HU204889B - Process for producing erythropoietin - Google Patents
Process for producing erythropoietin Download PDFInfo
- Publication number
- HU204889B HU204889B HU852404A HU240485A HU204889B HU 204889 B HU204889 B HU 204889B HU 852404 A HU852404 A HU 852404A HU 240485 A HU240485 A HU 240485A HU 204889 B HU204889 B HU 204889B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- dna
- erythropoietin
- polypeptide
- epo
- cells
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A jelen találmány tárgyát általában a genetikai anyagok manipulációi, részletesebben azok a rekombináns folyamatok képezik, amelyek lehetővé teszik az olyan polipeptidek előállítását, amelyek a természetben előforduló eritropoietin primer szerkezeti konformációjá- 5 nak és/vagy egy vagy több biológiai tulajdonságának részével vagy egészével rendelkeznek.
A) A genetikai anyagok manipulációi A genetikai anyagokat szélesebben úgy lehet meg- 10 határozni, mint azokat a kémiai anyagokat, amelyek programozzák és vezetik a sejtek és vírusok alkotórészeinek előállítását és irányítják a sejtek és vírusok válaszait. Egy hosszú láncú polimer vegyület, amely mint dezoxiribonukleinsav (DNS) ismeretes, tártál- 15 mázzá az összes élő sejt és vírus genetikai anyagát, kivéve néhány vírusét, amelyeket ribonukleinsavak (RNS) programoznak. A DNS polimer ismétlődő egységeit négy különböző nukleotid képezi, amelyek mindegyikében vagy egy purin (adenin vagy guanin) 20 vagy egy pirimidin (timin vagy citozin) dezoxiribóz cukorhoz van kötve, amelyhez viszont foszfátcsoport csatlakozik. A nukleotidok összekapcsolódása lineáris polimer formájában az egyik nukleotid 5’ foszfátjának egyesülése révén valósul meg a másik nukleotid 3’ 25 hidroxilcsoportjához. A funkcionális DNS a nukleotídok (amelyek dezoxioligonukleoíidokként ismertek) egyedi szálainak stabil kettős szálú összekapcsolódásai formájában létezik, amely összekapcsolódás a purin- és pirimidinbázisok közti hidrogénkötések révén megy 30 végbe [azaz „komplementer” összekapcsolódások alakulnak ki vagy az adenin (A) és timin (T), vagy a guanin (G) és citozin (C) között]. Hagyomány szerint a nukleotidokra az azokat alkotó purin- vagy pirimidinbázisok nevei alapján utalunk, és a nukleotidok komp- 35 Iementer összekapcsolódásaira a kettős szálú DNS-ben (pl. A-T és G-C) mint „bázispártokra utalunk. A ribonukleinsav olyan polinukleotid, amely adenint, guanint, citozint és - timin helyett - uracilt tartalmaz ribózhoz és egy foszfátcsoporthoz kötve. 40
Röviden elmondva a DNS programozó funkcióját általában egy olyan folyamat útján végzi el, ahol speciális DNS-nukleotidszekvenciákat (géneket) „átírnak” j viszonylag kevéssé stabil hírvivő (messenger) RNS ί (mRNS) polimerekbe. Az mRNS viszont mintaként 45 i (,,templát”-ként) szolgál a szerkezeti, szabályozó és j katalitikus fehérjék képzéséhez aminosavakból. Ez az 1 mRNS „lefordító” (transzlációs) folyamat magában i foglalja a kis RNS-szálak (tRNS) működését, amelyek e szállítják és sorba állítják az egyes aminosavakat az 50 í mRNS-szál mentén, hogy lehetővé tegyék polipeptidek 1 képződését a megfelelő aminosav-szekvenciában. Az I mRNS „üzenet”, amely a DNS-ből származik és amely r a tRNS szolgáltatásának és a húsz aminosav közül t bármelyik megadott aminosav irányításának alapjait 55 r nyújtja, tríplett „kodon”-ok formájában van. Ez három s nukleotidbázis egymást követő csoportjait jelenti. Bi- „ zonyos értelemben a fehérje képződése a gén nukleo- b tidszekvenciája által nyújtott programozott genetikai li üzenet „kifejeződés”-ének utolsó formája. 60 π
A „promotor” DNS-szekvenciák általában „megelőznek” egy gént egy DNS-polimerben és az niRNS-sé való átírás kiindulási helyét nyújtják. A „szabályozó” (regulátor) DNS-szekvenciák, amelyek általában szintén „fel5 felé” (azaz megelőzően) helyezkednek el egy génhez viszonyítva egy adott DNS-polimerben, olyan fehérjékhez kapcsolódnak, amelyek meghatározzák az átírási kiindulások gyakoriságát (vagy sebességét).
Együttesen „promotoi/regulátor”-nak, vagy „kont0 roll” DNS-szekvenciáknak hívjuk ezeket a szekvenciákat, amelyek megelőzik a kiválasztott gént (vagy gének sorozatát) egy funkcionális DNS-polimerben; ezek a szekvenciák együttműködnek, hogy meghatározzák, vajon egy gén átírása és az ebből eredő kifejeződés 5 megtörténik-e.
Azokat a DNS-szekvenciákat, amelyek „követnek” egy gént egy DNS-polimerben és egy jelet (szignál) szolgáltatnak az átírás befejezéséhez az mRNS-hez, átírási (transzkripciós) „terminátor” szekvenciáknak 3 nevezzük.
A mikrobiológiai eljárások célpontjai az elmúlt évtizedben az iparilag és gyógyászatílag fontos anyagok gyártására végzett kísérletek voltak olyan organizmusokat használva, amelyek vagy nem rendelkeznek ere) detileg a kívánt terméket illetőleg genetikailag kódolt információkkal, beleértve DNS-eiket is, vagy (emlős sejtek tenyésztése esetében) szokásos módon nem fejeznek ki kromoszomális géneket méltányolható szinten. Vegyünk egyszerűen egy gént, amely egy kívánt 1 polipeptidtermék szerkezetére fajlagos, ezt vagy izoláljuk egy „donor” organizmusból, vagy vegyi úton szintetizáljuk, majd stabilan bevezetjük egy másik organizmusba, amely előnyösen egy önreplikáló egysejtű organizmus, mint pl. baktérium, élesztő vagy emlős sejttenyészet. Amikor ezt megtettük, a gén kifejeződésére szolgáló meglevő mechanizmus a „transzformált” vagy „átfertőzött” mikrobiális gazdasejtben úgy működik, hogy megalkotja a kívánt terméket, a külső DNS-t mintaként (templátként) alkalmazva az mRNS átírásához, amely azután átfordítódik aminosavgyökök folyamatos szekvenciájává.
A szakterület gazdag a szabadalmakban és irodalmi publikációkban a „rekombináns DNS” módszerekkel kapcsolatban az izolálást, szintézist, tisztítást és a genetikai anyagok sokszorozódását illetően a kiválasztott gazdaszervezet transzformációjában való alkalmazáshoz. Cohen és munkatársainak 4 237 224 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás egysejtű gazdaszervezetek transzformációjával foglalkozik „hibrid” vírus vagy cirkuláris plazmid DNS-ekkel, amelyek magukban foglalják a kiválasztott exogén DNS-szekvenciákat. Cohen és munkatársai szabadalmának eljárási lépései először magukban foglalják egy transzformációs vektor előállítását vírus vagy cirkuláris plazmid DNS enzimes hasításával lineáris DNSszálakat képezve. A kiválasztott idegen („exogén” vagy „heterolőg”) DNS-szálakat, amelyek általában magukban foglalják a kívánt terméket kódoló szekvenciákat, lineáris formában állítják elő hasonló enzimek alkalmazásával. Az idegen DNS-sel rendelkező lineáis vírus
HU 204 889 Β vagy plazmád DNS-t inkubálják helyreállítási folyamatot végrehajtani képes ligáló enzimekkel és „hibrid” vektorokat képeznek, amelyek magukban foglalják a vírus vagy cirkuláris DNS-plazmidba „betoldott”, kiválasztott exogén DNS-szegmenst.
Összeférhető egysejtű gazdaszervezetek transzformálása a hibrid vektorral az exogén DNS sokszorozott másolatait eredményezi a gazdasejt-populációban. Néhány esetben a kívánt eredmény egyszeűen az idegen DNS sokszorozódása és a kinyert „tennék” a DNS. A transzformálás célja gyakrabban az exogén DNS kifejeződése a gazdasejt által, az idegen DNS által kódolt, kereskedelmileg fontos fehérje- vagy polipeptidffagmensek izolálható mennyiségei nagyléptékű szintézisének formájában. Lásd pl. a 4 264 731 (Shine), 4 273 875 (Manis), 4 293 652 (Cohen) lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat és a 093 619 bejelentési számú 1983. november 9-én közzétett európai szabadalmi bejelentést.
A DNS-vektorokba való betoldáshoz való fajlagos DNS-szekvenciák kifejlesztését nagyon sokféle technikával lehet végrehajtani, nagymértékben függően a „donor idegenség”-ének mértékétől az elképzelt gazdaszervezethez és a gazdaszervezetben kifejezendő polipeptid méretétől. A túlegyszerűsítés kockázatával megállapíthatjuk, hogy három alternatív elvi módszert alkalmazhatunk: (1) a kettős szálú DNS-szekvencia „izolálásba a donor genom DNS-éből; (2) egy szóban forgó polipeptidhez szolgáló kódot nyújtó DNS-szekvencia vegyi szintézise; és (3) egy kettős szálú DNSszekvencia „in vitro” szintézise a donorsejtből izolált mRNS-enzimes „reverz átírás”-ával. A legutolsónak említett módszereket, amelyek magukban foglalják az mRNS DNS „komplementer”-ének képződését, általában „cDNS” módszereknek nevezzük.
A DNS-szekvenciák előállításához gyakran a módszerek választéka áll rendelkezésre, ha a kívánt polipeptidtermék aminosavgyökeinek teljes szekvenciája ismert. A jelen bejelentéssel összefüggő, közös bejelentővel rendelkező 483 451 bejelentési sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (Alton és munkatársai) (amely 1983. április 15-én lett benyújtva, és amely megfelel az 1983. november 24-én WO 83/04053 közzétételi számon közzétett PCT US 83/00605 bejelentési számú bejelentésnek) pl. kiváló eszközt nyújt ilyen nagyon kívánatos eredmények megvalósításához, úgymint: a génekben általában jelen lévő, különböző kodonok jelenlétét biztosítja, amely kodonok magas szinten fejeződnek ki a kifejeződéshez kiválasztott gazdaszervezetben (pl. élesztő vagy E.coli „kedvezményes” kodonokat szolgáltat); elkerüli a le nem fordított „intron” szekvenciák jelenlétét (amelyek az emlős genom DNS-szekvenciákban és ezek mRNS átirataiban vannak jelen), amelyeket a prokarióta gazdasejtek nem könnyen dolgoznak fel; elkerüli a nemkívánatos „vezető” polipeptidszekvenciák kifejeződését, amelyeket genom DNS- és cDNS-szekvenciák általában kódolnak, de gyakran nem könnyen hasadnak le a szóban forgó polipeptidről a baktérium- vagy élesztőgazdasejtek révén; eszközt nyújt a DNS könnyű beiktatásához kellemes kifejeződő vektorokba, amelyek a kívánt promotor-/regulátor- és terminátor-szekvenciákkal vannak összekapcsolva; és eszközt nyújt a kívánt polipeptidek polipeptidfragmenseit és -analógjait kódoló gének könnyű megalkotásához.
Amikor a kívánt polipeptid aminosavgyökeinek teljes szekvenciája nem ismeretes, a DNS-szekvenciák közvetlen előállítása nem lehetséges, és a polipeptidet kódoló DNS-szekvenciák izolálása cDNS-módszerrel lesz a kiválasztott módszer, a fentiek szerint bemutatott mikrobiális kifejeződés magas szintjét szolgáltatni képes kifejeződő vektorok összeállításának könnyűségéhez viszonyított lehetséges hátrányai ellenére. A szóban forgó cDNS-szekvenciák izolálásához szolgáló standard eljárások közül a gének magas szintű kifejeződéséért felelős sejtekként kiválasztott donorsejtekben bőségesen előforduló mRNS reverz átírásából származó, plazmid eredetű cDNS „könyvtár” készítése is megtalálható (pl. a hipofízis sejtekből származó cDNS-ek könyvtára, amely viszonylag nagy mennyiségben fejez ki növekedési hormontermékeket). Ahol a polipeptidek aminosav-szekvenciájának jelentős részletei ismertek, jelzett, egyszálú DNS-vizsgáló szekvenciákat, amelyek a „cél” cDNS-ben feltehetően jelen levő szekvenciát megduplázzák, alkalmazhatunk DNS/DNS hibridizálási folyamatban, olyan cDNS-klónozott másolatokon hajtva végre, amelyek egyszálú formában denaturálódnak [lásd általában a szakterület közleményeit és tárgyalásait, pl. amelyet Wissman és munkatársai nyújtanak a 4 394 443 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, vagy amelyeket a hosszú oligonukleotid hibridizáló vizsgálóminták alkalmazásáról az elmúlt időkben bemutattak, mint Wallace és munkatársai: Nuc. Acids Rés., 6, 3543-3557 (1979), Reyes és munkatársai: P.N.A.S. (USA), 79, 3270-3274 (1982) és Jaye és munkatársai: Nuc. Acids Rés. 11,2325-2335 (1983). A DNS/DNS hibridizálási eljárásokra vonatkozóan diagnózis kivitelezésére lásd még: 4 358 535 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Falkow); az egyszálú polinukleotid-vizsgáló mintákon fénykibocsátó jelzésekre vonatkozóan lásd: 0 070 685 és 0 070 687 számon közzétett európai szabadalmi bejelentéseket; a telep- és plakkhibridizálási technikákkal kapcsolatban lásd: Davis és munkatársai: „A Manual fór Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics (A genetikai mérnökség kézikönyve, Alkalmazott baktériumgenetika), Cold Spring Harbor, New York, 1980, 55-58 és 174-176. oldalak; a DNS és RNS átviteléhez és hibridizálásához útmutatásokat nyújtó kézikönyv a New England Nuclear (Boston, Massachussets) kiadványa, a „Gene Screen” Hybridization Transfer Membrán Materials [Génátvizsgáló hibridizáló transzfermembrán anyagok (NEF-972 számú katalógus)].
A fontosabb legutóbbi fejlemények között van a rekombináns kiónok kiszűréséhez szolgáló hibridizálási folyamatokban a jelzett kevert szintetikus oligonukleotid-vizsgáló minták alkalmazása, amelyek mindegyike potenciálisan egy specifikus DNS-szekvencia
HU 204889 Β teljes komplementere a hibridizálási mintában, beleértve az egyszálú DNS-ek és RNS-ek heterogén keverékét Ezekről az eljárásokról tudjuk, hogy különösen hasznosak az olyan forrásokból származó cDNS-klőnok kimutatásában, amelyek rendkívül kis mennyiségű mRNS-szekvenciát szolgáltatnak a szóban forgó polipeptidhez. Rövidre fogva, nem fajlagos kötés elkerülése felé irányuló szigorú hibridizálási feltételek alkalmazása lehetővé teheti pl. egy fajlagos cDNS-klón autoradiográfiás láthatóvá tételét a cél DNS hibridizálása esetén ahhoz az egyedi vizsgálőmintához a keveréken belül, amely ennek teljes komplementere. Lásd általában: Wallace és munkatársai: Nuc. Acids Rés. 9, 879-897 (1981); Suggs és munkatársai: P.N.A.S. (USA), 78, 6613-6617 (1981); Choo és munkatársai: Natúré, 299,178-180 (1982); Kurachi és munkatársai: P.N.A.S. (USA), 79, 6461-6464 (1982); Ohkubo és munkatársai: P.N.A.S. (USA), 80, 2196-2200 (1983); és Komblihtt és munkatársai: PN.A.S. (USA), 80, 3218-3222 (1983). Általában Wallace kevert vizsgáló- í minta eljárását (1981, lásd fentebb) fejlesztették tovább különböző szerzők addig a pontig, ahol megbízható eredményeket nyertek a leírások szerint egy cDNSklőnizolálásban, egyformán változó DNS-szekvenciák ' 16 bázishosszúságú (16-mer) oligonukleotidjainak 32 2 tagú kevert „készlet”-ét egy egyedi (11 bázishosszúságú) ll-merrel együtt alkalmazva, így a szóban forgó cDNS jelenlétének kéthelyes „pozitív” igazolását hajtották végre.
A genom DNS-izolátumok alkalmazása a Iegke- 3 vésbé általános módszer a fentebb említett három módszerközül a fajlagos DNS-szekvenciák kifejlesztésére a rekombináns eljárásokban való alkalmazáshoz. Ez különösen igaz az emlős polipeptidek mikrobiális kifejeződésének biztosítására irányuló rekom- 3; bináns eljárások területén, ez elvileg az emlős genom DNS komplex voltának tulajdonítható. így, miközben megbízható folyamatok léteznek ember és más emlős faj eredetű genom DNS-fág eredetű „könyvtársának kifejlesztéséhez [lásd pl.: Lawn és munkatársai: Cell, 4( 75, 1157-1174 (1978), amely az általában „Maniatis könyvtár”-nak nevezett humán genomkönyvtár létrehozására szolgáló eljárásokra vonatkozik; Kam és munkatársai: P.N.A.S. (USA) 77,5172-5176 (1980), amely váltakozó restrikciós endonukleáz fragmentá- 4£ ciós eljáráson alapuló humán genomkönyvtárra vonatkozik; és Blattner és munkatársai: Science, 196, ' 161-169 (1977), amely egy szarvasmarha genomköny vtár megalkotását írja le], viszonylag kevés sikeres kísérlet van hibridizálási eljárások alkalmazásánál 50 genom DNS izolálásában az aminosav- vagy DNSszekvencia kiterjedt előzetes ismerete hiányában. Mint egyik példa erre, Fíddes és munkatársai [J. Moh and App. Genetics, 1, 3-18 (1981)] számolt be az emberi hipofízis glükoprotein alfa-alegységét kódoló 55 gén sikeres izolálásáról a „Maniatis könyvtáriból az alfa-alegységhez szolgáló, előzetesen izolált cDNSszekvencia teljes 621 bázispárfragmensét is tartalmazó „teljes hosszúságú” vízsgálóminta alkalmazása révén. 60
Egy másik példaként Das és munkatársai [P.N.A.S.
(USA), 80, 1531-1535 (1983)] számolnak be humán
HLA-DR-hez szolgáló humán genomklónok izolálásáról egy 175 bázispárból álló szintetikus oligonukleoti5 dót alkalmazva.
Végül Anderson és munkatársai számoltak be
RN.A.S. (USA), 80, 6838-6842 (1983) szarvasmarha hasnyálmirigy tripszininhibitoihoz (ΒΡΊΪ) szolgáló genomklón izolálásáról 86 bázíspár hosszúságú és a ΒΡΊΙ ismert aminosav-szekvenciája szerint megalkotott egyedi vizsgálómintát alkalmazva. A szerzők leírják a cDNSkönyvtár szintéziséhez alkalmas mRNS izolálásához tartozó szegényes távlatok meghatározását, amely szerény távlatok a kiindulásnál célba vett fultőmirigy- és tűdőszö15 vetforrásokban levő alacsony mRNS-szintnek tulajdoníthatók, majd előadják a siker távlatait jelzett vizsgálóminíák keverékét alkalmazva egy genomkönyvtár átvizsgálásában, a következőket állapítva meg: „Általánosabban, kevert szekvendájú oligodezoxinukleotíd-vizsgálő min?0 tákat alkalmazunk ismeretlen szekvendájú fehérjegének izolálására cDNS-könyvtárból. Az ilyen vizsgálóminták tipikusan 8-32 oligonukleotid keverékei, amelyek 14-17 nukleotid hosszúságúak, és amelyek az aminosav-szekvencia egy kis területéhez (5-6 gyök) szolgáló minden !5 lehetséges kodonkombinációt képviselnek. Szigorú hibridizálási köriilményekközött, amely kedvező a nem korrekt módon bázispárba rendeződött vizsgálóminták ellen, ezek a keverékek képesek fajlagos génszekvencíák meghatározására kis és közepes komplexitású klónkőnyvtá0 rakban. Rövidségük és heterogén voltuk miatt azonban a kevert vizsgálóminták gyakran nélkülözik a szekvenciák vizsgálatához szükséges fajlagosságot akár komplexként, akár emlős genomként. Έζ egy ilyen módszert használhatatlanná tesz az emlős fehérjegének izolálásához, amikor a megfelelő mRNS-ek nem állnak rendelkezésre” (az idézetben kihagyások vannak).
így továbbra is fennáll az igény a szakterületen javított módszerekre a cDNS-klónok gyors és hatásos izolálásának végrehajtására olyan esetekben, amikor a kő1 dőlt polipeptid aminosav-szekvenciájáról keveset tudunk, és amikor mRNS „dúsított” szöveti forrásai nem könnyen állnak rendelkezésre a cDNS-könyvtárak megalkotásához való használatra. Az ilyen javított módszerek különösen hasznosak lennének, ha ezeket > emlős genomklónok izolálásához lehetne alkalmazni, ahol gyér információk állnak csak rendelkezésre a keresett gén által kódolt polipeptid aminosav-szekvenciáját illetően.
B) Eritropoietin, a szóban forgó polipeptid
Az eritropoiézis, a vörősvérsejtek termelése, folyamatosan történik az emberi élet egészén át a sejtpusztulás pótlására. Az eritropoiézis nagyon pontosan szabályozott fiziológiai mechanizmus, amely lehetővé teszi, hogy elegendő számú vörösvérsejt álljon rendelkezésre a vérben a szövetek megfelelő oxigénellátásához, de ne legyen belőlük olyan sok, hogy a sejteket gátolják a cirkulálásban. A vörősvérsejtek képződése a csontvelőben történik, az eritropoietin hormon szabályozása alatt.
HU 204889 Β
Az eritropoietin, amely mintegy 34 000 dalton molekulatömegű savas glükoprotein, három formában (α, β és asialo) fordulhat elő. Az a és β formák kissé különböznek egymástól a szénhidrát-komponensekben, de azonos potenciállal, biológiai aktivitással és molekulatömeggel bírnak. Az asialo forma egy a vagy β forma, amelyről egy terminális szénhidrát (sziálsav) el van távolítva. Az eritropoietin igen kis koncentrációban van jelen a plazmában, amikor a test egészséges állapotban van, ahol is a szövetek elegendő oxigénellátást kapnak az eritrociták meglevő mennyiségétől. Ez a normálisan kis koncentráció elég, hogy stimulálja azoknak a vörösvérsejteknek a helyettesítését, amelyek az idő előrehaladtával normálisan elvesznek.
Az eritropoietin mennyisége a cirkulálásban növekszik a hipoxia körülményei között, amikor a vörösvérsejtek által végzett oxigénszállítás csökken. A hipoxiát okozhatja a vér nagy mennyiségének elvesztése vérzéssel, a vörösvérsejtek elroncsolódása sugárzásnak való túlzott kitevés révén, a nagy magasságnak vagy hosszantartó eszméletvesztésnek tulajdonítható oxigénbevitel csökkenés. A hipoxiás stressznek kitett szövetekre adott válaszként az eritropoietin növeli a vörösvérsejt termelést az elsődleges prekurzor sejtek átalakulását stimulálva pro- eritroblasztokká a csontvelőben, amelyek ezt követően megérnek, hemoglobint szintetizálnak, és kibocsátódnak a véráramba vörösvérsejtekként. Amikor a vörösvérsejtek száma magasabb a véráramban, mint amely a normális szöveti oxigénigényhez szükséges, az eritropoietin mennyisége a véráramban csökken.
Lásd általában a következő irodalmi helyeket. Testa és munkatársai: Exp. Hematol. 8 (Supp.8), 144—152 (1980); Tong és munkatársai: J. Bioi. Chem. 256 (24), 12 666-12 672 (1981); Goldwasser: J. Cell. Physiol. 110 (Supp.l), 133-135 (1982); Finch: Blood, 60 (6), 1241-1246 (1982); Sytowski és munkatársai: Expt. Hematol., 8 (Supp.8), 52-64 (1980); Naughton: Ann. Clin. Láb. Sci. 13 (5), 432-438 (1983); Weiss és munkatársai: Am. J. Vet. Rés. 44 (10), 1832-1835 (1983); Lappin és munkatársai: Exp. Hematol. 11 (7), 661-666 (1983); Baciu és munkatársai: Ann. N. Y. Acad. Sci. 414,66-72 (1983); Murphy és munkatársai: Acta Haematologica Japonica, 46 (7), 1380-1396 (1983); Dessypris és munkatársai: Brit. J. Haematol. 56, 295306 (1984); és Emmanouel és munkatársai: Am. J. Physiol., 247 (I Pt2), F168-76 (1984).
Mivel az eritropoietin nélkülözhetetlen a vörösvérsejt képzésének folyamatához, a hormonnak lehetséges hasznos alkalmazása van a kicsiny vagy hibás vörösvérsejt termeléssel jellemzett vérrendellenességek diagnózisában és kezelésében. Lásd általában: Pennathur-Das és munkatársai: Blood, 63 (5), 1168-71 (1984) és Haddy: Am. Jour. Ped. Hematol. [Oncol., 4, 191— 196 (1982)], amely irodalmi helyek az eritropoietinre, mint a sarlósejtes betegség ellen szolgáló lehetséges gyógyászati eszközre vonatkoznak; és Eschbach és munkatársai: J. Clin. Invest., 74 (2), 434-441 (1984), akik egy terápiás módot írnak le urémiás birkáknak, amely eritropoietinben gazdag plazmainfúziók in vivő válaszán alapul, és 10 egység EPO (eritropoietin)/kg/nap dózist javasolnak 15-40 napon át a krónikus veseelégtelenséggel társuló típusú anémia korrekciójaként. Lásd még: Krane: Henry Ford Hosp. Med. 3.,31(3), 177-181 (1983).
