CN115702926B - Versican蛋白在制备心肌损伤后修复的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供Versican蛋白在制备心肌损伤后修复的药物中的应用，该心肌损伤由心肌梗死造成，或心肌损伤发展为心力衰竭。Versican蛋白可作为治疗心肌梗死和心力衰竭的药物，通过刺激心肌细胞增殖，促进心脏再生与修复，从而减小心脏梗死面积，改善心肌梗死和心力衰竭患者的心泵功能，从而作为一种促进心血管疾病患者心脏修复的有效因子。

Description

Versican蛋白在制备心肌损伤后修复的药物中的应用

技术领域

本发明属于医学领域，涉及Versican蛋白在制备心肌损伤后修复的药物中的应用。

背景技术

心肌梗死和心力衰竭严重危害健康和生命。当前的治疗手段(如药物治疗和内科介入)能够增加心脏氧供，降低心脏负荷，但却无法从根本上解决心肌细胞丢失的问题，造成这一结果的直接原因是成年个体心肌细胞几乎不具备增殖能力。由此可见，心肌组织受损后心肌细胞数量的补充与维持，对于心血管疾病患者的治疗和预后有着决定性的作用。利用再生医学手段在心脏受损部位补充功能性心肌细胞是未来解决心力衰竭这一难题并提高预后的理想途径。因此，探讨心肌再生机制，进而发掘再生干预靶点、开发心肌梗死和心力衰竭的再生治疗手段刻不容缓。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供Versican蛋白在制备心肌损伤后修复的药物中的应用，实现心肌细胞增殖，促进心脏再生与修复的作用。

本发明另一目的在于提供Versican蛋白在制备治疗心肌梗死或心力衰竭的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供Versican蛋白在制备心肌损伤后修复的药物中的应用。

其中，所述心肌损伤由心肌梗死造成，或发展为心力衰竭。

本发明还提供Versican蛋白在制备治疗心肌梗死或心力衰竭的药物中的应用。

优选地，所述Versican蛋白为小鼠Versican蛋白或人Versican蛋白。

优选地，所述小鼠Versican蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示，所述人Versican蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.2所示。

本发明提供一种用于心肌损伤后的修复的药物，包含Versican蛋白。

优选地，进一步包括药学上可接受的载体。

优选地，所述药学可接受的载体包括稀释剂、赋形剂、崩解剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂、表面活化剂、稳定剂中的任何一种或多种组合。

优选地，所述药物的剂型为注射剂、针剂、片剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂中的任一种。

本发明的有益效果在于：

本发明提供Versican蛋白在制备心肌损伤后修复的药物中的应用以及在心肌梗死和心力衰竭治疗药物中的应用。Versican蛋白用于改善心肌梗死和心力衰竭患者的心泵功能，通过刺激心肌细胞增殖，促进心脏再生与修复，从而减小心脏梗死面积，改善心肌梗死和心力衰竭患者的心泵功能，可以作为一种促进心血管疾病患者心脏修复的有效因子。

附图说明

图1A为本发明提供的小鼠Versican蛋白处理体外分离培养的原代新生1 天小鼠心肌细胞24小时后，利用增殖标记物pH3与心肌细胞标记物α-actinin 进行免疫共染的结果图。

图1B为图1A的统计分析图。

图2A为本发明提供的小鼠Versican蛋白处理体外分离培养的原代新生1 天小鼠心肌细胞24小时后，利用增殖标记物Ki67与α-actinin进行免疫共染的结果图。

图2B为图2A的统计分析图。

图3A为本发明提供的小鼠Versican蛋白处理体外分离培养的原代新生1 天小鼠心肌细胞24小时后，利用增殖标记物Aurora B与α-actinin进行免疫共染的结果图。

图3B为图3A的统计分析图。

图4A为本发明提供的小鼠Versican蛋白处理体外分离培养的原代新生1 天小鼠心肌细胞24小时后，利用去分化标记物α-SMA和α-actinin进行免疫共染的结果图。

图4B为图4A的统计分析图。

图5为本发明提供的小鼠Versican蛋白处理了18小时后的原代新生1天小鼠心肌细胞RNA测序所得差异表达基因的热图和GO富集的结果图。

图6为本发明提供的小鼠Versican蛋白处理了18小时后的原代新生1天小鼠心肌细胞RNA测序所得差异表达基因的KEGG结果图。

图7A为本发明提供的小鼠Versican蛋白处理了12小时后的原代新生1天小鼠心肌细胞蛋白的Western blot结果图。

图7B为图7A的统计分析图。

图8A为利用激光共聚焦显微镜拍摄的增殖标记物pH3与α-actinin进行免疫共染的结果图。

图8B为使用Akt抑制剂LY292004(LY)和ERK抑制剂U0126对Versican 诱导的心肌细胞增殖(pH3标记)抑制的统计图。

图9A为利用激光共聚焦显微镜拍摄的增殖标记物Ki67与α-actinin进行免疫共染的结果图。

图9B为Akt抑制剂LY292004(LY)和ERK抑制剂U0126对Versican诱导的心肌细胞增殖(Ki67标记)抑制的统计图。

图10A为利用激光共聚焦显微镜拍摄的增殖标记物Aurora B与α-actinin进行免疫共染的结果图。

图10B为Akt抑制剂LY292004(LY)和ERK抑制剂U0126对Versican 诱导的心肌细胞增殖(Aurora B标记)抑制的统计图。

图11为构建Vcan^fl/fl小鼠的打靶载体。

图12为构建Col1a2-2A-CreER小鼠与Vcan^fl/fl小鼠杂交得到心脏成纤维细胞(Cardiac fibroblast，CF)特异敲除Vcan的小鼠(Vcan^△CF)示意图。

图13A为利用Western blot检测Vcan^△CF心脏成纤维细胞中Versican蛋白水平变化。

图13B为图13A的统计分析图。

图14为Vcan^△CF小鼠心尖切除手术和心肌梗死手术与心脏取材时间示意图。

图15A为新生一天Vcan^△CF小鼠进行心尖切除手术，术后7天取心脏组织利用心肌细胞去分化标记物α-SMA与α-actinin进行免疫共染的结果图。

图15B为图15A的统计分析图。

图16A为新生一天Vcan^△CF小鼠进行心尖切除手术，术后7天取心脏组织利用增殖标记物pH3与α-actinin进行免疫共染的结果图。

图16B为图16A的统计分析图。

图17A为新生一天Vcan^△CF小鼠进行心尖切除手术，术后7天取心脏组织利用激光共聚焦显微镜拍摄的增殖标记物Ki67与α-actinin进行免疫共染的结果图。

图17B为图17A的统计分析图。

图18A为新生一天Vcan^△CF小鼠进行心尖切除手术，术后7天取心脏组织利用的增殖标记物Aurora B与α-actinin进行免疫共染的结果图。

图18B为图18A的统计分析图。

图19为新生1天小鼠心尖切除后21天的心脏组织Masson染色图。

图20为图19的统计分析图。

图21为新生1天小鼠心尖切除后21天的心脏超声统计图。

图22为新生1天小鼠心梗后21天的心脏Masson染色图。

图23为图22的统计分析图。

图24为新生1天小鼠心梗后21天的心脏超声统计图。

图25为心脏成纤维细胞特异性敲除Vcan的新生1天小鼠(Vcan^△CF)心尖切除后立即进行心肌内小鼠Versican蛋白注射，在心尖切除后21天进行心脏组织Masson染色的结果图。

图26为图25的统计分析图。

图27为新生1天Vcan^△CF小鼠心尖切除后给予心肌注射Versican后21天的心脏超声统计图。

图28为提取从新生期到成年期C57BL/6J小鼠心脏组织，包括1天、4天、 7天、14天、28天和8周，利用Western blot检测出生后心脏组织中Versican 的蛋白水平变化结果图。

图29为成年小鼠心梗(MI)手术及小鼠Versican蛋白处理与心脏取材时间示意图。

图30A为利用Western blot检测成年小鼠心梗手术给予心肌注射Versican 蛋白或等量PBS处理后心肌组织中Versican的蛋白水平变化结果图。

图30B为图30A的统计分析图。

图31A为成年小鼠心梗手术给予小鼠Versican蛋白或等量PBS处理后7天心脏组织的麦胚凝集素(WGA)与细胞核标记物DAPI免疫染色结果图。

图31B为图31A的统计分析图。

图32为成年小鼠心梗手术给予小鼠Versican蛋白或等量PBS处理后7天取材心脏组织进行解离，计算心肌细胞数目的统计图，以等量PBS处理作为对照。。

图33A为成年小鼠心梗手术给予小鼠Versican蛋白或等量PBS处理后7天取材心脏组织进行解离，利用α-actinin与细胞核标记物DAPI免疫染色，观察成年小鼠心梗后心肌细胞的核型和倍性示意图。

图33B为成年小鼠心梗手术给予小鼠Versican蛋白或等量PBS处理后7天取材心脏组织进行解离，利用α-actinin与细胞核标记物DAPI免疫染色后心肌细胞的核型统计图。

图33C为成年小鼠心梗手术给予小鼠Versican蛋白或等量PBS处理后7天取材心脏组织，进行解离，利用α-actinin与细胞核标记物DAPI免疫染色后单核心肌细胞的倍性统计图。

图34A为成年小鼠心梗手术给予小鼠Versican蛋白或等量PSB处理后7天心脏组织与增殖标记物pH3与心肌细胞标记物α-actinin进行免疫共染的结果图。

图34B为图30A的统计图。

图35A为成年小鼠心梗手术给予小鼠Versican蛋白或等量PSB处理后7天心脏组织与增殖标记物Ki67与心肌细胞标记物α-actinin进行免疫共染的结果图。

图35B为图35A的统计图。

图36A为成年小鼠心梗手术给予小鼠Versican蛋白或等量PSB处理后7天心脏组织与增殖标记物Aurora B与心肌细胞标记物α-actinin进行免疫共染的结果图。

