа (PAS) в своде конъюнктивы. Исходное увеличение х100. Кратко, мышей линии C57BL6 содержали в СЕС в течение 14 дней и затем обрабатывали PDSP или носителем в течение дополнительных 5 дней. Фиг. 2(В) - среднее количество положительно окрашенных PAS клеток было значительно увеличено после обработки PDSP. Данные представлены как среднее значение+стандартное отклонение;
на фиг. 3 - результаты местного применения PDSP, демонстрирующие предотвращение разрушения поверхностного барьера глаза, вызванного стрессом потери влаги. Мышей содержали в СЕС в течение 14 дней и, начиная с начала содержания в СЕС, вводили им 100 мкМ PDSP. Значения выражены как среднее значение±стандартное отклонение;
на фиг. 4 - влияние местного применения PDSP на вызванное стрессом потери влаги воспаление глаз. Мышей линии C57BL6 содержали в СЕС в течение 14 дней (день 0) и затем обрабатывали PDSP или носителем в течение дополнительных 5 дней (день 5). Уровни мРНК различных воспалительных факторов оценивали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Значения выражены как среднее значение+стандартная ошибка в каждой группе. *Р<0,05 по сравнению с NS: мыши, не подвергавшиеся стрессу. **Р<0,05 по сравнению с группой, получавшей носитель;
на фиг. 5 показано, что местное применение PDSP предотвращает перекисное окисление липидов, вызванное окислительным стрессом. Мышей содержали в СЕС в течение 14 дней и, начиная с начала содержания в СЕС, вводили им 100 мкМ PDSP. На фиг. 5(А) показана репрезентативная иммуногистохимия маркера окислительного стресса 4-HNE в эпителии роговицы при сухом глазе. На фиг. 5(В) показаны результаты количественного анализа положительно окрашенных на 4-HNE клеток. Значения выражены как среднее+стандартное отклонение. *Р<0,00002 по сравнению с группой, получавшей носитель. (С) Репрезентативная иммуногистохимия 4-HNE в конъюнктивальном эпителии при сухих глазах;
на фиг. 6 - влияние PDSP на внутриклеточные уровни АФК и GSH в обработанных NaCl клетках эпителия роговицы кролика. Клетки эпителия роговицы кролика предварительно обрабатывали 10 мкМ PDSP или контрольным пептидом (ConP, остатки 93-110 PEDF) в течение 20 ч и затем обрабатывали NaCl для индукции гиперосмотического стресса. После обработки NaCl в течение еще 24 ч клетки подвергали детектированию АФК с помощью зонда H2DCFDA (А) или глутатиона (GSH) с помощью зонда ОРА (В). *Р<0,002 по сравнению с необработанными клетками (клетки в изотонической среде). #Р<0,05 по сравнению с клетками, обработанными ContP/NaCl (клетки в гиперосмотической среде);
на фиг. 7 - влияние PDSP на экспрессию мРНК ММР-9 и ее активность в обработанных NaCl клетках эпителия роговицы кролика. На фиг. 7(А) показаны уровни мРНК ММР-9, оцененные с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Значения выражены как среднее значение±стандартная ошибка в каждой группе. *Р< 0,005 по сравнению с необработанными клетками. #Р<0,02 по сравнению с клетками, обработанными ContP/NaCl. На фиг. 7(В) показана активность ММР-9, оцененную с помощью желатиновой зимографии. Значения выражены как среднее значение+стандартная ошибка в каждой группе. *Р<0,0001 по сравнению с необработанными клетками. #Р<0,0003 по сравнению с клетками, обработанными ContP/NaCl;
на фиг. 8 - эффекты различных аланин-замещенных пептидов при профилактике или лечении вызванных высыханием повреждений роговицы, выявленных окрашиванием флуоресцеином. Мышей содержали в среде СЕС в течение 14 дней, чтобы вызвать сухие глаза, и в течение 5 дней наносили на глаза различные пептиды. Через 5 дней роговицы окрашивали флуоресцеином для оценки повреждений поверхности;
на фиг. 9 - влияние различных аланин-замещенных пептидов на усиление выработки слезной жидкости, выявленного методом с фенольной красной нитью;
на фиг. 10 - влияние различных аланин-замещенных пептидов на жизнеспособность клеток С2С12 в культуре. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ-теста;
на фиг. 11 - терапевтические эффекты вариантов PDSP 29-мер человека и moPDSP 29-мер при сухом глазе, вызванном стрессом потери влаги. Мышей линии C57BL6 содержали в камере с контролируемой средой (СЕС) в течение 14 дней, чтобы вызвать разрушение поверхности глаз (день 0), а затем начинали обработки пептидом или носителем в течение 3 дней (день 3). Повреждения роговицы оценивались с помощью окрашивания роговицы флуоресцеином. Средняя оценка окраски роговицы у мышей в ответ на разные пептиды в течение 3 дней. *Р<0,05 по сравнению с днем 0;
на фиг. 12 - результаты выработок слезной жидкости, оцененные с помощью тестов с фенольной красной нитью. Мышей линии C57BL6 содержали в камере с контролируемой средой (СЕС) в течение 14
- 2 037698 дней, чтобы вызвать разрушение поверхности глаз (день 0), а затем начинали обработки пептидом или носителем в течение 3 дней (день 3). NS: Мышей, не подвергавшихся стрессу, содержали в нормальных условиях окружающей среды. *Р<0,05 по сравнению с днем 0.
Подробное описание изобретения
Фактор пигментного эпителия человека (PEDF) представляет собой секретируемый белок, содержащий 418 аминокислот, с молекулярной массой около 50 кДа. PEDF является многофункциональным белком со многими биологическими функциями (см., например, опубликованную патентную заявку США № 2010/0047212). Обнаружено, что разные пептидные области PEDF ответственны за разные функции. Например, 34-мерный фрагмент (остатки 44-77 PEDF) был идентифицирован как обладающий антиангиогенной активностью, тогда как 44-мерный фрагмент (остатки 78-121 PEDF) был идентифицирован как обладающий нейротрофическими свойствами.
Опубликованная патентная заявка США № 2010/0047212 раскрывает, что PEDF может способствовать самообновлению стволовых клеток. Патент США № 9051547 и патент США № 9617311 раскрывают, что фрагменты PEDF, длиной 20-39 аминокислот (остатки 93-121 PEDF), могут способствовать пролиферации стволовых клеток и заживлению ран, в частности пролиферации лимбальных эпителиальных стволовых клеток.
Варианты осуществления изобретения относятся к коротким пептидным фрагментам, полученным из PEDF, и их вариантам. Варианты осуществления изобретения также относятся к применению этих пептидов в профилактике и/или лечении синдромов сухого глаза (DES).
Сухой глаз возникает в тех случаях, когда глаз не вырабатывает достаточное количество слезной жидкости или когда слезная жидкость испаряется слишком быстро. Наличие сухих глаз в течение некоторого времени может привести к истиранию поверхности глаз. В запущенных случаях эпителий может подвергаться патологическим изменениям, таким как плоскоклеточная метаплазия или потеря бокаловидных клеток. В тяжелых случаях у пациентов могут появиться повреждения роговицы, в том числе утолщение поверхности роговицы, эрозия роговицы, точечная кератопатия, дефекты эпителия, изъязвление роговицы, неоваскуляризация роговицы, рубцевание роговицы, истончение роговицы и даже перфорация роговицы.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что определенные пептидные фрагменты, полученные из PEDF, могут предотвращать и/или лечить повреждения роговицы, вызванные сухостью.
В животной модели для заболеваний сухого глаза мышей помещали в камеру с контролируемой средой (СЕС), чтобы вызвать сухость глаз, как описано ранее (Barabino et al., 2005). Мышей, помещенных в СЕС, подвергали воздействию относительной влажности (RH)<25%, температуры от 20 до 22°С с потоком воздуха 15 л/мин, 12 ч в день. Мышей, не подвергавшихся стрессу, содержали в нормальной среде (RH>50%, отсутствие воздушного потока, температура 21-23 °С) такой же период времени. Через 14 дней мышей, не подвергавшихся стрессу, обрабатывали носителем, тогда как мышей, подвергавшихся стрессу, обрабатывали или исследуемым пептидом (например, 29-мерным PDSP), или раствором носителя (Группа носителя) в течение 5 дней. Затем роговицу исследовали окрашиванием флуоресцеином.
Как показано на фиг. 1(А), на 14-й день повреждения роговицы были очевидны при окрашивании флуоресцеином как в группе, не подвергавшейся стрессу, так и в тестируемой группе. После обработки коротким пептидом, полученным из PEDF (PDSP, остатки 93-121 PEDF), в течение 5 дней, повреждения на поверхности роговицы фактически исчезли, в то время как в контрольной группе (обработка носителем) повреждения роговицы все еще наблюдались.
