JP2020512015A - 融合タンパク質とその製造方法及びその眼疾患の治療、抗炎症、抗腫瘍薬物の製造における使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(一)融合タンパク質の遺伝子の取得及び発現ベクターの構築
血管阻害剤ポリペプチドHM−3配列は、SEQ ID NO.5に示される通りであり、インターロイキン4配列は、SEQ ID NO.6に示される通りであり、ヒトイムノグロブリンIgG1−Fcドメイン(SEQ ID NO.7)を、異なるリンカーペプチドであるGly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Serフレキシブル(F)リンカー、AlaGluAlaAlaAlaLysGluAlaAlaAlaLysGluAlaAla AlaLysGluAlaAlaAlaLysAlaリジッド(R)リンカーにより、IL4DM−HM3タンパク質と接続し、2種類の新規なFc融合タンパク質Fc−IL4DM−HM3を設計する。フレキシブル(F)リンカーで構築されたタンパク質一のアミノ酸配列は、SEQ ID NO.1に示される通りであり、リジッド(R)リンカーで構築されたタンパク質二のアミノ酸配列は、SEQ ID NO.2に示される通りである。CHO細胞コドンの好みにより、2種類の新規なFc融合タンパク質Fc−IL4DM−HM3をコードする配列を最適化し、すべて3’端にNheI酵素切断部位、Kozak配列、シグナルペプチドを導入し、5’端にXhoI酵素切断部位を導入し、全遺伝子合成方法によりSEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4というDNA配列を得る。
一過性トランスフェクションとは、DNAを真核細胞に導入する方法の一つである。一過性トランスフェクションにおいて、組換えDNAを感染性の強い細胞系に導入することにより、目的の遺伝子を一過的でありながら高いレベルで発現する。短い時間で実験に用いられる十分なタンパク質を取得し、安定的トランスフェクションにおける細胞選別時間を節約することができる。Expi293 Expression System一過性トランスフェクション発現システムにより、2種類の新規な融合タンパク質Fc−IL4DM−HM3を発現する。融合タンパク質の発現過程が完全に一致するので、Fc−IL4DM−HM3−1を例とし、実験過程は以下の通りである。
−80℃の冷蔵庫から、Fc−IL4DM−HM3−1発現ベクターによる菌株保存グリセリンチューブを1本取り出し、500mLのAmp抵抗性LB培地の入った2Lの振とうフラスコに接続し、37℃、160rpmで終夜振とうして培養する。
トランスフェクションに用いられる293F細胞を回復当日から4日間ずつ培養し、細胞密度0.4*106cells/mLで継代培養し、少なくとも継代培養を三回行ってから一過性トランスフェクションを行う。継代培養過程において、最終的なトランスフェクション培地の体積により、必要に応じて継代培養体積を増大する。
(1) 実験前日に6*107の生細胞を30mLのExpi293 Expression Mediumに入れ、37℃、8%CO2、125rpmで振とう培養する。
〔1〕30μgプラスミドDNAを1.5mLのOpti−MEM I Reduced Serum Mediumに再溶解し、軽く均一に混合する。
Protein Aは、黄色ブドウ球菌から分離された細胞壁タンパク質であり、主にFc断片により哺乳動物IgGに結合し、極めて高い特異性と結合能力を有し、IgG抗体とIgG−Fc融合タンパク質の精製に広く用いられる。2種類の新規な融合タンパク質Fc−IL4DM−HM3−1は、いずれもIgG−Fc断片を有し、精製過程が完全に一致するので、1.6LでFc−IL4DM−HM3−1を一過性トランスフェクションして製造することを例とし、実験過程は以下の通りである。
