CN101490244A - 利用有丝分裂灭活的干细胞修复损伤组织的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用有丝分裂灭活和/或致死灭活的干细胞来修复受损伤的器官和/或组织。这种干细胞是有丝分裂灭活和/或致死灭活的，可将其移植入受损组织中。可利用任何类型的离体灭活干细胞，因为这种干细胞在体内应用前不可能发生有丝分裂或细胞分裂。可采用有丝分裂灭活和/或致死灭活的干细胞来改善不同类型器官和/或组织的神经疾病，损伤和/或退变状况。

Description

利用有丝分裂灭活的干细胞修复损伤组织的方法
根据35 USC 119(e)，本申请要求2006年7月20日提交的美国临时申请号60/807,861的优先权，该申请的内容纳入本文作参考。
本发明涉及利用有丝分裂灭活和/或致死灭活的干细胞来修复受损伤的器官和/或组织。可利用任何类型的离体灭活干细胞，因为这种干细胞在体内应用前或后不可能发生不需要的有丝分裂或细胞分裂。可采用有丝分裂灭活和/或致死灭活的干细胞来改善不同类型器官和/或组织的神经疾病，损伤和/或退变状况。
发明背景
目前正在研究利用干细胞，特别是ESC的多能性来修复或重生新生组织。然而，由于ESC具有多能性当将其注射入体内时可能形成畸胎瘤，这是一种失调的癌性肿瘤生长。畸胎瘤包含所有三种胚层：中胚层、内胚层和外胚层的细胞。
为防止产生畸胎瘤，目前移植时使用的ESC必须先离体分化成约定的成熟干细胞系表型和/或完全分化的细胞。此过程耗时，需要长时间保持在规范的优良操作(GMP)条件下，和需要纯化最终产品确保其不污染有残留多能干细胞的方法，以及需要确保含有所需身份的细胞，各批细胞之间等价均一的方法。必须离体培养ESC衍生细胞，维持在无饲养细胞和成分明确的培养基中以符合GMP指南要求。
近年来细胞培养技术的进展在维持和扩增非分化ESC上已符合GMP要求。然而为了避免形成畸胎瘤，必须使ESC经历费时费力的广泛分化成为成熟体细胞后才能体内应用。此外，必须对这些体细胞进行纯化或选择以避免污染残留的畸胎瘤形成ESC细胞或其它未分化或分化的细胞。
由于围绕使用人ESC的政府限制和伦理道德问题束缚了ESC技术的进一步发展。许多要关注的问题是人ESC的医疗应用。
虽然围绕ESC存在着伦理问题而接受用目前方法产生的ESC移植病人需要终身免疫抑制治疗来防止ESC衍生细胞被排斥。可采用免疫抑制剂来实现这种免疫抑制。免疫抑制剂是一类能抑制机体免疫系统的药物。此类药物包括的许多制剂也有细胞毒性可用于治疗癌症。用作免疫抑制剂的细胞毒药物包括抗代谢药(硫唑嘌呤)、烷化剂(环磷酰胺)、叶酸拮抗剂(甲氨喋呤或6-MP)。其它免疫抑制剂包括霉酚酸酯(CellCept)和环孢菌素。可将这些药物用于移植ESC的病人以降低机体对外源物(如移植的ESC细胞)的自身天然防卫反应以图防止机体对ESC的排斥。
抑制病人的免疫系统可能导致许多不良副反应，如反胃、恶心、呕吐、腹痛、口腔溃疡、黑尿、白粪、黄疸(皮肤或眼白部分发黄)、罕见的出血或碰伤。严重的(和威胁生命的)副作用是骨髓活性降低，此种副作用可通过定期血液化验监测。偶而，服用免疫抑制剂的病人在开始这些药物治疗后几个月可能发生胰腺炎(胰腺炎症)。
此外，采用免疫抑制剂治疗的病人可能发生各种感染，如细菌感染、疱疹病毒感染(如唇疱疹和带状疱疹)、巨细胞病毒、真菌感染和卡氏肺囊虫(Pneumocystis carini)感染(肺感染)的危险性增大。由于病人处在这种感染增加的危险中，他们可能需要常规评估来核查感染的症候和症状。为预防疾病，病人需要服用抗病毒药物如阿昔洛韦、赛美维、伐昔洛韦；抗真菌药物如氟康唑和伏立康唑(voriconzaole)，以及抗菌素如复方新诺明(Bactrim)；。