Кроме того, в настоящем изобретении обнаружено, что PDSP различной длины (20-29 аминокислот, начиная с остатка 93 PEDF) способны восстанавливать повреждения роговицы на животных моделях заболеваний сухого глаза с концентрациями от 10 до 200 мкМ.
На фиг. 1(В) показаны результаты выработки слезной жидкости, выявленные с помощью теста с фенольной красной нитью (подробно описанного в следующем разделе). На фиг. 1(В), NS обозначает мышей, не подвергавшихся стрессу, a UT обозначает подвергавшихся стрессу и не получавших лечение мышей. Как показано на фиг. 1 (В), лечение с помощью PDSP значительно увеличивало выработку слезной жидкости, по сравнению с UT и группой, получавшей носитель.
У людей слезная пленка, покрывающая глаз, известная как прекорнеальная пленка, имеет три отдельных слоя: липидный слой (секретируемый мейбомиевыми железами), водный слой (секретируемый слезными железами) и слизистый слой (секретируемый бокаловидными клетками конъюнктивы). Сухой глаз, вызванный стрессом, может быть результатом снижения выработки любого или всех этих компонентов.
Снижение выработки муцина может быть результатом уменьшения количества бокаловидных клеток. Настоящее изобретение показывает, что PDSP может предотвращать уменьшение количества бокаловидных клеток из-за сухого глаза. На фиг. 2(А) показаны результаты окрашивания реактивом Шиффа (PAS) глаз мыши. Говоря кратко, мышей линии C57BL6 содержали в СЕС в течение 14 дней и затем лечили PDSP или носителем в течение дополнительных 5 дней. Глаза, подвергавшиеся стрессу, включены в качестве контроля с отсутствием стресса (NS). На фиг. 2(А) показано репрезентативное окрашива
- 3 037698 ние бокаловидных клеток в глазе, не подвергавшемся стрессу (NS), обработанном носителем, и обработанном PDSP глазе. На фиг. 2 (В) показано, что глаза, обработанные PDSP, включают больше бокаловидных клеток (больше PAS-положительных клеток) по сравнению с необработанными глазами, подвергавшимися стрессу, и глазами, обработанными носителем.
Помимо возможности инвертировать течение или вылечить синдромы сухого глаза, изобретатели также обнаружили, что PDSP может предотвратить повреждения, вызванные патологическими состояниями сухого глаза. В эксперименте PDSP в концентрации 100 мкМ или носитель (в качестве контроля) наносили на глаза мышей линии C57BL6, а затем мышей помещали в камеру с контролируемой средой (с низкой влажностью и потоком воздуха) на 14 дней. Затем с помощью окрашивания флуоресцеином визуализировали разрушение поверхностного барьера глаза, вызванное стрессом потери влаги. Разрушение поверхностного барьера глаза, вызванное стрессом потери влаги, оценивалось в диапазоне от 0 до 3 в зависимости от степени повреждения поверхности глаза. Как показано на фиг. 3, PDSP эффективно предотвращал повреждения поверхности глаза по сравнению с группой, получавшей носитель.
Сухой глаз связан с нарушениями прекорнеальной слезной пленки и последующими воспалительными изменениями на всей поверхности глаза, включая придаточный аппарат, конъюнктиву и роговицу (см. Hessen et al., Dry eye: An Inflammatory Ocular Disease, J. Ophthalmic Vis. Res., 2014, 9(2): 240250). Таким образом, затем были изучены эффекты PDSP на воспалительные реакции роговицы. Говоря кратко, мышей линии C57BL6 содержали в СЕС в течение 14 дней (день 0), а затем проводили лечение PDSP или носителем в течение дополнительных 5 дней (день 5). Затем оценивали уровни мРНК факторов воспаления с помощью количественной ПЦР в реальном времени.
Как показано на фиг. 4, экспрессия различных факторов, связанных с воспалением, например, IL1β, IL-6, TNF-α, и МСР-1 (моноцитарный хемоатрактантный белок-1 (MCP-1/CCL2), являющийся ключевым воспалительным хемокином, который контролирует рекрутмент лейкоцитов при воспалении и тканевой реакции), была увеличена в вызванных стрессом сухих глазах (см. группу UT, не получавшую лечение). Лечение PDSP значительно снижало экспрессию этих воспалительных факторов по сравнению с группой UT, не получавшей лечение, или группой, получавшей носитель. Таким образом, PDSP может эффективно уменьшить воспаление сухих глаз, вызванных стрессом.
Кроме того, предполагается, что существует связь между синдромом сухого глаза и нарастанием окислительного стресса (см. Nakamura et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2007, 48(4): 1552-8). Поэтому было также исследовано, может ли PDSP снизить или предотвратить окислительный стресс при сухих глазах.
Для этого испытания мышей содержали в СЕС в течение 14 дней и начинали лечение PDSP в начале содержания в СЕС. Затем исследовали продукцию продуктов окислительного стресса (например, 4гидрокси-2-ноненаль, 4-HNE). 4-HNE был обнаружен во всех тканях животных и в более высоких количествах во время окислительного стресса из-за увеличения перекисного окисления липидов. 4-HNE содержит реактивный альдегид, который может модифицировать белки. 4-HNE-модифицированные белки могут быть обнаружены с помощью антител, специфичных к фрагменту 4-HNE.
Как показано на фиг. 5(А), глаза, не подвергавшиеся стрессу, содержат минимальное количество 4HNE. Вызванные стрессом сухие глаза обладают повышенным уровнем окрашивания на 4-HNE (группа, получавшая носитель). В отличие от этого лечение с помощью PDSP сухого глаза, вызванного стрессом, привело к значительному снижению выработки 4-HNE. На фиг. 5 (В) показаны результаты количественного анализа положительно окрашенных на 4-HNE клеток. На фиг. 5(С) показывает репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание на 4-HNE в конъюнктивальном эпителии при сухих глазах.
Принято считать, что высокое осмотическое давление (НОР) слезной жидкости является причиной воспаления и повреждения глаз. НОР может индуцировать выработку активных форм кислорода (АФК), которые являются побочными продуктами клеточного метаболизма. Сообщалось, что генерация АФК увеличивается в фибробластах роговицы у пациентов с кератоконусом и в клетках эпителия роговицы на животных моделях сухого глаза. Это наблюдение позволяет предположить, что АФК могут играть роль в повреждениях роговицы при сухих глазах. С другой стороны, глутатион (GSH) является природным продуктом, который может противодействовать свободным радикалам или АФК и облегчать или предотвращать повреждения, вызванные свободными радикалами или АФК.
Поэтому мы изучили влияние PDSP на внутриклеточные уровни АФК и GSH в обработанных NaCl (HOP) клетках эпителия роговицы кролика. Говоря кратко, клетки эпителия роговицы кролика предварительно обрабатывали 10 мкМ PDSP или отрицательным контрольным пептидом (ConP) в течение 20 ч с последующей обработкой NaCl для индукции гиперосмотического стресса. После обработки NaCl в течение еще 24 ч клетки оценивали на АФК с использованием зонда 2',7'-дихлордигидрофлуоросцеина диацетата (H2DCFDA), который является индикаторным красителем АФК. H2DCFDA может диффундировать в клетки, где его ацетатные сложноэфирные связи расщепляются внутриклеточными эстеразами и окисляются АФК, что превращает нефлуоресцирующий дихлордигидрофлуоросцеина диацетат (H2DCFDA) в сильно флуоресцирующий 2',7'-дихлордигидрофлуоросцеина диацетат (DCF).
Как показано на фиг. 6(А), без НОР, только PDSP не увеличивал флуоресценцию DCF, по сравне
- 4 037698 нию с не получавшими лечение мышами. Когда НОР индуцировался NaCl, предварительная обработка PDSP приводила к снижению выработки АФК (т.е. к снижению флуоресценции DC) по сравнению с предварительной обработкой отрицательным контрольным пептидом (ConP). Этот результат указывает на то, что PDSP может снизить образование АФК, вызванное НОР.
На фиг. 6(В) показаны относительные уровни GSH в разных лечебных группах. Интересно, что без стресса НОР только один PDSP индуцировал небольшое повышение уровня GSH по сравнению с необработанными мышами. Этот повышенный уровень GSH, антиоксиданта, позволил бы клеткам лучше переносить окислительный стресс. В условиях НОР лечение с помощью PDSP также приводило к увеличению GSH по сравнению с обработками контрольным пептидом (ConP). Эти результаты показывают, что лечение PDSP минимизирует выработку АФК и в то же время повышает уровень GSH. Комбинированные действия делают клетки гораздо более устойчивыми к окислительному стрессу или гиперосмотическому стрессу.