クロマトグラフィー用カラムの情報は以下の通りである。
融合タンパク質の多種の腫瘍細胞に対する増殖阻害作用
MTT法により、実施例1で得られたインテグリン阻害剤である融合タンパク質の、黒色腫細胞B16F10、胃がん細胞MGC−803、肺がん細胞A549、肝がん細胞Hep−G2、乳がん細胞MDA−MB−231、結腸がん細胞HCT−116、ヒト脳膠腫U87、子宮頸がん細胞Helaを含む多種の腫瘍細胞に対する増殖活性阻害作用を測定する。
実験を5回独立して繰り返し、実験結果からmean±SDを算出し、統計T検定を行い、P<0.05の場合に有意差があり、P<0.01の場合に極めて顕著な有意差がある。実験結果を表1〜8に示す。
三次元transwell法によるヒト臍静脈内皮細胞に対する融合タンパク質一、タンパク質二の遊走阻害活性の測定
ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を、5%ウシ胎児血清及び1×ECGSを含有する内皮細胞培養液で、37℃、5%CO2インキュベータでコンフルエンスが90%以上になるように培養し、transwell法により内皮細胞に対する融合タンパク質一、タンパク質二の遊走阻害活性を測定し、内皮細胞HUVECは第2〜8世代のみを用い、具体的には、以下の通り操作する。
実験を3回独立して繰り返し、実験結果からmean±SDを算出し、統計T検定を行い、P<0.05の場合に有意差があり、P<0.01の場合に極めて顕著な有意差がある。実験結果を表9に示す。
マウス脾臓リンパ球の増殖に対する融合タンパク質一、タンパク質二の影響
無菌条件でマウス脾臓を取り出し、ブランク1640培地で3回洗浄し、5mLシリンジのピストンを用いて脾臓を押しつぶし、その後200メッシュの篩で濾過し、単細胞懸濁液を調製し、遠心分離(1000rpm×5min)した後、上澄みを捨て、Tris−NH4Clで赤血球を破砕し、氷水浴で4min静置し、遠心分離(1000rpm×5min)した後、上澄みを捨て、無菌PBSで細胞を2回洗浄する。最後に10%子牛血清のRPMI1640培養液(5mL)を加えて細胞を懸濁させ、細胞をカウントし、細胞濃度を5×106個/mLに調整した後、96ウェル培養プレートで培養する。
マウス腹腔マクロファージのIL−1β産生に対する融合タンパク質一、タンパク質二の影響
(1)IL−1βの産生:マウスに1mLのブロス培地(6%)澱粉を腹腔内注射し、3日後、無菌条件でマウス腹腔マクロファージを取り、1640培地で2回洗浄し、細胞濃度を2×106個/mLに調整した後、1mL/ウェルで24ウェル培養プレートに注入し、細胞インキュベータに置き3時間インキュベートし、30min毎に振とうすることで細胞を完全にプレートに接着させる。次いで、培養液で2回洗浄することでプレートに接着していない細胞を除去する。ブランク群はPBSを加え、陽性群は陽性薬デキサメタゾン(Dex)を加え、対照群は、濃度が低、中、高の3種類の融合タンパク質一と二であり、投与後、48時間継続的に培養した後、1000r/minで15min遠心分離する。上澄みをIL−1β活性測定サンプルとして回収する。
ラット綿球肉芽腫のような亜急性炎症に対する融合タンパク質一、タンパク質二の影響
分析天秤で脱脂綿40部を正確に秤量し、30mg/部で形状と大きさがほとんど同じ球形に丸める。使用のために、1.5kpaで30min高圧滅菌し、50℃でべーキングする。
マウス腹腔毛細血管透過性に対する融合タンパク質一、タンパク質二の影響