图36B为图36A的统计分析图。

图37为成年小鼠心梗手术给予小鼠Versican蛋白或等量PSB处理后28天心脏组织Masson染色的结果图。

图38为图37的统计分析图。

图39为成年小鼠心梗手术前及术后给予小鼠Versican蛋白或等量PSB处理后不同时间点利用小动物超声仪检测的心功能的变化结果图。

图40A为人源多能干细胞来源的心肌细胞进行PBS或人Versican蛋白处理 24小时后使用增殖标记物pH3与α-actinin进行免疫共染结果图。

图40B为图40A的统计图。

图41A为人源多能干细胞来源的心肌细胞进行PBS或人Versican蛋白处理24小时后使用增殖标记物Ki67与α-actinin进行免疫共染结果图。

图41B为图41A的统计图。

图42A为人源多能干细胞来源的心肌细胞进行PBS或人Versican蛋白处理 24小时后使用增殖标记物Aurora B与α-actinin进行免疫共染结果图。

图42B为图42A的统计图。

图43为用人Versican蛋白处理诱导的人源多能干细胞后，对心肌细胞功能基因(Cacna1c，Gja1，Kcnj2)和成熟基因(Scn5a，Casq2，S100a1，Myom2， Myom3，Cox6a2)表达量进行分析结果图。

具体实施方式

下面将对本发明的实施例进行详细、完善的描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

材料

1.Versican重组蛋白购买自Abbexa，UK，其中小鼠源Versican重组蛋白(简称：小鼠Versican蛋白，氨基酸序列如Seq ID No.1所示)货号为：abx069663，人源Versican重组蛋白(简称：人Versican蛋白，氨基酸序列如Seq ID No.2 所示)货号为：abx069660；由于Versican蛋白已商品化，因此直接购买使用。

2.人类诱导多能干细胞(hiPSC)、人心肌细胞分化试剂盒(产品编号：CA2004500)、/>人心肌细胞纯化培养基(产品编号： CA2005100)、人心肌细胞维持培养基(产品编号：CA2015002) 购买自北京赛贝生物技术有限公司。

3.Vcan^fl/fl小鼠委托北京百奥赛图基因生物技术有限公司构建。

4.Col1a2-2A-CreER小鼠由中国科学院上海生物化学与细胞生物研究所周斌研究员赠送，该小鼠根据文献Lingjuan He,et al,Preexisting endothelial cells mediatecardiac neovascularization after injury,Journal of Clinical Investigation,10.1172/JCI93868,127,8,(2968-2981),(2017).提供的方法制备。

5.C57BL/6J成年小鼠购买自北京维通利华实验动物技术有限公司， C57BL/6J新生1天小鼠购买自北京斯贝福生物技术有限公司。

6.新生鼠心脏分离试剂盒(Neonatal Heart Dissociation Kit,mouse and rat)购买自德国美天旎生物科技公司(Miltenyi Biotec)，产品编号130-098-373。

7.gentleMACS^TM Octo Dissociator购买自德国美天旎生物科技公司 (MiltenyiBiotec)，产品编号：130-095-937。

8.红细胞裂解液购买自上海碧云天生物技术有限公司，产品编号：C3702。

9.Western blot一抗稀释液购买自上海碧云天生物技术有限公司，产品编号P0256。

10.免疫荧光染色一抗稀释液购买自中杉金桥生物技术有限公司，产品编号 ZLI-9030。

11.山羊血清购买自中杉金桥生物技术有限公司，产品编号ZLI-9056。

12.Alexa Fluor 488驴抗兔免疫荧光抗体和Alexa Fluor 594驴抗小鼠免疫荧光抗体购买自Invitrogen公司，产品编号分别为A-32731和A-32742。

13.RNeasy Mini Kit购自Qiagen公司，产品编号：74104。

14.RIPA裂解液和PMSF购买自上海碧云天生物技术有限公司，产品编号分别为P0013D和ST506。

15.Atk抑制剂LY294002和ERK1/2抑制剂U0126购买自美国MCE (MedChemExpress)公司，LY294002产品编号HY-10108，U0126产品编号 HY-12031。

16.α-actinin抗体购买自英国Abcam公司，产品编号：ab9465；Ki67抗体购买自英国Abcam公司，产品编号：ab16667；Aurora B抗体购买自美国Sigma 公司，产品编号：A5102；phospho-histone H3(pH3)抗体购买自美国Millipore 公司,产品编号：06-570；α-SMA抗体购买自英国Abcam公司，产品编号：ab5694。

本实验所用实验动物均得到中国医学科学院阜外医院实验动物管理和使用委员会(the Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC,Fuwai Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences)的批准，并符合美国国立卫生研究院(NationalInstitute of Health,NIH)《the Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals》中的相关规定。

实施例1

为了证明Versican可以直接促进心肌细胞增殖，用小鼠Versican蛋白处理体外分离培养的原代C57BL/6J新生1天小鼠心肌细胞。24小时后，利用增殖标记物pH3、Ki67及Aurora B分别与心肌细胞标记物α-actinin进行免疫共染，评估Versican对心肌细胞增殖的影响。

具体步骤如下：

1.75％酒精短暂(1-2秒)浸泡新生1天的C57BL/6J小鼠，随后置于原代细胞操作台上。

2.使用显微器械获取小鼠心脏，置于PBS溶液中，修剪心房和流出道以及各种黏连组织，只保留心室肌组织。

3.使用新生小鼠心脏分离试剂盒中的酶试剂，根据试剂盒说明书中用量，将心室肌组织浸润于C型反应管中。

4.将C型反应管放置于gentleMACS^TM Octo Dissociator(Miltenyi Bio Tech,Teterow,Germany)进行解离反应，选择新生鼠心脏解离程序，处理约1小时。

5.程序结束后，用含10％FBS的DMEM培养液终止反应，300g离心5分钟，弃上清，轻弹沉淀，使其分散开，标准是没有明显的团块。

6.加入2-3ml的红细胞裂解液，室温裂解2分钟。300g离心5分钟。弃上清，轻弹沉淀，使其分散开，标准是没有明显的团块。PBS洗1次。

7.加入适量含10％FBS的DMEM培养液，随后将其移入培养皿中。差速贴壁1小时20分钟，收取上清，即为纯度约为85％的心肌细胞。

8.随后将细胞上清进行细胞计数。

9.将心肌细胞按照5×10⁵个细胞/孔接种入12孔培养板或按照2.5×10⁵/孔接种入共聚焦小皿EZ SLIDES(PEZGS0416，Millipore)，置于37℃和 5％二氧化碳培养箱中，培养过夜。

10.将培养板或共聚焦小皿中的细胞用PBS清洗2次，加入小鼠Versican 蛋白进行处理(100ng/ml)，对照组用等量PBS处理。实验组和对照组孔数各 3个。

11.24小时后，弃掉培养液，PBS清洗细胞2次，用4％多聚甲醛固定15 分钟。

12.PBS清洗2次，加入由山羊血清加入Triton X-100配制成含终浓度为 0.3％的Triton X-100的封闭液(1ml/孔)，室温封闭1小时。

13.甩掉封闭液，用一抗稀释液按说明书比例稀释好一抗(利用增殖标记物 pH3(稀释比1:1000)、Ki67(稀释比1:100)及Aurora B(稀释比1:100)分别与α-actinin(稀释比1:400)进行免疫共染)，加入到培养板中。4℃孵育过夜。

14.将细胞培养板或共聚焦小皿置于摇床上用PBS洗3次，每次5分钟。

15.用PBS稀释Alexa Fluor 488驴抗兔免疫荧光抗体(1:400)和Alexa Fluor 594驴抗小鼠免疫荧光抗体(1:400)，加入到培养板或共聚焦小皿上。室温避光孵育1小时。

16.避光将细胞培养板或共聚焦小皿置于摇床上用PBS洗3次，每次5分钟。

17.避光将含有DAPI的封片剂滴于PBS中(1ml加2滴)，反应15分钟。

18.将共聚焦小皿置于蔡司激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM800,Germany) 进行成像。利用共聚焦显微镜Z轴扫描进行共定位分析增殖标记物pH3、Ki67 及Aurora B的表达，

19.将12孔板置于高内涵机器Opera phenix(Perkin Elmer，USA)进行成像与统计分析。

结果如图1A至图3B所示。其中，图1A和图1B为利用增殖标记物 phosphorylatedhistone H3(pH3)与心肌细胞标记物α-actinin进行免疫共染的结果图，以等量PBS处理作为对照。pH3⁺α-actinin⁺细胞指示正在进行增殖的心肌细胞，如白色箭头所示。α-actinin(红色)标记心肌细胞，pH3(绿色)标记增殖指标，DAPI(蓝色)标记细胞核。结果表明Versican处理可促进pH3阳性心肌细胞明显增加，刺激心肌细胞增殖。

图2A和图2B为利用增殖标记物Ki67与α-actinin进行免疫共染的结果图，以等量PBS处理作为对照。Ki67⁺α-actinin⁺细胞指示正在进行增殖的心肌细胞，如白色箭头所示。α-actinin(红色)标记心肌细胞，Ki67(绿色)标记增殖指标， DAPI(蓝色)标记细胞核。结果表明Versican处理可促进Ki67阳性心肌细胞明显增加，刺激心肌细胞增殖。

