发明内容
本发明公开了一种重组人角质细胞因子KGF-2环境敏感型眼部传递系统及其应用。具体涉及一种KGF-2硅质体为核心的环境敏感型眼部传递系统、其制备方法及应用。该KGF-2硅质体采用薄膜水化超声法或乙醇溶胶注入法制备,并进一步制备成环境敏感型眼部传递系统。与现有技术相比,本发明产品可明显提高KGF-2稳定性,延长KGF-2在眼内滞留的时间,有利于KGF-2的吸收和利用。对各类角膜溃疡具有良好的修复作用,也能滋润眼球缓解干眼症症状,同时对眼部疲劳具备良好的舒缓作用,另外亦适用于其他口腔黏膜、粘膜创伤及皮肤美容治疗后的修复。
在第一方面中,本发明提供了一种重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统,所述系统包含1.2~3.5重量%的KGF-2、1~10重量%的有机-无机复合脂质、6~20重量%的保护剂和1~5重量%的凝胶基质。
其中所述的重组人KGF-2选自基因工程发酵纯化提取的KGF-2,其宿主菌选自大肠杆菌BL21(DE3)、BL21(DE3)rosatta、BL21(DE3)plyss,优选BL21(DE3)菌株。用于本发明的重组人KGF-2的氨基酸序列为SEQ IDNo.1所示。
其中所述的有机-无机复合脂质选自下式1-4中的任一种:
其中所述保护剂为多糖类,如壳聚糖、果胶、葡聚糖(如右旋糖苷、烷基葡萄糖苷、);所述凝胶基质选自壳聚糖、明胶、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、海藻酸钠或它们的任意组合。
本发明提供的KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统可以为温度敏感型、pH敏感型或离子敏感型,优选离子敏感型眼部传递系统。
在本发明提供的KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统,其中所述KGF-2硅质体平均粒径为100-300nm,优选150nm。
在第二方面中,本发明提供的一种制备KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)表达并纯化重组人KGF-2蛋白;
(2)利用选自下式1-4中的任一种的有机-无机复合脂质制备重组人KGF-2硅质体:
①通过下述任一种方法制备空白硅质体:
(a)薄膜水化超声法:
取5mg所述有机-无机复合脂质,将其溶解在2mL pH=3的酸性乙醇中室温孵育1小时,再将其转移到100mL圆底烧瓶中,加入3mL氯仿溶液,充分混匀;利用旋转蒸发仪在55℃条件下,缓慢将有机溶剂蒸出,此时在圆底烧瓶底部形成一层均匀的白色薄膜;将圆底烧瓶放入真空干燥箱中干燥过夜;次日,在圆底烧瓶中加入15mL超纯水,然后放入水浴锅中55℃恒温水浴20分钟,使薄膜充分水化。水浴超声15分钟,再用探头超声5分钟(振幅为2.0,超声3秒停止3秒)得到空白硅质体悬液;或
(b)乙醇溶胶注入法:
首先在20℃条件下,将所述有机-无机复合脂质在酸性乙醇溶液中孵育0.5~2h;然后在室温下将硅烷头部水解后的溶胶注入到乙醇/水(1:9v/v)中,注入后在50℃条件下孵育24小时制备硅质体;
②将步骤①制备的空白硅质体、步骤(1)得到的重组人KGF-2蛋白和蛋白保护剂在低温(4℃)下孵育过夜,制成重组人KGF-2硅质体,所述重组人KGF-2硅质体的粒径在100~300nm范围内;然后
(3)利用步骤(2)制得的重组人KGF-2硅质体配制KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递凝胶:
(i)普通温敏凝胶基质的制备:
壳聚糖/明胶/甘油磷酸钠体系:以体积比为10:0.5:2.0的壳聚糖/明胶/甘油磷酸钠体系空白凝胶;按比例加入2重量%壳聚糖溶液和0.5重量%明胶溶液,逐滴加入56重量%甘油磷酸钠并混匀,制成空白凝胶基质;
泊洛沙姆体系:18重量%P-407、5重量%P-188和0.6重量%羟丙基甲基纤维素(HPMC)