Синдром сухого глаза (DES) включает повышенную осмолярность слезной пленки и воспаление поверхности глаза. Гиперосмолярность слезной жидкости способствует воспалительному каскаду, который побуждает поврежденные эпителиальные клетки продуцировать повышенные уровни цитокина ММР-9. Повышенная активность ММР-9 при сухих глазах может способствовать нарушению функции барьера эпителия роговицы, усилению десквамации эпителия роговицы и неровности поверхности роговицы. (Chotikavanich et al., Production and activity of matrix metalloproteinase-9 on the ocular surface increase in dysfunctional tear syndrome, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2009; 50: 3203-3209).
Поэтому мы также исследовали влияние PDSP на экспрессию мРНК ММР-9 и ее активность в обработанных NaCl клетках эпителия роговицы кролика. Говоря кратко, клетки эпителия роговицы кролика обрабатывали, как описано выше. На фиг. 7(А) показано, что без гиперосмотического стресса только PDSP не влиял на уровни мРНК ММР-9, оцененные с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Гиперосмотический стресс вызывал значительное (приблизительно 2-кратное) повышение уровня мРНК ММР-9 (отрицательный контрольный пептид, ConP, с последующей обработкой NaCl). Для сравнения, обработка PDSP эффективно подавляла большую часть увеличения уровня мРНК ММР-9 при гиперосмотическом стрессе (обработка PDSP с последующим NaCl). Повышение уровней мРНК ММР-9 в значительной степени коррелирует с экспрессией белка ММР-9, измеренной с помощью электрофореза в геле с додецилсульфатом натрия, и ферментативной активностью, как показано на фиг. 7(В).
Вышеуказанные результаты наглядно показывают, что PDSP по изобретению может предотвращать и лечить заболевания сухого глаза (DED) или синдром сухого глаза (DES). В частности, эффекты PDSP по изобретению при профилактике и лечении DED включают: (1) профилактику и лечение повреждений поверхности роговицы, вызванных стрессом сухого глаза; (2) увеличение выработки слезной жидкости; (3) поддержку или защиту бокаловидных клеток конъюнктивы; (4) подавление воспаления, вызванного сухим глазом; (5) облегчение или минимизация перекисного окисления липидов, вызванного окислительным стрессом; (6) подавление образования внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) и повышение уровней внутриклеточного глутатиона (GSH); и (7) подавление экспрессии ММР-9.
Поскольку PDSP по изобретению являются эффективными агентами для профилактики и лечения DED, мы дополнительно исследовали взаимосвязь структура-активность PDSP с помощью аланинового сканирования. В экспериментах по аланиновому сканированию мы используем 29-мер из остатков 93121 PEDF человека: 93SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT121 (SEQ ID NO:4). Каждую из аминокислот в 29-мере заменяли аланином (или глицином, если остаток представляет собой аланин) и оценивали активность аланин-замещенных или глицин-замещенных мутантов.
На фиг. 8 показаны иллюстративные результаты анализов окрашивания глаз. В этих испытаниях повреждения поверхности роговицы, вызванные потерей влаги (оцениваемые с помощью окрашивания флуоресцеином), индуцировали в СЕС, как описано выше, и подробно экспериментально описано в следующем разделе. Эти результаты показывают, что аланиновые или глициновые замены по остаткам 1 (L93A), 4 (A96G), б (Q98A), 11 (П03А), 12 (I104A) и 14 (R106A) в 29-мере приводили к значительной потере активности PDSP, указывая на то, что эти остатки необходимы для активности PDSP.
На фиг. 9 показаны примерные результаты анализов на выработку слезной жидкости, которые были выполнены, как описано выше, и подробно в следующем разделе. Результаты по выработке слезной жидкости, показанные на фиг. 9, согласуются с результатами по окрашиванию флуоресцеином, показанными на фиг. 8. Т.е. аланиновые или глициновые замены по остаткам 1 (S93A), 4 (A96G), 6 (Q98A), 11 (П03А), 12 (I104A) и 14 (R106A) в 29-мере привели к значительным потерям способности PDSP индуцировать выработку слезной жидкости, указывая на то, что эти остатки необходимы для активности PDSP.
Тот факт, что PDSP по изобретению может предотвращать повреждение поверхности роговицы, уменьшать окислительный стресс в клетках и минимизировать воспалительные реакции, предполагает, что PDSP может обладать способностью в целом поддерживать жизнеспособность клеток. Это было проверено с помощью жизнеспособности клеток в клеточных культурах. На фиг. 10 показаны результаты экспериментов по аланиновому сканированию с использованием культуры клеток С2С12. Жизнеспособность клеток можно оценить с помощью окрашивания и подсчета количества клеток или с помощью МТТ-теста. Такие методы хорошо известны в данной области техники.
- 5 037698
Как показано на фиг. 10, аланиновые (или глициновые) замены для остатков в позициях 1 (S93A), 4 (A96G), 6 (Q98A), 11 (1103А), 12 (I104A) и 14 (R106A) в 29-мере, по существу, отменили способности этих пептидов поддерживать/улучшать жизнеспособность клеток. Эти результаты аланинового сканирования согласуются с результатами, показанными на фиг. 8 и фиг. 9, с использованием животных моделей сухого глаза.
В то время как вышеупомянутые эксперименты были выполнены с последовательностями PDSP человека (PDSP 29-мер: SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT, SEQ ID NO:4), мы обнаружили, что соответствующая последовательность мыши (moPDSP 29-мер: SLGAEHRTESVIHRALYYDLITNPDIHST, SEQ ID NO:5) функционирует аналогично. Например, на фиг. 11 показаны результаты защиты от повреждений поверхности роговицы, вызванных потерей влаги, как у человека (PDSP 29-мер), так и у мыши (moPDSP 29х-мер), выявленные окрашиванием глаз. Понятно, что последовательность мыши имеет те же эффекты, что и последовательность человека. Аналогичным образом, на фиг. 12 показано, что как PDSP человека, так и PDSP мыши в одинаковой степени улучшали выработку слезной жидкости. Эти результаты подтверждают, что не существует заметного функционального различия между PDSP человека и PDSP мыши в способности предотвращать и/или лечить DES.
Различия аминокислотных остатков между PEDF человека и PEDF мыши в этой области состоят из двух гомологичных замен, т.е. Q-98 в последовательности человека соответствует Н-98 в последовательности мыши и I-103 в последовательности человека соответствует V-103 в последовательности мыши. Следовательно, существенные остатки в этих двух позициях (98 и 103) могут быть заменены соответствующими остатками (98Q/H и 103I/V).
Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что гомологичные аминокислотные замены обычно не оказывают заметного влияния на биологическую активность, даже если обнаружено, что эти два остатка имеют решающее значение для лечения и профилактики сухого глаза. Кроме того, специалисту в данной области техники должно быть понятно, что подобные гомологичные замены в несущественных позициях будут даже лучше переноситься. Какие аминокислотные замены считаются гомологичными хорошо известно в данной области техники. Некоторые примеры: (I, V, L, М), (Q, N, Н), (D, Е), (R, K, Н), (S, Т, С) и (F, Y, W), при этом аминокислоты в одной и той же группе скобок обычно могут заменять друг друга без значительного влияния на биологическую активность пептида или белка.
На основании этих результатов можно сделать вывод, что существенная пептидная последовательность для PDSP для профилактики или лечения DED может быть представлена следующим образом:
1s-2x-3x-4a-5x-6q/h-7x-8x-9x-10x-11i/v-12i-13x-14r ТТЛ , λ (SEQ ID NO:1), где каждый X обозначает несущественный остаток и может представлять собой любую аминокислоту, предпочтительно природную аминокислоту. Соответствующая последовательность для PDSP человека: SLGAEQRTESIIHR (seq id nO:2) и для PDSP мыши: SLGAEHRTESVIHR (seq id NO:3).
Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что пептид, содержащий эти существенные остатки, может быть использован для профилактики или лечения сухих глаз. Такие пептиды обычно называют PDSP (т.е. короткие пептиды, полученные из PEDF). Некоторые примеры этих PDSP проиллюстрированы в следующей таблице:
- 6 037698
| Пептидные последовательности | SEQ ID NO |
| 1S-2X-3X-4A-5X-6Q/H-7X-8X-9X-10X-11l/V-12I-13X-14R | 1 |
| 1S-2L-3X-4A-5X-6Q/H-7X-8X-9X-10X-11l/V-12I-13X-14R | 6 |
| 1S-2A-3X-4A-5X-6Q/H-7X-8X-9X-10X-11l/V-12I-13X-14R | 7 |
| 1S-2X-3G-4A-5X-6Q/H-7X-8X-9X-10X-11l/V-12I-13X-14R | 8 |
| 1S-2X-3A-4A-5X-6Q/H-7X-8X-9X-10X-11l/V-12I-13X-14R | 9 |
| 1S-2X-3X-4A-5E-6Q/H-7X-8X-9X-10X-11l/V-12I-13X-14R | 10 |
| 1S-2X-3X-4A-5A-6Q/H-7X-8X-9X-10X-11l/V-12I-13X-14R | 11 |
| 1S-2X-3X-4A-5X-6Q/H-7R-8X-9X-10X-11l/V-12I-13X-14R | 12 |
| 1S-2L-3X-4A-5X-6Q/H-7A-8X-9X-10X-11l/V-12I-13X-14R | 13 |
| 1S-2A-3X-4A-5X-6Q/H-7X-8T-9X-10X-11l/V-12I-13X-14R | 14 |
| 1S-2X-3G-4A-5X-6Q/H-7X-8A-9E-10X-11l/V-12I-13X-14R | 15 |
| 1S-2X-3A-4A-5X-6Q/H-7X-8X-9A-10X-11l/V-12I-13X-14R | 16 |
| 1S-2X-3X-4A-5E-6Q/H-7X-8X-9X-10S-11l/V-12I-13X-14R | 17 |
| 1S-2X-3X-4A-5A-6Q/H-7X-8X-9X-10A-11l/V-12I-13X-14R | 18 |
| 1S-2X-3X-4A-5X-6Q/H-7X-8X-9X-10X-11l/V-12I-13H-14R | 19 |
| 1S-2X-3X-4A-5X-6Q/H-7X-8X-9X-10X-11l/V-12I-13A-14R | 20 |
| 1S-2L-3G-4A-5X-6Q/H-7X-8X-9X-10X-11l/V-12I-13X-14R | 21 |
| 1S-2L-3G-4A-5E-6Q/H-7X-8X-9X-10X-11l/V-12I-13X-14R | 22 |
| 1S-2L-3G-4A-5A-6Q/H-7X-8X-9X-10X-11l/V-12I-13X-14R | 23 |
| 1S-2L-3G-4A-5X-6Q/H-7R-8X-9X-10X-11l/V-12I-13X-14R | 24 |
| 1S-2L-3G-4A-5X-6Q/H-7A-8X-9X-10X-11l/V-12I-13X-14R | 25 |
| 1S-2L-3G-4A-5X-6Q/H-7X-8T-9X-10X-11l/V-12I-13X-14R | 26 |
| 1S-2L-3G-4A-5X-6Q/H-7X-8A-9E-10X-11l/V-12I-13X-14R | 27 |
| 1S-2L-3G-4A-5X-6Q/H-7X-8X-9A-10X-11l/V-12I-13X-14R | 28 |
| 1S-2L-3G-4A-5X-6Q/H-7X-8X-9X-10S-11l/V-12I-13X-14R | 29 |
| 1S-2L-3G-4A-5X-6Q/H-7X-8X-9X-10A-11l/V-12I-13X-14R | 30 |
| 1S-2L-3G-4A-5X-6Q/H-7X-8X-9X-10S-11l/V-12I-13H-14R | 31 |
| 1s-2l-3g-4a-5x-6q/h-7x-8x-9x-10a-11i/v-12i-13a-14r | 32 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7x-8x-9x-10x-11i/v-12i-13x-14r | 33 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8x-9x-10x-11i/v-12i-13x-14r | 34 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7a-8x-9x-10x-11i/v-12i-13x-14r | 35 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7x-8t-9x-10x-11i/v-12i-13x-14r | 36 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7x-8a-9e-10x-11i/v-12i-13x-14r | 37 |
- 7 037698
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7x-8x-9a-10x-11i/v-12i-13x-14r | 38 |
| 1S-2L-3G-4A-5E-6Q/H-7X-8X-9X-10S-11I/V-12I-13X-14R | 39 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7x-8x-9x-10a-11i/v-12i-13x-14r | 40 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7x-8x-9x-10s-11i/v-12i-13h-14r | 41 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7x-8x-9x-10a-11i/v-12i-13a-14r | 42 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8x-9x-10x-11i/v-12i-13x-14r | 43 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8t-9x-10x-11i/v-12i-13x-14r | 44 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8a-9e-10x-11i/v-12i-13x-14r | 45 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8x-9a-10x-11i/v-12i-13x-14r | 46 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8x-9x-10s-11i/v-12i-13x-14r | 47 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8x-9x-10a-11i/v-12i-13x-14r | 48 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8x-9x-10s-11i/v-12i-13h-14r | 49 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8x-9x-10a-11i/v-12i-13a-14r | 50 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8t-9x-10x-11i/v-12i-13x-14r | 51 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8t-9e-10x-11i/v-12i-13x-14r | 52 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8t-9a-10x-11i/v-12i-13x-14r | 53 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8t-9x-10s-11i/v-12i-13x-14r | 54 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8t-9x-10a-11i/v-12i-13x-14r | 55 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8t-9x-10s-11i/v-12i-13h-14r | 56 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8t-9x-10a-11i/v-12i-13a-14r | 57 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8t-9e-10s-11i/v-12i-13x-14r | 58 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8t-9e-10a-11i/v-12i-13x-14r | 59 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8t-9e-10x-11i/v-12i-13h-14r | 60 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8t-9e-10x-11i/v-12i-13a-14r | 61 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8t-9e-10s-11i/v-12i-13x-14r | 62 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8t-9e-10s-11i/v-12i-13a-14r | 63 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8t-9x-10s-11i/v-12i-13h-14r | 64 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8t-9a-10s-11i/v-12i-13h-14r | 65 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8x-9e-10s-11i/v-12i-13h-14r | 66 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7r-8a-9e-10s-11i/v-12i-13h-14r | 67 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7x-8t-9e-10s-11i/v-12i-13h-14r | 68 |
| 1s-2l-3g-4a-5e-6q/h-7a-8t-9e-10s-11i/v-12i-13h-14r | 69 |
| 1s-2l-3g-4a-5x-6q/h-7r-8t-9e-10s-11i/v-12i-13h-14r | 70 |
| 1s-2l-3g-4a-5a-6q/h-7r-8t-9e-10s-11i/v-12i-13h-14r | 71 |
| 1s-2l-3x-4a-5e-6q/h-7r-8t-9e-10s-11i/v-12i-13h-14r | 72 |
| 1s-2l-3a-4a-5e-6q/h-7r-8t-9e-10s-11i/v-12i-13h-14r | 73 |
| 1s-2x-3g-4a-5e-6q/h-7r-8t-9e-10s-11i/v-12i-13h-14r | 74 |
| 1s-2a-3g-4a-5e-6q/h-7r-8t-9e-10s-11i/v-12i-13h-14r | 75 |
Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что пептидные последовательности, перечисленные в приведенной выше таблице, приведены только для иллюстрации, и возможны другие сочетания в пределах объема изобретения. Кроме того, хотя вышеперечисленное может представлять собой короткие или минимальные пептиды, которые эффективны для профилактики и/или лечения синдрома сухого глаза, также могут использоваться более длинные пептиды. В частности, более длинные пептиды могут обладать более подходящей фармакокинетикой и/или биологической доступностью.
Для более длинных пептидов, дополнительные аминокислоты могут быть включены в N- и/или Сконец любого из указанных выше пептидов. Дополнительные аминокислоты могут представлять собой любые подходящие остатки, например остатки из PEDF человека или мыши, фланкирующие области вышеуказанных пептидов. Конкретные примеры более длинных пептидов могут включать 20-мер (остат
- 8 037698 ки 93-112 PEDF; SEQ ID NO:76), 22-мер (остатки 93-114 PEDF; SEQ ID NO:77), 24-мер (остатки 93-116 PEDF; SEQ ID NO:78) и 29-мер (остатки 93-121 PEDF; SEQ ID NO:4).
Варианты осуществления изобретения также относятся к способам профилактики и/или лечения сухого глаза у субъекта. Субъект в соответствии с вариантами осуществления изобретения может быть человеком или животным. Способ в соответствии с вариантом осуществления изобретения может включать введение субъекту, нуждающемуся в профилактике или лечении сухого глаза, композиции, содержащей пептид, выбранный из любого, описанного выше. В соответствии с примерами изобретения композиции могут содержать пептид по изобретению или соль такого пептида вместе с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем, например дистиллированной водой, водным раствором хлорида натрия, маслом или гелем.