接受免疫抑制剂治疗的病人可能经历每日常规的实质性变化。病人必须提高警惕避免接触造成感染风险的个人和活动。
可能需要限制病人在任何给定日期接触来访的个体数目和避开拥挤的密闭区域。病人必须避免接触已患病的朋友和家人包括学龄儿童。如果病人的直接家人中有人患病，该病人需要呆在另一房间中或旅馆内直到该家人不再患病。病人还必须避免接触婴儿和最近至少8周内曾接种过口服脊灰活病毒疫苗的儿童。该疫苗接种者可能在其机体排泄物如唾液和粪便中排出病毒而感染免疫抑制的个体。病人需要避开拥挤地方如饭店、教堂或寺院、零售店和公共运输场所。
还必须限制病人进行或从事某些具有感染高风险的活动，这些活动包括给婴儿换尿布、与宠物交谈沟通和参加大排挡。
发明概述
本发明涉及用有丝分裂灭活和/或致死灭活的干细胞修复受损组织，和移植这种有丝分裂灭活和/或致死灭活的干细胞到受损组织中的方法。移植这种有丝分裂灭活和/或致死灭活的干细胞能有效再生受损伤的细胞。移植这种有丝分裂灭活和/或致死灭活的干细胞到受损组织中不依赖于需要在受者中长久存在外源性干细胞，也不需要抑制受者的免疫系统而能让移植物长期存活。而且对于多能干细胞(pluripotent stem cell)而言，有丝分裂灭活可防止其形成畸胎瘤。利用这种有丝分裂灭活和/或致死灭活的干细胞可修复的各种机体器官和/或组织包括但不限于：心脏组织、神经组织、肌肉组织、胰腺组织和肝组织。此方法可有效修复动物，包括哺乳动物和人的这些组织。
可采用的干细胞包括多能干细胞。多能干细胞包括任何与其体内来源无关的干细胞或离体衍生自成人干细胞的多能干细胞，所述来源例如但不限于胚胎(ESC)、胎盘、羊水、骨髓多能。多能干细胞能分化成为一种以上的胚系细胞或组织特异性细胞系。
用能有效抑制或防止干细胞无限增殖的方法处理干细胞可有丝分裂灭活和/或致死灭活干细胞。在此方面，灭活胚胎干细胞的方法有：辐照、丝裂霉素C、光疗、或任何能抑制细胞增殖的试剂，包括但不限于有丝分裂所需细胞成分的抑制剂，例如但不限于蛋白合成、微管功能、纺锤体关卡单元、细胞周期特异性激酶、细胞周期蛋白的抑制剂，和/或凋亡诱导剂，以及能够终止或预防失调的或无限制的细胞增殖的任何遗传方法、蛋白质方法或细胞操纵方法。
附图简述
图1a是实施例1结果(将在下文中讨论)的示意图，图中将接受ESC治疗的心脏局部缺血的小鼠血压中值(mmHg)与未接受治疗的心脏局部缺血小鼠的血压中值(mmHg)作比较。
图1b是实施例1结果(将在下文中讨论)的示意图，图中将接受ESC治疗的心脏局部缺血的小鼠收缩压中值(mmHg/s)与未接受治疗的心脏局部缺血小鼠的收缩压中值(mmHg/s)作比较。
图1c是实施例1结果(将在下文中讨论)的示意图，图中将接受ESC治疗的心脏局部缺血的小鼠舒张压中值(mmHg)与未接受治疗的心脏局部缺血小鼠的舒张压中值(mmHg/s)作比较。
图2显示用有丝分裂灭活的ESC治疗糖尿病的效果。
图3显示不同剂量全身放射治疗后的存活率。
图4显示暴露于全身放疗(TBI)实验的对照哺乳动物存活曲线，与暴露于TBI然后注射有丝分裂灭活ESC的哺乳动物存活曲线的比较。
发明详述
下面描述解决以上问题和以上强调的其它问题的优选实施方式。下面的描述是目前认为实施本发明的最佳模式。这种描述不意味限制本发明，目的只是说明本发明的基本原理。