Nemrégiben felbecsülték, hogy az eritropoietinnek olyan mennyiségben kellene rendelkezésre állni, amely egyedül csak az USA-ban évenként 1 600 000 anémiás személy kezelését tegye lehetővé [lásd pl. Morrison: „Bioprocessing in space-an OverView” (Biológiai eljárások az űrben - áttekintés) 557-571] (a The World Biotech Report 1984. című kiadványban, Amerikai Egyesült Államok, 1984. 2. kötet, kiadó: Online Publications, New York 1984). A jelenlegi tanulmányok alapot nyújtanak az eritropoietin-terápia eredményességének megtervezéséhez különböző betegségi állapotokban, rendellenességeknél és hematológiai szabálytalansági állapotokban. Lásd: Vedovato és munkatársai: Acta Haematol. 71, 211-213 (1984) (béta-talasszémia); Vichinsky és munkatársai: J. Pediatr. 105 (1), 15-21 (1984) (cisztás fibrózis); Cotes és munkatársai: Brit. J. Obstet. Gyneacol. 90 (4), 304-311 (1983) (terhesség, menstruációs rendellenességek); Haga és munkatársai: Acta Pediatr. Scand. 72, 827-831 (1983) (a koraérés korai anémiája); Claus-Walker és munkatársai: Arch. Phys. Med. Rehabil., 65, 370-374 (1984) (gerincagysérülések); Dunn és munkatársai: Eur. J. Appl. Physiol. 52, 178-182 (1984) (űrrepülés); Miller és munkatársai: Brit. J. Haematol., 52,545-590 (1982) (akut vérveszteség); Udupa és munkatársai: J. Láb. Clin. Med. 103 (4), 574-580 és 581-588 (1984); és Lipschitz és munkatársai: Blood, 63 (3), 502-509 (1983) (időskor); és Doniak és munkatársai: Cancer, 51 (6), 1101-1106 (1983); és Schwartz és munkatársai: Otolaryngol. 109, 269-272 (1983) (különböző neoplazmás betegségi állapotok abnormális eritropoiézissel társulva).
A korábbi kísérletek, hogy eritropoietínt nyerjenek jó kitermeléssel plazmából vagy vizeletből, viszonylag sikertelennek bizonyultak. Komplikált és mesterkélt laboratóriumi technikák szükségesek, amelyek általában csak igen kis mennyiségű tisztátalan és nem stabil eritropoietínt tartalmazó extraktumok összegyűjtését eredményezték.
A 3 033 753 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás részleges eritropoietin tisztítási módszert ismertet birkavérplazmából, amely eritropoietint tartalmazó nyers, szilárd extraktumot szolgáltat kis kitermeléssel.
A kezdeti kísérletek az eritropoietin izolálására vizeletből nem stabil, biológiailag inaktív készítményt adtak. A 3 865 801 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás módszert ismertet a vizeletből kinyert, eritropoietínt tartalmazó nyers anyag biológiai aktivitásának stabilizálására. Az így létrejött, eritropoietínt tartalmazó nyers készítmény bizonyítottan megtartja az eritropoietin-aktivitás 90%-át, és stabil.
A humán eritropoietin tisztításának egy másik módszerét aplasztikus anémiában szenvedő betegek vizeletéből Miyake és munkatársai írják le [J. Bioi. Chem.,
HU 204889 Β
252 (15) (1977. aug. 10.), 5558-55641- Ez a hétlépéses eljárás magában foglal ioncserélő kromatográfíát, etanolos kicsapást, gélszurést és adszorpciós kromatográfiát, és tiszta eritropoietin készítményt állít elő 70 400 egység/mg fehérjepotenciállal, 21% kitermeléssel.
A 4 397 840 Iajstromszámű amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Takezawa és munkatársai) módszereket ír le egy „eritropoietin tennék” készítésére egészséges emberi vizeletmíntákból gyengén bázisos ioncserélőkkel, és megállapítja, hogy a nyert kis molekulatömegű termékeknek „nincs gátló hatása az eritropoietin ellen”.
A 2 085 887 lajstromszámú egyesült királyságbeli szabadalmi leírás (Sugimoto és munkatársai, publikálva 1982. május 6-án) eljárást ír le hibrid humán Iimfoblasztoidsejtek termelésére, beszámolva 3 és 420 egység közti eritropoietin/ml sejtszuszpenzió termelési szintről (amely a tenyészetben azután oszlik el, miután az emlős gazdaszervezet szaporodása elérte a 107 sejí/ml tartalmat). A legnagyobb bizonyított termelési szintnél, , amelyet nyertek, az eritropoietin-teimelés sebességét 40-től 4000 egység/106 sejt/48 órának lehet kalkulálni in vitro tenyészetben, amely a sejtek átvitelét követi az in vivő szaporítási rendszerből (lásd még ennek ekvivalensét, a 4 377 513 Iajstromszámű amerikai egyesült 1 államokbeli szabadalmi leírást). Számos javaslatot tettek még az eritropoietin izolálására szöveti forrásokból, beleértve neoplazmás sejteket is, de a kitermelés egészen alacsony volt Lásd pl.: Jelkman és munkatársai: Expt Hematol. II (7), 581-588 (1983); Tambourin £ és munkatársai: P.N.A.S. (USA), 80, 6269-6273 (1983); Kaísuoka és munkatársai: Gann, 74, 534-541 (1983); Hagivara és munkatársai: Blood, 63 (4), 828835 (1984); és Choppin és munkatársai: Blood, 64 (2), 341-347(1984). 3
Más izolálás! technikákat is alkalmaztak tisztított eritropoietin nyerésére, beleértve az immunológiai módszereket is. Egy eritropoietin ellen irányuló, poliklonális, szérum eredetű antitestet fejlesztettek ki, egy állatot, előnyösen patkányt vagy nyulat, humán eritro- 4 poietinnel injekciózva. Az injektált humán eritropoietint az állat immunrendszere mint idegen antigén anyagot ismeri fel, és előidézi az antigén elleni antitest termelését. Az antigénvegyület általi stimulálásra választ adó eltérő sejtek olyan antitesteket termelnek és 41 bocsátanak a véráramba, amelyek kissé különböznek azoktól, amelyeket más választ adó sejtek termelnek.
Az antitest-aktivitás az állat szérumában marad, amikor vérét kivonják. Bár a nem tisztított szérumot vagy a szérum immunglobulin G frakcióként tisztított antitest- 5( készítményt lehet azután alkalmazni a humán eritropoietín tisztítására és a humán eritropoietinnel való komplexképzéshez, ezeknek az anyagoknak sok hátránya van. Ez a szérumantitest, amely az egyes sejtek által termelt összes különböző antitestből áll, termé- 5£ szelében poliklonális és komplexet képez a nyers extraktumokban olyan komponensekkel is, amelyek az eritropoietintől eltérnek.
A jelen találmány hátterének szempontjából érdekes a jelenlegi előrehaladás olyan folyamatos sejttenyésze- 60 tek kifejlesztése területén, amelyek egy egyedi antitestfajta termelésére képesek, amely antitest fajlagosan immunolőgiailag reaktív egy kiválasztott antigén egyetlen antigén-determinánsával. Lásd általában:
Chrisholm, High Technology, 3 (1), 57-63 (1983). Kísérleteket végeztek sejtfúziót és hibridizálási technikákat alkalmazni eritropoietinre „monoklonális” antitestek kifejlesztésére és ezeknek az antitesteknek az alkalmazására a humán eritropoietin izolálásához és kvanti0 tatív kimutatásához. Egy példaként humán eritropoietinre monoklonális antitesteket kiválasztó egér-egér hibridóma-sejtvonalak sikeres kifejlesztéséről szóló beszámoló jelent meg kivonat formájában [Lee-Huang: Fed. Proc., 41,520 (1982), 1463. számú kivonat]. Egy másik példaként egy monoklonális anti-eritropoietin antitest készítésének és alkalmazásának részletes leírása jelent meg Weiss és munkatársainak közleményében P.N.A.S. (USA), 79, 5465-5469 (1982). Lásd még: Sasaki: Biomed, Biochem. Acta, 42 (11U2), S202) S206 (1983); Yanagawa és munkatársai: Blood, 64 (2), 357-364 (1984); Yanagawa és munkatársai: J. Bioi. Chem., 259 (5), 2707-2710 (1984); és 4 465 624 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás.
> A találmányunk háttere szempontjából szintén érdekesek a beszámolók az olyan szintetikus peptidek immunológiai aktivitásáról, amelyek lényegében lemásolják a meglévő természetben előforduló fehérjék, glükoproteinek és nukleoproteinek aminosaY-szekvenciáját Részletesebben, viszonylag kis molekulatömegő polipeptidekról kimutatták, hogy részt vesznek olyan immunreakciókban, amelyek hasonlóak terjedelemben és tartalomban olyan fiziológiailag fontos fehérjék immunreakcióihoz, mint a vírusantigének, polipeptidhormonok stb. Az ilyen polipeptidek reakciói között van a fajlagos antitestek képződésének a kiváltása immunológiailag aktív állatokban. Lásd pl.: Lemer és munkatársai: Cell, 23, 309-310 (1981); Ross és munkatársai: Natúré, 294, 654-656 (1981); Waiter és munkatársai: P.N.A.S. (USA), 77, 5197-5200 (1980); Lemer és munkatársai: P.N.A.S. (USA), 78, 3403-3407 (1981); Waiter és munkatársai: P.N.A.S. (USA), 78, 48824886 (1981); Wong és munkatársai P.N.A.S. (USA), 78,7412-7416 (1981); Green és munkatársak Cell, 28,
477-487 (1982); Nigy és munkatársai: P.N.A.S. (USA), 79,5322-5326 (1982); Báron és munkatársai: Cell, 28, 395-404 (1982); Dreesman és munkatársai: Natúré, 295, 158-160 (1982); és Lemen Scientífíc American, 248 (2), 66-74 (1983). Lásd még: Kaiser és munkatársai: Science, 223, 249-255 (1984), amely szintetikus peptidek biológiai és immunológiai aktivitásával foglalkozik, amelyek hozzávetőlegesen részesülnek a peptídhormonok másodlagos szerkezetében, de nem részesülhetnek ezek primer szerkezeti konformációjában. A fenti tanulmányok természetesen eritropoietintől eltérő fehérjék aminosav-szekvenciáira is vonatkoznak; az eritropoietin olyan anyag, amelyhez a lényeges aminosav-szekvenciát nem közölték. Egy azonos szerzőjű, ezzel összefüggő, 463,724 bejelentési sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadal6
HU 204 889 Β mi bejelentésben (J. Egrié), amelyet 1984. augusztus 22-én publikáltak 0 116 446 sorozatszámú európai szabadalmi bejelentésként, egy egér-egér hibridómasejtvonal van leírva (ATCC HB 8209), amely egy nagyon fajlagos, monoklonális, anti-eritropoietin antitestet termel, amely szintén fajlagos immunxeaktív egy polipeptiddel, amely a következő aminosav-szekvenciával rendelkezik:
NHí-Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-ArgVal-Leu-Glu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-Ála-Lys-COOH.
A polipeptidszekvencia olyan, amely a Miyake és munkatársai [J. Bioi. Chem. 252, 5558-5564, (1977)] módszere szerint izolált érett humán eritropoietin első huszonegy aminosavának felel meg, és amelyre az aminosav-elemzést gázfázisú szekvencia-elemzővel (Applied Biosystems, Inc.) hajtották végre Hewick M. és munkatársai J. Bioi. Chem., 256, 7990-7997 (1981) módszere szerint. Lásd még: Sue és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 80, 3651-3655 (1983), amely irodalmi hely egy eltérő aminosav-szekvencián alapuló szintetikus 26 tagú peptid (26-mer) elleni poliklonális antitestek kifejlesztésére vonatkozik, valamint Sytowski és munkatársai: J. Imm. Methods, 69, 181-186 (1984).
Miközben a fentebbiek szerint leírt poliklonális és monoklonális antitestek nagyon hasznos anyagokat szolgáltatnak az immunassay-ban való alkalmazáshoz az eritropoietin kimutatásához és mennyiségi méréséhez, és ezek hasznosak lehetnek az eritropoietin affinitásos tisztításához is, valószínűtlennek tűnik, hogy ezek az anyagok könnyen nyújthatnának eszközt az eritropoietin olyan mennyiségeinek nagyléptékű izolálásához emlős forrásokból, amely elegendő lenne a további elemzéshez klinikai vizsgálatokhoz, és a vegyület lehetséges széles körű terápiás alkalmazásához pl. krónikus vesebetegségben szenvedők kezelésében, ahol a megbetegedett szövetek képtelenek fenntartani az eritropoietin-termelést. Következésképpen a szakterületen tervezik a legjobb távlatokat az emlős eritropoietin teljes jellemzéséhez és ennek nagy mennyiségű szolgáltatásához a lehetséges diagnosztikai és klinikai alkalmazáshoz, a távlatokba beleértve a rekombináns eljárások sikeres alkalmazását a vegyület nagyléptékű mikrobiológiai szintézisének kivitelezéséhez.
Bár úgy tűnik, jelentős erőfeszítéseket tettek olyan kísérletek terén, amelyek a humán és más emlős eritropoietint kódoló DNS-szekvenciák izolálására irányultak, ezek egyike sem tűnik sikeresnek. Ez alapvetően a szöveti források, elsősorban a humán szöveti források szűkösségének tulajdonítható, az ilyen mRNS-ben dús szövetek tennék lehetővé egy cDNS „könyvtár” megalkotását, amelyből az eritropoietint kódoló DNS-szekvenciát lehetne izolálni hagyományos módon. Továbbá olyan keveset tudunk az eritropoietin aminosavgyökeinek folyamatos szekvenciájáról, hogy nem lehet megalkotni pl. hosszú polinukleotid-vizsgáló mintákat, amelyek könnyen képesek megbízható alkalmazásra a cDNS és különösen a DNS-könyvtárak DNS/DNS hibridizálási átvizsgálásában. Bemutatásképpen, az ATCC HB 8209 által termelt, fentebb megnevezett monoklonális antitest kiváltásához alkalmazott huszonegy aminosavból álló szekvencia nem teszi lehetővé egy egyértelmű, 60 bázispárból álló oligonukleotid-vizsgáló minta megalkotását azon a módon, ahogyan ezt Anderson és munkatársai (fentebb idézett közlemény) leírták. Úgy feltételezik, hogy az eritropoietinhez tartozó humán gén mint egy „egyedi kőpiagén” jelenhet meg a humán genomon belül, és bármilyen esetben a humán eritropoietint kódoló genetikai anyag valószínűleg kevesebb, mint a teljes emberi genom DNS 0,00005%-át alkotja, amely jelen lehet a genom könyvtárban.
Az eddig ismert és leírt legsikeresebb kísérletek a rekombináns jellegű módszerek terén, az emlős eritropoietin izolálható mennyiségeinek mikrobiológiai kifejeződésben való megvalósításához megfelelő DNSszekvenciák szolgáltatásához még távol vannak a céltól. Példaként Farber és munkatársai [Exp. Hematol. 11, Supp. 14., 101. kivonat (1983)] beszámolnak fenilhidrazinnal kezelt babuinmajmok veseszöveteiből mRNS kivonásáról és az mRNS injektálásáról Xenopus laevis oocitákba, „transzlációs termékek” keveréke in vitro termelésének inkább csak ideiglenes eredményével, amely termékek többek között magukban foglaltak eritropoietin biológiai tulajdonságait mutató terméket is. Nemrégiben Farber és munkatársai beszámoltak [Blood, 62 (5), Supp. 1, 392. kivonat, 122. a) oldal (1983)] humán vese mRNS in vitro transzlációjáról béka oocitákból. Az így nyert transzlációs termékkeverékről úgy becsülték, hogy magában foglal egy olyan transzlációs terméket, amely az injektált mRNS mikrogrammjaira számítva 220 milliegység nagyságrendben eritropoietin-aktivitást mutat. Bár az ilyen szintű eritropoietint kódoló exogén mRNS in vitro transzlációkat egészen kicsinek tekintették (összehasonlítva még a korábban közölt bábuin mRNS transzláció szintjével is a keresett termékké), úgy tartották, hogy az eredmények bizonyítják: az emberi vese, mint az eritropoietin kifejeződés helye, lehetővé teszi egy dúsított humán cDNS „könyvtár” megalkotását, amelyből a kívánt gént izolálni lehet [lásd még: Farber: Clin. Rés, 3 (4), 769A(1983)].
Az 561 024 és 582 185 bejelentési sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés benyújtása óta megjelent egy közlemény, humán eritropoietin cDNS-nek nyilvánított anyag klónozásáról és kifejeződéséről E.cohban. Röviden ismertetve, egy sor cDNS-klónt iktattak be E.coli plazmidokba és - laktamáz fúziós termékekről azt figyelték meg, hogy immunreaktívak a humán eritropoietin egy nem részletezett „epiíop”-jának monoklonális antitestével. Lásd: Lee-Huang: Proc. Nat. Acad. Sci (USA), 81, 27082712 (1984).
A jelen találmány elsőként nyújt tisztított és izolált polipeptidtermékeket, beleértve alléi variánsait is, amelyek rendelkeznek a természetben előforduló eritropoietin primer szerkezeti konformációjának (azaz aminosavgyökök folyamatos szekvenciájának) egy részével vagy egészével, és biológiai tulajdonságaiból (pl. immunológiai tulajdonságok és in vivő és in vitro biológiai aktivitás) eggyel vagy többel. Ezeket a polipepti7
HU 204889 Β deket egyedi módon lehet jellemezni úgy is, hogy ezek genomiális vagy cDNS-klónozással vagy génszintézissel nyert exogén DNS-szekvenciák prokarióía vagy eukarióta gazdaszervezetben való (pl. baktérium-, élesztő- és emlős sejttenyészetek) kifejeződésének termékei. A mikrobíális kifejeződés termékeit a gerinces (pl. emlős vagy madár) sejtekkel kapcsolatban tovább lehet jellemezni olyan módon, hogy ezek mentesek a humán fehérjékkel és más szennyeződésekkel való olyan összekapcsolódásoktól, amely összekapcsolódások az eritropoietinnel a maga természetes emlős sejt környezetében vagy az olyan extracelluláris folyadékokban, mint a plazma vagy a vizelet, felléphetnek. Tipikus élesztő (pl. Saccharomyces cerevisiae) vagy prokariőta (pl. E.coli) gazdasejtek termékei mentesek bármiféle emlős fehérjével való összekapcsolódástól. Az alkalmazott gazdaszervezettől függően a találmány szerinti polipeptidek glikozilezve lehetnek emlős vagy más eukarióta szénhidrátokkal, vagy lehetnek nem glikozilezettek. A találmány szerinti polipeptidek magukban foglalhatnak egy kiindulási metionin aminosavgyököt (az 1. helyen).
A találmány szerinti új glűkoprotein termékek magukban foglalják azokat, amelyek olyan primer szerkezeti konformációval bírnak, amelyek a természetben előforduló (pl. humán) eritropoietin primer szerkezeti konformációjának megfelelő másolatai, így lehetővé téve, hogy annak egy vagy több biológiai tulajdonságával rendelkezzék, és amelyek olyan átlagos szénhidrátösszetétellel bírnak, amely különbözik a természetben előforduló (pl. humán) eritropoietin szénhidrát-összetételétől.
A jelen találmány által szolgáltatott emlős (pl. COS1 és CHO) sejtek jelentik a valaha is rendelkezésre álló első sejteket, amelyeket in vitro folyamatosan lehet ! szaporítani és amelyek tenyészetben növesztve képesek növesztő tápközegükben több, mint 100 egység (előnyösen több, mint 500 egység, és legelőnyösebben több, mint 1000-5000 egység) eritropoietint előállítani, 105 sejtre számítva 48 óra alatt, amint ezt radioimmu- z nassay-val meghatároztuk.
A jelen találmány szolgáltat szintetikus polipeptideket is, amelyek részben vagy egészben másolatai az eritropoietin aminosavgyökök folyamatos szekvenciáinak, amelyet itt első ízben tisztáztunk. Ezek a szekven- 4 ciák a természetben előforduló eritropoietinnel egyező primer, szekunder vagy tercier szerkezeti és konformációs jellemzők alapján rendelkezhetnek a természetben előforduló termékkel közös biológiai aktivitással és/vagy immunológiai tulajdonságokkal úgy, hogy eze- 5 két lehet alkalmazni az eritropoietin biológiailag aktív vagy immunológiai helyettesítőjeként a gyógykezelésben és az immunológiai folyamatokban. Ennek megfelelően szolgáltatunk a standard eszközökkel kiváltott monoklonális és poliklonális antitesteket is, amelyek 51 immunreaktívak az ilyen polipeptidekkel és, előnyösen, immunreaktívak a természetben előforduló eritropoietinnel is.
A jelen találmányt illusztrálva majom és humán eredetű DNS-szekvenciákat és ezekből megfelelően kö- 6( vetkeztetett polipeptidszekvenciákat kiónozunk, amelyek a majom és humán eredetű eritropoietinek elsődleges szerkezeti konformációját képviselik.
A jelen találmány új, biológiailag funkcionális vírus és 5 cirkuláris plazmid DNS-vektorokat nyújt, amelybe a találmány szerinti DNS-szekvenciák vannak beépítve, valamint mikrobiális (pl. bakteriális, élesztő- és emlős sejt) gazdaszervezeteket nyújt, amelyek stabilan transzformálva vagy fertőzve vannak az ilyen vektorokkal. Ennek [ 0 megfelelőén a találmány új módszereket nyújt a hasznos polipeptidek előállítására, amely az ilyen transzformáit vagy fertőzött mikrobiális gazdaszervezet tenyésztéses növesztéséből áll az exogén, vektor eredetű DNS-szekvenciák nagyléptékű kifejeződéséhez kedvező körülmé5 nyék között, valamint a kívánt polipeptid izolálásából áll a növesztő tápközegből, sejtlizátumból vagy celluláris membránfrakciókból.
A találmány szerint szolgáltatott, mikrobiálisan kifejeződött polipeptidek izolálását és tisztítását lehet hall gyományos eszközökkel elvégezni, beleértve pl. a preparatív kromatográfiás elválasztást és az immunológiai elválasztásokat, ezen belül pl. a monoklonális és/vagy poliklonális antitestkészítmények alkalmazását
Az eritropoietin aminosav-szekvenciáját itt feltárva 5 a jelen találmány az eritropoietint kódoló DNS-szekvenciák teljes és/vagy részleges előállítását szolgáltatja, beleértve olyan előnyös jellemzőket is, mint pl. a kifejeződéshez „előnyös” kodonok beépítése kiválasztott nem emlős gazdaszervezetek által, gondoskodás a 3 restrikciós endonukleáz enzimekkel történő hasításhoz szolgáló helyekről, és gondoskodás további kiindulási, befejező és közbenső DNS-szekvenciákróI, amelyek megkönnyítik a könnyen kifejeződő vektorok megalkotását. Ennek megfelelőén a jelen találmány az eritro5 poietin-származékok vagy polipeptidanalógok mikrobiális kifejeződését kódoló DNS-szekvenciák előállítását (és a cDNS és genom DNS helyre fajlagos mutagenezisének kifejlesztését) nyújtja, a fenti eritropoietin-származékok különbőznek a természetben előfor1 dúló formáktól egy vagy több aminosavgyök elhelyezkedését és azonosságát tekintve [azaz az EPO-hoz meghatározott gyökök kevesebb, mint mindegyikét tartalmazó deléciós (kihagyásos) analógok és/vagy helyettesítéses analógok, ahol egy vagy több meghatározott gyököt más gyökök helyettesítenek és/vagy addíciós analógok, ahol egy vagy több aminosavgyököt adunk a polipeptid terminális vagy közbenső szakaszához]; és amely eritropoietin-száimazékok rendelkeznek a természetben előforduló formák bizonyos vagy összes tulajdonságaival.
A találmány szerinti új DNS-szekvenciák magukban foglalják az összes olyan szekvenciát, amely hasznos a polipeptidtermék kifejeződésének biztosításában a prokariőta vagy eukarióta gazdaszervezetben; a nevezett polipepíidteimék legalább részben rendelkezik az eritropoietin primer szerkezeti konformációjával és egy vagy több biológiai tulajdonságával·, a DNS-szekvenciák a következőket foglalják magukban: (a) az itt V. és VI. táblázatban közzétett DNS-szekvenciák és komplementerszálaik; (b) DNS-szekvenciák, amelyek hibridi8
HU 204 889 Β zálódnak (az itt bemutatott hibridizálási vagy szigorúbb körülmények között) az (a) pontban meghatározott DNS-szekvenciákhoz vagy ezek fragmenseihez; (c) DNS-szekvenciák, amelyek csak a genetikai kód degenerációja útján hibridizálódhatnak a fentebb meghatározott (a) és (b) szerinti DNS-szekvenciákhoz. Különösen beleértendők a (b) részbe azok a genom DNSszekvenciák, amelyek a majom és ember eritropoietin alléi variáns formáit kódolják és/vagy más emlős fajok eritropoietinjét kódolják. Különösen beleértendő a (c) részbe azoknak a DNS-szekvenciáknak a gyártása, amelyek EPO-t, EPO-ffagmenseket és EPO-analógokat kódolnak, ezek a DNS-szekvenciák a nem gerinces gazdaszervezetbe hírvivő RNS transzlációját megkönnyítő kodonokat építhetnek be.
A jelen találmányba beleértendők az itt bemutatott VI. táblázat humán genom DNS felső szálának DNSkomplementjeinek részei által kódolt polipeptidek, azaz a „komplementer megfordított fehérjék”, amint ezt Tramontano és munkatársai leírták [Nucleic Acids Research, 12,5049-5059 (1984)].
A jelen találmányba beleértendők a találmány szerinti polipeptidtermékek hatásos mennyiségét megfelelő hígítókkal, adjuvánsokkal és/vagy hordozókkal együtt tartalmazó gyógyászati kompozíciók, amelyek lehetővé teszik az eritropoietin-gyógykezelés megoldását, főleg anémiás betegségi állapotokban és még speciálisabban olyan anémiás állapotokban, amelyek a krónikus veseelégtelenséggel járnak együtt.
A találmány szerinti polipeptidtermékeket lehet „jelezni” kovalens kapcsolat révén kimutatható jelzőanyagokkal (pl. radioaktív jelzés 125I-vel), hogy az eritropoietin szilárd szövetekben és folyadékmintákban, pl. vérben vagy vizeletben való kimutatásában és mennyiségi meghatározásában hasznos reagenseket szolgáltassunk. A találmány szerinti DNS-termékeket is lehet jelezni kimutatható markerekkel (mint pl. radioaktív jelzéssel és nem izotóp jelzésekkel, pl. biotinnal) és ezeket alkalmazni lehet a DNS hibridizálási folyamatokban az eritropoietingén helyzetének és/vagy bármelyik rokon géncsalád helyzetének lokalizálására a humán-, majom- vagy más emlős faj kromoszomális térképben. Ezeket lehet használni az eritropoietingén-rendellenességek azonosítására is DNS-szinten és lehet alkalmazni génmarkerként is szomszédos gének és ezek rendellenességeinek azonosításához.