Композиция по изобретению может быть составлена в любых подходящих лекарственных формах, таких как раствор, мазь, суспензия, гель или эмульсия, которые могут быть составлены в любых подходящих концентрациях, например, 10-200 мкМ. Специалист в данной области сможет составить их в подходящей концентрации для доставки эффективной дозы без изобретательских усилий. Эти лекарственные формы могут быть составлены для местного нанесения на глаза или других подходящих способов введения (например, перорального или инъекционного).
Варианты осуществления изобретения будут дополнительно проиллюстрированы следующими экспериментальными деталями и примерами. Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что эти экспериментальные детали и примеры приведены только для иллюстрации и что возможны другие модификации и варианты в пределах объема изобретения.
Материалы и методы.
Натрий-карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), реактив Шиффа (PAS) и дексаметазон были от SigmaAldrich (St. Louis, МО, USA). КМЦ (1% мас./об.) В солевом растворе Balance (BSS; Alcone) использовали в качестве носителя для PDSP. PDSP и отрицательный контрольный пептид (СопР) были синтезированы и модифицированы ацетилированными на концах NH2 и амидированы на концах СООН для стабильности и охарактеризованы масс-спектрометрией (>95% чистоты), чтобы заказать в GenScript (Piscataway, NJ, USA).
Животные.
Для данных экспериментов использовали самок мышей линии C57BL/6 в возрасте 7-8 нед. Экспериментальные исследования были одобрены Экспертным советом Мемориальной больницы Маккей и проведены в соответствии с Положением ARVO (Ассоциация по исследованиям зрения и офтальмологии) об использовании животных в исследованиях офтальмологии и зрения.
Модель сухого глаза.
Сухой глаз индуцировали путем помещения мышей в камеру с контролируемой средой (СЕС), как описано ранее (Barabino et al., 2005). Говоря кратко, мышей, помещенных в СЕС, подвергали воздействию относительной влажности (RH)<25%, температуры от 20 до 22°С и потока воздуха 15 л/мин, 12 ч в день. Не подвергавшихся стрессу мышей (NS), без вызванного стрессом сухого глаза, содержали в нормальной среде (RH>50%, отсутствие воздушного потока, температура 21-23°С) такой же период времени.
Окрашивание роговицы флуоресцеином.
Животных анестезировали с помощью внутрибрюшинного введения смеси золетила (6 мг/кг) и ксилазина (3 мг/кг). Эпителиальное повреждение роговицы определяли путем местного окрашивания флуоресцеином (Fluor-I-Strip, Ayerst Laboratories, Philadelphia, PA). Окраску роговицы флуоресцеином исследовали с помощью щелевой лампы (биомикроскопа) в кобальтовом голубом свете и фотографировали цифровой камерой. Окрашивание роговицы красителем оценивали следующим образом: 0 баллов за отсутствие точечного окрашивания; 1 балл, когда было окрашено менее одной трети роговицы; 2 балла, когда были окрашены две трети или менее; и 3 балла, когда было окрашено более двух третей (HorwathWinter J. 2013).
Измерение выработки слезной жидкости.
Выработку слезной жидкости измеряли с помощью хлопковых нитей, пропитанных феноловым красным (Zone-Quick; Oasis, Glendora, CA). Достоверность этого теста на мышах была выполнена, как описано ранее (Dursun et al., 2002). Нити удерживали ювелирными пинцетами и помещали в латеральный угол глаза на 60 с. Выработка слезной жидкости выражена в миллиметрах нити, которая была мокрой от слезы и стала красной.
Окраска PAS бокаловидных клеток.
После того как животных умерщвляли, глаза удаляли хирургическим путем, фиксировали в 10% формалине, заключали в парафин и изготавливали срезы толщиной 5 мкм. Срезы окрашивали реактивом Шиффа (PAS; Sigma-Aldrich) для измерения бокаловидных клеток в верхнем и нижнем сводах конъюнктивы и исследовали, а также фотографировали с помощью микроскопа, оборудованного цифровой камерой. PAS-положительные бокаловидные клетки в конъюнктиве измерялись в пяти срезах каждого глаза.
Выделение РНК и количественная ПЦР в реальном времени.
- 9 037698
Суммарную РНК экстрагировали из клеток с использованием TRIzol (Invitrogen) и обрабатывали ДНКазой I свободной от РНКазы (Qiagen, Santa Clarita, CA) для удаления геномной ДНК, а затем очищали с помощью набора для очистки РНК (Dynabeads; Invitrogen). Синтез кДНК проводили с помощью Superscript III (Invitrogen). Количественную ПЦР в реальном времени проводили на секвенаторе GeneAmp 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Амплификацию проводили в общем объеме 40 мкл, содержащем 3 пмоль праймеров, серийно разведенный продукт RT и основные реагенты SYBR Green PCR (Applied Biosystems). Последовательность специфических праймеров для ПЦР представляла собой TNF-α мыши (номер доступа: NM_013693) смысловая, 5'-CTACCTTGTTGCCTCCTCTTT-3' (SEQ ID NO:79), антисмысловая, 5'-GAGCAGAGGTTCAGTGATGTAG-3' (SEQ ID NO:80); IL-ίβ мыши (номер доступа: NM 008361) смысловая, 5'-GGTGTGTGACGTTCCCATTA-3' (SEQ ID NO:81), антисмысловая, 5'ATTGAGGTGGAGAGCTTTCAG-3' (SEQ ID NO:82); IL-6 мыши (номер доступа: NM_031168) смысловая, 5'-GTCTGTAGCTCATTCTGCTCTG-3' (SEQ ID NO:83), антисмысловая, 5'-GAAGGCAACTG GATGGAAGT-3' (SEQ ID NO:84); MCP-1 мыши (номер доступа: NM 011333) смысловая, 5'CTCGGACTGTGATGCCTTAAT-3' (SEQ ID NO:85), антисмысловая, 5'-TGGATCCACACCTTGCATTTA3' (SEQ ID NO:86); MMP-9 кролика (номер доступа: NM_001082203) смысловая, 5'-TGCGAGTTT CCGTTCATCTT-3' (SEQ ID NO:87), антисмысловая, 5'-GTAGAGCTTGTCCTTGTCGTAG-3' (SEQ ID NO:88); Программа шагов цикла была настроена на денатурирование при 95°С в течение 15 с, а отжиг и удлинение при 62°С в течение 1 мин, в общей сложности 40 циклов. Все определения измеряли в трех повторностях. Значения порогового цикла (Ct) соответствовали номеру цикла ПЦР, при котором флуоресценция в реальном времени достигает порогового значения выше базовой линии, анализировали с использованием программного обеспечения GeneAmp 7700 SDS. Значение Ct исследуемого продукта ПЦР и контрольной мРНК (GAPDH) затем использовали для расчета относительных количеств мРНК между образцами.
Иммуногистохимия.
Вызванное окислительным стрессом перекисное окисление липидов оценивали иммуногистохимическим выявлением 4-гидрокси-2-ноненаля (4HNE) в роговице и конъюнктиве. Фиксированные в формалине и заключенные в парафин образцы глаз депарафинизировали в ксилоле и регидратировали в градуированной серии концентраций этанола. Срезы блокировали с 10% козьей сыворотки в течение 60 мин и затем инкубировали с первичным антителом против 4-HNE (разведение 1:100) (ab46545, Abcam) 4 ч при комнатной температуре. Затем срезы инкубировали с соответствующим меченным пероксидазой козьим иммуноглобулином (разведение 1:500; Chemicon, Temecula, CA) в течение 20 мин, а затем инкубировали с хромогенным субстратом (3,3'-диаминобензидин) в течение 2 мин перед контрастным окрашиванием гематоксилином.
Культура клеток эпителия роговицы и лечение.
Лимбальные стволовые клетки выделяли у 6-мес. новозеландских белых кроликов и непрерывно культивировали в течение 14 дней с помощью культуры суспензий клеток на основе на базальной среде DMEM/F-12 для достижения дифференцировки в эпителиальные клетки, подобные клеткам роговицы, как описано ранее (Но et al., 2013). Чтобы индуцировать активность АФК или ММР-9, вызванную гиперосмотическим стрессом, клетки инкубировали в течение ночи в гипертонической среде (463 мосм), полученной путем добавления 90 мМ NaCl. Клетки, культивируемые в базальной среде DMEM/F-12 (309 мосм), использовали в качестве отрицательного контроля. Чтобы обнаружить профилактический эффект на активность АФК или ММР-9, вызванную гиперосмотическим стрессом, клетки предварительно обрабатывали 10 мкМ PDSP за 20 ч до обработки NaCl.
