KR20230169375A - Pedf-유래 짧은 펩타이드를 포함하는 조성물 및 그것의 사용 - Google Patents
Pedf-유래 짧은 펩타이드를 포함하는 조성물 및 그것의 사용 Download PDFInfo
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Abstract
대상체에서 안과 질환을 치료하기 위한 제약학적 조성물은 펩타이드 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하고, 상기 펩타이드는 SEQ ID NO: 1: S-X-X-A-X-Q/H-X-X-X-X-I/V-I-X-R의 서열을 함유하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 10월 7일에 출원된 미국 출원 번호 62/405,522의 우선권을 주장하며, 상기 출원의 내용은 그 전문이 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 PEDF-유래 짧은 펩타이드 및 안과 질환, 특히 건성안 질환(dry eye diseases)의 치료 및/또는 개선에서의 그것의 사용에 관한 것이다.
건성각결막염(Keratoconjunctivitis Sicca)으로도 알려져 있는 건성안 질환 또는 증후군 (DED 또는 DES)은 불편함, 시각 장애, 및 잠재적인 안구 표면의 손상을 유발하는 눈물막 불안정성의 증상들을 초래하는 복잡한 질환이다. 건성안 (dry eye)은 눈물막의 증가된 삼투압 및 안구 표면의 염증에 수반된다. 건성안 신호/증상의 중증도 또한 환자들 사이에서 광범위하게 달라진다. 일부 환자들은 단지 미미한 자극에 시달리는 한편, 다른 환자들은 중증의 각막 손상 및 시각 장애로 이어지는 유의한 합병증을 겪는다.
건성각결막염으로도 알려져 있는 건성안 질환 (DED) 또는 건성안 증후군 (DES)은 눈물막 조성물 (지질, 수분, 및 뮤신), 안구 표면 또는 눈물 생성에 영향을 미쳐서, 안구 건조, 포깅 바디 감각(forging body sensation), 자극 및 통증을 초래하는 다인성 안구 표면 장애(multifunctional ocular surface disorder)이다. DED는 눈물막의 눈물 조성 또는 안정성 중 임의의 것의 생성에 영향을 미치는 다양한 이유로부터 발생할 수 있다 (예컨대 눈물의 빠른 증발). 이에 더불어, 눈물 고삼투압, 눈물 불안정성, 안구 표면 상피 통합성의 부적당한 지지가 또는 건성안을 유발할 수 있다.
눈물 고삼투압 상태는 안구 상피 세포의 염증 캐스케이드를 잠재적으로 손상시키고 자극할 수 있고, 결막 고블렛 세포(conjunctival goblet cell)를 포함한 표면 상피 세포의 상실로 이어질 수 있다. 고블렛 세포의 상실은 뮤신-분비를 감소시키고, 그것은 계속해서 표면 상피의 보호의 상실 및 눈물막 불안정성을 초래하며, 결국 건성안 증상의 발달뿐만 아니라 각막 상피 세포 상의 손상으로 이어진다. 이런 결과적인 눈물막 불안정성은 자주 DED를 유발하는 안구 표면에 대한 염증 및 손상의 만성 사이클을 초래한다.
DED 환자에게는 이런 다인성 안구 상태의 치료에 대한 막대한 미충족 요구가 있다. 현재, DED 환자에게는 인공 눈물, 항염증 약물, 및 진통제를 포함한, 소수의 치료 선택권이 있다. 비록 이런 치료들이 일부 환자들의 일부 증상을 완화시킬 수는 있지만, DED에 대한 더 나은 치료 및 예방 수단이 광범위하게 바람직하다.
본 발명의 구체예들은 건성안의 예방 및/또는 치료를 위한 시약 및 방법에 관한 것이다.
발명의 한 측면은 대상체에서 안과 질환을 치료하기 위한 제약학적 조성물에 관한 것이다. 발명의 한 구체예에 따르는 제약학적 조성물은 펩타이드 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하며, 여기서 펩타이드는 SEQ ID NO:1: S-X-X-A-X-Q/H-X-X-X-X-I/V-I-X-R의 서열을 포함하고, 이때 각 X는 독립적으로 임의의 아미노산이며, 단 펩타이드는 각각 인간 및 마우스 PDSP 서열에 상응하는 SLGAEQRTESIIHR (SEQ ID NO:2) 또는 SLGAEHRTESVIHR (SEQ ID NO:3)의 서열을 포함하지 않는다. 조성물은 용액, 연고, 또는 겔의 형태로서 있을 수 있다.
발명의 일부 구체예에 따르면, 펩타이드는 SEQ ID NO: 6 내지 75 중 임의의 하나의 서열을 포함한다. 발명의 일부 구체예에 따르면, 펩타이드는 20, 22, 24, 또는 29개의 아미노산 잔기로 구성되는 길이이다.
발명의 일부 구체예에 따르면, 안과 질환은 건성안 증후군 (DES)일 수 있는, 각막 손상 관련 질환이다.
발명의 한 측면은 안과 질환을 치료하는 방법에 관련된다. 발명의 한 구체예에 따르는 방법은 상기 기술된 펩타이들 중 임의의 하나를 함유하는 조성물을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 안과 질환은 건성안 증후군 (DES)일 수 있는, 각막 손상 관련 질환이다.
발명의 다른 측면은 다음의 설명 및 첨부된 도면으로 분명해질 것이다.
도 1(A)는 각막 손상을 추정하기 위해 사용된 각막 플루오레세인 염색에 의해 드러나는 바, 건조 스트레스-유도 건성안에서 PEDF-유래 짧은 펩타이드 (PDSP)의 영향을 도시한다. C57BL6 마우스는 안구 표면 파괴를 유도하기 위하여 14일 동안 제어된 환경 챔버 (CEC)에서 하우징 (0일)된 후 추가의 5일 동안 (5일) PDSP 또는 비히클로 처리된다. 도 1(B)는 페놀 레드 스레드 검사에 의해 평가된 수성 눈물 생성의 양을 도시한다. NS: 정상 주변 조건 하에서 하우징된 비-스트레스 마우스. UT: 14일 동안 CEC에 하우징된 미처리 마우스.
도 2(A)는 원개 결막(forniceal conjunctiva)의 고블렛 세포의 과요오드산 시프 시약 (PAS) 염색의 대표적인 이미지를 도시한다. 원래 배율X100. C57BL6 마우스는 CEC에 14일 동안 하우징된한 후 추가로 5일 동안 PDSP 또는 비히클로 처리된다. 도 2(B)는 PDSP 처리 후 유의하게 증가된 PAS-염색된 양성 세포의 평균 수를 도시한다. 데이터는 평균±SD로서 표시된다.
도 3은 건조 스트레스에 의해 유발된 안구 표면 장벽 파괴의 방지를 증명하는 국소 적용 PDSP의 결과를 도시한다. 마우스는 CEC에 14일 동안 하우징되었고 CEC에서의 하우징이 시작될 때 100 μM PDSP로 출발하여 투여되었다. 값은 평균±SD로서 표현된다.
도 4는 건조 스트레스-유도 안구 염증에 미치는 국소 PDSP 적용의 영향을 도시한다. C57BL6 마우스는 CEC에 14일 동안 하우징된 후 (0일) 추가의 5일 동안 PDSP 또는 비히클로 처리되었다 (5일). 다양한 염증 인자의 mRNA 수준이 정량적 실시간 PCR에 의해 평가된다. 값들은 각 그룹에서 평균 ± SE로서 표현된다. * NS: 비-스트레스 마우스에 대비하여 P <0.05. ** 비히클-처리된 그룹에 대비하여 P <0.05.
도 5는 PDSP의 국소 적용이 산화성 스트레스-유도 지질 과산화를 방지하는 것을 도시한다. 마우스는 CEC에 14일 동안 하우징되었고 CEC에서의 하우징이 시작될 때 100 μM PDSP로 출발하여 투여되었다. 도 5(A)는 건성안의 각막 상피에서 산화성 스트레스 마커 4-HNE의 대표적인 면역조직화학을 도시한다. 도 5(B)는 양성 4-HNE 세포의 정량적 분석의 결과를 도시한다. 값들은 평균±SD로서 표현된다. * 비히클-처리된 그룹에 대비하여 P <0.00002. (C) 건성안의 결막 상피에서 4-HNE의 대표적인 면역조직화학.
