JP2002209593A - 微生物由来のインビトロ発現法またはインビボ発現法によって生産されたエリスロポエチンの突然変異体の修飾体およびその生産方法 - Google Patents
微生物由来のインビトロ発現法またはインビボ発現法によって生産されたエリスロポエチンの突然変異体の修飾体およびその生産方法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 微生物のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖ
ｏ発現法から得られた、生物学的活性が増大した、エリ
スロポエチン（ＥＰＯ）の修飾された突然変異体及びそ
の生産方法の提供。 【解決手段】生物学的活性をもつＥＰＯの突然変異体の
修飾体を生産する方法であって、修飾位置のアミノ酸に
相応するコドンを、位置選択的突然変異法により、フレ
ームシフトコドンに転換する工程；無細胞蛋白質生産に
おいて、ｔＲＮＡに結合した非天然性アミノ酸をＥＰＯ
蛋白質に結合させるために、フレームシフトコドンに相
応するサプレッサーｔＲＮＡを含有させ、それによって
ＥＰＯの突然変異体を生産する工程；及びＥＰＯの突然
変異体に少なくとも一つの修飾物質を結合させる工程か
らなることを特徴とするＥＰＯの突然変異体の修飾体を
生産する方法、及び該方法により得られるＥＰＯの突然
変異体の修飾体によって提供。
ｏ発現法から得られた、生物学的活性が増大した、エリ
スロポエチン（ＥＰＯ）の修飾された突然変異体及びそ
の生産方法の提供。 【解決手段】生物学的活性をもつＥＰＯの突然変異体の
修飾体を生産する方法であって、修飾位置のアミノ酸に
相応するコドンを、位置選択的突然変異法により、フレ
ームシフトコドンに転換する工程；無細胞蛋白質生産に
おいて、ｔＲＮＡに結合した非天然性アミノ酸をＥＰＯ
蛋白質に結合させるために、フレームシフトコドンに相
応するサプレッサーｔＲＮＡを含有させ、それによって
ＥＰＯの突然変異体を生産する工程；及びＥＰＯの突然
変異体に少なくとも一つの修飾物質を結合させる工程か
らなることを特徴とするＥＰＯの突然変異体の修飾体を
生産する方法、及び該方法により得られるＥＰＯの突然
変異体の修飾体によって提供。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血液循環における
プラズマ（ｐｌａｓｍａ）の半減期を延長させる作用を
有する、微生物由来のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
発現法またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）発現法によっ
て生産されたエリスロポエチンの突然変異体の修飾体、
およびこれらの選択的なＥＰＯの突然変異体の修飾体の
生産方法に関する。修飾物質をもつ微生物から得られた
ＥＰＯの突然変異体の修飾体は、修飾されていない突然
変異体や微生物から得られたＥＰＯのポリペプチドに比
べて、生物学的活性が増加するものとなる。
プラズマ（ｐｌａｓｍａ）の半減期を延長させる作用を
有する、微生物由来のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
発現法またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）発現法によっ
て生産されたエリスロポエチンの突然変異体の修飾体、
およびこれらの選択的なＥＰＯの突然変異体の修飾体の
生産方法に関する。修飾物質をもつ微生物から得られた
ＥＰＯの突然変異体の修飾体は、修飾されていない突然
変異体や微生物から得られたＥＰＯのポリペプチドに比
べて、生物学的活性が増加するものとなる。
【０００２】
【従来の技術】エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏ
ｉｅｔｉｎ；ＥＰＯ）は、現在、慢性腎不全症をはじめ
いくつかの原因による貧血を治療するのに使用されてい
る治療用糖蛋白質である。ＥＰＯは、哺乳類と鳥類にお
いて赤血球の生産に係わる主要な制御因子である。特
に、この糖蛋白質ホルモンは、骨髄、脾臓および胎児の
肝で赤血球幹細胞が早く成長することを促進したり、そ
の後、末梢血管を循環する赤血球の末期分化（ｔｅｒｎ
ｉｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）に必要で
ある。治療用ＥＰＯは、現在、動物細胞培養で生産され
ている。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；
Ｅ．ｃｏｌｉ）のような微生物から生産したＥＰＯのポ
リペプチドは、糖鎖（ｇｌｙｃａｎｓ）がないので治療
目的で使用することができない。そのため、微生物から
生産したＥＰＯの突然変異体の修飾体の生産方法に加え
て、次のような生物学的活性を付与する新しい方法の開
発が求められる。本発明では、ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）の付加（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）を含む修飾
過程を導入した。微生物由来のＥＰＯの突然変異体の修
飾のために、インビトロ蛋白質生産（ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）とポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）の修飾、またはインビボ（ｉｎ
ｖｉｖｏ）発現とＰＥＧの修飾（ＰＥＧｙｌａｔｉｏ
ｎ）を含む選択的修飾過程を利用した。ここで、ＥＰＯ
の突然変異体とは、自然のままのＥＰＯと一部分が異な
る変異蛋白質を意味する。
ｉｅｔｉｎ；ＥＰＯ）は、現在、慢性腎不全症をはじめ
いくつかの原因による貧血を治療するのに使用されてい
る治療用糖蛋白質である。ＥＰＯは、哺乳類と鳥類にお
いて赤血球の生産に係わる主要な制御因子である。特
に、この糖蛋白質ホルモンは、骨髄、脾臓および胎児の
肝で赤血球幹細胞が早く成長することを促進したり、そ
の後、末梢血管を循環する赤血球の末期分化（ｔｅｒｎ
ｉｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）に必要で
ある。治療用ＥＰＯは、現在、動物細胞培養で生産され
ている。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；
Ｅ．ｃｏｌｉ）のような微生物から生産したＥＰＯのポ
リペプチドは、糖鎖（ｇｌｙｃａｎｓ）がないので治療
目的で使用することができない。そのため、微生物から
生産したＥＰＯの突然変異体の修飾体の生産方法に加え
て、次のような生物学的活性を付与する新しい方法の開
発が求められる。本発明では、ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）の付加（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）を含む修飾
過程を導入した。微生物由来のＥＰＯの突然変異体の修
飾のために、インビトロ蛋白質生産（ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）とポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）の修飾、またはインビボ（ｉｎ
ｖｉｖｏ）発現とＰＥＧの修飾（ＰＥＧｙｌａｔｉｏ
ｎ）を含む選択的修飾過程を利用した。ここで、ＥＰＯ
の突然変異体とは、自然のままのＥＰＯと一部分が異な
る変異蛋白質を意味する。
【０００３】Ｉｎ ｖｉｖｏ発現やｉｎ ｖｉｔｒｏ発
現などの発現方法にかかわらず、微生物から生産された
ＥＰＯのポリペプチドはオリゴ糖鎖（ｏｌｉｇｏｓａｃ
ｃｈａｒｉｄｅ）の欠乏によって生物学的活性をあまり
示さない。ポリペプチドの消滅速度の増加のため薬理活
性を示せないのである。ここで、ＥＰＯのポリペプチド
とは、糖鎖（ｇｌｙｃａｎｓ）を除外した蛋白質のペプ
チドの部分だけを意味する。このような問題点は、ＥＰ
Ｏの突然変異体を修飾することによって解決できる。治
療に役立つポリペプチドの生物学的活性を増加させるた
めに多くの研究が行われた。ここで、生物学的活性の増
加とは、血液内での滞在時間の増加を意味する。医薬用
蛋白質の生物学的活性を増加させるために多くの方法が
考案された。このような方法はしばしば薬用製剤の大き
さを増加させるのに主眼点を置いた。例えば、蛋白質を
巨大分子やＰＥＧのような物質と化学的に結合させて、
そのサイズを大きくすることができる。“ＰＥＧ化（Ｐ
ＥＧｙｌａｔｉｏｎ）”として知られた方法は、様々な
蛋白質について報告されたものであり（米国特許第４，
１７９，３３７号）、最初は目的蛋白質の抗原性（ａｎ
ｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ）を減少させるために使用された
が、生物学的活性の増加の方法としても使用されてい
る。
現などの発現方法にかかわらず、微生物から生産された
ＥＰＯのポリペプチドはオリゴ糖鎖（ｏｌｉｇｏｓａｃ
ｃｈａｒｉｄｅ）の欠乏によって生物学的活性をあまり
示さない。ポリペプチドの消滅速度の増加のため薬理活
性を示せないのである。ここで、ＥＰＯのポリペプチド
とは、糖鎖（ｇｌｙｃａｎｓ）を除外した蛋白質のペプ
チドの部分だけを意味する。このような問題点は、ＥＰ
Ｏの突然変異体を修飾することによって解決できる。治
療に役立つポリペプチドの生物学的活性を増加させるた
めに多くの研究が行われた。ここで、生物学的活性の増
加とは、血液内での滞在時間の増加を意味する。医薬用
蛋白質の生物学的活性を増加させるために多くの方法が
考案された。このような方法はしばしば薬用製剤の大き
さを増加させるのに主眼点を置いた。例えば、蛋白質を
巨大分子やＰＥＧのような物質と化学的に結合させて、
そのサイズを大きくすることができる。“ＰＥＧ化（Ｐ
ＥＧｙｌａｔｉｏｎ）”として知られた方法は、様々な
蛋白質について報告されたものであり（米国特許第４，
１７９，３３７号）、最初は目的蛋白質の抗原性（ａｎ
ｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ）を減少させるために使用された
が、生物学的活性の増加の方法としても使用されてい
る。
【０００４】ＰＥＧ−蛋白質の結合体（ｃｏｎｊｕｇａ
ｔｅｓ）を形成するために多くの技術が開発されたが、
最も多く使用されている方法は、化学的誘導体化（ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）を使用
する方法で、これを利用して蛋白質の一次配列（ｐｒｉ
ｍａｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に何ら変化を与えるこ
となしに、医薬用巨大分子の特性だけを変化させること
ができる。化学的誘導体化を利用する第一の目的は、高
い薬効の医薬を生み出すために、生物学的有用性（ｂｉ
ｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）（特に血液内での滞在時
間の延長に関しての）を高めることである。化学的ＰＥ
Ｇ化をはじめ既存の修飾方法は、化学的反応性が似てい
る各アミノ酸の修飾しうる側鎖をすべて修飾するので、
非特異的な修飾に限定されるという問題がある。一般的
に蛋白質を構成する２０個のアミノ酸の中で、理論的に
は、１３個が異なる化学的物質と反応可能な側鎖官能基
を持つ。シスチンのジスルフィド結合と、ポリペプチド
の主骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）の第二級アミド結合を含
むと、蛋白質内では基本的に次の１４種類の化学的反応
性を持つグループが考えられる。すなわち、チオ−（シ
ステイン（Ｃｙｓ）、まれにセレノシステイン（ｓｅｌ
ｅｎｏ−Ｃｙｓ））、メチルチオ−（メチオニン（Ｍｅ
ｔ））、ジスルフィド結合、第一および第二ヒドロキシ
ル基（セリン、トレオニン）、フェノール性ヒドロキシ
ル基（チロシン）、インドール（トリプトファン）、第
一級アミノ基（リシン、Ｎ−末端）、カルボキシル基
（アスパラギン酸、グルタミン酸、Ｃ−末端）、グアニ
ジン（アルギニン）、第一級アミド（アスパラギン、グ
ルタミン）、第二級アミドと第三級アミド（プロリ
ン）、イミダゾール（ヒスチジン）である。多くのいろ
いろな化学的試薬は、官能基をもつ一つまたはそれ以上
のこれら蛋白質に、ある程度の特異性を呈するが、ほと
んどの試薬は、これら蛋白質の反応可能な全ての基を修
飾する。
ｔｅｓ）を形成するために多くの技術が開発されたが、
最も多く使用されている方法は、化学的誘導体化（ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）を使用
する方法で、これを利用して蛋白質の一次配列（ｐｒｉ
ｍａｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に何ら変化を与えるこ
となしに、医薬用巨大分子の特性だけを変化させること
ができる。化学的誘導体化を利用する第一の目的は、高
い薬効の医薬を生み出すために、生物学的有用性（ｂｉ
ｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）（特に血液内での滞在時
間の延長に関しての）を高めることである。化学的ＰＥ
Ｇ化をはじめ既存の修飾方法は、化学的反応性が似てい
る各アミノ酸の修飾しうる側鎖をすべて修飾するので、
非特異的な修飾に限定されるという問題がある。一般的
に蛋白質を構成する２０個のアミノ酸の中で、理論的に
は、１３個が異なる化学的物質と反応可能な側鎖官能基
を持つ。シスチンのジスルフィド結合と、ポリペプチド
の主骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）の第二級アミド結合を含
むと、蛋白質内では基本的に次の１４種類の化学的反応
性を持つグループが考えられる。すなわち、チオ−（シ