Желатиновая зимография.
Для выявления активности ММР-9 использовали 10 мкл культуральной среды для проведения желатиновой зимографии по ранее описанному методу (Li et al., 2004). Интенсивность полосы в зимографии оценивали с помощью денситометра для визуализации, модель GS-700 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) и анализировали с использованием программного обеспечения Labworks 4.0.
Измерение внутриклеточного содержания АФК и глутатиона.
Внутриклеточную генерацию ROS анализировали с использованием 2', 7'-дихлордигидрофлуоросцеина диацетата (H2DCFDA; Molecular Probes, Eugene, OR), который при окислении ROS высвобождает зеленое флуоресцентное соединение 2',7'-дихлорфлуоресцеин (DCF). Для выявления АФК с помощью спектрофлуориметрического анализа клетки промывали PBS и затем лизировали с помощью буфера для лизиса NP-40 (10 мМ Трис-Cl, рН 7,4, 10 мМ NaCl и 0,5% NP-40) и инкубировали с PBS, содержащим 5 мкМ H2DCFDA в темноте в течение 15 мин при 37°С. Флуоресценцию (возбуждение 488 нм; эмиссия 520 нм) измеряли с помощью прибора Spectra MAX GEMINI Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Фоновая флуоресценция контрольных лунок без добавления H2DCFDA была вычтена из экспериментальных показаний.
Уровни GSH определяли количественно с использованием набора для анализа глутатиона (BioVision Research Products, Mountain View, CA) в соответствии с рекомендациями производителя. Говоря кратко, клеточный лизат, обработанный хлорной кислотой, инкубировали с зондом ОРА (ортофталевый
- 10 037698 альдегид) и буфером GSH в течение 40 мин при комнатной температуре. Флуоресценцию считывали при 340 нм для возбуждения и 420 нм для излучения на флуоресцентном микропланшетном спектрофотометре SPECTRAmax GEMINI XS (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Местное лечение PDSP восстанавливает повреждение поверхности глаза, вызванное стрессом потери влаги.
Чтобы определить, оказывают ли PDSP терапевтические эффекты на вызванные стрессом потери влаги (DS) дефекты поверхности глаза, мышей содержали в камере с контролируемой средой (СЕС) в течение 14 дней, чтобы вызвать разрушение поверхности глаза. После 14 дней в СЕС мы использовали мышей с показателями флуоресценции, которые были выше 2 для первых экспериментов (фиг. 1А). Впоследствии сухие глаза лечили местно с помощью PDSP в концентрации 25-200 мкМ (3 раза в день) или носителя PDSP (1% КМЦ в BSS) в течение еще 5 дней, сохраняя тот же самый протокол стресса потери влаги.
В день 0 средний объем слезной жидкости значительно уменьшился у мышей в сравнении с мышами, не подвергавшимися стрессу (NS), при определении с помощью теста с хлопковой нитью (3,8±0,5 мм по сравнению с 5,4±0,4 мм; фиг. 1В). Выработка слезной жидкости в глазах была значительно увеличена после того, как мышей лечили PDSP в течение 5 дней (5±0,3 по сравнению с 4,5±0,2) в сравнении с группой носителя.
PDSP частично восстанавливает количество бокаловидных клеток в конъюнктиве.
Бокаловидные клетки находятся главным образом в поверхностном эпителии свода конъюнктивы и отвечают за выработку слизистой слезной жидкости. Окрашивание реактивом Шиффа (PAS) NS-глаза показало, что бокаловидные клетки демонстрируют непрерывный однородный рисунок в конъюнктивальном эпителии (фиг. 2А). Тем не менее через 14 дней после стресса потери влаги (день 0) окраска PAS конъюнктивы показала, что количество бокаловидных клеток заметно уменьшилось по сравнению с группой NS (58±3,1 по сравнению с 38±3,2; фиг. 2В). При лечении PDSP или носителем в виде глазных капель в течение 5 дней количество бокаловидных клеток конъюнктивы было значительно выше в глазах, обработанных PDSP, по сравнению с контрольными группами, обработанными носителем (46±3,8 по сравнению с 37±1,1). В совокупности, обработка PDSP действительно сохранила число бокаловидных клеток.
Местное лечение с помощью PDSP предотвращает повреждение поверхности глаза, вызванное стрессом потери влаги.
Чтобы выяснить, может ли PDSP подавлять вызванное DS поражение эпителия роговицы, мы применяли для мышей 14-дневный протокол стресса потери влаги и обрабатывали этих мышей местно PDSP 3 раза в день. Через 14 дней дефект эпителия роговицы оценивали окрашиванием красителем флуоресцеином (фиг. 3), и результаты выявили, что показатели окрашивания роговицы флуоресцеином были значительно выше в обработанных носителем глазах, в сравнении с глазами, обработанными PDSP (1,7±0,3 по сравнению с 0,7±0,2). Этот результат указывает на то, что PDSP может также оказывать профилактический эффект на поверхность глаза против стресса потери влаги.
Сопоставимая функция PDSP человека и мыши в животной моделе стресса потери влаги.
Исследовать, одинаково ли функционирует одна и та же область PEDF у человека и мыши при лечении субъекта с DED. Активность PDSP человека и PDSP мыши исследовали на модели сухого глаза, вызванного стрессом потери влаги, у мышей. Показано, что PDSP человека и мыши способны восстанавливать повреждения поверхности глаза, вызванные стрессом потери влаги (фиг. 11), а также выработку слезной жидкости (фиг. 12) у мышей с вызванной стрессом сухих глазах.
PDSP подавляет вызванную стрессом потери влаги воспалительную реакцию.
Было высказано предположение, что воспаление может увеличить повреждение поверхности глаза при сухом глазе, вызванном стрессом потери влаги, у экспериментальных животных (Luo et al., 2004; De Paiva et al., 2006). Сообщалось, что среди провоспалительных медиаторов, вызванный стрессом потери влаги сухой глаз был устранен у мышей, предварительно получавших блокатор TNF-α или интерлейкина-1 (IL-1) [Ji YW 2013; Okanobo A. 2012]. Как показано на фиг. 4, после того как мыши содержались в СЕС в течение 14 дней (установлено как день 0; мыши, не получавшие лечения), уровни мРНК провоспалительных медиаторов, включая IL-1 β, TNF-α, IL-6 и МСР-1, были значительно повышены, 3,9-, 2,8-, 2,6- и 2,4-кратно соответственно, по сравнению с мышами, содержащимися в среде без стресса (NS). Тем не менее местное лечение с помощью PDSP в течение 5 дней у мышей, вероятно, подавляло экспрессию мРНК IL-1e, TNF-α, IL-6 и МСР-1 глаза 2,4-, 1,9-, 2,0- и 1,7-кратно соответственно, по сравнению с группой, обработанной носителем. В целом наши результаты показывают, что PDSP ослаблял воспалительные реакции глаз, индуцированные DS.
PDSP частично предотвращает связанное с перекисным окислением липидов повреждение поверхности глаза.
Окислительное повреждение на поверхности глаза в результате повышенной выработки активных форм кислорода (АФК) вовлечено в патогенез сухого глаза (Wakamatsu et al., 2013). Мы исследовали, может ли PDSP подавлять повреждение мембран, связанное с перекисным окислением липидов, посред
- 11 037698 ством иммуногистохимического окрашивания на 4-HNE. Как показано на фиг. 5А, 4-HNE-окрашивαние в эпителии роговицы после того, как мыши содержались в СЕС в течение 14 дней, продемонстрировало ядерную и/или перинуклеарную локализацию в многоугольных клетках эпителия, что согласуется с предыдущим сообщением (Nakamura et al., 2007). Количество клеток, положительно окрашенных на 4-HNE, составило 1,9±0,6, 20,1±1,4 и 5,3±1,0 в группах NS, носителя и PDSP соответственно (фиг. 5В), что указывает на то, что PDSP способен предотвращать перекисное окисление липидов. Кроме того, вызванное DS перекисное окисление липидов в конъюнктиве также оценивалось с помощью 4-HNE-окрaшиванuя, и результаты иммуногистохимического окрашивания показали, что сигнал 4-HNE был очевидно сильнее в глазах, обработанных носителем, чем в глазах, подвергавшихся лечению PDSP, дополнительно подтверждая обнаружение антиоксидантного эффекта PDSP (Фиг. 5С). В совокупности лечение с помощью PDSP значительно подавляло индуцированное DS окислительное повреждение поверхности глаза.