도 6은 NaCl-처리된 토끼 각막 상피 세포에서 세포내 ROS 및 GSH 수준에 미치는 PDSP의 영향을 도시한다. 토끼 각막 상피 세포가 10 μM PDSP 또는 대조군 펩타이드 (ConP, PEDF의 잔기 93 내지 110)로 20시간 동안 전처리된 후 NaCl로 처리되어 고삼투압 스트레스가 유도되었다. 추가로 24시간 동안 NaCl로 처리된 후, 세포에 대해 H2DCFDA 프로브에 의한 ROS의 검출 (A) 또는 OPA 프로브에 의한 글루타티온 (GSH)의 검출 (B)이 수행되었다. * 미처리 세포에 대비하여 P< 0.002 (등장성 배지 중의 세포). # ContP/NaCl-처리 세포에 대비하여 P< 0.05 (고삼투성 배지 중의 세포).
도 7은 NaCl-처리된 토끼 각막 상피 세포에서 MMP-9 mRNA 발현 및 활성에 미치는 PDSP의 영향을 도시한다. 도 7(A)는 정량적 실시간 PCR에 의해 평가된, MMP-9 mRNA 수준을 도시한다. 값들은 각 그룹에서 평균 ± SE로서 표현된다. * 미처리 세포에 대비하여 P< 0.005. # ContP/NaCl-처리 세포에 대비하여 P< 0.02. 도 7(B)는 젤라틴 자이모그래피에 의해 평가된 MMP-9 활성을 도시한다. 값들은 각 그룹에서 평균 ± SE로서 표현된다. * 미처리 세포에 대비하여 P< 0.0001. # ContP/NaCl-처리 세포에 대비하여 P< 0.0003.
도 8은 플루오레세인 염색에 의해 드라난 건조-유도 각막 손상의 예방 또는 치료에서 다양한 알라닌-치환 펩타이드의 영향을 도시한다. 마우스는 CEC 환경에서 14일 동안 하우징되어 건성안이 유도되고 다양한 펩타이드가 눈에 5일 동안 적용되었다. 5일 후에, 각막이 플루오레세긴으로 염색되어 표면에 대한 손상이 평가된다.
도 9는 페놀 레드 스레드 방법에 의해 드러난 눈물 생성의 향상에서 다양한 알라닌-치환 펩타이드의 영향을 도시한다.
도 10은 배양 중의 C2C12 세포의 세포 생존역에 미치는 다양한 알라닌-치환 펩타이드의 영향을 도시한다. 세포 생존력은 MTT 검정으로 평가되었다.
도 11은 건조 스트레스-유도 건성안에서 인간 PDSP 29mer 및 moPDSP 29mer 변종의 치료 효과를 도시한다. C57BL6 마우스가 제어된 환경 챔버 (CEC)에서 14일 동안 하우징되어 안구 표면 파괴가 유도되었고 (0일) 그런 후 펩타이드 또는 비히클로 3일 동안 치료가 시작되었다 (3일). 각막 손상이 각막 플루오레세인 염색으로 편가되었다. 3일 동안 상이한 펩타이드에 대한 반응으로 마우스의 평균 각막 염색 득점. * 0일에 대비하여 P< 0.05.
도 12는 페놀 레드 스레드 검사로 평가된 눈물 생성의 결과를 도시한다. C57BL6 마우스가 제어된 환경 챔버 (CEC)에서 14일 동안 하우징되어 안구 표면 파괴가 유도되었고 (0일) 그런 후 펩타이드 또는 비히클로 3일 동안 치료가 시작되었다 (3일). NS: 정상 주변 조건 하에서 하우징된 비-스트레스 마우스. * 0일에 대비하여 P< 0.05.
도 2(A)는 원개 결막(forniceal conjunctiva)의 고블렛 세포의 과요오드산 시프 시약 (PAS) 염색의 대표적인 이미지를 도시한다. 원래 배율X100. C57BL6 마우스는 CEC에 14일 동안 하우징된한 후 추가로 5일 동안 PDSP 또는 비히클로 처리된다. 도 2(B)는 PDSP 처리 후 유의하게 증가된 PAS-염색된 양성 세포의 평균 수를 도시한다. 데이터는 평균±SD로서 표시된다.
도 3은 건조 스트레스에 의해 유발된 안구 표면 장벽 파괴의 방지를 증명하는 국소 적용 PDSP의 결과를 도시한다. 마우스는 CEC에 14일 동안 하우징되었고 CEC에서의 하우징이 시작될 때 100 μM PDSP로 출발하여 투여되었다. 값은 평균±SD로서 표현된다.
도 4는 건조 스트레스-유도 안구 염증에 미치는 국소 PDSP 적용의 영향을 도시한다. C57BL6 마우스는 CEC에 14일 동안 하우징된 후 (0일) 추가의 5일 동안 PDSP 또는 비히클로 처리되었다 (5일). 다양한 염증 인자의 mRNA 수준이 정량적 실시간 PCR에 의해 평가된다. 값들은 각 그룹에서 평균 ± SE로서 표현된다. * NS: 비-스트레스 마우스에 대비하여 P <0.05. ** 비히클-처리된 그룹에 대비하여 P <0.05.
도 5는 PDSP의 국소 적용이 산화성 스트레스-유도 지질 과산화를 방지하는 것을 도시한다. 마우스는 CEC에 14일 동안 하우징되었고 CEC에서의 하우징이 시작될 때 100 μM PDSP로 출발하여 투여되었다. 도 5(A)는 건성안의 각막 상피에서 산화성 스트레스 마커 4-HNE의 대표적인 면역조직화학을 도시한다. 도 5(B)는 양성 4-HNE 세포의 정량적 분석의 결과를 도시한다. 값들은 평균±SD로서 표현된다. * 비히클-처리된 그룹에 대비하여 P <0.00002. (C) 건성안의 결막 상피에서 4-HNE의 대표적인 면역조직화학.
도 6은 NaCl-처리된 토끼 각막 상피 세포에서 세포내 ROS 및 GSH 수준에 미치는 PDSP의 영향을 도시한다. 토끼 각막 상피 세포가 10 μM PDSP 또는 대조군 펩타이드 (ConP, PEDF의 잔기 93 내지 110)로 20시간 동안 전처리된 후 NaCl로 처리되어 고삼투압 스트레스가 유도되었다. 추가로 24시간 동안 NaCl로 처리된 후, 세포에 대해 H2DCFDA 프로브에 의한 ROS의 검출 (A) 또는 OPA 프로브에 의한 글루타티온 (GSH)의 검출 (B)이 수행되었다. * 미처리 세포에 대비하여 P< 0.002 (등장성 배지 중의 세포). # ContP/NaCl-처리 세포에 대비하여 P< 0.05 (고삼투성 배지 중의 세포).
도 7은 NaCl-처리된 토끼 각막 상피 세포에서 MMP-9 mRNA 발현 및 활성에 미치는 PDSP의 영향을 도시한다. 도 7(A)는 정량적 실시간 PCR에 의해 평가된, MMP-9 mRNA 수준을 도시한다. 값들은 각 그룹에서 평균 ± SE로서 표현된다. * 미처리 세포에 대비하여 P< 0.005. # ContP/NaCl-처리 세포에 대비하여 P< 0.02. 도 7(B)는 젤라틴 자이모그래피에 의해 평가된 MMP-9 활성을 도시한다. 값들은 각 그룹에서 평균 ± SE로서 표현된다. * 미처리 세포에 대비하여 P< 0.0001. # ContP/NaCl-처리 세포에 대비하여 P< 0.0003.
도 8은 플루오레세인 염색에 의해 드라난 건조-유도 각막 손상의 예방 또는 치료에서 다양한 알라닌-치환 펩타이드의 영향을 도시한다. 마우스는 CEC 환경에서 14일 동안 하우징되어 건성안이 유도되고 다양한 펩타이드가 눈에 5일 동안 적용되었다. 5일 후에, 각막이 플루오레세긴으로 염색되어 표면에 대한 손상이 평가된다.
도 9는 페놀 레드 스레드 방법에 의해 드러난 눈물 생성의 향상에서 다양한 알라닌-치환 펩타이드의 영향을 도시한다.
도 10은 배양 중의 C2C12 세포의 세포 생존역에 미치는 다양한 알라닌-치환 펩타이드의 영향을 도시한다. 세포 생존력은 MTT 검정으로 평가되었다.