Amint ezután részletesen leírjuk, a jelen találmány továbbá jelentős javítást nyújt ismeretlen szekvencia fajlagos egyszálas polinukleotidjai kimutatásához szolgáló módszerekben heterogén celluláris vagy virális mintában, beleértve az összetett egyszálú polinukleotidokat, ahol (i) jelzett egyszálú polinukleotid-vizsgáló minták keverékét készítjük el, amely vizsgálóminták bázisok egyenletesen változó szekvenciáival rendelkeznek, az említett vizsgálóminták mindegyike potenciálisan fajlagosan komplementer bázisoknak olyan szekvenciájára, amely feltehetően egyedi a kimutatandó polinukleotidra;
(ii) a mintát szilárd szubsztrátumra rögzítjük;
(iii) az iderögzített mintával rendelkező szubsztrátumot kezeljük, hogy csökkentsük a polinukleotid további idekötődését, kivéve a polinukleotidhoz való hibridizálás útján történőt az említett mintában;
(iv) az iderögzített mintával rendelkező kezelt szubsztrátumot átmenetileg kapcsolatba hozzuk a jelzett vizsgálóminták említett keverékével olyan körülmények között, amely csak a teljesen komplementer polinukleotidok közti hibridizálást könnyíti meg, és (v) a fajlagos polinukleotidot kimutatjuk a hibridzálási reakció jelenlétét megfigyelve e között és egy teljesen komplementer vizsgálóminta között a jelzett vizsgálóminták említett keverékében, amint erről meg lehet bizonyosodni a jelzett anyag nagyobb sűrűségének jelenlétével a szubsztrátumon a fajlagos polinukleotid helyénél (lókuszánál), összehasonlítva a jelzett vizsgálómintáknak a szubsztrátumhoz való nem fajlagos kötése által előidézett jelzett anyag háttérsűrűséggel.
Az eljárások különösen hatékonyak olyan helyzetekben, ahol 64,128, 256,512, 1024 vagy több kevert polinukleotid-vizsgáló minta van megszabva a DNS/DNS vagy RNS/RNS vagy DNS/RNS hibridizálásokhoz, és ahol a vizsgálóminták hossza 17-20 bázis.
Amint alább leírjuk, a fentebb említett javított eljárások bemutathatóan lehetővé teszik a majomfaj eredetű eritropoietint kódoló cDNS-klónok azonosítását egy anémiás majomvesesejt mRNS-ből előállított „könyvtár”-on belül. Még részletesebben, 128 egyenletesen változó 20-mer vizsgálóminta-keveréket, amelyet a humán eritropoietin szekvencia-frakcióiból származó aminosav-szekvencia információkon alapulnak, alkalmaztunk a telephibridizálási eljárásokban, hogy azonosítani tudjunk hét „pozitív” eritropoietin cDNS-klónt 200 000 telep összességen belül. Még figyelemre méltóbb módon, a találmány szerinti javított eljárások gyakorlata lehetővé tette három pozitív klón izolálását egy 1 500 000 fág tarfolton belüli átvizsgálásból, amely egy humán genom „könyvtár”-at alkotott. Ezt 128 20mer vizsgálóminta fentebb említett keveréke révén valósítottuk meg, együtt 128 17-mer vizsgálóminta egy másik készletével, ahol az utóbbi vizsgálóminták humán eritropoietin különböző folyamatos szekvenciáinak aminosav-elemzésén alapultak.
A fentebb említett, illusztrációul szolgáló folyamat képezi az első ismert példát többszörös kevert oligonukleotid-vizsgáló minták alkalmazására emlős genomklónok izolálására irányuló DNS/DNS hibridizálási folyamatokban, és az első ismert példát több, mint 32 oligonukleotid-vizsgáló minta keverékének alkalmazására cDNS-klónok izolálásában.
A találmány számos előnye és különböző szempontjai nyilvánvalóak lesznek azoknak, akik a szakterületen jártasak, ha figyelembe veszik az ezután következő részletes leírást, amely a találmány gyakorlati megvalósításának bemutatását nyújtja a jelenleg előnyös megvalósítási formákban.
A jelen találmány szerint a humán- és majomfajok eritropoietinje (ezután időnként EPO) polipeptidszekvenciájának részét vagy egészét kódoló DNS-szekven9
HU 204889 Β ciákat izoláltunk és jellemeztünk. Ezenkívül a majom és ember eredetű DNS-t eukariőta és prokarióta kifejeződésnek tettük ki, a természetben előforduló EPO biológiai (pl. immunológiai) tulajdonságait, valamint az EPO in vivő és in vitro aktivitását mutató polipeptidek izolálható mennyiségét nyújtva.
A majom eredetű DNS-t egy olyan majom veseszövetéből származó mRNS-sel megalkotott cDNSkönyvtárból izoláltuk, amely kémiailag indukált anémiás állapotban volt, és amelynek szérumáról immunolőgiailag megállapítottuk, hogy magas szinten tartalmazza az EPO-t a normál majomszérummal összehasonlítva. Az EPO-t kódoló DNS-t tartalmazó kívánt cDNS-klőnok izolálását DNS/DNS telephibrídizálás alkalmazása útján hajtottuk végre 128 kevert, radioaktívan jelzett 20-mer oligonukleotid-vizsgáló minta gyűjteményének alkalmazásával, beleértve 200 000 telep gyors átvizsgálását. Az oligonukleotid-vizsgáló minták tervezése humán EPO kis mintáinak enzimes fragmentálásával és szekvenciaelemzésével nyújtott aminosav-szekvencia információkon alapult
A humán eredetű DNS-t egy humán DNS-könyvtárből izoláltuk. Az EPO-t kódoló DNS-t tartalmazó kiónok izolálását DNS/DNS plakkhibridizálás útján hajtottuk végre, a fentebb említett 128 kevert 20-mer oligonukleotid-vizsgáló minta gyűjteményét és 128 ra’ dioaktívan jelzett 17-mer vizsgálóminta második gyűjteményét alkalmazva, amely utóbbiak szekvenciái különböző enzimatikusan nyert humán EPO-fragmensből nyert aminosav-szekvencia információn alapultak.
Pozitív telepeket és plakkokat átvizsgáltunk klónozó DNS didezoxi szekvenciaelemzés segítségével a 20-mer vizsgálőminták gyűjteményén belül 16 szekvencia alkészletét alkalmazva és a kiválasztott kiónokat nukleotidszekvencia-elemzésnek vetettük alá, az ezzel kódolt ! EPO-polipeptidek elsődleges szerkezeti transzformációjának kikövetkeztetett formáját nyerve. A kikövetkeztetett polipeptidszekvenciák nagymértékű homológiát mutattak egymáshoz és a humán EPO-fragmensek aminosav-elemzésével nyert részleges szekvenciákhoz. í
Egy kiválasztott pozitív majom cDNS-klónt és egy kiválasztott pozitív humán genomklónt egyenként beültettünk egy „ingázó” DNS-vektorba, amely sokszoroződott Exoliban, és ezt alkalmaztuk emlős sejtek átfertőzésére · tenyészetben. Az átfertőzőtt gazdasejtek tenyésztéses nö- 4 vesztése olyan tenyészközeg-felülúsző készítményt eredményezett, amelyről 3000 milliegység EPO/ml tenyészfolyadékig terjedő EPO-tartalmat becsültünk.
Az ezután következő példákat a találmány illusztrálása céljából mutatjuk be, és ezek különösen azokra a 5 folyamatokra irányulnak, amelyeket a majom cDNSklónok és emberi genomklónok által kódolt EPO azonosítása előtt hajtottunk végre, valamint az ilyen azonosítást eredményező folyamatokra, és a szekvenciaelemzésre, a kifejeződő rendszerek fejlesztésére és az 5i ilyen rendszerekben az EPO kifejeződésének immunológiai igazolására.
Részletesebben, az 1. példa a humán EPO-fragmensek aminosav-szekvencia elemzésére és az ilyen szekvenciaelemzés eredményein alapuló radioaktív vizs- 6( gálóminták keverékének megalkotására irányul. A 2. példa általában a pozitív majomklónok azonosítását magában foglaló folyamatokra irányul, így információkat nyújt az állatok kezeléséhez és az állati szérumok előzetes radioimmunassay (RIA) analíziséhez. A 3. példa a cDNS-könyvtár előállítására, a telephibridizálási átvizsgálásra és a pozitív klőnok igazolására, a pozitív kiónok DNS szekvenciaelemzésére és a majom EPO-polipeptid elsődleges szerkezeti konformációjára (aminosav-szekvencia) vonatkozó információ megalkotására irányul. A 4. példa pozitív humán genomklónok azonosítását magában foglaló eljárásokra irányul, és így információt nyújt a genomkönyvtár forrását, plakkhibridizálási módszereket és pozitív kiónok iga5 zolását illetően. Az 5. ábra egy pozitív genomklón DNS szekvenciaelemzésére és humán EPO-polipeptid aminosav-szekvencia információjának létrehozására irányul, beleértve ennek összehasonlítását a majom EPO-szekvencia információval. A 6. példa egy vektor előállításához szükséges folyamatra irányul, amely vektorba pozitív majom cDNS-ldónból származó, EPO-t kódoló DNS van beépítve, valamint ennek a vektornak az alkalmazására irányul COS-1 sejtek fertőzésére és a fertőzött sejtek tenyésztéses növesztésére.
A 7. példa egy olyan vektor megalkotásának folyamatára irányul, amelybe pozitív humán genomklónból származó, EPO-t kódoló DNS van beépítve, valamint ennek a vektornak az alkalmazására irányul COS-1 sejtek fertőzésére és a fertőzött sejtek tenyésztéses nő) vesztésére. A 8. példa a 6. és 7. példa szerint fertőzött sejtek tenyésztéses növesztéséből nyert tápközeg-felülúszóban végrehajtott immunassay-folyamatokra irányul. A 9. példa a 6. és 7. példák szerint mikrobiálisan kifejezett EPO in vitro és in vivő biológiai aktivitására » irányul.
A 10. példa egy emlős gazda kifejeződő rendszer kifejlesztésére irányul majom EPO-cDNS és humán genomiális DNS-hez, beleértve a kínai hörcsögpetefészek (CHO) sejteket, valamint ezen kifejeződő rendszerek termékeinek immunológiai és biológiai aktivitásaira irányul, valamint az ilyen termékek jellemzésére.
A 11. ábra a humán fajta EPO-t és EPO-analőgokat kódoló kimunkált gének előállítására irányul, amely gének magukban foglalnak egy sor kedvező kodont E.coli és élesztőgazdasejíekben való kifejeződéshez, és az ezen alapuló kifejeződő rendszerekre irányul. A12. példa a 11. példa szerinti rendszerek kifejeződési termékeinek immunológiai és biológiai aktivitás profiljaira vonatkozik.
1. példa
A) Humán EPO-fragmensek aminosav-szekvencia elemzése
Humán EPO-t izolálunk vizeletből és tripszines emésztésnek vetjük alá, amelynek eredményeként 17 elkülönült fragmens fejlődik ki, amelyeket izolálunk egyenként 100-150 pikomól mennyiségben.
A fragmenseket önkényesen számokkal jelöljük és aminosav-szekvenciájukat elemezzük mikroszekvencia-elemzéssel gázfázisú szekvenciaelemzőt (Applied
HU 204 889 Β
Biosystems) alkalmazva, így nyújtjuk az alábbi I. táblázatban található szekvencia-információt, ahol az egyes betűkódokat alkalmazzuk és „X” jelöli azokat a gyököket, amelyek nem voltak kétséget kizáróan meghatározva.
I. táblázat
Fragmens Szekvenciaelemzés eredménye száma
| T4a | A-P-P-R |
| T4b | G-K-L-K |
| T9 | A-L-G-A-Q-K |
| T13 | V-L-E-R |
| T16 | A-V-S-G-L-R |
| T18 | L-F-R |
| T21 | K-L-F-R |
| T25 | Y-L-L-E-A-K |
| T26a | L-I-C-D-S-R |
| T26b | L-Y-T-G-E-A-C-R |
| T27 | T-I-T-A-D-T-F-R |
| T28 | E-A-I-S-P-P-D-A-A-M-A-A-P-L-R |
| T30 | E-A-E-X-I-T-T-G-X-A-E-H-X-S-L-N-E-X- -I-T-V-P |
| T31 | V-Y-S-N-F-L-R |
| T33 | S-L-T-T-L-L-R |
| T35 | V-N-F-Y-A-W-K |
| T38 | G-Q-A-L-L-V-X-S-S-Q-P-W-E-P-L-Q-L- -H-V-D-K |
B) Oligonukleotid próbakeverékek tervezése és megalkotása
Az I. táblázatban bemutatott aminosav-szekvenciákat áttekintjük a genetikai kód degenerálódásával összefüggésben abból a célból, hogy meggyőződjünk, vajon a próbakeverékeket lehet-e alkalmazni DNS/DNS hibridizálási eljáráshoz cDNS-en és/vagy genom DNS-könyvtáron. Ez az elemzés feltárja, hogy a T35 fragmensen belül létezik egy 7 aminosavgyökból álló sorozat (Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys), amelyet lehet egyedileg úgy jellemezni, mint amelyet a 20 bázispárt átfogó 128 lehetséges DNS egyike kódol. Ennél fogva 128 20-mer oligonukleotid első sorozatát szintetizáljuk standard foszfoamidit-módszerekkel [lásd pl.: Beaucage és munkatársai: Tetrahedron Letters, 22, 1859-1862 (1981)] egy szilárd hordozón az alábbi II. táblázatban bemutatott szekvencia szerint:
II. táblázat
Gyök-Val -Asn Phe Tyr Alá Trp Lys
3’ CAA TTG AAG ATG CGA ACC TT-5’
T A A A T
G G
C C
A további elemzés felderíti, hogy a T38 fragmensen belül létezik egy 6 aminosavgyökből álló sorozat (GlnPro-Trp-Glu-Pro-Leu), amelynek alapján lehet készíteni 128 kevert oligonukleotid 17-mer vizsgálómintából álló gyűjteményt, amint az alábbi III. táblázatban bemutatjuk.
ΠΙ. táblázat
| Gyök Gin | Pro | Trp | Glu | Pro | Leu |
| 3’ GTT | GGA | ACC | CTT | GGA | GA -5’ |
| C | T | C | T | A | |
| G | G | ||||
| C | C |
Az oligonukleotid-vizsgáló mintákat 5’ végüknél gamma-32P-ATP-vel jelöljük [7500-8000 Ci/mmól (ICN)], T< polinukleotid-kinázt (NEN) alkalmazva.
2. példa
A) Majomkezelési eljárások és RIA analízis
Hím Cynomolgus majmokat (Macaca fascicularias) (2,5-3 kg, 1,5-2 évesek) kezelünk szubkután fenil-hidrazin hidroklorid pH=7,0-es oldatával 12,5 mg/kg dózisszinttel az 1., 3. és 5. napon. A hematokritértéket megfigyeljük minden injekció előtt. A 7. napon, vagy amikor a hematokritszint a kezdeti szint 25%-a alá esik, a szérumot és a veséket kinyerjük 25 mg/kg adag ketamin-hidroklorid beadásával. A kinyert anyagot azonnal lefagyasztjuk folyékony nitrogénben és -70 °C hőmérsékleten tároljuk.
B) RIAazEPO-hoz
A mintákban az EPO kvantitatív meghatározásához alkalmazott radioimmunassay folyamatot a következő eljárás szerint hajtjuk végre:
Eritropoietin standardot vagy ismeretlen mintát inkubálunk antiszérummal együtt 2 órán át 37 °C hőmérsékleten. Két órás inkubálás után a mintát tartalmazó csöveket jégben lehűtjük, és 125I-vel jelzett eritropoietint adunk hozzá, majd a csöveket 0 °C hőmérsékleten inkubáljuk legalább további 15 órán át. Minden vizsgálócső 500 pl inkubálókeveréket tartalmaz, amely 50 pl hígított immunszérumból, 10 000 cpm 125I-eritropoietinből, 5 pl trasilolból és 0-250 pl vagy EPO standardból, vagy ismeretlen mintából áll, 0,1% BSA-6 (bovin szérumalbumin) tartalmazó PBS-sel (foszfátsópuffer) kiegészítve a fennmaradó térfogat erejéig. Az alkalmazott antiszérum humán vizelet eritropoietin 1%-os tiszta készítménnyel immunizált nyúl második vizsgálati kivérzéséből eredő anyag. A végső antiszérumhígítást a vizsgálatnál úgy állítjuk be, hogy az antitest által kötött 125I-EPO ne haladja meg a bevitt teljes szám 10-20%-át. Általában ez megfelel 1:50 000-1:100 000 végső antiszérum hígításának.
Az antitest által kötött 125I-eritropoietint 150 pl Staph A hozzáadásával kicsapjuk. 40 perces inkubálás után a mintákat centrifugáljuk és az üledéket kétszer mossuk 0,75 ml 10 mmól/literes Trisz-HCl (pH-8,2)11
HU 204 889 Β vei, amely még 0,15 mól/liter NaCl-ot 2 mmől/liter EDTA-t és 0,05% Triton Χ-100-at tartalmaz. A mosott üledéket gamma-számlálóban megszámoljuk, hogy meghatározzuk a kötött 125I-erítropoietin-százalékot Az immunszénim által kötött számokat kivonjuk minden egyes végső értékből, hogy korrigáljunk a nem fajlagos kicsapásra. Az ismeretlen minták eritropoietintartalmát a standard görbével összehasonlítva határozzuk meg.
A fenti folyamatot az A részben nyert majomszérumhoz, valamint a kezeletlen majomszérumhoz alkalmazzuk. A normál szérumszinteknél úgy találjuk, hogy mintegy 36 milliegység/ml-t tartalmaznak, míg a kezelt majomszérum 1000-1700 milliegység/ml-t tartalmaz.
3. példa
A) Majom-cDNS-könyvtár megalkotása
Hírvivő (messenger) RNS-t izolálunk normál és anémiás majmok veséiből Chirgwin és munkatársai- guanidium tiocianátos eljárása szerint [Biochemistry, 18,5294 (1979)] és poli (A)+ mRNS-t tisztítunk kétszer futtatva oligo(dT)-cellulóz oszlopkromatográfíával, amint ezt Maniatis és munkatársai leírták {„Molecular Cloning, A Laboraíory Manual” 197-198 [Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, New York, (1982)]}. A cDNS könyvtárat Okayama és munkatársai általános eljárásának [Mól. and Cell Bioi, 2,161-170 (1982)] módosított formája szerint alkotjuk meg. A jelenleg előnyös eljárások kulcslépései a következők: (1) pUC8-at alkalmazzuk egyedüli vektorként, Psíl-gyel hasítjuk, majd 60-80 bázis hosszúságú oligo(dT) farokkal látjuk el; (2) Hindi emésztést alkalmazunk az oligo(dT) farok eltávolítására a vektor egyik végéről; (3) első szál szintézist és olígo(dG) farokképzést hajtunk végre a publikált eljárás szerint; (4) BűwHí emésztést alkalmazunk, hogy eltávolítsuk az oligo(dG) faikot a vektor egyik végéről; és (5) az RNS-szálat helyettesítjük DNS-sel két kapcsoló (linker) jelenlétében (GATCTAAAGACCGTCCCCCCCC és ACGGTCTTTA) az oligo(dG) farokkal rendelkező vektorhoz viszonyított háromszoros moláris feleslegben.
B) Telephibridizálási folyamatok majom cDNS-kőnyvtár átvizsgálásához Transzformált E.colit szélesztünk 9000 telep/10*10 cm-es lemezsuruséggel olyan tápközeget tar- 45 talmazó lemezekre, amelyek 50 mikrogramm/ml ampicillint is tartalmaznak. Gene Screen szűrőket (New England Nuclear Catalog, NEF-972 szám) előnedvesítünk egy BHI-CAM lemezen (Bacto agy-szív infúzió, g/Iiter, kazaminosav (hidrolizált kazein) 2 g/liter, 50 agar 15 g/liter, és még 500 mikrogramm/ml klőramfenikolt is tartalmaz) és ezeket alkalmazzuk, hogy leemeljük a telepeket a lemezről. A telepeket azonos tápkőzegben 12 órán át vagy tovább, hogy sokszorozzuk a plazmidkópiaszámot. A sokszorozott telepeket 55 (teleppel felfelé) kezeljük a szűrőket sorozatban 2 Whatman 3 MM papírdarabra helyezve, amelyek mindegyike a következő oldatokkal van telítve:
(1) 50 mmól/liter glükóz - 25 mmól/liter Trisz-HCl (pH=8,0)-10 mmól/liter EDTA (pH=8,0), ötpercen át; 60 (2) 0,5 mól/liter NaOH tíz percen át; és (3) 1,0 mól/liter Trisz-HCl (pH=7,5) három percen át A szűrőket ezután levegőn szárítjuk vákuumban 80 °C feletti hőmérsékleten két órán át.
A szűrőket ezután K Proteináz emésztésnek vetjük alá egy olyan oldattal végzett kezelés útján, amely mikrogramm/ml proteázenzimet tartalmaz K pufferben [0,1 mól/liter Trisz-HCl (pH=8;0) - 0,15 mól/liter NaCl - 10 mmól/liter EDTA (pH=8,2) - 0,2% SDS]. Részletesebben, 5 ml ilyen oldatot adunk minden egyes szűrőhöz és az emésztést hagyjuk végbemenni 55 °C hőmérsékleten 30 percen át, amely után az oldatot eltávolítjuk.
A szűrőt azután 4 ml előhibridizáló puffeirel kezeljük (5’SSPE - 0,5% SDS - 100 mikrogramm/ml SS E.coli DNS - 5«BFP). Az előhibridizálási kezelést 55 ’C hőmérsékleten hajtjuk végre, általában 4 órán át vagy tovább, amely után az előhibridizáló puffért eltávolítjuk.
A hibridizálási folyamatot a következő módon hajtjuk végre. Mindegyik szűrőhöz 3 ml hibridizáló puffért adunk (5’SSPE - 0,5% SDS - 100 mikrogramm/ml élesztő tRNS), amely 0,025 pikomólt tartalmaz a U. táblázat 128 vizsgálóminta szekvenciájának mindegyikéből (a teljes keveréket EPV keveréknek jelöljük) és a szűrőt 48 °C hőmérsékleten tartjuk 20 órán át. Ez a hőmérséklet 2 ’C-kal kevesebb, mint a vizsgálőminták bármelyikéhez megállapított számított disszociációs hőmérsékletek (Td) legalacsonyabbika.
A hibridizálást követóén a szűrőket háromszor mossuk 10 percig egy rázőgépen 6*SSC - 0,1% SDS keverékkel a hibridizálási hőmérsékleten (48 °C).
A szűrők autoradiográfiája hét pozitív kiónt tár fel az átvizsgált 200 000 telepből.
A feltételezett majom cDNS-klónok egyikének (jelzése: 83. klón) kezdeti szekvenciaanalízisét bizonyítási célból Wallace és munkatársai módszereinek [Gene, 16,21-26 (1981)] módosított változatával végezzük el. Röviden, a 83. majom cDNS-klónből számazó plazmid DNS-t linearizáljuk EcoRI-gyel emésztve és denaturáljuk forró vizes fürdőben melegítve. A nukleotidszekvencíát Sanger és munkatársai didezoxi-módszerével határozzuk meg [P.N.A.S. (USA), 74, 5463-5467 (1977)]. A vizsgálati minták EPV keverékének egy alsorozatát, amely 16 szekvenciából áll, alkalmazzuk primer mintaként a szekvenciaképző reakciókhoz.
C) Majom EPO-hoz tartozó cDNS-szekvencia elemzése
A 83. klón nukleotidszekvencia elemzését Messing módszere [Methods in Enzymology, 101, 20-78 (1983)] szerint hajtjuk végre. AIV. táblázat a 83. klón mintegy 1600 bázispárból álló EcoRI/HíndlII klónozott fragmensének előzetes restrikciós térképelemzése.
A restrikciós endonukleázenzim-felismeróhelyek hozzávetőlees elhelyezkedését a 3’ bázisok számával adjuk meg az EcoBl helyig a fragmens 5’ végénél. A nukleotidszekvencia-elemzést az egyes restrikciós fragmensek szekvencia-meghatározásával hajtjuk végre azzal a szándékkal, hogy összeválogassuk az átfe12
HU 204 889 Β dőfragmenseket. így pl. szekvencia- információknak egy átfedését nyújtja a nukleotidok analízise a Cl 13mal jelzett restrikciós fragmensben (SauiA ~111nél/Smal ~324-nél) és a C73-mal jelzett fragmens fordított sorrendű szekvenciaelemzése (Alul ~424- 5 néVBstEQ. ~203-nál).
IV. táblázat
| Restrikciós enzimfelismerőhely | Hozzávetőleges elhelyezkedés(ek) | 10 |
| EcoRI | 1 | |
| Sau3A | 111 | |
| Smal | 180 | 15 |
| BstEII | 203 | |
| Smal | 324 | |
| KpnI | 371 | |
| Rsal | 372 | |
| Alul | 424 | 20 |
| PstI | 426 | |
| Alul | 430 | |
| Hpal | 466 | |
| Alul | 546 | |
| PstI | 601 | 25 |
| PvuH | 604 | |
| Alul | 605 | |
| Alul | 782 | |
| Alul | 788 | |
| Rsal | 792 | 30 |
| PstI | 807 | |
| Alul | 841 | |
| Alul | 927 | |
| Ncol | 946 | |
| Sau3A | 1014 | 35 |
| Alul | 1072 |
| Restrikciós enzimfelismeróhely | Hozzávetőleges elhelyezkedés(ek) |
| Alul | 1115 |
| Alul | 1223 |
| PstI | 1301 |
| Rsal | 1343 |
| Alul | 1384 |
| HindlH | 1449 |
| Alul | 1450 |
| Hindin | 1585 |
A mintegy 1342 bázispár szekvenciaelemzése (a Saul A 3’ hely és az EcóRl hely és a Hindül hely közt átíveld területen belül) és az összes lehetséges leolvasókeret elemzése lehetővé teszi a DNS- és aminosavszekvencia-információ kifejlesztését, amely az V. táblázatban látható. Ebben a táblázatban az érett EPO aminoterminális feltételezett kiindulási aminosavát (amint ezt a 20 aminoterminális gyök korábban említett szekvenciaanalízisével összefüggésben igazoltuk) a +1 számmal jelöljük. A metioninra fajlagos ATG kodon (-27 jelzésű) az érett fehérje aminosav-szekvenciájában első gyöknek jelzett kiindulási aminoterminális gyöktől „felfelé” jelzi annak valószínűségét, hogy az EPO kezdetben a citoplazmában prekurzor formájában fejeződik ki, magában foglalva azt a 27 aminosavból álló „vezető” területet, amely lehasad, mielőtt az érett EPO a véráramba lépne. A lehetséges glükozilezési helyeket a polipeptiden belül csillaggal jelöljük. A transzlációs terület becsült molekulatömegét 21,117 daltonnak határozzuk meg, és az érett majom EPO-t alkotó, 165 gyökből álló polipeptid molekulatömegét 18,236 daltonnak határozzuk meg.