ステイン（Ｃｙｓ）、まれにセレノシステイン（ｓｅｌ
ｅｎｏ−Ｃｙｓ））、メチルチオ−（メチオニン（Ｍｅ
ｔ））、ジスルフィド結合、第一および第二ヒドロキシ
ル基（セリン、トレオニン）、フェノール性ヒドロキシ
ル基（チロシン）、インドール（トリプトファン）、第
一級アミノ基（リシン、Ｎ−末端）、カルボキシル基
（アスパラギン酸、グルタミン酸、Ｃ−末端）、グアニ
ジン（アルギニン）、第一級アミド（アスパラギン、グ
ルタミン）、第二級アミドと第三級アミド（プロリ
ン）、イミダゾール（ヒスチジン）である。多くのいろ
いろな化学的試薬は、官能基をもつ一つまたはそれ以上
のこれら蛋白質に、ある程度の特異性を呈するが、ほと
んどの試薬は、これら蛋白質の反応可能な全ての基を修
飾する。
【０００５】修飾反応の特異性を向上するために、ポリ
ペプチド内に、修飾物質に特異的な反応性側鎖を持つ非
天然性アミノ酸を導入することが必要である。これは無
細胞蛋白質生産法（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）の技術を利用することでのみ
可能である。
ペプチド内に、修飾物質に特異的な反応性側鎖を持つ非
天然性アミノ酸を導入することが必要である。これは無
細胞蛋白質生産法（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）の技術を利用することでのみ
可能である。
【０００６】無細胞蛋白質生産法は、特に宿主細胞に対
する毒性によってｉｎ ｖｉｖｏで生産できない蛋白質
のために、ｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝子を発現させる研究
の実験的手段として使用された。無細胞蛋白質生産法
は、最近では、産業的に重要な蛋白質を生産する細胞培
養法の代替生産手段として再評価されている。これは主
に、新しい反応器システムの開発と、反応器の運転条件
の広範囲な最適化によるためである（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．
ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９：
８８１−８８６（１９９６）；Ｋｉｇａｗａ，Ｔ．ｅｔ
ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４４２：１５−１９
（１９９９））。さらに、２０個の天然アミノ酸のほか
にも、さまざまな非天然アミノ酸を、特定の目的のため
に、この方法を使って、蛋白質の構造内の意図する位置
に導入することが可能になった（Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．
ｅｔ，ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１８２−１８
８（１９８９））。
する毒性によってｉｎ ｖｉｖｏで生産できない蛋白質
のために、ｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝子を発現させる研究
の実験的手段として使用された。無細胞蛋白質生産法
は、最近では、産業的に重要な蛋白質を生産する細胞培
養法の代替生産手段として再評価されている。これは主
に、新しい反応器システムの開発と、反応器の運転条件
の広範囲な最適化によるためである（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．
ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９：
８８１−８８６（１９９６）；Ｋｉｇａｗａ，Ｔ．ｅｔ
ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４４２：１５−１９
（１９９９））。さらに、２０個の天然アミノ酸のほか
にも、さまざまな非天然アミノ酸を、特定の目的のため
に、この方法を使って、蛋白質の構造内の意図する位置
に導入することが可能になった（Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．
ｅｔ，ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１８２−１８
８（１９８９））。
【０００７】無細胞蛋白質生産法とは別な試みが、位置
選択的突然変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔ
ａｇｅｎｅｓｉｓ）を伴うｉｎ ｖｉｖｏ発現法であ
る。この方法においては、フリースルフヒドリル基（ｆ
ｒｅｅ ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌｇｒｏｕｐｓ）が無い遺
伝子コードを持つ蛋白質だけが、蛋白質の遺伝子の特定
位置のアミノ酸のコドンをシステインをコードするコド
ンを持つように改変できる。その結果、修飾位置にシス
テインが導入された突然変異体は、フリースルフヒドリ
ル基を含むものとなる。このフリースルフヒドリル基を
修飾反応の特定の位置として利用する。（米国特許第
５，２０６，３４４号）。
選択的突然変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔ
ａｇｅｎｅｓｉｓ）を伴うｉｎ ｖｉｖｏ発現法であ
る。この方法においては、フリースルフヒドリル基（ｆ
ｒｅｅ ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌｇｒｏｕｐｓ）が無い遺
伝子コードを持つ蛋白質だけが、蛋白質の遺伝子の特定
位置のアミノ酸のコドンをシステインをコードするコド
ンを持つように改変できる。その結果、修飾位置にシス
テインが導入された突然変異体は、フリースルフヒドリ
ル基を含むものとなる。このフリースルフヒドリル基を
修飾反応の特定の位置として利用する。（米国特許第
５，２０６，３４４号）。
【０００８】医療用蛋白質を合成高分子で修飾すること
は、潜在的に次のような二つの長所を持つ。最も重要な
ことは、蛋白質の血液内滞在時間を増加させて血組織内
での生物学的活性を増加させることである。二番目は、
外来蛋白質の抗原性を示す部位が高分子に隠されること
によって、ワクチンなどの免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅ
ｎｉｃｉｔｙ）を変化（ａｌｔｅｒ）できることであ
る。上記の二つの場合には、修飾に使用される物質に高
分子が好適である。なぜならば、高分子を使用すると、
蛋白質の表面の比較的少ない変異であっても、効果的に
分子量を増加できるためと、他の巨大分子との相互作用
を減少できるためである。これらの変異は、受容体（ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒｓ）（すなわち、血漿クリアランス（ｐ
ｌａｓｍａｃｌｅａｒａｎｃｅ）や免疫システムの認識
において必要とされるような受容体）と相互作用する蛋
白質の新規な表面を作り出し、これはしばしば異なった
性質を示すこともある。多くの医療用蛋白質が合成高分
子で修飾されている。特にポリ（エチレングリコール）
（ＰＥＧｓ）を利用した事例が多い；特に、多様な分子
量のものが商業的に入手可能であること、オキシエチレ
ン構造（ｂａｃｋｂｏｎｅ）（このそれぞれのユニット
が２から３モルの水と結合する）の親水性またはメトキ
シポリ（エチレングリコール）由来の単官能基誘導体の
合成の簡便さのためである。
は、潜在的に次のような二つの長所を持つ。最も重要な
ことは、蛋白質の血液内滞在時間を増加させて血組織内
での生物学的活性を増加させることである。二番目は、
外来蛋白質の抗原性を示す部位が高分子に隠されること
によって、ワクチンなどの免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅ
ｎｉｃｉｔｙ）を変化（ａｌｔｅｒ）できることであ
る。上記の二つの場合には、修飾に使用される物質に高
分子が好適である。なぜならば、高分子を使用すると、
蛋白質の表面の比較的少ない変異であっても、効果的に
分子量を増加できるためと、他の巨大分子との相互作用
を減少できるためである。これらの変異は、受容体（ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒｓ）（すなわち、血漿クリアランス（ｐ
ｌａｓｍａｃｌｅａｒａｎｃｅ）や免疫システムの認識
において必要とされるような受容体）と相互作用する蛋
白質の新規な表面を作り出し、これはしばしば異なった
性質を示すこともある。多くの医療用蛋白質が合成高分
子で修飾されている。特にポリ（エチレングリコール）
（ＰＥＧｓ）を利用した事例が多い；特に、多様な分子
量のものが商業的に入手可能であること、オキシエチレ
ン構造（ｂａｃｋｂｏｎｅ）（このそれぞれのユニット
が２から３モルの水と結合する）の親水性またはメトキ
シポリ（エチレングリコール）由来の単官能基誘導体の
合成の簡便さのためである。
【０００９】幾つかのタイプの化学的な結合が考案され
てきた。ある重合体（例えば、エチレン／無水マレイン
酸共重合体）は、本質的に反応性を持つが、多くの場合
は（はじめに）多反応性化学物質を利用する特別な活性
化段階が必要である。当初は、トリ−またはジ−ハロト
リアジンの水素を部分的に置換することがアミノ基とヒ
ドロキシル基の両方を持つ高分子を活性化するための一
般的な方法であったが、最近は、副反応やトリアジンの
反応性などの問題からほとんど使用されていない。カル
ボニルジイミダゾールは、ＰＥＧｓのヒドロキシ基をア
クリルイミダゾールに活性化させるのに大変有効な試薬
であり、このアクリルイミダゾールは、蛋白質のアミノ
基に対して良い反応性を持つ。高分子が加水分解によっ
て除去できる場合には（例えば、スクシニル−ＰＥＧの
活性エステルの利用）、ある結合戦略が高分子−蛋白質
の可逆結合に起こる。ジスルフィド結合の交換反応に基
づく方法は、蛋白質−蛋白質結合体を形成する反応に主
に使用されているが、蛋白質と高分子を結合するのには
あまり使用されていない。６０ｋＤａ以上の分子量の増
加した蛋白質が血漿クリアランス（ｐｌａｓｍａ ｃｌ
ｅａｒａｎｃｅ）に大きな影響を持つことは、ＰＥＧで
修飾された医療用蛋白質の研究から明らかであるが、そ
の影響の大きさは、修飾されていない蛋白質のクリアラ
ンスのメカニズムに多くを依存し、受容体によるクリア
ランスが行われた場合よりも、糸球体濾過（ｇｌｏｍｅ
ｒｕｌａｒ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によるクリアラン
スが主な場合に、より大きく影響する。
てきた。ある重合体（例えば、エチレン／無水マレイン
酸共重合体）は、本質的に反応性を持つが、多くの場合
は（はじめに）多反応性化学物質を利用する特別な活性
化段階が必要である。当初は、トリ−またはジ−ハロト
リアジンの水素を部分的に置換することがアミノ基とヒ
ドロキシル基の両方を持つ高分子を活性化するための一
般的な方法であったが、最近は、副反応やトリアジンの
反応性などの問題からほとんど使用されていない。カル
ボニルジイミダゾールは、ＰＥＧｓのヒドロキシ基をア
クリルイミダゾールに活性化させるのに大変有効な試薬
であり、このアクリルイミダゾールは、蛋白質のアミノ
基に対して良い反応性を持つ。高分子が加水分解によっ
て除去できる場合には（例えば、スクシニル−ＰＥＧの
活性エステルの利用）、ある結合戦略が高分子−蛋白質
の可逆結合に起こる。ジスルフィド結合の交換反応に基
づく方法は、蛋白質−蛋白質結合体を形成する反応に主
に使用されているが、蛋白質と高分子を結合するのには
あまり使用されていない。６０ｋＤａ以上の分子量の増
加した蛋白質が血漿クリアランス（ｐｌａｓｍａ ｃｌ
ｅａｒａｎｃｅ）に大きな影響を持つことは、ＰＥＧで
修飾された医療用蛋白質の研究から明らかであるが、そ
の影響の大きさは、修飾されていない蛋白質のクリアラ
ンスのメカニズムに多くを依存し、受容体によるクリア
ランスが行われた場合よりも、糸球体濾過（ｇｌｏｍｅ
ｒｕｌａｒ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によるクリアラン
スが主な場合に、より大きく影響する。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、血液内の滞
在時間を延長させる作用を有する、微生物から生産され
るＥＰＯの突然変異体の修飾体と、そのＥＰＯの突然変
異体の位置選択的修飾方法に関する。ここで、向上され
た生物学的活性というのは、血液内滞在時間の増加（つ
まり、微生物を利用して発現した修飾されていないＥＰ
Ｏの突然変異体よりも、血液内滞在時間を長くするこ
と）を意味する。さらに、本発明は、上述の血液内の滞
在時間を延長させる作用を有する、修飾されたＥＰＯの
突然変異体の製造方法に関し、さらにまた、これらの利
用方法にも関する。微生物から得られたＥＰＯの突然変
異体の修飾物質による修飾は、微生物によって製造され
たＥＰＯのポリペプチドや、修飾されないＥＰＯの突然
変異体などに比べて、向上した生物学的活性が得られ
た。
在時間を延長させる作用を有する、微生物から生産され
るＥＰＯの突然変異体の修飾体と、そのＥＰＯの突然変
異体の位置選択的修飾方法に関する。ここで、向上され
た生物学的活性というのは、血液内滞在時間の増加（つ
まり、微生物を利用して発現した修飾されていないＥＰ
Ｏの突然変異体よりも、血液内滞在時間を長くするこ
と）を意味する。さらに、本発明は、上述の血液内の滞
在時間を延長させる作用を有する、修飾されたＥＰＯの
突然変異体の製造方法に関し、さらにまた、これらの利
用方法にも関する。微生物から得られたＥＰＯの突然変
異体の修飾物質による修飾は、微生物によって製造され
たＥＰＯのポリペプチドや、修飾されないＥＰＯの突然
変異体などに比べて、向上した生物学的活性が得られ
た。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明のＥＰＯの突然変
異体の修飾体は、無細胞蛋白質生産法または微生物のｉ