도 11은 건조 스트레스-유도 건성안에서 인간 PDSP 29mer 및 moPDSP 29mer 변종의 치료 효과를 도시한다. C57BL6 마우스가 제어된 환경 챔버 (CEC)에서 14일 동안 하우징되어 안구 표면 파괴가 유도되었고 (0일) 그런 후 펩타이드 또는 비히클로 3일 동안 치료가 시작되었다 (3일). 각막 손상이 각막 플루오레세인 염색으로 편가되었다. 3일 동안 상이한 펩타이드에 대한 반응으로 마우스의 평균 각막 염색 득점. * 0일에 대비하여 P< 0.05.
도 12는 페놀 레드 스레드 검사로 평가된 눈물 생성의 결과를 도시한다. C57BL6 마우스가 제어된 환경 챔버 (CEC)에서 14일 동안 하우징되어 안구 표면 파괴가 유도되었고 (0일) 그런 후 펩타이드 또는 비히클로 3일 동안 치료가 시작되었다 (3일). NS: 정상 주변 조건 하에서 하우징된 비-스트레스 마우스. * 0일에 대비하여 P< 0.05.
인간 색소 상피세포-유래 인자 (PEDF)는 418개의 아미노산을 함유하고, 분자량이 약 50 kDa인 분비된 단백질이다. PEDF는 많은 생물학적 기능을 가진 다기능성 단백질이다 (예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0047212 참조). PEDF의 상이한 펩타이드 영역은 상이한 기능의 원인인 것으로 나타났다. 예를 들어, 34-mer 단편 (PEDF의 잔기 44 내지 77)은 항-혈관신생 활성을 가지는 것으로 확인된 한편, 44-mer 단편 (PEDF의 잔기 78 내지 121)은 신경영양 특성을 가지는 것으로 확인되었다.
미국 특허 출원 공개 번호 2010/0047212는 PEDF가 줄기 세포의 자가-재생을 촉진할 수 있음을 개시한다. 미국 특허 제 9,051,547호 및 미국 특허 제 9,617,311호는 20 내지 39개 아미노산 길이를 가지는 PEDF의 단편 (PEDF의 잔기 93 내지 121)이 줄기 세포 증식 및 상처 치유, 특히 윤부(limbal) 상피 줄기 세포의 증식을 촉진할 수 있다.
발명의 구체예들은 PEDF로부터 유래된 짧은 펩타이드 단편들 및 그것들의 변종에 관련된다. 발명의 구체예들은 또한 건성안 증후군 (DES)의 예방 및/또는 치료에서의 이들 펩타이드의 사용에 관련된다.
건성안은 눈이 충분한 눈물을 생성하지 못하거나 눈물이 너무 빠르게 증발할 때 발생한다. 잠시 동안이라도 건성안을 갖게 되면 눈의 표면 상의 마모로 이어질 수 있다. 진전된 경우에, 상피는 병리적 변화, 예컨대 편평상피 화생 또는 고블렛 세포의 상실을 진행할 수 있다. 중증 경우에, 환자들은 각막 표면의 두꺼워짐, 각막 침식, 점상 각막염(punctate keratopathy), 상피 결핍, 각막 궤양와, 각막 신생혈관, 각막 반흔, 각막 얇아짐, 및 심지어 각막 천공을 포함하여, 각막 손상으로 귀결될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 PEDF로부터 유래된 특정 펩타이드 단편이 건조에 의해 유발된 각막 손상을 예방 및/또는 치료할 수 있다는 것을 발견하였다.
건성안 질환에 대한 동물 모델에서, 마우스는 제어된 환경 챔버 (CEC)에 놓여 앞서 기술된 건성안이 유도되었다 (Barabino et al., 2005). CEC에 놓인 마우스는 25% 미만의 상대 습도 (RH), 20 내지 22℃의 온도에, 15 L/분의 기류로, 1일에 12시간 동안 노출되었다. 비-스트레스 마우스는 정상 환경 (RH > 50%, 기류 없음, 21 내지 23℃의 온도)에서 동일한 기간 동안 유지되었다. 14일 후에, 비-스트레스 마우스는 비히클로 처리된 한편, 스트레스 마우스는 테스트 펩타이드 (예컨대 29mer PDSP) 또는 비히클 용액 (비히클 그룹)으로 5일 동안 처리되었다. 그런 다음, 각막이 플루오레세인 염색으로 조사되었다.
도 1(A)에서 나타낸 것과 같이, 14일째에, 각막 손상이 비-스트레스 그룹 및 테스트 그룹 둘 다에서 플루오레세인 염색으로 나타났다. PEDF-유래 짧은 펩타이드 (PDSP, PEDF의 잔기 93 내지 121)로 5일 동안 치료 후, 각막 표면 상의 손상은 본질적으로 사라진 한편, 대조군 그룹 (비히클로 치료)에서의 손상은 여전히 각막에 손상된 것을 나타냈다.
추가적으로, 본 발명에서는 다양한 길이를 가진 PDSP (20 내지 29개 아미노산, PEDF의 잔기 93으로부터 출발함)가 10 uM 내지 200 uM의 농도로 건성안 질환의 동물 모델에서 각막 손상을 수복할 수 있는 것으로 나타난다.
도 1(B)는 페놀 레드 스레드 테스트에 의해 드러난 눈물 생성 (이하의 단락에서 상세하게 기술됨)의 결과를 도시한다. 도 1(B)에서, NS는 비-스트레스 마우스를 나타내고, UT는 스트레스 및 미처리 마우스를 나타낸다. 도 1(B)에서 나타낸 것과 같이, PDSP로의 치료는, UT 및 비히클 처리된 그룹과 비교하여, 눈물 생성을 유의하게 증가시켰다.
인간에서, 각막앞 막으로서 알려져 있는, 눈을 코팅하는 눈물막은 3개의 뚜렷한 층을 가진다: 지질 층 (마이봄샘(Meibomian glands)에 의해 분비됨), 수성 층 (눈물샘에 의해 분비됨), 및 점성 층 (결막 고블렛 세포에 의해 분비됨). 스트레스-유도 건성안은 이들 구성요소들 중 임의의 것 또는 전부의 감소된 생성으로부터 유발될 수 있다.
감소된 뮤신 생성은 감소된 고블렛 세포로부터 유발될 수 있다. 본 발명은 PDSP가 건성안으로 인한 고블렛 세포의 감소를 예방할 수 있음을 보여준다. 도 2(A)는 마우스 눈의 과요오드산 시프 (PAS) 시약 염색으로부터의 결과를 보여준다. 간단히 설명하면, C57BL6 마우스가 CEC에 14일 동안 하우징된 후 PDSP 또는 비히클로 추가의 5일 동안 처리된다. 비-스트레스 눈이 비-스트레스 대조군 (NS)으로서 포함된다. 도 2(A)는 비-스트레스 눈 (NS), 비히클-처리된 눈, 및 PDSP-처리된 눈에서의 고블렛 세포의 대표적인 염색을 보여준다. 도 2(B)는 PDSP-처리된 눈이 미처리된 스트레스 눈 및 비히클-처리된 눈과 비교하여, 더 많은 고블렛 세포 (더 많은 PAS-양성 세포)를 가지는 것을 보여준다.
건성안 증후군을 반전 또는 치유할 수 있는 것에 더불어, 본 발명자들은 또한 PDSP가 건성안 상태에 의해 유발된 손상을 방지할 수 있음을 발견하였다. 실험에서, 100 μM의 농도의 PDSP 또는 비히클 (대조군으로서의)이 C57BL6 마우스의 눈에 적용된 후 마우스들은 제어된 환경 챔버 (저습도 및 기류가 있음)에서 14일 동안 유지되었다. 그런 다음, 건조 스트레스에 의해 유발된 안구 표면 장벽 파괴가 플루오레세인 염색으로 시각화되었다. 건조 스트레스에 의해 유발된 안구 표면 장벽 파괴는 안구 표면 손상의 정도를 기준으로 0부터 3까지 채점되었다. 도 3에서 나타난 것과 같이, PDSP는 비히클 처리 그룹에 비교하여, 안구 표면 손상을 효과적으로 예방하였다.