本发明的优点是消除了干细胞分化和体细胞纯化的高消耗步骤，因为这种有丝分裂灭活和/或致死灭活的干细胞或者是同种异型(另一人的)组织特异性成人干细胞，或是多能干细胞，即ESC(也是同种异型)或是同种异型羊水衍生的多能干细胞(或任何来源的多能干细胞)能在体内向内源组织提供短暂的辅助伴侣而无需抑制免疫系统或不会形成不良的畸胎瘤(有丝分裂不灭活的ESC会形成畸胎瘤)。如本文所用，不形成畸胎瘤意味着防止了失控性增殖和随后的并发症。灭活的干细胞不能经历失控的细胞分裂因而不会形成畸胎瘤。此外，由于这种干细胞的伴侣作用即使只对短期免疫抑制的病人也有效，因此长期(如一生中)免疫抑制的病人不一定需要再用有丝分裂灭活和/或致死灭活的干细胞治疗。避免免疫抑制治疗显著改善了病人的舒适感和生活质量。
本发明的另一方面内容是本文第一次证明胚胎干细胞ESC能产生显著的伴侣作用或体内的细胞-辅助-细胞作用，此种作用能介导内源组织再生。在体内提供这种伴侣作用或细胞-辅助-细胞作用。ESC介导的伴侣作用是短暂的，反复注射同种异型ESC可使宿主免疫系统不能消除这种ESC作用。
在一实施方式中，此伴侣作用可穿越外部屏障让动物的ESC代替人的ESC而使组织再生，这减轻了ESC治疗所关注的伦理问题和限制。在另一实施方式中，可从成人干细胞或从羊水或胎盘或其它来源衍生的多能干细胞获得这种伴侣效应，这减轻了所关注的伦理问题。
干细胞
干细胞是未分化细胞，通过复制能自身更新和分化成为成熟的专一细胞。广义上，有二类干细胞，胚胎干细胞(ESC)和成人干细胞(ASC)。人的ESC传统上分离自50-150个细胞4-5日龄的受精后胚泡。ESC在人体内能产生各种专一细胞，虽然离体时能无限增殖，但体内只短时存在于胚胎发育期。ASC位于整个机体的各组织中，其功能是替换受损或衰老细胞的贮存库。ASC限于分化成为其所在器官系统的细胞系。干细胞也称为：全能、多能(pluri-)、复能(multi-)或单能干细胞。全能干细胞来自桑椹胚能形成机体所需的所有细胞，包括胎盘滋养层细胞。在胚胎发育的下一阶段，桑椹胚变成胚泡。多能干细胞传统上来自发育期的胚泡阶段能分化成为机体的各种细胞但不能形成胎盘滋养层细胞。也已从羊水中回收到多能干细胞，可能发现于或产生自其它来源如胎盘，或通过操作ASC而产生。ASC作为复能干细胞(multipotent stem cells)限于分化产生其所在部位的组织品系或区室细胞。单能干细胞也称为短时扩增细胞，限于分化成为一种专一细胞。
与ASC相比，ESC具有很大的应用前景和通用性，但目前难以驯服因为他们倾向于形成机体的所有类型组织，即形成畸胎瘤。相反，ASC具有正常的良好行为不会形成肿瘤，且按照传统的品系专一分化方式执行他们的生理同类物功能，从而替代轮换的、衰老的或受损伤的组织。
我们在本文中证明了有丝分裂灭活的ESC对内源组织的修复具有强效伴侣作用且不会形成畸胎瘤。虽然我们证明了有丝分裂灭活的ESC具有此种作用，但我们断言其他有丝分裂灭活的干细胞，甚至有丝分裂灭活的成人干细胞如脐带血干细胞也能显示这种作用，尽管效率较低，这将可能在遗传背景不同的接受者中产生类似作用而无须关注同种异型细胞的无限增殖。
多能干细胞最初获自多处来源，包括胚胎、胎盘、羊水、成人干细胞的操作和各种商业来源的培养扩增细胞。
有丝分裂灭活和/或致死灭活
可采用能有效抑制干细胞无限增殖的任何方法来灭活干细胞的有丝分裂活性。抑制无限增殖意味着干细胞在体内不会产生因失控性增殖而致的并发症。
可用辐照、丝裂霉素C、光疗、或任何能抑制细胞增殖的试剂，包括但不限于有丝分裂所需细胞成分的抑制剂，例如但不限于蛋白合成、微管功能、纺锤体关卡单元、细胞周期特异性激酶、细胞周期蛋白的抑制剂；和/或凋亡诱导剂来灭活干细胞如ESC的有丝分裂活性。也可用任何能够终止或预防不良增殖或分化的蛋白质或遗传或细胞操作方法来灭活干细胞的有丝分裂活性。。此种方法可用于任何形式的离体灭活的干细胞，使此干细胞不能在体内有丝分裂或细胞分裂。我们已证明ESC在接受范围广泛的0-40戈瑞辐照后提供了组织修复伴侣作用。