准确称取配方量的P407(泊洛沙姆407)、P188(泊洛沙姆188)和HPMC(羟丙基甲基纤维素),加入柠檬酸缓冲液(pH4.0),边加边搅拌,之后将其放入冷库中(4-10℃),间歇搅拌,待颗粒完全溶胀后高压蒸汽灭菌(121℃,20min),置于4℃存放;
(ii)载有重组KGF-2温敏凝胶的制备
在4℃条件下将已制备好的KGF-2硅质体缓慢加入到步骤(i)制备的空白凝胶基质中,KGF-2硅质体与空白凝胶基质的质量比为1:100~1:10,边加边搅拌,混合均匀即得重组KGF-2硅质体环境敏感型凝胶。
在本发明的一个优选的实施方案中,所述重组人KGF-2硅质体可以通过下述步骤制备:
(a1)称取3mg选自式1-4的任一种的有机-无机复合脂质在pH=3的盐酸乙醇溶液中酸化后置于25mL圆底烧瓶中,旋干后溶于适量的氯仿,再缓慢旋转蒸发(55℃水浴,90r/min)除去溶剂,溶剂蒸发完以后再旋转30min以充分除去痕量氯仿;
(a2)向步骤(a1)的圆底烧瓶中加入总体积4~5mL的包含超纯水、KGF-2和果胶(作为蛋白保护剂)的水溶液(其中所述无机-有机复合脂质与重组人KGF-2的摩尔比为10:1,果胶与重组人KGF-2的摩尔比例为3:1),将烧瓶放在37℃的恒温水浴锅中使薄膜充分水化30min,然后水浴超声,形成多室囊泡;最后用探头超声仪冰水浴超声5min(0℃,振幅20,间隔为3s)至溶液充分分散形成稳定体系,即得到KGF-2硅质体悬液;
(a3)将步骤(a2)中制得的KGF-2硅质体悬液依次过0.8μm、0.45μm和0.22μm膜,调整KGF-2硅质体的粒径在100~300nm范围内。
在本发明的另一个优选的实施方案中,所述重组人KGF-2硅质体还可以通过下述步骤制备:
(b1)称取3mg有机-无机复合脂质在pH=3的盐酸乙醇溶液中酸化后置于25mL圆底烧瓶中,旋干后溶于适量的氯仿,再缓慢旋转蒸发(55℃水浴,90r/min)除去溶剂,溶剂蒸发完以后再旋转30min以充分除去痕量氯仿;
(b2)将粒径均一(100nm~2μm)的模板微球溶液(模板微球为可去除的模板材料,选自三聚氰胺甲醛树脂(MF)胶体颗粒、SiO2颗粒、CaCO3颗粒等)加入到步骤(b1)的脂质薄膜中,孵育1~5h后,进行水浴超声;
(b3)超声后得到的溶液室温静置,待模板微球表面形成无机硅酸盐壳层,用物理或化学的方法除去模板微球得到空白硅质体;
(b4)向步骤(b3)制得的空白硅质体中加入总体积4~5mL的包含超纯水、重组人KGF-2和葡聚糖400(作为蛋白保护剂)的水溶液(所述无机-有机复合脂质与重组人KGF-2的摩尔比为10:1,葡聚糖400与KGF-2的摩尔比例为3:1),与空白硅质体在4℃过夜孵育。
在本发明的一个优选实施方案中,提供一种制备KGF-2硅质体离子敏感型眼部传递系统的方法,所述方法包含以下步骤:
(1)表达并纯化重组人KGF-2蛋白:采用SUMO融合蛋白表达系统,在大肠杆菌宿主菌中表达重组人KGF-2蛋白,纯化得到重组人KGF-2蛋白;
(2)制备重组人KGF-2硅质体:
(a’)称取3mg选自式1-4中任一种的有机-无机复合脂质在pH=3的盐酸乙醇溶液中酸化后置于25mL圆底烧瓶中,旋干后溶于适量的氯仿,再缓慢旋转蒸发(55℃水浴,90r/min)除去溶剂,溶剂蒸发完以后再旋转30min以充分除去痕量氯仿;
(b’)向步骤(a’)的烧瓶中加入总体积4~5mL的包含超纯水、KGF-2和蛋白保护剂的水溶液(所述复合脂质与重组人KGF-2摩尔比为10:1,蛋白保护剂与KGF-2的摩尔比例为3:1),将烧瓶放在37℃的恒温水浴锅中使薄膜充分水化30min,然后水浴超声,形成多室囊泡;最后用探头超声仪冰水浴超声5min(0℃,振幅20,间隔为3s)至溶液充分分散形成稳定体系,即得到KGF-2硅质体悬液;
(c’)将步骤(b’)中制得的KGF-2硅质体悬液依次过0.8μm、0.45μm和0.22μm膜,调整粒径在100~300nm范围内;