图3A和图3B为利用增殖标记物Aurora B与α-actinin进行免疫共染的结果图，以等量PBS处理作为对照。Aurora B⁺α-actinin⁺细胞指示正在进行增殖的心肌细胞，如白色箭头所示。α-actinin(红色)标记心肌细胞，Aurora B(绿色) 标记增殖指标，DAPI(蓝色)标记细胞核。结果表明Versican处理可促进Aurora B阳性心肌细胞明显增加，刺激心肌细胞增殖。

从图1A至图3B可以看出，Versican可以显著促进心肌细胞增殖。

心肌细胞属于终末分化的细胞，在重新启动细胞周期前，需要经历由分化到去分化的过程。如图4A所示为去分化标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle Actin，α-SMA)和α-actinin进行免疫共染的结果图，以等量PBS处理作为对照，图中以PBS组为对照(左)，Versican处理组为实验组(右)，其中，α-SMA⁺α-actinin⁺细胞指示去分化的心肌细胞，如白色箭头所示。图4B对图4A 进行统计分析，可以看出Versican处理后α-SMA⁺α-actinin⁺细胞明显增加，表明 Versican处理可促进心肌细胞去分化。

实施例2

使用RNeasy Mini Kit提取实施例1中用小鼠Versican蛋白处理18小时后的新生1天C57BL/6J小鼠原代心肌细胞的RNA，提取过程按照试剂盒说明书进行操作。然后，利用Metagenomics公司的paired-end-run方法(PE150)，制备 cDNA文库。

采用Illumina Nova6000进行RNA测序(RNA-Sequencing，RNA-Seq)分析小鼠心肌细胞基因表达谱的变化。利用Gene ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes(KEGG)对差异表达的基因进行分析，结果如图5和图6所示。

如图5左半图所示，小鼠Versican蛋白处理后，差异基因表达的热图显示有589个基因上调，604个基因下调(红色代表Versican蛋白处理后表达上调的基因，蓝色代表Versican蛋白处理后表达上调的基因)。图5右半图GO富集分析结果显示心肌细胞内与增殖和生长因子刺激反应调控有关的基因表达上调；与分化和能量代谢相关的基因下调。KEGG分析如图6所示，经小鼠Versican 蛋白处理后，心肌细胞内PI3K-Akt和ERK1/2通路的激活被显著富集。

实施例3

收取用小鼠Versican蛋白处理了12小时后的原代培养的新生1天C57BL/6J 小鼠心肌细胞，按照如下步骤提取蛋白：

1.将细胞收集在Ep管中，加入80-100μl包含1mM PMSF的RIPA裂解液，在冰上操作。

2.冰上裂解40分钟后4℃，12500rpm，离心15分钟。

3.将蛋白上清转移至1.5ml EP管中。

然后通过Western blot检测Akt及ERK1/2的磷酸化水平，结果如图7A所示，然后对图7A进行统计分析，结果如图7B所示。从图7A和7B可以看出， Versican处理后，心肌细胞中Akt和ERK1/2的磷酸化水平均明显升高，表明 Versican处理可能通过激活心肌细胞Akt及ERK1/2信号通路，促进了心肌细胞增殖。

实施例4

利用Akt抑制剂LY294002(LY)或ERK1/2的抑制剂U0126处理原代 C57BL/6J新生1天小鼠心肌细胞抑制其激酶活性(终浓度均为10μM，预处理 1小时)，然后再给予小鼠Versican蛋白处理(终浓度为100ng/ml)。24小时后，利用增殖标记物pH3、Ki67及Aurora B分别与α-actinin进行免疫共染。置于蔡司激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM800,Germany)进行成像。利用共聚焦显微镜Z轴扫描进行共定位分析增殖标记物pH3、Ki67及Aurora B的表达。置于高内涵机器Opera phenix(Perkin Elmer，USA)进行成像与统计分析。结果如图8A、图8B、图9A、图9B、图10A和图10B所示。

图8A为利用增殖标记物pH3与α-actinin进行免疫共染的结果图，其中， pH3⁺α-actinin⁺细胞指示正在进行增殖的心肌细胞，如白色箭头所示。α-actinin (红色)标记心肌细胞，pH3(绿色)标记增殖指标，DAPI(蓝色)标记细胞核。图8B为使用Akt抑制剂LY292004(LY)和ERK抑制剂U0126对Versican 诱导的心肌细胞增殖(pH3标记)抑制的统计图。

从图8A和图8B可以看出，抑制Akt或ERK，导致Versican诱导增加的 pH3阳性心肌细胞减少，说明Versican通过激活Akt和ERK促进心肌细胞增殖。

图9A为利用增殖标记物Ki67与α-actinin进行免疫共染的结果图，其中， Ki67⁺α-actinin⁺细胞指示正在进行增殖的心肌细胞，如白色箭头所示。α-actinin (红色)标记心肌细胞，Ki67(绿色)标记增殖指标，DAPI(蓝色)标记细胞核。图9B为Akt抑制剂LY292004(LY)和ERK抑制剂U0126对Versican诱导的心肌细胞增殖(Ki67标记)抑制的统计图。

从图9A和图9B可以看出，抑制Akt或ERK，导致Versican诱导增加的 Ki67阳性心肌细胞减少，说明Versican通过激活Akt和ERK促进心肌细胞增殖。

图10A为利用增殖标记物Aurora B与α-actinin进行免疫共染的结果图，其中，Aurora B⁺α-actinin⁺细胞指示正在进行增殖的心肌细胞，如白色箭头所示。α-actinin(红色)标记心肌细胞，Aurora B(绿色)标记增殖指标，DAPI(蓝色) 标记细胞核。图10B为Akt抑制剂LY292004(LY)和ERK抑制剂U0126对 Versican诱导的心肌细胞增殖(Aurora B标记)抑制的统计图。

从图10A和图10B可以看出，抑制Akt或ERK，导致Versican诱导增加的 Aurora B阳性心肌细胞减少，说明Versican通过激活Akt和ERK促进心肌细胞增殖。

从上述结果可以看出，Akt抑制剂LY294002(LY)和ERK抑制剂U0126 能够分别抑制Versican的促心肌细胞增殖作用，说明Versican通过激活Akt和 ERK1/2途径促进心肌细胞增殖。

实施例5Vcan^fl/fl小鼠构建

Vcan^fl/fl(Vcan即Versican的基因名)小鼠委托北京百奥赛图基因生物技术有限公司构建，主要过程如下：

1.设计sgRNA序列并合成相应引物，通过Gibson Assembly的方式连入 pCS-3G载体，连接产物转化后送样测序验证连接是否正确，并检测活性，确定 sgRNA序列，其中5’序列如Seq ID No.3所示： GATAGCTCAAGCTTCACAATCGG，3’序列如Seq ID No.4所示：AAGTATTATTCTAGGAGTCTGGG。

2.将sgRNA序列连入带T7启动子的质粒载体并进行体外转录，得到用于显微注射的RNA。

3.设计打靶载体，通过酶切鉴定和测序，确认打靶载体构建完成，打靶载体如图11所示。

4.将用于显微注射的RNA和打靶载体显微注射到小鼠C27BL/6N受精卵中，得到F0代小鼠，PCR鉴定阳性F0小鼠；阳性F0小鼠与野生型小鼠交配得到 F1代小鼠，PCR鉴定阳性F1小鼠，阳性F1小鼠自交鉴定得到纯合Vcan^fl/fl小鼠。

上述原始小鼠以及所用载体、试剂均由委托公司提供。

实施例6

Cre酶可作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA。它是一种位点特异性酶，能介导两个LoxP位点(序列)之间的特异性，使LoxP 位点间的基因序列Vcan被删除或。

将Col1a2-2A-CreER小鼠与Vcan^fl/fl小鼠杂交，如图12所示。从图12可以看出，Col1a2-2A-CreER先与Vcan^fl/fl小鼠杂交得到Col1a2-2A-CreER⁺；Vcan^fl/+小鼠，Col1a2-2A-CreER⁺；Vcan^fl/+小鼠再与Vcan^fl/fl小鼠杂交得到 Col1a2-2A-CreER；Vcan^fl/fl(Vcan^△CF)小鼠。

因为Col1a2几乎只在心脏成纤维细胞中表达，因此Vcan^△CF小鼠在他莫昔芬诱导下可以特异敲除心脏成纤维细胞中的Versican，結果如图13A和图13B 所示：图13A为利用Western blot检测Vcan^△CF心脏成纤维细胞中Versican蛋白水平变化，图13B为图13A的统计分析图。图13A和13B结果显示Vcan^△CF心脏成纤维细胞中Versican蛋白水平明显下降，说明心脏成纤维细胞中的Versican 被有效敲除。

取Vcan^fl/fl、Vcan^△CF的新生1天小鼠进行手术，小鼠手术与取材时间如图 14所示：对新生1天(P1)小鼠进行心尖切除(Apical resection，AR)手术或心梗(Myocardiolinfarction，MI)手术，术后7天(7dpr/dpi)取心脏进行心肌细胞去分化和增殖检测，术后21天(21dpr/dpi)进行心脏超声评估心功能，并取心脏组织制成石蜡切片进行Masson染色，判断纤维化程度。其中，dpr(day-post resection)代表的是心尖切除手术后天数，dpi(day-post infarction)代表的是心肌梗死手术后天数。