건성안은 전-각막 눈물막의 비정상 및 부속기, 결막 및 각막을 포함한, 전체 안구 표면의 후속되는 염증성 변화와 관련된다. (Hessen et al., "Dry eye: An Inflammatory Ocular Disease," J. Ophthalmic Vis. Res., 2014, 9(2): 240-250 참조). 그러므로, 각막 염증 반응에서 PDSP의 효과가 다음으로 조사되었다. 간단히 설명하면, C57BL6 마우스가 CEC에 14일 동안 하우징되고 (0일) 그런 후 PDSP 또는 비히클로의 치료가 추가의 5일 동안 수행되었다 (5일). 그런 다음, 염증성 인자에 대한 mRNA 수준이 정량적 실시간 PCR에 의해 평가되었다.
도 4에서 나타낸 것과 같이, 다양한 염증 관련 인자들, 예컨대 IL-1β, IL-6, TNF-α, 및 MCP-1 (단핵세포 화학주성인자 단백질-1 (MCP-1/CCL2)은 염증 및 조직 반응에서 백혈구의 충원을 제어하는 핵심 염증성 케모카인이다)의 발현은 스트레스-유도 건성안에서 증가되었다 (미처리 UT 그룹 참조). PDSP로의 치료는 이런 염증성 인자들의 발현을 미처리 UT 그룹 또는 비히클-처리된 그룹과 비교하여 유의하게 감소하였다. 그러므로, PDSP는 스트레스-유도 건성안에서 염증을 효과적으로 감소시킬 수 있다.
이에 더불어, 건성안 증후군과 산화성 스트레스의 축적 사이에 관계가 있는 것으로 가정되었다 (Nakamura et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2007, 48(4): 1552-8 참조). 그러므로, PDSP가 건성안에서 산화성 스트레스를 감소시킬 수 있는지 또는 예방할 수 있는지가 또한 조사되었다.
이 테스트를 위해, 마우스가 CEC에 14일 동안 하우징되었고 PDSP 치료가 CEC에 하우징되기 시작할 때 시작되었다. 그런 후, 산화성 스트레스 생성물 (예컨대, 4-하이드록시-2-노네날, 4-HNE)의 생성이 조사되었다. 4-HNE는 동물 조직 전체에서, 지질 과산화의 증가로 인해 산화성 스트레스 중에 대량으로 발견되었다. 4-HNE는 반응성 알데하이드를 함유하며, 그것은 단백질을 변형시킬 수 있다. 4-HNE-변형 단백질은 4-HNE 모이어티에 특이적인 항체들로 검출될 수 있다.
도 5(A)에서 나타낸 것과 같이, 비-스트레스 눈은 최소한의 4-HNE를 가진다. 스트레스-유도 건성안은 증가된 4-HNE 염색을 가진다 (비히클-처리된 그룹). 대조적으로, 스트레스-유도 건성안의 PDSP 치료는 4-HNE의 유의하게 감소된 생성을 초래하였다. 도 5(B)는 양성 4-HNE 세포의 정량적 분석의 결과를 나타낸다. 도 5(C)는 건성안의 결막 상피에서 4-HNE의 대표적인 면역조직화학 염색을 나타낸다.
일반적으로 누액의 고삼투압 (HOP)이 안구 염증 및 상처에 대한 원인인 것으로 알려져 있다. HOP는 세포 대사의 부산물인 반응성 산소 종 (ROS)의 생성을 유도할 수 있다. ROS 발생은 원추각막(keratoconus) 환자의 각막 섬유모세포에서 및 건성안 동물 모델의 각막 상피 세포에서 증가되는 것으로 보고되었다. 이런 관찰은 ROS가 건성안의 각막 손상에서 역할을 할 수 있음을 시사한다. 다른 한편으로, 글루타티온 (GSH)은 유리 라디칼 또는 ROS를 대응하고 유리 라디칼 또는 ROS에 의해 유발된 손상을 완화 또는 예방할 수 있는 천연 종이다.
그러므로 본 발명자들은 NaCl-처리된 (HOP) 토끼 각막 상피 세포에서 세포내 ROS 및 GSH 수준에 미치는 PDSP의 영향을 조사하였다. 간단히 설명하면, 토끼 각막 상피 세포가 10 μM PDSP 또는 음성 대조군 펩타이드(ConP)로 20시간 동안 전처리된 후, 이어서 NaCl로 치료되어 고삼투성 스트레스가 유도되었다. 또 다시 24시간 동안 NaCl 치료 후, 세포는 ROS 지표 염료인 2',7'-다이클로로다이하이드로플루오레세인 다이아세테이트 (H2DCFDA) 프로브를 사용하여 ROS에 대해 평가되었다. H2DCFDA는 세포로 확산될 수 있고, 그곳에서 그것의 아세테이트 에스테르 결합이 세포내 에스테라제에 의해 절단되고 ROS에 의해 산화될 수 있는데, ROS는 비형광성 다이클로로다이하이드로플루오레세인 다이아세테이트 (H2DCFDA)를 고도로 형광성 2',7'-다이클로로다이하이드로플루오레세인 다이아세테이트 (DCF)로 전환시킨다.
도 6(A)에서 나타낸 것과 같이, HOP 없이, PDSP는 단독으로, 미처리 마우스와 비교하여 DCF 형광을 증가시키지 못하였다. HOP가 NaCl로 유도된 때, PDSP로의 사전치료는 음성 대조군 펩타이드 (ConP)로의 사전치료와 비교하여, 감소된 ROS 생성 (즉 더 낮은 DC 형광)을 초래하였다. 이런 결과는 PDSP가 HOP 유도된 ROS 형성을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
도 6(B)는 상이한 치료 그룹에서 상대적인 GSH 수준을 보여준다. HOP 스트레스 없이, PDSP가 단독으로, 미처리 마우스와 비교하여, GSH 수준의 약간의 증가를 유도하였다는 것은 흥미롭다. 이런, 항산화제인 GSH의 증가된 수준은 세포가 산화성 스트레스를 더 잘 견디는 것을 가능하게 할 수 있을 것이다. HOP 하에서, PDSP 치료는 또한 대조군 펩타이드 (ConP)로의 치료와 비교하여, 증가된 GSH를 초래하였다. 이런 결과는 PDSP 치료가 ROS 생성을 최소화하고 동시에 GSH 수준을 증가시키는 것을 나타낸다. 조합된 효과는 세포들이 산화성 스트레스 또는 고삼투성 스트레스에 대해 훨씬 더 잘 견딜 수 있게 해줄 것이다.
건성안 증후군 (DES)은 눈물막의 증가된 오스몰 농도 및 안구 표면의 염증을 포함한다. 눈물의 고삼투압은 사이토카인 MMP-9의 상승된 수준을 생성하기 위하여 아픈 상피 세포를 유발하는 염증성 캐스케이드에 기여한다. 건성안의 증가된 MMP-9 활성은 정상이 아닌 각막 상피 장벽 기능, 증가된 각막 상피 박리, 및 각막 표면 불규칙성에 기여할 수 있다. (Chotikavanich et al., "Production and activity of matrix metalloproteinase-9 on the ocular surface increase in dysfunctional tear syndrome", Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2009; 50: 3203-3209).
그러므로, 본 발명자들은 또한 NaCl-처리된 토끼 각막 상피 세포에서 MMP-9 mRNA 발현 및 활성에 미치는 PDSP의 영향을 조사하였다. 간단히 설명하면, 토끼 각막 상피 세포가 상기 기술된 것과 같이 처리되었다. 도 7(A)는 정량적 실시간 PCR로 평가되는 바, 고삼투성 스트레스 없이, PDSP는 단독으로 MMP-9 mRNA 수준에 영향을 미치지 못하였음을 보여준다. 고삼투성 스트레스는 MMP-9 mRNA 수준 (음성 대조군 펩타이드, ConP, NaCl 치료가 이어짐)에 실질적인 (약 2배) 증가를 유도하였다. 비교하자면, PDSP 치료는 고삼투성 스트레스 하에서 (PDSP 치료 후 NaCl) MMP-9 mRNA 수준의 증가의 대부분을 효율적으로 억제하였다. MMP-9 mRNA 수준의 증가는, 도 7(B)에 나타낸 것과 같이, SDS-겔 및 효소 활성으로 측정되는 바, 실질적으로 MMP-9 단백질의 발현과 상관관계가 있다.