(3)使用步骤(2)中制得的重组人KGF-2硅质体以2重量%海藻酸钠为凝胶基质制备离子敏感型眼用凝胶。
在本发明的另一个优选实施方案中,提供的一种制备KGF-2硅质体温度敏感型眼部传递系统的制备方法,所述方法包含以下步骤:
(1)表达并纯化重组人KGF-2蛋白:采用SUMO融合蛋白表达系统,在大肠杆菌宿主菌中表达重组人KGF-2蛋白,纯化得到重组人KGF-2蛋白;
(2)利用选自式1-4中的任一种的有机-无机复合脂质制备重组人KGF-2硅质体:
(a”)称取3mg有机-无机复合脂质在pH=3的盐酸乙醇溶液中酸化后置于25mL圆底烧瓶中,旋干后溶于适量的氯仿,再缓慢旋转蒸发(55℃水浴,90r/min)除去溶剂,溶剂蒸发完以后再旋转30min以充分除去痕量氯仿,制得复合脂质薄膜;
(b”)将粒径均一(粒径为100nm~2μm)的模板微球溶液(其中所用的模板材料是可去除的,可选自三聚氰胺甲醛树脂(MF)胶体颗粒、SiO2颗粒、CaCO3颗粒等)加入到步骤(a”)中制得的脂质薄膜中,孵育1~5h后,进行水浴超声;
(c”)将超声后得到的溶液室温静置,待模板微球表面形成无机硅酸盐壳层后,用物理或化学的方法除去模板微球得到空白硅质体;
(d”)向步骤(c”)制得的空白硅质体中加入总体积4~5mL的包含超纯水、重组人KGF-2和烷基葡萄糖苷的水溶液(其中,所述复合脂质与重组人KGF-2的摩尔比为10:1,蛋白保护剂与重组人KGF-2的摩尔比为3:1),与空白硅质体在4℃过夜孵育;
(3)使用步骤(2)中制得的重组人KGF-2硅质体以泊洛沙姆为基质制备温度敏感型眼用凝胶。
本发明还提供重组人KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统在制备用于治疗受试者中的角膜损伤或病变的药物中的应用,其中所述角膜损伤或病变为各种原因引起的角膜损伤或病变,包括但不限于,角膜上皮缺损和点状角膜病变,复发性浅层点状角膜病变、轻中度干眼症、大泡性角膜炎、角膜擦伤、轻中度化学烧伤、角膜手术及术后愈合不良、地图状(或营养性)单庖性角膜溃疡等。
本发明还提供治疗受试者中的角膜损伤或病变的方法,所述方法包括给所述受试者施用有效量的本发明的重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统。
其中所述角膜损伤或病变包括各种原因引起的角膜损伤或病变,包括但不限于,角膜上皮缺损和点状角膜病变,复发性浅层点状角膜病变、轻中度干眼症、大泡性角膜炎、角膜擦伤、轻中度化学烧伤、角膜手术及术后愈合不良、地图状(或营养性)单庖性角膜溃疡等。
本发明提供的重组人KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统,为局部药物制剂,其也可以用于口腔黏膜、其他黏膜创伤的修复。因此,本发明还提供重组人KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统在制备用于修复黏膜创伤的试剂盒中的应用,其中所述粘膜创伤包括但不限于,口腔黏膜创伤,鼻窦粘膜创伤等。
本发明提供的重组人KGF-2硅质体环境敏感型制剂也可以制成美容剂用在美容中。
综上所述,本发明提供下述:
1.一种重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统,包含1.2~3.5重量%的重组人KGF-2蛋白、1~10重量%的有机-无机复合脂质、6~20重量%的保护剂和1~5重量%的凝胶基质。
2.根据第1项所述的环境敏感型眼部传递系统,其中所述的重组人KGF-2的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
3.根据第1项所述的环境敏感型眼部传递系统,其中所述有机-无机复合脂质选自下式1-4中的任一种:
其中所述保护剂为多糖类,如壳聚糖、果胶、葡聚糖(如右旋糖苷、烷基葡萄糖苷);所述凝胶基质选自壳聚糖、明胶、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、海藻酸钠或它们的任意组合。