V. táblázat
A majom EPO-cDNS transzlációja
Sau3A
GATCCCGCGCCCCCTGGACAGCCGCCCTCTCCTCCAGGCCCGTGGGGCTGGCCCTGCCC
CGCTGAACTTCCCGGGATGAGGACTCCCGGTGTGGTCACCGCGCGCCTAGGTCGCTGAG -27 -20
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp
GGACCCCGGCCAGGCGCGGAGATG GGG GTG CAC GAA TGT CCT GCC TGG -10
| Leu | Trp | Leu | Leu | Leu | Ser | Leu | Val | Ser | Leu | Pro | Leu | Gly | Leu | Pro |
| CTG | TGG | CTT -1 | CTC +1 | CTG | TCT | CTC | GTG | TCG | CTC | CCT | CTG | GGC 10 | CTC | CCA |
| Val | Pro | Gly | Ala | Pro | Pro | Arg | Leu | Ile | Cys | Asp | Ser | Arg | Val | Leu |
| GTC | CCG | GGC | GCC | CCA | CCA | CGC | CTC 20 | ATC | TGT | GAC | AGC * | CGA | GTC | CTG |
| Glu | Arg | Tyr | Leu | Leu | Glu | Ala | Lys | Glu | Ala | Glu | Asn | Val | Thr | Met |
| GAG | AGG | TAC 30 | CTC | TTG | GAG | GCC | AAG | GAG | GCC | GAG * | AAT | GTC 40 | ACG | • ATG |
| Gly | Cys | Ser | Glu | Ser | Cys | Ser | Leu | Asn | Glu | Asn | Ile | Thr | Val | Pro |
| GGC | TGT | TCC | GAA | AGC | TGC | AGC | TTG | AAT | GAG | AAT | ATC | ACC | GTC | CCA |
| Asp | Thr Lys | Val | Asn | Phe | Tyr | Alá | Trp | Lys | Arg Met | Glu | Val | Gly |
| GAC | ACC AAA | . GTT | AAC | TTC | TAT | GCC | TGG | AAG | AGG ATG | GAG | GTC | GGG |
| 60 | 70 | |||||||||||
| Gin | Gin Alá | Val | Glu | Val | Trp | Gin | Gly | Leu | Alá Leu | Leu | Ser | Glu |
| CAG | CAG GTC | GTA | GAA | GTC | TGG | CAG ΟΛ | GGC | : ctg | GCC CTG * | CTC | TCA | GAA |
| Alá | Val Leu | Arg | Gly | Gin | Alá | oU Val | Leu | Alá | Asn Ser | Ser | Gin : | Pro |
| GCT | GTC CTG | CGG | GGC | CAG | GCC | GTG | TTG | GCC | AAC TCT | TCC | CAG | CCT |
| 90 | 100 | |||||||||||
| Phe | Gin Pro | Leu | Gin | Leu | His | Met | Asp | Lys | Alá Ile | Ser | Gly | Leu |
| TTC | GAG CCC | CTG | CAG | CTG | CAC | ATG | GAT | AAA | GCC ATC | AGT | GGC | CTT |
| 110 | ||||||||||||
| Arg | Ser Ile | Thr | Thr | Leu | Leu | Arg | Alá | Leu | Gly Alá | Gin | Glu | Alá |
| CGC | AGC ATC | ACC | ACT | CTG | CTT | CGG | GCG | CTG | GGA GCC | CAG | GAA | GCC |
| 120 | 130 | |||||||||||
| Ile | Ser Leu | Pro | Asp | Alá | Alá | Ser | Alá | Alá | Pro Leu | Arg | Thr | Ile |
| ATC | TCC CTC | CCA | GAT | GCG | GCC | TCG | GTC | GTC | CCA CTC | CGA | ACC | ATC |
| 140 | ||||||||||||
| Thr | Alá Asp | Thr | Phe | Cys | Lys | Leu | Phe | Arg | Val Tyr | Ser Asn Ϊ | Phe | |
| ACT | GCT GAC | ACT | TTC ' | TGC AAA ' | CTC TTC CGA GTC TAC TCC AAT TTC | |||||||
| 150 | 160 | |||||||||||
| Leu | Arg Gly | Lys | Leu | Lys | Leu | Tyr | Thr | Gly | Glu Alá | Cys | Arg | Arg |
| ere | CGG GGA | AAG | CTG | AAG | CTG | TAC | ACG | GGG | GAG GCC | TGC | AGG | AGA |
Gly Asp Arg OP
CGG GAC AGA TGA CCAGGTGCGTCCAGCTGGGCACATCCACCACCTCCCTCACCAACA
CTGCCTGTGCCACACCCTCCCTCACCACTCCCGAACCCCATCGAGGGGCTCTCAGCTAAG
CGCCAGCCTGTCCCATGGACACTCCAGTGCCAGCAATGACATCTCAGGGGCCAGAGGAAC
TGTCCAGAGCACAACTCTGAGATCTAAGGATGTCGCAGGGCCAACTTGAGGGCCAGAAGC
AGGAAGCATTCAGAGAGCAGCTTTAAACTCAGGAGCAGAGACAATGCAGGGAAAACACCT
GAGCTCACTCGGCCACCTGCAAAATTTGATGCAGGACACGCTTTGGAGGCAATTTACCTG
TnTTGCACCTACCATCAGGGACAGGATGACTGGAGAACrTAGGTGGCAAGCTGTGACTT
CTCAAGGCCTCACGGGCACTCCCTTGGTGGCAAGAGCCCCCTTGACACTGAGAGAATATT
TTGCAATCTGCAGCAGGAAAAATTACGGACAGGTnTGGAGGTTGGAGGGTACITGACAG
GTGTGTGGGGAAGCAGGGCGGTAGGGGTGGAGCTGGGATGCGAGTGAGAACCGTGAAGAC
AGGATGGGGGCTGGCCTCTGGTTCTCGTGGGGTCCAAGCTT
HindfS.
Az V. táblázat szerinti polipeptidet könnyen alá lehet vetni nagyon hidrofil területek és/vagy olyan szekunder konformációs jellemzők elemzésének, amelyek potenciálisan nagyon immunogén területekre utalnak, ilyen elemzés végezhető Hopp és munkatársai [P.N.A.S. (USA), 78,3824-3828 (1981)1 és Kyte és munkatársai [J. Mól. Bioi. 157,105-132 (1982)] és/vagy Chou és munkatársai [Biochem., 13,222-245 (1974)] módszerével és az Advances in Enzimology, 47, 45-47 (1978) irodalmi helyen leírt módszerrel. A Hopp és munkatársai szerinti komputerrel segített módszer rendelkezésre áll egy program segítségével, amelyet PÉP Reference Section 6.7nek neveznek, és amely az Jntelligenetics, Inc.-nél kapható (124 University Avenue, Palo Alto, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok).
4. példa
A) Humán genomkönyvtár
Ch4A fág eredetű humán embriómáj genomkönyvtárat, amelyet Lawn és munkatársai eljárásával készítünk [Cell, 18, 533-543 (1979)], kapunk és tartunk fenn egy plakk hibridizálási vizsgálatban való felhasználáshoz.
HU 204 889 Β
B) Plakk hibridizálási eljárás humán genomkönyvtár átvizsgálásához Fágrészecskéket lizálunk és a DNS-eket szűrőkön rögzítjük (50 000 pakk/szűrő) Woo eljárása szerint [Methods in Enzimology, 68, 389-395 (1979)], kivéve a Gene Screen Plus szűrőket (New England Nuclear Catalogy, NEF-976 szám) és NZYAM lemezeket [NaCI, 5 g; MgCh’óHaO, 2 g; NZ-Amin A, 10 g; élesztőkivonat, 5 g; kazaminosav (hidrolizált kazein), 2 g; maltőz, 2 g; és agar, 15 g/liter].
A levegőn szárított szűrőket 80 °C hőmérsékleten sütjük 1 órán át, majd emésztjük K Proteinázzal, amint ezt a 3. példa B) részében leírtuk. Előhibridizálást hajtunk végre 1 mól/liter NaCl-1% SDS pufferben 55 'C hőmérsékleten 4 órán át vagy tovább, ezután pedig a puffért eltávolítjuk. A hibridizálás utáni mosásokat olyan módon hajtjuk végre, ahogyan ezt a 3. példa b) részében leírtuk. Mind a 128 20-mer vizsgálóminta-keveréket, amelyet EPV-vel jelölünk, mind a 128 17-mer vizsgálóminta-keverékét a III. táblázat szerint (amelyet EPQ keveréknek nevezünk) alkalmazzuk. A hibridizálást 48 ’C hőmérsékleten hajtjuk végre az EPV próbakeverékét használva. Az EPQ vizsgálóminta-keverékkel a hibridizálást 46 °C hőmérsékleten hajtjuk végre, ez 4 °C-kal alatta van a keverék tagjaihoz kalkulált legalacsonyabb Td-értéknek. A hibridizáló próbakeverék eltávolítását az újrahibridizáláshoz forralással hajtjuk végre 1«SSC 0,1% SDS-sel két percen át. A szűrők autoradiográfiája három pozitív kiónt tár fel (ezek reaktívak mindkét vizsgálóminta-keverékkel) az átvizsgált 1 500 000 átvizsgált fágplakkból. A pozitív kiónok bizonyítását arra nézve, hogy ezek EPO-t kódoló kiónok, DNS-szekvenciaelemzéssel, és a 3. példa majom cDNS-ével történő heteroduplex-képzés elektronmikrográfiás megjelenítésével nyerjük. Ez az eljárás szintén bizonyítékot ad a sokszoros intronokról a genom DNS-szekvenciában.
5. példa
A pozitív kiónok közül az egyik (XhEl jelű) nukleotidszekvencia elemzését végrehajtjuk, és az eddig nyert eredményeket a VI. táblázatban adjuk meg.
VI. táblázat
AAGCTTCTGGGCTTCCAGACCCAGCTACTTTGCGGAACTCAGCAACCCAGGCATCTCTGAGTCTCCGCCCA
AGACCGGGATGCCCCCCAGGGGAGGTGTCCGGGAGCCCAGCCTTTCCCAGATAGCACGTCCCGCCAGTCCC
AAGGITGCGCAACCGGCTGCACTCCCCTCCCGCGACCCAGGGCCCGGGAGCAGCCCCCATGACCCACACGC
ACGTCTGCAGCAGCCCCGCTCACGCCCCGGCGAGCCTCAACCCAGGCGTCCTGCCCCTGCTCTGACCCCGG
GTGGCCCCTACCCCTGGCGACCCCTCACGCACACAGCCTCTCCCCCACCCCCACCCGCGCACGCACACATG
CAGATAACAGCCCCGACCCCCGGCCAGAGCCGXAGAGTCCCTGGGCCACCCCGGCCGCTCGCCTGCCGCTG
CGCCGCACCGCGCTGTCCTCCCGGAGCCGGACCGGGGCCACCGCGCCCXGCTCTGCTCCGACACCGCGCCC
CTTGGACAGCCGCCCTCTCCTCTAGGCCCGTGGGGCTGGCCCTGCACCGCCGAGCTTCCCGGGATGAGGXX -27 -24
Met Gly Val His
CCCGGTGACCGGCGCGCCCCAAGTCGCTGAGGGACCCCGGCCAAGCGCGGAG ATG GGG GTG CAC G
GTGAGTACTCGCGGGCTGGGCGCTCCCGGCGGCCGGGTTCCTGTTTGAGCGGGGATTTAGCGCCCCGGCT
ATTGGCCAAGAGGTGGCTGGGTTCAAGGACCGGCGACTTGTCAAGGACCCCGGAAGGGGGAGGGGGGTGGG
GCAGCCTCCACGTGCCGCGGGGACTTGGGGGAGTTCTTGGGGATGGCAAAAACCTGGCCTGTTGAGGGGCA
CAGTTTGGGGITGGGGAGGAGGTTTGGGGrrCTGCTGTGCAGTTGTGTCTGTGTCAGTGTCTCG |I.S]
TTGCACACGCACAGATCAATAAGCCAGAGGCAGCACCTGAGTGCTTGCATGGTTGGGACAGGAAGGACGAG
CTGGGGCAGAGACGTGGGGATGAAGGAAGCTGTCCTTCCACAGCCACCCTTCTCCCCCCCCGCCTGACTCT -23 -20
Glu Cys Pro Alá Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
CAGCCTGGCTATCTGTTCTAG AA TGT CCT GCC TGG CTG TGG CTT CTC CTG TCC CTG
HU 204889 Β
| -10 | -1 | +1 | ||||||||||||||
| Leu | Ser | Leu | Pro | Leu | Gly | Leu | Pro | Val | Leu | Gly | Alá | Pro | Pro | Arg | Leu | He Cys |
| CTG | TCG | CTC | CCT | CTG | GGC | CTC | CCA | GTC | CTG | GGC | GCC | CCA | CCA | CGC | CTC | ATC TGT |
| 10 | 20 | * | ||||||||||||||
| Asp | Ser | Arg | Val | Leu | Glu | Arg | Tyr | Leu | Leu | Glu | Alá | Lys | Glu | Alá | Gin | Asn Ile |
GAC AGC CGA GTC CTG GAG AGG TAC CTC TTG GAG GCC AAG GAG GCC GAG AAT ATC
Thr
ACG GTGAGACCCCTTCCCCAGCACATTCCACAGAACTCACGCTCAGGGdTCAGGGAACTCCTCCCAGAT
CCAGGAACCTGGCACTTGGTTTGGGGTGGAGTTGGGAAGCTAGACACTGCCCCCCTACATAAGAArAAGTC
TGGTGGCCCCAAACCATACCTGAAACTAGGCAAGGAGCAAAGCCAGCAGATCCTACGCCTGTGGGCCAGGG 27 30
Thr Gly Cys Alá Glu
CCAGAGCCTTCAGGGACCCITGACTCCCCGGGCTGTGTGCAnTCAG ACG GGC TGT GCT GAA * 40
His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Iíe Thr 'Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr
CAC TGC AGC TTG AAT GAG AAT ATC ACT GTC CCA GAC ACC AAA GTT AAT TTC TAT
55
Alá Trp Lys Arg Met Glu
GCC TGG AAG AGG ATG GAG GTGAGTTCCTlTITITITrriTTrCCTnCTTTTGGAGAATCTCATT
TGCGAGCCTGAmTGGATGAAAGGGAGAArGArCGGGGGAAAGGTAAAATGGAGCAGCAGAGATGAGGCT
GCCTGGGCGCAGAGGCTCACGTCTATAATCCCAGGCTGAGATGGCCGAGATGGGAGAATTGCTTGAGCCCT
GGAGTTTCAGACCAACCTAGGCAGCArAGTGAGArCCCCCATCTCTACAAACAnTAAAAAAAITAGTCAG
GTGAAGTGGTGCATGGTGGTAGTCCCAGATATTTGGAAGGCTGAGGCGGGAGGArCGCTTGAGCCCAGGAA
TTTGAGGCTGCAGTGAGCTGTGATCACACCACTGCACTCCAGCCTCAGTGACAGAGTGAGGCCCTGTCTCA
AAAAAGAAAAGAAAAAAGAAAAATAArGAGGGCTGTATGGAATACATTCAITATrCATCCACTCACTCACT
CACTCAITCAITCATrCAITCAITCAACAAGTCTTArrGCATACCTTCTGTTrGCTCAGCrrGGTGCTTGG
GGCTGCTGAGGGGCAGGAGGGAGAGGGTGACATGGGTCAGCTCGACTCCCAGAGTCCACTCCCTGTAG
| 56 | 60 | 70 |
| Val Gly Gin | Gin Alá Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Alá | Leu Leu Ser Glu Alá |
| GTC GGG CAG | CAG GCC GTA GAA GTC TGG CAG GGC CTG GCC CTG CTG TCG GAA GCT | |
| 80 * | 90 | |
| Val Leu Arg | Gly Gin Alá Leu Leu Val Asn Ser Ser Gin | Pro Trp Glu Pro Leu |
| GTC CTG CGG | GGC CAG GCC CTG TTG GTC AAC TCT TCC CAG | CCG TGG GAG CCC CTG |
| 100 | ||
| Gin Leu His | Val Asp Lys Alá Val Ser Gly Leu Arg Ser | Leu Thr Thr Leu Leu |
| CAG CTG CAT | GTG GAT AAA GCC GTC AGT GGC CIT CGC AGC | CTC ACC ACT CTG CIT |
| 110 | 115 | |
| Arg Alá Leu | Gly Alá Gin |
CGG GTC CTG GGA GCC CAG GTGAGTAGGAGCGGACACTTCTGCTTGCCCTTTCTGTAAGAAGGGGA
GAAGGGTCTTGCTAAGGAGTACAGGAACTGTCCGTATTCCTTCCCITTCTGTGGCACTGCAGCGACCTCCT 116 120
Lys Glu Alá He Ser Pro Pro Asp Alá Alá Ser Alá Alá GTTTTCTCCTTGGCAG AAG GAA GCC ATC TCC CCT CCA GAT GCG GCG TCA GTC GTC
130 140
Pro Leu Arg Thr He Thr Alá Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser CCA CTC CGA ACA ATC ACT GCT GAC ACT TTC CGC AAA CTC TTC CGA GTC TAC TCC
HU 204 889 Β
150 160
Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Alá Cys Arg Thr Gly AAT TTC CTC CGG GGA AAG CTG AAG CTG TAC ACA GGG GAG GCC TGC AGG ACA GGG
Asp Arg OP
GAC AGA TGA CCAGGTGTGTCCACCTGGGCATATCCACCACCTCCCTCACCAACATTGCITGTGCCACA
CCCTCCCCCGCCACTCCTGAACCCCGTCGAGGGGCTCTCAGCTCAGCGCCAGCCTGTCCCATGGACACTCC
AGTGCCAGCAATGACATCTCAGGGGCCAGAGGAACTGTCCAGAGAGCAACTCTGAGATCTAAGGATGTCAC
AGGGCCAACITGAAGGGCCCAGAGCAGGAAGCAITCAGAGAGCAGCnTAAACTCAGGGACAGAGCCATGC
TGGGAAGACGCCTGAGCTCACTCGGCACCCTGCAAAATTTGATGCCAGGACACGCTTTGGAGGCGATITAC
CTGITTTCGCACCTACCATCAGGGACAGGATGACCTGGAGAACITAGGTGGCAAGCTGTGACTTCTCCAGG
TCTCACGGGCATGGGCACTCCCTTGGTGGCAAGAGCCCCCTTGACACCGGGGTGGTGGGAACCATGAAGAC
AXGATXGGGGCTGGCCTCTGGCTCTCATGGGGTCCAAGTTTTGTGTAITCTCAACCTAITGACAGACTGAA
ACACAATATGAC
A VI. táblázatban a kezdeti folyamatos DNS-szek- tározott aminosavgyököt (becsült molekulatövencia egy 620 bázisból álló első szálat jelöl, amely- 25 ben nyilvánvalóan a humán EPO-gén lefordított szakaszát közvetlenül megelőző le nem fordított szekvencia van. Részletesebben a szekvencia, úgy tűnik, annak a génnek az 5’ részét tartalmazza, amely egy vezetőszekvencia („preszekvencia”) első négy ami- 30 nosavát (-27-től -24-ig) kódoló lefordított DNS-területhez vezet fel. Négy bázispár a szekvenciában a vezető kezdetét kódoló szekvencia előtt még nincs kétségen kívül meghatározva, ezért jelöljük „X”-nek.
Ezt követi azután egy intron mintegy 639 bázispárral 35 (amelyből 439 bázispár szekvenciaelemzését elvégeztük, és a fennmaradó 200 bázispárt jelöljük „I.S”nek), és ez közvetlenül megelőz egy glutaminhoz szolgáló kodont, amelyet a lefordított polipeptid-23 gyökeként jelölünk. Az ezt közvetlenül követő exon- 40 szekvenciáról látható, hogy kódolja az aminosavgyököket az alaningy öktől (+1 jelöléssel az érett humán EPO aminosav-szekvenciájában) a +26. helyen levő treoning, ezután következik egy második intron, amely 256 bázist tartalmaz, amint ezeket részletesen 45 jelöljük. Ezt az intront egy exonszakasz követi a 27. aminosavgyöktől az 55.-ig, majd egy 612 bázispárt tartalmazó intron kezdődik. Az ezt követő exon a humán EPO 56-115. gyökeit kódolja és ezután kezdődik egy negyedik intron 134 bázispárral. A negye- 50 dik intront követően a 116-166, gyököket kódoló exon és egy „stop kodon (TGA) található. Végül a VI. táblázat azonosít egy 568 bázispárból álló szekvenciát, amely a humán EPO-gén egy le nem fordított 3 ’ területének tűnik, amelyből két bázispár szekven- 55 ciáját még nem határoztuk meg kétséget kizáróan („X”).
A VI. szerkezet tehát arra szolgál, hogy azonosítsa az érett humán EPO elsődleges szerkezeti konformációját (aminosav-szekvencia), beleértve 166 meghameg=18,399). A táblázat feltárja azt a 27 gyökös vezetőszekvenciát kódoló DNS-szekvenciát is az 5’ és 3’ DNS-szekvenciák mentén, amely fontos lehet a humán gén operon promotor/operátor funkcióihoz. Az érett humán EPO polipeptid lehetséges glikozilezési helyeit a táblázatban csillaggal jelöljük. Érdemes megjegyezni, hogy a VI. táblázat fajlagos aminosavszekvenciája valószínűleg a humán eritropoietin természetben előforduló allélformájának szekvenciáját alakítja ki. Ennek a helyzetnek a támogatása található meg a humán eritropoietin vizelet-izolátumainak szekvenciaelemzésénél végzett folyamatos erőfeszítések eredményeiben, amelyek azt a felismerést nyújtják, hogy eritropoietin molekulák jelentős száma rendelkezik egy 126. metioningyökkel, ellentétben a táblázatban levő szerinnel. Az alábbi VII. táblázat a polipeptidszekvencia- homológia mértékét mutatja be a humán és a majom EPO között. A táblázatban levő felső folyamatos vonalban az egyes betűjeleket úgy alkalmazzuk, hogy a -27-tel kezdődő humán EPO következtetett, lefordított polipeptid szekvenciáját reprezentálják, és az alsó folyamatos vonal mutatja a -27 számmal jelölt gyöknél kezdődő majom EPO kikövetkeztetett polipeptidszekvenciáját. Csillagokat alkalmazunk, hogy megvilágítsuk a szekvencia-homológiákat. Meg kell jegyeznünk, hogy a kikövetkeztetett humán és majom EPO szekvenciák feltárnak egy „többlet” lizin (K) gyököt a (humán) 116. helyzetnél. A VI. táblázattal végzett kereszt- összehasonlítás azt jelzi, hogy ez a gyök a vélt mRNS összeillesztés elágazás peremén van a genomszekvenciában. A lizingyök jelenlétét a humán polipeptidszekvenciában tovább igazoltuk a humán genom DNS-sel transzformált COS-1 sejtekből izolált mRNS-ből készített cDNS humán szekvenciaklónok szekvenciaelemzésével a későbbi 7. példában.
HU 204889 Β
VII. táblázat
A humán és majom EPO polipeptidek összehasonlítása
-20 -10 +1 10 20 30
Humán: MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENnTGCA ***:(:**************** ******** ******************************* * **
Majom: MGVHECPAWLWLLLSLVSLPLGLPVPGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENVTMGCS
50 60 70 80 90
Humán: EHCSLNENTTVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEP * *************************************************************** * ******* ** Majom: ESCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQAVLANSSQPFEP
100 110 120 130 140 150
Humán: LQLHVDKAVSGLRSLTTLLRAEGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLERVYSNFLR ***** **** ****** ************* **** ********************* **************
Majom: LQLHMDKAISGLRSnTLLRALGAQ-EAISLPDAASAAPLRTITADTFCKLFRVYSNFLR 160
Humán: GKLKLYTGEACRTGDR
Majom: GKLKLYTGEACRRGDR
6. példa
A kezdeti kísérletekhez kiválasztott kifejeződési rendszer a 3. példa szerinti eljárással szolgáltatott majom cDNS által kódolt EPO polipeptid izolálható mennyiségének mikrobiológiai szintézisénél olyan 25 rendszer, amely emlős gazdasejteket (azaz COS-1 sejteket, ATCC CRL-1650) foglal magában. A sejteket egy „ingázó” vektorral fertőzzük át, amely képes autonóm replikációra E.coli gazdaszervezetben (pBR322 eredeti DNS jelenléténél fogva) és emlős 30 gazdaszervezetben (SV40 vírus eredetű DNS jelenléténél fogva).