PDSP предотвращает накопление АФК, вызванное гиперосмотическим стрессом, и уменьшение содержания глутатиона в клетках эпителия роговицы.
Считается, что повышенная осмолярность слезы является основным механизмом при сухом глазе, вызывающим воспаление и повреждение поверхности глаза (Stahl et al., 2012). Текущая предельная концентрация для диагностики сухого глаза составляет 316 мосм по сравнению с 300-310 мосм для нормальных глаз (Liu et al., 2009). Тем не менее в in vitro исследованиях гиперосмолярности в клетках эпителия роговицы для того, чтобы вызвать активность АФК и ММР-9 требуется длительное воздействие на клетки более высоких уровней осмолярности слезы (350-500 мосм) (Li DQ 2004; Li J. 2016).
Чтобы исследовать влияние гиперосмотического стресса на формирование внутриклеточных АФК, клетки эпителия роговицы кролика культивировали в гиперосмотической среде (463 мосм), добавляя 90 мМ NaCl в течение 24 ч. Внутриклеточные уровни АФК детектировали с помощью зонда H2DCFDA и измеряли образование DCF-флуоресценции с помощью спектрофлуориметра.
Как показано на фиг. 6А, флуоресценция DCF увеличилась 1,6-кратно после культивирования клеток в гиперосмотической среде в течение 24 ч по сравнению с клетками, культивируемыми в изотонической среде (309 мосм). Тем не менее, клетки эпителия роговицы кролика, предварительно обработанные PDSP, показали 1,3-кратное снижение уровня флуоресценции DCF по сравнению с клетками, которые обрабатывались только NaCl (Р<0,04). Предварительная обработка контрольным пептидом (ContP) не имела таких эффектов. Индуцированный NaCl гиперосмотический стресс также заметно уменьшил уровни глутатиона (GSH), антиоксиданта, по сравнению с контрольными клетками в изотонической среде (фиг. 6В; 46,7±15,4% по сравнению с 100±7,0%), тогда как в клетках, повторно обработанных PDSP, значительно повысился уровень GSH до 70,5±11,4%. Эти результаты показывают, что PDSP обладает антиоксидантным эффектом в клетках эпителия роговицы, которые обрабатывали при помощи гиперосмотического стресса, вызванного NaCl (463 мосм), по крайней мере, частично, путем повышения уровня GSH.
PDSP подавляет вызванную гиперосмотическим стрессом экспрессию ММР-9 в клетках эпителия роговицы.
Чтобы исследовать влияние PDSP на вызванную гиперосмотическим стрессом экспрессию ММР-9 в клетках эпителия роговицы, клетки предварительно обрабатывали PDSP или контрольным пептидом (ConP) в течение 20 ч, а затем подвергали клетки воздействию гиперосмотической среды (463 мосм) в течение еще 24 ч. Как показано на фиг. 7А, уровень мРНК ММР-9 в клетках, обработанных ContP/гиперосмотической средой, был значительно повышен, 3-кратно по сравнению с клетками, культивированными в изотонической среде (необработанный контроль). Тем не менее, предварительная обработка PDSP подавляла экспрессию мРНК ММР-9 в 2 раза.
Желатиновая зимография также продемонстрировала, что гиперосмотический стресс индуцировал активность ММР-9 в 2,7 раза по сравнению с необработанным контролем (величина около 90 кДа; фиг. 7В). Зимография также показала, что предварительная обработка PDSP подавляла активность ММР-9 в 3 раза. Эти результаты указывают на то, что PDSP подавляет экспрессию и активность ММР-9, вызванные гиперосмотическим стрессом.
При этом варианты осуществления изобретения были проиллюстрированы ограниченным количеством примеров. Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что возможны другие модификации или варианты в пределах объема изобретения. Таким образом, объем изобретения должен быть ограничен прилагаемой формулой изобретения.
Claims (16)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения офтальмологического заболевания у субъекта, содержащая пептид и фармацевтически приемлемый наполнитель, где пептид включает последовательность SEQ ID NO:1: S-X-X-A-X-Q/H-X-X-X-X-I/V-I-X-R, где каждый X независимо представляет собой любую аминокислоту.
- 2. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанный пептид не содержит последовательность SLGAEQRTESIIHR (SEQ ID NO:2) или SLGAEHRTESVIHR (SEQ ID NO:3).
- 3. Фармацевтическая композиция по п.1, где пептид содержит последовательности по любой из- 12 037698SEQ ID NO: 6-75.
- 4. Фармацевтическая композиция по п.1, где пептид состоит из 20, 22, 24 или 29 аминокислотных остатков.
- 5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4, где пептид модифицирован ацетилированием на N-конце или модифицирован амидированием на С-конце.
- 6. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4, где офтальмологическое заболевание представляет собой заболевание, связанное с повреждением роговицы.
- 7. Фармацевтическая композиция по п.6, где заболевание, связанное с повреждением роговицы, представляет собой синдром сухого глаза.
- 8. Фармацевтическая композиция по п.5, где концентрация указанного пептида составляет от 10 до 200 мкМ.
- 9. Фармацевтическая композиция по п.5, где указанная композиция находится в форме раствора, мази или геля.
- 10. Фармацевтическая композиция по п.5, где указанный субъект является человеком.
- 11. Способ профилактики и/или лечения офтальмологического заболевания, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, композиции по любому из пп.1-5.
- 12. Способ по п.11, где офтальмологическое заболевание представляет собой заболевание, связанное с повреждением роговицы.
- 13. Способ по п.11, где указанное заболевание, связанное с повреждением роговицы, представляет собой синдром сухого глаза.
- 14. Способ по п.11, где концентрация указанного пептида составляет от 10 до 200 мкМ.
- 15. Способ по п.11, где указанная композиция находится в форме раствора, мази или геля.
- 16. Способ по п.11, где указанный субъект является человеком.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201662405522P | 2016-10-07 | 2016-10-07 | |
| PCT/US2017/048340 WO2018067244A1 (en) | 2016-10-07 | 2017-08-24 | Compositions comprising pedf-derived short peptides and uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201990885A1 EA201990885A1 (ru) | 2019-08-30 |
| EA037698B1 true EA037698B1 (ru) | 2021-05-12 |
Family
ID=61831898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201990885A EA037698B1 (ru) | 2016-10-07 | 2017-08-24 | Композиции, содержащие короткие пептиды, полученные из pedf, и их применение |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11760784B2 (ru) |
| EP (1) | EP3596104A4 (ru) |
| JP (2) | JP2019533722A (ru) |
| KR (2) | KR20230169375A (ru) |
| CN (1) | CN110312732A (ru) |
| AU (2) | AU2017340245B2 (ru) |
| EA (1) | EA037698B1 (ru) |
| IL (1) | IL265796A (ru) |
| TW (1) | TW201822785A (ru) |
| WO (2) | WO2018067244A1 (ru) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019199679A1 (en) * | 2018-04-08 | 2019-10-17 | Brim Biotechnology, Inc. | Application of pedf-derived short peptides in the treatment of osteoarthritis |
| EA202092368A1 (ru) * | 2018-04-08 | 2021-01-18 | Брим Байотекнолоджи, Инк. | Применение происходящих из pedf коротких пептидов при заживлении сухожилий |
| US20210128685A1 (en) * | 2018-05-04 | 2021-05-06 | Brim Biotechnology, Inc. | Pedf-derived peptides for promoting meibomian gland regeneration and uses thereof |
| CN111632128B (zh) * | 2019-02-14 | 2022-07-05 | 三凡生技研发股份有限公司 | 短链胜肽组合物在预防或治疗干眼症的应用 |