4.根据第1项所述的环境敏感型眼部传递系统,其中所述的硅质体环境敏感型眼部传递系统为温度敏感型、pH敏感型或离子敏感型,优选离子敏感型眼部传递系统。
5.根据第1项所述的环境敏感型眼部传递系统,其中所述硅质体平均粒径为100-300nm,优选150nm。
6.一种制备第1项所述的重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统的方法,所述方法包含以下步骤:
(1)表达并纯化重组人KGF-2蛋白;
(2)利用选自下式1-4中的任一种的有机-无机复合脂质制备空白硅质体:
(3)将步骤(2)制备的空白硅质体、(1)得到的重组人KGF-2蛋白和蛋白保护剂在低温(4℃)下孵育,制成重组人KGF-2硅质体,所述重组人KGF-2硅质体的粒径在100~300nm范围内;然后
(4)利用步骤(3)制得的重组人KGF-2硅质体配制KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递凝胶。
7.根据第6项所述的方法,其中步骤(2)的空白硅质体通过薄膜水化超声法或乙醇溶胶注入法制备。
8.第1项的重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统在制备用于治疗受试者中的角膜损伤或病变的药物中的应用,其中所述角膜损伤或病变为各种原因引起的角膜损伤或病变,包括,角膜上皮缺损和点状角膜病变、复发性浅层点状角膜病变、轻中度干眼症、大泡性角膜炎、角膜擦伤、轻中度化学烧伤、角膜手术及术后愈合不良或地图状(或营养性)单庖性角膜溃疡。
9.第1项的重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统在制备美容剂中的应用。
10.一种用于治疗受试者中的角膜损伤或病变的方法,所述方法包括向所述受试者的损伤或病变处施用有效性的权利要求1所述的重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明,但是本领域技术人员应该理解,本发明并不限于这些具体的实施例。
实施例一、重组人KGF-2蛋白的表达和纯化
采用SUMO融合蛋白表达系统,利用大肠杆菌表达宿主,使用LB培养液发酵,菌体破碎液通过阳离子交换层析、肝素亲和层析柱、HPLC进行分离,收集得到纯化的重组人KGF-2蛋白。其中重组人KGF-2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。
先使用分子伴侣SUMO作为表达rhKGF-2的融合标签,该标签一方面可以改善目的蛋白的溶解性和帮助其正确折叠,以达到获得大量可溶性融合蛋白的目的,而且还能大大提高rhKGF-2的表达率,有利于进行大规模的发酵生产。具体可参见文献(提供相关的文献)(MolecularBiotechnology.01/2009;42(1):68-74.DOI:10.1007/s12033-008-9135-7)。
实施例二、重组人KGF-2硅质体的制备
(a)称取3mg选自式1-4中任一项的有机-无机复合脂质在pH=3的盐酸乙醇溶液中酸化后置于25mL圆底烧瓶中,旋干后溶于适量的氯仿,再缓慢旋转蒸发(55℃水浴,90r/min)除去溶剂,溶剂蒸发完以后再旋转30min以充分除去痕量氯仿;
(b)加入总体积4~5mL的超纯水、重组人KGF-2的水溶液(其中所述复合脂质与重组人KGF-2的摩尔比为10:1)以及烷基葡萄糖苷(烷基葡萄糖苷作为蛋白保护剂,其中所述的烷基葡萄糖苷与重组人KGF-2的摩尔比为3:1),将烧瓶放在50℃的恒温水浴锅中使薄膜充分水化30min,然后水浴超声,形成多室囊泡;最后用探头超声仪超声5min(振幅20,间隔为3s)至溶液充分分散形成稳定体系,即得到KGF-2硅质体悬液;