Még részletesebben, egy kifejeződő vektort alkotunk meg a kővetkező eljárások szerint. A 3. példában szolgáltatott 83. plazmidklőnt sokszorozzuk E.coli-ban 35 és a mintegy 1,4 kb-s majom EPO-t kódoló DNS-t izoláljuk EcoRI és HindSl emésztéssel. pBR322-ből külön egy mintegy 4,0 kb-s HindWSaR fragmenst izolálunk. Egy mintegy 30 bp-s, Ecó&HSaR „linker” (kapcsoló) fragmenst nyerünk M13mpl0 RF DNS-ból 40 (P and L Laboratories). Ez a kapcsoló magában foglal sorba kapcsolva egy EcoRI „tapadós” véget, ezt követik az Sirl, őíműI, BamHI és Xbal felismerőhelyek és egy Sáli „tapadós” vég. A fenti három fragmenst ligáljuk egy mintegy 5,4 kb-s intermedier plazmidot 45 („pERS”) nyújtva, ahol az EPO DNS egyik oldalon hasznos restrikciós endonukleáz-felismerőhelyek „bankijával van szegélyezve. A pERS-t azután HindíII-mal és őa/I-gyel emésztjük, hogy az EPO DNS-t és az EcoSl-et nyújtsuk a SalL (M13mpl0) kapcsolóhoz. 50 Az 1,4 kb-s fragmenst ligáljuk pBR322 BamHIZSall mintegy 4,0 kb-s fragmenséhez és egy másik M13mpl0 HindíElBamRL RF fragmens kapcsolóhoz, amely mintegy 30 bp-vel rendelkezik. Az M13 kapcsolőfragmenst egy „tapadós” HindSL véggel jellemezzük, 55 amelyet Pstl, Sáli és Xbal felismerőhelyek és egy BamHI „tapadós” vég követ. A Ilgációs tennék ismét egy hasznos intermedier plazmid („pBR-EPO”), amely magában foglalja az EPO DNS-t, mindkét oldalán restrikciós helyek „bankijával szegélyezve. 60
Az EPO DNS COS-1 sejtekben való kifejeződéshez kiválasztott vektort („pDSVLl”) már korábban megalkották, hogy lehetővé tegyék a kiválasztást és autonóm replikációt E.coliban. Ezeket a jellemzőket a replikációs origó és az ampicillin-rezisztenciagén DNS-szekvenciák, amelyek a pBR322 2448 és 4362 nukleotidjai közti területben vannak jelen, szolgáltatják. Ezt a szekvenciát szerkezetileg módosítja egy kapcsoló (linker) hozzáadása, amely egy HindSL felismerőhelyet biztosít közvetlenül a 2448. nukleotid szomszédságában a vektorba való beépülés előtt. A kiválasztott vektor más hasznos tulajdonságai között van az autonóm rekpikáció képessége COS-1 sejtekben és egy, az emlős sejtekben funkcionális vírus eredetűpromotor jelenléte. Ezeket a jellemzőket a replikáciő DNS-szekvenciájának kiindulása („origin”), és az 5171. számú nukleotid és az SV40 genom 270. nukleotidja közt elterülő 342 bp-s szekvenciában jelen levő „késői gén” vfruspromotor DNS-szekvencia szolgáltatja. Egy egyedi restrikciós helyet nyújtunk a vektorban (BamHI), amely közvetlenül szomszédos a víruspromotor szekvenciával, egy kereskedelemben kapható kapcsoló („linker”) szekvencia alkalmazása révén (Collaborative Research). A vektorba be van építve még egy 237 bázispáros szekvencia (amely az SV40 2553-2770 számú nukleotidja közti részről származik), amely a „késői gén” vírus mRNS poliadenilező jelet (szignált) tartalmazza (ezt általában mint „átírási teiminátort” szokták megnevezni). Ez a fragmens a vektorban a megfelelő orientációban helyezkedik el, vis-a-vis a „késői gén” víruspromotorral az egyedi BamHI helyen át. A vektorban jelen van még egy másik emlős gén is egy olyan helyzetnél, amely nem tárgya az egyedi BamHI helynél beiktatott gén lehetséges átírásának, a víruspromotor és a terminátor szekvenciák között. [Az emlős gén tartalmaz egy mintegy 2500 bp-s egér dlhidrofolát reduktóz (DHFR) mínigént, amelyet a pMG-1 plazmidból izoláltak, lásd Gasser és munkatársai: P.N.A.S. (USA), 79,6522-6526 (1982)]. A pDSVLl fő operatív komponensei a pBR 322 2448 és 4 362 közti nukleotidjait tartalmazzák az
HU 204 889 Β
SV40 DNS 5171 és 270 közti (342 bp) és 2553 és 2770 közti (237 bp) nukleotidjaival együtt.
A már leírt eljárásokat követve (pl. Maniatis és munkatársai, fentebb idézett munka) az EPO-t kódoló DNS-t a pBR-EPO plazmádból izoláljuk, mint BűznHI fragmenst és ligáljuk BűmHI-gyel hasított pDSVLl plazmidba. Restrikciós enzimelemzést alkalmazunk, hogy bebizonyítsuk az EPO-gén korrekt irányban történő beiktatását az így létrejött klónozott vektor közül kettőben (H és L másolatvektorok). Lásd a 2. ábrát, amely a pDSVL-MkE plazmidot illusztrálja. A rossz orientációban levő EPO-génekkel rendelkező vektorokat is megőrizzük negatív kontrollként való alkalmazáshoz az átfertőzési kísérletekben, amelyeket arra szánunk, hogy meghatározzuk az EPO kifejeződési szintet a korrekt orientációban levő EPO/DNS-sel rendelkező vektorokkal tanszformált gazdasejtekben.
A H, L, F, X és G vektorokat kombináljuk hordozó DNS-sel (egérmáj és -lép DNS), és ezt alkalmazzuk, hogy másolati 60 mm-es lemezeket fertőzzünk kalcium-foszfát mikroprecipitációs módszerrel. A 60 mm-es másolati lemezeket átfertőzzük hordozó DNS-sel is, mint „ál” transzformációs negatív kontrollal. 5 nap múlva minden tenyészlevet átvizsgálunk a természetben előforduló EPO immunológiai tulajdonságaival rendelkező polipeptidek jelenlétére.
7. példa
A) Kiindulási EPO kifejeződési rendszer, beleértve a COS-1 sejteket
A humán genom DNS EPO kiónnal kódolt humán EPO polipeptidanyag izolálható mennyiségeinek mikrobiológiai szintézisénél a kiindulási kísérletekhez kiválasztott rendszer magában foglalja a kifejeződést emlős gazdaszervezet sejtjeiben is (pl. COS-1 sejtek, ATCC CRL-1650). A humán géneket először szubklónozzuk egy „ingázó” vektorba, amely képes autonóm replikációra mind E.coli gazdaszervezetben (pBR 322 eredetű DNS jelenléténél fogva), mind az emlős COS-1 emlős sejtvonalban (az SV40 vírus eredetű DNS jelenléténél fogva). Az ingázóvektort, amely a gént tartalmazza, azután átfertőzzük COS-1 sejtekbe. Az EPO polipeptidanyag azután az átfertőzött sejtekben termelődik és kiválasztódik a sejt tenyészközegbe.
Részletesebben egy kifejeződő vektort alkotunk meg a következő eljárás szerint. XhEl lambda klónból, amely a humán genom EPO-gént tartalmazza, izolált DNS-t emésztünk BawHI és 77/náIII restrikciós endonukleázokkal, és egy 5,6 kb-s DNS-fragmenst izolálunk, amelyről tudjuk, hogy tartalmazza a teljes EPOgént. Ezt a fragmenst összekeverjük és ligáljuk a pUC8 bakteriális plamzmiddal (Bethesda Laboratories, Inc.), amelyet előzőleg hasonlóképpen emésztettünk, így a „pUC8-HuE” intermedier plazmidot alkotjuk meg, amely ennek a restrikciós fragmensnek a kényelmes forrását szolgáltatja.
Az EPO DNS COS-1 sejtekben való kifejeződéséhez kiválasztott vektort (psV4SEt) már korábban megalkották. A pSV4SEt plazmid tartalmazza azokat a
DNS-szekvenciákat, amelyek lehetővé teszik a szelekciót és az autonóm replikádét E.coliban.
Ezeket a jellemzőket a replikációs kiindulás („origin”) és az ampicillin-rezisztenciagén DNS-szekvenciák, amelyek a pBR 322 2448. és 4362. nukleotidjai közti területben vannak jelen, szolgáltatják. Ezt a szekvenciát szerkezetileg módosítja egy kapcsoló („linker”) hozzáadása, amely egy HindlH fehsmerőhelyet biztosít közvetlenül a 2448. nukleotid szomszédságában. A pSV4SEt plazmid szintén képes autonóm replikációra COS1 sejtekben. Ezt a jellemzőt egy 342 bp-s fragmens szolgáltatja, amely a replikáció SV40 vírus kiindulását („origin”) tartalmazza (az 5171. és 270. számú nukleotidok között). Ezt a fragmenst módosítja egy EcoRI felismerőhelyet szolgáltató kapcsoló (linker) hozzáadása, amely egy Sáli felismerőhelyet tartalmaz az 5171. nukleotid szomszédságában. Az SV40nek egy 1061 bp-s fragmense szintén jelen van ebben a vektorban (az 1711. és 2772. nukleotidszámok között, plusz egy kapcsoló, amely egy Sáli felismerőhelyet nyújt a 2772. számú nukleotid közelében). Ezen a fragmensen belül van egy egyedi BamHI felismerőszekvencia. Összegezve, a pSV4SEt plazmid egyedi BamHI és Hindui felismerőhelyeket tartalmaz, amelyek lehetővé teszik a humán EPO-gén beiktatását, replikációt és szelekciót az E.coli-ban lehetővé tevő szekvenciákat tartalmaz, és a COS-1 sejtekben a replikációt lehetővé tevő szekvenciákat tartalmaz.
Abból a célból, hogy az Epo gént beiktássuk pSV4SEt-be, pUC8-HuE plazmidot emésztünk Bam Hl és Hind ül restrikciós endonukleázokkal és a mintegy 5,6 kb-s EPO-t kódoló DNS fragmenst izoláljuk. A pSV4SEt-t szintén emésztjük Bam ΗΙ-el és Hind ΙΠ-al és a fő, 2513 bp-s fragmenst izoláljuk (megőrizve az összes szükséges funkciót). Ezeket a fragmenseket összekeverjük és ligáljuk, megalkotva a végső vektort, a „pSVgHuEPO”-t (lásd 3. ábra). Ezt a vektort E.coliban szaporítjuk és a vektor DNS-t izoláljuk. Restrikciós enzimanalízist alkalmazunk, hogy bizonyítsuk az EPO-gén beiktatását.
A pSVgHuEPO DNS-t alkalmazzuk, hogy kifejezzük a humán EPO polipeptidanyagot COS-1 sejtekben. Részletesebben, pSVgHuEPO DNS-t kombinálunk hordozó DNS-sel és átfertőzzük három másolatban COS-1 sejtek 600 mm-es lemezeire. Kontrollként hordozó DNS-t egyedül fertőzünk át COS-1 sejtekbe. A sejttenyésztő közegből öt és hét nap után mintát veszünk és megvizsgáljuk a természetben előforduló humán EPO immunológiai tulajdonságaival bíró polipeptidek jelenlétére.
B) Második EPO kifejeződő rendszer, beleértve a
COS-1 sejteket
Egy további rendszert tervezünk humán genom DNS EPO klón által COS-1 sejtekben (ATCC CRL1650) kódolt humán EPO polipeptidanyag javított termelésének szolgáltatására.
Az ezt közvetlenül megelőző rendszerben az EPO COS-1 sejtekben fejeződik ki saját promotorját alkalmazva, amely az 5,6 kb-s BamHI-HindílI restrikciós
HU 204 889 Β fragmensen belül van. A következő konstrukcióban az
EPO-gén úgy változik, hogy ez az SV40 „késői” promotort használva fejeződik ki.
Részletesebben a klónozott, 5,6 kb-s genom humán
EPO BamHI-HlndHI restrikciós fragmenst a következő eljárással módosítjuk. A pUC8-HuE plazmidot a fentebb leírtak szerint RűwzHI és BstEH restrikciós endonukleázofckal hasítjuk. ABsíEH az 5,6 kb-s EPO-génen belül hasít annál a helyzetnél, amely 44 bázispárra van az 5’ irányban a prepeptidet kódoló kiindulási ATG-től és 3’ irányban mintegy 680 bázíspárra van a HindSL restrikciós helytől. A mintegy 4900 bázispáros fragmenst izoláljuk. Szintetikus kapcsoló (linker) frag menst, amely SalL és TtaSH „tapadós” végeket és belső .BűímHI felismerőhelyet tartalmaz, szintetizálunk és tisztítunk. A két fragmenst összekeverjük pBR 322 plazmiddal, amelyet előzőleg őa/I-gyel és Bű/nHI-gyel hasítottunk, így nyerjük a pBRgHE intermedier plazmidot. A genom humán EPO-gént ebből izolálhatjuk, mint 4900 bázispáros SamHI-emésztett fragmenst, amely hordozza a teljes struktúrgént egy egyedi ATGvel, 44 bázispárral 3’ irányban az aminoteiminálist kódoló területtel szomszédos BatriHI helytől.
Ezt a fragmenst izoláljuk és Tta/nHI fragmensként beiktatjuk Rű/nHi-gyel hasított pDSVLl kifejeződő vektorplazmidba (amelyet a 6. példában írtunk le). Az így létrejött plazmidot, amelyet a 4. ábrában mutatunk be, alkalmazzuk az EPO polipeptidanyag kifejeződésére COS-1 sejtekből, amint ezt a 6. és 7. A) példákban leírtuk.
8. példa
A 6. példa hat átfertőzött COS-1 tenyészetének növekedéséből származó tenyészlevet elemzőnk radioimmunassayval a 2. példa B) részében már korábban leírt ! módszer szerint Minden mintát 250, 125, 50 és 25 mikroliter alikvot szinten mérünk. Az „ál”-fertőzött vagy a helytelen EPO-gén orientációval rendelkező vektorral fertőzött sejtek növesztéséből származó felülúszók kétségtelenül negatívak az immunreaktivitás 2 szempontjából. A helyes orientációban lévőEPO DNSsel bíró vektorokkal (H és L) átfertőzött COS-1 sejtek növesztéséből származó két felülúsző mindegyik mintájánál a 125I-EPO-nak az antitesthez való kötésének %-os gátlása 72% és 88% közötti tartományban van. 4 Az EPO pontos koncentrációját a tenyészet felülúszóban nem lehet azután pontosan felbecsülni. Egy egészen hagyományos becslést végezve azonban 300 milliegység/ml-t becsiünk a legnagyobb alikvotméret (250 mikroliter) értékkalkuláciőjából. 5
A 6. példa szerint nyert tenyészfolyadék egy reprezentatív mintáját és a 7. A) példa szerint nyert öt és hét napos tenyészfolyadékokat vizsgálunk RIA-val (radioimmunassay) abból a célból, hogy összehasonlítsuk a rekombináns majom és humán EPO-anyagok aktivitá- 5· saít egy természetben előforduló EPO standarddal, az eredményeket grafikus formában az 1. ábrában adjuk meg. Röviden, az eredmények a várt módon feltárják, hogy a rekombináns majom EPO jelentősen verseng az antihumán EPO-antítestért, bár nem képes teljesen gá- 6( tolni a kötést a vizsgálat körülményei között. A maximális százalékos gátlást értékek a rekombináns humán EPO-hoz azonban szorosan megközelítették a humán EPO standard értékeit. A dózisválaszgörbék párhuza) mos természete általában a szekvenciák (epitópok) immunológiai azonosságát sugallja. A majom EPO előzetes becsléseit a tenyészfolyadékban újraértékeljük ezeknél a nagyobb hígítást szinteknél, és ezeket a 2,91 és 3,12 egység/ml tartományban találjuk. A becsült
D humán EPO termelési szintek megfelelően beállnak 392 milliegység/ml-re az 5 napos növekedési mintánál és 567 milliegység/ml-re a 7 napos növekedési mintánál. A 7. B) példa szerinti kifejeződő rendszerben a becsült majom EPO termelési szint hasonló nagyság5 rendi, vagy jobb.
9. példa
A 6. és 7. példa szerinti készített tenyészfolyadékokat in vitro mérésnek vetjük alá EPO aktivitásra Gold) wasser és munkatársainak eljárása szerint {EndocrinoIogy, 97(2), 315-323 (1975)]. A becsült majom EPOértékek a vizsgált tenyészfolyadékoknál 3,2 és 4,3 egység/ml között vannak. A humán EPO tenyészfolyadékok szintén aktívak ebben az in vitro mérési módszer> ben, továbbá ezt az aktivitást lehet semlegesíteni antiEPO-antitesttel. A 6. példa szerinti rekombináns majom EPO tenyészfolyadékokat alávetettük egy in vivő biológiai aktivitásmérésnek is Cotes és munkatársainak [Natúré, 191, 1065-1067 (1961)] és Hammond és munkatársainak [Ann. N.Y. Acad. Sci. 149, 516-527 (1968)] általános módszerei szerint, és 0,94 és 1,24 egység/ml közti aktivitás értékeket nyerünk.
10. példa
A korábbi példákban rekombináns majom vagy humán EPO anyagot termeltünk a COS-1 sejtekbe átfertőzésre használt vektorokból. Ezek a vektorok replikálódnak COS-1 sejtekben az SV40 T antigén jelenléte miatt a sejtben és egy SV40 replikációs kiindulás (origin) jelenléte miatt a vektorban. Bár ezek a vektorok hasznos mennyiségű EPO-t termelnek COS-1 sejtekben, a kifejeződés csupán átmeneti (7-14 nap) a vektor lehetséges elvesztése miatt. Ezenkívül a COS-l-nek csupán egy kis százaléka fertőződik át produktívan a vektorral. A jelen példa leír olyan kifejeződő rendszereket, amelyek kínai hőrcsőgpetefészek (CHO) DHFR'-sejtjeit és a DHER szelektálható rendszert tartalmazzák. [A rokon kifejeződő rendszerek tárgyalásához lásd: 4, 399,216 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és 117 058, 117 059 és 117 060 európai szabadalmi bejelentések, amelyek 1984. augusztus 29-én lettek közzétéve].
A CHO DHFR'-sejtekben (Dux-Bll) és a CHO Klsejtekben [Urlaub és munkatársai: Proc. Nat Acad. Sci. (USA), 77,4461 (1980)] hiányzik a dihidrofolát reduktáz enzim a struktúrgénekben történt mutációk következtében és ezért a tápkőzegben glicin, hipoxantin és timidin jelenlétét igénylik. A pDSVL-MKE plazmidot (6. példa) vagy a pDSVL-gHuEPO plazmidot [7. B) példa] átfertőzzük egy hordozó DNS-sel együtt CHO
HU 204 889 Β
DHFR’-sejtekbe, amelyek hipoxantint, timidint és glicint tartalmazó tápközegben nőnek 60 mm-es tenyésztőlemezeken, pSVgHuEPO plazmidot [7. A) példa] keverünk össze egy pBR322 bakteriális plazmid vektorba klónozott egér dihidrofolát reduktáz gént tartalmazó pMG2 plazmiddal (Gasser és munkatársai: fentebb idézett munka). A plazmidkeveréket és a hordozó DNS-t átfertőzzük CHO DHFR’-sejtekbe. (Azok a sejtek, amelyek egy plazmidot felvesznek, általában felvesznek egy második plazmidot is). Három nap múlva a sejteket tripszinezéssel szétosztjuk számos 100 mm-es tenyésztőlemezre, amelyek hipoxantint és timidint nélkülöző tápközeget tartalmaznak. Ezen a tápközegen csupán azok a sejtek élnek meg, amelyek stabilan transzformálódtak a DHFR-génnel és ezáltal az EPOgénnel. 7-21 nap után a túlélő sejtek telepei láthatóvá válnak. Ezeket a transzformáns telepeket, tripszinezéssel végzett szétoszlatás után folyamatosan lehet szaporítani hipoxantint és timidint nélkülöző tápközegben, új sejttörzseket alkotva ilyen módon (pl. CHO pDSVLMkEPO, cHOpSVgHuEPO, CHO-pDSVL-gHuEPO).
A fenti sejttörzsekből nyert tenyészközegeket RIAval vizsgáljuk rekombináns majom vagy humán EPO jelenlétére. A CHOpDSVL-MkEPO törzs tenyészközege tartalmaz EPO-t olyan immunológiai tulajdonságokkal, mint amelyeket a pDSVL-MkEPO plazmiddal átfertőzött COS-1 sejtekből nyertünk. Egy reprezentatív 65 órás tenyészközeg 0,60 egység/ml majom EPO-t tartalmaz.
A CHO pSVgHuEPO és CHO pDSVL-gHuEPOból nyert tenyészközegek rekombináns humán EPO-t tartalmaznak olyan immunológiai tulajdonságokkal, mint amelyeket a pSVgHuEPO vagy pDSVL-gHuEPO plazmidokkal átfertőzött COS-1 sejtekből nyertünk. Egy CHO pSVgHuEPO-ból nyert reprezentatív 3 napos tenyészközeg 2,99 egység/ml humán EPO-t és egy CHO pDSVL-gHuEPO-ból nyert 5,5 napos minta 18,2 egység/ml humán EPO-t tartalmaz, RIAval mérve.
A fentebb leírt sejttörzsek által termelt EPO mennyiségét növelni lehet génsokszorozással egy nagyobb termelékenységű új sejttörzset adva. Adihidrofolát-reduktáz (DHFR) enzimet, amely a DHFR által kódolt termék, gátolni lehet a metotrexát (MTX) gyógyszerrel. Részletesebben hipoxantint és timidint nélkülöző tápközegben szaporított sejteket gátolni lehet, vagy elpusztítani MTX-szel. Megfelelő körülmények között (pl. az MTX minimális koncentrációjánál) MTX-re rezisztens és MTX-ben nőni képes sejteket nyerhetünk. Ezekről a sejtekről úgy találjuk, hogy rezisztensek MTX-re DHFR-génjeik számának sokszorozódása miatt, amely a DHFR-enzim megnövekedett termelését eredményezi. A túlélő sejteket viszont lehet kezelni megnövekedett MTX koncentrációval, amely nagyobb számú DHER-gént tartalmazó sejttörzseket eredményez. Az „utazó génekéről (pl. EPO), amelyeket a kifejeződő vektor a DHFR-génnel együtt hordoz, vagy amelyek a DHFR-génnel transzformálva vannak, úgy találjuk, hogy szintén megnövelik génmásolataik számát.
Ennek a sokszorozási rendszemek gyakorlati példájaként CHO pDSVL-Mke sejttörzset növekvő MTX koncentrációknak tesszük ki (0 nmól/liter, 30 nmól/liter és 100 nmól/liter). 65 órás reprezentatív mintákat veszünk minden egyes sokszorozási lépésből és RIAval mérjük, és azt határozzuk meg, hogy a minták 0,60, illetve 2,45, illetve 6,10 egység/ml-t tartalmaznak. CHO pDSVL-gHuEPO törzs sejteket teszünk ki növekvő MTX koncentrációk sorozatának (30 nmól/liter, 50 nmól/liter, 100 nmól/liter, 200 nmól/liter, 1 mól/liter, és 5 mól/liter MTX). A 100 nmól/liter MTX-nek kitett 3 napos tenyészközeg egy reprezentatív mintája RIA-val értékelve 3089+129 egység/ml humán EPO-t tartalmaz. A 100 nmól/liter és 1 pmól/liter MTX-nek kitett 48 órás tenyészközegek reprezentatív mintái 466 egység/ml illetve 1352 egység/ml humán EPO-t tartalmaznak RIA-val értékelve (három párhuzamos mérés átlaga). Ezekben az eljárásokban 1Ί06 sejtet helyezünk 5 ml tápközegre, 60 mm-es tenyésztőcsészékben. 24 óra múlva a tápközeget eltávolítjuk és helyettesítjük 5 ml szérummentes tápközeggel (nagy glükóztartalmú DMEM, 0,1 mmól/liter nemesszenciális aminosavkeverékkel és L-glutaminnal kiegészítve). Az EPO-t hagyjuk akkumulálódni 48 órán át a szérummentes tápközegben. A tápközeget a RIA méréshez összegyűjtjük és a sejteket tripszinezzük és megszámoljuk. A 467 egység/ml és 1352 egység/ml átlagos értékek 100 nmól/liter, illetve 1 pmól/liter MTX jelenlétében nőtt sejteknél 2335 egység/lemez, illetve 6750 egység/lemez tényleges termelést szolgáltatnak. Az átlagos sejtszám lemezenként 1.94406, illetve 3,12·10δ sejt. A tényleges termelési sebességek ezeknél a tenyésztési körülményeknél így 1264, illetve 2167 egység/106 sejt/48 óra.
A közvetlenül előzőekben leírt tenyészetekben a sejtek genetikailag heterogén polulációt képeznek. Standard átvizsgálási módszereket alkalmazunk egy kísérletben, hogy genetikailag homogén kiónokat izoláljunk a legnagyobb termelési kapacitással. Lásd „Point to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologics” (Megfontolási tényezők biológiai anyagok termeléséhez alkalmazott sejtvonalak jellemzésében) A) fejezet, 2. rész; 1984. június 1, Office of Biologics Research Review, Center fór Drugs and Biologics, US. Food and Drug Administration (Amerikai Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerfelügyelete, Gyógyszer- és Biológiai Anyag Központ, Biológiai Kutatási Szemle Hivatala).
A fentebb leírt EPO-t termelő CHO-sejtvonalak termelékenységét javítani lehet a megfelelő sejttenyésztési technikákkal. Az emlős sejtek szaporítása a tenyészetben általában szérum jelenlétét igényli a növesztő tápközegben. Egy eljárás eritropoietin termeléséhez CHO-sejtekből olyan tápközegben, amely nem tartalmaz szérumot, nagymértékben megkönnyíti az eritropoietin tisztítását a tenyészközegből. Az alább leírt módszer képes gazdaságosan termelni eritropoietint szérummentes tápközegból termeléshez elegendő nagy mennyiségekben.
Standard sejttenyésztési körülmények között nőt CHO pDSVL-gHuEPO-sejtek törzsét alkalmazzuk,
HU 204 889 Β hogy beoltsunk rázólombikos sejttenyészeteket. A sejteket sejtvonal-szuszpenzióként szaporítjuk a rázólombikos sejttenyészeíekben olyan tápközegben, amely nagy glűkóztartalmú DMEM- és Ham-féle F12 tápközeg 50:50 arányú keverékét tartalmazza, kiegészítve 5 5% borjúembriő szérummal, L-glutaminnal, penicillinnel és streptomicinnel, 0,05 mmól/h'ter nem esszenciális aminosav-keverékkel és a megfelelő mennyiségű metotrexáttal. A szuszpenziós sejttenyészet lehetővé teszi, hogy a CHO-sejtek könnyen kiterjedjenek nagy 10 térfogatokra. A szuszpenzióban nőtt CHO-sejteket alkalmazzuk, hogy beoltsunk hengeres palackokat 1,5·107 élősejt/850 cm2 hengeres palack kiindulási oltási sűrűséggel 200 ml tápközegben. A sejteket növekedni hagyjuk, hogy összefolyjanak tapadó sejtvonal- 15 ként egy három napos periódus során. A növekedésnek ehhez a fázisához alkalmazott tápközeg azonos azzal, amelyet a szuszpenziós növesztésben alkalmazunk. A három napos növesztés! periódus végén a tápközeget tartalmazó szérumot eltávolítjuk és helyette- 20 sítjök 100 ml szérummentes tápközeggel, amely nagy glűkóztartalmú DMEM-et és Ham-féle F 12 tápközeg 50:50 arányú keverékéből áll, kiegészítve 0,05 mmól/liter nem esszenciális aminosav-keverékkel és L-glutaminnal. A hengeres palackokat visszahelyez- 25 zük a hengeres palackinkubátorba 1-3 órára és a tápközeget ismét eltávolítjuk és helyettesítjük 100 ml friss, szérummentes tápközeggel. A szérummentes tápközeg 1-3 órás inkubálása csökkenti a szennyező szérum fehérjekoncentrációját. A hengeres palackokat vissza- 30 helyezzük az inkubátorba hét napra, amelynek során eritropoietin akkumulálódik a szérummentes tenyészközegben. A két napos termelési fázis végén a kialakult tápközeget eltávolítjuk és friss szérum-mentes tápközeggel helyettesítjük egy második termelési ciklushoz. 35 Ennek a termelési rendszemek gyakorlati példájaként egy hét napos, szérummentes tápközeg reprezentatív mintája 3892±409 egység/ml humán eritropoietint tartalmaz RIA-val mérve. 0,9-1,8^105 sejt/cm2 becsült sejtsűrűségre alapozva minden 850 cm2-es hengeres 40 palack 0,75^1,5^108 sejtet tartalmaz, és így az EPO termelési sebessége a 7. napon, 100 ml- es tenyészetben 750-1470 egység/106 sejt/48 óra.