具体心尖切除手术操作步骤如下：

1.将新生1天小鼠埋在碎冰中低温麻醉2-3分钟(低温可诱导小鼠心跳和呼吸减弱)。

2.取出小鼠，将其仰卧位用医用胶带固定在事先预冷的微型金属手术台上；先用5％碘伏棉球将小鼠胸部皮肤由内向外消毒，再用75％的酒精棉球消毒。

3.在体视镜下，从小鼠左侧第四肋间用显微剪剪开皮肤，采用显微手术剪钝性分离皮下组织及肌肉入胸，用眼科镊撑开胸腔，轻轻撕破心包，暴露心脏。

4.利用显微镊弯曲段压迫胸腔开口处两端，将心尖挤压出胸腔外，眼科虹膜剪剪除部分心尖左室肌肉，以左心室腔微微出血为准；

5.用灭菌棉签擦拭血迹的同时，将心脏压放回到胸腔中。利用8/0涤纶线八字缝合皮肤，75％酒精棉球擦拭，以免感染。

6.将手术后小鼠置于37℃复温台上10分钟左右；待小鼠恢复自主活动并可见皮肤红润，且缝合部位无明显出血，放回母鼠笼中喂养，在合适的时间点取材观察。

7.假手术组模型在不切心尖的基础上完成上述步骤。

取心尖切除手术术后7天Vcan^fl/fl与Vcan^△CF小鼠各3只，进行心脏组织取材，制成石蜡切片，利用增殖标记物(抗体)pH3(稀释比1:1000)、Ki67(稀释比1:100)及Aurora B(稀释比1:100)，和去分化标记物α-SMA(稀释比1:200) 分别与α-actinin(稀释比1:400)进行免疫共染(50μl/切片组织表面)，检测心肌细胞增殖和去分化情况，利用激光共聚焦显微镜进行拍摄，通过共聚焦显微镜Z轴扫描进行共定位分析，结果如图15A至图18B所示。

图15A为新生1天Vcan^△CF小鼠进行心尖切除(AR)手术，术后7天取心脏组织利用心肌细胞去分化标记物α-SMA与α-actinin进行免疫共染的结果图，其中α-SMA⁺α-actinin⁺细胞指示去分化的心肌细胞。α-actinin(红色)标记心肌细胞，α-SMA(绿色)标记去分化指标，DAPI(蓝色)标记细胞核。图15B为图15A的统计分析图，从图15A和图15B可以看出，心脏成纤维细胞特异性敲除Vcan会导致损伤后的心脏中α-SMA阳性心肌细胞明显减少，抑制心肌细胞去分化。

图16A为新生1天Vcan^△CF小鼠进行心尖切除(AR)手术，术后7天取心脏组织利用增殖标记物pH3与α-actinin进行免疫共染的结果图，其中， pH3⁺α-actinin⁺细胞指示正在进行增殖的心肌细胞。α-actinin(红色)标记心肌细胞，pH3(绿色)标记增殖指标，DAPI(蓝色)标记细胞核。图16B为图16A 的统计分析图。从图16A和图16B可以看出，心脏成纤维细胞特异性敲除Vcan 会导致损伤后的心脏中pH3阳性心肌细胞明显减少，抑制心肌细胞增殖。

图17A为新生1天Vcan^△CF小鼠进行心尖切除(AR)手术，术后7天取心脏组织利用增殖标记物Ki67与α-actinin进行免疫共染的结果图，其中， Ki67⁺α-actinin⁺细胞指示正在进行增殖的心肌细胞。α-actinin(红色)标记心肌细胞，Ki67(绿色)标记增殖指标，DAPI(蓝色)标记细胞核。图17B为图17A 的统计分析图。从图17A和图17B可以看出，心脏成纤维细胞特异性敲除Vcan 会导致损伤后的心脏中Ki67阳性心肌细胞明显减少，抑制心肌细胞增殖。

图18A为新生1天Vcan^△CF小鼠进行心尖切除(AR)手术，术后7天取心脏组织利用增殖标记物Aurora B与α-actinin进行免疫共染的显微共聚焦结果图，其中，Aurora B⁺α-actinin⁺细胞指示正在进行增殖的心肌细胞。α-actinin(红色) 标记心肌细胞，Aurora B(绿色)标记增殖指标，DAPI(蓝色)标记细胞核。图18B为图18A的统计分析图。从图18A和图18B可以看出，心脏成纤维细胞特异性敲除Vcan会导致损伤后的心脏中Aurora B阳性心肌细胞明显减少，抑制心肌细胞增殖。

从上述结果可以看出，术后7天，成纤维细胞Vcan特异性敲除(Vcan^△CF) 组心肌细胞去分化水平明显下降，细胞增殖能力显著减弱。

实施例7

为了观察心肌再生程度，术后21天利用小动物超声仪检测心功能的变化，并取材心脏组织，制成石蜡切片，利用Masson染色观察对心肌再生的影响，结果如图19至图21所示。

如图19所示为新生1天Vcan^△CF小鼠心尖切除后21天的心脏Masson染色图，从图19中可以看出，心脏成纤维细胞特异性敲除Vcan会导致新生1天小鼠心尖切除后心肌不能再生，而是明显的纤维化。对图19进行统计分析，如图 20所示，心脏成纤维细胞特异性敲除Vcan会导致新生1天小鼠心尖切除后心肌再生能力显著下降。

如图21为新生1天Vcan^△CF小鼠心尖切除后21天进行心脏超声，用于判断心功能变化。从图21可以看出，心脏成纤维细胞特异性敲除Vcan会导致新生1 天小鼠心尖切除后射血分数(Ejection Fraction)减小，心功能明显受损。

从图19至图21可以看出，成纤维细胞Vcan特异性敲除小鼠术后21天心肌再生受阻，心肌组织明显纤维化，并且心功能被严重破坏。

实施例8

对新生1天小鼠进行心梗手术，具体心梗手术操作步骤如下：

1.将新生1天小鼠埋在碎冰中低温麻醉2-3分钟(低温可诱导小鼠心跳和呼吸减弱)。

2.取出小鼠，将其右侧仰卧位用医用胶带固定在事先预冷的微型金属手术台上；先用5％碘伏棉球将小鼠胸部皮肤由内向外消毒，再用75％的酒精棉球消毒。

3.在体视镜下，从小鼠左侧第4肋间用显微剪剪开皮肤，采用显微手术剪钝性分离皮下组织及肌肉入胸，用眼科镊撑开胸腔，轻轻撕破心包膜，暴露心脏。

4.结扎冠状动脉左前降支：体视镜下左心耳下缘2mm处可见倒Y字形走形鲜红色血管，向心尖走形的即为小鼠冠状动脉左前降支。用8/0涤纶线精确结扎左前降支，即刻可见结扎线以下心室肌变苍白，提示建模成功。

5.用灭菌棉签擦拭血迹后，利用8/0涤纶线八字缝合肋骨和皮肤，75％酒精棉球擦拭，以免感染。

6.将手术后小鼠置于37℃复温台上10分钟左右；待小鼠恢复自主活动并可见皮肤红润，且缝合部位无明显出血，放回母鼠笼中喂养，在合适的时间点取材观察。

7.假手术组模型在不结扎冠脉的基础上完成上述步骤。

术后21天利用小动物超声仪检测心功能的变化，并取材心脏组织，制成石蜡切片，进行Masson染色，检测成纤维细胞中Vcan特异敲除对心肌再生和心功能的影响，结果如图22至图24所示。

如图22为新生1天Vcan^△CF小鼠心梗后21天的心脏Masson染色图，观察心脏组织纤维化程度，用于判断心肌是否再生。图23为图22的统计分析图。从图22和图23可以看出心脏成纤维细胞特异性敲除Vcan会导致新生1天小鼠心梗后心肌不能再生，而是明显的纤维化，纤维化程度显著增加。

如图24为新生1天Vcan^△CF小鼠心梗后21天进行心脏超声统计图，从图中可以看出心脏成纤维细胞特异性敲除Vcan会导致新生1天小鼠心梗后心功能明显受损。

从图22至图24可以看出，成纤维细胞特异性敲除Vcan导致心梗后的心肌不能完全再生，心功能也明显减弱。

实施例9

对Vcan^△CF新生1天小鼠进行心尖切除手术后立刻进行心肌内注射小鼠 Versican蛋白：利用Hamilton 36G注射器吸取2μl小鼠Versican蛋白(0.2ug)，注射在切除了心尖的组织边缘，以等量PBS处理作为对照。

术后21天利用小动物超声仪检测心功能的变化，并取材心脏组织，制成石蜡切片，进行Masson染色，检测心肌内注射Versican对Vcan^△CF小鼠心肌再生和心功能的影响，结果如图25至图27所示。

如图25为Vcan^△CF新生1天小鼠进行心尖切除手术后立刻进行心肌内注射小鼠Versican蛋白后21天的心脏Masson染色图，观察心脏组织纤维化程度，用于判断心肌是否再生。图26为图25的统计分析图。从图25和图26可以看出，小鼠Versican蛋白注射组心肌损伤后纤维化明显减少，心肌再生能力明显增强。

如图27为Vcan^△CF新生1天小鼠进行心尖切除手术后立刻进行心肌内注射小鼠Versican蛋白后21天进行心脏超声统计图，从图中可以看出小鼠Versican 蛋白注射组心功能显著改善。

从图25至图27可以看出，Versican可以挽救小鼠心肌再生，说明新生1 天小鼠心肌损伤后成纤维细胞中Versican是心肌再生所必需的。

实施例10

提取从新生期到成年期小鼠(C57BL/6J)心脏组织，包括1天、4天、7天、 14天、28天和8周，利用Western blot检测出生后鼠Versican蛋白水平变化，结果如图28所示。

从图28可以看出，小鼠Versican蛋白在出生后1天心脏中表达量最高，8 周龄心脏中显著减少，呈年龄依赖性下降。

实施例11

对成年8周龄C57BL/6J小鼠(P56)进行心梗手术，并在手术当天给予心肌内注射小鼠Versican蛋白(10μl，100μg/ml)，在心梗周围分四个点均量注射。以等量PBS代替Versican注射作为对照组。术后7天和28天分别进行心脏取材，时间示意图如图29所示。图30A为利用Western blot检测成年小鼠心梗手术给予心肌注射Versican蛋白或等量PBS处理后心肌组织中Versican的蛋白水平变化结果图。图30B为图30A的统计分析图。从图30A至图30B可以看出，注射Versican蛋白后1天心肌组织中Versican蛋白水平明显增加。