(c)将步骤(c)中制得的KGF-2硅质体悬液依次过0.8μm、0.45μm和0.22μm膜,调整KGF-2硅质体的粒径在100~300nm范围内。
实施例三、重组人KGF-2硅质体的制备
(a)称取3mg选自式1-4中任一项的有机-无机复合脂质在pH=3的盐酸乙醇溶液中酸化后置于25mL圆底烧瓶中,旋干后溶于适量的氯仿,再缓慢旋转蒸发(55℃水浴,90r/min)除去溶剂,溶剂蒸发完以后再旋转30min以充分除去痕量氯仿;
(b)将粒径均一(粒径为100nm~2μm)的模板微球溶液(即,SiO2颗粒)加入到脂质薄膜中,孵育3h后,进行水浴超声;
(c)超声后得到的溶液室温静置,待模板微球表面形成无机硅酸盐壳层后,用物理或化学的方法除去模板微球得到空白硅质体;
(d)加入总体积4~5mL的超纯水、重组KGF-2和蛋白保护剂的水溶液(其中复合脂质与重组人KGF-2的摩尔比为10:1,蛋白保护剂与重组人KGF-2的摩尔比为3:1)与空白硅质体在4℃过夜孵育,即得到KGF-2硅质体悬液。
实施例四、重组人KGF-2硅质体离子敏感型眼部给药系统的制备
海藻酸钠和羟丙基甲基纤维素(HPMC)组成离子敏感型凝胶基质。
以1重量%的海藻酸钠和8重量%的HPMC在搅拌下加入适量注射用水,另取羟苯乙酯(0.03重量%)溶于适量热水后加入,待混匀放凉后,再加入氯化钠(0.68重量%),得到的空白凝胶100℃,流通蒸汽灭菌30min,备用。
空白凝胶基质加入实施例二中的KGF-2硅质体(其中在制得的凝胶剂中KGF-2硅质体的含量为10重量%),混合均匀,加注释用水至足量。并分装。此过程严格无菌操作。
实施例五、KGF-2硅质体温度敏感型眼部给药系统的制备
采用冷法,制备KGF-2硅质体温度敏感型凝胶。
21重量%泊洛沙姆407、5重量%泊洛沙姆188(购自德国BASF公司)和0.10重量%透明质酸(购自山东福瑞达)组成稳定敏感型凝胶基质。防腐剂采用羟苯乙酯(0.03重量%),氯化钠调等渗。先制备空白凝胶基质,100℃,流通蒸汽灭菌30min,备用。
此空白凝胶基质加入实施例三中的KGF-2硅质体(其中在制得的凝胶剂中KGF-2硅质体的含量为15重量%),混合均匀,加注释用水至足量。并分装。此过程严格无菌操作。
实施例六、重组人KGF-2硅质体温度敏感型眼部给药系统(实施例五)药效学研究
I.材料与方法
①动物模型的构建:
碱烧伤模型:日本大耳白兔用速眠新II注射液按0.2~0.3ml/kg肌肉注射麻醉,局部用1重量%盐酸丁卡因滴眼液点眼表面麻醉后,将直径6mm的滤纸片浸入0.5mol/L NaOH溶液中3秒钟后取出,贴于角膜表面,计时30s后取下,于角膜中央造成瓷白色圆形烧伤斑。
②实验分组
阴性对照组:给药等量的生理盐水
实验组:给予不同剂量的实施例五制备的重组人KGF-2硅质体温度敏感型眼部给药系统,其中给予的KGF-2含量为:
KGF-2 12.5μg/ml组
KGF-2 25μg/ml组
KGF-2 50μg/ml组
KGF-2 100μg/ml组
阳性对照组:给药有效量的贝复舒滴眼液(珠海亿胜生物制药有限公司批号:20120601,21000IU/5ml/瓶,浓度约为2.5μg/ml(1ng相当于1.7IU)。)③观察指标
A.动物整体观察
烧伤后1~14d(天),每日观察各组动物恢复状况、角膜临床表现,包括结膜囊内分泌物、结膜充血、角膜和结膜水肿、角膜烧伤斑混浊程度以及角膜新生血管形成等。
B.裂隙灯观察及角膜照相
于兔角膜碱烧伤前及伤后即刻、7d和14d行眼科裂隙灯观察及角膜彩色照相,记录角膜烧伤斑的病程变化。应用SLM型眼科裂隙灯自带软件对烧伤斑在不同时间点的面积、平均灰度进行测量。经SAS软件统计处理,定量分析不同实验组角膜烧伤斑的修复情况。
此外,对数码相机拍摄的角膜相片进行电脑图像分析,采用半定量方法确定角膜损伤修复率(%)。
C.病理组织学观察
于兔角膜碱烧伤后1d、7d和14d在体分离角膜,制备病理组织学切片,光镜下观察。
D.角膜透光率OD值测定