另一方面内容，所述干细胞可以是致死灭活的。致死灭活意味着射线照射量或凋亡诱导剂的用量不仅仅制止了细胞分裂，而且该细胞在注射入体内数小时、数天或数周后将死亡。
干细胞移植
本发明在此地公开了利用有丝分裂灭活和/或致死灭活的干细胞修复受损伤和/或组织的方法。根据一种实施方式，将有丝分裂灭活和/或致死灭活的干细胞经静脉内移植或注射到病人的受损组织部位，或该组织的周围体液如脑脊液中。包括以单次或重复间隔多次和所有剂量的所有途径给予或输送有丝分裂灭活的干细胞。
治疗
本文所述的方法可用于所有不同类型的和/或组织的任何种类的损伤、疾病状态或衰老所致的天然退变状况。事实上任何器官都可用有丝分裂灭活和/或致死灭活的干细胞如ESC修复。例如，通过移植有丝分裂灭活干细胞可修复的器官和/或组织类型包括但不限于：(1)局部缺血或创伤后的心脏或心肌组织，(2)脑血管意外或中风后的脑或中枢神经系统(CNS)的存活，(3)脱髓鞘CNS疾病如多发性硬皮病时的少突神经胶质细胞修复，(4)退行性CNS疾病如帕金森病、享廷顿病和阿尔茨海默病的轴突修复，(5)创伤如枪伤或爆炸伤后的伤口快速愈合，(6)脊髓损伤(SCI)的修复以再生神经/再生髓鞘，(7)防止意外接触放射线幅射损伤、恐怖袭击后的组织凋亡和损伤，或从放射线导致的损伤中恢复进行医学治疗，(8)I型和II型糖尿病的胰岛细胞再生，(9)肺气肿病人的肺组织修复，(10)退变或炎症关节疾病的软骨修复，(11)急性肾小管损伤(ATN)后局部缺血肾上皮细胞的再生，(12)慢性或急性缺血组织的供血血管的再生，和(13)中毒和/或放射线导致组织损伤的修复。
虽然不希望受理论的束缚，但我们假设非分化的ESC可通过体液介质或旁分泌介质和/或细胞因子，或通过细胞接触而能介导ASC或体细胞增殖、生长因子提供了伴侣(细胞-辅助-细胞)作用，这种更新只需要短时间，可由致死灭活的或有丝分裂灭活的ESC提供。这种作用不依赖于免疫系统是否接受ESC，或不依赖于是否建立了留持的或分化的ESC后代细胞。
本发明方法的优点是简单实用。此法避免了基因治疗或细胞因子/介质介导涉及的离体ESC细胞分化，和大量纯化ESC-衍生体细胞的工作。这种不分化的ESC可直接用于促进器官特异性再生，而没有有丝分裂不灭活ESC形成畸胎瘤的不良副作用。这大大节省了时间、工作量、费用和促进了定期医疗处理的顺从性。
此外，不需要使病人免疫耐受，因外源性ESC-衍生的或多能干细胞衍生的或成人同种异型干细胞衍生的体细胞将被受者所排斥，除非他/她接受了终身免疫抑制。本文所述方法不需要免疫抑制。有丝分裂灭活ESC的旁分泌或伴侣作用是短暂的，预计此ESC将受到免疫排斥或凋亡。
从伦理角度讲，将外源性有丝分裂灭活的ESC加上人产生的ESC能有效治疗哺乳动物的疾病和损伤。虽然人ESC对于某给定应用可能是较好，但采用另一种动物的有丝分裂灭活的ESC可避免采用人ESC给病人治疗的现实伦理问题。也从伦理角度讲，从非胚胎来源的，例如但不限于胎盘或羊水来源的，或成人干细胞产生的有丝分裂灭活的多能干细胞可用于同样或类似的目的，尽管其效率较低。
可用有丝分裂灭活和/或致死灭活的干细胞治疗任何类型的哺乳动物。可治疗的哺乳动物例子包括，例如人和猩猩。由于胚胎和多能干细胞始终是保守性演化细胞，任何种类的哺乳动物都同样可以是干细胞的供者，例如，啮齿动物如小鼠和大鼠、猪、猫、狗，和灵长动物包括例如人和猩猩。
有丝分裂灭活和/或致死灭活的干细胞可能具有广泛的用途。这种应用可以是用于因疾病、创伤、局部缺血、衰老、退变或接触毒性物质所致的任何器官系统损伤。优点是，许多这种应用可得自保存产品的一次使用。由于有丝分裂灭活的ESC是通用产品，可用于任何疾病或创伤或局部缺血的器官，不论个体之间的免疫差异，因而他们易成为商品化保存产品而得到。
实施例
通过以下以列举方式给出的实施例可更好了解该实施方式和它的许多优点。