상기 결과들은 발명의 PDSP가 건성안 질환 (DED) 또는 건성안 증후군 (DES)을 예방 및 치료할 수 있음을 분명하게 보여준다. 구체적으로, DED의 예방 및 치료에서 발명의 PDSP의 효과는 다음을 포함한다: (1) 건성안 스트레스에 의해 유도된 각막 표면에 대한 손상을 예방 및 치유; (2) 눈물 생성을 증가시킴; (3) 결막 고블렛 세포의 유지 또는 보호; (4) 건성안 유도된 염증의 억제; (5) 산화성 스트레스 유도된 지질 과산화의 완화 또는 최소화; (6) 세포내 반응성 산소 종 (ROS)의 형성의 억제 및 세포내 글루타티온 (GSH) 수준의 증가; 및 (7) MMP-9 발현의 억제.
발명의 PDSP가 DED 예방 및 치료에 효과적인 작용제이기 때문에, 본 발명자들은 알라닌 스캐닝에 의해 PDSP의 구조-활성 관계를 추가로 조사하였다. 알라닌 스캐닝 실험에서, 본 발명자들은 인간 PEDF의 잔기 93 내지 121로부터의 29mer: 93SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT121 (SEQ ID NO:4)를 사용한다. 29mer의 각각의 아미노산은 알라닌으로 (또는 잔기가 알라닌이라면 글리신으로) 교체되었고 알라닌-치환된 또는 글리신-치환된 돌연변이체의 활성이 평가되었다.
도 8은 안구 염색 검정으로부터의 예시적인 결과를 도시한다. 이 테스트들에서, 건조 유도된 각막 표면 손상 (플루오레세인 염색으로 평가됨)이 상기에서 및 하기 단락에서 상세하게 설명되는 실험에서 기술되는 것과 같이 CEC에서 유도되었다. 이 결과들은 29mer의 잔기 1 (L93A), 4 (A96G), 6 (Q98A), 11 (I103A), 12 (I104A), 및 14 (R106A)에서의 알라닌 또는 글리신 치환이 PDSP 활성의 실질적인 손실을 초래하였고, 그것은 이런 잔기들이 PDSP 활성에 필수적인 것을 나타낸다.
도 9는 상기에서 및 이어지는 단락에서 상세하게 기술되는 것과 같이 수행된, 눈물 생성 검정으로부터의 예시적인 결과를 도시한다. 도 9에 도시된 눈물 생성을 기반으로 한 결과는 도 8에 도시된 플루오레세인 염색을 기반으로 한 결과들과 일치한다. 즉, 29mer의 잔기 1 (S93A), 4 (A96G), 6 (Q98A), 11 (I103A), 12 (I104A), 및 14 (R106A)에서의 알라닌 또는 글리신 치환은 눈물 생성을 유도하기 위하여 PDSP의 능력의 실질적인 상실을 초래하였고, 그것은 이들 잔기가 PDSP 활성에 필수적인 것을 나타낸다.
발명의 PDSP가 각막 표면 손상을 예방할 수 있고, 세포에서 산화성 스트레스를 감소시킬 수 있으며, 염증성 반응을 최소화할 수 있다는 사실은 PDSP가 세포 생존력을 일반적으로 유지하는 능력을 가질 수 있음을 시사한다. 이것은 세포 배양에서 세포 생존력으로 테스트되었다. 도 10은 C2C12 세포 배양을 사용하는 알라닌 스캐닝 실험의 결과를 보여준다. 세포 생존력은 염색 및 세포수 카운트로 또는 MTT 검정으로 평가될 수 있다. 이 기법들은 당업계에 잘 알려져 있다.
도 10에 나타낸 것과 같이, 29mer의 위치 1 (S93A), 4 (A96G), 6 (Q98A), 11 (I103A), 12 (I104A), 및 14 (R106A)에서의 잔기들에 대한 알라닌 (또는 글리신) 치환은 세포의 생존력을 지속/향상시키는 이 펩타이드들의 능력을 실질적으로 없앴다. 이런 알라닌 스캐닝 결과들은 건성안 동물 모델을 사용하는, 도 8 및 도 9에서 나타낸 결과들과 일치한다.
상기 실험들이 인간 PDSP 서열 (PDSP 29mer: SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT, SEQ ID NO:4)로 수행된 한편, 본 발명자들은 상응하는 마우스 서열 (moPDSP 29mer:SLGAEHRTESVIHRALYYDLITNPDIHST, SEQ ID NO:5)이 비슷하게 기능하는 것을 발견하였다. 예를 들어, 도 11은 안구 염색에 의해 드러난 것과 같이, 인간 (PDSP 29mer) 및 마우스 (moPDSP 29mer) 둘 다에 의해 건조에 의해 유도된 각막 표면 손상으로부터의 보호의 결과를 나타낸다. 마우스 서열은 인간 서열의 것과 유사한 효과를 가지는 것이 분명하다. 유사하게, 도 12는 인간 PDSP 및 마우스 PDSP가 둘 다 동일한 정도로 눈물 생성을 개선하였음을 보여준다. 이 결과들은 DES를 예방 및/또는 치료하는 그것들의 능력에 있어 인간 PDSP와 마우스 PDSP 사이에 식별가능한 기능적 차이가 없음을 확인해준다.
이 영역에서 인간 PEDF와 마우스 PEDF 사이의 아미노산 잔기 차이는 2개의 상동성 치환으로 구성되는데, 즉, 인간 서열에서 Q-98은 마우스 서열에서 H-98에 상응하고 인간 서열에서 I-103은 마우스 서열에서 V-103에 상응한다. 그러므로, 이 두 위치 (98 및 103)에서의 필수 잔기는 상응하는 잔기들로 교체될 수 있다 (98Q/H 및 103I/V).
당업자는 상동성 아미노산 치환이, 이러한 두 잔기가 건성안 치료 및 예방에 중요한 것으로 밝혀진다 하더라도, 전형적으로 현저하게 생물학적 활성에 영향을 주지 못한다는 것을 인정하게 될 것이다. 나아가, 당업자는 비필수 위치에서의 유사한 상동성 치환이 더 낫게 허용될 수 있을 것임을 인정할 것이다. 어떤 아미노산 치환이 상동성으로 여겨지는지는 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 실례는 (I, V, L, M), (Q, N, H), (D, E), (R, K, H), (S, T, C), 및 (F, Y, W)이고, 여기서 동일한 괄호 그룹의 아미노산은 전형적으로, 펩타이드 또는 단백질의 생물학적 활성에 유의하게 영향을 미치지 않으면서 서로 치환할 수 있다.
이 결과들을 기반으로, 당업자는 DED를 예방 또는 치료하기 위한 필수 펩타이드 서열이 다음: 1 S-2X-3X-4 A-5X-6 Q/H-7X-8X-9X-10X-11 I/V-12 I-13X-14 R (SEQ ID NO:1)과 같이 표시될 수 있는 것으로 결론내릴 수 있고, 여기서 각각의 X는 비필수 잔기를 나타내며 임의의 아미노산, 바람직하게는 천연 아미노산일 수 있다. 인간 PDSP에 대한 상응하는 서열은 SLGAEQRTESIIHR (SEQ ID NO:2)이고, 마우스 PDSP에 대한 것은 SLGAEHRTESVIHR (SEQ ID NO:3)이다.
당업자는 이런 필수 잔기들을 포함하는 펩타이드가 건성안을 예방 또는 치료하기 위해 사용될 수 있음을 인정할 것이다. 그러한 펩타이드는 일반적으로 PDSP (즉, PEDF 유래된 짧은 펩타이드)로서 언급될 수 있다. 이런 PDSP의 일부 실례들은 다음의 표에 예시된다:
당업자는 상기 표에 열거된 펩타이드 서열들이 단지 예시를 위한 것이고 다른 순열이 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 가능한 것을 인정할 것이다. 이에 더불어, 상기가 건성한 증후군을 예방 및/또는 치료하는 데 효과적인 짧은 또는 최소 펩타이드를 나타낼 수 있는 것인 한편, 더 긴 펩타이드가 또한 사용될 수 있다. 특히, 더 긴 펩타이드는 보다 유리한 약물동역학 및/또는 생체이용률을 제공할 수 있다.