分别于兔角膜碱烧伤后7d、14d时将动物处死,沿角巩膜缘剪取角膜,分光光度计560nm波长下在损伤斑区域从上向下沿轴心均匀测定10个点,再将角膜倒转90°测定10个点,总计每只角膜测定20个点。
E.MTT法检测角膜上皮活性
分别于兔角膜碱烧伤后7d、14d时将动物处死,用直径6mm的角膜环钻钻取烧伤部位的前1/3板层角膜,培养于含2ml10%胎牛血清DMEM培养液的24孔板中,37℃孵箱孵育1h后,每孔加入新配制的MTT工作液(5mg/ml)200μl,37℃恒温摇床振摇4~6h,每孔加入2ml含10%SDS的10nmol/L HCl中止反应,37℃孵箱中过夜,混匀后吸取100μl加于96孔培养板中,设5个复孔,酶联免疫仪测定492nm处的光吸收值,每个样品重复测量3次。
II.重组人KGF-2硅质体温度敏感型限用凝胶促进兔角膜上皮损伤修复试验
建立兔角膜碱烧伤模型,模型动物随机分为5组,即KGF-2硅质体温度敏感型眼用凝胶低、中和高三个剂量组、赋形剂对照组(阴性对照组)和bFGF滴眼液组(阳性对照组,其中bFGF滴眼液为购自珠海亿胜生物科技有限公司的贝复舒滴眼液),每组8只,雌雄各半。每天滴眼四次,连续3周。观察KGF-2硅质体温度敏感型眼用凝胶是否可阻断机体的免疫应答、感染、炎症反应,抑制角膜新生血管的形成及促进角膜上皮细胞的恢复。
II.1下表1显示使用本发明的重组人KGF-2硅质体温度敏感型眼用凝胶的激光烧伤后兔角膜半定量损伤修复率。
表1和图1为碱烧伤后兔角膜半定量损伤修复率情况,结果显示,与烧伤对照组相比,伤后7d,bFGF2.5μg/ml组和各剂量KGF-2组均有显著性差异;伤后14d,bFGF2.5μg/ml组和KGF-225μg/ml组与烧伤对照组有显著性差异。与bFGF2.5μg/ml组相比,伤后7d,烧伤对照组和各剂量KGF-2组均有显著性差异,bFGF2.5μg/ml组明显优于其它各组;伤后14d,bFGF2.5μg/ml组明显优于烧伤对照组和KGF-212.5μg/ml组,而与KGF-225μg/ml组和KGF-250μg/ml组间无显著性差异。
表1碱烧伤后兔角膜半定量损伤修复率(%)
注:与同一时间点碱烧伤阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
与同一时间点bFGF2.5μg/ml组比较,#P<0.05,##P<0.01
另外,从图1可以看到,碱烧伤后7d,bFGF2.5μg/ml治疗组的损伤修复率高于烧伤对照组和各剂量KGF-2组,14d时,bFGF2.5μg/ml治疗组与KGF-225μg/ml治疗组间无显著性差异,二者促进角膜损伤修复的作用相当。
II.2裂隙灯显微镜观察结果
角膜新生血管的形成:经眼科裂隙灯显微镜观察,计数损伤后角膜新生血管的形成,并对记录数据进行综合计数统计,结果参见表2和图2、8。碱烧伤后,与烧伤对照组相比,伤后1-w,KGF-212.5μg/ml组的角膜新生血管发生率有显著性差异,二者分别为17.5%(14/80)和4.17%(1/24);与2.5μg/ml bFGF-2组相比,烧伤对照组和各剂量KGF-2组均无显著性差异。碱烧伤后2-w,无论与碱烧伤对照组还是2.5μg/ml bFGF-2组相比较,各组之间均无明显的统计学差异。
表2碱烧伤后兔角膜新生血管发生率(%)
注:与同一时间点碱烧伤阴性对照组比较,*P<0.05
从以上结果可以看出,在兔角膜碱烧伤模型中,本发明的重组人角质细胞因子KGF-2硅质体温度敏感型眼部传递系统与阳性bFGF滴眼液组一样有效。本发明的重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统可以用于治疗各种原因引起的角膜损伤或病变。
应该理解,尽管参考其示例性的实施方案,已经对本发明进行具体地显示和描述,但是本领域的普通技术人员应该理解,在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下,可以在其中进行各种形式和细节的变化,可以进行各种实施方案的任意组合。