实施例1：心脏局部缺血
采用冠状动脉钳将经过照射(20-30戈瑞)的小鼠ESC注射入小鼠的缺血心肌中作为缺血/重灌模型。将接受照射ESC的小鼠与接受未照射ESC的小鼠和未接受ESC的小鼠作比较。
接受了未照射ESC和接受有丝分裂灭活ESC的心肌梗塞小鼠，与未接受ESC的小鼠相比，显示心脏舒张压和收缩压显著改善。
在几个小鼠心脏中未经处理的ESC快速恶性生长成为畸胎瘤，而在接受有丝分裂灭活ESC小鼠的心脏或任何其它器官中没有发现残留的ESC。
以下为材料、方法和结果：
小鼠
129X1/SvJ雌性小鼠购自杰克逊实验室(Jackson Lab，Bar Harbor，Main)，饲养在有过滤罩的笼子中，易接近水和食物。所有的动物实验得到西北大学动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee ofNorthwestern University)的批准。
胚胎干细胞
可采用各种动物的ESC细胞系，如129/SvJX129/SV-CP杂交雄性F1代3.5日龄小鼠(H-2b)胚泡产生的胚胎干细胞系，或人ESWC系WA09。商品化的人ESC获自伟赛研究所(WiCell Research，Madison，Wisconsin)的NIH批准的细胞系WA09。用许多已发表的方法维持培养ESC细胞，对于此法的成功已不是唯一的。对于小鼠ESC，将胚胎干细胞维持在非分化状态，在添加了15％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM β-巯基乙醇、1x非必须氨基酸、1x丙酮酸钠和1000U/ml白血病抑制因子(LIF)(专业介质公司(Specialty Media，Phillipsburg，NJ)；干细胞技术公司(StemCell Technologies，温哥华，加拿大))的高葡萄糖Dulbecco改进的Eagle培养基胶凝化组织培养皿上培养细胞。用丝裂霉素C处理的原代胚胎成纤维细胞(干细胞技术公司)作为长期培养R1ESC的饲养细胞层。将胚胎干细胞培养在明胶包被的塑料平皿中，不加PMEF至少传二代然后收集细胞供注射。
ESC有丝分裂活性的灭活和细胞增殖分析
在培养条件下ESC生长至约70％融合，然后收集并用Gammacell 40放射仪以30戈瑞照射，一天后供注射。利用溴化脱氧尿苷(BrdU)摄入分析经照射(20-30戈瑞)和未照射的ESC的增殖速率。细胞培养总体积为2ml，培养基为含LIF和10μl/mlBrdU的MESC。24或48小时后收获细胞按照厂商方案用试剂盒(BrdU Flow Kit)(BD药厂(BD Pharmingen))加工。用FITC抗-BrdU抗体和7-氨基-放线菌素(7-AAD)染色细胞。用Epics XL流式细胞仪获得流式细胞计数数据，用CellQuest软件分析。
冠状动脉结扎
将麻醉的小鼠放在仰卧位用夹子固定在手术台上。轻轻牵开舌头。在紧靠声带的下方用装有24英寸可弯曲光纤臂的150W卤灯(世界精密仪器公司(World precision Instruments，萨拉索塔，佛罗里达州))照射气管，为气管内插管提供气管观察。将插管通过咽喉插入到气管中。用鼠类通风器提供通风。沿胸骨左侧靠近胸骨中线切开肋骨打开胸腔。用5-0或6-0号丝线或单缝线牵开胸壁。轻轻牵开左心耳暴露整个左侧主冠状动脉系统。用7-0号缝线在左冠状动脉左侧动脉降支距正常左心耳部位的尖端1-3mm处穿过带结扎线的针头进行结扎。将1mm的PE-10管段置于血管顶端，在PE-10管段顶端扎紧结头阻断冠状动脉。结扎60分钟后，切去PE-10管顶端的结头进行再灌注。除去动脉阻塞后立即将细胞注射入梗阻边缘的缺血心肌中。关闭胸壁。从呼吸器中取出小鼠撤除气管内插管，用加热垫保温小鼠，通过鼻孔输入100％氧气，加强护理至24小时。进行冠状动脉结扎后30天的功能研究和免疫组化研究。