더 긴 펩타이드의 경우, 추가적인 아미노산은 상기 펩타이드 중 임의의 하나의 N- 및/또는 C-말단에서 포함될 수 있다. 추가적인 아미노산은 임의의 적합한 잔기, 예컨대 상기 펩타이드의 영역을 플랭킹하는 인간 또는 마우스 PEDF로부터의 잔기들일 수 있다. 더 긴 펩타이드의 특정 실례는 20mer (PEDF의 잔기 93 내지 112; SEQ ID NO:76), 22mer (PEDF의 잔기 93 내지 114; SEQ ID NO:77), 24mer (PEDF의 잔기 93 내지 116; SEQ ID NO:78), 및 29mer (PEDF의 잔기 93 내지 121; SEQ ID NO:4)를 포함할 수 있다.
발명의 구체예들은 또한 대상체의 건성안을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관련된다. 발명의 구체예들에 따르는 대상체는 인간 또는 동물일 수 있다. 발명의 구체예에 따르는 방법은 상기 기술된 임의의 것으로부터 선택된 펩타이드를 포함하는 조성물로 건성안 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 발명의 실시예들에 따르면, 조성물은 발명의 펩타이드, 또는 그러한 펩타이드의 염을 제약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제, 예컨대 증류수, 식염수, 오일, 또는 겔과 함께 포함할 수 있다.
발명의 조성물은 임의의 적합한 투여 형태, 예컨대 용액, 연고, 현탁액, 겔 또는 에멀션으로 제제화될 수 있고, 그것들은 임의의 적합한 농도, 예컨대 10 내지 200 μM으로 제제화될 수 있다. 당업자는 창의적인 노력 없이 유효량을 전달하기에 적합한 농도에서 이것들을 제제화할 수 있을 것이다. 이러한 투여 형태는 눈에 국소 적용하기 위해 또는 다른 적합한 투여 경로 (예컨대 경구 또는 주사 투여)를 위해 제제화될 수 있다.
발명의 구체예들은 다음의 실험의 상세한 설명 및 실시예들로 추가로 예시될 것이다. 당업자는 이런 실험의 상세한 설명 및 실시예들이 단지 에시를 위한 것이고 다른 변형 및 변화가 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 가능한 것일 인정하게 될 것이다.
재료 및 방법
카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 (CMC), 과요오드산 시프 (PAS) 시약 및 덱사메타손은 모두 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)로부터 얻었다. 평형 염 용액 (BSS; Alcone) 중의 CMC (1% 중량/부피)를 PDSP에 대한 비히클로서 사용하였다. PDSP 및 음성 대조군 펩타이드 (ConP)를 합성하였고 안정성을 위해 NH2 말단에서 아세틸화 및 COOH 말단에서 아미드화로 변형시켰으며 GenScript (Piscataway, NJ, USA)의 지시대로 질량 분석에 의해 특성화하였다.
동물
생후 7 내지 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 이 실험에 사용하였다. 실험 과정은 맥케이 메모리얼 병원 검토 위원회(Mackay Memorial Hospital Review Board)에 의해 승인받았고 안과 및 시력 연구에서 동물의 사용(Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research)에 대한 ARVOStatement를 따라 수행되었다.
건성안 모델
건성안은 마우스를, 앞서 기술된 것과 같이 (Barabino et al., 2005) 제어된 환경 챔버 (CEC)에 넣음으로써 유도되었다. 간단히 설명하면, CEC에 넣은 마우스를 25%를 초과하는 상대 습도 (RH), 20 내지 22℃의 온도, 및 15 L/분의 기류에, 1일당 12시간 동안 노출시켰다. 스트레스-유도 건성안을 갖지 않은 비-스트레스 (NS) 마우스는 정상 환경 (RH >50%, 기류 없음, 21 내지 23℃의 온도)에서 동일한 기간 동안 유지시켰다.
각막 플루오레세인 염색 및
동물들을 졸레틸(zoletil) (6 mg/kg) 및 자일라진(xylazine) (3 mg/kg)의 혼합물의 복강내 주사에 의해 마취시켰다. 각막 상피 상처를 국소 플루오레세인 (Fluor-I-Strip, Ayerst Laboratories, Philadelphia, PA)으로의 염색에 의해 측정하였다. 각막 플루오레세인 염색을 코발트 블루 광 하에서 슬릿-램프 생체현미경으로 조사하였고 디지털 카메라로 촬영하였다. 각막의 염료 염색을 다음과 같은 방식으로 채점하였다: 점상 염색(punctuate Staining)이 없는 경우에 0점; 각막의 1/3 미만이 염색되었을 때 1점; 각막의 2/3 이하가 염색되었을 때 2점; 및 각막의 2/3 이상이 염색되었을 때 3점 (Horwath-Winter J 2013).
눈물 생성의 측정
눈물 생성을 페놀 레드-침지 면사 (Zone-Quick; Oasis, Glendora, CA)로 측정하였다. 마우스에서 이 테스트의 타당성은 이전에 기술된 것과 같이 수행하였다 (Dursun et al., 2002). 실들을 보석 겸자로 잡고 60초 동안 가쪽 눈구석에 놓았다. 눈물 생성을 눈물에 의해 젖어서 적색으로 변한 실의 밀리미터로 표시하였다.
고블렛 세포의 PAS 염색
동물들을 안락사시킨 후, 눈을 수술로 적출하여 10% 포르말린에 고정하고, 파라핀에 내장한 후, 5-μm 섹션으로 절단하였다. 결막의 위쪽 및 앞쪽의 고블렛 세포를 측정하기 위하여 섹션들을 과요오드산 시프 시약 (PAS; Sigma-Aldrich)으로 염색하고 조사하고 디지털 카메라가 장착된 현미경으로 촬영을 하였다. 결막의 PAS-양성 고블렛 세포를 각 눈으로부터의 5개의 섹션에서 조사하였다.
RNA 추출 및 정량적 실시간 PCR
총 RNA를 TRIzol (Invitrogen)을 사용하여 세포로부터 추출하고 RNase 유리 DNase I (Qiagen, Santa Clarita, CA)로 처리하여 게놈 DNA를 제거한 후 RNA 정제 키트 (Dynabeads; Invitrogen)로 정제하였다. cDNA의 합성을 Superscript III (Invitrogen)에 의해 수행하였다. 정량적 실시간 PCR을 GeneAmp 7700 서열 검출 시스템 (Applied Biosystems, Foster City, CA)으로 수행하였다. 증폭을 3 pmol의 프라이머, 연속적으로 희석된 RT 생성물 및 SYBR Green PCR 코어 시약 (Applied Biosystems)을 함유한 40 μl의 총 부피로 수행하였다. 특이적 PCR 프라이머의 서열은 마우스 TNF-α(승인 번호: NM_013693) 센스, 5'- CTACCTTGTTGCCTCCTCTTT -3' (SEQ ID NO:79), 안티센스, 5'- GAGCAGAGGTTCAGTGATGTAG -3' (SEQ ID NO:80); 마우스 IL-1β (승인 번호: NM_008361) 센스, 5'- GGTGTGTGACGTTCCCATTA -3' (SEQ ID NO:81), 안티센스, 5'- ATTGAGGTGGAGAGCTTTCAG -3' (SEQ ID NO:82); 마우스 IL-6 (승인 번호: NM_031168) 센스, 5'- GTCTGTAGCTCATTCTGCTCTG -3' (SEQ ID NO:83), 안티-센스, 5'- GAAGGCAACTGGATGGAAGT -3' (SEQ ID NO:84); 마우스 MCP-1 (승인 번호: NM_011333) 센스, 5'- CTCGGACTGTGATGCCTTAAT -3' (SEQ ID NO:85), 안티-센스, 5'- TGGATCCACACCTTGCATTTA -3' (SEQ ID NO:86); 토끼 MMP-9 (승인 번호: NM_001082203) 센스, 5'- TGCGAGTTTCCGTTCATCTT-3' (SEQ ID NO:87), 안티-센스, 5'- GTAGAGCTTGTCCTTGTCGTAG-3' (SEQ ID NO:88)이었다. 스텝-사이클 프로그램(step-cycle program)을, 95℃에서 15초 동안 변성시키고, 어닐링시키고 62℃에서 1분 동안 연장시키는 것을 총 40 사이클 동안 설정하였다. 모든 측정을 3개 한벌로 측정하였다. 형광 방출이 실시간으로 기준선 방출보다 높은 한계에 도달했을 때의 PCR 사이클 수에 상응하는 사이클 한계 (Ct) 값을 GeneAmp 7700 SDS 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 그런 다음 관심의 PCR 생성물 및 대조군 mRNA (GAPDH)의 Ct 값을 사용하여 샘플 간 mRNA의 상대적인 양을 계산하였다.