取小鼠术后7天的心脏组织，制成石蜡切片，利用麦胚凝集素(Wheat germagglutinin，WGA)与细胞核标记物DAPI免疫染色观察成年小鼠心梗后Versican 注射对心肌细胞大小的影响，以等量PBS处理作为对照，结果如图31A所示。对图31A进行统计分析，结果如图31B所示，可以看出，相对于PBS对照处理组，小鼠Versican蛋白治疗后，心肌细胞面积明显减小。

取小鼠术后7天的心脏组织，进行解离，计算心肌细胞的数目，结果如图 32所示，可以看出，相对于PBS对照处理组，小鼠Versican蛋白治疗后，心肌细胞数目明显增加。

然后将解离的心肌细胞用心肌细胞标记物α-actinin与细胞核标记物DAPI 免疫染色，观察成年小鼠心梗后Versican注射对心肌细胞的核型和倍性的影响，如图33A所示，可以看到分别为单核二倍体、单核四倍体、双核和多核心肌细胞。对所有免疫染色后的心肌细胞核型倍性进行统计，结果如图33B所示， Versican蛋白治疗后，单核心肌细胞数目明显增加。再对单核心肌细胞的倍性进行统计，结果如图33C所示，Versican蛋白治疗后，单核二倍体心肌细胞数目明显增加。

取小鼠术后7天的心脏组织，制成石蜡切片，利用增殖标记物pH3、Ki67 及AuroraB分别与α-actinin进行免疫共染，评估Versican对心梗后心肌细胞增殖的影响，结果如图34A至图36B所示，其中以等量PSB作为对照。

如图34A为增殖标记物pH3与心肌细胞标记物α-actinin进行免疫共染的结果，图34B为图34A的统计图，从图34B可以看出，相对于PBS对照处理组， Versican蛋白治疗后，pH3阳性心肌细胞明显增加，表明Versican可刺激成年心肌细胞增殖。

图35A为增殖标记物Ki67与心肌细胞标记物α-actinin进行免疫共染的结果，图35B为图35A的统计图，从图35B可以看出，相对于PBS对照处理组， Versican蛋白治疗后，Ki67阳性心肌细胞明显增加，表明Versican可刺激成年心肌细胞增殖。

图36A为增殖标记物Aurora B与心肌细胞标记物α-actinin进行免疫共染的结果。图36B为图36A的统计图，从图36B可以看出，相对于PBS对照处理组， Versican蛋白治疗后，Aurora B阳性心肌细胞明显增加，表明Versican可刺激成年心肌细胞增殖。

从图34A至图36B可以看出，Versican蛋白处理后，pH3⁺、Ki67⁺，Aurora B⁺与α-actinin⁺细胞比例显著增加，大约是PBS处理组的3倍以上，充分证明 Versican可促进成年心肌细胞增殖。

术后28天利用小动物超声仪检测心功能的变化，然后取材心脏组织，制成石蜡切片，进行Masson染色观察Versican对成年小鼠心梗后心肌再生的影响，结果如图37至图39所示。

如图37所示为Masson染色图，可以看出Versican蛋白治疗后，心肌明显有再生，心脏梗死面积减小。图38为图37的统计分析图，从图38可以看出，成年小鼠心梗手术后进行Versican蛋白治疗，28天后心肌明显有再生，心脏梗死面积减小。

如图39所示为成年小鼠心梗手术前及术后给予Versican或等量PSB处理后不同时间点利用小动物超声仪检测的心功能的变化结果图。可以看出，Versican 蛋白治疗后，心脏射血分数(EF)值在7天(7dpi)开始有明显升高，表明心功能有明显改善。

因此，经Versican蛋白治疗后，心肌明显有再生，心脏梗死面积减小，心功能有明显改善，可以说明Versican是促进成年心肌损伤后心脏修复与再生的一种有效的因子。

实施例12

制备人类诱导多能干细胞来源的心肌细胞(human induced pluripotent stemcells-cardiomyocytes,hiPSC-CMs)，具体步骤如下：

1.用PBS溶液和0.5mM EDTA以10:1的比例将hiPSC解离。

2.用人心肌细胞维持培养基培养3天。

3.当达到80％融合时，在诱导培养基II中培养2天。

4.然后在诱导培养基III中培养。此后每隔1天更换一次诱导培养基III。

5.诱导后第8天开始观察细胞自发收缩。诱导后第15天，用人心肌细胞纯化培养基纯化心肌细胞得到hiPSC-CMs。

对hiPSC-CMs进行PBS或人Versican蛋白处理(终浓度100ng/ml)24小时后，利用增殖标记物pH3、Ki67及Aurora B分别与α-actinin进行免疫共染，利用激光扫描共聚焦显微镜Z轴扫描进行共定位分析，结果如图40A至42B所示。

图40A为对hiPSC-CMs进行PBS或人Versican蛋白处理后使用增殖标记物 pH3与α-actinin进行免疫共染。其中，pH3⁺α-actinin⁺细胞指示正在进行增殖的心肌细胞，如白色箭头所示。α-actinin(红色)标记心肌细胞，pH3(绿色)标记增殖指标，DAPI(蓝色)标记细胞核。图40B为图40A的统计图，显示与 PBS对照处理组相比，加入人Versican蛋白可显著增加pH3⁺α-actinin⁺细胞的比例。

图41A为对hiPSC-CMs进行PBS或人Versican蛋白处理后使用增殖标记物Ki67与α-actinin进行免疫共染。其中，Ki67⁺α-actinin⁺细胞指示正在进行增殖的心肌细胞，如白色箭头所示。α-actinin(红色)标记心肌细胞，Ki67(绿色) 标记增殖指标，DAPI(蓝色)标记细胞核。图41B为图41A的统计图，显示与 PBS对照处理组相比，加入人Versican蛋白可显著增加Ki67⁺α-actinin⁺细胞的比例。

图42A为对hiPSC-CMs进行PBS或人Versican蛋白处理后使用增殖标记物 AuroraB与α-actinin进行免疫共染。其中，Aurora B⁺α-actinin⁺细胞指示正在进行增殖的心肌细胞，如白色箭头所示。α-actinin(红色)标记心肌细胞，Aurora B(绿色)标记增殖指标，DAPI(蓝色)标记细胞核。图42B为图42A的统计图，显示与PBS对照处理组相比，加入人Versican蛋白可显著增加Aurora B⁺α-actinin⁺细胞的比例。

从上述结果可以看出，在人Versican蛋白处理24小时后，pH3⁺、Ki67⁺和 Aurora B⁺的hiPSC-CM显著增加，表明Versican可以促进hiPSC-CM增殖。

为了分析人Versican蛋白对iPSC-CMs的分化和成熟的影响，从诱导后的第7天起，用人Versican蛋白以50、100和200ng/ml的剂量处理iPSC(同时用PBS替代人Versican蛋白作为阴性对照)，隔日补充一次。7天后收集细胞利用RT-PCR对心肌细胞功能基因(Cacna1c，Gja1，Kcnj2)和成熟基因(Scn5a， Casq2，S100a1，Myom2，Myom3，Cox6a2)表达量进行分析。

RT-PCR所用引物如下表1所示：

表1心肌细胞功能基因和成熟基因的上下游引物

/>

将RNA逆转录所得cDNA稀释50倍，反应体系如下表2所示：

表2 RNA逆转录反应体系

反应条件如下：95℃预变性10分钟，95℃变性10秒，60℃复性30秒，溶解曲线是95℃反应15秒，60℃反应1分钟，95℃反应15秒。

结果如图43所示，从图43可以看出，在给药7天后，经Versican蛋白处理的hiPSC-CMs显示出功能和成熟标记物的表达显著减少，其中，100ng/ml 剂量组效果最显著，这说明，Versican蛋白不仅能促进心肌细胞的增殖，而且能延缓hiPSC-CMs的成熟。

从上述实施例可以看出，Versican蛋白可以促进心肌细胞增殖，延缓心肌细胞成熟，促进心脏再生与修复，从而减小心脏梗死面积，改善心功能。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院阜外医院

<120> Versican蛋白在制备心肌损伤后修复的药物中的应用

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3357

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Leu Ile Asn Met Lys Gly Ile Leu Trp Met Cys Ser Thr Leu Leu

1 5 10 15

Leu Thr His Ala Leu His Gln Ala Lys Met Glu Thr Ser Pro Pro Val

20 25 30

Lys Gly Ser Leu Ser Gly Lys Val Val Leu Pro Cys His Phe Ser Thr

35 40 45

Leu Pro Thr Leu Pro Pro Asn Tyr Asn Thr Ser Glu Phe Leu Arg Ile

50 55 60

Lys Trp Ser Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Lys Asp Ile Lys Glu

65 70 75 80

Thr Thr Val Leu Val Ala Gln Asn Gly Asn Ile Lys Ile Gly Gln Asp

85 90 95

Tyr Lys Gly Arg Val Ser Val Pro Thr His Pro Asp Asp Val Gly Asp

100 105 110

Ala Ser Leu Thr Met Val Lys Leu Arg Ala Ser Asp Ala Ala Val Tyr

115 120 125

Arg Cys Asp Val Met Tyr Gly Ile Glu Asp Thr Gln Asp Thr Met Ser

130 135 140

Leu Ala Val Asp Gly Val Val Phe His Tyr Arg Ala Ala Thr Ser Arg

145 150 155 160

Tyr Thr Leu Asn Phe Ala Ala Ala Gln Gln Ala Cys Leu Asp Ile Gly

165 170 175

Ala Val Ile Ala Ser Pro Glu Gln Leu Phe Ala Ala Tyr Glu Asp Gly

180 185 190

Phe Glu Gln Cys Asp Ala Gly Trp Leu Ser Asp Gln Thr Val Arg Tyr

195 200 205

Pro Ile Arg Ala Pro Arg Glu Gly Cys Tyr Gly Asp Met Met Gly Lys

210 215 220

Glu Gly Val Arg Thr Tyr Gly Phe Arg Ser Pro Gln Glu Thr Tyr Asp

225 230 235 240

Val Tyr Cys Tyr Val Asp His Leu Asp Gly Asp Val Phe His Ile Thr

245 250 255

Ala Pro Ser Lys Phe Thr Phe Glu Glu Ala Glu Ala Glu Cys Thr Ser

260 265 270

Arg Asp Ala Arg Leu Ala Thr Val Gly Glu Leu Gln Ala Ala Trp Arg

275 280 285

Asn Gly Phe Asp Gln Cys Asp Tyr Gly Trp Leu Ser Asp Ala Ser Val

290 295 300

Arg His Pro Val Thr Val Ala Arg Ala Gln Cys Gly Gly Gly Leu Leu

305 310 315 320

Gly Val Arg Thr Leu Tyr Arg Phe Glu Asn Gln Thr Cys Phe Pro Leu

325 330 335

Pro Asp Ser Arg Phe Asp Ala Tyr Cys Phe Lys Pro Lys Gln Asn Ile

340 345 350

Ser Glu Ala Thr Thr Ile Glu Met Asn Ile Leu Ala Glu Thr Ser Ser

355 360 365

Pro Ser Leu Ser Lys Glu Pro His Met Val Pro Asp Arg Ala Thr Pro

370 375 380

Val Ile Pro Leu Ala Thr Glu Leu Pro Ile Phe Thr Thr His Phe Pro

385 390 395 400

Pro Ala Gly Asn Ile Val Asn Ser Glu Gln Lys Ser Val Val Tyr Ser

405 410 415

Gln Ala Ile Thr Gly Arg Leu Ala Thr Glu Ser Pro Thr Thr Thr Arg

420 425 430

Asn Thr Ile Asn Ser Trp Asp Leu Asn Asp Ser Leu Ala Ser Gly Ser

435 440 445

Gly Pro Leu Gly Met Pro Asp Ile Ser Glu Ile Lys Glu Glu Glu Leu

450 455 460

Arg Ser Thr Thr Val Ile Ser Gln His Ala Thr Gly Ser Gln Ala Val

465 470 475 480

Ile Thr Glu Asp Thr Gln Thr His Glu Ser Val Ser Gln Ile Glu Gln

485 490 495

Ile Glu Val Gly Pro Leu Val Thr Ser Met Glu Ile Thr Asn His Ile

500 505 510

Ser Leu Lys Glu Leu Pro Glu Lys Asn Lys Thr Pro Tyr Glu Ser Thr

515 520 525

Glu Val Thr Leu Glu His Thr Thr Glu Met Pro Thr Val Ser Ala Ser

530 535 540

Pro Glu Leu Ala Thr Thr Ser His Tyr Gly Phe Thr Leu Arg Glu Asp

545 550 555 560

Asp Arg Glu Asp Arg Thr Leu Thr Val Arg Ser Asp Gln Ser Thr Arg

565 570 575

Val Phe Ser Gln Ile Pro Glu Val Ile Thr Val Ser Lys Thr Ser Glu

580 585 590

Asp Thr Thr Tyr Ser Gln Leu Gly Asp Leu Glu Ser Ile Ser Thr Ser

595 600 605

Thr Ile Thr Met Leu Gly Thr Asp Arg Ser Leu Ile Asp Lys Glu Lys

610 615 620

Glu Pro Lys Thr Asn Gly Lys Val Thr Glu Asp Glu Phe Gly Gln Ser

625 630 635 640

Gln Pro Thr Thr Thr Phe Pro Ser Gln His Leu Thr Glu Val Glu Leu

645 650 655

Leu Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Thr Ser Val Glu Gly Ile Ser Thr Val

660 665 670

Ile Tyr Pro Ser Leu Gln Thr Asp Val Thr Gln Gly Arg Glu Arg Thr

675 680 685

Glu Thr Pro Arg Pro Glu Leu Lys Lys Asp Pro Tyr Thr Val Asp Glu

690 695 700

Ile Pro Glu Lys Val Thr Lys Asp Pro Phe Ile Gly Lys Thr Glu Glu

705 710 715 720

Val Phe Ser Gly Met Pro Leu Ser Thr Ser Ser Ser Glu Ser Ser Val

725 730 735

Glu Arg Thr Glu Ser Val Ser Pro Ala Leu Thr Ile Glu Lys Leu Thr

740 745 750

Gly Lys Pro Thr Glu Ala Arg Asp Val Glu Glu Met Thr Thr Leu Thr

755 760 765

Arg Leu Glu Thr Asp Val Thr Lys Ser Asp Lys Asp Val Thr Arg Val

770 775 780

His Leu Thr His Ser Thr Leu Asn Val Glu Val Val Thr Val Ser Lys

785 790 795 800

Trp Pro Gly Asp Glu Asp Asn Ser Thr Ser Lys Pro Leu Pro Ser Thr

805 810 815

Glu His Ala Gly Phe Thr Lys Leu Pro Pro Val Pro Leu Ser Thr Ile

820 825 830

Gly Ile Asn Gly Lys Asp Lys Glu Ile Pro Ser Phe Thr Asp Gly Gly

835 840 845

Gly Glu Tyr Thr Leu Phe Pro Asp Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Lys

850 855 860

Val Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ser Gly Glu Leu Thr Val Thr Phe His

865 870 875 880

Thr Ser Thr Ser Ile Gly Ser Ala Glu Lys Ser Ala Ser Gly Glu Pro

885 890 895

Thr Thr Gly Asp Arg Phe Leu Pro Thr Thr Ser Thr Glu Asp Gln Val

900 905 910

Ile Asn Ala Thr Ala Glu Gly Ser Ala Leu Gly Glu Asp Thr Glu Ala

915 920 925

Ser Lys Pro Leu Phe Thr Gly Pro Pro Phe Val His Thr Ser Asp Val

930 935 940

Glu Glu Leu Ala Phe Val Asn Tyr Ser Ser Thr Gln Glu Pro Thr Thr

945 950 955 960

Tyr Val Asp Ile Ser His Thr Ser Pro Leu Ser Ile Ile Pro Lys Thr

965 970 975

Glu Trp Ser Val Leu Glu Thr Ser Val Pro Leu Glu Asp Glu Ile Leu

980 985 990

Gly Lys Ser Asp Gln Asp Ile Leu Glu Gln Thr His Leu Glu Ala Thr

995 1000 1005

Met Ser Pro Gly Ala Leu Arg Thr Thr Gly Val Ser Gln Gly Glu

1010 1015 1020

Thr Gln Glu Glu Pro Gln Thr Pro Gly Ser Pro Phe Pro Thr Phe

1025 1030 1035

Ser Ser Thr Ala Val Met Ala Lys Glu Thr Thr Ala Phe Glu Glu

1040 1045 1050

Gly Glu Gly Ser Thr Tyr Thr Pro Ser Glu Gly Arg Leu Met Thr

1055 1060 1065

Gly Ser Glu Arg Val Pro Gly Leu Glu Thr Thr Pro Val Gly Thr

1070 1075 1080

Ser Tyr Pro Pro Gly Ala Ile Thr Asp Gln Glu Val Glu Met Asp

1085 1090 1095

Thr Met Val Thr Leu Met Ser Thr Ile Arg Pro Thr Val Val Ser

1100 1105 1110

Ser Thr Glu Ser Glu Val Ile Tyr Glu Ala Glu Gly Ser Ser Pro

1115 1120 1125

Thr Glu Phe Ala Ser Thr Leu Arg Pro Phe Gln Thr His Val Thr

1130 1135 1140

Gln Leu Met Glu Glu Thr Thr Glu Glu Gly Lys Lys Ala Ser Leu

1145 1150 1155

Asp Tyr Thr Asp Leu Gly Ser Gly Leu Phe Glu Pro Arg Ala Thr

1160 1165 1170

Glu Leu Pro Lys Phe Pro Ser Thr Pro Ser Asp Ile Ser Val Phe

1175 1180 1185

Thr Ala Ile Asp Ser Leu His Arg Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser

1190 1195 1200

Ser Ser Phe Thr Glu Glu Gln Arg Val Phe Glu Glu Glu Ser Ser

1205 1210 1215

Glu Lys Thr Thr Gly Asp Ile Leu Pro Gly Glu Ser Val Thr Gln

1220 1225 1230

His Pro Val Thr Thr Leu Ile Asp Ile Val Ala Met Lys Thr Glu

1235 1240 1245

Ser Asp Ile Asp His Met Thr Ser Lys Pro Pro Val Thr Gln Pro

1250 1255 1260

Thr Arg Pro Ser Val Val Glu Arg Lys Thr Thr Ser Lys Thr Gln

1265 1270 1275

Glu Leu Ser Thr Ser Thr Pro Ala Ala Gly Thr Lys Phe His Pro

1280 1285 1290

Asp Ile Asn Val Tyr Ile Ile Glu Val Arg Glu Asn Lys Thr Gly

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Arg Leu Ser Asp Met Ile Val Ser Gly His Pro Ile Asp Ser Glu