昆明マウス80匹を準備し、10匹/群で8群にランダムに分け、それぞれブランクモデル群、デキサメタゾン陽性群(10mg/kg)、高、中、低用量(128、32、8mg/kg)の融合タンパク質一及びタンパク質二を試験群とする。5日に1回注射投与し、ブランクモデル群に対して等体積の生理食塩水を5日間持続して投与し、正常に給餌する。投与後5日目に、5g/Lエバンスブルー生理食塩水溶液を10kg/mL尾静脈注射した後、すぐにHAc溶液(6mL/L)を10kg/mL腹腔内注射して炎症を誘発する。20min後に頸椎脱臼でマウスを死亡させ、5mLの生理食塩水を腹腔内注射し、腹部を2min軽く揉み、腹腔を切り、腹腔洗浄液を収集し、4000rpmで10min遠心分離し、1mLの上澄みを取り3mLの生理食塩水に加えて4mLの希釈液を得、紫外分光光度計により波長590 nmで希釈液の吸光度OD値を測定し、OD590 nm値によって色素滲出量を表し、マウス腹腔毛細血管透過性を観察する。実験結果を表13に示す。
キシレンによるマウスの耳腫脹に対する融合タンパク質一、タンパク質二の影響
昆明マウス80匹を取り、10匹/群で8群に分け番号付けする。生理食塩水群をブランク対照群、アスピリン群(200mg/kg)を陽性対照群、融合タンパク質一及びタンパク質二の高、中、低用量(128、32、8mg/kg)を試験群とする。マウスに対して5日に1回注射投与する。ブランク対照群に対して等体積の生理食塩水を投与する。投与後5日目に、マウスの右耳の両面にキシレン0.05mLを塗布して炎症を誘発し、左耳には塗布せずに正常耳とする。2時間後に頸椎脱臼でマウスを死亡させ、耳介に沿って両耳を切り、イヤーパンチで耳ピースを取り、重さを測り、以下の算式で腫脹度及び腫脹率を算出する。腫脹度=右耳ピースの重さ−左耳ピースの重さ、腫脹率=(腫脹度/左耳ピースの重さ)×100%。実験結果を表14に示す。
カラギーナン誘導ラット足趾腫脹急性炎症に対する融合タンパク質一、タンパク質二の影響
SDラット80匹を取り、10匹/群で8群にランダムに分け、それぞれブランクモデル群、デキサメタゾン陽性群(5mg/kg)、及び融合タンパク質一とタンパク質二の高、中、低用量群(128、32、8mg/kg)の試験群とする。5日に1回注射投与し、モデル群に等体積の生理食塩水を3日間持続して投与し、正常に給餌する。投与後3日目に、右後足の足裏に1%カラギーナン0.1mLを皮下注射することで炎症を誘導し、炎症誘導後の1時間、3時間、5時間、7時間にそれぞれ足の体積を測定する。以下の算式により足腫脹度を算出する。足腫脹度(mL)=炎症誘導後の足の体積−炎症誘導前の足の体積。こぼれた液体のミリリットル数を記録する(方法:右関節の突起箇所に対しボールペンで測定マークとして円を描き、後肢が装置外に露出し且つ円が描かれた箇所が液面と重なり合うように、各ラットの右後足を体積測定装置内に順次入れる。足が液体に入ると、液面が高くなり、こぼれた液体の体積をラットの右後足の体積として各ラットの右後足の正常体積を測定する)。実験結果を表15に示す。
アジュバントラット関節炎慢性炎症に対する融合タンパク質一、タンパク質二の影響
モデルの構築:
SPFレベルのSDラット80匹を取り、8群にランダムに分け、各群のラットをエーテルで浅麻酔させた後、ラットの左後のつま先に不活性化された結核菌を含む完全フロイントアジュバント0.1mLを皮下注射した後、左後足に原発性関節炎が迅速に生じ、モデル構築後の13日目程度に、右後足に続発性関節炎が発生し始める。ブランク対照群に等体積の生理食塩水を注射する。モデル構築後の13日目から投与する。ここで、メトトレキセート群に5日に1回、15日計4回注射投与する。融合タンパク質一及びタンパク質二の高、中、低の3種類の用量(128mg/kg、32mg/kg、8mg/kg)で5日に1回、15日注射投与する。