면역조직화학
산화성 스트레스-유도 지질 과산화를 각막 및 결막에서 4-하이드록시-2-노네날(4HNE)의 면역조직화학 검출에 의해 평가하였다. 포르말린-고정된, 파라핀-내장된 눈 시편들을 자일렌 중에서 파라핀을 제거하고 단계별 에탄올 농도에 재수화시켰다. 슬라이드를 10% 염소 혈청으로 60분 동안 차단한 후 4-HNE (1:100 희석) (ab46545, Abcam)에 대한 일차 항체와 함께 4시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 슬라이드를 계속해서 적절한 과산화효소-표지된 염소 면역글로불린 (1:500 dilution; Chemicon, Temecula, CA)과 함께 20분 동안 인큐베이션한 후 크로모겐 기질 (3,3'-다이아미노벤지딘)과 함께 2분 동안 인큐베이션한 후 헤마톡실린으로 대조염색하였다.
각막 상피 세포 배양 및 치료
생후 6개월의 뉴질랜드 화이트 토끼로부터 윤부 줄기 세포를 분리하고, 이전에 기술된 것과 같이 (Ho et al., 2013) 계속해서 14일 동안, DMEM/F-12 기준 배지 기반 세포-현탁액 배양에 의해 각막-유사 상피 세포 분화가 이루어질 때까지 배양하였다. 고삼투성 스트레스에 의해 유발된 ROS 또는 MMP-9 활성을 유도하기 위해, 세포를 밤새도록 90 mM NaCl의 첨가에 의해 이루어진 고장성 배지 (463 mOsm)에서 인큐베이션하였다. DMEM/F-12 기준 배지 (309 mOsm)에서 배양된 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 고삼투성 스트레스-유도 ROS 또는 MMP-9 활성에 미치는 예방 효과를 검출하기 위하여, 세포를 10 μM PDSP로 20시간 동안 전처리한 후 NaCl로 치료하였다.
젤라틴 자이모그래피
MMP-9 활성을 검출하기 위하여, 10 μL의 배양 배지를 사용하여 앞서 기술된 방법과 같이 (Li et al., 2004) 젤라틴 자이모그래피를 수행하였다. 밴드 세기를 자이모그래피에서 모델 GS-700 영상화 밀도계 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)로 평가하고 Labworks 4.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
세포내 ROS 및 글루타티온 함량의 측정
세포내 ROS 생성을, ROS에 의해 산화되었을 때 녹색 형광 화합물 2',7'-다이클로로플루오레세인 (DCF)을 방출하는 2',7'-다이클로로다이하이드로플루오레세인 다이아세테이트 (H2DCFDA; 분자 프로브, Eugene, OR)를 사용하여 검정하였다. 분광형광계 검정에 의해 ROD를 검출하기 위해, 세포를 PBS로 세척한 후 NP-40 용해 완충액 (10 mM Tris-Cl, pH 7.4, 10 mM NaCl, 및 0.5% NP-40)에 의해 용해시키고 5 μM H2DCFDA를 함유하는 PBS와 함께 암실에서 15분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 형광 (여기, 488 nm; 방출, 520 nm)을 스펙트라 MAXGEMINI 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다. H2DCFDA의 첨가가 없는 대조군 웰로부터의 배경 형광을 실험 판독값으로부터 뺐다.
GSH 수준을 글루타티온 검정 키트 (BioVision Research Products, Mountain View, CA)를 사용하여 제조사의 권고를 따라 정량화하였다. 간단히 설명하면, 과요오드산 처리된 세포 용해물을 OPA (o-프탈알데하이드) 프로브 및 GSH 완충액과 함께 40분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 형광을 SPECTRAmax GEMINI XS 형광 마이크로플레이트 형광분광계 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 상에서 여기의 경우 340 nm에서 및 방출의 경우 420 nm에서 판독하였다.
국소 PDSP 치료는 건조 스트레스에 의해 유도된 안구 표면 손상을 회복시킨다
PDSP가 건조 스트레스 (DS)-유도 안구표면 결함에서 치료 효과를 갖는지를 측정하기 위하여, 마우스를 제어된 환경 챔버 (CEC)에 14일 동안 하우징하여 안구 표면 파괴를 유발시켰다. CEC에서 14일 후에, 본 발명자들은 처음 실험에 대해 2보다 높은 형광 점수를 가진 마우스들을 사용하였다 (도 1A). 계속해서, 건성안을 25 내지 200 μM의 PDSP로 국소적으로 (3회/일) 또는 PDSP 비히클 (BSS 중의 1% CMC)로 또 다시 5일 동안 치료하는 한편으로, 동일한 건조 스트레스 프로토콜을 유지하였다.
제 0일에, 평균 눈물 부피는 면사 테스트에 의해 측정되는 바 비-스트레스 (NS) 마우스와 비교하여 유의하게 감소되었다 (5.4±0.4 mm에 대비하여 3.8±0.5 mm; 도 1B). 눈물 생성은 마우스가 PDSP로 5일 동안 처리된 후에 눈에서 비히클 그룹과 비교하여 유의하게 증가하였다 (4.5 ± 0.2에 대비하여 5 ± 0.3).
PDSP는 결막의 고블렛 세포의 양을 부분적으로 회복시킨다
고블렛 세포는 결막 원개의 표면 상피에 주로 존재하고 점성 눈물 생성에 기여한다. NS 눈의 과요오드산 시프 (PAS) 염색은 고블렛 세포가 결막 상피에서 연속적인 균일한 패턴을 나타내는 것을 보여주었다 (도 2A). 그러나, 건조 스트레스 후 14일 후 (제 0일), 결막의 PAS 염색은 고블렛 세포의 수가 NS 그룹과 비교하여 현저하게 감소하였음을 보여주었다 (38±3.2에 대비하여 58±3.1; 도 2B). 5일 동안 점안액 중의 PDSP 또는 비히클로의 치료로 결막 고블렛 세포 수는 비히클-처리된 대조군에 비교하여 PDSP-처리된 눈에서 유의하게 더 높았다 (37±1.1에 대비하여 46±3.8). 종합적으로, PDSP 치료는 고블렛 세포의 수를 구제하지 못하였다.
국소 PDSP는 건조 스트레스에 의해 유도된 안구 표면 손상을 예방한다
PDSP가 DS-유도 각막 상피 파괴를 억제할 수 있는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 14-일 건조 스트레스 프로토콜을 마우스에 적용하였고, 이 마우스들을 국소적으로 PDSP로 하루에 3회 처리하였다. 14일 후에, 각막 상피 결함을 플루오레세인 염료 염색에 의해 평가하였고 (도 3) 그 결과는 각막 플루오레세인 염색 점수가 PDSP-처리된 눈에 비해 비히클-처리된 눈에서 유의하게 더 높았음을 나타냈다 (0.7±0.2에 대비하여 1.7±0.3). 이런 결과는 PDSP가 또한 건조 스트레스에 대하여 안구 표면에 예방적 효과를 나타낼 수 있음을 가리킨다.
건조 스트레스 동물 모델에서 인간 및 마우스 PDSP의 비슷한 기능
인간 및 마우스에서 PEDF의 동일한 영역이 DED 대상체의 치료에 비슷하게 기능하는지를 조사하기 위한 것. 인간 PDSP 및 쥐과 PDSP의 활성을 마우스의 건조 스트레스-유도 건성안 모델에서 조사하였다. 인간 및 마우스 PDSP는 둘 다 건조 스트레스에 의해 유도된 안구 표면 손상 (도 11)뿐만 아니라 스트레스-유도 건성안을 가진 마우스에서 눈물 생성 (도 12)을 회복시킬 수 있는 것으로 나타난다.