梗阻区血液动力学测定和范围大小测定
麻醉小鼠。在37C°盐水中将高度可弯曲的带尖头压力-容积导管(SPR 839，米勒仪器公司(Millar Instruments，休斯顿，得克萨斯州，美国))作归零调节。用止血钳分离右颈动脉轻轻环绕二条线阻断血管的血流。当不再看见搏动的血流时，在紧靠远端线下处作一小切口将导管安置在颈动脉中原位缝合。将换能器推入心脏，通过舒张压波的快速偏离而收缩压无变化证实其位置(正确)。让小鼠稳定安静30分钟。稳定后收集30秒钟的数据。结束收集数据时，取出心脏内测定动脉压的导管验证心瓣膜没有损伤。然后从小鼠收回导管。用数据翻译系列数字转换器将信号数字化，然后保存，在Millar PVAN数据获取和分析系统上进行分析。血压追踪产生的平均数值不到20。心室功能评估后，收集心脏用10％低聚甲醛固定。将各心脏切成4段石蜡包埋侧面平整。用切片机将心脏切成一系列5微米厚的切片。
组织学
用H&E染色评估梗阻范围大小。图象分析软件(NIH图象)以测面积法测定梗阻区域。评估了各心脏4段的所有切片。梗阻区大小表示为各心脏4段上的左心室平均百分比。也良好利用了H&E染色来分析心肌的形态，心肌中是否存在渗出和/或肿瘤生长。
FISH分析
按照厂商方案(凯姆生物有限公司(Cambio Ltd，剑桥，英国))进行单标记(整个Y染色体)的FISH分析。切割成4微米厚的一系列石蜡包埋全心块切片，准备用作组织微阵列(TMA)程序。TMA允许组合所有的组织标本包括阳性对照和阴性对照在一张载玻片上。脱去组织切片上载玻片的蜡，复水，用硫氰酸钠液和胃蛋白酶处理，固定，脱水。空气干燥后，各玻片加入15-20微米变性核苷酸探针，用盖玻片覆盖密封。37C°杂交过夜后，移去盖玻片作一系列洗涤。用DAPI反染色细胞核。用带有相应滤光系统的荧光显微镜(奥林巴斯BX-41(Olympus BX-41))检查切片。
结果
表1显示接受未照射ESC的心肌梗塞小鼠(未照射ESC，N)与接受有丝分裂灭活ESC的小鼠(照射ESC，I)和未注射ESC的产生心肌梗塞小鼠(对照，C)之间心收缩压的真实值。
表1
 
分组 BP(mmHg) 收缩压(mmHg/s) 舒张压(mmHg)
1 N 92 8502 6079
2 N 95 8934 6400
3 N 90 7875 6008
4 N 92 9593 6384
5 I 91 10079 6996
6 I 82 7076 6408
7 I 94 7388 6204
8 I 92 7906 7059
9 I 96 10753 7162
10 C 62 3780 3553
11 C 66 4270 3710
12 C 68 4367 4230
接受未照射ESC的心肌梗塞小鼠(未照射ESC，N)与接受有丝分裂灭活ESC的小鼠(照射ESC，I)和未注射ESC的产生心肌梗塞小鼠(对照，C)之间心收缩压平均值和中值的分析示于表2。至关重要的是接受照射过与未照射过ESC的小鼠之间就舒张压和心收缩压而言没有差异，但二者与未接受ESC的小鼠相比有显著改善。
表2
 
组别 # BP BP 收缩压 收缩压 舒张压 舒张压
组别 # 均值±SD 中值(最小，最大) 均值±SD 中值(最小，最大) 均值±SD 中值(最小，最大)
N 4 92.3±2.1 92(90，95) 8712.3±701.5 8718(7875，9538) 6217.8±203.4 6231.5(6008，6400)
I 5 91±5.4 92(82，96) 8638.6±1667.0 7906(7067，10753) 6765.8±429.9 6996(6204，7162)
C 3 65.3±3.1 66(62，68) 4139±314.7 4270(3780，4367) 3831±354.3 3710(3553，4230)
Figure A200780027362D00151
结论
接受未照射ESC与有丝分裂灭活ESC的心肌梗塞小鼠，与未接受ESC的小鼠相比，心肌舒张压和收缩压显示有显著改善。在几个小鼠心脏中未处理过的ESC快速恶性生长成畸胎瘤，而在接受有丝分裂灭活ESC的动物心脏或任何其它器官中没有发现残留的ESC。
实施例2：糖尿病
I型和II型糖尿病是由于机体需要的胰岛素产生不足。I型糖尿病的β胰岛细胞丧失相对较快且胰岛素损失深。非肥胖性糖尿病小鼠在90-100日龄时发生临床糖尿病。此过程是由于免疫系统介导的胰岛素生成胰岛细胞破坏而致。我们先前已证明有丝分裂灭活的ESC能修复缺血损伤导致的心肌功能失调。我们接着测定了有丝分裂灭活的ESC是否能修复或预防NOD小鼠的糖尿病。下面叙述材料、方法和结果。
小鼠
6周龄NOD/Ltj小鼠获自杰克逊实验室。
胚胎干细胞
可采用各种动物的胚泡产生的胚胎干细胞。为维持小鼠胚胎干细胞在非分化状态，在添加了15％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、1x非必须氨基酸、1x丙酮酸钠和1000U/ml白血病抑制因子(LIF)(专业介质公司(Specialty Media，Phillipsburg，NJ)；干细胞技术公司(StemCell Technologies，温哥华，加拿大))的高葡萄糖Dulbecco改进的Eagle培养基胶凝化组织培养皿上培养细胞。用丝裂霉素C处理的原代胚胎成纤维细胞(干细胞技术公司)作为长期培养R1 ESC的饲养细胞层。将胚胎干细胞培养在明胶包被的塑料平皿中，不加PMEF至少传二代然后收集细胞供注射。
ESC有丝分裂活性的灭活和细胞增殖分析
在培养条件下ESC生长至约70％融合，然后收集并用Gammacell 40放射仪以30戈瑞照射，一天后供注射。利用溴化脱氧尿苷(BrdU)摄入分析经照射(20-30戈瑞)和未照射的ESC的增殖速率。细胞培养总体积为2ml，培养基为含LIF和10μl/ml BrdU的MESC。24或48小时后收获细胞按照厂商方案用试剂盒(BrdU Flow Kit)(BD药厂(BD Pharmingen))加工。用FITC抗-BrdU抗体和7-氨基-放线菌素(7-AAD)染色细胞。用Epics XL流式细胞仪获得流式细胞计数数据，用CellQuest软件分析。
ESC移植
将小鼠分成对照组和有丝分裂灭活ESC治疗组。对照组小鼠不接受治疗。治疗组小鼠接受(尾静脉)注射5百万个已经用30戈瑞照射过并用PBS洗涤三次的ESC细胞。照射过的ESC用200微升PBS配制在小鼠70天时注射。
血糖监测
用25G号针头穿刺侧面尾静脉获得一滴外周血。用试纸(One Touch Strip)和试剂盒(Accu-Check Advantage Kit)检测血糖。首次注射后每周检测二次。血糖高于300mg/ml认为是高血糖症。
结果
所有用照射过的ESC治疗的NOD小鼠维持血糖正常无糖尿病症状，而所有对照鼠(未治疗)产生了糖尿病，见图2所示
用照射过的ESC治疗的NOD小鼠产生了临床或组织学证据的畸胎瘤。有丝分裂灭活ESC的伴侣(细胞-辅助-细胞)作用可能是由于旁分泌作用、细胞融合、生长因子、新血管生成作用或抗凋亡作用以及有益的免疫介导作用所致。
实施例3：致死性照射损伤
用不同剂量全身照射(TBI)后测定全身照射的致死剂量--SJL/J小鼠的存活情况，结果示于图3。