A CHO pDSVL-MkEPO törzsből nyert tenyészfolyadékokat, amelyek 10 nmől/liter MTX-et tartalmaz- 45 , nak, RIA mérésnek vetjük alá in vitro és EPO akivitás- ] mérsének vetjük alá in vivő. A kialakult tápközegminta j
41,2±1,4 egység/ml MkEPO-t tartalmaz RIA-val mér- i ve, 41,2±0,064 egység/ml MkEPO-t tartalmaz in vitro j biológiai aktivitásméréssel mérve és 42,5+5 egység/ml 50 1 MkEPO-t tartalmaz in vivő biológiai aktivitásméréssel i mérve. A polipeptidtermék aminosavszekvencia-elem- j zése EPO-termék jelenlétét tárja fel, egy olyan fajtáét, 1 amely a vélt alanin aminoterminálissal szomszédos % „vezető” szekvencia 3 gyökével rendelkezik. Hogy 55 s vajon ez a polipeptid helytelen memhránfeldolgozásá- 2 nak eredménye a CHO-sejtekben, vagy a majom EPO r aminoterminálisának szerkezetében levő különbséget s tükrözi a humán EPO-val szemben, ezt ma még nem k tudjuk. 60 Jí
A CHO pDSVL-gHuEPO-sejt törzseiből nyert tenyészközeget háromféle mérésnek vetjük alá. Egy 5,5 napos minta RIA méréssel 18,2 egység/ml, in vitro méréssel 15,8+4,6 egység/ml és in vivő méréssel
16,8±3,0 egység/ml szinten tartalmaz rekombináns humán EPO-t a tápközegben.
Az elkészített CHO pDSVL-gHuEPO-sejtekbőI nyert tenyészközegeket, amelyeket lépésenként 100 nmól/Iiter MTX-szel sokszorozva készítettünk, a háromféle mérés0 nek vetjük alá. Egy 3 napos minta RIA méréssel 3089+129 egység/ml, in vitro méréssel 2589+71,5 egység/ml és in vivő méréssel 2040+160 egység/ml szinten tartalmaz rekombináns humán EPO-t. Ennek a terméknek az aminosav-szekvenciája olyan aminoterminálist tár 5 fel, amely megfelel a VL táblázatban jelölt aminoterminálisnak.
ApDSVL-MkE plazmiddal átfertőzött CHO-sejtekből nyert, 10 nmől/Eter MTX-et tartalmazó, sejtkialakított tenyészközegeket összegyűjtjük és az MTX-et több ) napon át végzett dialízissel eltávolítjuk, olyan tenyészközeget nyerve, amely 22l±5,l egység/ml EPO-aktivitással bír (EPO-CCM). Hogy meghatározzuk az EPOCCM in vivő hatását a hematokritszintre normál Balb/C egerekben, a következő kísérletet hajtjuk végre, i Át nem fertőzött CHO-sejtekbőI nyert sejtkialakított tenyészközeget (CCM) és EPO-CCM-et PBS-sel beállítunk. A CCM-et alkalmazzuk a kontrollcsoporthoz (3 egér) és két dózisszinten - 4 egység/injekció és 44 egység/injekció - alkalmazzuk az EPO-CCM-et a kísérleti csoportokhoz (2 egér/csoport). Az 5 hetes kísérlet során a hét egeret iníraperiíoneálisan injekciózzuk háromszor hetenként. Nyolc injekció után az átlagos hematokritértékeket a kontrollcsoportnál 50,4%nak, a 4 egységet kapott csoportnál 55,1%-nak és a 44 egységet kapott csoportnál 67,9%-nak határozzuk meg.
Az emlős sejt kifejeződési termékeket könnyen kinyerhetjük lényegében tiszta formában a tenyészközegből HPLC-t (C4) alkalmazva etanolgradiensen, előnyösen pH=7-nél.
Előzetes kísérletet végzünk, hogy jellemezzük a humán EPO-gént kifejező COS-1 és CHO-sejtek kialakult tenyészközegéból nyert rekombináns glükoproteintermékeket a humán, vizelet eredetű EPO ízolátumokkal öszszehasonlítva, mind Wesíem-foltképzőelemzést, mind SDS-PAGE-t alkalmazva. Ezek a tanulmányok azt jelzik, hogy a CHO-ban termelt EPO anyagnak valamivel nagyobb a molekulasúlya, mint a COS-1 kifejeződési terméknek, amely viszont kissé nagyobb, mint az összegyűjtött humán vizeletextraktum-forrásból nyert termék. Mindegyik tennék bizonyos mértékig heterogén. A neuraminidáz enzimes kezelés, amely a síalinsavat eltávolítja, mintegy azonos molekulasúlyú COS-1 és CHO rekombináns terméket eredményez, amelyek viszont nagyobbak, mint a nyert asialo humán vizelet extraktumból származó terméké. A rekombináns CHO-termék és a vizeletextraktumból nyert tennék endoglikozidáz F enzimes (EC 3.2.1) kezelése (hogy teljesen eltávolítsuk a szénhidrátot mindkettőről) lényegében homogén termékeket eredményez, amelyek lényegében azonos molekulasúly-jellemzőkkel bírnak.
HU 204 889 Β
A tisztított humán vizelet EPO-t és egy találmány szerinti rekombináns, CHO-sejt által termelt EPO-t szénhidrátelemzésnek vetünk alá Ledeen és munkatársainak módszere szerint [Methods in Enzimology, 83(Part D), 139-191 (1982)], módosítva Nesser és 5 munkatársainak hidrolízises eljárása alkalmazásával [Anal. Biochem., 142, 58-67 (1984)]. A kísérletileg meghatározott szénhidrogén-alkotórész értékek (a termékben szénhidrát mólarányban kifejezve) a vizeletizolátumnál a következők: hexózok: 1,73; n-acetil-glü- 10 köz-amin: 1; N-acetil-neuraminsav: 0,93; Fukóz: 0; és N-acetil-galaktóz-amin: 0. A megfelelő értékek a rekombináns terméknél (amelyek CHO pDSVL-gHuEPO 3 napos tenyészközegéból származnak 100 nmól/liter MTX jelenlétében) a következők: hexózok: 15,09; 15 N-acetil-glükóz-amin: 1; N-acetil- neuraminsav: 0,998; Fukóz: 0; és N-acetil-galaktóz-amin: 0. Ezek az értékek egybevágnak azokkal, amelyeket a fentebb leírt Westem-foltképzési és SDS-PAGE elemzéssel nyerünk. 20
A jelen találmány által szolgáltatott glükoproteintermékek így kiterjednek az olyan termékekre, amelyeknek elsődleges szerkezeti konformációja megfelelő másolata a természetben előforduló eritropoietin elsődleges szerkezeti konformációjának, ez pedig le- 25 hetővé teszi, hogy a találmány szerinti termékek rendelkezzenek a természetben előforduló termék egy vagy több biológiai tulajdonságával. A találmány szerinti termékek átlagos szénhidrát-összetétele eltér a természetben előforduló eritropoietin szénhidrát- 30 összetételétől.
11. példa
A jelen példa a VI. táblázat szerinti humán EPOszekvenciát kódoló két struktúrgén teljes előállításával 35 foglalkozik nukleotid bázisok összeállításával, illetve az E.coli és élesztő (S. cerevisiae) sejtekben „előnyös” kodonok beépítésével. A példa leírja a humán EPO analógjait kódoló gének megalkotását is. Röviden elmondva az alkalmazott eljárás általában az, amely Alton és munkatársai korábban megemlített közlésében (WO 83/04053) közzé volt téve. Ennek során az alkotó oligonukleotidokat duplexek sorozatává alakítottuk, melyekből három elkülönült szekciót hoztunk létre. Ezeket a szekciókat a gyors sokszorozódáshoz terveztük és a sokszorozási rendszer eltávolítása után, ezeket egymás után lehet összeilleszteni vagy egy többszörös ffagmens-ligálással lehet összeilleszteni egy megfelelő kifejeződő vektorban.
Az alábbi VIH-XIV. táblázatok illusztrálják egy humán EPO transzlációs terméket kódoló gén tervezését és összeillesztését, amely nélkülöz mindenféle vezetővagy előszekvenciát, de rendelkezik egy kiindulási metioningyökkel a-1 helyzetnél. A konstrukciót mint „ECEPO” gént említjük.
VIH. táblázat
ECEPO 1. rész oligonukleotidjai
1. AATTCTAGAAACCATGAGGGTAATAAAATA
2. CCATTATTTTATTACCCTCATGGTTTCTAG
3. ATGGCTCCGCCGCGTCTGATCTGCGAC
4. CTCGAGTCGCAGATCAGACGCGGCGGAG
5. TCGAGAGTTCTGGAACGTTACCTGCTG
6. CTTCCAGCAGGTAACGTTCCAGAACT
7. GAAGCTAAAGAAGCTGAAAACATC
8. GTGGTGATGTTTTCAGTCTCTTTAG
9. ACCACTGGTTGTGCTGAACACTGTTC
10. CAAAGAACAGTGTTCAGCACAACCA
11. TTTGAACGAAAACATTACGGTACCG
12. GATCCGGTACCGTAATGTTTTCGTT
IX. táblázat ECEPO l.rész
Xbal
EcoRI 1
AATTCTAG AAACCATGAG GGTAATAAAA TA1ATGGCTCC GCCGCGTCTG GATC TTTGGTACTC CCATTATTTT ATTACCÍ3AGG CGGCGCAGAC
ATCTGCGAck CGAGAGITCT GGAACGTTAC TAGACGCTGA GCTCjTCAAGA CCTTGCAATG ctgctg|gaag CTAAAGAAGC GACGACCTTCIGATTTCTTCG
TGAAAACATC IACCACTGGTT GTGCTGAACA ACTTTTGTAG TGGTG|ACCAA CACGACTTGT
10 KpnI BamHI
TTACGGTACC G
AATGCCATGG CCTAG
CTGTTcfrTTG AACGAAAACA GACAAGAAACj TTGCTTTTGT
HU 204889 Β
X. táblázat
ECEPO 2. rész oligonukleotidjai
1. AATTCGGTACCAGACACCAAGGT
2. GTTAACCITGGTGTCTGGTACCG
3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT
4. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA
5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT
6. CCAAACTTCAACTGCTTGTTGACCAAC
7. TGGGCAGGGTCTGGCACTGCTGAGCG
8. GCCTCGCTCAGCAGTGCCAGACCCTG
9. AGGCTGTACTGCGTGGCCAGCCA
10. GCAGTGCCTGGCCACGCAGTACA
11. CTGCTGGTAAACTCCTCTCAGCCGT
12. TTCCCACGGCTGAGAGGAGTTTACCA
13. GGGAACCGCTGCAGCTGCATGTTGAC
14. GCTTTGTCAACATGCAGCTGCAGCGG
15. AAAGCAGTATCTGGCCTGAGATCTG
16. GATCCAGATCTCAGGCCAGATACT
XI. táblázat ECEPO 2. rész
EcoRI KpnI 1 . 3
A ATTCGGTACC AGACACCAAG GTITAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTAIJoGAA GCCATGG TCTGTGGTTC CAATTGJaAGA TGCGAACCTT TGCATTCCTT)
4
GTTGGTCAAC
CAACCAGTTG
GGCTGTACTG
CCGjACATGAC
AACCGCTGCA
TÍjaGCGACGT
AAGCAGTTGA AGljlTGGGAG GGTCTGGCAC TGCTGAGCG^. ttcgtcaact tcaaaccJgtc CCAGACCGTG ACGACTCGCT cqtggccagg CAfaccrcoT iUcci CAOCCofe gcaccggtcc gtgacgUcca TTTGAGGAGA GTCGGCACCC
12.
BglH BamHI
GCTGCATGTT GACAAAGCAG TATCTGGCCT GAGATCTG CGACGTACAA CTGTTTCGÍTC ATAGACCGGA CTCTAGACCTAC
XH. táblázat
ECEPO 3. rész oligonukleotidjai
1. GATCCAGATCTCTGACTACTCTGC
2. ACGCAGCAGAGTAGTCAGAGATCTG
3. TGCGTGCTCTGGGTGCACAGAAAGAGG
4. GATAGCCTCnTCTGTGCACCCAGAGC
5. CTATCTCTCCGCCGGATGCTGCATCT
6. CAGCAGATGCAGCATCCGGCGGAGA
7. GTCGCACCGCTGCGTACCATCACTG
8. ATCAGCAGTGATGGTACGCAGCGGTG
9. CTGATACCTTCCGCAAACTGTTTCG
10. ArACACGAAACAGTTTGCGGAAGGT
11. TGTATACTCTAACTTCCTGCGTGGTA
12. CAGTTTACCACGCAGGAAGTTAGAGT 35 13. AACTGAAACTGTATACTGGCGAAGC
14. GGCATGCTTCGCCAGTATACAGTTT
15. ATGCCGTACTGGTGACCGCTAATAG
16. TCGACTATTAGCGGTCACCAGTAC
XIII. táblázat ECEPO 3. rész
BamHI BglII GA TCCAGATCTCTG GTCTAGAGAC 1 3
ACTACTCTGC | TGCGTGCTCT GGGTGCACAG AAAGAGGÍCTA TCTCTCCGCC
TGATGAGACG ACGCAjCGAGA CCCACGTGTC TTTCTCCGAT AűÍAGAGGCGG 2 4
2
GGATGCTGCA TClfeCTGCAC CGCTGCGTAC CATCACTGÍCT GATACCTTCC CCTACGACGT AGACGACjGTG GCGACGCATG GTAGTGACGA CTAjrGGAAGG
13
GCAAACTGTT TCGfTGTATAC TCTAACTTCC TGCGTGGTAlA ACTGAAACTG CGTTTGACAA AGCACATAÍFG AGATTGAAGG ACGCACCATT TGACflTTGAC 1 12
Sáli
TATACTGGCG AAGCjATGCCG TACTGGTGAC CGCTAATAG ATATGACCGC TTCGTACGGh ATGACCACTG GCGATTATC AGCT
16
HU 204 889 Β
XIV. táblázat ECEPO-gén
Xbal
CTAG AAACCATGAG GGTAATAAAA TAATGGCTCC GCCGCGTCTG TTTGGTACTC CCATTATTTT ATTACCGAGG CGGCGCAGAC
ATCTGCGACT CGAGAGITCT GGAACGTTAC CTGCTGGAAG CTAAAGAAGC TAGACGCTGA GCTCTCAAGA CCTTGCAATG GACGACCTTC GATTTCTTCG
TGAAAACATC ACCACTGGTT GTGCTGAACA CTGTTCTTTG AACGAAAACA ACmTGTAG TGGTGACCAA CACGACTTGT GACAAGAAAC TTGCTTTTGT
TTACGGTACC AGACACCAAG GTTAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTATGGAA AATGCCATGG TCTGTGGTTC CAATTGAAGA TGCGAACCTT TGCATACCTT
GITGGTCAAC AAGCAGTTGA AGTTTGGCAG GGTCTGGCAC TGCTGAGCGA CAACCAGTTG TTCGTCAACT TCAAACCGTC CCAGACCGTG ACGACTCGCT
GGCTGTACTG CGTGGCCAGG CACTGCTGGT AAACTCCTCT CAGCCGTGGG CCGACATGAC GCACCGGTCC GTGACGACCA TTTGAGGAGA GTCGGCACCC
AACCGCTGCA GTCGCATGTT GACAAAGCAG TATCTGGCCT GAGATCTCTG TTGGCGACGT CGACGTACAA CTGTTTCGTC ATAGACCGGA CTCTAGAGAC
ACTACTCTGC TGCGTGCTCT GGGTGCACAG AAAGAGGCTA TCTCTCCGCC TGATGAGACG ACGCACGAGA CCCACGTGTC TTTCTCCGAT AGAGAGGCGG
GGATGCTGCA TCTGCTGCAC CGCTGCGTAC CATCACTGCT GATACCTTCC CCTACGACGT AGACGACGTG GCGACGCATG GTAGTGACGA CTATGGAAGG
GCAAACTGTT TCGTGTATAC TCTAACITCC TGCGTGGTAA ACTGAAACTG CGTTTGACAA AGCACATATG AGATTGAAGG ACGCACCATT TGACTTTGAC
SaE
TATACTGGCG AAGCATGCCG TACTGGTGAC CGCTAATAG
ATATGACCGC TTCGTACGGC ATGACCACTG GCGATTATCA GCT
Részletesebben ismertetve, a VIII. táblázat a humán polipeptid aminoterminális gyökeit kódoló ECEPO 1. rész megalkotásához alkalmazott oligonukleotidokat ábrázolja. Az oligonukleotidokat duplexekben állítjuk össze (1 és 2,3 és 4 stb.) és azután a duplexeket Egáljuk, hogy az ECEPO 1. részt szolgáltassuk a IX. táblázat szerint. Meg kell jegyezni, hogy az öszszeillesztett rész magában foglalja a megfelelő terminális EcoRI és BarriHI „tapadós” végeket, amelyek az FcoRI tapadós végtől „lefelé” egy Xbal restrikciós enzimfelismerő-hely, és a PamHI tapadós végtől „felfelé” egy KpnI felismerőhely. Az 1. rész könnyen sokszorozható a rész szekvenciájának igazolásához alkalmazott M13 fágvektort alkalmazva. Bizonyos nehézségekkel szemben találjuk magunkat a rész izolálásában az E.coliban előidézett RF DNS-ből eredő XbaUKpnl fragmensként, amely valószínűleg a KpnI felismerőhely bázisok metilezésének tulajdonítható a gazdaszervezeten belül. Ezért egyszálú fág DNS-eket izolálunk és kétszálúvá tesszük in vivő bevezető rész (primer) kiterjesztéssel, és a kívánt kétszálú fragmenst azután könnyen izoláljuk.
Az ECEPO-gén 2. és 3. részeit (XI. és XIII. táblázat) hasonló módon alkotjuk meg a X., illetve XII. táblázatban található oEgonukleotidokból. Mindegyik részt a szekvencia-megerősítéshez alkalmazott Ml3 vektorban sokszorozzuk és fág DNS-ből izoláljuk. Amint ez a XI. táblázatból nyilvánvaló, az ECEPO 2. részt FcoRI és BamHI tapadós végekkel alkotjuk meg és KpriUBgRl fragmensekként izolálhatjuk. Hasonlóképpen, az ECEPO 3. részt fiűznHI és SaB tapadós végekkel készítjük el és izolálhatjuk az RF fág DNS-ből mint BgBUSaB fragmenst. Az így előáUított három részt könnyen összeálEthatjuk egy folyamatos DNS-szekvenciává (XIV. táblázat), amely a teljes humán EPO poEpeptidet kódolja, egy aminoterminális metioninkodonnal együtt (ATG) az E.coli transzlációs beinduláshoz. Meg keE jegyezni, hogy a kündulási ATG-től „felfelé” van egy sor bázispár, amely lényegében megduplázza az E.coE nagymértékben kifejezett OMP-f génjének riboszóma-kötőhely szekvenciáját.
Bármilyen alkalmas kifejeződő vektort alkalmazhatunk, hogy hordozza az ECEPO-t. Az ECEPO-gén kifejeződésére kiválasztott tényleges vektor a „hőmérséklet-érzékeny” pCFM536 plazmid - a pCFM414 plazmid (ATCC 40 076) származéka - amint ez le van írva az ezzel összefüggő 636 727 bejelentési sorozatszámú amerikai egyesült államokbeE szabadalmi bejelentésben, amelyet
HU 204 889 Β
1984. augusztus 6-án nyújtottak be (Charles F. Morris).
Részletesebben, pCEM536-ot emésztünk Xbal-gyel és
Hindül-mal; a nagy fiagmenst izoláljuk és alkalmazzuk egy két részes ligálásban ECEPO-génnel. Az 1. részt (Xbdl/Kprű), a 2. részt (Kpnl/BgíH) és a 3. részt (Sg/l- 5 11/SaB) előzőleg a megfelelő sorrendben összeillesztjük M13-ban és az EPO-gént izoláljuk belőle mint egy egyedi Xbaí/HindlR fiagmenst. Ez a fragmens magában foglal az M13 mp9 fágból származó, ennek Őa/I és HintSB. helyei közt elterülő polilinker részt A kifejeződés szabá- 10 lyozása az így létrejött p536 kifejeződő plazmidban egy lambdaPL promotorrévén történik, amely önmaga a Cbj7 represszorgén szabályozása alatt lehet (amelyet az E.coli K 12AHtrp törzs szolgáltat).
A fentebb gyártott ECEPO-gént különbözőfélekép- 15 pen lehet módosítani, hogy eritropoietin analógokat kódoljon, mint pl. [Asn2, des-Pro2-IIeő-ig]hEPO-t és [His7] EPO-t, amint ezt az alábbiakban leírjuk.
A) [AsrP, des-Prc?-Ile6-ig]hEPO 20
A XIV. táblázat szerint gyártott ECEPO-gént, mint Xbal-HindSl beiktatást hordozó 536. plazmidot emésztünk .ί/ϊηζ/ΠΙ-mal és X/zol- gyei. Az utóbbi endonukleáz az ECEPO-gént egy egyedi, 6 bázispáros felis- . merőhelynél hasítja, amely az Asp8-at kódoló kodon 25
Xbal +1 2 3 4 5 6
Met Alá Pro Pro Arg Leu Ile
5’-CTAG ATG GCT CCG CCA CGT CTG ATC 3’-TAC CGA GGC GGT GCA GAC TAG
A kapcsolót (linkért) és az XhőUHindSÍ ECEPO szekvenciafragmenst azután pCFM536-ba iktatjuk, hogy a kívánt analóg Met'1 formájának E.coli kifejeződését kódoló, plazmid eredetű DNS-t hozzunk létre. 35
Az élesztőnek előnyösen kodonokat magában foglaló gyártott gének G,SCEPO”) megalkotását az itt következő XV-XXL táblázatok írják le. Akárcsak az ECEPO-gének esetében, a teljes megalkotás magában foglalja három oligonukleotíd-készlet (XV., XVH. és 40 XIX. táblázatok) képzését, amelyek duplexekbe vannak képezve és részekben összeillesztve (XVI., XVIH. és XX. táblázatok). Meg kell jegyezni, hogy a szintézist részben megkönnyíti néhány szuboptimális kodon alkalmazása mind a SCEPO, mind az ECEPO megal- 45 kotásában, azaz mindkét gén 1. részének 7-12 oligonukleoíidjai azonosak, és ugyancsak azonosak a 2. rész .
1-6 oligonukleotídjai mindkét génben.
utolsó bázisa és az Arg10 kodon második bázisa között terül el. Egy XbaBXhöl „linker” szekvenciát állítunk elő, amelynek szekvenciája a kővetkező:
+1 2 7 8 9
Met Alá Asn Cys Asp Xhol 5’-CTAG ATG GCT AAT TGC GAC-3’
3’-TACCGATTA ACGCTGAGCT-5’
Az XbaVXhol linkért és az XhoI/HindHI ECEPOgén szekvenciafiagmenseket beiktatjuk a pCFM536 plazmid Sbal és Hindin emésztéséből létrejött nagy fragmensbe [a pCMF526 a pCMF414 (ATCC 40 076) származéka], amint ezt az ezzel összefüggő 636 727 bejelentési sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben, amelyet 1984. augusztus 6-án nyújtottak be, leírták (Charles E Morris). Ilyen módon a kívánt analóg Mer1 formájának E.colí kifejeződését kódoló plazmid eredetű DNS-t hozunk létre.
B) [His’jhEPO
Az 536. plazmidot emésztjük HindlH-mal és Xholgyel, ahogyan a fenti A) részben tettük. Egy Xbal/Xhol kapcsolót (linkért) állítunk elő, amelynek szekvenciája a következő:
8 9 Xhol
His Asp
CAT GAC-3’
GTA CTG AGCT-5’
XV. táblázat
A SCEPO 1. rész oligonukleotídjai
1. AATTCAAGCTTGGATAAAAGAGCT
2. GTGGAGCTCTnTATCCAAGCTTG
3. CCACCAAGATTGATCTGTGACTC
4. TCTCGAGTCACAGATCAATCTTG
5. GAGAGTTTTGGAAAGATACTTGTTG
6. CTTCCAACAAGTATCTTTCCAAAAC
7. GAAGCTAAAGAAGCTGAAAACATC
8. GTGGTGATGTTTTCAGTCTCTTTAG
9. ACCACTGGTTGTGCTGAACACTGTTC
10. CAAAGAACAGTGTTCAGCACAACCA
11. TTTGAACGAAAACATTACGGTACCG
12. GATCCGGTACCGTAATGTTTTCG1T
XVI. táblázat ASCEPO 1.része
EcoRI Hindin 1
AATTCA AGCTTGGATA GT TCGAACCTAT
AAAGAGClfclC ACCAAGATTG ATCTGTGACT cjGAGAGTITT TTTCTCGAGG TGjOTTCTAAC TAGACACTGA GCTCljCAAAA
HU 204 889 Β
GGAAAGATAC
CCTTTCTATG
GTGCTGAACA
CACGACTTGT
ITGTTGÍGAAG CTAAAGAAGC tgaaaacatc Iaccactggit AACAACCTTCI GATTTCTTCG ACTTTTGTAG TGGTGAlCCAA
KpnI BamHI
CTGTTCÍrTTG AACGAAAACA TTACGGTACC G GACAAGAAACj TTGCTTTTGT AATGCCATGG CCTAG
XVII. táblázat
A SCEPO 2. rész oligonukleotidjai
1. AAITCGGTACCAGACACCAAGGT
2. GTTAACCTTGGTGTCTGGTACCG
3. TAACTTCTACGCITGGAAACGTAT
4. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA
5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT
6. CCAAACTTCAACTGCTTGTTGACCAAC
7. TTGGCAAGGTTTGGCCTTGTTATCTG
8. GCTTCAGATAACAAGGCCAAACCTTG
9. AAGCTGITTTGAGAGGTCAAGCCT
10. AACAAGGCITGACCTCTCAAAACA
11. TGTTGGTTAACTCTTCTCAACCATGGG
12. TGGTTCCCATGGTTGAGAAGAGTTAACC
13. AACCATTGCAATTGCACGTCGAT
14. CTTTATCGACGTGCAATTGCAA
15. AAAGCCGTCTCTGGTTTGAGATCTG
16. GATCCAGATCTCAAACCAGAGACGG
XVin. táblázat A SCEPO 2. része
KpnI
EcoRI 1
A ATTCGGTACC AGACACCAAG GCCATGG TCTGTGGTTC
5
GIÍTAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTAljGGAA GTTGGTCAAC AAGCTGTTGA caattgIaaga tgcgaacctt tgcataccit) CAACCAGITG TTCGACAACT
6
9 agiJttggcaa ggtttggcct tgttatctgIa agctgttttg agaggtcaag
TCAAACcjGTT CCAAACCGAA ACAATAGACT TCGpVCAAAAC TCTCCAGTTC
10 ii ii
CCljrGTTGGT TAACTCTTCT CAACCATGGG ÍAACCAITGCA ATTGCACGTC ggaacaaJcca ATTGAGAAGA GTTGGTACCC TTGGT|4ACGT TAACGTGCAG
14
BglII BamHI gaiRaagccg tctctggttt gagatctg
CTATTTCÍGGC AGAGACCAAA CTCTAGACCTA G 16
XIX. táblázat
A SCEPO 3. rész oligonukleotidjai
1. GATCCAGATCTTTGACTACTTTGTT
2. TCTCAACAAAGTAGTCAAAGATCTG
3. GAGAGCTTTGGGTGCTCAAAAGGAAG
4. ATGGCTTCCTTTTGAGCACCCAAAGC
5. CCATTTCCCCACCAGACGCTGCTT
6. GCAGAAGCAGCGTCTGGTGGGGAA
7. CTGCCGCTCCATTGAGAACCATC
8. CAGTGATGGTTCTCAATGGAGCG
9. ACTGCTGATACCTTCAGAAAGTT
10. GAATAACTTTCTGAAGGTATCAG 50 11. ATTCAGAGTTTACTCCAACTTCT
12. CTCAAGAAGTTGGAGTAAACTCT
13. TGAGAGGTAAATTGAAGTTGTACAC
14. ACCGGTGTACAACTTCAATTTACCT
15. CGGTGAAGCCTGTAGAACTGGT 55 16. CTGTCACCAGTTCTACAGGCTTC
17. GACAGATAAGCCCGACTGATAA
18. GTTGTTATCAGTCGGGCTTAT
19. CAACAGTGTAGATGTAACAAAG
20. TCGACTTTGTTACATCTACACT
HU 204 889 B
XX. táblázat A SCEPO 3. része
BamHI BgUI 1
GATC CAGATCTTTG ACTACTTTGT TgAGAGCTIT
GTCTAGAAAC TGATGAAACA ACTCTCGAAA 2 3 5.