PDSP는 건조 스트레스-유도 염증성 반응을 억제한다
염증이 실험 동물의 건조 스트레스-유도 건성안의 안구 표면 손상을 증가시킬 수 있을 것이라고 시사되었다 (Luo et al., 2004; De Paiva et al., 2006). 전염증성 매개물질 중에서, 건조 스트레스-유도 건성안은 TNF-α 또는 인터류킨-1 (IL-1) 차단제로 사전치료된 마우스에서 개선된 것으로 보고되었다 [Ji YW 2013; Okanobo A 2012]. 도 4에서 나타낸 것과 같이, 마우스가 CEC에서 14일 동안 하우징된 후에 (제 0일로서 설정됨; 미처리 마우스), IL-1β, TNF-α, IL-6 및 MCP-1을 포함한 전염증성 매개물질의 mRNA 수준은, 비-스트레스 (NS) 환경에서 하우징된 마우스와 비교하여, 각각 3.9-, 2.8-, 2.6-, 및 2.4-배씩 유의하게 상향조절되었다. 그러나, 마우스에서 5일 동안 국소 PDSP 치료는 안구 IL-1β, TNF-α, IL-6 및 MCP-1의 mRNA 발현을, 비히클-처리된 그룹에 비교하여, 각각 2.4-, 1.9-, 2.0-, 및 1.7-배씩 분명하게 억제하였다. 이것들을 함께 고려하면, 본 발명자들의 결과는 PDSP가 DS-유도 안구 염증성 반응을 약화시켰음을 나타낸다.
PDSP는 지질 과산화 관련 안구 표면 손상을 부분적으로 예방한다
반응성 산소 종 (ROS) 과잉생성으로부터 유발된 안구 표면에서의 산화성 손상은 건성안의 병리에 포함되었다 (Wakamatsu et al., 2013). 본 발명자들은 PDSP가 지질 과산화 관련 막 손상을 억제할 수 있는지를 4-HNE 면역조직화학 염색을 통해 조사하였다. 도 5A에서 나타낸 것과 같이, 마우스가 CEC에 14일 동안 하우징 된 후에, 각막 상피의 4-HNE 염색은 상피의 윙 세포(wing cell) 상에서 핵 및/또는 핵주변에 국한된 것을 나타냈고, 이것은 이전의 보고와 일치하였다 (Nakamura et al., 2007). 4-HNE에 대해 양성으로 염색된 세포의 수는 NS, 비히클 및 PDSP 그룹에서 각각 1.9±0.6, 20.1±1.4, 및 5.3±1.0이었고 (도 5B), 이것은 PDSP가 지질 과산화를 방지할 수 있음을 나타낸다. 이에 더불어, 결막에서의 DS-유도 지질 과산화를 또한 4-HNE 염색에 의해 평가하였고, 면역조직화학 결과는 4-HNE 신호가 PDSP 치료를 받은 눈에서보다 비히클-처리된 눈에서 분명하게 더 강력하였음을 나타냈으며, 이것은 추가로 PDSP의 항산화 효과의 발견을 지지하였다 (도 5C). 종합적으로, PDSP 치료는 안구 표면에서 DS-유도 산화성 손상을 유의하게 억제하였다.
PDSP는 각막 상피 세포에서 고삼투성 스트레스-유도 ROS 축적 및 글루타티온 고갈을 예방한다
상승된 눈물 오스몰농도는 염증 및 안구 표면 손상을 유도하는 건성안의 핵심 메커니즘인 것으로 여겨진다 (Stahl et al., 2012). 건성안 진단에 대한 현재의 컷오프는 정상 눈에서의 300 내지 310 mOsm에 비교하여 316 mOsm이다 (Liu et al., 2009). 그러나, 각막 상피 세포에서 고삼투압의 시험관내 연구는, ROS 및 MMP-9 활성을 유도하기 위해서는 더 높은 수준의 눈물 오스몰농도 (350 내지 500 mOsm)에 대한 세포의 장기간 노출이 필요한 것을 보여준다 (Li DQ 2004; Li J 2016).
세포내 ROS 형성에 미치는 고삼투성 스트레스의 영향을 조사하기 위하여, 토끼 각막 상피 세포를 90 mM NaCl을 첨가함으로써 고삼투성 배지 (463 mOsM)에서 24시간 동안 배양하였다. 세포내 ROS 수준을 H2DCFDA 프로브에 의해 검출하였고 DCF-형광의 형성을 분광형광계에 의해 측정하였다.
도 6A에 나타낸 것과 같이, DCF-형광은 등장성 배지 (309 mOsm)에서 배양된 세포에 비교하여, 세포가 고삼투성 배지에서 24시간 동안 배양된 후에 1.6배 증가하였다. 그러나, PDSP로 사전처리된 토끼 각막 상피 세포는 NaCl 단독으로 처리된 세포에 비교하여, 1.3배의 인자만큼 억제된 DCF-형광을 나타냈다 (P<0.04). 대조군 펩타이드 (ContP) 사전치료는 그런 영향을 나타내지 못하였다. NaCl-유도 고삼투성 스트레스 또한 등장성 환경에서의 대조군 세포에 비교하여, 항산화제인 글루타티온 (GSH)의 수준을 현저하게 떨어뜨린 반면 (도 6B; 100±7.0%에 대비하여 46.7±15.4%), PDSP로 다시 처리된 세포는 GSH 수준을 최대 70.5±11.4%로 유의하게 증가시켰다. 이 결과들은 PDSP가 NaCl-유도 고삼투성 스트레스 (463 mOsM)로 처리된 각막 상피 세포에서, 적어도 부분적으로 GSH 수준을 향상시키는 것을 통해 항-산화 효과를 나타내는 것을 가리킨다.
PDSP는 각막 상피 세포에서 고삼투성 스트레스-유도 MMP-9 발현을 억제한다
각막 상피 세포에서 고삼투성 스트레스-유도 MMP-9 발현에 미치는 PDSP의 효과를 조사하기 위하여, 세포를 PDSP 또는 대조군 펩타이드 (ConP)로 20시간 동안 사전처리한 후 세포를 고삼투성 배지 (463 mOsM)에 추가로 24시간 동안 노출시켰다. 도 7A에서 나타낸 것과 같이, ContP/ 고삼투성 배지로 처리된 세포에서 MMP-9의 mRNA 수준은 등장성 배지에서 배양된 세포 (미처리 대조군)에 비교하여, 3배만큼 유의하게 상향조절되었다. 그러나, PDSP 전처리는 MMP-9 mRNA 발현을 2배나 억제하였다.
젤라틴 자이모그래피는 또한 고삼투성 스트레스가 미처리 대조군에 비교하여, MMP-9 활성을 2.7배만큼 유도하였음을 증명하였다 (90 kDa에 가까운 크기; 도 7B). 자이모그래피는 추가로 PDSP 전처리가 MMP-9 활성을 3배나 억제하였음을 보여주었다. 이 결과들은 PDSP가 고삼투성 스트레스에 의해 유도된 MMP-9 발현 및 활성을 억제하는 것을 나타낸다.
발명의 구체예들이 제한된 수의 실시예로 예시되었다. 당업자는 다른 변형 또는 변화가 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 가능한 것을 인정할 것이다. 그러므로, 보호 범주는 첨부되는 청구범위에 의해 제한되어야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> BRIM Biotechnology, Inc.
Frank Wen-Chi Lee
<120> COMPOSITIONS COMPRISING PEDF-DERIVED SHORT PEPTIDES AND USES
THEREOF
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Claims (16)
- 대상체에서 안과 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 제약학적 조성물로서, 펩타이드 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하며, 여기서 펩타이드는 SEQ ID NO 1: S-X-X-A-X-Q/H-X-X-X-X-I/V-I-X-R의 서열을 포함하고, 여기서 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산인, 제약학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 SLGAEQRTESIIHR (SEQ ID NO:2) 또는 SLGAEHRTESVIHR (SEQ ID NO:3)의 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 펩타이드는 SEQ ID NO: 6 내지 75 중 임의의 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 펩타이드는 20, 22, 24, 또는 29개 아미노산 잔기로 구성되는 길이인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,펩타이드는 N-말단에서 아세틸화로 변형되거나 또는 C-말단에서 아미드화로 변형되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 안과 질환은 각막 손상 관련 질환인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 각막 손상 관련 질환은 건성안 증후군인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 펩타이드의 농도는 10 내지 200 μM인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 연고, 또는 겔의 형태인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 안과 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법으로서, 필요로 하는 대상체에게 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따르는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 안과 질환은 각막 손상 관련 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 각막 손상 관련 질환은 건성안 증후군인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 펩타이드의 농도는 10 내지 200 μM인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 연고, 또는 겔의 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체인 것을 특징으로 하는 방법.
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