8戈瑞单次剂量TBI后所有小鼠在12天内死亡。接着我们用8戈瑞TBI照射小鼠且对照组小鼠不作进一步治疗，TBI后治疗组小鼠或每天接受一次注射，或在TBI后0，2，4天接受三次注射。静脉内(尾静脉或眶后静脉)每次注射经照射和洗涤的5百万个ESC细胞。图4显示了结果。
所有只接受8戈瑞TBI的小鼠均死亡，只有接受有丝分裂灭活ESC的小鼠(经30戈瑞照射处理后注射)存活。照射的小鼠为雌鼠，注射有丝分裂灭活ESC的是雄鼠。没有循环血Y染色体的证据。这种有丝分裂灭活的ESC对内源性造血提供了伴侣作用，看来有剂量反应效应，注射几天高剂量有丝分裂灭活ESC得到更长时间的存活。没有发生畸胎瘤，而将未经处理的ESC注射到照射过的小鼠导致某些小鼠在注射部位发生畸胎瘤。

Claims (13)

1.一种修复组织的方法，该方法包括：
有丝分裂灭活和/或致死灭活干细胞；和
移植这种有丝分裂灭活和/或致死灭活的干细胞到组织中。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞是多能干细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多能干细胞分离自胚胎、胎盘、或羊水，或产生自任何组织或细胞系。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用能有效抑制胚胎干细胞无限增殖的方法灭活所述干细胞。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，采用辐照、丝裂霉素C、光疗、或任何能抑制细胞增殖的试剂灭活所述干细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述要修复的组织选自心脏组织、神经组织、肌肉组织、胰腺组织、上皮组织、造血组织、肝组织、或机体的任何组织或器官。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有丝分裂灭活和/或致死灭活的干细胞不会形成畸胎瘤。
8.一种有丝分裂灭活和/或致死灭活干细胞的方法，该方法包括：
提供多能干细胞；和
用能有效抑制多能干细胞无限增殖和有效灭活成人干细胞如脐带血干细胞以防止它们在受者体内生长或持续存留的方法灭活多能干细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述多能干细胞分离自胚胎、胎盘、或羊水，所述成人干细胞分离自任何成人器官、脐带血或胎盘，其中可采用成人干细胞来产生多能干细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，采用辐照或丝裂霉素C，或任何能有效抑制细胞增殖直到并包括致死性损伤细胞的试剂或技术来灭活所述干细胞。
11.一种由包括以下步骤的方法产生的有丝分裂灭活的干细胞，所述步骤为：
提供多能干细胞；和
用能有效抑制多能干细胞无限增殖的方法灭活所述多能干细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述多能干细胞分离自胚胎、胎盘、或羊水，或成人干细胞。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，采用以下方法来灭活所述胚胎干细胞：辐照，丝裂霉素C，光疗，或任何能抑制细胞增殖的试剂，包括但不限于有丝分裂所需细胞成分的抑制剂，例如但不限于蛋白合成、微管功能、纺锤体关卡单元、细胞周期特异性激酶、细胞周期蛋白的抑制剂，和/或凋亡诱导剂。
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