1310 1315 1320

Ser Lys Glu Glu Glu Pro Cys Ser Glu Glu Thr Asp Pro Leu His

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Asp Leu Phe Ala Glu Ile Leu Pro Glu Leu Pro Asp Ser Phe Glu

1340 1345 1350

Ile Asp Ile Tyr His Ser Glu Glu Asp Glu Asp Gly Glu Glu Asp

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Cys Val Asn Ala Thr Asp Val Thr Thr Thr Pro Ser Val Gln Tyr

1370 1375 1380

Ile Asn Gly Lys Gln Leu Val Thr Thr Val Pro Lys Asp Pro Glu

1385 1390 1395

Ala Ala Glu Ala Arg Arg Gly Gln Tyr Glu Ser Val Ala Pro Ser

1400 1405 1410

Gln Asn Phe Pro Asp Ser Ser Ala Thr Asp Thr His Gln Phe Ile

1415 1420 1425

Leu Ala Glu Thr Glu Ser Ser Thr Thr Met Gln Phe Lys Lys Ser

1430 1435 1440

Lys Glu Gly Thr Glu Leu Leu Glu Ile Thr Trp Lys Pro Glu Thr

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Tyr Pro Glu Thr Pro Asp His Val Ser Ser Gly Glu Pro Asp Val

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Phe Pro Thr Leu Ser Ser His Asp Gly Lys Thr Thr Arg Trp Ser

1475 1480 1485

Glu Ser Ile Thr Glu Ser Ser Pro Asn Leu Glu Asn Pro Val His

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Lys Gln Pro Lys Pro Val Pro Leu Phe Pro Glu Glu Ser Ser Gly

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Glu Gly Ala Ile Glu Gln Ala Ser Gln Glu Thr Ile Leu Ser Arg

1520 1525 1530

Ala Thr Glu Val Ala Leu Gly Lys Glu Thr Asp Gln Ser Pro Thr

1535 1540 1545

Leu Ser Thr Ser Ser Ile Leu Ser Ser Ser Val Ser Val Asn Val

1550 1555 1560

Leu Glu Glu Glu Pro Leu Thr Leu Thr Gly Ile Ser Gln Thr Asp

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Glu Ser Met Ser Thr Ile Glu Ser Trp Val Glu Ile Thr Pro Ser

1580 1585 1590

Gln Thr Val Lys Phe Ser Glu Ser Ser Ser Ala Pro Ile Ile Glu

1595 1600 1605

Gly Ser Gly Glu Val Glu Glu Asn Lys Asn Lys Ile Phe Asn Met

1610 1615 1620

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1625 1630 1635

Leu Asp Met Ser Lys Ile Met Ile Thr Asn His His Ile Tyr Ile

1640 1645 1650

Pro Ala Thr Ile Ala Pro Leu Asp Ser Lys Leu Pro Ser Pro Asp

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Ala Arg Pro Thr Thr Val Trp Asn Ser Asn Ser Thr Ser Glu Trp

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Val Ser Asp Lys Ser Phe Glu Gly Arg Lys Lys Lys Glu Asn Glu

1685 1690 1695

Asp Glu Glu Gly Ala Val Asn Ala Ala His Gln Gly Glu Val Arg

1700 1705 1710

Ala Ala Thr Glu Arg Ser Asp His Leu Leu Leu Thr Pro Glu Leu

1715 1720 1725

Glu Ser Ser Asn Val Asp Ala Ser Ser Asp Leu Ala Thr Trp Glu

1730 1735 1740

Gly Phe Ile Leu Glu Thr Thr Pro Thr Glu Ser Glu Lys Glu Met

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Val Glu Ala Gln Pro Phe Glu His Ser Ser Ser Ser His Pro Arg

1775 1780 1785

Val Gln Glu Glu Leu Thr Thr Leu Ser Gly Asn Pro Pro Ser Leu

1790 1795 1800

Phe Thr Asp Leu Gly Ser Gly Asp Ala Ser Thr Gly Met Glu Leu

1805 1810 1815

Ile Thr Ala Ser Leu Phe Thr Leu Asp Leu Glu Ser Glu Thr Lys

1820 1825 1830

Val Lys Lys Glu Leu Pro Ser Thr Pro Ser Pro Ser Val Glu Ile

1835 1840 1845

Ser Ser Ser Phe Glu Pro Thr Gly Leu Thr Pro Ser Thr Val Leu

1850 1855 1860

Asp Ile Glu Ile Ala Gly Val Met Ser Gln Thr Ser Gln Lys Thr

1865 1870 1875

Leu Ile Ser Glu Ile Ser Gly Lys Pro Thr Ser Gln Ser Gly Val

1880 1885 1890

Arg Asp Leu Tyr Thr Gly Phe Pro Met Gly Glu Asp Phe Ser Gly

1895 1900 1905

Asp Phe Ser Glu Tyr Pro Thr Val Ser Tyr Pro Thr Met Lys Glu

1910 1915 1920

Glu Thr Val Gly Met Gly Gly Ser Asp Asp Glu Arg Val Arg Asp

1925 1930 1935

Thr Gln Thr Ser Ser Ser Ile Pro Thr Thr Ser Asp Asn Ile Tyr

1940 1945 1950

Pro Val Pro Asp Ser Lys Gly Pro Asp Ser Thr Val Ala Ser Thr

1955 1960 1965

Thr Ala Phe Pro Trp Glu Glu Val Met Ser Ser Ala Glu Gly Ser

1970 1975 1980

Gly Glu Gln Leu Ala Ser Val Arg Ser Ser Val Gly Pro Val Leu

1985 1990 1995

Pro Leu Ala Val Asp Ile Phe Ser Gly Thr Glu Ser Pro Tyr Phe

2000 2005 2010

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2015 2020 2025

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2030 2035 2040

Leu Thr Glu Asn Gly Tyr Ile Glu Val Asn Ser Thr Met Ser Leu

2045 2050 2055

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2060 2065 2070

Glu Val Asn Leu Asp Lys Gln Glu Ile Gly Arg Glu Thr Val Thr

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2090 2095 2100

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2120 2125 2130

Lys Thr Tyr Ile Thr Asn Lys Glu Val Glu Glu Glu Gly Met Ser

2135 2140 2145

Ile Ala His Met Ser Thr Pro Gly Pro Gly Ile Lys Asp Leu Glu

2150 2155 2160

Ser Tyr Thr Thr His Pro Glu Ala Pro Gly Lys Ser His Ser Phe

2165 2170 2175

Ser Ala Thr Ala Leu Val Thr Glu Ser Gly Ala Ala Arg Ser Val

2180 2185 2190

Leu Met Asp Ser Ser Thr Gln Glu Glu Glu Ser Ile Lys Leu Phe

2195 2200 2205

Gln Lys Gly Val Lys Leu Thr Asn Lys Glu Ser Asn Ala Asp Leu

2210 2215 2220

Ser Phe Ser Gly Leu Gly Ser Gly Gly Ala Leu Pro Pro Leu Pro

2225 2230 2235

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2240 2245 2250

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Leu Gly Asp Lys Met Glu Asp His Glu Arg Met Glu Asp Val Ser

2270 2275 2280

Ser Asn Glu Val Arg Met Leu Ile Ser Lys Ile Gly Ser Ile Ser

2285 2290 2295

Gln Asp Ser Thr Glu Ala Leu Asp Thr Thr Leu Ser His Thr Gly

2300 2305 2310

Thr Glu Glu Pro Thr Thr Ser Thr Leu Pro Phe Val Lys Leu Met

2315 2320 2325

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Lys Pro Lys Thr His Arg Pro Gln Thr Met Ser Gly Leu Ile Ser

2345 2350 2355

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2360 2365 2370

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2390 2395 2400

Asn Ser Gly Glu Gly Ser Gly Glu Val Asp Thr Leu Asp Leu Val

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Leu Ala Ser His Gly Phe Leu Glu Lys His Pro Glu Val Ser Lys

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2495 2500 2505

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Gly Ser Ser Glu Glu Ser Leu Gln Val Gln Glu Lys Tyr Glu Gly

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Ala Val Thr Leu Ser Pro Thr Glu Glu Ser Phe Glu Gly Ser Gly

2600 2605 2610

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2720 2725 2730

Ser Phe Gln Pro Glu Phe Phe Ser Gly Val Gly Glu Val Leu Thr

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2750 2755 2760

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Gly Gly Asn Val His Arg Thr Glu Pro Pro Ser Met Ser Arg Asp

2855 2860 2865

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2870 2875 2880

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Leu Ile Gly Ile Ser Glu Glu Ser Val Glu Gly Thr Ala Val Tyr

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Lys Pro Arg Tyr Glu Ile Asn Ser Leu Ile Arg Tyr His Cys Lys

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Asp Gly Phe Ile Gln Arg His Leu Pro Thr Ile Arg Cys Leu Gly

3290 3295 3300

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Ser Ala Lys Asp Asn Ser Ile Asn Thr Ser Lys His Glu His Arg

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Trp Ser Arg Arg Gln Glu Thr Arg Arg

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<211> 3396

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Phe Ile Asn Ile Lys Ser Ile Leu Trp Met Cys Ser Thr Leu Ile

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Met Pro Thr Leu Pro Pro Ser Tyr Asn Thr Ser Glu Phe Leu Arg Ile

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Lys Leu Asp Ile Ser Glu Ile Lys Glu Glu Val Leu Gln Ser Thr Thr

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Lys Gln Thr Gln Glu Ser Val Thr Gln Ile Glu Gln Ile Glu Val Gly

485 490 495

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Ser Lys Thr Glu Lys Lys Met Val Ser Thr Val Ser Glu Leu Val Thr