ｎ ｖｉｖｏ発現法で生産されたものからなり、ＰＥＧ
ｓ、単糖類（ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、二糖
類（ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、オリゴ糖（ｏｌｉ
ｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）および多糖類（ｐｏｌｙ
ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）などの修飾物質によって、化
学的、酵素的または化学的−酵素的に修飾されたもので
ある。ここで、化学的−酵素的修飾または化学的−酵素
的反応というのは、化学的修飾／反応と酵素的修飾／反
応の組み合わせを意味し、修飾物質というのは、無細胞
蛋白質生産法や微生物のｉｎ ｖｉｖｏ発現法で生産さ
れたＥＰＯ突然変異体内に導入された特定アミノ酸の反
応基と反応できる反応基を持つ物質を意味する。特定の
場合において、修飾物質は、すでに非天然のアミノ酸に
結合されていても良い。
異体の修飾体は、無細胞蛋白質生産法または微生物のｉ
ｎ ｖｉｖｏ発現法で生産されたものからなり、ＰＥＧ
ｓ、単糖類（ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、二糖
類（ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、オリゴ糖（ｏｌｉ
ｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）および多糖類（ｐｏｌｙ
ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）などの修飾物質によって、化
学的、酵素的または化学的−酵素的に修飾されたもので
ある。ここで、化学的−酵素的修飾または化学的−酵素
的反応というのは、化学的修飾／反応と酵素的修飾／反
応の組み合わせを意味し、修飾物質というのは、無細胞
蛋白質生産法や微生物のｉｎ ｖｉｖｏ発現法で生産さ
れたＥＰＯ突然変異体内に導入された特定アミノ酸の反
応基と反応できる反応基を持つ物質を意味する。特定の
場合において、修飾物質は、すでに非天然のアミノ酸に
結合されていても良い。
【００１２】修飾されていないＥＰＯの突然変異体は、
次のような微生物由来の無細胞蛋白質生産法によって生
産される。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または組換
え型の微生物の培養、位置選択的突然変異法で糖鎖付加
位置に置換されたコドンを持つＥＰＯのｃＤＮＡプラス
ミドが導入された大腸菌の菌株などである。修飾されて
いないＥＰＯの突然変異体は、一般的なＰＥＧ化の方法
により、位置選択的に修飾される。
次のような微生物由来の無細胞蛋白質生産法によって生
産される。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または組換
え型の微生物の培養、位置選択的突然変異法で糖鎖付加
位置に置換されたコドンを持つＥＰＯのｃＤＮＡプラス
ミドが導入された大腸菌の菌株などである。修飾されて
いないＥＰＯの突然変異体は、一般的なＰＥＧ化の方法
により、位置選択的に修飾される。
【００１３】無細胞蛋白質生産法によって生産されたＥ
ＰＯの突然変異体は、修飾物質に特異的な反応性がある
側鎖（保護基によって保護されていたり保護されていな
い状態である）を持った非天然性アミノ酸が導入され
る。このような非天然性アミノ酸の導入は、無細胞蛋白
質生産法によってのみ可能である。修飾させる位置のア
ミノ酸残基のコドンは、位置選択的突然変異法で、アン
バーストップコドン（ａｍｂｅｒ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏ
ｎ）に置換される。アンバーストップコドンを持つ新し
い遺伝子（ｔｅｍｐｌａｔｅ）は、無細胞蛋白質生産法
で発現される。他のストップコドンとレアコドンによる
フレームシフト（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｓｂｙ ｒａｒ
ｅ ｃｏｄｏｎ）（Ｈｏｈｓａｋａ， Ｔ． ｅｔ．
ａｌ．，Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１
８：９７７８−９７７９ （１９９６））は、上述と同
様な方法で、アンバーストップコドンの代わりに利用す
ることができる。無細胞蛋白質生産系に、特定の非天然
性アミノ酸をコード化（ｅｎｃｏｄｅ）するために、ア
ンバーストップコドンに相応するサプレッサーｔＲＮＡ
を導入する。このように導入された非天然性アミノ酸
は、修飾物質に特異的反応性を示すので、これを位置選
択的な修飾に利用する。発現されたＥＰＯの突然変異体
を分離して、化学的方法、酵素的方法、または化学的−
酵素的方法を利用して修飾する。
ＰＯの突然変異体は、修飾物質に特異的な反応性がある
側鎖（保護基によって保護されていたり保護されていな
い状態である）を持った非天然性アミノ酸が導入され
る。このような非天然性アミノ酸の導入は、無細胞蛋白
質生産法によってのみ可能である。修飾させる位置のア
ミノ酸残基のコドンは、位置選択的突然変異法で、アン
バーストップコドン（ａｍｂｅｒ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏ
ｎ）に置換される。アンバーストップコドンを持つ新し
い遺伝子（ｔｅｍｐｌａｔｅ）は、無細胞蛋白質生産法
で発現される。他のストップコドンとレアコドンによる
フレームシフト（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｓｂｙ ｒａｒ
ｅ ｃｏｄｏｎ）（Ｈｏｈｓａｋａ， Ｔ． ｅｔ．
ａｌ．，Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１
８：９７７８−９７７９ （１９９６））は、上述と同
様な方法で、アンバーストップコドンの代わりに利用す
ることができる。無細胞蛋白質生産系に、特定の非天然
性アミノ酸をコード化（ｅｎｃｏｄｅ）するために、ア
ンバーストップコドンに相応するサプレッサーｔＲＮＡ
を導入する。このように導入された非天然性アミノ酸
は、修飾物質に特異的反応性を示すので、これを位置選
択的な修飾に利用する。発現されたＥＰＯの突然変異体
を分離して、化学的方法、酵素的方法、または化学的−
酵素的方法を利用して修飾する。
【００１４】微生物からｉｎ ｖｉｖｏ発現法で発現し
たＥＰＯの突然変異体は、次のような技術によって修飾
される。ＥＰＯの成熟した（ｍａｔｕｒｅ）未変性の配
列（ｎａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸の一
つがシステイン残基で置換されたＥＰＯの突然変異体を
生産して、この置換されたシステイン残基を利用して、
位置選択的に選択された修飾物質と結合する。このよう
な突然変異蛋白質は、位置選択的突然変異法によって親
蛋白質の遺伝子から変化させてきた突然変異体をエンコ
ード（ｅｎｃｏｄｅ）する、突然変異体の遺伝子の宿主
（ｈｏｓｔ）によって生産される。
たＥＰＯの突然変異体は、次のような技術によって修飾
される。ＥＰＯの成熟した（ｍａｔｕｒｅ）未変性の配
列（ｎａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸の一
つがシステイン残基で置換されたＥＰＯの突然変異体を
生産して、この置換されたシステイン残基を利用して、
位置選択的に選択された修飾物質と結合する。このよう
な突然変異蛋白質は、位置選択的突然変異法によって親
蛋白質の遺伝子から変化させてきた突然変異体をエンコ
ード（ｅｎｃｏｄｅ）する、突然変異体の遺伝子の宿主
（ｈｏｓｔ）によって生産される。
【００１５】こうして、上述の方法に従ってＥＰＯの突
然変異体を修飾し、その修飾体を生産した結果、得られ
たＥＰＯの突然変異体の修飾体は、微生物によって生産
された修飾されていないＥＰＯの突然変異体やポリペプ
チドと比較して、高い生物学的活性の能力を示す。
然変異体を修飾し、その修飾体を生産した結果、得られ
たＥＰＯの突然変異体の修飾体は、微生物によって生産
された修飾されていないＥＰＯの突然変異体やポリペプ
チドと比較して、高い生物学的活性の能力を示す。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明は、生物学的活性が向上さ
れたＥＰＯの突然変異体の修飾体およびＥＰＯの突然変
異体の修飾体を生産する方法に関する。本発明に記述し
ている修飾に適合するＥＰＯの突然変異体は、無細胞蛋
白質生産法またはｉｎ ｖｉｖｏ発現法で発現したもの
で、修飾しようとする位置のアミノ酸に変異的反応性を
持つ側鎖が存在する。本発明で開発されたＥＰＯの突然
変異体の修飾体は、生物学的活性が向上したものなの
で、医薬品で使用すると投薬回数を少なくすることがで
きるだろう。
れたＥＰＯの突然変異体の修飾体およびＥＰＯの突然変
異体の修飾体を生産する方法に関する。本発明に記述し
ている修飾に適合するＥＰＯの突然変異体は、無細胞蛋
白質生産法またはｉｎ ｖｉｖｏ発現法で発現したもの
で、修飾しようとする位置のアミノ酸に変異的反応性を
持つ側鎖が存在する。本発明で開発されたＥＰＯの突然
変異体の修飾体は、生物学的活性が向上したものなの
で、医薬品で使用すると投薬回数を少なくすることがで
きるだろう。
【００１７】本発明の一つの態様では、微生物の細胞培
養や微生物由来の無細胞蛋白質生産法で生産されたＥＰ
Ｏの突然変異体は、一つまたは二つ以上のＰＥＧ分子と
共有結合により、ＥＰＯの突然変異体の各分子に化学的
に修飾される。この場合、ＰＥＧは、ＥＰＯの突然変異
体内のフリースルフヒドリル基（ｆｒｅｅ ｓｕｌｆｈ
ｙｄｒｙｌ ｇｒｏｕｐ）と結合する。天然ＥＰＯのポ
リペプチドの構造から考察されるように、天然ＥＰＯの
ポリペプチドは、反応性の（フリー）スルフヒドリル基
が全くないので、フリースルフヒドリル基（ｆｒｅｅ
ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｇｒｏｕｐ）は、ＥＰＯ上の意
図する一つまたは二つ以上の位置に導入される。
養や微生物由来の無細胞蛋白質生産法で生産されたＥＰ
Ｏの突然変異体は、一つまたは二つ以上のＰＥＧ分子と
共有結合により、ＥＰＯの突然変異体の各分子に化学的
に修飾される。この場合、ＰＥＧは、ＥＰＯの突然変異
体内のフリースルフヒドリル基（ｆｒｅｅ ｓｕｌｆｈ
ｙｄｒｙｌ ｇｒｏｕｐ）と結合する。天然ＥＰＯのポ
リペプチドの構造から考察されるように、天然ＥＰＯの
ポリペプチドは、反応性の（フリー）スルフヒドリル基
が全くないので、フリースルフヒドリル基（ｆｒｅｅ
ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｇｒｏｕｐ）は、ＥＰＯ上の意
図する一つまたは二つ以上の位置に導入される。
【００１８】もっと詳しく言えば、ＥＰＯ上の意図する
位置にフリースルフヒドリル基を導入するために、二つ
の異なった方法を使用した。まず一つは、反応基が保護
された非天然性アミノ酸が結合したサプレッサーｔＲＮ
Ａを利用して、ストップコドン（ｓｔｏｐ ｃｏｄｏ
ｎ）を制御する方法であり、もうひとつは、位置選択的
突然変異法で、希望する箇所に、システインを導入する
方法である。
位置にフリースルフヒドリル基を導入するために、二つ
の異なった方法を使用した。まず一つは、反応基が保護
された非天然性アミノ酸が結合したサプレッサーｔＲＮ
Ａを利用して、ストップコドン（ｓｔｏｐ ｃｏｄｏ
ｎ）を制御する方法であり、もうひとつは、位置選択的
突然変異法で、希望する箇所に、システインを導入する
方法である。
【００１９】無細胞蛋白質生産法を利用して生産された
ＥＰＯの突然変異体には、修飾物質との特異的反応性を
持つ側鎖基が導入された非天然性アミノ酸が導入されて
いる。このことは、無細胞蛋白質生産法の技術の使用に
よって可能となる。この修飾させるべき位置に存在する
アミノ酸残基に相応するＤＮＡのコドンは、位置選択的
突然変異法によりアンバーストップコドン（ａｍｂｅｒ
ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）に転換（ｃｏｎｖｅｒｔ）さ
れる。アンバーストップコドンを含むこの新しい鋳型
（ｔｅｍｐｌａｔｅ）が、無細胞蛋白質生産法によって
発現される。また、無細胞蛋白質生産時、アンバースト
ップコドンを特定の非天然性アミノ酸へと解読するため
に、アンバーストップコドンに相応するサプレッサーｔ
ＲＮＡが添加される。修飾物質に特異的反応性がある非
天然性アミノ酸が、このサプレッサーｔＲＮＡに結合さ
れている。発現されたＥＰＯの突然変異体は、精製さ
れ、その後、ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）などの
化学的修飾法によって修飾される。うまく蛋白質に導入
できた、いろいろな非天然性アミノ酸やその類似物が、
Ｃｏｒｎｉｓｈ Ｖ．Ｗ．らによって報告されている
（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３
４：６２１−６３３（１９９５））。非天然性アミノ酸
は、修飾物質と反応する前に保護を外すこと（ｄｅｐｒ
ｏｔｅｃｔｉｏｎ）を必要とするような、保護された反
応基を含んでいてもよい。または、化学的修飾法を用い
てＰＥＧのような合成高分子で修飾することができる単
糖類や、化学的修飾法、酵素的修飾法または化学的−酵
素的修飾法を用いて単糖類、二糖類、オリゴ糖および多
糖類で修飾することができる単糖類を含んでいても良
い。
ＥＰＯの突然変異体には、修飾物質との特異的反応性を
持つ側鎖基が導入された非天然性アミノ酸が導入されて
いる。このことは、無細胞蛋白質生産法の技術の使用に
よって可能となる。この修飾させるべき位置に存在する
アミノ酸残基に相応するＤＮＡのコドンは、位置選択的
突然変異法によりアンバーストップコドン（ａｍｂｅｒ
ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）に転換（ｃｏｎｖｅｒｔ）さ
れる。アンバーストップコドンを含むこの新しい鋳型
（ｔｅｍｐｌａｔｅ）が、無細胞蛋白質生産法によって
発現される。また、無細胞蛋白質生産時、アンバースト
ップコドンを特定の非天然性アミノ酸へと解読するため
に、アンバーストップコドンに相応するサプレッサーｔ
ＲＮＡが添加される。修飾物質に特異的反応性がある非
天然性アミノ酸が、このサプレッサーｔＲＮＡに結合さ
れている。発現されたＥＰＯの突然変異体は、精製さ
れ、その後、ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）などの
化学的修飾法によって修飾される。うまく蛋白質に導入
できた、いろいろな非天然性アミノ酸やその類似物が、
Ｃｏｒｎｉｓｈ Ｖ．Ｗ．らによって報告されている
（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３
４：６２１−６３３（１９９５））。非天然性アミノ酸
は、修飾物質と反応する前に保護を外すこと（ｄｅｐｒ
ｏｔｅｃｔｉｏｎ）を必要とするような、保護された反
応基を含んでいてもよい。または、化学的修飾法を用い
てＰＥＧのような合成高分子で修飾することができる単
糖類や、化学的修飾法、酵素的修飾法または化学的−酵
素的修飾法を用いて単糖類、二糖類、オリゴ糖および多
糖類で修飾することができる単糖類を含んでいても良
い。
【００２０】本発明におけるＥＰＯの突然変異体を修飾
するもう一つの方法は、位置選択的突然変異法とｉｎ
ｖｉｖｏ法を組み合わせる方法である。修飾位置の特定
のアミノ酸に相応するコドンを、システインをコードす
るコドンへと位置選択的突然変異法で置換して、フリー
スルフヒドリル基を持たないポリペプチドをエンコード
する遺伝子を、突然変異させることができる。その結
果、システインが人為的に導入されたポリペプチドは、
修飾したい箇所に位置選択的にフリースルフヒドリル基
を含んだものとなる。このフリースルフヒドリル基は位
置選択的に修飾するのに利用される。ＥＰＯの突然変異
体を作成した後に、ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）
が実行される。ＥＰＯの成熟した（ｍａｔｕｒｅ）未変
性の配列（ｎａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ
酸の一つがシステイン残基で置換されたＥＰＯの突然変
異体を生産して、この置換されたシステイン残基を利用
して、位置選択的に、選択された修飾物質と接合（ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅ）する。このような突然変異蛋白質は、
位置選択的突然変異法によって親蛋白質の遺伝子から変
化させてきた突然変異体をエンコードする、突然変異体
の遺伝子の宿主（ｈｏｓｔ）によって生産される。選択
された修飾物質とＥＰＯの突然変異体との接合体（ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、無細胞蛋白質生産法と同様な
方法により、生産されても良い。
するもう一つの方法は、位置選択的突然変異法とｉｎ
ｖｉｖｏ法を組み合わせる方法である。修飾位置の特定
のアミノ酸に相応するコドンを、システインをコードす
るコドンへと位置選択的突然変異法で置換して、フリー
スルフヒドリル基を持たないポリペプチドをエンコード
する遺伝子を、突然変異させることができる。その結
果、システインが人為的に導入されたポリペプチドは、
修飾したい箇所に位置選択的にフリースルフヒドリル基
を含んだものとなる。このフリースルフヒドリル基は位
置選択的に修飾するのに利用される。ＥＰＯの突然変異
体を作成した後に、ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）
が実行される。ＥＰＯの成熟した（ｍａｔｕｒｅ）未変
性の配列（ｎａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ
酸の一つがシステイン残基で置換されたＥＰＯの突然変
異体を生産して、この置換されたシステイン残基を利用
して、位置選択的に、選択された修飾物質と接合（ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅ）する。このような突然変異蛋白質は、
位置選択的突然変異法によって親蛋白質の遺伝子から変
化させてきた突然変異体をエンコードする、突然変異体
の遺伝子の宿主（ｈｏｓｔ）によって生産される。選択
された修飾物質とＥＰＯの突然変異体との接合体（ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、無細胞蛋白質生産法と同様な
方法により、生産されても良い。
【００２１】無細胞蛋白質生産法とＰＥＧ化を組み合わ
せた方法によって、ＰＥＧ化されたＥＰＯの突然変異体
を製造する詳しい方法を実施例１に記載する。さらに、
ｉｎｖｉｖｏ発現法とＰＥＧ化を組み合わせた方法によ
って、ＰＥＧ化されたＥＰＯの突然変異体を製造する詳
しい方法を実施例２に記載する。
せた方法によって、ＰＥＧ化されたＥＰＯの突然変異体
を製造する詳しい方法を実施例１に記載する。さらに、
ｉｎｖｉｖｏ発現法とＰＥＧ化を組み合わせた方法によ
って、ＰＥＧ化されたＥＰＯの突然変異体を製造する詳
しい方法を実施例２に記載する。
【００２２】
【実施例】以下、本発明をさらに詳細に説明するため
に、実施例および比較例を挙げて具体的に説明するが、
本発明は、これらの実施例によって限定されるものでは
ないし、本発明分野における当業者によってさまざまな
変形が可能であることは、理解されるであろう。
に、実施例および比較例を挙げて具体的に説明するが、
本発明は、これらの実施例によって限定されるものでは
ないし、本発明分野における当業者によってさまざまな
変形が可能であることは、理解されるであろう。
【００２３】実施例１無細胞蛋白質生産法を利用したＰＥＧ化されたＥＰＯの
突然変異体の生産 無細胞蛋白質生産法を利用した非天然性アミノ酸の導入
方法には、ＤＮＡにアンバーストップコドンを導入する
ことが必要である。このアンバーストップコドンに相応
する同族のｔＲＮＡが無細胞蛋白質生産法の反応液には
ないため、ＤＮＡを含むアンバーコドンのｍＲＮＡにお
けるアンバーコドンで中断される。しかし、相応する同
族のサプレッサーｔＲＮＡが補われた無細胞蛋白質生産
法の反応液中で、ＤＮＡを含むアンバーストップコドン
が書き換えられ、そして、翻訳された際には、完全な長
さのポリペプチドや蛋白質を合成することができる（Ｎ
ｏｒｅｎ，ＣＪ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
４：１８２−１８８（１９８９））。
突然変異体の生産 無細胞蛋白質生産法を利用した非天然性アミノ酸の導入
方法には、ＤＮＡにアンバーストップコドンを導入する
ことが必要である。このアンバーストップコドンに相応
する同族のｔＲＮＡが無細胞蛋白質生産法の反応液には
ないため、ＤＮＡを含むアンバーコドンのｍＲＮＡにお
けるアンバーコドンで中断される。しかし、相応する同
族のサプレッサーｔＲＮＡが補われた無細胞蛋白質生産
法の反応液中で、ＤＮＡを含むアンバーストップコドン
が書き換えられ、そして、翻訳された際には、完全な長
さのポリペプチドや蛋白質を合成することができる（Ｎ
ｏｒｅｎ，ＣＪ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
４：１８２−１８８（１９８９））。
【００２４】図１は、無細胞蛋白質生産法で位置選択的
に非天然性アミノ酸が導入されたＥＰＯの突然変異体を
生産する方法を示す概略図である。
に非天然性アミノ酸が導入されたＥＰＯの突然変異体を
生産する方法を示す概略図である。
【００２５】天然の（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）ＥＰＯ（ア
スパラギン）において、関連のコドンの残基を、位置選
択的突然変異法により、アンバーストップコドンへ変異
させた。このような変形ＤＮＡを含むプラスミドを、あ
らかじめ保護した非天然性アミノ酸が結合されたアンバ
ーサプレッサーｔＲＮＡを一緒に添加して、無細胞蛋白
質生産系で翻訳した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによっ
てこのプラスミドの翻訳が行われ、その後、サプレッサ
ーｔＲＮＡによって翻訳と抑制が行われ、希望した位置
に非天然性アミノ酸が結合された完全な長さのＥＰＯの
突然変異体が生産された。抗体を利用して生産されたＥ
ＰＯの突然変異体を分離し、続いて、非天然性アミノ酸
の作用基に結合された保護基を除去してフリースルフヒ
ドリル基を再生し、この作用基を以後のＰＥＧ化反応に
使用した。具体的に言うと、ＥＰＯの突然変異体の３８
番めの位置のＰＥＧ化の方法は次のとおりである。
スパラギン）において、関連のコドンの残基を、位置選
択的突然変異法により、アンバーストップコドンへ変異
させた。このような変形ＤＮＡを含むプラスミドを、あ
らかじめ保護した非天然性アミノ酸が結合されたアンバ
ーサプレッサーｔＲＮＡを一緒に添加して、無細胞蛋白
質生産系で翻訳した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによっ
てこのプラスミドの翻訳が行われ、その後、サプレッサ
ーｔＲＮＡによって翻訳と抑制が行われ、希望した位置
に非天然性アミノ酸が結合された完全な長さのＥＰＯの
突然変異体が生産された。抗体を利用して生産されたＥ
ＰＯの突然変異体を分離し、続いて、非天然性アミノ酸
の作用基に結合された保護基を除去してフリースルフヒ
ドリル基を再生し、この作用基を以後のＰＥＧ化反応に
使用した。具体的に言うと、ＥＰＯの突然変異体の３８
番めの位置のＰＥＧ化の方法は次のとおりである。
【００２６】既存の治療用で使用されているＥＰＯのｃ
ＤＮＡをＴ７プロモーターとターミネーターとがある原
核生物用発現ベクターｐＫ７（Ｋｉｍ．Ｄ．Ｍ．ｅｔ
ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２３９：８８１
−８８６（１９９６））にクローニングした（図４）。
既存のＥＰＯのアスパラギンを暗号化していた３８番コ
ドンをＰＣＲ方法による位置選択的突然変異法でアンバ
ーストップコドンに置換した。ヒトＥＰＯのｃＤＮＡが
クローニングされた発現用ベクターであるｐＫ７の発現
構造は図４に示した。
ＤＮＡをＴ７プロモーターとターミネーターとがある原
核生物用発現ベクターｐＫ７（Ｋｉｍ．Ｄ．Ｍ．ｅｔ
ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２３９：８８１
−８８６（１９９６））にクローニングした（図４）。
既存のＥＰＯのアスパラギンを暗号化していた３８番コ
ドンをＰＣＲ方法による位置選択的突然変異法でアンバ
ーストップコドンに置換した。ヒトＥＰＯのｃＤＮＡが
クローニングされた発現用ベクターであるｐＫ７の発現
構造は図４に示した。
【００２７】このように導入されたアンバーストップコ
ドンの抑制に使用されるサプレッサーｔＲＮＡは、二つ
の段階に分けて合成した。サプレッサーｔＲＮＡの基本
構造は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アラニンのｔＲＮＡの
構造を使用し、このアラニンのｔＲＮＡのアンチコドン
部位を、アンバーストップコドンに相応するように変異
させた。ここで使用した大腸菌のアラニンのｔＲＮＡ以
外のもの、アミノ酸のｔＲＮＡも、アンバーまたは他の
ストップコドンにおける翻訳中断の抑制に使用できる。
末端のＣＡ（ｔＲＮＡ（−ＣＡ））が除去されたアンバ
ーサプレッサーｔＲＮＡを暗号化する合成ＤＮＡを、ｐ
ＵＣ１９（ｐＳｕｐ−ａｌａ）にクローニングしてｐＳ
ｕｐ−ａｌａプラスミドを製作した。製作されたプラス
ミドをＦｏｋ Ｉで切断して、ｒｕｎ−ｏｆｆ転写（ｒ
ｕｎ―ｏｆｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）方法でｔ
ＲＮＡ（−ＣＡ）を製造した。ｐＳｕｐ−ａｌａプラス
ミドからｔＲＮＡ（−ＣＡ）を製造する方法の概略図を
図５に示した。
ドンの抑制に使用されるサプレッサーｔＲＮＡは、二つ
の段階に分けて合成した。サプレッサーｔＲＮＡの基本
構造は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アラニンのｔＲＮＡの
構造を使用し、このアラニンのｔＲＮＡのアンチコドン
部位を、アンバーストップコドンに相応するように変異
させた。ここで使用した大腸菌のアラニンのｔＲＮＡ以
外のもの、アミノ酸のｔＲＮＡも、アンバーまたは他の
ストップコドンにおける翻訳中断の抑制に使用できる。
末端のＣＡ（ｔＲＮＡ（−ＣＡ））が除去されたアンバ
ーサプレッサーｔＲＮＡを暗号化する合成ＤＮＡを、ｐ
ＵＣ１９（ｐＳｕｐ−ａｌａ）にクローニングしてｐＳ
ｕｐ−ａｌａプラスミドを製作した。製作されたプラス
ミドをＦｏｋ Ｉで切断して、ｒｕｎ−ｏｆｆ転写（ｒ
ｕｎ―ｏｆｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）方法でｔ
ＲＮＡ（−ＣＡ）を製造した。ｐＳｕｐ−ａｌａプラス
ミドからｔＲＮＡ（−ＣＡ）を製造する方法の概略図を
図５に示した。
【００２８】転写はＰｒｏｍｅｇａ社のＲｉｂｏＭＡＸ
多量ＲＮＡ製造システム（ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ Ｒ
ＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を利用し
て、この製造システム会社の説明する方法に従った。末
端ジヌクレオチドｐｄＣｐＡ部が合成され（Ｒｏｂｅｒ
ｔｓｏｎ、ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：９６４９−９６６０（１９８