GGGTGCTCAA AAGGAAGÍCCA TTTCCCCACC AGACGCTGCT TTTGCCGCTC CCCACGAGTT TTCCTTCGGT AjAAGGGGTGG TCTGCGACGA AGACGGCGAG
6 “ 7 9 ,11
CATTGAGAAC CATckcTGCT GATACCTTCA GAAAGTTATT CAGAGTTTAC GTAACTCTTG GTAGTGAÓGA CTATGGAAGT CTTTCAATAA ÓTCTCAAATG
10 12
TCCAACTTCT [TGAGAGGTAA ATTGAAGTTG TACAcjcGGTG AAGCCTGTAG AGGTTGAAGA ACTCjrCCATT TAACTTCAAC ATGTGGCCA|c TTCGGACATC
16
19
AACTGGlfeAC AGATAAGCCC GACTGATAAÍC AACAGTGTAG ttgaccactg tcJtattcggg ctgactattg ttgItcacatc
Sáli
ATGTAACAAA G
TACATTGTTT CAGCT
XXL táblázat ASCEPO-gén
-1 +1
HindlH ArgAIa
AGCTTGGATA AAAGAGCTCC ACCAAGATTG ATCTGTGACT CGAGAGTTIT ACCTAT TTTCTCGAGG TGGTTCTAAC TAGACACTGA GCTCTCAAAA
GGAAAGATAC TTGTTGGAAG CTAAAGAAGC TGAAAACATC ACCACTGGTT CCTTTCTATG AACAACCTTC GATTTCTTCG ACTTTTGTAG TGGTGACCAA
GTGCTGAACA CTGTTCTTTG AACGAAAACA TTACGGTACC AGACACCAAG CACGACTTGT GACAAGAAAC TTGCTTTTGT AATGCCATGG TCTGTGGTTC
GTTAACTTCT ACGCITGGAA ACGTATGGAA GTTGGTCAAC AAGCTGTTGA CAATTGAAGA TGCGAACCTT TGCATACCTT CAACCAGITG TTCGACAACT
AGTTTGGCAA GGTTTGGCCT TGTTATCTGA AGCTGITTTG AGAGGTCAAG TCAAACCGTT CCAAACCGGA ACAATAGACT TCGACAAAAC TCTCCAGTTC
CTTTGTTGGT TAACTCTTCT CAACCATGGG AACCATTGCA ATTGCACGTC GGAACAACCA ATTGAGAAGA GTTGGTACCC TTGGTAACGT TAACGTGCAG
GATAAAGCCG TCTCTGGTTT GAGATCTTTG ACTACTTTGT TGAGAGCITT CTATTTCGGC AGAGACCAAA CTCTAGAAAC TGATGAAACA ACTCTCGAAA
GGGTGCTCAA AAGGAAGCCA TTTCCCCACC AGACGCTGCT TCTGCCGCTC CCCACGAGTT TTCCTTCGGT AAAGGGGTGG TCTGCGACGA AGACGGCGAG
CATTGAGAAC CATCACTGCT GATACCTTCA GAAAGTTATT CAGAGTTTAC GTAAACCTTG GTAGTGACGA CTATGGAAGT CTTTCAATAA GTCTCAAATG
TCCAACTTCT TGAGAGGTAA ATTGAAGTTG TACACCGGTG AAGCCTGTAG AGGTTGAAGA ACTCTCCATT TAACTTCAAC ATGTGGCCAC TTCGGACATC
HU 204 889 Β
AACTGGTGAC AGATAAGCCC GACTGATAAC AACAGTGTAG TTGACCACTG TCTATTCGGG CTGACTATTG TTGTCACATC
Sáli
ATGTAACAAA G
TACATTGTTT CAGCT
Az összeillesztett SCEPO részeket sorrendbe állítjuk M13-ban és az 1., 2. és 3. részek izolálhatók a fágból mint HindűüKpnl, illetve KpnUBglH, illetve BgBUSall fragmensek.
A SCEPO-géntermékekhez a jelenleg előnyös kifejeződő rendszer egy S. cerevisiae α-faktor szekréción alapuló szekréciós rendszer, amelyet az ezzel összefüggő 487 753 bejelentési sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés ír le, amelyet 1983. április 22-én jelentettek be (Grant A. Bittér) és 1984. október 31-én publikáltak 0 123 294 számú európai szabadalmi bejelentésként. Röviden ismertetve, a rendszer magában foglal egy olyan konstrukciót, ahol az élesztő a-faktor géntermék vezetőszekvenciáját kódoló DNS közvetlenül a kifejezendő exogén gén kódoló területének 5’ irányában helyezkedik el. Ennek megfelelően a transzlációnak alávetett géntermék magában foglal egy vezető- vagy jel(szignál) szekvenciát, amely „feldolgozódik” egy endogén élesztőenzim által a termék maradék részének szekréciója folyamán. Mivel a konstrukció az α-faktor transzlációs beindító kodont (ATG) hasznosítja, nincs szükség szolgáltatni ilyen kodont a SCEPO-gén -1 helyzeténél. Amint megjegyezhettük a XXI. táblázatnál, az alanint (+1) kódoló szekvenciát megelőzi egy linker szekvencia, lehetővé téve a közvetlen beiktatást egy plazmádba, beleértve az α-faktor promotort követő α-faktor vezető (leader) első 80 gyökéhez szolgáló DNS-t. A SCEPO-gén kifejeződéshez különösen előnyös konstrukció magában foglal egy négy részes ligálást, beleértve a fentebb említett SCEPO-rész fragmenseket és a paC3 plazmid/frWÍll/Salí emésztéséből származó nagy fragmenst. Az így létrejött paC3/SCEPO plazmádból az α-faktor promotort és vezetőszekvenciát és a SCEPO-gént izoláljuk BamHIgyel végzett emésztéssel és BamHI-gyel emésztett pYE plazmádba ligáljuk, hogy a pYE/SCEPO kifejeződőplazmidot képezzük.
12. példa
A jelen példa a gyártott ECEPO- és SCEPO-gének rekombináns termékeinek kifejeződésével foglalkozik all. példa kifejeződő rendszerén belül.
Az E.coli gazdaszervezetben való felhasználáshoz tervezett kifejeződő rendszer alkalmazásakor a 11. példa pCFM536 plazmidját AM7 E.coli sejtekbe transzformáljuk, amely sejteket előzőleg megfelelő, C1857 gént befogadó pMWl plazmiddal transzformáltunk. A sejtek tenyészeteit LB tápközegben (ampicillin 50 pg/ml és kanamicin 5 Qmg/ml, előnyösen 10 mmól/liter MgSO4-tal) tartjuk fenn 28 °C hőmérsékleten, és amikor a tenyészetben a sejtek növekedése eléri az OD«xi“0,l értéket, az EPO kifejeződését indukáljuk, a tenyészet hőmérsékletét 42 °C-ra emelve. A mintegy 40 OD értékig nőtt sejtek mintegy 5 mg/OD liter EPO-termelést szolgáltatnak (géllel felbecsülve).
A sejteket kinyerjük, lizáljuk, francia préssel (French Press, 10 000 psi~6,8»107 Pa) összeszúzzuk és lizozimmal, valamint NP-40 detergenssel kezeljük. A 24 000’g-vel végzett centrifugálásból nyert üledéket guanidin*HCl-dal szolubilizáljuk és további tisztításnak vetjük alá egy lépésben, C4 (Vydac) Reverse Phase HPLC-vel (fordított fázisú, nagy felbontású folyadékkromatográfia) (etanol, 0-80%, 50 mmól/liter NH4acetát, pH=4,5). A fehérjeszekvencia-elemzés feltárja, hogy a termék 95%-nál nagyobb tisztaságú és a nyert termékek két különböző aminoterminálist mutatnak. A-P-P-R... és P-P-R... mintegy 3:1 viszonyított menynyiségi arányban. A hEPO-nak és a [des Ala^hEPOterméknek ez utóbbi megfigyelése azt jelzi, hogy az aminoterminális „feldolgozás”-a a gazdaszervezeten belül a terminális metionin és bizonyos esetekben a kezdő alanin eltávolítására szolgál. Az izolátumok radioimmunassay aktivitása 150 000-160 000 egység/mg szinten van; az in vitro mért aktivitás 30 00062 000 egység/mg szinten van; és az in vivő vizsgálati aktivitás a 120-720 egység/mg tartományban van. (Vo. a humán vizelet eredeti izolátora, standard 70 000 egység/mg-os mindegyik mérésben.) A rekombináns termékhez tartozó dózisválaszgörbe az in vivő mérésekben határozottan különbözik a humán vizelet eredetű EPO standard görbéjétől.
11. példa A) és B) részében képzett EPO-analógplazmidok mindegyikét pMWl-gyel transzformált AM7 E.coli sejtekbe transzformáljuk és a sejteket a fentiek szerint tenyésztjük. A tisztított izolátomokat mind RIAval, mind in vitro méréssel megvizsgáljuk. A RIA és in vitro mérési értékek az [Asn2, des-Pro2-Ile6-ig]hEPO kifejeződési termékekhez mintegy 11 000 egység/mg fehérje, illetve 6000 egység/mg fehérje, míg a His7 hEPO-hoz a mérési értékek mintegy 41 000 egység/mg fehérje, illetve 14 000 egység/mg fehérje, jelezve, hogy az analógtermékek 1/4—1/10 részben olyan aktívak a vizsgálatokban, mint a „szülő” kifejeződési termékek.
A S. cerevisiae gazdasejtekben való alkalmazáshoz tervezett kifejeződési rendszerben a pYE/SCEPO plazmidot transzformáljuk két különböző törzsbe, YSOP4be (genotípus: a pép 4-3 trpl) és RK81-be (genotípus: aa pép 4-3 trpl). A transzformált Y SDP4 gazdaszervezeteket SD tápközegben növesztjük [Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 62 (1983)], amelyet 0,5% kazaminosavval (hidrolizált kazein) kiegészítünk, pH=6,5-nél 30 ’C hőmérsékleten. Amikor a sejtek 36 OD értékig kinőttek, a kinyert tápközeg kb. 244 egység/ml (97 jig/OD liter, RIA-val mérve) szinten tartalmaz EPO-terméket. A transzformált RK81 sejtek, amelyeket vagy 6,5 OD vagy 60 OD értékig növesztünk, mintegy 80-90 egység/ml EPO-koncentrációt szolgáltatnak (34 g/OD liter, RIA-val mérve). Az előzetes
HU 204889 Β elemzések jelentős heterogenitást tárnak fel a kifejeződési rendszerben termelt termékekben, amely valószínűleg a kifejezett fehérjék glikozilezésében való eltéréseknek és a társult szénhidrogén viszonylag nagy mannőztartalmának tulajdonítható.
A PaC3 és pYE plazmidokat E.coli HB101 sejtekben letétbe helyeztük a Rules of Practice of the U.S. Patent Office-val (az Amerikai Egyesült Államok Találmányi Hivatala Gyakorlatának Szabályai) összhangban 1984. szeptember 27-én az American Type Culture Collection-nál (ATCC) 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, ATCC 39 881, illetve ATCC 39 882 letéti számon. A pCEM526 plazmidot AM7 sejtekben, a pCFM536-ot JM103 sejtekben, és a pMWl-et JMí03 sejtekben hasonlóképpen deponáltuk 1984. november 21-én ATCC 39 932, illetve ATCC 39 934, illetve ATCC 39 933 letéti számon. Az YSPD4 és RK81 törzseket szintén 1984. november 21-én deponáltuk ATCC 20 734, illetve ATCC 20 733 letéti számon.
A fenti, illusztráció céljául szolgáló példák megfon- 2 tolásából könnyen nyilvánvaló lehet, hogy a jelen találmány számos rendkívül értékes terméket és eljárást nyújt többféle szempontból is.
A találmány által nyújtott polipeptidek nyilvánvalóan hasznos anyagok, ezek akár mikrobiolőgiailag kife- 2 jezett termékek, akár szintetikus termékek; ezeknek a termékeknek a primer, szekunder és tercier szerkezeti konformációja a jelen találmánnyal vált ismertté.
Amint korábban jeleztük, a jelen találmány szerinti rekombináns és szintetikus termékek változó mérték- 3 ben rendelkeznek a természetes forrásokból eredőEPO izolátumok in vitro biológiai aktivitásával, következésképpen tervezhető, hogy hasznosíthatók úgy is, mint az EPO izolátumok helyettesítői az eritropoietin-termelő sejtek tenyészetben való növesztéséhez alkalmazott te- 3! nyészközegekben. Hasonlóképpen olyan mértékig, amilyen mértékig a találmány szerinti termékek rendelkeznek a természetes EPO izolátumok in vivő aktivitásával, ezek nyilvánvalóan alkalmasak az eritropoietin terápiás eljárásokban való felhasználáshoz, amelyeket 4( emlősöknél, beleértve az embert is, alkalmaznak in vivő az EPO-nak tulajdonított hatások bármelyikének vagy mindegyikének kifejlesztéséhez, ilyenek pl. a retikulocita válasz stimulálása, a ferrokinetikus hatás kifejlesztése [úgy, mint plazma vasforgalom (tumover) 4£ hatások és csontvelő tranzitidő hatások], eritrocita tőmegváltozások, hemoglobin C szintézis (lásd Eschbach, fentebb idézett munka) és, amint a 10. példában már jeleztük, az emlősökben növekvő hematokritszintek. A találmány szerinti termékekkel kezelhető embe- 50 rek osztályába értjük azokat a betegeket, akik általában vértranszfúziót igényelnek, valamint balesetek áldozatait, sebészeti betegeket, vesebeteg pácienseket, beleértve a dialízisre szorulókat, és különböző vérősszetételére ható rendellenességekkel, pl. hemofíliával, sarlósejtbetegséggel, fiziológiás anémiával bíró betegeket stb. Remélhető a transzfúziő szükségességének minimálisra szorítása EPO-terápia alkalmazása útján, amely a fertőző ágensek átvitelének csökkentését eredményezheti. A találmány szerinti termékekről, mivel termelésük rekombináns módszerekkel történik, várható, hogy mentesek pirogénektől, természetes inhibitorvegyületektől és hasonlóktól, és így valószínűleg megnövekedett általános hatékonyságot szolgáltatnak a gyógyászati folyamatokban a természetes eredetű termékekhez viszonyítva. A jelen találmány szerinti termékekkel végzett eritropoietin terápiától az is várható, hogy hasznos lesz a hipoxiás környezeti feltételekkel befolyásolt egyének oxigénhordoző kapacitásának emelésében és talán a jótékony kardiovaszkuláris hatások szolgáltatásában.
Atalálmány szerinti polipeptidíermékek beadásához előnyös módszer a parenterális (pl. IV, 1M, SC vagy IP) beadás, és a beadott kompozíciók általában a terápiá15 san hatásos mennyiségű termékeket elfogadható hígítókkal, hordozókkal és/vagy adjuvánsokkal együtt tartalmazzák. Az előzetes faimakokinetikaí tanulmányok hosszabb fél-éleítertamot jeleznek in vivő a majom EPO termékeknél, amikor ezeket IM adjuk be IV he!0 lyetí. A hatásos dózisok várhatóan lényegesen változnak a kezelt személyek állapotától függően, de a jelenleg várt terápiás dózisok 0,1 (~7 egység) és 100 (~7000 egység) pg/aktív anyag/festtömeg kg közti tartományban vannak. Standard hígítókat, mint a humán szérum 5 albumint el lehet fogadni a találmány szerinti kompozíciókhoz, valamint olyan standard hordozókat is, mint a sóoldat.
A találmány szerinti kompozíciókban való alkalmazásra megfelelő adjuváns anyagok magukban foglal0 nak olyan vegyületeket, amelyekről egymástól függetlenül feljegyeztek eritropoietin stimuláló hatást, ilyenek pl. a tesztoszteron, őssejt stimulátorok, ínzulinszerű növekedési faktorok, prosztaglandinok, szerotoninok, ciklusos AMP, prolaktrn és trijód-tirozin, valamint 5 azok az ágensek, amelyeket általában alkalmaznak a plasztikus anémia kezelésében, mint pl. a metenolon, stanozolol és nandrolon [lásd pl. Resegotti és munkatársai: Panminerva Medica, 23, 243-248 (1981); McGonigle és munkatársai: Kidney Int., 25(2), 437) 444 (1984); Pavlovíc-Kantera és munkatársak Expt. Hematol. 8(Supp.8), 283-291 (1980); és Kuríz, FEBS Letters, 14a(l), 105-108 (1982)]. Adjuvánsként megfontolhatók azok a vegyüíetek is, amelyekről leírták, hogy növelik az eritropoietin vagy asialo-EPO hatásait » vagy szinergizmusban vannak ezekkel, ilyenek pl. az adrenerg-agonisták, tiroidhormonok, androgének és BPA [lásd: Dunn: „Cunent Concepts in Erythropoiesis”, John Wiley and Sons (kiadó) (Chichester, Anglia, 1983); Weiland és munkatársai: Blut, 44(3), 173-175 (1982); Kalmanti: Kidney Int., 22, 383-391 (1982); Shahidi: New. Eng. J. Med., 289,72-80 (1973); Fisher és munkatársai: Steroids, 30(6), 833-845 (1977); Urabe és munkatársai: J. Exp. Med., 149, 1314—1325 (1979); és Billat és munkatársai: Expt. Hematol, 10(1), 133-140 (1982)], a „máj eritropoietin faktorok”-nak jelölt vegyüíetek osztályai [lásd: Naughton és munkatársai: Acta Haemat. 69, 171-179 (1983)], az „eritrotropinok” [amint ezt Congote és munkatársai leírták a „Proceedings 7th International Congress of Endocrinology” című kiadványban (Quebec City, Quebec, 1984.
HU 204 889 Β július 1-7.) a 364. kivonatban, valamint a következő irodalmi helyeken: Congote: Biochem. Biophys. Rés. Comm. 115(2), 447-483 (1983) és Congote: Anal. Biochem., 140, 428-433 (1984)], valamint az „eritrogeninek” [amint ezeket Rothman és munkatársai leírták: J. Surg. Oncol. 20,105-108 (1982)]. A vagy 5a-dihidrotesztoszteronnal vagy nandrolonnal előkezelt, majd a jelen találmány szerinti eritropoietint kapott ex-hipoxiás, policitémiás (vörösvérsejt túltengésben szenvedő) egerek eritropoietin-válaszának mérésére tervezett előzetes átvizsgálások bizonytalan eredményeket váltottak ki.
A találmány szerinti polipeptidek diagnosztikai alkalmazásai hasonlóképpen kiterjedtek és magukban foglalják az alkalmazást jelzett vagy jelzetlen formában az immunassay-technikák széles választékában, beleértve a RIA-t, ELISA-t és hasonlókat, valamint az in vitro és in vivő aktivitásmérések széles választékát. Lásd pl. Dunn és munkatársai: Expt. Hematol. 11(7), 590-600 (1983); Gibson és munkatársai: Pathology,
16, 155-156 (1984); Krystal: Expt. Hematol., 11(7), 649-660 (1983); Saito és munkatársai: Jap. J. Med, 23(1), 16-21 (1984); Náthán és munkatársai: New Eng.
J. Med., 308(9), 520-522 (1983); és az ezekben referált különböző idézetek a mérésekre vonatkozólag. A talál- 25 (1) hEPO 41-57: V-P-D-T-K-V-N-F-Y-A-W-K-I (2) hEPO 116-128: K-E-A-I-S-P-P-D-A-A-S-A-A:
(3) hEPO 144-166: V-Y-S-N-F-L-R-G-K-L-K-L-Y
A fentebb említett polipeptideket alkalmazó előzetes immunizálási tanulmányok egy viszonylag gyenge pozitív választ tárnak fel hEPO 41-57-re, nincs méltányolható válasz hEPO 116-128-ra, és erősen pozitív a válasz a hEPO 144-166-ra, amint ezt a nyúl szérumán- 35 titestek kapacitásával mérjük 125I-jelzett humán vizelet eredetű EPO-izolátumok immunprecipitálására. Az előzetes in vivő aktivitási tanulmányok a három pepiidre nem túrtak fel jelentős aktivitást sem egyedül, sem kombinációban. 40
Míg a bemutatott példák által nyújtott emlős EPO aminosavgyökeinek kikövetkeztetett szekvenciái teljesen meghatározzák az érett EPO elsődleges szerkezeti konformációját, meg lehet érteni, hogy a majom EPO 165 aminosavgyökének (az V. táblázat szerint) és a 45 humán EPO 166 aminosavgyökének (a VI. táblázatban) speciális szekvenciája nem korlátozza a találmány által szolgáltatott hasznos polipeptidek körét. A jelen találmány magában foglalja az EPO-nak mindazokat a különböző természetben előforduló allélformáit, ame- 50 lyekről a biológiailag aktív emlős polipeptidek elmúlt kutatásai, mint pl. a γ- interferon-kutatás, jelzik, hogy valószínűleg léteznek [vesd össze pl. azt a humán interferonfajtát, amelyről leírták, hogy orginingyökkel rendelkezik az EPO 140. helyzeténél (0 077 670 számú 55 bejelentés), és azt a fajtát, amelyről leírták, hogy glutaminnal rendelkezik a 140. helyzetnél [Gray és munkatársai, Natúré, 295, 503-508 (1982)]. Mindkét fajtát az jellemzi, hogy „érett” humán γ-interferon-szekvenciákat képeznek. Az érett EPO-polipeptidek allélformáit 60 mány szerinti polipeptidek, beleértve az EPO-gyökök először itt feltárt szekvenciáit tartalmazó szintetikus peptideket is, szintén nagyon hasznos tiszta anyagokat szolgáltatnak a poliklonális antitestek előidézéséhez, 5 valamint az EPO eltérő folyamatos és nem folyamatos epitopjaira fajlagos monoklonális antitestek „bankjaihoz. Példaként a VI. táblázat aminosav-szekvenciáinak előzetes analízise a vízgyógykezeléssel összefüggésben Hopp és munkatársai szerint [P.N.A.S. (USA), 10 78,3824-3828 (1981)] és a szekunderszerkezet vizsgálata Chou és munkatársai szerint [Ann. Rév. Biochem., 47, 251 (1978)] feltárja, hogy a szintetikus peptidek, amelyek a 41-57 helyzetek (szélső értékeket beleértve), 116-118 helyzetek (szélső értékeket beleértve) és 15 144-166 helyzetek (szélső értékek beleértve) között elterülő gyökök folyamatos szekvenciáinak másolatai, valószínűleg nagy antigénválaszt adnak és mind a szintetikus peptiddel, mind a teljes fehérjével immunreaktív, hasznos monoklonális és poliklonális antitesteket 20 váltanak ki. Az ilyen antitestektől azt várjuk, hogy hasznosak lesznek az EPO és az EPO-val rokon termékek kimutatásában és affinitásos tisztításában.
Szemléltetés céljából a következő szintetikus peptideket állítjuk elő:
,-M-E-V-G;
’-G-E-A-C-R-T-G-D-R.
variálni lehet egymásból és az V. és VI. táblázatokban levő szekvenciákból a szekvencia hosszának szempontjából és/vagy az aminosavak deléciói (kihagyások), szubsztitúciói (helyettesítések), beiktatásai vagy hozzáadásai szempontjából a szekvenciában, az ebből következő lehetséges variációkkal együtt a glikozilezési kapacitásban. Amint korábban megjegyeztük, a humán fajta EPO egyik vélt allélformájáról úgy hisszük, hogy metioningyököt tartalmaz a 126. helyzetnél. Várhatóan az EPO-t kódoló DNS genom- és cDNS-szekvenciák természetben előforduló olyan allélformái szintén valószínű, hogy előfordulnak, amelyek kódolják az alléi polipeptidek fentebb említett típusait, vagy egyszerűen eltérő kodonokat alkalmaznak azonos, megadott polipeptidek meghatározásához.