1.原発性及び続発性足趾腫脹度
足の体積測定方法により、各ラットの左右後足の足首関節に脂溶性標識ペンで標識し、動物の左右後足をそれぞれ体積測定装置に浸漬する。浸漬深さは、マーカーを限界とし、当該装置の目盛ピペットでの読取値を動物の左右後足の初期体積とする。
続発性足趾腫脹度(mL)=測定当日の右後足の体積−右後足の初期体積
2.臨床スコア
全身スコア:続発性炎症が発生した後、2日おきに全身スコアを行う。
前足:腫脹がない=0点、1つの前足に腫脹が発生する=1点、2つの前足に腫脹が発生する=2点、
耳:赤みと結節がない=0点、1つの耳に赤み又は結節が発生する=1点、2つの耳に赤みと結節が発生する=2点、
鼻:腫脹がない=0点、顕著な腫脹=1点、
尾:結節がない=0点、結節がある=1点。満点8点。
モデル構築前に各群のラットの初期体重を秤量し、モデル構築のd1日目から、2日おきに体重を測り、初期体重を引き、各群のラットの体重増加値とする。実験結果を表16に示す。
ヒト網膜血管内皮細胞(HRCEC)に対する融合タンパク質一、タンパク質二の増殖阻害作用
MTT法により、インテグリン阻害剤であるポリペプチドの、ヒト網膜血管内皮細胞に対する増殖活性阻害を測定する。HRCEC細胞を37℃、5%CO2インキュベータ内で密度90%以上まで培養し、トリプシンで消化して収集し、培養液で細胞を再懸濁させ、顕微鏡下でカウントする。細胞濃度を3.0×104個/mLに調整した後、細胞懸濁液を100μL/ウェルで96ウェルプレートに接種し、37℃、5%CO2インキュベータ内で一晩培養する。ポリペプチドI、ポリペプチドII、ポリペプチドIII、Avastinを培養液でそれぞれの所定濃度に希釈する。細胞が完全にプレートに接着した後、各希釈液をそれぞれ96ウェルプレート(100μL/ウェル)に加える。インテグリン阻害剤であるポリペプチドを加えたものを投与群、Avastinを加えたものを陽性対照群、いずれの薬物も加えなかった培養液をブランク対照群とし、37℃、5%CO2インキュベータで48時間インキュベートする。96ウェルプレートの各ウェルに5mg/mLのMTTを20μL加え、引き続き4時間培養する。培地を吸引により除去した後、各ウェルに100μLのDMSOを加えて溶解する。マイクロプレートリーダーを用いて測定波長570nm、参照波長630nmで吸光度値を測定し、以下の算式により増殖阻害率(proliferation inhibition,PI)を算出する。
実験を5回独立して繰り返し、実験結果からmean±SDを算出し、統計T検定を行い、P<0.05の場合に有意差があり、P<0.01の場合に極めて顕著な有意差があった。実験結果を表17に示す。
鶏胚漿尿膜(CAM)による融合タンパク質一、タンパク質二のインビボでの血管新生に対する阻害活性作用の分析
本研究では、CAM試験により融合タンパク質一、タンパク質二のインビボでの血管新生に対する阻害活性を検討する。研究によると、鶏胚が成長する8日目から11日目まで、コラーゲンタンパク質の生合成速度が最大に達し、このときが血管新生の最も盛んな段階となり、体内免疫システムはまだ完全に構築されていないので、8日目に成長する鶏胚を選択して投与し始める。薬物担持紙上のポリペプチドは、鶏胚漿尿膜に一定の拡散範囲制限があることを考慮すると、試験では、紙の縁から半径5mmの範囲での新生血管数のみをカウントする。以下の通り操作する。
マウス角膜新生血管に対する融合タンパク質一、タンパク質二の作用
(1)BALB/cマウスアルカリ火傷誘導角膜新生血管モデルの構築:
健康BALB/cマウス15匹(雄性、体重20〜25g)を、細隙灯顕微鏡下で両眼前眼部及び付属器官を検査し、眼病変を排除する。アルカリ火傷のモデル構築前日に0.3%オフロキサシン点眼薬を1日2回投与して点眼する。マウスを1.8%Avertinを腹腔内注射することで麻酔させた後、ピンセットで直径2mmの単層ろ紙を挟み、1mol/L水酸化ナトリウム溶液に浸漬し、飽和状態になった後、余分な液体を取り除き、ろ紙をBALB/cマウス角膜中央に40S放置し、ろ紙を捨て、すぐに15mLのPBSで火傷領域及び結膜嚢を1min十分に洗い流す。綿棒で余分な水分を拭き取り、上皮下基質層及び角膜縁に損傷を与えないように、手術用顕微鏡下でブレードで角膜縁に平行になるように角膜上皮を回転して剥離し、手術終了後に感染を予防するために結膜嚢にエリスロマイシン眼軟膏を塗布する。
マウス15匹を5匹/群でランダムに分け、融合タンパク質一群、融合タンパク質二群及び対照群と記し、アルカリ火傷を加えた後、それぞれ64μgの融合タンパク質一、64μgの融合タンパク質二及び生理食塩水を硝子体注射により7日1回投与する。アルカリ火傷を加えた後の1、7、14日目に細隙灯顕微鏡下で各群角膜の炎症反応及び新生血管の状況を観察する。アルカリ火傷を加えた後の14日目に前眼部撮影付きの細隙灯顕微鏡下で撮影し各群角膜の新生血管形成状況を記録した後、頸椎脱臼で全てのマウスを死亡させ、眼球を摘出し、生理食塩水で洗い流して血痕を除去し、4%パラホルムアルデヒドで1.5時間固定し、30%スクロースを含むPBSに入れて終夜脱水した後、OCT凍結組織切片作製用包埋剤で包埋し、−80℃の冷蔵庫中に保存し、8μmの凍結切片を作製し、免疫組織化学法によりCD31の発現を検出する。
微小血管密度(Microvessel density,MVD)は、血管形成を評価する指標である。抗CD31抗体免疫組織化学法により血管内皮細胞を標識し、単位面積当たりの微小血管数をカウントすることにより、新生血管形成の程度を評価する。微小血管の統計は、以下のように行われる。顕微鏡下で角膜組織における隣接する組織の境界が明確で、琥珀色若しくは褐色に染色された内皮細胞又は細胞集団を観察し新生血管としてカウントする。10×20の顕微鏡下で切片全体における新生血管の数をカウントし、角膜組織切片を撮影した後、画像処理ソフトウェアImage Jにより角膜組織切片全体の面積を算出し、切片全体における新生血管の密度を求める。結果を表19に示す。
イエウサギの虹彩新生血管に対する融合タンパク質一、タンパク質二の作用
577nmのアルゴンイオンレーザーによりイエウサギの網膜の主分枝静脈を凝固・閉塞させ、蛍光眼底血管造影(FFA)により静脈が成功裏に閉塞されたことを確認する。5〜12日後に、蛍光虹彩血管造影(IFA)により、虹彩血管は、正常対照群に比べてフルオレセイン漏出が顕著であり、これは虹彩新生血管化動物モデル(NVI)の形成を実証している。
ウサギ眼脈絡膜血流に対する融合タンパク質一、タンパク質二の影響
体重が2.5〜3.0キログラムであるニュージーランドウサギを取り、3群にランダムに分け、それぞれ対照群、融合タンパク質一群、タンパク質二群と標識する。各群のウサギに対して35mg/kgのキシラジンで混合した後筋肉内麻酔させ、その後、1時間ごとに初期量の半分で連続して筋肉内注射で麻酔させる。左眼の眼圧を40mmHgに上げ、当該圧力下で眼血流を正常値の1/3に低下させることができる。ミクロスフェアを注射するために(眼血流量を算出する)右頸動脈を経由して左心室まで挿管し、採血のために股動脈に挿管する。各群に硝子体注射によりそれぞれ生理食塩水を投与し、128μgの融合タンパク質一、128μgの融合タンパク質二を投与した後0、30、60分にカラーミクロスフェア技術により高眼圧のウサギ眼の眼血流量を測定する。各時点で、0.2mL(約200万)のミクロスフェアを注射し、ミクロスフェアを注射した直後股動脈採血を60秒行い、ヘパリン化抗凝固管に放置し、採血量を記録する。最後に採血した後、100mg/kgのフェノバルビタールを静脈注射して動物を死亡させ、眼球を摘出し、網膜、脈絡膜、虹彩及び毛様体を分離し、組織重量を記録する。各時点で以下の算式により組織の血流を算出する。Qm=(Cm×Qr)/Cr。ここで、Qmは、単位がμL/min/mgである組織の血流を表し、Cmは、1ミリグラム当たりの組織のミクロスフェア数であり、Qrは、単位がμL/minである血流量であり、Crは、参照とする血液のミクロスフェア数である。実験結果を表20に示す。
OIRマウスにおける網膜血管に対する融合タンパク質一、タンパク質二の影響
OIRモデルの構築:C57/B16マウス出生後の7〜12日目に、マウス幼畜とその親マウスを75%の高酸素雰囲気に暴露させることにより、その中央網膜における毛細血管をすぐに消失させることができる。12日目に室内空気に戻したところ、高酸素雰囲気に暴露された網膜血管がすぐに消失し、広範な異常な血管新生の形成を引き起こし、網膜の中央部分は、長時間かなりの程度無血管状態のままである。血管が完全に消失した後、13日目に融合タンパク質(投与群、融合タンパク質一、タンパク質二の用量がいずれも64μgである)又は生理食塩水(陰性群)を硝子体注射により投与し、17日目に網膜血管を評価する(閉合していない血管に標識を付けるために、テキサスレッドで標識したトマトレクチン50mLを左心室に注射し5 min循環させる)。実験結果を表21に示す。
未熟児網膜症ラットモデルの新生血管に対する融合タンパク質一、タンパク質二の作用
変動酸素誘導動物モデルを取り、同じ日に自然分娩された新生ラット(12時間内)を酸素供給モデル群、酸素供給治療群、正常対照群の3群にランダムに分ける。酸素供給モデルをさらに3つのサブモデル群に分け、治療群と共にアクリルガラス製の半閉鎖酸素室に置き、室内に医療用酸素を導入し、酸素計により濃度を80%±2%に調整し、24時間後に酸素室内に窒素を導入することで酸素濃度を10%±2%に迅速に調整して24時間維持する。これを繰り返して、酸素室内の酸素濃度が24時間毎に80%と10%とを交互するように保持し、7日後に、空気雰囲気で飼育する。毎日酸素濃度を8回モニタリングし、酸素室内の温度を23℃±2℃に制御し、パット交換、食料追加、水交換、親マウス交換を1回行う。正常対照群を動物飼育環境に置く。モデル群は、対照群に比べて、網膜ホールマウントのADP酵素染色による血管変化が顕著であり、網膜内膜を通過して硝子体に入った血管内皮細胞核の数が多くなり、差が統計的に有意である場合に、モデル構築が成功する。
糖尿病性網膜症ラットモデルの新生血管に対する融合タンパク質一、タンパク質二の作用
実験では糖尿病ラットをストレプトゾシンSTZでモデルを構築する。STZを0.1mol/L、pH4.5のクエン酸緩衝液に溶解して2%溶液に配合する。全ての実験では、Wistarラットに注射する前に12時間断食させ、各ラットを65mg/kgの用量で2% STZ溶液を腹腔内注射する。注射した後、単独で籠で飼育し、48時間後尿糖と血糖を測定する。尿糖+++以上、血糖16.7mmol/L以上をモデル構築が成功する標準とする。血糖、尿糖、尿量の測定及び網膜VEGF免疫組織化学的測定により、糖尿病性網膜症モデル構築が成功する。
Claims (13)
- 分子中に血管阻害剤ポリペプチドHM−3配列、インターロイキン4配列及び抗体IgG1のFc配列を含むことを特徴とする融合タンパク質。
- 血管阻害剤ポリペプチドHM−3配列、インターロイキン4配列及び抗体IgG1のFc配列間がフレキシブルリンカーにより接続されることを特徴とする請求項1に記載の融合タンパク質。
- アミノ酸配列がSEQ ID NO.1であることを特徴とする請求項2に記載の融合タンパク質。
- 血管阻害剤ポリペプチドHM−3配列、インターロイキン4配列及び抗体IgG1のFc配列間がリジッドリンカーにより接続されることを特徴とする請求項1に記載の融合タンパク質。
- アミノ酸配列がSEQ ID NO.2であることを特徴とする請求項4に記載の融合タンパク質。
- 配列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2をコードする核酸配列は、それぞれSEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4であることを特徴とする請求項3又は5に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
- 請求項1に記載の融合タンパク質の、炎症治療薬、抗腫瘍薬及び眼科疾患の治療薬の製造における使用。
- 前記炎症は、関節リウマチ、骨関節炎、痛風性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、感染性関節炎、外傷性関節炎、全身性エリテマトーデス及び乾癬を含むことを特徴とする請求項7に記載の融合タンパク質の、炎症治療薬、抗腫瘍薬及び眼科疾患の治療薬の製造における使用。
- 前記腫瘍は、胃がん、肺がん、肝がん、乳がん、結腸がん、膠腫、黒色腫及び子宮頸がん、並びにヒトの頭頚部、脳、甲状腺、食道、膵臓、肺臓、肝臓、胃、乳腺、腎臓、胆嚢、結腸若しくは直腸、卵巣、子宮頚、子宮、前立腺、膀胱、精巣に由来する原発性がん又は続発がん、黒色腫及び肉腫を含むことを特徴とする請求項7に記載の融合タンパク質の、炎症治療薬、抗腫瘍薬及び眼科疾患の治療薬の製造における使用。
- 前記眼科疾患は、虹彩新生血管性眼疾患、脈絡膜新生血管性眼疾患、網膜新生血管性眼疾患又は角膜新生血管性眼疾患を含むことを特徴とする請求項7に記載の融合タンパク質の、炎症治療薬、抗腫瘍薬及び眼科疾患の治療薬の製造における使用。
- 前記虹彩新生血管性眼疾患は、新生血管性緑内障、糖尿病性網膜症又は網膜中心静脈閉塞症による虹彩新生血管性眼疾患を含み、前記脈絡膜新生血管性眼疾患は、加齢性黄斑変性、中心性滲出性脈絡網膜症、眼ヒストプラズマ症候群又は匍行性脈絡膜症による脈絡膜新生血管性眼疾患を含み、前記網膜新生血管性眼疾患は、糖尿病、腫瘍、網膜剥離、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈周囲炎、全身性エリテマトーデス、Eales病又はCoat病に関連する網膜新生血管性眼疾患を含み、前記角膜新生血管性眼疾患は、コンタクトレンズによる角膜新生血管性疾患、及びアルカリや他の化学物質火傷、角膜手術、細菌感染、クラミジア感染、ウイルス感染又は原虫感染による角膜新生血管性眼疾患を含むことを特徴とする請求項10に記載の融合タンパク質の、炎症治療薬、抗腫瘍薬及び眼科疾患の治療薬の製造における使用。
- 薬物の剤形は、カプセル、錠剤、丸薬、注射剤、鼻スプレー剤又はエアロゾル剤であることを特徴とする請求項7〜11の何れか1項に記載の融合タンパク質の、炎症治療薬、抗腫瘍薬及び眼科疾患の治療薬の製造における使用。
- 真核細胞による発現の方法及び精製方法を用いることを特徴とする請求項1に記載の融合タンパク質の製造方法。
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