| TWI759610B (zh) * | 2019-06-27 | 2022-04-01 | 晶碩光學股份有限公司 | 具有角膜修護功能的眼用產品 |
| TWI744683B (zh) * | 2019-08-27 | 2021-11-01 | 台灣基督長老教會馬偕醫療財團法人馬偕紀念醫院 | 短合成胜肽及其治療視網膜退化性疾病和/或組織損傷的用途 |
| JP7353548B2 (ja) * | 2019-08-27 | 2023-10-02 | 台湾基督長老教会馬偕医療財団法人馬偕紀念医院 | 網膜変性疾患及び／又は組織傷害を処置するための短鎖合成ペプチド及びその使用 |
| KR20230106115A (ko) * | 2019-10-06 | 2023-07-12 | 브림 바이오테크놀로지, 인코퍼레이티드 | Pedf-유래된 짧은 펩타이드 (pdsp)를 포함하는 조성물 및 그것의 사용 |
| CN112206312A (zh) * | 2020-11-19 | 2021-01-12 | 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） | 一种包含pedf的用于治疗干眼的药物组合物 |
| CN115364199A (zh) * | 2021-05-19 | 2022-11-22 | 远大医药（中国）有限公司 | 包含pedf衍生的短肽的组合物及其制备方法和用途 |
| WO2023244618A1 (en) * | 2022-06-13 | 2023-12-21 | Brim Biotechnology, Inc. | Compositions comprising pedf-derived short peptides for the treatment of dry eye diseases |
| TW202400628A (zh) * | 2022-06-24 | 2024-01-01 | 全福生物科技股份有限公司 | 用於治療神經營養性角膜炎疾病之包含pedf衍生短肽之組合物 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050260180A1 (en) * | 2004-03-12 | 2005-11-24 | Genvec, Inc. | Materials and methods for treating vascular leakage in the eye |
| US20130333068A1 (en) * | 2008-04-29 | 2013-12-12 | Marie Coffin | Genes and uses for plant enhancement |
| US20150079094A1 (en) * | 2013-09-13 | 2015-03-19 | The Penn State Research Foundation | Functional Peptide Analogs of PEDF |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6451763B1 (en) * | 1992-06-04 | 2002-09-17 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Retinal pigmented epithelium derived neurotrophic factor and methods of use |
| US6797691B1 (en) * | 1997-07-23 | 2004-09-28 | Northwestern University | Methods and compositions for inhibiting angiogenesis |
| EP1684692A2 (en) * | 2003-10-29 | 2006-08-02 | The Johns Hopkins University | Pigment epithelium-derived factor, novel biological activity and methods of use |
| EP1986676A4 (en) * | 2006-02-15 | 2009-11-04 | Univ Yale Inc | COMPOSITIONS AND METHODS USING PIGMENT EPITHELIUM DERIVED FACTOR (PEDF) PEPTIDE FRAGMENTS |
| CA2776748A1 (en) * | 2009-10-08 | 2011-04-14 | Neurotech Usa, Inc. | Use of pedf in an encapsulated cell-based delivery system |
| EP2508196B1 (en) * | 2011-03-23 | 2018-09-26 | Mackay Memorial Hospital | Use of PEDF-derived polypeptides for promoting stem cells proliferation and wound healing |
| TWI554521B (zh) * | 2011-10-19 | 2016-10-21 | 台灣基督長老教會馬偕醫療財團法人馬偕紀念醫院 | 色素上皮衍生因子衍生之多胜肽於治療禿髮和／或毛髮脫色之用途 |
| EP3342781B1 (en) * | 2012-08-09 | 2019-07-24 | MacKay Memorial Hospital | Use of pedf-derived polypeptides for promoting arteriogenesis |
| AU2012390200B2 (en) * | 2012-09-19 | 2017-06-29 | Mackay Memorial Hospital | Use of pedf-derived polypeptides for preventing and/or ameliorating skin aging |
| EA030022B1 (ru) * | 2012-09-20 | 2018-06-29 | Маккей Мемориал Хоспитал | Применение pedf-производных полипептидов для лечения остеоартрита |
-
2017
- 2017-08-24 WO PCT/US2017/048340 patent/WO2018067244A1/en unknown
- 2017-08-24 KR KR1020237039829A patent/KR20230169375A/ko active Application Filing
- 2017-08-24 EA EA201990885A patent/EA037698B1/ru unknown
- 2017-08-24 KR KR1020197012272A patent/KR20190066030A/ko not_active Application Discontinuation
- 2017-08-24 AU AU2017340245A patent/AU2017340245B2/en active Active
- 2017-08-24 JP JP2019540514A patent/JP2019533722A/ja active Pending
- 2017-08-24 US US16/340,113 patent/US11760784B2/en active Active
- 2017-08-24 EP EP17858860.4A patent/EP3596104A4/en active Pending
- 2017-08-24 CN CN201780075291.2A patent/CN110312732A/zh active Pending
- 2017-09-29 TW TW106133749A patent/TW201822785A/zh unknown
- 2017-10-07 WO PCT/US2017/042474 patent/WO2018067217A2/en active Application Filing
-
2019
- 2019-04-03 IL IL265796A patent/IL265796A/en unknown
-
2022
- 2022-06-28 AU AU2022204557A patent/AU2022204557A1/en not_active Abandoned
- 2022-09-29 JP JP2022155973A patent/JP2022185042A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050260180A1 (en) * | 2004-03-12 | 2005-11-24 | Genvec, Inc. | Materials and methods for treating vascular leakage in the eye |
| US20130333068A1 (en) * | 2008-04-29 | 2013-12-12 | Marie Coffin | Genes and uses for plant enhancement |
| US20150079094A1 (en) * | 2013-09-13 | 2015-03-19 | The Penn State Research Foundation | Functional Peptide Analogs of PEDF |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2017340245A1 (en) | 2019-05-23 |
| EP3596104A4 (en) | 2021-02-17 |
| JP2019533722A (ja) | 2019-11-21 |
| WO2018067217A3 (en) | 2019-05-02 |
| JP2022185042A (ja) | 2022-12-13 |
| WO2018067217A2 (en) | 2018-04-12 |
| IL265796A (en) | 2019-06-30 |
| EP3596104A1 (en) | 2020-01-22 |
| KR20190066030A (ko) | 2019-06-12 |
| US11760784B2 (en) | 2023-09-19 |
| WO2018067244A1 (en) | 2018-04-12 |
| CN110312732A (zh) | 2019-10-08 |
| TW201822785A (zh) | 2018-07-01 |
| AU2017340245B2 (en) | 2022-07-21 |
| US20190248859A1 (en) | 2019-08-15 |
| AU2022204557A1 (en) | 2022-07-21 |
| EA201990885A1 (ru) | 2019-08-30 |
| KR20230169375A (ko) | 2023-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA037698B1 (ru) | Композиции, содержащие короткие пептиды, полученные из pedf, и их применение | |
| Tang et al. | Sleep deprivation induces dry eye through inhibition of PPARα expression in corneal epithelium | |
| US11759499B2 (en) | Compositions and methods for prevention and treatment of corneal haze and scarring | |
| Ma et al. | Corneal autophagy and ocular surface inflammation: a new perspective in dry eye | |
| Lin et al. | Serine protease inhibitor A3K suppressed the formation of ocular surface squamous metaplasia in a mouse model of experimental dry eye | |
| JP2019065013A (ja) | 軟骨細胞の細胞外基質由来ペプチド | |
| US20230348538A1 (en) | Method for treatment of dry eye comprisng applying p55pik inhibitor | |
| Li et al. | Effects of topical mucolytic agents on the tears and ocular surface: a plausible animal model of mucin-deficient dry eye | |
| Fernandez-Robredo et al. | Azithromycin reduces inflammation in a rat model of acute conjunctivitis | |
| KR102356603B1 (ko) | 안구건조증 치료를 위한 레코플라본 함유 점안 조성물 | |
| Chaudhari et al. | Rodent models for dry eye syndrome: Standardization using benzalkonium chloride and scopolamine hydrobromide | |
| JP6779599B2 (ja) | 角結膜障害治療剤 | |
| TWI698250B (zh) | 短鏈胜肽組合物於預防或治療乾眼症之應用 | |
| Lin et al. | Comparison of 0.025% FK-506, 0.05% cyclosporin a, and 0.3% sodium hyaluronate eye drops for the treatment of botulinum toxin B-induced mouse dry eye | |
| JP2021523116A (ja) | マイボーム腺再生を促進するためのｐｅｄｆ由来ペプチドおよびその使用 | |
| EP3827814A1 (en) | Ophthalmic formulations | |
| KR20230117622A (ko) | 안구 표면 질환의 치료 방법 | |
| Kulualp et al. | Therapeutic effect of bovine amniotic fluid in murine dry eye model. | |
| WO2017049001A1 (en) | Protection and sealing of the ocular surface barrier by clusterin | |
| Chen et al. | A PEDF peptide mimetic effectively relieves dry eye in a diabetic murine model by restoring corneal nerve, barrier, and lacrimal gland function | |
| TWI540141B (zh) | 短合成胜肽及其治療和／或預防乾眼症之用途 | |
| Peral Cerda et al. | Therapeutic Targets in Dry Eye Syndrome | |
| JP2007278819A (ja) | 角結膜障害若しくは涙腺機能障害の治療薬、改善薬または予防薬のスクリーニング方法 | |
| CZ20031891A3 (cs) | Použití L-karnitinu jako stabilizátoru proteinů |