９））、α−アミンのシアノメチルエステルと、アミノ
酸で保護された反応基が、有機化学的方法で合成され
た。
多量ＲＮＡ製造システム（ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ Ｒ
ＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を利用し
て、この製造システム会社の説明する方法に従った。末
端ジヌクレオチドｐｄＣｐＡ部が合成され（Ｒｏｂｅｒ
ｔｓｏｎ、ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：９６４９−９６６０（１９８
９））、α−アミンのシアノメチルエステルと、アミノ
酸で保護された反応基が、有機化学的方法で合成され
た。
【００２９】本実施例で使用した非天然性アミノ酸を導
入するために利用したα−アミンとほかの作用基が保護
されたシアノメチルエステルは、Ｎ−（４−ペンテノイ
ル）、Ｓ−（２−ニトロベンゾイル）システインシアノ
メチルエステルである。簡潔に言うと、ｐｄＣｐＡは、
ホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）
の化学を使用することにより合成された。そして、上記
非天然性アミノ酸は、システインと２−ニトロベンジル
クロリドと反応させ、続いて４−ペンテノイック無水物
（４−ｐｅｎｔｅｎｏｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）と反
応させて合成された。上記非天然性アミノ酸の活性エス
テル（ａｃｔｉｖｅ ｅｓｔｅｒ）は、上記アミノ酸と
クロロアセトニトリルとの反応によって合成された。ｐ
ｄＣｐＡのテトラブチルアンモニウム塩は、Ｎ−（４−
ペンテノイル）、Ｓ−（２−ニトロベンゾイル）の活性
エステルとアミノアシル化され、その後、Ｃ１８カラム
を使用して、高性能液体クロマトグラフィー；ＨＰＬＣ
によって精製された。得られた分離したｐｄＣｐＡ−ア
ミノ酸結合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）は、Ｔ４ ＲＮＡリガ
ーゼでｔＲＮＡ（−ＣＡ）と結合した。それから、ヨー
ドを利用して、保護基である４−ペンテノイル基を除去
して、サプレッサーを完成させた。いままで説明した、
サプレッサーｔＲＮＡ（−ＣＡ）にｐｄＣｐＡ−アミノ
酸の結合体を結合して、サプレッサーｔＲＮＡを製作す
る詳しい過程を、図２および図３に示す。
入するために利用したα−アミンとほかの作用基が保護
されたシアノメチルエステルは、Ｎ−（４−ペンテノイ
ル）、Ｓ−（２−ニトロベンゾイル）システインシアノ
メチルエステルである。簡潔に言うと、ｐｄＣｐＡは、
ホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）
の化学を使用することにより合成された。そして、上記
非天然性アミノ酸は、システインと２−ニトロベンジル
クロリドと反応させ、続いて４−ペンテノイック無水物
（４−ｐｅｎｔｅｎｏｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）と反
応させて合成された。上記非天然性アミノ酸の活性エス
テル（ａｃｔｉｖｅ ｅｓｔｅｒ）は、上記アミノ酸と
クロロアセトニトリルとの反応によって合成された。ｐ
ｄＣｐＡのテトラブチルアンモニウム塩は、Ｎ−（４−
ペンテノイル）、Ｓ−（２−ニトロベンゾイル）の活性
エステルとアミノアシル化され、その後、Ｃ１８カラム
を使用して、高性能液体クロマトグラフィー；ＨＰＬＣ
によって精製された。得られた分離したｐｄＣｐＡ−ア
ミノ酸結合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）は、Ｔ４ ＲＮＡリガ
ーゼでｔＲＮＡ（−ＣＡ）と結合した。それから、ヨー
ドを利用して、保護基である４−ペンテノイル基を除去
して、サプレッサーを完成させた。いままで説明した、
サプレッサーｔＲＮＡ（−ＣＡ）にｐｄＣｐＡ−アミノ
酸の結合体を結合して、サプレッサーｔＲＮＡを製作す
る詳しい過程を、図２および図３に示す。
【００３０】無細胞蛋白質生産とサプレッション（ｓｕ
ｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）反応は、基本的に、Ｋｉｍらの方
法（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ． ２３９：８８１−８８６（１９９６））
に従い、これを若干変更した方法で実行した。無細胞蛋
白質生産反応液は次のもので構成されている：５７ｍＭ
のＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ８．２）、１．２ｍＭのＡ
ＴＰ．、各０．８５ｍＭのＧＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴ
Ｐ、１５０ｍＭのグルカミン酸カリウム、８０ｍＭの酢
酸アンモニウム、１８ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１
７ｍｇ／ｍｌの大腸トータルｔＲＮＡ混合物（ＭＲＥ
６００菌からのもの）、３４ｍｇ／ｍｌの１−５−ホル
ミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸、６．７μｇ
／ｍｌの環状プラスミド（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｌａｓ
ｍｉｄ）、３３μｇ／ｍｌのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、
０．３Ｕ／ｍｌのピルビン酸キナーゼ、２８ｍＭのホス
ホ（エノール）ピルビン酸、０．１μｇ／ｍｌのサプレ
ッサーｔＲＮＡ、２０％（ｖ／ｖ）のＳ３０抽出液。反
応液を３７℃で６０分間反応させた。Ｓ−（２−ニトロ
ベンゾイル）システイン−ＥＰＯを、ＥＰＯへの単一抗
体を利用して、一般的な方法によって、免疫的に精製分
離（ｉｍｍｕｎｏ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）した。
ｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）反応は、基本的に、Ｋｉｍらの方
法（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ． ２３９：８８１−８８６（１９９６））
に従い、これを若干変更した方法で実行した。無細胞蛋
白質生産反応液は次のもので構成されている：５７ｍＭ
のＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ８．２）、１．２ｍＭのＡ
ＴＰ．、各０．８５ｍＭのＧＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴ
Ｐ、１５０ｍＭのグルカミン酸カリウム、８０ｍＭの酢
酸アンモニウム、１８ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１
７ｍｇ／ｍｌの大腸トータルｔＲＮＡ混合物（ＭＲＥ
６００菌からのもの）、３４ｍｇ／ｍｌの１−５−ホル
ミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸、６．７μｇ
／ｍｌの環状プラスミド（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｌａｓ
ｍｉｄ）、３３μｇ／ｍｌのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、
０．３Ｕ／ｍｌのピルビン酸キナーゼ、２８ｍＭのホス
ホ（エノール）ピルビン酸、０．１μｇ／ｍｌのサプレ
ッサーｔＲＮＡ、２０％（ｖ／ｖ）のＳ３０抽出液。反
応液を３７℃で６０分間反応させた。Ｓ−（２−ニトロ
ベンゾイル）システイン−ＥＰＯを、ＥＰＯへの単一抗
体を利用して、一般的な方法によって、免疫的に精製分
離（ｉｍｍｕｎｏ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）した。
【００３１】リフォルディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）
溶液（５０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、２％（ｖ／
ｖ）のラウリルサルコシン酸ナトリウム、４０μＭの硫
酸銅（ｃｕｐｒｉｃ ｓｕｌｆａｔｅ））で透析、リフ
ォルディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）させた後、ＥＰＯ
の突然変異体を凍結乾燥した。免疫的に精製分離（ｉｍ
ｍｕｎｏ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）したＥＰＯの突然変異体
のサンプル（１ｍｇ、水またはＰＢＳ中に５０μｇの蛋
白質）を、パイレックス（Ｐｙｒｅｘ）試験管に入れ、
封をし、３２０ｎｍの紫外線で反応させた。光脱保護反
応（ｐｈｏｔｏｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）で、ＥＰＯ
の突然変異体にフリースルフヒドリル基が結合され、こ
の位置（３８番システイン）を位置選択的にＰＥＧ化し
た。光脱保護反応（ｐｈｏｔｏｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏ
ｎ）とＰＥＧ化は、同時にまたは別々に行うことができ
る。ＥＰＯの突然変異体とＰＥＧ−マレイミド（ＰＥＧ
−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）との反応は、５ｍＭのＥＤＴＡ
が混合された５０ｍＭの酢酸ナトリウムの緩衝溶液（ｐ
Ｈ６）中で、ＥＰＯの突然変異体／ＰＥＧモル比１：５
で、室温で２４時間撹拌して行った。ＰＥＧ化されたＥ
ＰＯの突然変異体の修飾体は、修飾されていないＥＰＯ
の突然変異体と、残りのＰＥＧから、サイズ排除クロマ
トグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ;ＳＥＣ）を利用して分離し
た。分離したＰＥＧ化されたＥＰＯの突然変異体の修飾
体の生物学的活性は次のように測定した。
溶液（５０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、２％（ｖ／
ｖ）のラウリルサルコシン酸ナトリウム、４０μＭの硫
酸銅（ｃｕｐｒｉｃ ｓｕｌｆａｔｅ））で透析、リフ
ォルディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）させた後、ＥＰＯ
の突然変異体を凍結乾燥した。免疫的に精製分離（ｉｍ
ｍｕｎｏ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）したＥＰＯの突然変異体
のサンプル（１ｍｇ、水またはＰＢＳ中に５０μｇの蛋
白質）を、パイレックス（Ｐｙｒｅｘ）試験管に入れ、
封をし、３２０ｎｍの紫外線で反応させた。光脱保護反
応（ｐｈｏｔｏｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）で、ＥＰＯ
の突然変異体にフリースルフヒドリル基が結合され、こ
の位置（３８番システイン）を位置選択的にＰＥＧ化し
た。光脱保護反応（ｐｈｏｔｏｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏ
ｎ）とＰＥＧ化は、同時にまたは別々に行うことができ
る。ＥＰＯの突然変異体とＰＥＧ−マレイミド（ＰＥＧ
−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）との反応は、５ｍＭのＥＤＴＡ
が混合された５０ｍＭの酢酸ナトリウムの緩衝溶液（ｐ
Ｈ６）中で、ＥＰＯの突然変異体／ＰＥＧモル比１：５
で、室温で２４時間撹拌して行った。ＰＥＧ化されたＥ
ＰＯの突然変異体の修飾体は、修飾されていないＥＰＯ
の突然変異体と、残りのＰＥＧから、サイズ排除クロマ
トグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ;ＳＥＣ）を利用して分離し
た。分離したＰＥＧ化されたＥＰＯの突然変異体の修飾
体の生物学的活性は次のように測定した。
【００３２】ＰＥＧ化されたＥＰＯの突然変異体の修飾
体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性は、１０％ウシ胎児血清を含
むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ
ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７３：３７５−３８０（１９８
９））で培養し、ＥＰＯに依存性生長を示すヒト株化細
胞（ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅ）ＴＦ−１の成長
で測定し、Ｉｎ ｖｉｖｏ活性は、ネズミ（ｅｘｈｙｐ
ｏｘｉｃ ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉｃ ｍｉｃｅ）の赤
芽球細胞（ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ）に導
入された５９Ｆｅを定量して測定した（Ｇｏｌｄｗａｓ
ｓｅｒ，Ｅ．ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３７：１０９−１２１
（１９７５））。各測定値は、平行線分析（ｐａｒａｌ
ｌｅｌｌｉｎｅ ａｓｓａｙ）（Ｄｕｎｎ，ＣＤＲ．，
Ｎａｐｉｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｐ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏ
ｌ．（Ｎ．Ｙ．） ６：５７７−５８４（１９７８））
により決定した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析では、９投与量
／１サンプル、２度の分析／１投与量で、ｉｎ ｖｉｖ
ｏ分析では、３投与量以上／１サンプル、３匹のネズミ
／１投与量で、測定した。培地と一緒に１／５００希釈
で使用された場合、塩などの、ＥＰＯの突然変異体の修
飾体の標本におけるどんな添加物も、分析評価を妨げな
かった。生物学的活性分析には、第二国際標準基準品
（ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）によ
り高度に精製された組替えヒトＥＰＯ（ｒｅｃｏｍｂｉ
ｎａｎｔｈｕｍａｎ ＥＰＯ、ｒＨｕＥＰＯ）を標準品
で使用した。生物学的活性の測定の結果、ＰＥＧ化され
たＥＰＯの突然変異体の修飾体は、無処置のｒＨｕＥＰ
Ｏに比べてｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が２倍以上高かった
し、ＰＥＧ化されていないＥＰＯの突然変異体は、無処
置のｒＨｕＥＰＯに比べて３倍以上の高いｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ活性を示したが、ｉｎ ｖｉｖｏ活性が消失され
た。ＰＥＧ化されていないＥＰＯの突然変異体は、ｉｎ
ｖｉｖｏのクリアランスシステムによって消失したの
である。ＰＥＧ化されたＥＰＯの突然変異体は、ｒＨｕ
ＥＰＯに比べて高いｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示したが、
ｉｎ ｖｉｖｏ活性は無処置のｒＨｕＥＰＯと同様か、
もしくは少し低いレベルで示された。ＰＥＧ化されたＥ
ＰＯの突然変異体の修飾体のｉｎ ｖｉｖｏ活性で見ら
れた若干の実験値の変異は、ＥＰＯの突然変異体に付加
されているＰＥＧ分子の水和量によるものであろう。
体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性は、１０％ウシ胎児血清を含
むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ
ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７３：３７５−３８０（１９８
９））で培養し、ＥＰＯに依存性生長を示すヒト株化細
胞（ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅ）ＴＦ−１の成長
で測定し、Ｉｎ ｖｉｖｏ活性は、ネズミ（ｅｘｈｙｐ
ｏｘｉｃ ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉｃ ｍｉｃｅ）の赤
芽球細胞（ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ）に導
入された５９Ｆｅを定量して測定した（Ｇｏｌｄｗａｓ
ｓｅｒ，Ｅ．ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３７：１０９−１２１
（１９７５））。各測定値は、平行線分析（ｐａｒａｌ
ｌｅｌｌｉｎｅ ａｓｓａｙ）（Ｄｕｎｎ，ＣＤＲ．，
Ｎａｐｉｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｐ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏ
ｌ．（Ｎ．Ｙ．） ６：５７７−５８４（１９７８））
により決定した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析では、９投与量
／１サンプル、２度の分析／１投与量で、ｉｎ ｖｉｖ
ｏ分析では、３投与量以上／１サンプル、３匹のネズミ
／１投与量で、測定した。培地と一緒に１／５００希釈
で使用された場合、塩などの、ＥＰＯの突然変異体の修
飾体の標本におけるどんな添加物も、分析評価を妨げな
かった。生物学的活性分析には、第二国際標準基準品
（ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）によ
り高度に精製された組替えヒトＥＰＯ（ｒｅｃｏｍｂｉ
ｎａｎｔｈｕｍａｎ ＥＰＯ、ｒＨｕＥＰＯ）を標準品
で使用した。生物学的活性の測定の結果、ＰＥＧ化され
たＥＰＯの突然変異体の修飾体は、無処置のｒＨｕＥＰ
Ｏに比べてｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が２倍以上高かった
し、ＰＥＧ化されていないＥＰＯの突然変異体は、無処
置のｒＨｕＥＰＯに比べて３倍以上の高いｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ活性を示したが、ｉｎ ｖｉｖｏ活性が消失され
た。ＰＥＧ化されていないＥＰＯの突然変異体は、ｉｎ
ｖｉｖｏのクリアランスシステムによって消失したの
である。ＰＥＧ化されたＥＰＯの突然変異体は、ｒＨｕ
ＥＰＯに比べて高いｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示したが、
ｉｎ ｖｉｖｏ活性は無処置のｒＨｕＥＰＯと同様か、
もしくは少し低いレベルで示された。ＰＥＧ化されたＥ
ＰＯの突然変異体の修飾体のｉｎ ｖｉｖｏ活性で見ら
れた若干の実験値の変異は、ＥＰＯの突然変異体に付加
されているＰＥＧ分子の水和量によるものであろう。
【００３３】実施例２遺伝子蛋白質生産法を利用したＥＰＯの突然変異体の生
産およびＰＥＧ化の方法 図６は、位置選択的突然変異法で３８番の位置にシステ
インを導入して、そこにＰＥＧを付加して、ＰＥＧ化さ
れたＥＰＯを製造する過程を示すものである。
産およびＰＥＧ化の方法 図６は、位置選択的突然変異法で３８番の位置にシステ
インを導入して、そこにＰＥＧを付加して、ＰＥＧ化さ
れたＥＰＯを製造する過程を示すものである。
【００３４】位置選択的突然変異法は、修飾する位置に
システインを導入するため、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ
ＴＭ位置選択的突然変異誘発キット（ｓｉｔｅ−ｄｉｒ
ｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ：ＳＴＲ
ＡＴＡＧＥＮＥ社）を利用して行われた。この時使用し
た３２量体（３２−ｍｅｒ）のオリゴヌクレオチドプラ
イマーの配列は、以下に示すように化学的に合成され
た。
システインを導入するため、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ
ＴＭ位置選択的突然変異誘発キット（ｓｉｔｅ−ｄｉｒ
ｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ：ＳＴＲ
ＡＴＡＧＥＮＥ社）を利用して行われた。この時使用し
た３２量体（３２−ｍｅｒ）のオリゴヌクレオチドプラ
イマーの配列は、以下に示すように化学的に合成され
た。
【００３５】５’−ＧＡＣＧＣＴＴＧＡＡＴＧＡＧＴＧ
ＴＡＴＣＡＣＴＧＴＣＣＣＡＧＡＣ−３’
ＴＡＴＣＡＣＴＧＴＣＣＣＡＧＡＣ−３’
【００３６】このプライマーは、既存の治療で使用され
ている、未変性の（ｎａｔｉｖｅ）ヒトＥＰＯ ｃＤＮ
Ａ配列の、３８番めのアスパラギンをシステインで置換
するようにデザインされた。人間ＥＰＯのｐＥＴ１６ｂ
（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングして製作したプラス
ミドｐＥＴ１６ｂ−ｈＥＰＯを、上記プライマーと鋳型
（ｔｅｍｐｌａｔｅ）を使用して、次のＰＣＲ条件で、
ＰＣＲを行った：ＰＣＲ反応液の組成は、５０μｌの反
応液あたり５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ社）、１μｌの１０ｍＭのデオキシヌクレオシド三リ
ン酸混合物、５０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチド、
２．５プラーク形成単位（ｕｎｉｔｓ ｏｆ Ｐｆｕ）
のＤＮＡポリメラーゼそして５０ｎｇのＤＮＡ鋳型（ｔ
ｅｍｐｌａｔｅ）を使用した。その後、３０μｌのミネ
ラルオイルを覆い被せた。ＰＣＲ反応が終わった反応液
を、氷に２分間置いて３７℃以下に冷却した。鋳型（ｔ
ｅｍｐｌａｔｅ）で使用したＤＮＡを除去するために、
３７℃で１時間、１μｌのＤｐｎ Ｉ制限酵素（ｒｅｓ
ｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ）で処理した。
ている、未変性の（ｎａｔｉｖｅ）ヒトＥＰＯ ｃＤＮ
Ａ配列の、３８番めのアスパラギンをシステインで置換
するようにデザインされた。人間ＥＰＯのｐＥＴ１６ｂ
（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングして製作したプラス
ミドｐＥＴ１６ｂ−ｈＥＰＯを、上記プライマーと鋳型
（ｔｅｍｐｌａｔｅ）を使用して、次のＰＣＲ条件で、
ＰＣＲを行った：ＰＣＲ反応液の組成は、５０μｌの反
応液あたり５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ社）、１μｌの１０ｍＭのデオキシヌクレオシド三リ
ン酸混合物、５０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチド、
２．５プラーク形成単位（ｕｎｉｔｓ ｏｆ Ｐｆｕ）
のＤＮＡポリメラーゼそして５０ｎｇのＤＮＡ鋳型（ｔ
ｅｍｐｌａｔｅ）を使用した。その後、３０μｌのミネ
ラルオイルを覆い被せた。ＰＣＲ反応が終わった反応液
を、氷に２分間置いて３７℃以下に冷却した。鋳型（ｔ
ｅｍｐｌａｔｅ）で使用したＤＮＡを除去するために、
３７℃で１時間、１μｌのＤｐｎ Ｉ制限酵素（ｒｅｓ
ｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ）で処理した。
【００３７】１μｌのＤｐｎＩ制限酵素で処理したＤＮ
Ａが、Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌ
ｕｅ ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞に形質転換さ
れた。形質転換された細胞をアルブミン（ＡＬＢ）プレ
ートに薄く延ばし、その形質転換体をプラスミド標本
（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）の液体培養液に播種した。
Ａが、Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌ
ｕｅ ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞に形質転換さ
れた。形質転換された細胞をアルブミン（ＡＬＢ）プレ
ートに薄く延ばし、その形質転換体をプラスミド標本
（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）の液体培養液に播種した。
【００３８】３８番アスパラギンがシステインに置換さ
れたＥＰＯ（これをＮ３８Ｃ ｈＥＰＯという）が、大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）から発現し
た。細胞を、ＮＺＣＹＭ培地で、３７℃、６００ｎｍで
吸光度が０．６になる時点まで培養して、１ｍＭのイソ
プロピルチオ−β−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を
添加して、Ｎ３８Ｃ ｈＥＰＯの発現を誘導した。ＩＰ
ＴＧ誘導の４時間後、５，０００ｘｇ、４℃で５分間遠
心分離して細胞を収集し、これを１倍（１Ｘ）結合緩衝
液（変性剤なし；５ｍＭのイミダゾール、０．５Ｍの塩
化ナトリウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．
０）で再浮遊させた。収集した細胞は超音波を利用して
破砕した。破砕物を４℃、７，０００ｘｇで４０分間遠
心分離し、沈殿物を１倍（１Ｘ）結合緩衝液（ｂｉｎｄ
ｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で再浮遊させ超音波を利用して
破砕した。これをまた上記の条件で遠心分離した。得ら
れた沈殿物をもう１度、１倍（１Ｘ）結合緩衝液（変性
剤あり；５ｍＭのイミダゾール、０．５Ｍの塩化ナトリ
ウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、８Ｍの尿素、ｐＨ
８．０）で再浮遊させた。浮遊液を氷に１時間置いて、
４℃、１８，０００ｘｇで４０分間遠心分離し、上澄み
を０．４５μｍのシリンジフィルター（ｓｙｒｉｎｇｅ
ｆｉｌｔｅｒ）で濾過した。
れたＥＰＯ（これをＮ３８Ｃ ｈＥＰＯという）が、大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）から発現し
た。細胞を、ＮＺＣＹＭ培地で、３７℃、６００ｎｍで
吸光度が０．６になる時点まで培養して、１ｍＭのイソ
プロピルチオ−β−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を
添加して、Ｎ３８Ｃ ｈＥＰＯの発現を誘導した。ＩＰ
ＴＧ誘導の４時間後、５，０００ｘｇ、４℃で５分間遠
心分離して細胞を収集し、これを１倍（１Ｘ）結合緩衝
液（変性剤なし；５ｍＭのイミダゾール、０．５Ｍの塩
化ナトリウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．
０）で再浮遊させた。収集した細胞は超音波を利用して
破砕した。破砕物を４℃、７，０００ｘｇで４０分間遠
心分離し、沈殿物を１倍（１Ｘ）結合緩衝液（ｂｉｎｄ
ｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で再浮遊させ超音波を利用して
破砕した。これをまた上記の条件で遠心分離した。得ら
れた沈殿物をもう１度、１倍（１Ｘ）結合緩衝液（変性
剤あり；５ｍＭのイミダゾール、０．５Ｍの塩化ナトリ
ウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、８Ｍの尿素、ｐＨ
８．０）で再浮遊させた。浮遊液を氷に１時間置いて、
４℃、１８，０００ｘｇで４０分間遠心分離し、上澄み
を０．４５μｍのシリンジフィルター（ｓｙｒｉｎｇｅ
ｆｉｌｔｅｒ）で濾過した。
【００３９】発現したＮ３８Ｃ ｈＥＰＯを精製するた
めに、Ｎｉ―ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーを、次の
順序で、緩衝液を追加して実行した。
めに、Ｎｉ―ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーを、次の
順序で、緩衝液を追加して実行した。
【００４０】１．平衡化のため、１倍（１Ｘ）結合緩衝
液（変性剤含有） ２．細胞破砕物 ３．１倍（１Ｘ）結合緩衝液（変性剤含有） ４．１倍（１Ｘ）洗浄緩衝液（ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅ
ｒ）（２０ｍＭのイミダゾール、０．５Ｍの塩化ナトリ
ウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、８Ｍの尿素、ｐＨ
８．０）で湧出 ５．溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（１
Ｍのイミダゾール、０．５Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍ
Ｍのリン酸ナトリウム、８Ｍの尿素、ｐＨ８．０）
液（変性剤含有） ２．細胞破砕物 ３．１倍（１Ｘ）結合緩衝液（変性剤含有） ４．１倍（１Ｘ）洗浄緩衝液（ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅ
ｒ）（２０ｍＭのイミダゾール、０．５Ｍの塩化ナトリ
ウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、８Ｍの尿素、ｐＨ
８．０）で湧出 ５．溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（１
Ｍのイミダゾール、０．５Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍ
Ｍのリン酸ナトリウム、８Ｍの尿素、ｐＨ８．０）
【００４１】精製したＥＰＯの突然変異体から、ポリ
（ヒスチジン）タグ（ｔａｇ）を、蛋白質切断酵素のＦ
ａｃｔｏｒ Ｘａで取り除いた。２０ｍＭのトリス−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１Ｍの塩化ナトリウム
を含んだ反応混合物が、さらにＣ１８カラムで、ＨＰＬ
Ｃによって精製された。
（ヒスチジン）タグ（ｔａｇ）を、蛋白質切断酵素のＦ
ａｃｔｏｒ Ｘａで取り除いた。２０ｍＭのトリス−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１Ｍの塩化ナトリウム
を含んだ反応混合物が、さらにＣ１８カラムで、ＨＰＬ
Ｃによって精製された。
【００４２】８Ｍの尿素が含まれている蛋白質溶液に、
３ｍＭのジチオスレイトールを添加し、リフォルディン
グ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）溶液（５０ｍＭのリン酸二水
素ナトリウム、２％（ｖ／ｖ）ラウリルサルコシン酸ナ
トリウム、硫酸銅（ｃｕｐｒｉｃ ｓｕｌｆａｔｅ））
で透析しながら、ＥＰＯの突然変異体のリフォルディン
グ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）を誘導した。その後、緩衝液
はＰＥＧ化緩衝液（５０ｍＭの酢酸ナトリウム、５ｍＭ
のＥＤＴＡ、ｐＨ６）で置換された。ＥＰＯの突然変異
体とＰＥＧ−マレイミドの反応は、５ｍＭのＥＤＴＡが
混合された５０ｍＭの酢酸ナトリウムの緩衝溶液（ｐＨ
６）中で、ＥＰＯの突然変異体／ＰＥＧモル比１：５
で、室温で２４時間撹拌して行った。ＰＥＧ化されたＥ
ＰＯの突然変異体の修飾体は、修飾されていないＥＰＯ
の突然変異体と、残りのＰＥＧから、サイズ排除クロマ
トグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ;ＳＥＣ）を利用して分離し
た。分離したＰＥＧ化されたＥＰＯの突然変異体の修飾
体の生物学的活性は次のように測定した。
３ｍＭのジチオスレイトールを添加し、リフォルディン
グ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）溶液（５０ｍＭのリン酸二水
素ナトリウム、２％（ｖ／ｖ）ラウリルサルコシン酸ナ
トリウム、硫酸銅（ｃｕｐｒｉｃ ｓｕｌｆａｔｅ））
で透析しながら、ＥＰＯの突然変異体のリフォルディン
グ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）を誘導した。その後、緩衝液
はＰＥＧ化緩衝液（５０ｍＭの酢酸ナトリウム、５ｍＭ
のＥＤＴＡ、ｐＨ６）で置換された。ＥＰＯの突然変異
体とＰＥＧ−マレイミドの反応は、５ｍＭのＥＤＴＡが
混合された５０ｍＭの酢酸ナトリウムの緩衝溶液（ｐＨ
６）中で、ＥＰＯの突然変異体／ＰＥＧモル比１：５
で、室温で２４時間撹拌して行った。ＰＥＧ化されたＥ
ＰＯの突然変異体の修飾体は、修飾されていないＥＰＯ
の突然変異体と、残りのＰＥＧから、サイズ排除クロマ
トグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ;ＳＥＣ）を利用して分離し
た。分離したＰＥＧ化されたＥＰＯの突然変異体の修飾
体の生物学的活性は次のように測定した。
【００４３】ＰＥＧ化されたＥＰＯの突然変異体の修飾
体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性は、１０％ウシ胎児血清を含
むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ
ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７３：３７５−３８０（１９８
９））で培養し、ＥＰＯに依存性生長を示すヒト株化細
胞（ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅ）ＴＦ−１の成長
で測定し、Ｉｎ ｖｉｖｏ活性は、ネズミ（ｅｘｈｙｐ
ｏｘｉｃ ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉｃ ｍｉｃｅ）の赤
芽球細胞（ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ）に導
入された５９Ｆｅを定量して測定した（Ｇｏｌｄｗａｓ
ｓｅｒ，Ｅ．ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３７：１０９−１２１
（１９７５））。各測定値は平行線分析（ｐａｒａｌｌ
ｅｌ ｌｉｎｅ ａｓｓａｙ）（Ｄｕｎｎ，ＣＤＲ．，
Ｎａｐｉｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｐ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏ
ｌ．（Ｎ．Ｙ．） ６：５７７−５８４（１９７８））
により決定した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析では、９投与量
／１サンプル、２度の分析／１投与量で、ｉｎ ｖｉｖ
ｏ分析では、３投与量以上／１サンプル、３匹のネズミ
／１投与量で、測定した。培地と一緒に１／５００希釈
で使用された場合、塩などの、ＥＰＯの突然変異体の修
飾体の標本におけるどんな添加物も、分析評価を妨げな
かった。生物学的活性分析には、第二国際標準基準品
（ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）によ
り高度に精製された組替えヒトＥＰＯ（ｒｅｃｏｍｂｉ
ｎａｎｔｈｕｍａｎ ＥＰＯ、ｒＨｕＥＰＯ）を標準品
で使用した。生物学的活性の測定の結果、ＰＥＧ化され
たＥＰＯの突然変異体の修飾体は、無処置のｒＨｕＥＰ
Ｏに比べてｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が２倍以上高かった
し、ＰＥＧ化されていないＥＰＯの突然変異体は、無処
置のｒＨｕＥＰＯに比べて３倍以上の高いｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ活性を示したが、ｉｎ ｖｉｖｏ活性が消失され
た。ＰＥＧ化されていないＥＰＯの突然変異体は、ｉｎ
ｖｉｖｏのクリアランスシステムによって消失したの
である。ＰＥＧ化されたＥＰＯの突然変異体は、ｒＨｕ
ＥＰＯに比べて高いｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示したが、
ｉｎ ｖｉｖｏ活性は無処置のｒＨｕＥＰＯと同様か、
もしくは少し低いレベルで示された。ＰＥＧ化されたＥ
ＰＯの突然変異体の修飾体のｉｎ ｖｉｖｏ活性で見ら
れた若干の実験値の変異は、ＥＰＯの突然変異体に付加
されているＰＥＧ分子の水和量によるものであろう。
体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性は、１０％ウシ胎児血清を含
むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ
ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７３：３７５−３８０（１９８
９））で培養し、ＥＰＯに依存性生長を示すヒト株化細
胞（ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅ）ＴＦ−１の成長
で測定し、Ｉｎ ｖｉｖｏ活性は、ネズミ（ｅｘｈｙｐ
ｏｘｉｃ ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉｃ ｍｉｃｅ）の赤
芽球細胞（ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ）に導
入された５９Ｆｅを定量して測定した（Ｇｏｌｄｗａｓ
ｓｅｒ，Ｅ．ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３７：１０９−１２１
（１９７５））。各測定値は平行線分析（ｐａｒａｌｌ
ｅｌ ｌｉｎｅ ａｓｓａｙ）（Ｄｕｎｎ，ＣＤＲ．，
Ｎａｐｉｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｐ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏ
ｌ．（Ｎ．Ｙ．） ６：５７７−５８４（１９７８））
により決定した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析では、９投与量
／１サンプル、２度の分析／１投与量で、ｉｎ ｖｉｖ
ｏ分析では、３投与量以上／１サンプル、３匹のネズミ
／１投与量で、測定した。培地と一緒に１／５００希釈
で使用された場合、塩などの、ＥＰＯの突然変異体の修
飾体の標本におけるどんな添加物も、分析評価を妨げな
かった。生物学的活性分析には、第二国際標準基準品
（ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）によ
り高度に精製された組替えヒトＥＰＯ（ｒｅｃｏｍｂｉ
ｎａｎｔｈｕｍａｎ ＥＰＯ、ｒＨｕＥＰＯ）を標準品
で使用した。生物学的活性の測定の結果、ＰＥＧ化され
たＥＰＯの突然変異体の修飾体は、無処置のｒＨｕＥＰ
Ｏに比べてｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が２倍以上高かった
し、ＰＥＧ化されていないＥＰＯの突然変異体は、無処
置のｒＨｕＥＰＯに比べて３倍以上の高いｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ活性を示したが、ｉｎ ｖｉｖｏ活性が消失され
た。ＰＥＧ化されていないＥＰＯの突然変異体は、ｉｎ
ｖｉｖｏのクリアランスシステムによって消失したの
である。ＰＥＧ化されたＥＰＯの突然変異体は、ｒＨｕ
ＥＰＯに比べて高いｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示したが、
ｉｎ ｖｉｖｏ活性は無処置のｒＨｕＥＰＯと同様か、
もしくは少し低いレベルで示された。ＰＥＧ化されたＥ
ＰＯの突然変異体の修飾体のｉｎ ｖｉｖｏ活性で見ら
れた若干の実験値の変異は、ＥＰＯの突然変異体に付加
されているＰＥＧ分子の水和量によるものであろう。
【００４４】最後に、当業者であれば、単なる慣例の実
験を用いて明確にここに述べられている発明の特定の具
体化との多くの同等物を認識し、または確かめることが
できるであろう。このような同等物は、当然のことなが
ら、特許請求の範囲に含まれることを意図されている。
験を用いて明確にここに述べられている発明の特定の具
体化との多くの同等物を認識し、または確かめることが
できるであろう。このような同等物は、当然のことなが
ら、特許請求の範囲に含まれることを意図されている。
【００４５】
【発明の効果】本発明によれば、微生物由来のインビト
ロ発現法またはインビボ発現法によって、血液循環にお
けるプラズマ（ｐｌａｓｍａ）の半減期を延長させる作
用を有するエリスロポエチンの突然変異体の修飾体が生
産することができ、このような修飾物質をもつ微生物か
ら得られたＥＰＯの突然変異体の修飾体は、修飾されて
いない突然変異体や微生物から得られたＥＰＯのポリペ
プチドに比べ、血液内滞在時間が増大する等の点で、生
物学的活性が著しく増加する。
ロ発現法またはインビボ発現法によって、血液循環にお
けるプラズマ（ｐｌａｓｍａ）の半減期を延長させる作
用を有するエリスロポエチンの突然変異体の修飾体が生
産することができ、このような修飾物質をもつ微生物か
ら得られたＥＰＯの突然変異体の修飾体は、修飾されて
いない突然変異体や微生物から得られたＥＰＯのポリペ
プチドに比べ、血液内滞在時間が増大する等の点で、生
物学的活性が著しく増加する。
【図１】図１は、無細胞蛋白質生産法で非天然性アミノ
酸が導入されたＥＰＯの突然変異体を生産する方法を示
す概略図である。
酸が導入されたＥＰＯの突然変異体を生産する方法を示
す概略図である。
【図２】図２は、ｐｄＣｐＡ−アミノ酸の結合体(ｃｏ
ｍｐｌｅｘ)とｔＲＮＡ（−ＣＡ）とを結合してサプレ
ッサーｔＲＮＡを製作する過程を示す。
ｍｐｌｅｘ)とｔＲＮＡ（−ＣＡ）とを結合してサプレ
ッサーｔＲＮＡを製作する過程を示す。
【図３】図３は、ｐｄＣｐＡ−アミノ酸の結合体(ｃｏ
ｍｐｌｅｘ)とｔＲＮＡ（−ＣＡ）とを結合してサプレ
ッサーｔＲＮＡを製作する過程を示す。
ｍｐｌｅｘ)とｔＲＮＡ（−ＣＡ）とを結合してサプレ
ッサーｔＲＮＡを製作する過程を示す。
【図４】図４は、ヒトＥＰＯのｃＤＮＡを暗号化（ｃｏ
ｄｅｓ）している発現用ベクターｐＫ７−ＥＰＯを示
す。
ｄｅｓ）している発現用ベクターｐＫ７−ＥＰＯを示
す。
【図５】図５は、ｐＳｕｐ−ａｌａプラスミドからｔＲ
ＮＡ（−ＣＡ）を製造する方法を示す概略図である。
ＮＡ（−ＣＡ）を製造する方法を示す概略図である。
【図６】図６は、位置選択的突然変異法で３８番目の位
置にシステインを導入したＥＰＯ突然変異体の製造方法
と、そこにＰＥＧを付加する方法を示す概略図である。
置にシステインを導入したＥＰＯ突然変異体の製造方法
と、そこにＰＥＧを付加する方法を示す概略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 (72)発明者 サン ヒョン カン 大韓民国、ソウル、ガナク−グ、ボンチョ ン ８−ドン、1536−２ (72)発明者 テク ジン カン 大韓民国、ソウル、ガナク−グ、シリム− ドン、415−19 (72)発明者 ジ ヒョン ウー 大韓民国、インチョン、ブピョン−グ、ブ ガエ ２−ドン、106−37 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 DA06 EA04 GA11 GA19 HA01 4B064 AG18 CA02 CA19 CA21 CC24 CE02 CE10 DA01 4C084 AA06 AA07 BA44 CA04 DB56 NA14 ZA552 ZB212 4H045 AA10 AA20 BA57 CA40 DA13 EA24 FA70 FA74 GA21
Claims (6)
- 【請求項１】 生物学的活性をもつエリスロポエチン
（ＥＰＯ）の突然変異体の修飾体を生産する方法であっ
て、 修飾位置のアミノ酸に相応するコドンを、位置選択的突
然変異法（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ）により、アンバーストップコドン（ａｍｂ
ｅｒ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）、他のストップコドンま
たはレアコドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ）を含むフレー
ムシフトコドン（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｃｏｄｏｎ）に
転換する工程、 無細胞蛋白質生産において、ｔＲＮＡに結合した非天然
性アミノ酸をエリスロポエチン（ＥＰＯ）蛋白質に結合
させるために、その中に該アンバーストップコドン、他
のストップコドンまたはレアコドンを含むフレームシフ
トコドンに相応するサプレッサー（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏ
ｒ）ｔＲＮＡを含有させ、それによってエリスロポエチ
ン（ＥＰＯ）の突然変異体（ここで、該非天然アミノ酸
に下記の修飾物質をあらかじめ結合させておいてもよ
い。）を生産する工程、およびエリスロポエチン（ＥＰ
Ｏ）の突然変異体における一つまたはそれ以上の所望と
する位置に、化学的反応、酵素的反応または化学的−酵
素的反応により少なくとも一つの修飾物質（ｍｏｄｉｆ
ｉｅｒ（ｓ））を結合させる工程からなることを特徴と
するエリスロポエチン（ＥＰＯ）の突然変異体の修飾体
を生産する方法。 - 【請求項２】 上記修飾物質が、ＰＥＧ、単糖類、二糖
類、オリゴ糖類および／または多糖類であることを特徴
とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 請求項１または２に記載の方法により生
産されることを特徴とするエリスロポエチン（ＥＰＯ）
の突然変異体の位置選択的な修飾体。 - 【請求項４】 生物学的活性をもつエリスロポエチン
（ＥＰＯ）の突然変異体の修飾体を生産する方法であっ
て、 修飾位置のアミノ酸に相応するコドンをシステインをコ
ードするコドン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｃ
ｏｄｏｎ）に転換する工程、 上記突然変異ＤＮＡを持つ宿主細胞を形質転換（ｔｒａ
ｎｓｆｏｒｍｉｎｇ）させて、該修飾位置にフリースル
フヒドリル（ｆｒｅｅ ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌｇｒｏｕ
ｐ）をもつシステインの導入されたエリスロポエチン
（ＥＰＯ）の突然変異体を生産する工程、およびエリス
ロポエチン（ＥＰＯ）の突然変異体における一つまたは
それ以上の反応性スルフヒドリル基に、化学的反応、酵
素的反応または化学的−酵素的反応により少なくとも一
つの修飾物質（ｍｏｄｉｆｉｅｒ（ｓ））を結合させる
工程からなることを特徴とするエリスロポエチン（ＥＰ
Ｏ）の突然変異体の修飾体を生産する方法。 - 【請求項５】 上記修飾物質が、ＰＥＧ、単糖類、二糖
類、オリゴ糖類および／または多糖類であることを特徴
とする請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 請求項４または５に記載の方法により生
産されることを特徴とするエリスロポエチン（ＥＰＯ）
の突然変異体の位置選択的な修飾体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2000-0082531A KR100401296B1 (ko) | 2000-12-27 | 2000-12-27 | 수식물질에 의해 수식된 단백질 변이체 및 이것의 제조방법 |
| KR2000-0082531 | 2000-12-27 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=19703638
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001047494A Pending JP2002209593A (ja) | 2000-12-27 | 2001-02-23 | 微生物由来のインビトロ発現法またはインビボ発現法によって生産されたエリスロポエチンの突然変異体の修飾体およびその生産方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20020081734A1 (ja) |
| EP (1) | EP1219636A3 (ja) |
| JP (1) | JP2002209593A (ja) |
| KR (1) | KR100401296B1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005075639A1 (ja) * | 2004-02-06 | 2005-08-18 | Shionogi Co., Ltd. | 拡張コドンを利用した糖タンパク質の作製方法 |
| JP2007519422A (ja) * | 2004-02-02 | 2007-07-19 | アンブレツクス・インコーポレイテツド | 修飾されたヒト四螺旋バンドルポリペプチド及びそれらの使用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7345019B1 (en) * | 1999-04-13 | 2008-03-18 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin |
| US7767643B2 (en) | 2000-12-29 | 2010-08-03 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs |
| US20030072737A1 (en) * | 2000-12-29 | 2003-04-17 | Michael Brines | Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs |
| JP2007517769A (ja) * | 2003-09-29 | 2007-07-05 | ウォーレン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド | 敗血症および癒着形成の治療および予防のための組織保護性サイトカイン |
| US20060084136A1 (en) * | 2004-07-14 | 2006-04-20 | Invitrogen Corporation | Production of fusion proteins by cell-free protein synthesis |
| SG160437A1 (en) | 2004-12-22 | 2010-04-29 | Ambrx Inc | Modified human growth hormone |
| KR20070100299A (ko) | 2004-12-22 | 2007-10-10 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 재조합 인간 성장 호르몬의 발현 및 정제 방법 |
| KR101224781B1 (ko) | 2004-12-22 | 2013-01-21 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인간 성장호르몬의 조제물 |
| EP1848461A2 (en) * | 2005-02-16 | 2007-10-31 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugates of an epo moiety and a polymer |
| US20080171696A1 (en) * | 2005-10-21 | 2008-07-17 | Avigenics, Inc. | Pharmacodynamically enhanced therapeutic proteins |
| CA2622210A1 (en) * | 2005-10-21 | 2007-04-26 | Avigenics, Inc. | Glycolated and glycosylated poultry derived therapeutic proteins |
| EP2041167B1 (en) | 2006-07-25 | 2010-05-12 | Lipoxen Technologies Limited | Derivatisation of granulocyte colony-stimulating factor |
| KR101486449B1 (ko) | 2008-01-11 | 2015-01-26 | 세리나 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 | 다작용성 형태의 폴리옥시졸린 공중합체 및 이를 포함하는 약물 조성물 |
| US8101706B2 (en) | 2008-01-11 | 2012-01-24 | Serina Therapeutics, Inc. | Multifunctional forms of polyoxazoline copolymers and drug compositions comprising the same |
| GB0922354D0 (en) | 2009-12-21 | 2010-02-03 | Polytherics Ltd | Novel polymer conjugates |
| JP6357154B2 (ja) * | 2013-08-05 | 2018-07-11 | 国立大学法人 東京大学 | 荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドの製造方法 |
| WO2015130963A2 (en) | 2014-02-27 | 2015-09-03 | Xenetic Biosciences, Inc. | Compositions and methods for administering insulin or insulin-like protein to the brain |
| US20200179524A1 (en) | 2017-04-25 | 2020-06-11 | Lipoxen Technologies Limited | Methods of treating multiple myeloma cancers expressing high levels of epo-receptor using psa-epo |
| WO2024073568A2 (en) * | 2022-09-28 | 2024-04-04 | President And Fellows Of Harvard College | Evolution of fluorogenic sensors |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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