Az érett EJPO természetben előforduló allélformáin kívül a jelen találmány felölel más „EPO-termék”-eket is, úgymint az EPO polipeptid-analógjait és az „érett” EPO fragmenseit. Alton és munkatársai fentebb említett, publikált bejelentésének (WO/83/04053) eljárását követve könnyen lehet tervezni és előállítani az érett EPO itt megadott primer konformációjától egy vagy több gyök azonossága vagy elhelyezkedése szempontjából (pl. helyettesítések, terminális és köztes addíciók és deléciók) eltérő primer konformációval rendelkező polipeptidek mikrobiológiai kifejeződését kódoló géneket. Egy másik módszer szerint cDNS- és genom EPO-gének módosítását könnyen végre lehet hajtani jól ismert helyre irányuló mutagenezis technikával és ezt lehet alkalmazni EPO analógjainak és származékai31
HU 204 889 Β nak létrehozására. Az ilyen EPO-íermékek rendelkezhetnek az EPO legalább egy biológiai tulajdonságával, másokban viszont eltérhetnek. Példaként, a találmány szerint tervezett EPO-termékek magukban foglalhatnak olyanokat, amelyek meg vannak rövidítve, pl. deléciókkal: [Asn2dez-Pro2-Iles-ig]hEPO, [dez-ThrIS3ArgI66-ig]hEPO és „Δ27-554ΕΡΟ”, ez utóbbiban egy teljes exonnal kódolt gyökök hiányoznak; vagy amelyek stabilabbak hidrolízisre (és ennél fogva határozottabb és hosszabban tartó hatásuk lehet, mint a természetben előforduló EPO-nak); vagy amelyek úgy vannak megváltoztatva, hogy glikozilezésre szolgáló lehetséges helyeik közül egy vagy több hiányzik (amely eredményezhet nagyohb aktivitásokat élesztőben termelt termékeknél); vagy amelyekben egy vagy több ciszteingyök hiányzik vagy helyettesítve van pl. hisztidin- vagy szeringyökkel (mint pl. a [His7]hEPO analóg) és potenciálisan könnyebben izolálhatok aktív formában a mikrobiológiai rendszerekből; vagy amelyekben egy vagy több tírozingyök helyettesítve van fenil- 2 alaninnal (mint pl. a [Pfiel5]hEPO, [Phe49]hEPO, és [PheI4S]hEPO) és ez többé-kevésbé könnyen kötődhet EPO-receptorokhoz a célsejteken. A bejelentés szerinti vegyületek magukban foglalják azokat a polipeptidfragmenseket is, amelyek az érett EPO-n belüli folya- 2 matos aminosav-szekvenciának vagy szekunder konformációknak csupán egy részét másolja; ezek a fragmensek rendelkezhetnek az EPO egyik aktivitásával (pl. receptorkötés), míg másokkal nem (pl. eritropoietin-aktivitás). Ebben a tekintetben különösen fontosak 3 az EPO-nak azok a lehetséges fragmensei, amelyek a VI. táblázat humán genom DNS-szekvenciája figyelembevételével lehet megvilágítani, vagyis a teljes folyamatos EPO-szekvencia „fragmens”-ei, amelyeket az intronszekvenciák határolnak be, és amelyek a bioló- 31 giai aktivitás elkülönült „birtok”-ait alkothatják. Megjegyzésre méltó, hogy az in vivő aktivitás hiánya egy vagy több találmány szerinti „EPO-termék”-nél nem teljesen zárja ki a terápiás hasznosítást (lásd: Weiland és munkatársai, fentebb idézett munka) vagy a haszno- 4( sítást más összefüggésekben, pl. EPO-mérésekben vagy EPO-antagonizmusokhan. Az eritropoietin antagonistái egészen hasznosak lehetnek policitémia kezelésében vagy EPO-túltermelés esetében [lásd pl. · Adamson: Hosp. Practice, 18(12), 49-57 (1983); és 45 Hellmann és munkatársai: Clin. Láb. Haemat. 5,335342(1983)].
A jelen találmány egy másik szempontja szerint az itt leírt klónozott DNS-szekvenciák, amelyek humán és majom EPO polipeptideket kódolnak, feltétlenül érté- 50 kesek az olyan információkhoz, amelyeket ezek az emlős eritropoietin aminosav-szekvenciáját illetően nyújtanak, amelyek eddig nem voltak hozzáférhetők a természetben előforduló termékek izolátumai analitikai feldolgozására fordított évtizedek ellenére sem. A DNS-szekvenciák feltétlenül értékesek olyan termékekként is, amelyek a sokféle rekombináns technika segítségével az eritropoietin nagyléptékű mikrobiológiai szintézisének kivitelezésében használhatók. Egy másik oldalról a találmány által szolgátlatott DNSszekvenciák hasznosak új és hasznos vírus és cirkuláris plazmid DNS-vektorok létrehozásában, új és hasznos vírus és cirkuláris plazmid DNS-vektorok létrehozásában, új és hasznos transzformált és átfertőzött prokarió5 ta és eukarióta gazdasejtek létrehozásában (beleértve a bakteriális és élesztősejteket, valamint a tenyészetben nőtt emlős sejteket), és új és hasznos módszerek megalkotásában az EPO és EPO-termékek kifejezésére képes ilyen mikrohiális gazdasejtek tenyésztéses növeszf 0 léséhez. A találmány szerinti DNS-szekvenciák kétségtelenül alkalmas anyagok jelzett vizsgálómintaként való felhasználáshoz is az ember- és majomfajtól eltérő emlős fajok EPO-ját, és rokon fehérjéket kódoló cDNS- és genom. DNS-szekvenciák izolálásában, amint ezt itt részletesen illusztráltuk. Azt a mértéket, amennyire a találmány szerinti DNS-szekvenciák alkalmazást nyernek majd a fehérjeszintézis (pl. rovarsejtekben) különböző változó módszereiben, vagy az emberekben és más állatokban a genetikai terápiában,
Ό még nem lehet kiszámítani. A találmány szerinti DNSszekvenciáktól azt várjuk, hogy hasznosak lesznek az olyan átvitt génekkel rendelkező emlős fajok kifejlesztésében, amelyek eukarióta „gazdagként szolgálhatnak az eritropoietin és az eritropoietin-termékek termelésé5 hez jelentősebb mennyiségben. Lásd általában: Palmiter és munkatársai: Science, 222(4625), 809-814 (1983).
Ebben a megvilágításban áttekintve a bemutatott példákat világos, hogy nem szándékoznak korlátozni a 0 jelen találmány oltalmi körét, és várható, hogy számos módosítás és variáció alakulhat ki azok számára, akik a szakterületen jártasak. Bár a bemutatott példák által nyújtott DNS-szekvenciák magukban foglalnak cDNSés genom DNS-szekvenciákat, mivel ez a bejelentés a 5 DNS-szekvencia előállításához nélkülözhetetlen amínosavszekvencia-információt szolgáltatja, a találmány magában foglal olyan gyártott DNS-szekvenciákat is, amelyeket az EPO aminosav-szekvenciák ismereteire alapítva konstruáltunk. Ezek kódolhatják az EPO-t ) (mint a 12. példában), valamint EPO-fragmenseket és EPO polipeptidanalógokat (azaz „EPO-terméke”-ket), amelyek rendelkezhetnek a természetben előforduló EPO egy vagy több biológiai tulajdonságával, de nem rendelkeznek másokkal (vagy rendelkeznek másokkal, de eltérő mértékben).
A jelen találmány által nyújtott DNS-szekvenciák így magukban foglalnak minden olyan DNS-szekvenciát, amely alkalmas egy polipeptidtermék eukarióta vagy prokarióta gazdaszervezetében biztonságos kifejeződésben való felhasználáshoz, ahol is a nevezett polipeptidtermék az eritropoietin egy vagy több biológiai tulajdonságával és legalább a primer szerkezeti konformáció egy részével rendelkezik, ezeket a DNSszekvenciákat a következők közül választjuk kb (a) az V. és VI. táblázatban bemutatott DNS-szekvenciák; (b) azok a DNS-szekvenciák, amelyek hibridizálódnak az (a) pontban megadott DNS-szekvenciákhoz vagy azok fragmenseihez; és (c) azok a DNS-szekvenciák, amelyek kizárólag a genetikai kőd degenerációja miatt híbridizálódhatnak az (a) és (b) pontban megadott DNS32
HU 204 889 Β szekvenciákhoz. Ebben a tekintetben figyelemre méltó pl., hogy a létező alléi majom és ember EPO-génszekvenciáktól és más emlős faj génszekvenciáktól azt várjuk, hogy hibridízálódjanak az V. és VI. táblázat szekvenciáihoz vagy azok fragmenseihez. Ezen túl a genetikai kód degenerációja miatt a SCEPO- és ECEPO-gének és a gyártott vagy mutagenezisnek alávetett cDNSvagy genom DNS-szekvenciák, amelyek különböző EPO-fragmenseket és analógokat kódolnak, szintén hibridizálódnak a fentebb említett DNS-szekvenciákhoz. Az ilyen hibridizálást könnyen végre lehet hajtani az itt leírt hibridizálási feltételek között, tekintettel a majom- és humán EPO-t kódoló DNS kezdeti izolálására, vagy még szigorúbb feltételek között, ha kívánatos a háttérhibridizálás csökkentése.
Hasonló módon, miközben a fenti példák illusztrálják az EPO- termékek mikrobiális kifejeződéséről szóló találmányt bakteriális plazmid és vírus genom eredetű hibridvektorokba beiktatott DNS emlős sejt kifejeződésével kapcsolatban, a kifejeződő vektorok széles változatossága van a találmány körén belül. Vitathatatlanul idetartoznak az olyan kifejeződő rendszerek, amelyek magukban foglalják a tenyészetben levő különböző bakteriális, élesztő- és emlős sejtekhez alkalmazott homogén eredetű vektorokat, valamint az olyan kifejeződő rendszereket, amelyekben vektor nem szerepel (pl. a sejtek kalcium-foszfátos átfertőzése). Ebben a tekintetben meg kell érteni, hogy pl. a majom eredetű DNS kifejeződése tenyészetben levő majomgazdasejtekben és humán eredetű gazdasejtekben valójában „exogén” DNS kifejezésére szolgáló példákat képez, mivel az EPO DNS, amelynek magas szintű kifejeződését keressük, eredetileg nem található a gazdaszervezet genomjában. A találmány szerinti kifejeződő rendszerek továbbá azokat a gyakorlati kiviteli formákat is célozzák, amelyek az EPO-termékek citoplazmás képződését és glikozilezett és nem glikozilezett EPO-teimékek felgyülemlését eredményezik a gazdasejt citoplazmájában vagy membránjaiban (pl. felgyülemlés a bakteriális periplazmás terekben) vagy a tenyészközeg felülúszójában, amint ezeket fentebb illusztráltuk, valamint meglehetősen szokatlan rendszerekben, mint pl. P. aeruginosa kifejeződő rendszerekben [amelyet Gray és munkatársai írtak le: Biotechnology, 2,161-165 (1984)].
A találmány szerinti javított hibridizálási módszerek, bár bemutatás céljábó DNS/DNS hibridizálási átvizsgálásnál alkalmaztuk ezeket, egyaránt alkalmazhatók RNS/RNS és RNS/DNS átvizsgálásokkal is. Az itt illusztrált kevert vizsgálóminta-technikák általában egy sor javítást képeznek a hibridizálási módszerekben, lehetővé téve gyorsabb és megbízhatóbb polinukleotid izolálásokat. Ezek az egyes eljárás javítási módszerek magukban foglalják: a javított telepátviteli és fenntartási eljárásokat; nylon alapú szűrők, mint Gene Screen és Gene Screen Plus alkalmazását, hogy lehetővé tegyük az újra átvizsgálást azonos szűrőkkel és a szűrő ismételt felhasználását; új proteázos kezelés alkalmazása [viszonyítva pl. Taub és munkatársai módszeréhez: Anal. Biochem., 126, 222-230 (1982)]; nagyon kis egyedi koncentrációk alkalmazása (0,025 pikomól nagyságrendben) nagy számú kevert vizsgálómintából (pl. több, mint 32 vizsgálómintából); és hibridizálási és utóhibridizálási lépések kivitelezése szigorúan betartott hőmérsékleti körülmények között, amelyek szorosan megközelítik (azaz 4 °C-on belül, előnyösen 2 °C-on belül vannak) az alkalmazott kevert vizsgálóminták bármelyikének legkisebb kiszámított disszociációs hőmérsékletét. Ezek a javítások összességében olyan eredményeket szolgáltatnak, amelyektől nem lehetett várni, hogy az ilyen módszerekkel együtt járnak. Ezt gazdagon illusztrálja az a tény, hogy a jelen kevert vizsgálómintás eljárások az eddig valaha is sikeresen alkalmazottnak leírt vizsgálómintához viszonyítva négyszeres számú vizsgálőmintát foglalnak magukban, és még a viszonylag kis mennyiségű hírvivő RNSeken végzett cDNS átvizsgálásokban is sikeresen alkalmazhatók egy egyedi szekvenciájú gén izolálásához egy genomkönyvtárból, 1 500 000 fág tarfoltot átvizsgálva. Ezt a nagyszerű teljesítményt lényegében Anderson és munkatársainak fentebb idézett munkájában található, megfontolt véleményt tükröző kijelentésével ütközve hajtottuk végre, akik szerint a kevert vizsgálómintás átvizsgálási módszerek „gyakorlatilag megvalósíthatatlanok az emlős fehérjegének izolálásához, amikor megfelelő RNS-ek nem állnak rendelkezésre”.
Az ezt megelőző leírásban, az ezt követő igénypontokban és/vagy a kísérő ábrákban foglalt jellemző vonások mind egyenként, mind egymással kombinálva a találmány reahzálására szolgáló anyagok lehetnek azok különböző formáiban.
Claims (4)
- (1) az említett szilárd hordozóként poliamid alapú papírt alkalmazunk;1. Eljárás mikroorganizmus vagy szövettenyészet előállítására, mely a természetben előforduló eritropoietin primer szerkezetű konformációjának egy részével vagy egészével és biológiai tulajdonságai közül eggyel vagy többel rendelkezik, azzal jellemezve, hogy prokarióta vagy eukarióta gazdasejteket az alábbi DNS-szekvenciák közül eggyel transzformálunk vagy átfertőzünk:a) az V. és VI. táblázatok DNS-szekvenciái vagy azok komplementer megfelelői,b) az a) pontban definiált DNS-szekvenciákkal hibridizálódó DNS-szekvenciák vagy ezek fragmensei, vagyc) olyan DNS-szekvenciák, amelyek a genetikai kód degenerációja következtében hibridizálódnának az a) és b) pontokban definiált DNS-szekvenciákkal.
- (2) a iii) lépésben proteázos kezelést végzünk;2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-szekvenciaként egy cDNS-szekvenciát alkalmazunk.3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-szekvenciaként szintetikus DNS-szekvenciát alkalmazunk.4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-szekvenciaként egy genomiális DNS-szekvenciát alkalmazunk.HU 204 889 Β5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vagy több, E.coli sejtekben történő kifejeződésre előnyös kodont tartalmazó DNSszekvenciát alkalmazunk.6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 5 azzal jellemezve, hogy egy vagy több, élesztősejtekben történő kifejeződésre előnyös kodont tartalmazó DNSszekvenciát alkalmazunk.7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán eritropoietín kifejeződé- 10 sét kódoló DNS-szekvenciát alkalmazunk.8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a XIV. táblázatban megadott proteint kódoló régiót tartalmazó DNS-szekvenciát alkalmazunk. 159. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a XXV. táblázatban megadott proteint kódoló régiót tartalmazó DNS-szekvenciát alkalmazunk.10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 20 azzal jellemezve, hogy a PheI5hEPO-t, D?he49]hEPO-t, [Phe14S]hEPO-t, [His7]hEPO-t, [Asn2dez-Pro2-He6ig]hEPO-t, [dez-Thrlö-Arg166-ig]hEPO-t vagy [Δ2755]hEPO-t kódoló DNS-szekvenciát alkalmazunk.11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 25 azzal jellemezve, hogy a prokarióta vagy eukarióta gazdasejteket a DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-vektorral transzformáljuk vagy átfertőzzük.12. A11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vektorként autonóm replikálódó cirkuláris DNS- 30 plazmidot vagy vírusvektort alkalmazunk.13. Eljárás a 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárásban alkalmazható DNS-vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy DNS-vektorba az alábbi DNS-szekvenciákat tartalmazó DNS-t építjük be: 35a) az V. és VT. táblázatok DNS-szekvenciái vagy azok komplementer megfelelői,b) az a) pontban definiált DNS-szekvenciákkal hibridizáló DNS-szekvenciák vagy ezek fragmensei, vagy 40c) olyan DNS-szekvenciák, amelyek a genetikai kód degenerációja következtében hibridizálódnának az a) és b) pontokban definiált DNS-szekvencíákkal.14. Eljárás polipeptid előállítására, amely a tenné- 45 szetben előforduló eritropoietín primer szerkezeti konformációjának egy részével vagy egészével, és biológiai tulajdonságai közül eggyel vagy többel rendelkezik, azzal jellemezve, hogy az 1-12. igénypontok bármelyike szerint előállított mikroorganizmust vagy szövettenyé- 50 szetet alkalmas tápkőzegben tenyésztjük, a DNS kifejezésével termelt polipeptidet kinyerjük, majd adott esetben jelzőanyaggal kapcsoljuk.15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlős, proteinjellegu polipeptidet termelő mikro- 55 organizmust vagy szövettenyészetet tenyésztünk.16. A14. vagy 15. igénypont szerinti eljárás a humán eritropoietín VI. táblázatban bemutatott primer szerkezeti konformációjának vagy bármely természetes allélvariánsának egészét vagy részét tartalmazó polipeptid 60 előállítására, azzal jellemezve, hogy a tenyészetből a megfelelő polipeptidet nyerjük ki.17. A14. igénypont szerinti eljárás majom eritropoietin vagy valamely természetben előforduló allélvariánsa V. táblázatban bemutatott primer szerkezetű konformációjának részét vagy egészét tartalmazó polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a tenyészetből a megfelelő polipeptidet nyerjük ki.18. A16. vagy 17. igénypont szerinti eljárás a természetben előforduló eritropoietín immunológiai tulajdonságaival rendelkező polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a tenyészetből a megfelelő polipeptidet nyerjük ki.19. A14-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a természetben előforduló eritropoietin in vitro biológiai aktivitásával rendelkező polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a tenyészetből a megfelelő polipeptidet nyerjük ki.20. A14-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a természetben előforduló eritropoietín in vivő biológiai aktivitásával rendelkező polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a tenyészetből a megfelelő polipeptidet nyerjük ki.21. A14-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az izolált polipeptidet egy kimutatható jelzőanyaggal kovalens kapcsoljuk.22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy radioaktív jelzőanyagot alkalmazunk.23. A14-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a természetben előforduló eritropoietin másolatának megfelelő primer szerkezeti konformációval, és ennek megfelelőén az eritropoietin biológiai tulajdonságai közül eggyel vagy többel rendelkező, míg átlagos szénhidrát-összetételében a természetben előforduló humán eritropoietinétől eltérő glikoprotein polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a tenyészetből a megfelelő polipeptidet nyerjük ki.24. A 23. igénypont szerinti eljárás természetben előforduló humán eritropoietin másolatának megfelelő primer szerkezeti konformációval, és ennek megfelelően a humán eritropoietin biológiai tulajdonságai közül eggyel vagy többel rendelkező, míg átlagos szénhidrát-összetételében a természetben előforduló humán eritropoietinétől eltérő glikoprotein polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő polipeptidet nyerjük ki.25. A14-24. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy folyamatosan szaporítható in vitro és tenyészetben növesztéskor a tápközegben, radiohnmunassayval meghatározható, legalább 100 egység eritropoietin/IO6 sejt termelésére képes, emlős gazdasejteket tenyésztünk.26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 48 óra alatt legalább 500 egység eritropoietin/106 sejt termelésére képes emlős gazdasejteket tenyésztünk.27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 48 óra alatt legalább 1000 egység erifropoietin/106 sejt termelésére képes emlős gazdasejteket tenyésztünk.28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlős gazdasejtként COS-1 vagy CHO-sejtet tenyésztünk.HU 204 889 Β29. Eljárás vörösvérsejt képződést szabályozó gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a 19-29. igénypontok bármelyike szerint előállított polipeptidet legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal együtt szokásos dózisformává alakítunk.30. Eljárás antitestek előállítására, melyek immunreakciót adnak eritropoietinnel és egy szintetikus polipeptiddel, mely olyan primer szerkezeti konformációval rendelkezik, amely lényegében a természetben előforduló eritropoietin folyamatos aminosav-szekvenciájának megfelelő másolata, kivéve bármely olyan polipeptidet, mely azA-P-P-R-L-I-C-D-S-R-V-L-E-R-Y-L-L-E-A-K szekvencián teljesen belül eső aminosav-szekvenciát tartalmaz, azzal jellemezve, hogy megfelelő tápközegben a fenti antitest képzésére alkalmas sejteket tenyésztünk, majd a kívánt antitestet izoláljuk.31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestként monoklonális antitesteket izolálunk.32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestként poliklonáiis antitesteket izolálunk.33. A 30. igénypont szerinti eljárás az eritropoietinnel és egyV-P-D-T-K-V-N-F-Y-A-W-K-R-M-E-V-G, vagy K-E-A-I-S-P-P-D-A-A-S-A-A, vagyV-Y-S-N-F-L-R-G-K-L-K-L-Y-T-G-E-A-C-R-T-G-D-R szekvenciájú szintetikus polipeptiddel immunreakciót adó antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy a kívánt antitestet izoláljuk.34. Eljárás ismeretlen szekvenciájú speciális egyszálú polinukleotid kimutatására heterogén celluláris vagy vírusmintában, amely több egyszálú polinukleotidot foglal magában, amelynek soráni) jelzett egyszálú polinukleotid-vizsgáló minták keverékét készítjük el, amely bázisok egységesen változó szekvenciájával rendelkeznek, és ahol az említett vizsgálóminták mindegyike potenciálisan fajlagosan komplementer olyan bázisok szekvenciájával, amely feltehetőleg egyedi a kimutatandó polinukleotidra;ii) a mintát szilárd hordozón rögzítjük;iii) a rögzített mintát tartalmazó szubsztrátumot kezeljük, annak megakadályozására, hogy polinukleotidok tovább kötődjenek más módon, mint az említett mintában a polinukleotidokhoz való hibridizálódással;iv) a rögzített mintával rendelkező kezelt szubsztrátumot átmenetileg érintkezésbe hozzuk a jelzett vizsgálóminták keverékével olyan körülmények között, amely csak a teljesen komplementer polinukleotidok közti hibridizálódásnak kedvez; ésv) a speciális nukleotidokat kimutatjuk azok és a jelzett vizsgálóminták említett keverékén belüli teljesen komplementer vizsgálóminták között fellépő hibridizálási reakció jelenlétének megfigyelésével, ahol a jelzett anyag nagyobb sűrűségben van jelen a szubsztrátum speciális polinukleotid helyénél, mint a jelzett anyag háttérsűrűsége, amely a jelzett vizsgálómintáknak a szubsztrátumhoz való nem fajlagos kötődésének eredménye; azzal jellemezve, hogy 32 kevert vizsgálóminta feleslegét alkalmazzuk, és az alábbi lépések közül egyet vagy többet hajtunk végre:
- (3) mintegy 0,025 pikomől koncentrációban alkalmazzuk az egyes jelölt vizsgálómintákat; és (4) a iv) lépésben a hibridizálási feltételek egyikeként olyan szigorú hőmérsékleti körülményeket alkalmazunk, hogy a hőmérséklet
- 4 °C-kal közelítse meg az alkalmazott vizsgálóminták bármelyikének legkisebb számított Td-értékét.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US65584184A | 1984-09-28 | 1984-09-28 | |
| US06/675,298 US4703008A (en) | 1983-12-13 | 1984-11-30 | DNA sequences encoding erythropoietin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT40694A HUT40694A (en) | 1987-01-28 |
| HU204889B true HU204889B (en) | 1992-02-28 |
Family
ID=27097052
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU852404A HU204889B (en) | 1984-09-28 | 1985-06-18 | Process for producing erythropoietin |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1016795B (hu) |
| CZ (1) | CZ281542B6 (hu) |
| FI (1) | FI93470C (hu) |
| GE (1) | GEP19991639B (hu) |
| GR (1) | GR852245B (hu) |
| HU (1) | HU204889B (hu) |
| NO (1) | NO852384L (hu) |
| PT (1) | PT81213B (hu) |
| SK (1) | SK279959B6 (hu) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106608906A (zh) * | 2015-10-22 | 2017-05-03 | 天津药物研究院有限公司 | 一种具有刺激红细胞生成功能的环形多肽的制备及其应用 |
-
1985
- 1985-06-13 NO NO852384A patent/NO852384L/no unknown
- 1985-06-14 FI FI852377A patent/FI93470C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-06-18 SK SK4438-85A patent/SK279959B6/sk unknown
- 1985-06-18 CZ CS854438A patent/CZ281542B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1985-06-18 HU HU852404A patent/HU204889B/hu unknown
- 1985-06-19 CN CN85106191A patent/CN1016795B/zh not_active Expired
- 1985-09-16 GR GR852245A patent/GR852245B/el unknown
- 1985-09-27 PT PT81213A patent/PT81213B/pt unknown
-
1993
- 1993-07-09 GE GEAP1993984A patent/GEP19991639B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SK443885A3 (en) | 1999-06-11 |
| PT81213B (pt) | 1987-09-30 |
| SK279959B6 (sk) | 1999-06-11 |
| CN1016795B (zh) | 1992-05-27 |
| FI852377A0 (fi) | 1985-06-14 |
| CN85106191A (zh) | 1987-07-29 |
| CZ281542B6 (cs) | 1996-11-13 |
| GEP19991639B (en) | 1999-03-23 |
| CZ443885A3 (en) | 1996-09-11 |
| NO852384L (no) | 1986-04-01 |
| FI93470B (fi) | 1994-12-30 |
| GR852245B (hu) | 1986-01-17 |
| FI93470C (fi) | 1995-04-10 |
| FI852377L (fi) | 1986-03-29 |
| PT81213A (en) | 1985-10-01 |
| HUT40694A (en) | 1987-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4703008A (en) | DNA sequences encoding erythropoietin | |
| US5547933A (en) | Production of erythropoietin | |
| US5756349A (en) | Production of erythropoietin | |
| FI113372B (fi) | Menetelmä LIF-polypeptidin (LIF = Leukemiaa estävä tekijä) valmistamiseksi | |
| CA2005358A1 (en) | Somatotropin analogs | |
| HU204889B (en) | Process for producing erythropoietin | |
| RU2261276C2 (ru) | Выделенная молекула днк, кодирующая эритропоэтин человека, (варианты), экспрессирующий плазмидный или вирусный днк-вектор, гликопротеид эритропоэтин (варианты) и способ его получения, фармацевтическая композиция (варианты), линия клеток млекопитающего (варианты) | |
| AU4252400A (en) | Production of erythropoietin | |
| CA1341607C (en) | Production of erythropoietin | |
| AU1974001A (en) | Production of erythropoietin | |
| DK172611B1 (da) | DNA-sekvens kodende for erythropoietin, vektor inkluderende sekvensen, vært transformeret eller transficeret med sekvensen, | |
| LT4012B (en) | Process for the preparation of polipeptides | |
| DD251786A5 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids |