BRPI0714455A2

BRPI0714455A2 - mÉtodos para reparar tecido e para inativar mitoticamente e/ou letalmente cÉlulas-tronco, e, cÉlula-tronco mitoticamente inativada

Info

Publication number: BRPI0714455A2
Application number: BRPI0714455-5A
Authority: BR
Inventors: Richard Burton
Original assignee: Richard Burton
Priority date: 2006-07-20
Filing date: 2007-07-19
Publication date: 2013-04-02
Also published as: RU2009105890A; WO2008011524A2; US20160022744A1; US20090214491A1; JP2009544362A; US9017658B2; AU2009200637A1; WO2008011524A3; BRPI0714455A8; CN101490244A; US9867855B2; CA2659021A1; MX2009000741A; EP2049655A2; EP2049655A4; US20150328265A1; CO6160246A2

Abstract

PROCESSO PARA EPIMERIZAR CICLOHEXENIL CETONAS E SUA APLICAÇçO NO PROCESSO DE CONDENSAÇçO ALDOL. A presente invenção refere-se a processos para produção de materiais intermediários usados em perfumarias, especificamente ciclohexenil cetonas epimerizadas. A invenção também refere-se a processos para empregar a reação epimerizante em uma reação de condensação aldol. O processo para epimerizar uma ciclohexenil cetona compreende a etapa de reagir uma cicloxenil cetona epimerizável com um hidreto metálico, preferivelmente um hidreto dos metais do Grupo 1 ou Grupo 2, sendo que mais preferivelmente, em que o hidreto metálico é selecionado do grupo que consiste em LiH. NaH, CaH2 e misturas dos mesmos.Grupo 2, sendo que mais preferivelmente, em que o hidreto metálico é selecionado do grupo que consiste em LiH. NaH, CaH2 e misturas dos mesmos.

Description

"MÉTODOS PARA REPARAR TECIDO E PARA INATIV AR MITOTICAMENTE E/OU LETALMENTE CÉLULAS-TRONCO, E, CÉLULA-TRONCO MITOTICAMENTE INATIVADA"

Este pedido reivindica o benefício sob 35 USC 119(e) do pedido provisório US número 60/807.861, depositado em 20 de julho de 2006, que é incorporado aqui por referência.

A presente invenção refere-se ao uso de células-tronco mitoticamente e/ou letalmente inativadas para o reparo de órgãos e/ou tecidos danificados. Qualquer forma de inativação ex vivo de células-tronco pode ser usada de modo que as células-tronco não possam sofrer mitose ou divisão celular indesejada antes ou após aplicação in vivo. Células-tronco mitoticamente e/ou letalmente inativadas podem ser usadas para melhorar numerosas doenças, danos e/ou condições degenerativas em diferentes tipos de órgãos e/ou tecidos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Células-tronco, especialmente ESC, devido à pluripotência, são investigadas para reparar ou rejuvenescer tecido. No entanto, ESC, devido ao seu comportamento pluripotencial (também chamado pluripotente), quando injetada in vivo, formam teratomas, um crescimento de tumor canceroso desregulado. Os teratomas são compostos de células de todas as três camadas germinais embrionárias: mesoderma, endoderma e ectoderma.

Para enganar a geração de teratomas, ESC atualmente usadas em transplantes devem ser diferenciadas in vivo em linhagem de fenótipos de células-tronco adultas comprometidas e ou células totalmente diferenciadas. Este processo consome tempo, requer a manutenção de Bons Procedimentos de Fabricação (GMP) durante um período de tempo prolongado, e um método para purificar o produto final para assegurar que não ocorra contaminação de ESC pluripotentes residuais, e um método para assegurar a identidade de células desejadas e equivalência lote a lote. Células derivadas de ESC devem ser cultivadas ex vivo e mantidas em condições de meios definidas e isentas de alimentadores para atender às diretrizes de GMP.

Avanços recentes na tecnologia de cultura de células têm atendido às exigências de GMP para manutenção e expansão de ESC indiferenciadas. No entanto, a fim de evitar a formação de teratomas, ESC devem passar por diferenciações onerosas e de uso intensivo de mão de obra em uma célula somática madura antes da aplicação in vivo. Além disso, estas células somáticas devem sofrer purificação ou seleção para evitar contaminação com ESC formando teratoma residual ou outras células

contaminantes diferenciadas ou indiferenciadas.

Outros avanços em tecnologias de ESC são restringidos devido a restrições governamentais e questões éticas circundando o uso de ESC humana. De interesse para muitos é o uso de ESC humanas em procedimentos médicos.

Apesar das questões éticas circundando ESC, pacientes que recebem ESC transplantadas produzidas pelos métodos atuais podem requerer supressão imune durante toda a vida para prevenir rejeição de células somáticas derivadas de ESC. A supressão imune pode ser obtida pelo uso de imunossupressores. Imunossupressores são uma classe de fármacos capazes de inibir o sistema imunológico do corpo. Muitos dos agentes incluídos nesta categoria também são citotóxicos (venenos de célula) e são usados no tratamento de câncer. Os agentes citotóxicos usados como imunossupressores incluem anti-metabólitos (azatioprina), agentes alquilantes (ciclofosfamida) e antagonistas de ácido fólico (metotrexato ou 6-MP). Outros imunossupressores incluem micofenolato (CellCept) e ciclosporina. Estes fármacos podem ser usados em pacientes com transplante de ESC para aumentar a defesa natural própria do corpo aos corpos estranhos (como ESC transplantadas) e, assim, tentar prevenir a rejeição a ESC pelo corpo.

A supressão do sistema imunológico pode criar um número de efeitos colaterais indesejáveis em um paciente como indisposição do estômago, náusea, vômito, dor abdominal, úlceras da boca, urina escurecida, fezes pálidas, icterícia (amarelecimento da pele ou porção branca dos olhos), sangramento incomum ou machucados. Um efeito colateral grave (e ameaçador para a vida) é a atividade reduzida da medula óssea, que é monitorada com testes de sangue regulares. Ocasionalmente, pacientes tomando imunossupressores desenvolverão pancreatite (inflamação do pâncreas) alguns meses após iniciar estas drogas.

Além disso, pacientes passando por terapia de imunossupressão estão em maior risco para várias infecções incluindo infecções bacterianas, infecções por herpes (como herpes labial e herpes- zóster), citomegalovírus, infecções fungicas, e Pneumocystis carinii (uma infecção do pulmão). Devido aos pacientes estarem em um risco aumentado para infecção, pode ser requerido que eles tenham avaliações de rotina para checar quaisquer sinais ou sintomas de infecção. Para prevenir enfermidades, pode ser requerido que os pacientes tomem medicações antivirais como aciclovir, citovene e velaciclovir; medicações antifungicas como fluconazol e

voriconazol; e antibióticos como Bactrim.

Pacientes recebendo terapia com imunossupressores irão experimentar provavelmente mudanças substanciais na rotina diária. Os pacientes devem ser vigilantes para evitar pessoas e atividades os colocando

em risco de infecção.

Os pacientes podem necessitar restringir o número de

indivíduos com os quais eles entram em contato em qualquer dia dado e evitar

áreas fechadas, cheias de pessoas. Os pacientes devem evitar contato com

amigos e família que estão doentes incluindo crianças em idade escolar. Se

um membro da família imediata do paciente estiver enfermo, pode ser

requerido que o paciente permaneça em outro quarto ou permaneça em um

hotel até o membro da família não estar mais doente. Os pacientes devem também evitar contato com bebês e crianças que foram vacinadas recentemente com a vacina contra pólio oral com vírus vivo durante pelo menos oito semanas. Os recipientes da vacina podem liberar o vírus nas excreções do corpo como saliva e fezes e infectar um indivíduo imunossuprimido. Pode ser requerido que o paciente evite lugares cheios como restaurantes, igrejas e templos, supermercados, e transporte público.

Os pacientes também podem estar limitados de desempenhar ou se engajar em certas atividades que têm um alto risco para infecção. Estas atividades podem incluir trocar fralda de bebê, interagir com animais domésticos, e jardinagem.

SUMÁRIO

A presente invenção é dirigida a um método para reparar tecido danificado por inativação mitótica e/ou inativação letal de células- tronco e transplante das células-tronco mitoticamente e/ou letalmente inativadas para o tecido danificado. As células-tronco mitoticamente e/ou letalmente inativadas são eficazes para a regeneração de células danificadas. O transplante de células-tronco mitoticamente e/ou letalmente inativadas no tecido danificado não depende de uma presença permanente de células-tronco estranhas no recipiente e o sistema imunológico do recipiente não precisa ser suprimido para permitir um enxerto duradouro. Além disso, para células- tronco pluripotentes, inativação mitótica previne a formação de teratomas. Cada órgão e ou tecido no corpo pode ser reparado usando células-tronco mitoticamente e/ou letalmente inativadas, incluindo mas não limitados a tecido cardíaco, tecido nervoso, tecido muscular, tecido pancreático e tecido do fígado. O método é eficaz para reparar estes tecidos em animais, incluindo

mamíferos, primatas e humanos.

Células-tronco que podem ser utilizadas incluem células-

tronco pluripotentes. Células-tronco pluripotentes incluem qualquer célula- tronco independente de sua fonte de origem in vivo como, mas não limitadas a embriões (ESC), placenta, fluido amniótico, medula óssea, ou células-tronco pluripotentes derivadas de célula-tronco adulta ex vivo. Uma célula-tronco pluripotente é capaz de diferenciar-se em mais do que uma linhagem germinal ou linhagens de células específicas de tecido.

Células-tronco são mitoticamente e/ou letalmente inativadas

tratando as células-tronco com um método eficaz para inibir ou prevenir a proliferação ilimitada de células-tronco. Neste aspecto, as células-tronco embrionárias são inativadas com irradiação, mitomicina C, fototerapia, ou qualquer agente que inibe a proliferação de células incluindo, mas não limitados a, inibidores de componentes celulares necessários para mitose como, mas não limitados a síntese de proteína, função de microtúbulo, unidade de ponto de verificação de fuso, quinases específicas de ciclos de células, ciclinas, e ou agentes de indução apoptóticos, bem como quaisquer meios de manipulação genética, de proteína e ou de células que permitirão o término ou prevenção de proliferação de células desregulada ou ilimitada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Fig. 1 é uma representação gráfica dos resultados do exemplo 1 (discutidos a seguir) em que a pressão sangüínea mediana (mmHg) em camundongos tendo corações isquêmicos tratados com ESC é comparada à pressão sangüínea mediana (mmHg) em camundongos tendo corações isquêmicos não recebendo nenhum tratamento.

Fig. Ib é uma representação gráfica dos resultados do exemplo 1 (discutidos a seguir) onde contratilidade mediana (mmHg/s) em camundongos tendo corações isquêmicos tratados com ESC é comparada à contratilidade mediana (mmHg/s) em camundongos tendo corações isquêmicos não recebendo nenhum tratamento.

Fig. Ic é uma representação gráfica dos resultados do exemplo 1 (discutidos a seguir) onde relaxamento mediano (mmHg) em camundongos tendo corações isquêmicos tratados com ESC é comparado a relaxamento mediano (mmHg) em camundongos tendo corações isquêmicos não recebendo nenhum tratamento.

Fig. 2 demonstra o efeito de tratamento com ESC mitoticamente inativadas sobre diabetes.

Fig. 3 mostra a sobrevivência % após dose diferente de irradiação do corpo total./ Fig. 4 mostra uma curva de sobrevivência para experiências de irradiação do corpo total (TBI) em controles (expostos a TBI) comparado a mamíferos expostos a TBI e então injetados com ESC mitoticamente inativadas.

DESCRIÇÃO DETALHADA Os problemas acima e outros referidos acima são resolvidos pelas formas de realização discutidas abaixo. A seguinte descrição é do melhor modo atualmente contemplado para praticar a invenção. Esta descrição não deve ser tomada em um sentido limitante, mas é feita simplesmente para o fim de descrever os princípios gerais da invenção.

A invenção vantajosamente elimina as etapas onerosas de diferenciação de células -tronco e purificação de células somáticas porque as células-tronco mitoticamente e/ou letalmente inativadas ou células -tronco adultas específicas de tecido alogeneicas ou células -tronco pluripotentes (de outra pessoa) isto é, células -tronco pluripotentes derivadas de fluido amniótico alogeneico (também alogênico) ESC (ou células-tronco pluripotentes de qualquer fonte) podem prover uma "acompanhante" in vivo transiente em tecido endógeno sem necessidade de supressão imune ou formação de teratoma indesejável (ESC, que são teratomas na forma mitoticamente inativada). Como usado aqui, não formando teratomas significa prevenção de proliferação descontrolada e suas complicações subseqüentes. Células-tronco inativadas não são capazes de sofrer divisão celular descontrolada e, assim, não formam teratomas. Além disso, devido ao efeito de "acompanhante" de células-tronco ser eficaz mesmo se somente presente transientemente, imunossupressão a longo prazo (isto é, por toda a vida) em um paciente não é necessariamente um requisito de tratamento com células- tronco mitoticamente e/ou letalmente inativadas. Evitar uma terapia de imunossupressão melhora drasticamente o conforto e qualidade de vida do paciente.

Em outro aspecto da invenção, como demonstrado pela primeira vez aqui para células-tronco embrionárias, ESC produzem um efeito de "acompanhante" pronunciado ou um efeito de célula-ajuda-célula in vivo que media a regeneração de tecido endógeno. Este efeito de "acompanhante" ou célula-ajuda-célula é proporcionado in vivo. O efeito de "acompanhante" mediado por ESC é transiente e a rejeição de ESC alogeneicas pelo sistema imunológico do hospedeiro não diminuem a eficácia de ESC.

Em uma forma de realização, o efeito de "acompanhante" pode ocorrer através de barreiras xenogênicas permitindo a substituição de ESC de animal por ESC humanas para regeneração de tecido que pode mitigar as preocupações com relação à ética e restrições em terapias com ESC. Em outra forma de realização, este efeito de "acompanhante" pode ser obtido de células-tronco pluripotentes derivadas de células-tronco adultas ou de fluido amniótico ou placenta ou outras fontes que poderiam mitigar as preocupações com relação à ética. Células-tronco

Células-tronco são células indiferenciadas que através de replicação têm a capacidade de tanto auto-renovação como de diferenciação em células especializadas maduras. Em termos amplos, existem dois tipos de células-tronco, células-tronco embrionárias (ESC) e células-tronco adultas (ASC). ESC humanas são tradicionalmente isoladas de um blastócito pós- fertilização de 4 a 5 dias de idade, de 50 a 150 células. ESC geram toda célula especializada no corpo humano; e apesar de serem capazes de proliferação ex vivo indefinida, existem somente transientemente durante embriogênese in vivo. ASC estão localizadas em tecidos por todo o corpo e funcionam como um reservatório para substituir células envelhecidas ou danificadas. ASC são restritas em sua diferenciação em linhagens de células do sistema de órgãos em que elas estão localizadas. As células-tronco também são referidas como toti-, pluri-, multi- ou uni-potentes. Células-tronco totipotentes surgem da mórula e são capazes de formar todas as células essenciais para o corpo, incluindo trofoblastos placentários. No próximo estágio de desenvolvimento embrionário, a mórula torna-se um blastócito. Células-tronco pluripotentes surgem tradicionalmente do estágio de blastócito de desenvolvimento e dão origem a cada célula no corpo, mas não trofoblastos placentários. Células- tronco pluripotentes também são recuperadas de fluido amniótico e podem ser encontradas ou geradas de outras fontes como placenta ou da manipulação de ASC. ASC são células-tronco multi-potentes em que sua diferenciação é limitada à linhagem de tecido ou compartimento em que elas estão localizadas. Células-tronco uni-potentes, também denominadas células de ampliação transientes, são restritas em diferenciação em uma célula

especializada única.

ESC representam uma grande promessa e tem versatilidade

mas, comparadas a ASC, são atualmente difíceis de 'domesticar' devido à sua tendência de formar todos os tipos de tecido dentro do corpo, isto é, um teratoma. Em contraste, ASC normalmente comporta-se bem sem formação de tumores, e seguem padrões de diferenciação específicos de linhagens tradicionais, preenchendo sua função homóloga fisiológica de substituir a reposição tipo viragem normal, tecidos em envelhecimento ou danificados. Aqui, os requerentes demonstraram que ESC que são

mitoticamente inativadas têm um efeito de "acompanhante" potente sobre o reparo de tecidos endógenos e não formam teratomas. Apesar dos requerentes demonstrarem que este efeito para ESC mitoticamente inativadas, os requerentes mantêm que a inativação mitótica de outras células-tronco pluripotentes e mesmo células-tronco adultas mitoticamente inativadas como sangue do cordão umbilical, podem transmitir, embora com eficácia menor, um efeito similar sem a preocupação de proliferação não controlada de células alogeneicas em um recipiente geneticamente diferente.

Células-tronco pluripotentes podem ser obtidas originalmente

de um número de fontes incluindo embriões, placenta, fluido amniótico, de manipulação de células-tronco adultas, e de várias fontes comerciais que expandem as células em cultura. Inativação mitótica e/ou letal As células-tronco podem ser mitoticamente inativadas com

qualquer método eficaz para inibir a proliferação ilimitada de células-tronco. Inibição de proliferação ilimitada significa que células-tronco não apresentam complicações in vivo de proliferação descontrolada.

Células-tronco, como ESC, podem ser mitoticamente inativadas com radiação, fototerapia com mitomicina, ou qualquer agente que inibe proliferação de células incluindo mas não limitados a inibidores de componentes celulares necessários para mitose como, mas não limitados a síntese de proteína, função de microtúbulo, unidade de ponto de checagem de fuso, quinases específicas de ciclos de células, ciclinas, e ou agentes de indução apoptóticos. As células-tronco também podem ser mitoticamente inativadas por quaisquer meios de manipulação de proteína ou genética ou celular que terminarão ou prevenirão a proliferação indesejada e ou diferenciação. Esta abordagem aplica-se a qualquer forma de inativação ex vivo de células-tronco de modo que as células-tronco não podem sofrer mitose ou divisão células in vivo. Os requerentes mostram que ESC provêem um efeito de "acompanhante" de reparo de tecidos após exposição a amplas faixas

de doses de radiação de 10 a 40 Gy.

Em um outro aspecto, as células-tronco podem ser letalmente inativadas. Letalmente inativadas significam que a dose de radiação ou agente de indução apoptótico é de tal modo que ESC não somente param de dividir- se mas morrem dentro de horas, dias ou semanas da injeção. Transplante de células-tronco

A invenção aqui descrita utiliza células-tronco mitoticamente e/ou letalmente inativadas para o reparo de órgãos e/ou tecidos danificados. De acordo com uma forma de realização, células-tronco mitoticamente e/ou letalmente inativadas como ESC são transplantadas ou injetadas em um sítio de tecido danificado ou intravenosamente ou em fluido circundante como fluido cérebro-espinhal em um paciente. Isto cobre todas as vias de administração ou de liberação de células-tronco mitoticamente inativadas no corpo em intervalos únicos ou repetidos e em todas as doses. Tratamentos

Os métodos aqui descritos se aplicam a todos os diferentes tipos de órgãos e/ou tecidos para qualquer tipo de dano, estado doentio, ou estado degenerativo natural causado por envelhecimento. Virtualmente qualquer órgão pode ser reparado com células-tronco mitoticamente e/ou letalmente inativadas como ESC. Por exemplo, os tipos de órgãos e/ou tecido que podem ser reparados por transplante de células-tronco mitoticamente inativadas incluem mas não são limitados a (1) tecido cardíaco ou coração após dano isquêmico ou traumático, (2) preservação do cérebro ou sistema nervoso central (CNS) após acidente vascular cerebral ou derrame, (3) reparo de oligodendrócitos em desmielinação de doenças do SNC como esclerose múltipla, (4) reparo axonal de doenças do SNC degenerativas como mal de Parkinson, Huntington e Alzheimer, (5) cicatrização rápida de feridas após traumas como danos de tiros de revólver ou de explosivos, (6) reparo de danos da medula espinham (SCI) para reinervação / remielinação, (7) prevenção de apoptose de tecido e dano após dano causado por radiação ou de exposição acidental, após um ataque terrorista, ou para recuperação de dano induzido por radiação usado como terapia médica, (8) regeneração de células da ilhota para diabete tipo I e II, (9) tecido do pulmão em pacientes com enfisema, (1) reparo de cartilagem em doenças das juntas degenerativas ou inflamatórias, (11) regeneração de epitélio renal isquêmico após dano tubular agudo (ATN), (12) regeneração de suprimento vascular para tecido cronicamente ou agudamente isquêmico, e (13) reparo de dano de tecido induzido por tóxicos e/ou radiação.

Apesar de não se desejar ser limitado por teoria, formula-se a hipótese de que ESC indiferenciadas provêem um efeito de "acompanhante" (célula-ajuda-célula) por mediadores humorais ou parácrinos e ou fatores celulares ou fatores mediados através de contato celular que podem mediar ASC ou proliferação de células somáticas, crescimento e renovação que é requerido apenas transientemente e pode ser provido por ESC letalmente inativadas ou mitoticamente inativadas. Este efeito não depende da aceitação imune de ESC ou de estabelecimento de uma progênie de células comprometidas ou diferenciadas derivadas de ESC.

O método é com vantagem simples e prático. Ele evita diferenciação de ESC que envolve terapia de genes ou diferenciação ex vivo dirigida por citocinas / meio e purificação extensiva de célula somáticas derivadas de ESC. ESC indiferenciadas pode ser diretamente usadas para aumentar a regeneração específica de órgãos sem efeitos laterais indesejados de formação de teratoma de ESC não mitoticamente inativadas. Esta é uma economia tremenda de tempo, esforço, despesas e aceitação de questões regulatórias.

Além disso, a tolerância imune em pacientes não é requerida. as células somáticas derivadas de ESC ou derivadas de células-tronco pluripotentes ou derivadas de células-tronco alogeneicas adultas são estrangeiras e podem ser rejeitadas pelo recipiente salvo se ele/ela receber supressão imune a vida toda. Os métodos aqui descritos não requerem supressão imune. O efeito de parácrina ou acompanhante de ESC mitoticamente inativas é transiente e a rejeição mediada por imune ou apoptose de ESC poderia ser esperada.

De um ponto de vista ético, ESC mitoticamente inativadas xenogeneicas além de ESC derivadas de humanos são eficazes para tratar doença e danos em mamíferos. Apesar de ESC humanas serem superiores para uma dada aplicação, o uso de ESC mitoticamente inativadas de outra espécie evita qualquer questão ética par átomos de carbono de pacientes surgindo de intervenção e uso de ESC humanas. Também de um ponto de vista ético, as células-tronco pluripotentes mitoticamente inativadas derivadas de fontes não embriônicas como mas não limitadas a placenta e fluido amniótico ou derivadas de células-tronco adultas podem ser usadas com o mesmo ou similar efeito, apesar de talvez menor.

Qualquer tipo de mamífero pode ser tratado com células- tronco mitoticamente e/ou letalmente inativadas. Os exemplos de mamíferos que podem ser tratados incluem, mas não limitados a roedores, como camundongos e ratos, porcos, gatos, cães, e primatas, incluindo, por exemplo humanos e chimpanzés. Porque as células-tronco embriônicas e pluripotentes são um tema evolucionário consistentemente conservado, qualquer tipo de mamífero pode ser provavelmente um doador de células-tronco, como por exemplo, roedores como camundongos e ratos, porcos, gatos, cães, e primatas, incluindo, por exemplo humanos e chimpanzés.

Existem uma ampla faixa de aplicações para as quais as células-tronco mitoticamente e/ou letalmente inativadas podem ser usadas. As aplicações são disponíveis para uso em qualquer sistema do órgão danificado por doença, trauma, isquemia, envelhecimento, degeneração, ou exposição a substâncias nocivas. Com vantagem, muitas das aplicações podem ser derivadas de um único produto de prateleira. Porque ESC mitoticamente inativadas são um produto universal que pode ser usado para qualquer doença ou órgão traumatizado ou com isquemia independente de diferenças imunológicas entre os indivíduos, elas são prontamente disponíveis dentre o

produto comercial na prateleira.

EXEMPLOS

Uma melhor compreensão da presente forma de realização e de suas muitas vantagens pode ser esclarecida com o seguinte exemplo, dado a título de ilustração. EXEMPLO 1 - ISQUEMIA CARDÍACA

ESC irradiadas de camundongos (20 Gy a 30 Gy) foram injetadas em miocárdio murino isquêmico usando grampo de artéria coronária como um modelo isquêmico / reperfusão. Os camundongos recebendo ESC irradiadas foram comparados com camundongos recebendo ESC não irradiadas e camundongo não recebendo ESC.

Os camundongos com infarto recebendo ESC não irradiadas e ESC mitoticamente inativadas mostraram uma melhora marcada em termos de relaxamento cardíaco e contratibilidade em comparação com camundongos

não recebendo ESC.

ESC não tratadas deram lugar a teratomas malignos de rápido

crescimento em vários dos corações em questão enquanto nenhuma ESC residual pode ser encontrada nos corações ou qualquer outro órgão de animais recebendo ESC mitoticamente inativadas.

Os materiais, métodos e resultados seguinte abaixo:

Camundongos

Os camundongos fêmeas 129X1/SvJ foram adquiridos do

Jackson Laboratories (Jackson Lab. Bar Harbor, Main) e alojados em caixas

de topo filtrado usando condições de barreira com fácil acesso a água e

alimento. Todas as experiências de animais foram aprovadas pelo Institutional

Animal Care and Use Committee of Northwestern University.

Células-tronco embriônicas

Várias linhagens ESC de animais como as linhagens de células-tronco embriônicas derivadas de blastócitos de camundongo de 3-5- dias híbrido Fl macho 129/SvJX129/SV-CP (H-2b) ou linhagem WA09 ESWC podem ser usadas. ESC humanas foram obtidas comercialmente (WiCeIl Research Madison, Wisconsin) como uma linhagem de células aprovada por NIH WA09. A cultura de ESC em cultura de manutenção pode ser realizada em numerosos modos publicados e não são singulares para o sucesso desta abordagem. Para ESC de camundongo, para manter células - tronco embriônicas em um estado indiferenciado, as células foram cultivadas em discos de cultura de tecido gelatinizado em meio de Eagle's modificado por Dulbecco's suplementado com 15% soro fetal bovino (FBS)5 2mM L- glutamina, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 1 χ aminoácidos não essenciais, 1 χ piruvato de sódio e 1000 U/ml fator inibidor de leucemia (LIF) (Specialty Media, Phillipsburg, NJ; StemCell Technologies, Vancouver, Canada). Os fibroblastos embriônicos primários tratados com Mitomicina C- (StemCell Technologies) foram usados como uma camada de alimentação para cultura a longo prazo de Rl ESC. As células -tronco embriônicas foram cultivadas em discos de plástico revestidos com gelatina sem PMEF para as duas últimas passagens antes da coleta para a injeção. Inativacão mitótica de ESC e análise de proliferação celular ESC foram cultivadas sob condições de cultura como acima

em 70% de confluência, então coletadas e irradiadas com 30 Gy usando irradiador Gammacell 40 um dia antes da injeção. ESC irradiadas (20 a 30 Gy) e ESC não irradiadas foram analisadas para taxa de proliferação usando absorção de bromodesoxiuridina (BrdU). As células foram cultivadas em um volume total de 2 mL em meio MESC na presença de LIF e lOuL/mL de BrdU. 24 ou 48 horas depois, as células foram coletadas e processadas com o kit BrdU Flow (BD Pharmingen) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram coloridas com FITC anti-BrdU e 7-amino-actinomicina (7- AAD). Os dados citométricos de fluxo foram adquiridos usando um citômetro de fluxo Epics XL e analisadas com o software CellQuest. Ligação da artéria coronária

Os camundongos anestesiados foram colocados em posição supina com as patas amarradas na mesa de operação. A língua foi levemente retraída. Uma fonte de luz de halogênio A150-W (World Precision Instruments, Sarasota, FL) com dois braços de fibra óptica flexível de 60,96 cm permitiu a transiluminação da traquéia logo abaixo das cordas vocais para prover visualização da traquéia para intubação endotraqueal. Um cateter foi inserido através da laringe e na traquéia. A ventilação foi provida por um ventilador para roedor. O peito foi aberto ao longo do lado esquerdo o esterno cortando através das costelas até aproximadamente o meio esterno. As paredes do peito foram retraídas pelo uso de uma sutura de seda 5-0 ou 6-0 ou monofilamento. A aurícula esquerda foi levemente retraída expondo todo o sistema arterial coronário principal esquerdo. A ligação prosseguiu com uma sutura de seda 7-0 com uma agulha cega embaixo do ramo descendente anterior esquerdo da artéria coronária esquerda 1 -3 mm da ponta da aurícula esquerda normalmente posicionada. Uma seção de 1 mm de tubo PE-IO foi colocada no topo do vaso, e nó foi amarrado no topo do tubo para ocluir a artéria coronária. Após oclusão durante 60 min, a reperfusão ocorreu por corte do nó no topo do tubo PE-10. As células foram injetadas no miocárdio isquêmico na borda do sítio do infarto imediatamente antes de remover a oclusão da artéria. A parede do peito foi então fechada. O camundongo foi removido do respirador, o tubo endotraqueal foi retirado, e o camundongo foi mantido quente por uma almofada térmica e deixado 100% oxigênio via cone nasal sob cuidado intensivo durante até 24 h. Os estudos funcionais e imuno- histoquímica foram feitos 30 dias após a ligação da artéria coronária. Medida hemodinâmica e determinação da extensão do infarto

Os camundongos foram anestesiados. Um cateter de volume de pressão com ponta de transdutor de alta fidelidade (SPR 839, Millar Instruments, Houston, TX, USA) foi zerado a solução salina a 37 0C. A artéria carótida direita foi isolada, e as duas ligações foram suavemente puxadas para trás, usando hemostatos, para bloquear o fluxo de sangue do vaso. Quando o fluxo pulsátil não foi mais visível, um corte pequeno foi feito logo abaixo da ligação distai, e o cateter foi colocado dentro da artéria carótida, e fixado em posição. O transdutor foi avançado no coração, onde sua posição foi confirmada pela deflexão rápida da onda de pressão diastólica sem qualquer mudança na pressão sistólica. Os camundongos foram deixados estabilizar durante 30 min. Após estabilização, 30 s de dados foram coletados. No final da coleta de dados, o cateter foi removido do coração para medida da pressão arterial, a fim de verificar que as válvulas não tinham sido danificadas. O cateter foi então removido do camundongo. Sinais foram digitados por uso de conversor analógico digital de uma série de tradução de dados e então armazenados e analisados em um sistema de aquisição e análise de dados Millar PVAN. Os valores derivados de traços de pressão foram tirados em média em menos que 20. Após avaliação da função ventricular, os corações foram coletados e fixados em 10 % para-formaldeído. Todos os corações foram cortados em 4 blocos e foram incrustados em parafina com lado plano para baixo. As seções em série de coração foram cortadas em espessura de 5 μηι com um micrótomo. Histologia

A extensão do infarto foi avaliada por coloração H&E. A área do infarto foi determinada por planimetria usando software de análise de imagem (imagem NIH). Todas as seções dos 4 blocos de cada coração foram avaliadas. O tamanho do infarto foi expressado como a porcentagem média do ventrículo esquerdo dos 4 blocos de cada coração. As laminas coloridas com H&E foram usadas assim como para analisar a morfologia de cardiomiócitos, a presença ou ausência de infiltração, e/ou crescimento de tumor sem miocárdio. Análise FISH

A análise FISH de rótulo único (único cromossomo Y) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (Cambio Ltd, Cambridge, UK). As seções em série de bloco de coração total incrustado em parafina foram cortadas (4 jom de espessura) e preparadas para procedimento usando micro-arranjo de tecido (TMA). TMA permitiu a combinação de todas as amostras de tecido incluindo controles positivo e negativo em uma lâmina. As seções de tecido nas lâminas revestidas foram removidas de cera, reidratadas, tratadas com solução de tiocianato de sódio e pepsina, fixadas e desidratadas. Após secar em ar, 15-20 μΐ de sonda de nucleotídeo desnaturada foram adicionados a cada lâmina, cobertas por tampa e seladas. Após hibridização noturna a 37 0C, a tampa foi removida e lavagens em série foram realizadas. Os núcleos foram contra-manchados com DAPI. As lâminas foram examinadas por microscópio fluorescente (Olympus BX-41) com um sistema de filtro apropriado. Resultados

Os valores reais de contratibilidade entre camundongos com infarto recebendo ESC não irradiadas (ESC-não irradiadas N), camundongos que receberam ESC mitoticamente inativadas (ESC irradiadas - I) e camundongos que tiveram infarto sem ESC injetadas (controle C) são mostrados na tabela 1.

Tabela 1

Grupo BP (mmHg) Contratilidade (mmHg/s) Relaxamento (mmHg) 1 N 92 8502 6079 2 N 95 8934 6400 3 N 90 7875 6008 4 N 92 9593 6384 I 91 10079 6996 6 I 82 7076 6408 7 I 94 7388 6204 8 I 92 7906 7059 9 I 96 10753 7162 C 62 3780 3553 11 C _J 66 4270 3710 12 C 68 4367 4230 Análise de contratibilidade média e mediana entre camundongos com infarto recebendo ESC não irradiadas (ESC não irradiadas - N), camundongos que receberam ESC mitoticamente inativadas (ESC irradiadas -I), e camundongo que tiveram infarto sem ESC injetadas (controle-C) são mostrados na tabela 2. É importante notar nenhuma diferença entre ESC irradiadas e ESC não irradiadas em termos de relaxamento cardíaco e contratibilidade mas que se nota uma melhora marcada tanto quando comparado com camundongos não recebendo ESC.

Tabela 2

Grupo # BP BP Contra- tilidade Contra- tilidade Relaxa -mento Relaxamento Grupo # médio ± SD médio (min; max) médio ± SD médio (min;max) médio ± SD médio (min; max) N 4 92,3±2,1 92 (90; 95) 8712,3± 701,5 8718 (7875; 9538) 6217,8± 203,4 6231,5 (6008; 6400) I 5 91 ±5,4 92 (82;96) 863 8,6± 1667,0 7906 (7067; 10753) 6765,8± 429,9 6996 (6204; 7162) C 3 65,3±3,1 66 (62; 68) 4139± 314,7 4270 (3780; 4367) 3831± 354,3 3710 (3553;4230)

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Os camundongos com infarto recebendo ESC não irradiadas e

ESC mitoticamente inativadas mostraram uma melhora marcada em termos

de relaxamento cardíaco e contratibilidade em comparação com os

camundongos não recebendo ESC. ESC não tratadas deram lugar a teratomas

malignos de crescimento rápido em vários dos corações dos indivíduos

enquanto nenhuma ESC residual pode ser encontrada em corações ou

qualquer outro órgão de animais recebendo ESC mitoticamente inativadas.

F,XEMPLO 2 - DIABETE Tanto o diabete tipo I como tipo II são devido a insulina

insuficiente para exigências do corpo. No diabete tipo I, perda de células beta-

ilhota é relativamente rápida e profunda com perda de produção de insulina.

Os camundongos diabéticos não obesos desenvolveram diabete clínica cerca

de 90 a 100 dias deidade. Este processo é devido à destruição mediada imune

de células ilhotas produzindo insulina. Os requerentes demonstraram

previamente que ESC mitoticamente inativadas poderia reparar a disfunção

induzida por dano isquêmico de miocárdio. A seguir os requerentes

determinaram se ESC mitoticamente inativadas poderiam reparar ou prevenir

diabete em camundongo NOD. Os materiais e métodos e resultados seguem

abaixo.

Camundongos

Camundongos NOD/Ltj de seis semanas de idade foram obtidos do Jackson laboratory. Células-tronco embriônicas Linhagens de células-tronco embriônicas derivadas de

blastócitos de vários animais podem ser usadas. Para manter células -tronco embriônicas em um estado indiferenciado, as células foram cultivadas em discos de cultura de tecido gelatinizado em meio de Eagle1S modificado por Dulbecco's de alto teor de glicose, suplementado com 15% soro fetal bovino (FBS), 2mM L-glutamina, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 1 χ aminoácidos não essenciais, 1 χ piruvato de sódio e 1000 U/ml fator inibidor de leucemia (LIF) (Specialty Media, Phillipsburg, NJ; StemCell Technologies, Vancouver, Canada). Os fibroblastos embriônicos primários tratados com Mitomicina C- (StemCell Technologies) foram usados como uma camada de alimentação para cultura a longo prazo de RI ESC. As células -tronco embriônicas foram cultivadas em discos de plástico revestidos com gelatina sem PMEF para as duas últimas passagens antes da coleta para a injeção. Inativacão mitótica de ESC e análise de proliferação celular ESC foram cultivadas sob condições de cultura como acima

em 70% de confluência, então coletadas e irradiadas com 30 Gy usando irradiador Gammacell 40 um dia antes da injeção. ESC irradiadas (20 a 30 Gy) e ESC não irradiadas foram analisadas para taxa de proliferação usando absorção de bromodesoxiuridina (BrdU). As células foram cultivadas em um volume total de 2 mL em meio MESC na presença de LIF e lOuL/mL de BrdU. 24 ou 48 horas depois, as células foram coletadas e processadas com o kit BrdU Flow (BD Pharmingen) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram coloridas com FITC anti-BrdU e 7-amino-actinomicina (7- AAD). Os dados citométricos de fluxo foram adquiridos usando um citômetro de fluxo Epics XL e analisadas com o software CellQuest. Transplante de ESC

Os camundongos foram divididos em grupos de ESC mitoticamente inativadas e de controle. Os camundongos de controle não receberam intervenção. Os camundongos tratados receberam injeção intravenosa (veia da cauda) de 5 milhões de ESC que tinham sido irradiadas com 30 gray e lavadas com PBS três vezes. As ESC irradiadas foram injetadas em 200 μΐ PBS no dia 70 da vida do animal. Monitoração de glicose no sangue

Uma gota de sangue periférico foi obtida por punção da veia da cauda lateral com uma agulha 25G. A glicose no sangue foi medida usando um kit OneTouch Strip e Accu-Check Advantage. As medidas foram realizadas duas vezes por semana desde a primeira injeção. A glicemia acima de 300 mg/ml foi considerada hiperglicêmica. Resultados

Todos os camundongos NOD tratados com ESC irradiadas permaneceram euglicêmicos sem evidência de diabete, enquanto todos os camundongos de controle (não tratados) desenvolveram diabete, como

demonstrado na figura 2.

Nenhum camundongo NOD tratado com ESC irradiadas desenvolveu evidência clínica ou histológica para teratomas. O efeito de "acompanhante" (célula-ajuda-célula) de ESC mitoticamente inativadas pode ser devido a efeitos parácrinos, fusão celular, fator de crescimento, angiogênicos ou anti-apoptóticos assim como efeitos mediados imunes benéficos.

EXEMPLO 3 - DANO POR RADIAÇÃO LETAL

A dose letal de sobrevivência de camundongos SJL/J - irradiação do corpo total foi determinada após doses diferentes de irradiação de corpo total (TBI) como mostrado na figura 3.

Em uma dose única de TBI de 8 grays, todos os camundongos morreram em 12 dias. A seguir, os requerentes irradiaram camundongos com TBI de 8 gray enquanto os camundongos de controle não receberam outra terapia, os camundongos tratados receberam uma injeção um dia após TBI ou 3 injeções nos dias O, 2 e 4 após TBI. ESC lavadas irradiadas foram injetadas ou intravenosamente (veia da cauda ou retro-orbital) em 5 milhões de ESC por injeção. Os resultados são mostrados na figura 4.

Todos os camundongos recebendo TBI 8 grau apenas morreram, somente os camundongos recebendo ESC mitoticamente inativadas (tratados com irradiação de 30 Gy antes da injeção) sobreviveram. Os camundongos irradiados foram fêmeas e injetados com ESC mitoticamente inativadas eram machos. Não se tem documentação sobre cromossomos y circulantes. ESC mitoticamente inativadas proveram um efeito de "acompanhante" para hematopoiese endógena e pareceu ser um efeito de resposta à dose com maiores doses de células mitoticamente inativadas injetadas durante vários dias dando uma sobrevivência mais longa. Não ocorreram teratomas, enquanto injeção de ESC não tratadas em camundongos irradiados resultou em formação de teratomas em sítios de injeção em alguns camundongos.

Claims

1. Método para reparar tecido, caracterizado pelo fato de compreender: células-tronco mitoticamente e/ou letalmente inativantes, e transplante das células-tronco mitoticamente e/ou letalmente inativadas para o tecido.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células-tronco são células-tronco pluripotentes.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as células-tronco pluripotentes são isoladas de embriões, placenta, ou fluido amniótico ou geradas de qualquer tecido ou linhagem celular.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células-tronco são inativadas usando um método eficaz para inibir a proliferação não limitada de células-tronco embriônicas.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as células -tronco são inativadas com irradiação ou mitomicina C, fototerapia, ou qualquer agente que inibe a proliferação celular.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tecido sendo reparado é selecionado dentre o grupo consistindo de tecido cardíaco, tecido do nervo, tecido muscular, tecido pancreático, tecido epitelial, tecido hematopoiético, tecido do fígado, ou qualquer tecido ou órgão no corpo.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células-tronco mitoticamente e/ou letalmente inativadas não formam teratomas.

8. Método para inativar mitoticamente e/ou letalmente células- tronco, caracterizado pelo fato de compreender: prover células-tronco pluripotentes, e inativar as células-tronco pluripotentes com um método eficaz para inibir a proliferação não limitada das células-tronco pluripotentes e eficaz para inativar as células-tronco adultas como sangue de cordão umbilical para evitar seu crescimento ou persistência em um recipiente.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as células-tronco pluripotentes são isoladas de embriões, placenta, ou fluido amniótico e células-tronco adultas são isoladas e qualquer órgão adulto, de sangue de cordão umbilical ou placenta, em que as células-tronco adultas podem ser usadas para gerar células-tronco pluripotentes.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as células-tronco são inativadas com irradiação ou mitomicina C, ou qualquer agente ou técnica eficaz para inibir a proliferação de células até e incluindo dano letal à célula.

11. Célula-tronco mitoticamente inativada caracterizada pelo fato de ser produzida por um método compreendendo: prover células-tronco pluripotentes, e inativar as células-tronco pluripotentes com um método eficaz para inibir a proliferação não limitada das células-tronco pluripotentes.

12. Célula-tronco de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que as células-tronco pluripotentes são isoladas de embriões, placenta, ou fluido amniótico ou de células-tronco adultas.

13. Célula-tronco de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que as células-tronco embriônicas são inativadas com irradiação, mitomicina C, fototerapia, ou qualquer agente que inibe a proliferação de células incluindo, mas não limitados a, inibidores de componentes celulares necessários para mitose como, mas não limitados a síntese de proteína, função de microtúbulo, unidade de ponto de verificação de fuso, quinases específicas de ciclos de células, ciclinas, e ou agentes de indução apoptóticos.