530 535 540

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Thr Leu Thr Val Gly Ser Asp Glu Ser Thr Leu Ile Phe Asp Gln Ile

565 570 575

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580 585 590

His Leu Glu Asp Leu Glu Ser Val Ser Ala Ser Thr Thr Val Ser Pro

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610 615 620

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Pro Tyr Ser Gly Asp Lys Ile Leu Val Glu Gly Ile Ser Thr Val Ile

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675 680 685

Thr Leu Ile Pro Glu Met Arg Thr Asp Thr Tyr Thr Asp Glu Ile Gln

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Glu Glu Ile Thr Lys Ser Pro Phe Met Gly Lys Thr Glu Glu Glu Val

705 710 715 720

Phe Ser Gly Met Lys Leu Ser Thr Ser Leu Ser Glu Pro Ile His Val

725 730 735

Thr Glu Ser Ser Val Glu Met Thr Lys Ser Phe Asp Phe Pro Thr Leu

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Ser Lys Trp Ser Trp Asp Glu Asp Asn Thr Thr Ser Lys Pro Leu Glu

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850 855 860

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Ile Arg Phe Gln Pro Thr Thr Ser Thr Gly Ile Ala Glu Lys Ser Thr

885 890 895

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1010 1015 1020

Thr Lys Ile Thr Glu Gly Thr Thr Gln Glu Glu Phe Pro Trp Lys

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1070 1075 1080

Ser Glu Arg Val Pro Val Leu Glu Thr Thr Pro Val Gly Lys Ile

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1100 1105 1110

Val Lys Thr Asp Glu Val Val Thr Leu Thr Pro Arg Ile Gly Pro

1115 1120 1125

Lys Val Ser Leu Ser Pro Gly Pro Glu Gln Lys Tyr Glu Thr Glu

1130 1135 1140

Gly Ser Ser Thr Thr Gly Phe Thr Ser Ser Leu Ser Pro Phe Ser

1145 1150 1155

Thr His Ile Thr Gln Leu Met Glu Glu Thr Thr Thr Glu Lys Thr

1160 1165 1170

Ser Leu Glu Asp Ile Asp Leu Gly Ser Gly Leu Phe Glu Lys Pro

1175 1180 1185

Lys Ala Thr Glu Leu Ile Glu Phe Ser Thr Ile Lys Val Thr Val

1190 1195 1200

Pro Ser Asp Ile Thr Thr Ala Phe Ser Ser Val Asp Arg Leu His

1205 1210 1215

Thr Thr Ser Ala Phe Lys Pro Ser Ser Ala Ile Thr Lys Lys Pro

1220 1225 1230

Pro Leu Ile Asp Arg Glu Pro Gly Glu Glu Thr Thr Ser Asp Met

1235 1240 1245

Val Ile Ile Gly Glu Ser Thr Ser His Val Pro Pro Thr Thr Leu

1250 1255 1260

Glu Asp Ile Val Ala Lys Glu Thr Glu Thr Asp Ile Asp Arg Glu

1265 1270 1275

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1280 1285 1290

Pro Thr Val Glu Asp Lys Glu Ala Phe Gly Pro Gln Ala Leu Ser

1295 1300 1305

Thr Pro Gln Pro Pro Ala Ser Thr Lys Phe His Pro Asp Ile Asn

1310 1315 1320

Val Tyr Ile Ile Glu Val Arg Glu Asn Lys Thr Gly Arg Met Ser

1325 1330 1335

Asp Leu Ser Val Ile Gly His Pro Ile Asp Ser Glu Ser Lys Glu

1340 1345 1350

Asp Glu Pro Cys Ser Glu Glu Thr Asp Pro Val His Asp Leu Met

1355 1360 1365

Ala Glu Ile Leu Pro Glu Phe Pro Asp Ile Ile Glu Ile Asp Leu

1370 1375 1380

Tyr His Ser Glu Glu Asn Glu Glu Glu Glu Glu Glu Cys Ala Asn

1385 1390 1395

Ala Thr Asp Val Thr Thr Thr Pro Ser Val Gln Tyr Ile Asn Gly

1400 1405 1410

Lys His Leu Val Thr Thr Val Pro Lys Asp Pro Glu Ala Ala Glu

1415 1420 1425

Ala Arg Arg Gly Gln Phe Glu Ser Val Ala Pro Ser Gln Asn Phe

1430 1435 1440

Ser Asp Ser Ser Glu Ser Asp Thr His Pro Phe Val Ile Ala Lys

1445 1450 1455

Thr Glu Leu Ser Thr Ala Val Gln Pro Asn Glu Ser Thr Glu Thr

1460 1465 1470

Thr Glu Ser Leu Glu Val Thr Trp Lys Pro Glu Thr Tyr Pro Glu

1475 1480 1485

Thr Ser Glu His Phe Ser Gly Gly Glu Pro Asp Val Phe Pro Thr

1490 1495 1500

Val Pro Phe His Glu Glu Phe Glu Ser Gly Thr Ala Lys Lys Gly

1505 1510 1515

Ala Glu Ser Val Thr Glu Arg Asp Thr Glu Val Gly His Gln Ala

1520 1525 1530

His Glu His Thr Glu Pro Val Ser Leu Phe Pro Glu Glu Ser Ser

1535 1540 1545

Gly Glu Ile Ala Ile Asp Gln Glu Ser Gln Lys Ile Ala Phe Ala

1550 1555 1560

Arg Ala Thr Glu Val Thr Phe Gly Glu Glu Val Glu Lys Ser Thr

1565 1570 1575

Ser Val Thr Tyr Thr Pro Thr Ile Val Pro Ser Ser Ala Ser Ala

1580 1585 1590

Tyr Val Ser Glu Glu Glu Ala Val Thr Leu Ile Gly Asn Pro Trp

1595 1600 1605

Pro Asp Asp Leu Leu Ser Thr Lys Glu Ser Trp Val Glu Ala Thr

1610 1615 1620

Pro Arg Gln Val Val Glu Leu Ser Gly Ser Ser Ser Ile Pro Ile

1625 1630 1635

Thr Glu Gly Ser Gly Glu Ala Glu Glu Asp Glu Asp Thr Met Phe

1640 1645 1650

Thr Met Val Thr Asp Leu Ser Gln Arg Asn Thr Thr Asp Thr Leu

1655 1660 1665

Ile Thr Leu Asp Thr Ser Arg Ile Ile Thr Glu Ser Phe Phe Glu

1670 1675 1680

Val Pro Ala Thr Thr Ile Tyr Pro Val Ser Glu Gln Pro Ser Ala

1685 1690 1695

Lys Val Val Pro Thr Lys Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Ser Glu

1700 1705 1710

Trp Ile Ser Ser Thr Thr Val Glu Glu Lys Lys Arg Lys Glu Glu

1715 1720 1725

Glu Gly Thr Thr Gly Thr Ala Ser Thr Phe Glu Val Tyr Ser Ser

1730 1735 1740

Thr Gln Arg Ser Asp Gln Leu Ile Leu Pro Phe Glu Leu Glu Ser

1745 1750 1755

Pro Asn Val Ala Thr Ser Ser Asp Ser Gly Thr Arg Lys Ser Phe

1760 1765 1770

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Ser Thr Pro Val Phe Thr Glu Thr Asn Thr Leu Glu Asn Leu Gly

1790 1795 1800

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1805 1810 1815

Glu Gly Leu Thr Thr Leu Pro Arg Ser Pro Ala Ser Val Phe Met

1820 1825 1830

Glu Gln Gly Ser Gly Glu Ala Ala Ala Asp Pro Glu Thr Thr Thr

1835 1840 1845

Val Ser Ser Phe Ser Leu Asn Val Glu Tyr Ala Ile Gln Ala Glu

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1880 1885 1890

Val Val Ala Glu Asn Ile Thr Gln Thr Ser Arg Glu Ile Val Ile

1895 1900 1905

Ser Glu Arg Leu Gly Glu Pro Asn Tyr Gly Ala Glu Ile Arg Gly

1910 1915 1920

Phe Ser Thr Gly Phe Pro Leu Glu Glu Asp Phe Ser Gly Asp Phe

1925 1930 1935

Arg Glu Tyr Ser Thr Val Ser His Pro Ile Ala Lys Glu Glu Thr

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Val Met Met Glu Gly Ser Gly Asp Ala Ala Phe Arg Asp Thr Gln

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Thr Ser Pro Ser Thr Val Pro Thr Ser Val His Ile Ser His Ile

1970 1975 1980

Ser Asp Ser Glu Gly Pro Ser Ser Thr Met Val Ser Thr Ser Ala

1985 1990 1995

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2030 2035 2040

Gly Leu Gly Glu Val Gly Thr Val Asn Glu Ile Asp Arg Arg Ser

2045 2050 2055

Thr Ile Leu Pro Thr Ala Glu Val Glu Gly Thr Lys Ala Pro Val

2060 2065 2070

Glu Lys Glu Glu Val Lys Val Ser Gly Thr Val Ser Thr Asn Phe

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aatcgcctat ggactcctct t 21

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<212> DNA

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<212> DNA

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ctgggtcttg ggaattctgg tt 22

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<212> DNA

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gagaacatgt cctgttgctg gc 22

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tcattagggg gaaggcgtga 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ctgggcacca ctcttttgct t 21

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<212> DNA

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tctctatggc aatccacccc a 21

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tgaagagcga gtgaaccaga 20

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<212> DNA

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<212> DNA

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Claims (1)

1.Versican蛋白在制备治疗心肌梗死的药物中的应用，其特征在于，所述Versican蛋白为小鼠Versican蛋白或人Versican蛋白；其中，所述小鼠Versican蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示，所述人Versican蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.2所示，所述药物减少心脏梗死面积。