WO2005075639A1 - 拡張コドンを利用した糖タンパク質の作製方法 - Google Patents

拡張コドンを利用した糖タンパク質の作製方法 Download PDF

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WO2005075639A1
WO2005075639A1 PCT/JP2005/001721 JP2005001721W WO2005075639A1 WO 2005075639 A1 WO2005075639 A1 WO 2005075639A1 JP 2005001721 W JP2005001721 W JP 2005001721W WO 2005075639 A1 WO2005075639 A1 WO 2005075639A1
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group
amino acid
sugar chain
protein
trna
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PCT/JP2005/001721
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English (en)
French (fr)
Inventor
Shinichiro Nishimura
Reiko Sadamoto
Naoki Matsubara
Kenichi Niikura
Original Assignee
Shionogi Co., Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/44—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles
    • C07D209/48—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles with oxygen atoms in positions 1 and 3, e.g. phthalimide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins

Definitions

  • the present invention relates to the fields of biochemistry and protein-related biochemistry. More particularly, the present invention relates to glycoproteins and their synthesis.
  • Modification of proteins with sugar chains is important because it helps to improve the blood stability and retention time of protein preparations (hormonal agents, etc.), and most of them are currently converted into proteins using animal cells.
  • Chain modification In the case of natural sugar chain addition using such animal cells, the sugar chain to be introduced is determined by the culture system and cannot be freely designed, and the sugar chain introduction site and introduction rate are freely controlled. The difficulty is that you can't.
  • Non-Patent Document 1 A method using a stop codon developed by Schultz et al. Is a method for introducing unnatural amino acids other than the 20 commonly used amino acids into proteins by newly defining corresponding codons.
  • Non-Patent Document 1 a method using four base codons proposed by Shishido 'Yoshizaka et al.
  • Non-Patent Documents 2-4 a method using four base codons proposed by Shishido 'Yoshizaka et al.
  • the method using four base codons has the advantage that various unnatural amino acids can be introduced into the respective target sites, since the number of codons that can be used at one time is theoretically many.
  • Non-Patent Document 5 There is a report that a non-natural amino acid having a ketone group is introduced into a three-base codon to bond a sugar chain with an aminoxyl group.
  • Non-patent literature l Schultzet al., Vol. 96, Issue 9, 4780-4785, April 27, 1999
  • Non-Patent Document 2 Taki M. et al. FEBS Lett. 507, 35-38, 2001
  • Non-Patent Document 3 HohsakaT. Et al. J. Am. Chem. Soc, 121, 34-40, 1999
  • Non-Patent Document 4 Hohsaka T. et al. J. Am. Chem. Soc, 118, 9778-9779, 1996
  • Non-Patent Document 5 H. Liu et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 1702-1703, 2003
  • An object of the present invention is to provide a protein containing an amino acid having a functional group capable of easily introducing a sugar chain, and a method for producing a glycopeptide derived therefrom. Means for solving the problem
  • an amino acid having a group for introducing a sugar chain such as an aminooxy group suitable for introducing a sugar chain is subjected to a method using four or more bases as codons (for example, a four-base codon method).
  • a method using four or more bases as codons for example, a four-base codon method.
  • the functional group capable of binding to the sugar chain includes an aminooxy group which may be protected, an N-alkylaminooxy group which may be protected, a hydrazide group, an azide group, a thiosemicarbazide group and a cysteine residue.
  • Item 2 The method according to Item 1, having at least one group selected from the group consisting of:
  • the amino acid derivative containing a functional group capable of binding to a sugar chain is an amino acid in which a functional group capable of binding to a sugar chain is bonded to a natural amino acid.
  • the amino acid having a functional group capable of binding to the sugar chain is an amino acid or a derivative thereof selected from the group consisting of tyrosine, homoseri, and celica.
  • the protein generated when the above four base codon is read as a three base codon is significantly different in molecular weight from the protein generated when the above four base codon is read as a four base codon. 14. The method according to any one of 13 above.
  • the amino acid having a functional group capable of binding to the sugar chain has the following formula: [Formula 11]
  • amino acid selected from the group consisting of the following:
  • Item 14 The method according to Item 1-14, wherein the bond is to RNA at the carboxyl group of the amino acid.
  • the modified tRNA is GCGGAUUUAGCUCAGUUG shown in SEQ ID NO: 1.
  • Item 18 The method according to Item 1-17, comprising the sequence CACAGAAUUCGCACCA.
  • (B) a method for producing a glycoprotein, comprising the step of binding the protein to a desired sugar chain to produce a glycoprotein.
  • the amino acid having a functional group capable of binding to the sugar chain is 2-amino-4 [N-methyl-aminooxy] butyric acid (2-amino-4- [N-methytriaminooxy] -butyric acid) 21.
  • the method according to item 21. (21-2) The method according to item 21, wherein in the step B, the sugar chain concentration is between 10 mM and 1M.
  • the sugar chain is an acetate buffer.
  • step B The method according to item 21, wherein the step B is performed for 6 hours and 5 days.
  • Deoxyribonucleotidyl in the above pdNpN is ⁇ -D-thymidine, 2, -deoxy- ⁇ -D-cytidine, 2, -deoxy- ⁇ -D-adenosine, 2, -deoxy- ⁇ 23.
  • the ribonucleotidyl in the pdNpN is selected from the group consisting of ⁇ -D-cytidine, ⁇ -D-adenosine, j8-D-guanosine, j8-D-peracyl and
  • the modified tRNA is GCGGAUUUAGCUCAGUUG shown in SEQ ID NO: 1.
  • a modified nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence containing the 4-base codon or a complement thereof, wherein the nucleic acid sequence encodes a functional protein when one amino acid is assigned to the 4-base codon.
  • a sugar chain comprising a transcriptase for transcribing the modified nucleic acid molecule, a protein synthesis system including a translation enzyme for translating a set of tRNA and mRNA required for translation.
  • a kit for producing a protein comprising an amino acid having a functional group capable of binding.
  • a modified nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence containing the 4-base codon or a complement thereof, wherein the nucleic acid sequence encodes a functional protein when one amino acid is assigned to the 4-base codon.
  • C) a protein synthesis system comprising a transcriptase for transcription of the modified nucleic acid molecule, a translation enzyme for translating a set of tRNA and mRNA required for translation;
  • a glycoprotein production kit comprising: a linking means for linking a functional group capable of binding to the sugar chain with the sugar chain.
  • (34) 4 recognize base codon modified tRNA 0 comprising an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain
  • tRNA a modified tRNA containing an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain that recognizes a 4-base codon, and a set of tRNAs required for translation, for use in a translation reaction for producing a glycoprotein. Itoi components.
  • a protein synthesis system containing a modified tRNA containing an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain and recognizing a 4-base codon, and a translation enzyme for translating a set of tRNA and mRNA required for translation. ).
  • the protein synthesis system according to item 36 further comprising a transcriptase for transcribing a nucleic acid molecule.
  • nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence containing a 4-base codon or a complement thereof, wherein the nucleic acid sequence encodes a functional protein when one amino acid corresponds to the 4-base codon
  • composition comprising the protein prepared by the method according to item 1.
  • composition comprising the glycoprotein prepared by the method according to item 21.
  • R is hydrogen from the side chain of the amino acid
  • R and R each independently represent a protecting group or hydrogen, and R is bonded to a sugar chain.
  • R—R and R are each independently hydrogen, Fmoc group, acetyl group,
  • R or R is an aminooxy group which may be protected
  • N-alkylaminooxy group, hydrazide group, azide group, thiosemicarbazide group, and cysteine residue are also groups selected from the group consisting of those with one hydrogen removed.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram when a modified tRNA is used.
  • FIG. 2 shows an overview of protein synthesis using a modified tRNA.
  • FIG. 3 shows the results of SDS-PAGE electrophoresis in Example 6. Left: tRNA-CA; Right: 2-amino-4- [0- [N-trimethylsilylethoxycarbol] amino] hydroxybutylic acid di-tRNA (CCCG).
  • FIG. 4 shows the results of Western plot analysis in Example 7.
  • Primary antibody anti-T7 tag antibody (derived from mouse); Secondary antibody: anti-mouse IgG-alkaline phosphatase.
  • Left strange Expression using 2-amino-4- [0- [N-trimethylsilylethoxycarbol] amino] hydroxybutyric acidil-tRNA (CCCG) for different lysozyme sequences! /, Center: wild-type Expression of lysozyme sequence; and right: mutant lysozyme sequence expressed using 2-amino 4- [0- [N-trimethylsilylethoxycarbol] amino] hydroxybutyric acid giro tRNA (CCCG) What was done (experiment above).
  • Fig. 5 shows the results of Example 8 showing how the ratio of arginine, which is a competing amino acid, is changed to show the effect on expression.
  • 1 2-amino-4- [0- [N-trimethylsilylethoxycarbol] amino] hydroxybutylic acid diyl tRNA (CCCG) (hereinafter also referred to as ntrPhe-tRNA), 20 amino acids (volume ratio: All 1); 2: ntrPhe—tRNA (4 volumes), 19 amino acids: 0.1 Arg (volume ratio); 3: ntrPhe—tRNA, 19 amino acids: 0.1 Arg; 4: ntrPhe—tRNA, 19 amino acids: 0 OlArg (volume ratio); 5: ntrPhe—tRNA, 19 amino acids: without Arg; ntrPhe—tRNA without 20 amino acids; 7ntrPhe—tRNA without 19 amino acids.
  • CCCG 2-amino-4- [0- [N-trimethylsilylethoxycarbol] amino]
  • FIG. 6A was used to verify whether a full-length protein was synthesized when a compound other than an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain produced in Example 14 was introduced.
  • Fig. 3 shows the structure of mRNA (streptavidin 83CGGG (SEQ ID NO: 6)).
  • FIG. 6B shows whether a full-length protein is synthesized when a compound other than an amino acid having a functional group (116) capable of binding to a sugar chain produced in Example 14 is introduced. The result (lower right) of the verification is shown.
  • Fig. 7 shows the results of comparison in the case of using a circular nucleic acid molecule and a linear nucleic acid molecule in a protein synthesis system.
  • 1 circular template
  • 2 circular template (1-1. His)
  • 3 linear (mRNA) template
  • 4 linear (mRNA) template (1-1. His).
  • FIG. 8 shows various conditions for expression of lysozyme.
  • 1 Lysozyme wild type; 2: Lysozyme 44CGGG; 3: Lysozyme 44CGGG (+ Tyr-N3, 30 ° C, 0.1argg); 4: Lysozyme 44CGGG (+ Tyr-N3, 37 ° C, 0.1argg); 5: Lysozyme 44CGGG (+ Tyr — N3, 37.C, 20 amino acids); 6: Lysozyme 44CGGG (+ Tyr—N3, 37.C, 1,2 amino acid (0.1arg)); 7: Lysozyme 44CGGG (+ Tyr to N3, 42 ° C, 0.lArg); 8: 44.000 (+ 11 ⁇ 261: (0? «1 60.), at 37, 0. lArg); 9: lysozyme 44CGGG (+ Hser (ONHTeoc) X 2, 37. C, 0. lArg);
  • Fig. 9 shows the results of mass analysis of the results of the synthesis of mutant streptavidin into which 2-amino-4 [N-methyl-aminooxy] butyric acid was introduced using MALDI TOF MASS using DHB as a matrix.
  • the horizontal axis indicates the mass-to-charge ratio (mZz), and a.i. indicates the absolute intensity.
  • FIG. 10 shows the results obtained in Example 15 by using MALDI TOFMASS obtained by modifying mutated streptavidin into which 2-amino-4- [N-methyl-aminooxy] -butyric acid was introduced with glucose and using DHB as a matrix.
  • 3 shows the results of measuring the molecular weight.
  • the horizontal axis indicates the mass-to-charge ratio (mZz), and a.i. indicates the absolute intensity.
  • FIG. 11 shows the results obtained in Example 15 when DHB obtained by modifying a mutant streptavidin into which 2-amino-4- [N-methyl-aminooxy] -butyric acid was introduced with maltose was used as a matrix.
  • 3 shows the results of molecular weight measurement using MALDITOF MASS. The horizontal axis indicates the mass-to-charge ratio (mZz), and a.i. indicates the absolute intensity.
  • FIG. 12 shows that, in Example 15, mutated streptavidin into which 2-amino-4- [N-methyl-aminooxy] -butyric acid was introduced was modified with maltotriose to use DHB as a matrix. The results of the molecular weight measurement with MALDITOF MASS are shown. The horizontal axis indicates the mass-to-charge ratio (mZz), and a.i. indicates the absolute intensity.
  • mZz mass-to-charge ratio
  • a.i. indicates the absolute intensity.
  • FIG. 13 shows that in Example 15, mutated streptavidin into which 2-amino-4- [N-methyl-aminooxy] -butyric acid was introduced was modified with DHB when modified with N-acetyldarcosamine.
  • the results of molecular weight measurement with MALDITOF MASS when used as a matrix are shown.
  • the horizontal axis indicates the mass-to-charge ratio (mZz), and a.i. indicates the absolute intensity.
  • FIG. 14 shows the results of molecular weight measurement with MALDI TOF MASS when DHB was used as a matrix in Example 16 for modification with ratatose and ⁇ 2,3 sialyltransferase glycan elongation reaction.
  • the horizontal axis indicates the mass-to-charge ratio (mZz), and a.i. indicates the absolute intensity.
  • SEQ ID NO: 1 shows the sequence of tRNA (RNA) used in the present invention.
  • SEQ ID NO: 2 shows the sequence of RNA (-CA).
  • SEQ ID NO: 3 Nucleotide sequence of lysozyme having 4 base codons produced by the present invention
  • SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence of lysozyme having 4 bases codon produced by the present invention
  • SEQ ID NO: 5 Having 4 base codons produced by the present invention
  • Nucleic acid sequence of streptavidin SEQ ID NO: 6: amino acid sequence of streptavidin having 4-base codon produced in the present invention Best mode for carrying out the invention
  • the "sugar chain” refers to a conjugate composed of one or more unit sugars (monosaccharide and Z or a derivative thereof). When two or more unit sugars are linked, each unit sugar is linked by dehydration condensation through glycosidic bonds.
  • sugar chains examples include polysaccharides (glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetyldarcosamine, N-acetylgalatatosamine, sialic acid, Conjugates and derivatives), as well as a wide range of sugar chains decomposed or derived from complex biomolecules such as degraded polysaccharides, glycoproteins, proteodalicans, glycosaminodalicans, and glycolipids. Not limited. Therefore, in this specification, a sugar chain can be used interchangeably with "polysaccharide (polysaccharide)", “saccharide”, and "carbohydrate”.
  • sugar chain in this specification may include both sugar chains and sugar chain-containing substances.
  • the term "monosaccharide derivative” refers to a derivative in which one or more hydroxyl groups on a monosaccharide are substituted with another substituent and the resulting substance is not within the range of the monosaccharide.
  • Examples of such monosaccharide derivatives include sugars having a carboxyl group (eg, aldonic acid in which the C 1 position has been oxidized to form a carboxylic acid (eg, D-dalconic acid in which D-glucose has been oxidized), Peronic acid in which the C atom has become a carboxylic acid (D-glucuronic acid in which D-glucose is oxidized), a sugar having an amino group or a derivative of an amino group (for example, an acetylated amino group) (for example, N-acetyl-D-darcosamine) , N-acetyl-D-galactosamine, etc.), a saccharide having both an amino group and a carboxyl group (eg, N-acetylneuraminic acid (sialic acid), N-acetylmuramic acid, etc.), and a deoxydylated saccharide (eg, 2-Doxy D-ribose
  • sugar chain-containing substance refers to a substance containing a sugar chain and a substance other than the sugar chain.
  • sugar chain-containing substances are found abundantly in living organisms.
  • complex substances such as degraded polysaccharides, glycoproteins, proteodalicans, glycosaminoglycans, glycolipids, etc.
  • the biomolecular force also includes, but is not limited to, a wide range of sugar chains decomposed or derived.
  • glycoprotein or “glycopeptide” is used interchangeably and refers to a protein or peptide containing a sugar chain.
  • glycoproteins include various useful functional proteins, including, but not limited to, enzymes, hormones, cytokins, antibodies, vaccines, receptors, serum proteins, and the like.
  • polypeptide As used herein, the terms "protein,””polypeptide,””oligopeptide,” and “peptide” are used interchangeably herein and refer to amino acids of any length.
  • the polymer may be linear or branched or cyclic.
  • the amino acid contained in the polypeptide may be a naturally-occurring amino acid or a non-naturally-occurring amino acid, or a modified amino acid (for example, an amino acid containing a functional group capable of binding to a sugar chain).
  • the term may also include those assembled into a complex of multiple polypeptide chains.
  • the term also embraces naturally or artificially modified amino acid polymers.
  • Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component).
  • This definition also includes, for example, polypeptides containing one or more analogs of an amino acid (eg, including unnatural amino acids, etc.), peptide-like conjugates (eg, peptoids) and those known in the art. Other modifications are included.
  • polynucleotide As used herein, the terms “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to a polymer of nucleotides of any length. The term also includes “derivative oligonucleotides” or “derivative polynucleotides.” “Derivative oligonucleotide” or “derivative polynucleotide” refers to an oligonucleotide or polynucleotide having an unusual force or a bond between nucleotides containing a derivative of a nucleotide, and is used interchangeably.
  • oligonucleotide examples include, for example, 2,1-O-methyl-ribonucleotide, a derivative in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and an oligonucleotide in a oligonucleotide.
  • oligonucleotides in which phosphodiester bonds are converted to N3, -P5, phosphoramidate bonds, derivative oligonucleotides in which ribose and phosphoric diester bonds are converted to peptide nucleic acid bonds, and oligonucleotides in oligonucleotides Derivative oligonucleotide in which peracyl is substituted with C5 propynyl peracyl, derivative oligonucleotide in which peracyl in the oligonucleotide is substituted with C-5 thiazole peracyl, and cytosine in the oligonucleotide is substituted with C5 propyl-cytosine Derivative oligonucleotides, derivative oligonucleotides in which cytosine in the oligonucleotide is replaced with phenoxazine-modified cytosine, derivative oligonucleotides in which ribose
  • nucleic acid sequence may also have conservatively modified variants (e.g., degenerate codon substitutions) and complements, as well as explicitly stated sequences. It is contemplated to include the sequence. Specifically, degenerate codon substitutions create a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and a Z or deoxyinosine residue. (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91— 98 (1994)).
  • degenerate codon substitutions create a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and a Z or deoxyinosine residue.
  • nucleic acid molecule is used interchangeably with nucleic acids, oligonucleotides, and polynucleotides, and includes cDNA, mRNA, genomic DNA, and the like. Nucleic acid molecules can be provided in circular (eg, circular vectors, plasmids, etc.) or linear (eg, PCR fragments). As used herein, nucleic acids and nucleic acid molecules may be included in the concept of the term “gene”.
  • a nucleic acid molecule encoding a gene sequence also includes "splice variants (variants).” Similarly, a particular protein encoded by a nucleic acid includes any protein encoded by a splice variant of the nucleic acid. As the name suggests, "splice variants" are the products of alternative splicing of a gene. After transcription, the initial nucleic acid transcript can be spliced such that different (alternate) nucleic acid splice products encode different polypeptides. The mechanism of production of splice variants varies, but involves alternative splicing of exons. Another polypeptide derived from the same nucleic acid by read-through transcription is also included in this definition. Any product of a splicing reaction, including recombinant forms of the splice product, is included in this definition.
  • the term "gene” refers to a factor that defines a genetic trait. Usually, they are arranged in a certain order on a chromosome. Those that define the primary structure of a protein are called structural genes.
  • a gene includes a structural gene and a regulatory gene unless otherwise specified.
  • gene refers to “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” and Z or “protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide”. May point.
  • gene product also refers to “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” expressed by a gene and Z or “protein” “polypeptide”, “oligopeptide” and Includes “peptide”. Those skilled in the art can understand what the gene product is, depending on the situation.
  • homology of a gene refers to the degree of identity between two or more gene sequences.
  • the higher the homology between two genes the higher the identity or similarity between their sequences.
  • Whether the two genes have homology can be determined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, by stringent hybridization under stringent conditions.
  • the DNA sequences between the gene sequences are typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 80%, 90% , 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical, the genes are homologous.
  • similarity of a gene refers to the homology of two or more gene sequences when conservative substitutions are regarded as positive (identical) in the above homology. Refers to the degree of identity to each other. Thus, if there are conservative substitutions, identity and similarity will be different depending on the existence of the conservative substitution. When there is no conservative substitution, identity and similarity show the same numerical value.
  • terminal 1 is located downstream of a gene coding region of a gene, and is a sequence involved in terminating transcription when DNA is transcribed into mRNA and adding a poly A sequence. It is. Terminators are known to be involved in mRNA stability and affect gene expression levels.
  • promoter refers to a region on DNA that determines the transcription start site of a gene and that directly regulates the frequency, and is usually a base to which RNA polymerase binds to start transcription. Is an array. Therefore, in the present specification, a portion of a gene having a promoter function is referred to as a “promoter portion”.
  • the region of the promoter is Usually, the region is within about 2 kbp upstream of the first exon of the putative protein coding region.Therefore, if the protein coding region in the genomic nucleotide sequence is predicted using DNA analysis software, the promoter region can be estimated. Can.
  • the putative promoter region varies for each structural gene, but is usually located upstream of the structural gene, but is not limited thereto, and may be located downstream of the structural gene.
  • a T7 promoter can be used.
  • the term “functions in an in vitro system” means, when used with respect to a promoter, an activity capable of promoting gene transcription in an in vitro system (eg, a cell-free system). Say. Such activity can be determined in a cell-free system by placing a promoter of interest upstream or downstream of an appropriate gene and confirming that the promoter promotes transcription of the gene.
  • the term "ennosense” refers to a sequence used to increase the expression efficiency of a target gene. Such enos are well known in the art. A plurality of enhancers can be used, but one may be used! /, And no need to use! /.
  • operably linked refers to a transcription / translation regulatory sequence (eg, a promoter, an enno, a nucleic acid, etc.) having expression (operation) of a desired sequence, or It is placed under the control of the translation control sequence.
  • a promoter In order for a promoter to be operably linked to a gene, the promoter is usually, but not necessarily, positioned immediately upstream of the gene.
  • any technique for introducing a nucleic acid molecule into cells may be used. Examples include transformation, transduction, and transfection. Techniques for introducing such nucleic acid molecules are well known and commonly used in the art, and are described, for example, in Ausubel FA et al. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York; NY; Sambrook J et al. (1987) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. And its third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY Co., 1997. Gene transfer can be performed by methods described herein such as Northern blot, Western blot analysis or other well-known methods. It can be confirmed by using technology.
  • any of the above-described methods for introducing DNA into cells can be used, and examples thereof include transfection, transduction, and transformation (for example, Calcium phosphate method, ribosome method, DEAE dextran method, electroporation method, method using particle gun (gene gun), etc.).
  • vector refers to a vector that can transfer a target polynucleotide sequence into a target cell.
  • vectors are capable of autonomous replication in host cells such as prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, animal individuals and plant individuals, or capable of incorporation into chromosomes, Those containing a promoter at a position suitable for transcription of the polynucleotide of the present invention are exemplified.
  • those suitable for cloning are referred to as “cloning vectors”.
  • Such closing vectors are usually
  • restriction enzyme sites and multiple closing sites are well known in the art, and those skilled in the art can appropriately select and use them according to the purpose. Such techniques are described in the literature described herein (eg, Sambrook et al., Supra).
  • expression vector refers to a structural gene and a promoter that regulates its expression, and various regulatory elements are operably linked in a host cell. Nucleic acid sequence.
  • the regulatory elements may preferably include a terminator, a selectable marker such as a drug resistance gene, and an enhancer. It is well known to those skilled in the art that the type of expression vector of an organism (eg, an animal) and the type of regulatory element used may vary depending on the host cell or protein expression system.
  • transformant refers to all or a part of an organism such as a cell produced by transformation.
  • examples of the transformant include prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, and the like.
  • a transformant is also called a transformed cell, a transformed tissue, a transformed host, or the like, depending on the target.
  • the cells used in the present invention may be transformants.
  • prokaryotic cells when prokaryotic cells are used for genetic manipulation, etc.,
  • examples of the biotic cell vesicles include prokaryotic cells belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Panyu, Microbacterium Chen, Pseudomonas ⁇ , etc., for example, Escherichia coli XL1—Blue, Escherichia coli XL2—B1ue, Escherichia coli DH1 is exemplified.
  • “detection” or “quantification” of gene expression is achieved using an appropriate method including, for example, mRNA measurement and immunological measurement.
  • the molecular biological measurement method include a Northern blot method, a dot plot method, and a PCR method.
  • the immunological measurement method include, for example, an ELISA method using a microtiter plate, an RIA method, a fluorescent antibody method, a Western plot method, and an immunohistological staining method.
  • Examples of the quantification method include an ELISA method and an RIA method. It can also be performed by a gene analysis method using an array (for example, a DNA array or a protein array).
  • DNA arrays are widely described in (Shujunsha eds., Cell Engineering Special Edition, “DNA Microarrays and the Latest PCR Method”). Protein arrays are described in detail in Nat Genet. 2002 Dec; 32 Suppl: 526-32. Methods for analyzing gene expression include, but are not limited to, RT-PCR, RACE, SSCP, immunoprecipitation, two-hybrid systems, in vitro translation, and the like, as described above. Such further analysis methods are described, for example, in Genome Analysis and Experimental MethodsYusuke Nakamura Lab's Manual, edited by Yusuke Nakamura Yodosha (2002), which are all incorporated herein by reference. Is done.
  • “capable of binding to a sugar chain” refers to the ability to bind (preferably, covalently bind) to a sugar chain.
  • covalent bond is used in the ordinary sense in the art, and refers to a chemical bond formed when an electron pair is shared by two atoms. Examples of such a covalent bond include, but are not limited to, an oxime bond, a hydrazone bond, a thiosemihydrazone bond, a perhydrothiazine ring formation, and a thiazolidine ring formation.
  • (functional) group capable of binding to a sugar chain refers to any functional group capable of binding to a sugar chain.
  • a functional group may be a "functional group capable of reacting with an aldehyde group in a fluid".
  • a functional group capable of reacting with an aldehyde group in a fluid means that a sugar chain is an aqueous solution.
  • Examples of such a functional group include, but are not limited to, an aminooxy group, an N-alkylaminooxy group, a hydrazide group, an azide group, a thiosemicarbazide group, and a cysteine residue.
  • An aminooxy group, an N-alkylaminooxy group, and an azide group are preferred.
  • fluid refers to a fluid capable of providing an environment in which the substance of the present invention (for example, an amino acid containing a (functional) group capable of binding to a sugar chain) interacts with the sugar chain. Anything can be used.
  • the substance of the present invention for example, an amino acid containing a (functional) group capable of binding to a sugar chain
  • such fluids are substantially free of materials containing keto groups. This is because, when a substance containing a keto group is significantly contained, the reaction between the aldehyde group in the fluid and the substance of the present invention does not proceed sufficiently. Therefore, a form that does not include a substance containing a keto group is not essential, but is a preferred embodiment.
  • the fluid used herein is preferably such that it brings the sugar into equilibrium between the cyclic hemiacetal form and the acyclic aldehyde form.
  • Such fluids include, but are not limited to, for example, aqueous solutions, organic solvents, and mixtures thereof.
  • the fluid is an aqueous solution.
  • fragment refers to a protein or polynucleotide having a sequence length of 1 to n-1 with respect to a full-length protein or polynucleotide (length is n).
  • length is n
  • the length of the fragment can be appropriately changed according to its purpose.For example, the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 for proteins. , 15, 20, 25, 30, 40, 50 and more amino acids, and the length represented by an integer not specifically listed herein (for example, 11 or the like) is also a lower limit. May be appropriate. In the case of polynucleotides, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 and more nucleotides may be mentioned. The lengths represented by!
  • the lengths of a protein and a polynucleotide can be represented by the number of amino acids or nucleic acids, respectively, as described above, but the numbers described above have the same function but are not absolute. As long as the above-mentioned number as the upper limit or adjustment is intended, it is intended to include a few above and below (or, for example, 10% above and below). In order to express such an intention, in this specification, "about” may be used before a number. However, as used herein, it should be understood that the presence or absence of “about” does not affect the interpretation of that number.
  • nucleotide refers to a nucleoside in which a sugar moiety is converted to a phosphate ester.
  • nucleoside refers to a conjugate in which a base and a sugar form an N-glycoside bond.
  • Nucleic acids are polymers (polynucleotides) of nucleotides X with pyrimidine or purine bases (pyrimidine nucleotides and purine nucleotides). Those whose sugar moiety is D-ribose are obtained as ribonucleotides! /,,,, And are obtained by hydrolysis of RNA.
  • deoxyribonucleotides Those whose sugar moiety is D-2, -deoxyribose are called deoxyribonucleotides, can get. It may be natural or non-natural.
  • a “derivative nucleotide” or “nucleotide analog” is one that differs from a naturally occurring nucleotide but has a function similar to that of the original nucleotide. Such derivative nucleotides and nucleotide analogs are well known in the art. Examples of such derivative nucleotides and nucleotide analogs include phosphorothioates, phosphonoreamidates, methylphosphonates, chiral methylphosphonates, 2-0-methylribonucleotides, peptide nucleic acids (PNA). It is not limited to these.
  • amino acid is used in a meaning commonly used in the art, and refers to an organic compound having a carboxyl group and an amino group.
  • amino acids may be natural or unnatural amino acids.
  • natural amino acid refers to the L isomer of a naturally occurring amino acid that exists in vivo.
  • Natural amino acids include glycine, alanine, norin, leucine, isoleucine, serine, homoserine, methionine, threonine, fenylalanine, tyrosine, tryptophan, cysteine, proline, histidine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, Glutamine, ⁇ -carboxyglutamic acid, arginine, ortin, and lysine. Unless otherwise indicated, all amino acids referred to in the present specification are in the form of L-form and D-form amino acids are also within the scope of the present invention.
  • the term "unnatural amino acid” refers to an amino acid not normally found in nature in proteins.
  • unnatural amino acids are norleucine, para- Nitrophe-nolelanine, homophene-nolelanine, para-phenolic pheno-nolelanine, 3-amino-2-benzylpropionic acid, D-form or L-form of homoarginine, and D-tationalanine.
  • amino acids modified based on natural amino acids are included in the range of non-natural amino acids if they are not natural amino acids.
  • Amino acid analog refers to a molecule that is not an amino acid, but that is similar in physical properties and Z or function to the amino acid. Amino acid analogs include, for example, etyonin, canavanine, 2-methylglutamine and the like.
  • Amino acid mimetics refers to compounds that have a structure that is different from the general chemical structure of an amino acid, but that functions in a manner similar to a naturally occurring amino acid.
  • amino acids may be replaced by amino acid analogs or amino acid mimetics.
  • Amino acids can be represented by their commonly known three letter symbols, or by IUPAC-IUB Biochemical.
  • an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain is typically represented by the following formula:
  • R is the amino acid with one side chain hydrogen removed, and R—R and
  • R 124 and R each independently represent a protecting group or hydrogen, and R is a group capable of binding to a sugar chain).
  • Represented can be represented by a compound.
  • the side chain of an amino acid refers to an amino acid represented by RCH (NH) COOH.
  • R represents a group corresponding to R.
  • the amino acid is represented by R R CH (NH) COOH (R and a b a and R are arbitrary groups and may be taken together to form a cyclic group).
  • Individual exemplary amino acids include, for example, glycine, Lanine, norin, leucine, isoleucine, serine, homoserine, methionine, threonine, penylalanine, tyrosine, tryptophan, cystine, proline, histidine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, ⁇ -carboxyglutamic acid, arginine, Or-tin, and lysine, but are not limited thereto.
  • a cyclic imino acid such as proline
  • R and R or R When the amino acid is glycine, R and R are used.
  • R—R and R are each independently hydrogen (protected !, if
  • the oxycarbol group is bonded as a linker. This is because the interposition of the oxycarbol group facilitates the connection with the amino group.
  • R is an aminooxy group, an N alkylaminooxy group, a hydrazide group, an azide group,
  • It may be a thiosemicarbazide group, a cysteine residue or the like.
  • pdNpN refers to a compound in which a 5-phospho-2-deoxyribonucleotide is bonded to a ribonucleotide, and is useful as a substrate for producing tRNA by bonding an arbitrary amino acid to the 3-position.
  • Representative pdNpNs include, but are not limited to, pdCpA (5'phospho-2'deoxyribocytidylylriboadenosine).
  • Deoxyribonucleotidyl in pdNpN is j8-D thymidine, 2'-deoxy j8-D-cytidine, 2'-deoxy j8-D adenosine, 2, -deoxy j8-D guanosine, 2, -deoxy j8-D-peracyl And 2'-deoxy-j8-D inosine.
  • the ribonucleotidyl in pdNpN can be ⁇ -D-cytidine, j8-D adenosine, ⁇ -D-guanosine, ⁇ -D-peracyl and ⁇ -D inosine.
  • pdCpA is represented by the following equation. [0067] [Formula 22]
  • modified tRNA refers to a transcribed RNA (tRNA) containing an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain.
  • tRNA transcribed RNA
  • one or more molecular species exist for each of 20 kinds of amino acids in a cell.
  • tRNA is a relatively small RNA having a sedimentation coefficient of 4S, a molecular weight of 20,000 to 30,000, and a nucleotide number of about 70 to 90, and is known to contain many modified bases (eg, methylidaninucleoside).
  • the nucleotide sequence (primary structure) of tRNA is a sequence that can take a cloverleaf model as a secondary structure even if the force differs depending on the molecular species, and it can be folded to take an L-shaped tertiary structure. It is known that a nucleotide sequence complementary to a codon (naturally a three-base sequence, and a modified tRNA provided in the present invention other than three bases (for example, Or more bases, typically 4 bases) to form an anticodon loop. 3. It is known that aminoacyl-tRNA has specific amino acids bonded to its ends and forms complementary base pairs with mRNA codons on ribosomes, and successively associates codons with amino acids.
  • modified tRNAs include, for example, 5,1-GCGGAUUUAGCUCAGUUGG
  • ACAGAAUUCGCACCA also called tRNA; SEQ ID NO: 1; 5, GGC GA
  • tRNA U UUA GCU CAG UUG GGA GAG CGC CAG ACU NCCU AA U CUG GAG GUC CUG UGU UCG AUC CAC AGA AUU CGC AC (also referred to as tRNA (-CA); N is any base; SEQ ID NO: 2) Not limited to them.
  • the tRNA of the present invention can be prepared by substituting another 4-base sequence at the position of NCCU in SEQ ID NO: 2.
  • Examples of the 4-base sequence that can be used in the modified tRNA of the present invention include, but are not limited to, anticodons such as CUCU, CUCA, CCCU, CGGU, and CGGG.
  • the "first three bases” of four base codons are defined as 5, starting from the first nucleotide to the third nucleotide when aligned from the end. It is composed of codons.
  • the “last three bases” of a four-base codon (or more base codons) are: 5, when aligned from the end, from the first nucleotide to the third nucleotide when counted from 3.
  • “any three bases” of a four base codon (or more base codons) refers to codons composed of any three consecutive nucleotides when aligned from the 5 ′ end.
  • the codon correspondence table is shown in the following table. The table below shows the power of three base codons. Representative examples of four base codons incorporating previously reported unnatural amino acids are shown.
  • the term "anticodon” refers to a sequence complementary to a codon or a molecule having the sequence.
  • the anticodon for CGT is ACG, and A-T (or U), the interconversion of CG and inversion of 5 'and 3' can create complementary sequences.
  • corresponding codons and tRNAs are defined according to the correspondence table of genetic codons (including the codons of three base codons and the codons when four or more base codons are present). Refers to the relationship between codons and tRNAs that have a corresponding relationship.
  • the term "significantly large” refers to an amount large enough to significantly change the amount of protein synthesis obtained by the tRNA. Typically, significantly higher refers to those that are statistically higher, but is not so limited, and those skilled in the art can select such amounts using techniques well known in the art. Exemplary significantly higher amounts include, for example, 1.1 times, 1.2 times, 1.3 times, 1.4 times, 1.5 times, 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 10 times Times and 100 times, but not limited to them. As used herein, “significantly less! /,” Refers to the opposite concept to “significantly more,”.
  • the term "protein formed when a 4-base codon is read as a 3-base codon” refers to the transcription and translation of the modified nucleic acid molecule of the present invention assuming that all use 3-base codons. Produce protein when you do! , U. Since the 4-base codon is read as a 3-base codon, the amino acid sequence after the codon is different, and the stop codon is usually shifted, so that the length of the protein to be produced is changed.
  • modified nucleic acid molecule with respect to a functional protein includes a four-base codon or its complement, and encodes a functional protein when one amino acid corresponds to the four-base codon.
  • the four-base codon usually corresponds to an amino acid bound to the modified tRNA corresponding to the four-base codon, and in the present invention, typically, an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain corresponds to the amino acid. I do.
  • the modified tRNA can be obtained by a method known in the art and Hohsaka T. et al., (1996) Am. Chem. Soc.
  • tRNA can be prepared by reverse-transcription of a template DNA encoding a DNA modified to have the following sequence to synthesize RNA.
  • a template DNA encoding tRNA (which may be natural or already modified) is chemically synthesized under the control of the T7 promoter, and another tRNA (-CA ) Template is made by site-directed mutagenesis.
  • the aminoacyl dinucleotide chemically synthesized is ligated to the T7-transcribed template tRNA using T4 RNA ligase, whereby an aminoacyl tRNA (—CA) can be produced.
  • aminoacyl-tRNA synthetase refers to an enzyme that activates a specific amino acid to correctly bind to a corresponding tRNA.
  • One amino acid and its corresponding multiple tRNAs usually have the ability to have one specific enzyme.In some cases, two or more specific enzymes exist. Enzymes can also be used in the present invention.
  • Aminoacyl-tRNA synthetases usually involve two-step reactions: (1) an amino acid-activating reaction that converts amino acids in the presence of ATP; and (2) converting the activated amino acid to the 3′-terminal adenosine of the corresponding tRNA.
  • the aminoacyl-tRNA synthetase can be used not only for a conventional ligation reaction between a tRNA and an amino acid, but also for a ligation reaction between the modified tRNA of the present invention and a protected pdNpN amino acid.
  • Ligation of the modified tRNA with the protected pdNpN amino acid can be performed using a ligase such as T7 ligase.
  • the amino acids may be provided as aminoacyl dinucleotides.
  • transcription is used in the same meaning as commonly used in the art, and refers to a reaction in which the nucleotide sequence of gene DNA is copied as complementary RNA.
  • This reaction is usually performed in vivo (intracellularly) as long as the necessary materials are present. It can also be performed in the vesicle system.
  • a cell-free system may include DNA-dependent RNA polymerases known in the art and their co-factors and Zs or regulators, as well as the necessary nucleotides.
  • reverse reaction of transcription DNA synthesis reaction in which RNA is ⁇
  • reverse transcription reverse transcription
  • translation refers to the process of reading a base sequence on mRNA, selecting an amino acid corresponding to the information, and forming a peptide chain during protein biosynthesis or artificial synthesis.
  • Translation is also usually performed in vivo (intracellular), but can also be performed in a cell-free system as long as the necessary materials are present.
  • Such cell-free systems are referred to herein as "protein synthesis systems.”
  • mRNA When performed in vivo, mRNA binds to ribosomes, and amino acids are sequentially linked by aminoacyl-tRNAs having structures corresponding to codons (triple bases) on the mRNA.
  • Cell-free systems include ribosome systems that have also removed cellular power and other necessary amino acids, and these systems can be performed in vitro.
  • Protein synthesis typically includes the following four-step reaction steps.
  • Amino acid activity Each amino acid is acylated and activated in the presence of ATP on an aminoacyl-tRNA synthetase specific to that amino acid. Ester bond to the 3 'terminal adenosine to form an aminoacyl-tRNA. This step binds the tRNA carrying the amino acid and the anticodon for that amino acid. In other words, it is important to maintain the accuracy of protein biosynthesis in that genetic information is directly linked to amino acids. In the present invention, a modified tRNA can be used at this stage.
  • Initiation of synthesis In protein biosynthesis, the initiation codon (AUG) force is usually also started.
  • Initiation codons are recognized by formyl methion tRNA (f Met-tRNA) in prokaryotes and by methionyl tRNA in eukaryotes.
  • f Met-tRNA formyl methion tRNA
  • GTP protein chain initiation factor
  • the mRNA is fixed at the correct position on the ribosome, and an initiation complex is formed in which the fMet tRNA is bound to the initiation codon on the mRNA.
  • Elongation of protein chain on mRNA Binds on the complex with the help of the aminoacyl-tRNA force elongation factor ⁇ GTP ⁇ Mg 2+ defined by the next codon and forms a base pair with the next codon.
  • f Met transfers to the amino group of the next amino acid to form a peptide bond.
  • This reaction is catalyzed by rRNA (23S rRNA in prokaryotic cells) in the ribosomal subunit.
  • the ribosome then moves in the 5 ' ⁇ 3' direction on the mRNA by one codon.
  • the peptide chain is sequentially extended in the C-terminal direction according to the genetic codon indicated by the mRNA.
  • Termination of synthesis When a stop codon comes in the position where the next aminoacyl tRNA enters, a protein chain terminator binds instead of tRNA, and separates the nascent protein chain from tRNA and releases it from the ribosome. .
  • the ribosome is reused for the next protein biosynthesis.
  • the released nascent protein chain is folded and undergoes processing and some post-translational modification, resulting in the production of a protein with a final biologically active conformation.
  • the protein synthesis system may preferably contain factors necessary for transcription. In such a case, it is also called a cell-free expression system.
  • FIG. Fig. 2 shows the overall picture of protein synthesis using the modified tRNA.
  • a four-base codon is the force or longer terminating translation as a fragment when read at the three-base codon, usually because the stop codon moves to another location. Because it is translated as a protein, it can be distinguished from a product translated with four base codons, and can coexist with three base codons, greatly disrupting the 20 amino acid system of three base codons in nature It can be introduced without anything.
  • isolation of a substance refers to another substance in a cell of an organism in which the biological factor naturally exists.
  • a substance eg, a biological factor such as a cell, nucleic acid, or protein
  • a factor other than the sugar chain or the sugar chain-containing substance or a sugar chain or a sugar chain-containing substance other than the target sugar chain or the sugar chain-containing substance
  • it is a nucleic acid, a nucleic acid containing a factor other than the nucleic acid and a nucleic acid sequence other than the target nucleic acid
  • a protein a protein containing a factor other than the protein and an amino acid sequence other than the target protein, etc.
  • the “isolated” sugar chain or sugar chain-containing substance is purified by the purification method of the present invention. Includes manufactured sugar chains or sugar chain-containing substances. Therefore, the isolated sugar chain or sugar chain-containing substance includes a chemically synthesized sugar chain or sugar chain-containing substance.
  • purification of a substance refers to removing at least a part of a factor naturally associated with the substance. Say. Thus, purification and separation partially overlap in their form. Therefore, the purity of a substance in a purified substance (eg, a biological factor such as a sugar chain or a sugar chain-containing substance) is usually higher than that in a state where the substance is usually present (ie, the substance is concentrated). Non-enriched state is also included in the concept of "purified" as long as naturally associated factors are reduced.
  • concentration of a substance is higher than the content of the substance in a sample before concentration.
  • concentration also partially overlaps the concept of purification and separation. Therefore, a concentrated substance (for example, a biological factor such as a sugar chain or a sugar chain-containing substance) usually has a reduced impurity content in a state where the substance is usually present, but has a different purpose. As long as the content of the substance is increased, certain impurities may increase! / "Purified", and the state is also included in the concept of "concentration”.
  • a transformant derived from a microorganism, animal cell, or the like having a recombinant vector incorporating a DNA encoding the protein of the present invention has a functional group capable of binding to the modified tRNA and Z or sugar chain of the present invention.
  • Producing the protein or glycoprotein of the present invention by cultivating the protein of the present invention using amino acids, culturing the protein of the present invention, accumulating the protein of the present invention and collecting the protein of the present invention from the culture of the present invention Can be done.
  • the method for culturing the transformant of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • a culture medium for culturing a transformant obtained by using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be used by the organism of the present invention.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • glucose As the carbon source, glucose, flatatose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, acetic acid, propionic acid, etc. may be used as long as the microorganisms can assimilate. Alcohols such as organic acids, ethanol and propanol can be used.
  • Examples of the nitrogen source include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other inorganic or organic acid ammonium salts, and others. Nitrogen-containing substances, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof can be used.
  • potassium monophosphate potassium monophosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, and the like can be used. It can. Cultivation is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culturing temperature is 15 to 40 ° C, and the culturing time is usually 5 hours to 7 days.
  • the pH is maintained at 3.0-9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like. If necessary, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • an inducer may be added to the medium.
  • an inducible promoter for example, isopropyl ⁇ D thiogalatatopyranoside is used, and when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the trp promoter, indole acryl is used.
  • An acid or the like may be added to the medium.
  • the cells or organs of the plant into which the gene has been introduced can be cultured in large quantities using a jar armmenter.
  • a culture medium As a culture medium, a commonly used Murashige & Stag (MS) medium, a white (White) medium, or a culture medium supplemented with plant hormones such as auxin, cytokinin, etc. in these mediums may be used. it can.
  • MS Murashige & Stag
  • White white
  • plant hormones such as auxin, cytokinin, etc. in these mediums
  • the medium for culturing the cells of the present invention may be a commonly used RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association]. ation, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proceedings of the Society for the Biological Medicine] , 73, 1 (1950)], or a medium obtained by adding fetal serum or the like to such a medium.
  • Culture is usually performed for 17 days under conditions such as pH 6-8, 25-40 ° C, and the presence of 5% C02. If necessary, antibiotics such as kanamycin, penicillin, and streptomycin may be added to the medium during the culturing.
  • antibiotics such as kanamycin, penicillin, and streptomycin may be added to the medium during the culturing.
  • isolation or purification of a conventional enzyme commonly used in the art can be used.
  • Method can be used.
  • the culture is treated by a method such as centrifugation to obtain a soluble fraction.
  • a purified sample can be obtained by using a method such as a chromatographic method, a gel filtration method using a molecular sieve, an affinity chromatography method, a chromatofocusing method, or an electrophoresis method such as isoelectric focusing.
  • the cells in the culture are collected by centrifuging the culture to obtain the cells. After washing, the cells are crushed by an ultrasonic crusher, a French press, a Manton-Gaurin homogenizer, a Dynomill or the like to obtain a cell-free extract.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention is expressed by forming an insoluble substance in the cells, the cells are similarly collected, crushed, and centrifuged to obtain a precipitate fraction obtained by a conventional method. After recovering the protein of the invention, the insoluble form of the protein is soluble with a protein denaturant. This soluble solution is diluted or dialyzed into a solution that does not contain a protein denaturant or is diluted to such an extent that the protein denaturant does not denature the protein, thereby allowing the protein of the present invention to have a normal three-dimensional structure. After that, a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the protein can be purified according to a general protein purification method II. Evan. Sadler et al .: Methods in Enzymolgy, 83, 458].
  • the protein of the present invention can be produced as a fusion protein with another protein and purified using affinity chromatography using a substance having an affinity for the fused protein [Akio Yamakawa, Experimental Medicine, 13, 469—474 (1995)].
  • affinity chromatography using a substance having an affinity for the fused protein.
  • the protein of the present invention can be produced as a fusion protein with protein A and purified by affinity chromatography using immunoglobulin G.
  • the protein of the present invention can be produced as a fusion protein with a FLAG peptide and purified by affinity chromatography using an anti-FLAG antibody [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86]. , 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)].
  • the protein can be purified by affinity chromatography using an antibody against the protein itself of the present invention.
  • the protein of the present invention can be transcribed in vitro according to the known method Q [Biomolecula NMR, 6, 129-134, Science, 242, 1162-1164, Biochem., 110, 166-168 (1991)]. Can be produced using a translation system.
  • a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbol method) or the tBoc method (t-butyloxycarbol method) is used.
  • a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbol method) or the tBoc method (t-butyloxycarbol method) is used.
  • Chemical synthesis can also be carried out using a peptide synthesizer such as Advanced ChemTech, Applied Biosystems, Pharmacia Biotech, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimadzu Corporation.
  • the structural analysis of the purified protein of the present invention is carried out by a method usually used in protein tradition, for example, a protein structural analysis for gene closing (Hisashi Hirano, published by Tokyo Chemical Dojin, 1993). It can be implemented by a method.
  • deletion, substitution or addition of amino acids in the protein of the present invention can be carried out by a site-directed mutagenesis method which is a well-known technique prior to filing. Deletion, substitution or addition of one or several powerful amino acids is described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Eco Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press “989), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley. & S ons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Nat 1.Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic A cids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1 985), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 5662 (1984), Science, 224, 143. 1 (1984), PCT WO85 / 00817 (1985), Nature, 316, 601 (1985), and the like.
  • alkyl refers to a monovalent group generated by the loss of one hydrogen atom in an aliphatic hydrocarbon (alkane) such as methane, ethane, and propane.
  • n 2n + l is represented by one (where n is a positive integer).
  • Alkyl can be straight or branched.
  • substituted alkyl refers to an alkyl in which H of the alkyl is substituted by a substituent defined below.
  • C1-C2 alkyl C1-C3 alkyl, C1-C4 alkyl, C1-C5 alkyl, C1-C6 alkyl, C1 C1 alkyl, CI C8 alkyl, C1 C9 alkyl, C1 C10 alkyl, C1 C11 alkyl or C1 C12 alkyl, C1 C2 substituted alkyl, C1 C3 substituted alkyl, C1 C4 substituted Substituted alkyl, C1-C5 substituted alkyl, C1-C6 substituted alkyl, C1-C7 substituted alkyl, C1-C8 substituted alkyl, C1-C9 substituted alkyl, C1-C10 substituted Alkyl, C1-C11 substituted alkyl or C1-C12 substituted alkyl.
  • C 1 -C 10 alkyl means a linear or branched alkyl having 1-10 carbon atoms, such as methyl (CH—), ethyl (CH-1), n-propyl (CH 2 CH 2). CH-1), isop
  • C1-C10-substituted alkyl means C1
  • One C10 alkyl in which one or more hydrogen atoms are substituted with a substituent is substituted with a substituent.
  • alkyl which may be substituted means that "alkyl” or “substituted alkyl” as defined above may be different from that described above.
  • alkylene refers to a divalent group formed by the loss of two hydrogen atoms in aliphatic hydrocarbon (alkane) power such as methylene, ethylene, and propylene. Where n is a positive integer. Alkylene is straight chain or branched n 2n
  • substituted alkylene refers to an alkylene in which H of the alkylene is substituted by a substituent defined below. Examples of these are C1-C2 alkylene, C1-C3 alkylene, C1-C4 alkylene, C1-C5 alkylene, C1-C6 alkylene, C1-C7 alkylene, C1-C8 alkylene, C1-C9 alkylene, C1-C10 alkylene Alkylene, C1-C11 alkylene or C1-C12 alkylene, C1-C2-substituted alkylene, C1-C3-substituted alkylene, C1-C4-substituted alkylene, C1-C5-substituted alkylene, C1-C6-substituted Alkylene, C1-C7 substitution Alkylene substituted, C1-C8 substituted alkylene, C1-
  • C1-C10-substituted alkylene refers to C1-C10 alkylene in which one or more hydrogen atoms are substituted with a substituent.
  • alkylene includes one or more atoms that are also selected from oxygen and sulfur nuclear! / ⁇ .
  • optionally substituted alkylene means that it may be a shift of "alkylene” or "substituted alkylene” defined above.
  • cycloalkyl refers to alkyl having a cyclic structure. “Substituted cycloalkyl” refers to cycloalkyl in which H of cycloalkyl is replaced by a substituent defined below.
  • C3-C4 cycloalkyl C3-C5 cycloalkyl, C3-C6 cycloalkyl, C3-C7 cycloalkyl, C3-C8 cycloalkyl, C3-C9 cycloalkyl, C3-C10 cycloalkyl, C3-C11 Cycloalkyl, C3-C12 cycloalkyl, C3-C4-substituted cycloalkyl, C3-C5-substituted cycloalkyl, C3-C6-substituted cycloalkyl, C3-C7-substituted cycloalkyl, C3-C8-substituted Cycloalkyl substituted, C3-C9 substituted cycloalkyl, C3-C10 substituted cycloalkyl, C3-C11 substituted cycloalkyl or C3-C12 substituted cycloalky
  • the "optionally substituted cycloalkyl” refers to the "cycloalkyl” as defined above. This means that the difference between the “alkyl” and the “substituted cycloalkyl” may be different.
  • alkenyl refers to a monovalent group generated by the loss of one hydrogen atom from an aliphatic hydrocarbon having one double bond in the molecule, and is generally CH table
  • substituted alkenyl refers to an alkenyl in which H of the alkenyl is substituted by a substituent defined below.
  • substituents include C2—C3 anoreckeninole, C2—C4 anoreckeninole, C2—C5 anoreckeninole, C2—C6 alkane, C2—C7 alkenyl, C2—C8 alkenyl, C2—C9 alkane, C2—C10, C2—C11 or C2—C12, C2—C3 substituted, C2—C4 substituted, C2—C5 substituted -C2-C6 substituted alkyl, C2-C7 substituted alkyl, C2-C8 substituted alkyl, C2-C9 substituted alkyl, C2-C10 substituted alkyl Or a C2-C11 substituted alkyl or a C2-C12 substitute
  • a C2-C10 substituted alkylene refers to a C2-C10 alkylene in which one or more hydrogen atoms are substituted with a substituent.
  • the "optionally substituted alcohol” may be a deviation from the above defined “alkyl” or “substituted alkyl”. means.
  • alkenylene refers to a divalent group generated by losing two hydrogen atoms from an aliphatic hydrocarbon having one double bond in a molecule, generally,- CH-table
  • substituted alkelenes refers to alkelenes in which H of the alkenylene is substituted by the substituents defined below.
  • specific examples include C2-C25 alkene-ren or C2-C25 substituted alkene-len, particularly C2-C3 alkene-len, C2-C4 alkene-len, C2-C5 alkene-len, C2 C6 alkenylene, C2-C7 alkenylene, C2-C8 alkenylene, C2-C9 alkalene, C2-C10 alkalene, C2-C11 alkalene or C2-C12 alkenylene C-substituted alkene, C2-C4 substituted alkene, C2-C5-substituted alkene, C2-C6-substituted alkene, C2-C7 substituted Substituted alkene, C2-C8 substituted alken
  • C2-C10 alkyl means a straight-chain or branched alkylene having 2 to 10 carbon atoms
  • C10-substituted alkelenes are C2-C10 alkelenes in which one or more hydrogen atoms have been replaced by substituents.
  • alkylene may contain one or more selected oxygen and sulfur atoms.
  • alkenylene may deviate from “alkylene” or “substituted alkenylene” as defined above.
  • cycloalkyl refers to an alkyl having a cyclic structure.
  • substituted cycloalkyl refers to a cycloalkyl in which H of the cycloalkyl is substituted by a substituent defined below.
  • C3-C4 cycloalkyl C3-C5 cycloalkyl, C3-C6 cycloalkyl, C3-C7 cycloalkyl, C3-C8 cycloalkyl, C3-C9 cycloalkyl, C3-C10 Cycloalkyl, C3-C11 cycloalkyl, C3-C12 cycloalkyl, C3-C4-substituted cycloalkyl, C3-C5-substituted cycloalkyl, C3-C6-substituted cycloalkyl C3-C7 substituted cycloalkyl, C3-C8 substituted cycloalkyl, C3-C9 substituted cycloalkyl, C3-C10 substituted cycloalkyl, C3-C11 substituted cycloalkyl Or a C3-C12 substituted cycloalkenyl.
  • the "optionally substituted cycloalkyl” may be a deviation from the above-defined “cycloalkyl” or “substituted cycloalkyl”.
  • the term “alkynyl” refers to a monovalent group such as acetylene generated by the loss of one hydrogen atom from an aliphatic hydrocarbon having one triple bond in the molecule. Generally represented by CH (where n is a positive integer greater than or equal to 2). “Substituted alk n 2n— 3
  • -yl refers to an alkyl in which H of the alkyl is substituted by a substituent defined below. Specific examples include C2-C3 alkyl, C2-C4 alkyl, C2-C5 alkynyl, C2-C6 alkyl, C2-C7 alkyl, C2-C8 alkyl, C2-C9a Alkyl, C2-C10 alkyl, C2-C11 alkyl, C2-C12 alkyl, C2-C3-substituted alkyl, C2-C4-substituted alkyl, C2-C5-substituted Alkyl, C2-C6-substituted alkyl, C2-C7-substituted alkyl, C2-C8-substituted alkyl, C2-C9-substituted alkyl, C2-C10-substituted Alkyl, C2-C1-substituted alkyl or C2-C12-substituted
  • C2-C10 alkyl means, for example, a linear or branched alkyl containing 2-10 carbon atoms, such as ethynyl (CH ⁇ C—), 1-propyl (CH C ⁇ C—). Also, for example, C2-C10-substituted alkyl-
  • alkoxy refers to a monovalent group generated by losing a hydrogen atom of a hydroxy group of an alcohol, and is generally represented by CHO- (where n is an integer of 1 or more).
  • the “substituted alkoxy” refers to an alkoxy in which H of the alkoxy is substituted by a substituent defined below. Specific examples include C1-C2 alkoxy, C1-C3 alkoxy, C1-C4 alkoxy, C1-C5 alkoxy, C1-C6 alkoxy, C1-C7 alkoxy, C1-C8 alkoxy, C1-C9 alkoxy, C1-C10 alkoxy C1-C11 alkoxy, C1-C12 alkoxy, C1-C2-substituted alkoxy, C1-C3-substituted alkoxy, C1-C4-substituted alkoxy, C1-C5-substituted alkoxy, C1-C6-substituted Alkoxy, C1-C7 substituted alkoxy, C1-C8 substituted alkoxy, C1-C9 substituted alkoxy, C1-C10 substituted alk
  • optionally substituted alkoxy means that the "alkoxy" or “substituted alkoxy” defined above may be shifted.
  • heterocycle (group) refers to a group having a cyclic structure including carbon and hetero atoms.
  • the hetero atom is selected from the group consisting of 0, S, and N forces, and may be the same or different, may contain one, or may contain two or more.
  • Heterocyclic groups can be aromatic or non-aromatic, and can be monocyclic or polycyclic. Heterocyclic groups may be substituted.
  • the "optionally substituted heterocycle (group)” refers to the “heterocycle (group)” or the “substituted heterocycle (group)” defined above. , It may be misaligned, which means
  • alcohol refers to an organic compound in which one or more hydrogen atoms of an aliphatic hydrocarbon are substituted with a hydroxyl group.
  • ROH is also referred to as ROH.
  • R is an alkyl group.
  • R can be C1-C6 alkyl.
  • examples of the alcohol include, but are not limited to, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol and the like.
  • Carbocyclic group refers to a group containing a cyclic structure containing only carbon, and includes the above-mentioned “cycloalkyl”, “substituted cycloalkyl”, “cycloalkyl” And “substituted cycloalkyl”.
  • Carbocyclic groups can be aromatic or non-aromatic, and can be monocyclic or polycyclic.
  • substituted carbocyclic group refers to a carbocyclic group in which H of the carbocyclic group is substituted by a substituent defined below.
  • C3-C4 carbocycle C3-C5 carbocycle, C3-C6 carbocycle, C3-C7 carbocycle, C3-C8 carbocycle, C3-C9 carbocycle, C3-C10 Carbocyclic group, C3-C11 carbocyclic group, C3-C12 carbocyclic group, C3-C4-substituted carbocyclic group, C3-C5-substituted carbocyclic group, C3-C6-substituted carbocyclic group, C3- C7-substituted carbocyclic group, C3-C8 substituted Carbocyclic group, C3-C9-substituted carbocyclic group, C3-C10-substituted carbocyclic group, C3-C11-substituted carbocyclic group or C3-C12-substituted carbocyclic group.
  • the carbocyclic group can also be a C4-C7 carbocyclic group or a C4-C7 substituted carbocyclic group.
  • Examples of the carbon ring group include one in which one phenyl group hydrogen atom is deleted.
  • the hydrogen deletion position may be any position that is chemically possible, whether on an aromatic ring or on a non-aromatic ring.
  • substituted or carbocyclic group refers to a deviation from the above-defined “carbocyclic group” or “substituted carbocyclic group”. It also means.
  • heterocyclic group refers to a group having a cyclic structure including carbon and hetero atoms.
  • the hetero atom is selected from the group consisting of 0, S and N forces, and may be the same or different, and may include one or two or more.
  • Heterocyclic groups can be aromatic or non-aromatic, and can be monocyclic or polycyclic.
  • “Substituted heterocyclic group” refers to a heterocyclic group in which H of the heterocyclic group is substituted by a substituent defined below.
  • C3-C4 carbocycle C3-C5 carbocycle, C3-C6 carbocycle, C3-C7 carbocycle, C3-C8 carbocycle, C3-C9 carbocycle, C3-C10 Carbocyclic group, C3-C11 carbocyclic group, C3-C12 carbocyclic group, C3-C4 substituted carbocyclic group, C3-C5 substituted carbocyclic group, C3-C6 substituted carbocyclic group, C3 I C7-substituted carbocyclic group, C3-C8-substituted carbocyclic group, C3-C9-substituted carbon ring group, C3-C10-substituted carbocyclic group, C3-C11-substituted carbocyclic group or It may be a C3-C12 substituted carbocyclic group in which one or more carbon atoms have been substituted with a heteroatom.
  • a heterocyclic group can also be a C4-C7 carbocyclic group or a C4-C7 substituted carbocyclic group in which one or more carbon atoms have been replaced with one or more heteroatoms.
  • the heterocyclic group include a phenyl group, a pyrrolyl group, a furyl group, an imidazolyl group, and a pyridyl group.
  • the position of deletion of hydrogen may be any position that is chemically possible, and may be on an aromatic ring or on a non-aromatic ring.
  • a carbocyclic group or a heterocyclic group may be substituted with a divalent substituent in addition to being substituted with a monovalent substituent as defined below.
  • halogen refers to a monovalent group of elements such as fluorine (F), chlorine (C1), bromine (Br), and iodine (I) belonging to Group 7B of the periodic table.
  • hydroxy refers to a group represented by OH.
  • substituted hydroxy refers to a compound in which H of hydroxy is substituted by a substituent defined below.
  • thiol is a group in which an oxygen atom of a hydroxy group is substituted with a sulfur atom (mercapto group), and is represented by SH.
  • substituted thiol refers to a group in which H of mercapto is substituted with a substituent defined below.
  • cyano refers to a group represented by -CN.
  • Niro means -NO
  • Carboxy refers to a group represented by COOH.
  • substituted carbonyl refers to carboxy in which H is substituted with a substituent as defined below.
  • Substituted thiocarboxy refers to thiocarboxy in which H is replaced with a substituent as defined below.
  • acyl refers to a monovalent group formed by removing OH from a carboxylic acid.
  • Representative examples of the acetyl group include acetyl (CH CO—) and benzoyl (CHCO—).
  • substituted acyl refers to the hydrogen of an acyl substituted with a substituent as defined below.
  • amide is a group in which hydrogen of ammonia is substituted with an acid group (acyl group), and is preferably represented by CONH.
  • Substituted amide refers to an amide substituted
  • Substituted carboyl means a carboyl group substituted with a substituent selected below.
  • Thiocarbol contains thioketone And thioaldehyde.
  • Substituted thiocarbol means thiocarbonyl substituted with a substituent selected below.
  • sulfol is a generic term for a substance containing a characteristic group, -SO-
  • Substituted sulfonyl means sulfonyl substituted with a substituent selected as described below.
  • sulfiel is a generic term for a substance containing -SO- which is a characteristic group. “Substituted sulfiel” means sulfiel substituted with a substituent selected below.
  • aryl refers to a group formed by removing one hydrogen atom bonded to a ring of an aromatic hydrocarbon, and is included in the present specification as a carbocyclic group.
  • substitution refers to replacing one or more hydrogen atoms in a certain organic compound or substituent with another atom or atomic group. It is also possible to remove one hydrogen atom and substitute with a monovalent substituent, and it is also possible to remove two hydrogen atoms and substitute with a divalent substituent.
  • substitution refers to replacing one or more hydrogen atoms in a certain organic compound or substituent with another atom or atomic group. It is also possible to remove one hydrogen atom and substitute with a monovalent substituent, and it is also possible to remove two hydrogen atoms and substitute with a divalent substituent.
  • substituents in the present invention include alkyl, cycloalkyl, alkaryl, cycloalkyl, alkyl, alkoxy, carbocyclic group, heterocyclic group, halogen, hydroxy, thiol, nitro nitro, Include, but are not limited to, aminocarboxy, carbamoyl, acyl, isylamino, thiocarboxy, amide, substituted carboyl, substituted thiocarbol, substituted sulfol or substituted sulfiel. ,.
  • substituents can be appropriately used in the present invention when designing an amino acid.
  • each when there are a plurality of substituents, each may be independently a hydrogen atom or an alkyl, but not all of the plurality of substituents are hydrogen atoms. More preferably, independently, when multiple substituents are present, each is independently hydrogen and C1-C6 Lucirca can also be selected from the group.
  • the substituents may all have substituents other than hydrogen, but preferably have at least one hydrogen, more preferably 2-n (where n is the number of substituents) hydrogen. I can do it. It may be preferable that the number of hydrogens among the substituents is large. A large substituent or a polar substituent is also a force that may hinder the effect of the present invention (particularly, interaction with an aldehyde group).
  • the substituent other than hydrogen may preferably be C1-C6 alkyl, C1-C5 alkyl, C1-C4 alkyl, C1-C3 alkyl, C1-C2 alkyl, methyl, and the like.
  • Cl, C2, ..., Cn represent the number of carbon atoms. Accordingly, C1 is used to represent a substituent having one carbon atom.
  • optical isomer refers to one or a pair of a pair of non-superimposable compounds which have a crystal or molecular structure in a mirror image relationship. It is a form of stereoisomer that differs only in optical rotation, despite other properties being the same.
  • the term "protection reaction” refers to a reaction in which a protecting group such as Boc is added to a functional group for which protection is desired. By protecting the functional group with the protecting group, the reaction of the functional group having higher reactivity can be suppressed, and only the functional group having lower reactivity can be reacted.
  • the protection reaction can be performed, for example, by a dehydration reaction.
  • the term "deprotection reaction” refers to a reaction for eliminating a protecting group such as Boc.
  • Examples of the deprotection reaction include a reaction such as a reduction reaction using PdZC.
  • the deprotection reaction can be performed, for example, by hydrolysis.
  • protecting group includes, for example, a fluorenylmethoxycarbol (Fmoc) group, an acetyl group, a benzyl group, a benzoyl group, a t-butoxycarbol group, Butyldimethyl group, silyl group, trimethylsilylethyl group, N-phthalimidyl group, trimethylsilylethyloxycarboxyl group, 2-tro-5,5-dimethoxybenzyl group, 2-toro-4,5- Dimethoxybenzyloxycarbol group, olebamate group and the like are mentioned as typical protecting groups.
  • Fmoc fluorenylmethoxycarbol
  • the protecting group can be used for protecting a reactive functional group such as an amino group and a carboxyl group.
  • Various protecting groups can be used depending on the reaction conditions and purpose. Hydroxy protecting groups include acetyl, benzyl and silyl
  • a protecting group for a functional amino group such as a group or a derivative thereof
  • a benzyl group, a t-butoxycarbonyl group or a derivative thereof can be used in addition to an acetyl group.
  • As the protecting group for the aminooxy group and the N-alkylaminooxy group a trimethylsilylethyloxycarbonyl group, a 2-nitro-4,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl group or a derivative thereof is preferable. .
  • a target product is obtained by removing contaminants (unreacted weight loss, by-products, solvent, etc.) from a reaction solution by a method commonly used in the art (for example, extraction, distillation, After removal by washing, concentration, precipitation, filtration, drying, etc.), isolation by a combination of post-treatment methods commonly used in the art (eg, adsorption, elution, distillation, precipitation, precipitation, chromatography, etc.). obtain.
  • a method commonly used in the art for example, extraction, distillation, After removal by washing, concentration, precipitation, filtration, drying, etc.
  • isolation by a combination of post-treatment methods commonly used in the art (eg, adsorption, elution, distillation, precipitation, precipitation, chromatography, etc.). obtain.
  • a glycoprotein having a sugar chain bonded thereto can be produced using the sugar chain and a protein containing an amino acid having a functional group capable of binding to the sugar chain of the present invention.
  • Production of a glycoprotein having a sugar chain attached thereto can be carried out by mixing the two materials in the presence of a suitable buffer and reacting at a suitable temperature for a suitable time. Such conditions can be selected based on the description in the present specification.
  • the produced protein After producing a protein containing an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain produced in the present invention by, for example, an expression system such as E. coli, the produced protein is subjected to an appropriate means (for example, it is purified by affinity purification chromatography) and freeze-dried if necessary.
  • an appropriate means For example, it is purified by affinity purification chromatography
  • the protein containing an amino acid having a functional group capable of binding to the produced sugar chain is combined with a desired sugar chain (for example, oligomannose such as ratatose and mannopentaose, Lewis b, and Sialyl Lewis X).
  • a desired sugar chain for example, oligomannose such as ratatose and mannopentaose, Lewis b, and Sialyl Lewis X.
  • a suitable buffer for example, an acetate buffer system, a phosphate buffer system, a Tris buffer system and the like can be used.
  • the concentration of the protein and the sugar chain containing an amino acid having a functional group capable of binding to the sugar chain used may be any concentration as long as the reaction proceeds.
  • a 1: 1 reaction is expected, it is desirable to react at approximately the same molar concentration. Not limited to that. Therefore, as the relative ratio used, for example, 1: 10—10: 1 can be used. It is understood that such a relative ratio depends on the relative relationship between a protein containing an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain and the sugar chain used, and such a relative relationship is determined by the present invention. Those skilled in the art can understand based on the description.
  • the absolute concentration of the sugar chain used can be, for example, ImM-2M, and preferably 10 mM-1M.
  • the concentration of the protein containing an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain to be used may also be, for example, ImM-2M, and preferably 10 mM-1M. Can be.
  • the addition reaction of a sugar chain proceeds in principle as long as contact occurs.
  • the reaction proceeds at 25 ° C to 80 ° C.
  • Appropriate upper limits of temperature include, but are not limited to, 80 ° C, 70 ° C, 60 ° C, 50 ° C, 42 ° C, 40 ° C, and the like.
  • the upper limit may be, for example, 37 ° C. for proteins that are easily denatured by heat.
  • Suitable lower limits for the temperature can be, for example, 25 ° C, 30 ° C, 32 ° C, 37 ° C, and the like.
  • An appropriate lower limit of the temperature can be appropriately determined by those skilled in the art in consideration of the required time, in relation to the reaction rate.
  • reaction time can also be appropriately determined by those skilled in the art with reference to the description in the present specification. Examples of such time include, but are not limited to, 6 hours and 15 days.
  • Examples of the lower limit of the reaction time include several hours (1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, etc.), 1 day, and several days (2 to 3 days).
  • Examples of the upper limit of the reaction time include, but are not limited to, several days (2 to 3 days), 5 days, 6 days, and 10 days. It is desirable to set the upper limit of the reaction time to such an extent that the produced glycoprotein is not decomposed or denatured.
  • the present invention relates to medicaments (for example, medicaments such as vaccines, health foods, medicaments whose residual protein or lipid has reduced antigenicity) and cosmetics.
  • the medicine and cosmetics may further include a pharmaceutically acceptable carrier and the like.
  • the pharmaceutically acceptable carrier contained in the medicament of the present invention includes any substance known in the art.
  • Suitable formulation materials or pharmaceutically acceptable carriers include antioxidants, preservatives, colorants, flavors, and diluents, emulsifiers, suspending agents, solvents, fillers, Such as, but not limited to, bulking agents, buffers, delivery vehicles, diluents, excipients and / or pharmaceutical adjuvants.
  • a medicament of the invention comprises a composition comprising an isolated pluripotent stem cell, or a variant or derivative thereof, together with one or more physiologically acceptable carriers, excipients or diluents. It is administered in the form of a product.
  • a suitable vehicle may be water for injection, physiological solution, or artificial cerebrospinal fluid, which may be supplemented with other materials common in compositions for parenteral delivery. .
  • an acceptable carrier, excipient, or stabilizer is non-toxic to recipients, and preferably is inert at the dosages and concentrations employed.
  • PEG polyethylene glycol
  • Exemplary suitable carriers include neutral buffered saline, or saline mixed with serum albumin.
  • the product is formulated as a lyophilizate using suitable excipients (eg, sucrose).
  • suitable excipients eg, sucrose
  • Other standard carriers, diluents and excipients may be included as desired.
  • Other exemplary compositions include Tris buffer at pH 7.0-8.5 or acetate buffer at pH 4.0-5.5, which further includes sorbitol or a suitable alternative thereof. obtain.
  • the medicament of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • the medicament of the present invention can be administered intravenously or subcutaneously.
  • the medicament used in the present invention may be in the form of a pyrogen-free, pharmaceutically acceptable aqueous solution.
  • the preparation of such pharmaceutically acceptable compositions can be readily performed by those skilled in the art by considering pH, isotonicity, stability, and the like.
  • the administration method includes oral administration, parenteral administration (for example, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, mucosal administration, rectal administration, vaginal administration, local administration to the affected area, Skin administration).
  • Formulations for such administration may be provided in any formulation.
  • Such preparations include, for example, solutions, injections, and sustained-release preparations.
  • the medicament of the present invention may contain a physiologically acceptable carrier, excipient or stabilizing agent (Japanese Pharmacopoeia 14th edition or its latest edition, Remington's Pharmaceutical sciences, 18th Edition, AR Gennaro, ed., MacK Publishing Company, 1990, etc.) and a glycan composition having a desired degree of purity, thereby preparing a lyophilized cake or aqueous solution. Can be saved.
  • a physiologically acceptable carrier Japanese Pharmacopoeia 14th edition or its latest edition, Remington's Pharmaceutical sciences, 18th Edition, AR Gennaro, ed., MacK Publishing Company, 1990, etc.
  • a glycan composition having a desired degree of purity
  • the amount of the sugar chain composition used in the treatment method of the present invention depends on the purpose of use, target disease (type, severity, etc.), age, weight, sex, medical history, cell morphology or type of the patient. A person skilled in the art can easily determine this in consideration of such factors.
  • the frequency of applying the treatment method of the present invention to the subject (or patient) also depends on the purpose of use, the target disease (type, severity, etc.), the patient's age, weight, sex, medical history, and course of treatment. Considering such factors as Can be specified.
  • the frequency includes, for example, administration once every few months (for example, once a week-once a month). It is preferable to administer once a week to one month while observing the course.
  • cosmetics can be prepared while observing the regulations specified by the authorities.
  • composition of the present invention can also be used as a component of a pesticide.
  • a pesticide composition When formulated as a pesticide composition, it may contain an agriculturally acceptable carrier, excipient or stabilizer, if necessary.
  • composition of the present invention When the composition of the present invention is used as an agricultural chemical, herbicides (such as virazolate), insecticides' acaricides (such as diazinon), fungicides (such as probenazole), and plant growth regulators (such as probenazole) E.g., noclobutrazole), nematicides (e.g., benomyl), synergists (e.g., pip-rubbutoxide), attractants (e.g., eugenol), repellents (e.g., Creosote, etc.), pigments (eg, Food Blue No. 1, etc.), fertilizers (eg, urea, etc.) can also be mixed if necessary.
  • herbicides such as virazolate
  • insecticides' acaricides such as diazinon
  • fungicides such as probenazole
  • plant growth regulators such as probenazole
  • probenazole E.g., noclobut
  • the present invention can also be used in the field of health food.
  • the above points of consideration when used as an oral medicine should be considered as necessary.
  • the sugar chain composition of the present invention can also be used as a low-allergen food.
  • the present invention provides (a) a step of providing a modified tRNA containing an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain and recognizing a 4-base codon; (b) the 4-base codon or its complement Providing a modified nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence comprising: a nucleic acid sequence encoding a protein portion of a glycoprotein of interest when one amino acid is associated with the four base codon; (C) transcribing the modified nucleic acid molecule to produce mRNA; and (d) exposing the mRNA to a protein synthesis system containing the modified tRNA and a set of tRNAs required for translation to produce a protein.
  • a glycoprotein is linked to a protein obtained by the method for producing a protein as a substrate for producing the glycoprotein of the present invention and a desired sugar chain.
  • a method for producing a glycoprotein eg, a biologically active glycoprotein.
  • a glycoprotein can be provided at a desired position in a form in which a desired sugar chain is introduced, or a substrate therefor can be provided. It is useful in that the desired glycoprotein can be obtained at a higher yield than before, and that glycoproteins (e.g., pharmaceuticals, agricultural chemicals, foods, etc.) can be designed with higher selectivity than before. Yes, with significant effects.
  • a modified tRNA containing an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain and recognizing a 4-base codon or more bases (for example, 5 bases) can be obtained from any amino acid.
  • Substituting any group (eg, hydrogen in the side chain) with a functional group capable of binding to a sugar chain to obtain an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain, and converting the functional group capable of binding to the sugar chain to The amino acid can be provided by binding the amino acid to tRNA.
  • Such a modified tRNA can be produced, for example, by introducing a mutation so as to replace a part of an anticodon that recognizes a three-base codon with an anticodon that recognizes a desired four-base codon or a five-base codon.
  • a mutation can be introduced using a site-directed mutagenesis method well known in the art.
  • a modified nucleic acid molecule containing a nucleic acid sequence containing a 4-base codon or its complement can be prepared using any method known in the art. That Examples of such a production method include, but are not limited to, generating DNA by PCR, automatic oligonucleotide synthesis, and the like.
  • the modified nucleic acid molecule of the present invention is constructed so as to include a nucleic acid sequence encoding a protein portion of a target glycoprotein when one amino acid is made to correspond to a four-base codon. It will be understood by those skilled in the art that any nucleic acid molecule containing any nucleic acid sequence can be designed and prepared arbitrarily.
  • the production of mRNA by transcription of the modified nucleic acid molecule can be carried out using any transcription method known in the art.
  • the production of such mRNA depends on the template DNA (eg, the modified nucleic acid molecule of the present invention) and the enzyme that catalyzes its transcription (eg, DNA-dependent RNA polymerase), the substrate RNA molecule, and Can be performed using other regulatory factors, cofactors, etc.
  • exposing mRNA to a protein synthesis system containing a modified tRNA and a set of tRNA necessary for translation to produce a protein can also be performed by any system known in the art (for example, Cell-free synthesis system or cell synthesis system). It is sufficient for the set of tRNAs required for translation to include at least one tRNA containing amino acids to be included in the target protein. Therefore, when the target protein also comprises 20 amino acids, it usually has at least one tRNA corresponding to the 20 amino acids. Preferably, it includes, but is not limited to, tRNAs corresponding to all 64 codons.
  • the desired glycoprotein can be produced by changing the nucleic acid sequence of the modified nucleic acid molecule of the present invention accordingly.
  • the target protein is composed of 19 or less amino acids, it may be sufficient to include tRNA corresponding to 19 or less amino acids.
  • a technique for producing a glycoprotein by binding a protein to a desired sugar chain may also be carried out using a chemical method or an enzymatic method known in the art.
  • a chemical method is realized by exposing a reaction mixture containing the protein produced by the method of the present invention and a desired sugar chain to conditions for binding to a functional sugar capable of binding to the sugar chain of the present invention.
  • enzymatic methods such as dehydration condensation This is achieved by exposing a reaction mixture containing a protein produced by the method of the present invention and a desired sugar chain to an enzyme that catalyzes the reaction under appropriate conditions.
  • the concentration of the protein containing an amino acid having a functional group capable of binding to the sugar chain and the concentration of the sugar chain used may be any concentration as long as the reaction proceeds. Is also good.
  • the relative ratio to be used for example, 1: 10-10: 1, 5: 1-1: 5, 2: 1-1: 2, etc. can be used. It is understood that such a relative ratio depends on the relative relationship between the protein containing an amino acid having a functional group capable of binding to the sugar chain and the sugar chain used, and such a relative relationship is described in the present specification.
  • any concentration can be used as the sugar chain concentration.
  • any concentration may be used as long as it is between ImM-2M, 10mM-1M, 50mM-500mM, and the like. Preferably it can be 50 mM-300 mM.
  • the concentration of a protein containing an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain used in the present invention can also include, for example, ImM-2M, and for example, Examples include, but are not limited to, 10 mM—1 M, 20 mM—500 mM, 50 mM—200 mM, and the like.
  • the binding reaction between the sugar chain and the protein can be performed at any temperature, since it is understood that the reaction proceeds in principle, as long as contact occurs, and preferably, for example, 25 ° C-80 ° C is used.
  • Suitable upper limits for the temperature include, but are not limited to, 80 ° C, 70 ° C, 60 ° C, 50 ° C, 42 ° C, 40 ° C, and the like.
  • Such a temperature may have an upper limit of, for example, 37 ° C. for a protein which is easily denatured depending on the kind of the protein.
  • Suitable lower limits for the temperature can be, for example, 25 ° C, 30 ° C, 32 ° C, 37 ° C, and the like.
  • the usable temperature range may be 25 ° C. to 60 ° C., 25 ° C. to 50 ° C., 30 ° C. to 42 ° C., but is not limited thereto.
  • the reaction time can also be appropriately determined by those skilled in the art with reference to the description in the present specification. Such time can be, for example, 6 hours to 5 days. It is not limited to.
  • the lower limit of the reaction time may be, for example, several hours (1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, etc.), 1 day, several days (2-3 days), etc.
  • the present invention is not limited thereto, and those skilled in the art can appropriately determine them based on the description in the present specification in consideration of the reaction rate, efficiency, and the like.
  • Examples of the upper limit of the reaction time include, but are not limited to, several days (2 to 3 days), 5 days, 6 days, and 10 days. It is desirable to set an upper limit for the reaction time to such an extent that the produced glycoprotein is not degraded or denatured.
  • the identity of the reacted product can be analyzed by mass spectrometry, NMR, or the like.
  • the functional group capable of binding to the sugar chain that can be used includes an aminooxy group, an N-alkylaminooxy group, a hydrazide group, an azide group, a thiosemicarbazide group and a cysteine residue. But not limited to them. More preferably, an aminooxy group, an N-alkylaminooxy group or the like can be used. Most preferably, it is an aminooxy group.
  • These functional groups may be protected by a protecting group
  • the amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain may be, but is not limited to, an amino acid derivative containing a functional group capable of binding to a sugar chain in a natural amino acid.
  • an amino acid derivative that is close to the natural amino acid form is more likely to retain the original biological activity, but amino acids other than the natural amino acid as long as they have the desired biological activity.
  • an amino acid derivative containing a functional group capable of binding to a sugar chain may be used.
  • Preferred amino acids include, but are not limited to, for example, tyrosine, homoserine, serine or derivatives thereof.
  • Examples of the 4-base codon used in the modified tRNA of the present invention include, but are not limited to, anticodons such as CUCU, CUCA, CCCU, CGGU, and CGGG. More preferably, CGGG is used.
  • the protein synthesis system used in the present invention does not have a tRNA corresponding to a codon that is also the first three bases of four (or more) base codons. This is because such a three-base codon competes with the four-base codon of the present invention. In such a case, replace the codon corresponding to the three-base codon to be removed with the desired protein in advance. It is preferable that the codon be removed from the nucleic acid sequence encoding the protein or changed to another codon (preferably, encoding the same amino acid).
  • the protein synthesis system used in the present invention does not have a tRNA corresponding to a codon consisting of the first 3 bases and the last 3 bases of the 4-base codon.
  • tRNA corresponding to any 3 bases codon in the codons of 5 bases or more is not provided.
  • the codon corresponding to the three base codons to be removed is previously removed from the nucleic acid sequence encoding the target protein or changed to another codon (preferably, the same amino acid is encoded). I prefer to keep it.
  • recognition of the four-base codon of the modified tRNA of the present invention is achieved by the modified tRNA having a complementary sequence of a four-base codon as an anticodon.
  • Techniques for including such a 4-base codon complementary sequence in tRNA are well known in the art, and may be performed at the corresponding DNA level using a site-directed mutagenesis method. Is done.
  • the protein synthesis system used in the present invention preferably contains the modified tRNA of the present invention in a significantly larger amount than the natural tRNA.
  • the modified tRNA may be included in significantly greater amounts as compared to the native tRNA having three competing base codons (eg, the first three consecutive codons).
  • the protein synthesis system converts the modified tRNA of the present invention into a natural tRNA or a specific competing tRNA at least 1.1 times, at least 1.2 times, at least 1.3 times, at least 1.4 times. At least 1.5 times, at least 2 times, at least 3 times, at least 4 times, at least 5 times, at least 10 times, at least 100 times, at least 1000 times May be included. A range of 1 to 100 times seems to be preferred, but not limited.
  • the protein synthesis system used in the present invention may contain significantly less tRNAs corresponding to codons consisting of the first three bases of the four base codons than other tRNAs.
  • the tRNA corresponding to the codon consisting of the first three bases of the four base codon is contained at a ratio of 11 to 0.01 times, more preferably 0.5 to 0.1 times the other tRNA.
  • the method of the present invention may further include the step of removing such proteins, as they would be expected to contaminate the proteins produced when read.
  • Such protein removal can be carried out by separating proteins based on differences in molecular weight or activities based on amino acid sequences that differ between two existing proteins, and removing unnecessary ones. Examples include, but are not limited to, molecular weight columns, affinity columns, electrophoresis, and the like.
  • a protein that is generated when a 4-base codon is read as a 3-base codon is designed to have a significantly different molecular weight from a protein that is generated when a base codon is read as a 4-base codon.
  • Such a design can be performed using techniques well known in the art, taking genetic codons into account.
  • amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain used in the present invention has the following formula:
  • Examples include compounds selected from the group that also possesses strength and protected forms thereof.
  • this amino acid typically binds to the modified tRNA of the present invention at the carboxyl group of the amino acid itself.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is provided as a linear or circular vector.
  • protein synthesis systems that perform translation in vitro include those that use linear nucleic acid molecules as templates and those that use circular DNA as templates. Linear ones are typically translated by directly using the mRNA. Those using circular DNA are provided as vectors containing nucleic acids encoding proteins. Such kits are commercially available from, for example, Promega, and any of them can be used herein.
  • mRNA as a template, for example, a T7 promoter is introduced into the promoter of RNA polymerase to inactivate transcription. Designed to do at Toro.
  • the modified nucleic acid molecules of the present invention may include a promoter sequence that functions in an in vitro system.
  • the promoter sequence may typically be a T7 promoter sequence.
  • the modified tRNA used in the present invention includes, for example, the sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 or variants thereof.
  • the variant of the modified tRNA may have any modification as long as it does not substantially include a modification in a site such as an anticodon or an aminoacylide, and has a function of the tRNA. Therefore, it is understood that the variant of the modified tRNA may contain one or more substitutions, additions, or deletions in the nucleic acid sequence.
  • transcription into mRNA and translation into protein may be performed simultaneously in the same step or separately. It is preferable to carry out in the same step. The number of processes decreases.
  • the present invention provides (i) a step of protecting a amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain to produce a protected amino acid; (ii) 5′-phospho-2′-deoxyribonucleotide. (Iii) dehydrating and condensing the protected amino acid and the pdNpN to produce a protected pdNpN amino acid; (iv) providing a modified tRNA recognizing a 4-base codon.
  • amino acid protection can be performed using any method known in the art.
  • Amino acid protection can be achieved by any or all of the carboxyl, amino, and Z or side chain reactive functional groups, or any combination or combination thereof.
  • an aminocarbyl group such as an acetyl group, a 2-nitro-4,5-dimethoxybenzyloxycarbol group, a benzyloxycarbol group or a t-butoxycarbol group is bonded to an amino group.
  • Groups can be used as protecting groups.
  • the carboxyl group can be protected as an alkyl carboxyl, benzyl carboyl, cyanomethyloxycarbonyl or a derivative thereof.
  • 5'phospho-2'-deoxyribonucleotidyl ribonucleotide can be produced by any method known in the art. Alternatively, you may use a commercial product.
  • the deoxyribonucleotidyl in pdNpN is 13-D thymidine, 2, -deoxy ⁇ D-cytidine, 2, -deoxy ⁇ -D adenosine, 2, -deoxy ⁇ -D guanosine, 2, -deoxy ⁇ -D-peracyl, and 2-deoxy. It can be jS-D-inosine.
  • the ribonucleotidyl in pdNpN can be ⁇ -D-cytidine, j8-D adenosine, ⁇ -D-guanosine, j8-D-peracinole, j8-D inosine and the like.
  • the pdNpN used in the present invention is 5'phospho-2'-deoxyribocytidylylriboadenosine (pdCpA). This is a force that is known to successfully advance synthesis in protein synthesis using extended codons using 4-base codons used in the present invention.
  • a technique for producing a protected pdNpN amino acid by dehydrating and condensing a protected amino acid with pdNpN can also be achieved by a technique well-known in the art.
  • a technique for example, there is a method in which a protected amino acid is mixed with pdN pN under appropriate conditions, and a catalyst is optionally mixed, thereby carrying out the method.
  • pdNpN can be dissolved in a less reactive solvent (eg, N, N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide, etc.). Acetonitrile can be used for the reaction.
  • a modified tRNA that recognizes a 4-base codon can be produced using a method well known in the art. For example, it can be prepared by substituting a sequence recognizing the four base codon (typically, the anticodon of the four base codon) into the anticodon portion of a known tRNA by site-directed mutagenesis.
  • the method of linking the modified tRNA and the protected pdNpN amino acid to provide a protected pdNpN amino acid-linked tRNA may be performed using any method well known in the art. Can be. In such a ligation method, for example, T4 RNA ligase can be used.
  • a technique for deprotecting a modified tRNA to which a protected pdNpN amino acid is linked to produce a tRNA to which a pdNpN amino acid is linked is also a technique for deprotecting the pdNpN amino acid, which is well known in the art. It can be carried out using.
  • amino acid material used examples include natural amino acids and unnatural amino acids. Any of them may be used, but it is preferable that the inserted glycoprotein does not impair the target activity (for example, biological activity). Thus, in one embodiment, it may be preferable to use natural amino acids. Examples of such amino acids include, but are not limited to, tyrosine, homoserine, and serine.
  • Examples of the protecting group used in the method of the present invention include an Fmoc group, an acetyl group, a benzyl group, a benzoyl group, a t-butoxycarbol group, a t-butyldimethyl group, an N-phthalimidyl group, a silyl group and a trimethylsilyl group.
  • the protection / deprotection reaction in the method of the present invention may be, but is not limited to, a combination of dehydration condensation and hydrolysis.
  • the present invention provides a modified tRNA containing an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain, which recognizes a 4-base codon.
  • a modified tRNA can be produced using the method of the present invention as described above, but is not limited thereto.
  • the modified tRNA is GCGGAUUUAGCUCAGUUGGGAGAGCGCCAG shown in Rooster column number 1.
  • the present invention provides: A) a modified tRNA that recognizes a 4-base codon and has an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain; B) a nucleic acid sequence containing the 4-base codon or a complement thereof.
  • a modified nucleic acid molecule comprising the modified nucleic acid molecule, wherein the nucleic acid sequence encodes a functional protein when one amino acid is associated with the four base codon;
  • a protein production kit including an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain, comprising a protein synthesis system including a translation enzyme for translating a required set of tRNA and mRNA.
  • the present invention provides: A) a modified tRNA that recognizes a 4-base codon and includes an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain; B) a modified tRNA that includes a nucleic acid sequence containing the 4-base codon or its complement A nucleic acid molecule, the nucleic acid sequence of which is a modified nucleic acid molecule which encodes a functional protein when one amino acid is associated with the 4-base codon; C) a transcriptase for transcription of the modified nucleic acid molecule, which is necessary for translation.
  • a protein synthesis system including a translation enzyme for translating a set of tRNAs and mRNAs; D) a sugar chain; and E) a linking means for linking the sugar chain with a functional group capable of binding to the sugar chain.
  • the present invention provides a glycoprotein production kit comprising: Here, a modified tRNA containing an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain that recognizes a 4-base codon; a modified nucleic acid molecule containing a nucleic acid sequence containing a 4-base codon or its complement, and the nucleic acid sequence is A modified nucleic acid molecule that encodes a functional protein when one amino acid is assigned to a base codon; a transcriptase for transcription of the modified nucleic acid molecule, a translation enzyme for translating a set of tRNA and mRNA required for translation Can take the form as described in other parts of the present specification (particularly, a method for producing a glycoprotein).
  • the sugar chain to be contained in the kit of the present invention is preferably a sugar chain to be contained in the glycoprotein, but a shorter sugar chain may be linked and then extended, or a longer sugar chain may be used. The sugar chains may be linked and then cut later.
  • the linking means to be included in the kit of the present invention for linking a functional group capable of binding to a sugar chain with the sugar chain may catalyze the link between the functional group and the sugar chain.
  • any means may be used.
  • an enzyme having hydrolysis activity is exemplified, but not limited thereto.
  • One of the features of the present invention is that the enzyme can be linked by an equilibrium reaction even in the absence of a catalyst. It should be understood that there is. Therefore, the connecting means used in the present invention may be a simple solvent (such as water or an organic solvent).
  • the present invention relates to a method for producing a glycoprotein, comprising a modified tRNA containing an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain and recognizing a 4-base codon, and a set of tRNAs required for translation.
  • Compositions for use in translation reactions are provided.
  • the modified tRNA to be included in such a set of tRNAs for producing a glycopeptide may take any form as described elsewhere herein, especially the modified tRNA. It should be understood.
  • the present invention provides a modified tRNA containing an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain, which recognizes a 4-base codon, and a translation enzyme for translating a set of tRNAs and mRNAs required for translation.
  • a protein synthesis system may take the form as described elsewhere herein, especially the method for producing glycoproteins.
  • a translation enzyme for example, a ribosome extract of natural cells may be used. Synthetic systems using such ribosome extracts are commercially available, and such products may be used.
  • a protein synthesis system may further include a transcriptase for transcription of the nucleic acid molecule.
  • the present invention provides a modified nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence containing a 4-base codon or its complement, wherein the nucleic acid sequence encodes a functional protein when one amino acid is assigned to the 4-base codon ,
  • a modified nucleic acid molecule In a conventional protein synthesis system, such a nucleic acid molecule synthesizes a meaningless protein, but using the technology of the present invention, it corresponds to a nucleic acid molecule for synthesizing a target glycoprotein. It is understood that.
  • modified nucleic acid molecules may be referred to elsewhere herein, particularly as glycoproteins. The method described in (Method for Producing Ceramics) can be employed.
  • the present invention provides a composition comprising a glycoprotein prepared by the method for producing a glycoprotein of the present invention.
  • a composition can be a composition used for various uses such as medicines, agricultural chemicals, cosmetics, specified health foods, foods, and industrial materials.
  • the present invention has achieved easy and selective preparation, and in that sense, the utility is high.
  • the invention provides a compound of the formula:
  • R is one obtained by removing one hydrogen from the side chain of an amino acid
  • R and R each independently represent a protecting group or hydrogen, and R is bonded to a sugar chain.
  • modified nucleic acid molecules are described in other parts of the present specification (in particular, a method for producing a glycoprotein and a method for producing tRNA for introducing a sugar chain).
  • a method for producing a glycoprotein and a method for producing tRNA for introducing a sugar chain Such an arbitrary form can be adopted.
  • R can be a natural amino acid with one hydrogen removed from the side chain.
  • the protecting groups R—R and R are each independently hydrogen, fluorenylmethoxy
  • R which is a protecting group for the carboxyl group, is 2-twotro 4,5-
  • Dimethoxybenzyloxycarbol group trimethylsilylethyleneoxycarbol Group, benzyloxycarbyl group, alkylmethyl group, t-butoxycarbol group or a derivative thereof.
  • R and R which are protecting groups for an amino group, are
  • these protecting groups may be a protecting group such as an acetyl group, a benzyloxycarbol group, a t-butoxycarbol group.
  • R which is a group capable of binding to a sugar chain, is an aminooxy group, an N-alkylaminooxy group,
  • One base hydrogen such as a razide group, an azide group, a thiosemicarbazide group and a cysteine residue may be removed. If not protected, join with R and R,
  • It can be an aminooxy group, an N-alkylaminooxy group, a hydrazide group, an azide group, a thiosemicarbazide group and a cysteine residue.
  • This compound is a typical example of an amino acid having a functional group capable of binding a sugar chain.
  • the present invention provides a compound of the formula:
  • a compound having the structure shown in This is an example of a typical amino acid having a functional group that binds a sugar chain and having the functional group protected.
  • the present invention provides a compound of the formula:
  • a compound having the structure shown in This compound is a representative example of an amino acid having a functional group capable of binding to the sugar chain of the present invention, in which the amino group and the carboxyl group of the amino acid are protected and the functional group binding to the sugar chain is protected.
  • the present invention provides the following intermediate or product:
  • Such an intermediate is an intermediate or a product generated when producing an amino acid and a Z or modified tRNA having a functional group capable of binding to the sugar chain of the present invention.
  • conjugates in which the side chains of amino acids, functional groups capable of binding to sugar chains, nucleotide bases, and the like are changed to other examples are also included in the scope of the present invention. Is understood to be
  • Example 1 Synthesis of N- (4 pentenoyl) L homoserine tert-butyl ester
  • an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain was synthesized. In the synthesis, first, the amino group and the carboxyl group of the amino acid were protected. Homoserine was used as an amino acid.
  • Example 5 a dinucleotide linked to an amino acid having a functional group capable of binding to a sugar chain was linked to tRNA.
  • tRNA -phospho-2-dioxycytidyl (3, -5,)-2, (3,) — O— [2— (N— (4-pentenyl)) amino-4— [0 — [N-Trimethylsilylethoxycarbol] amino] hydr Dipoxylipic acididyl] adenosine in dimethylsulfoxide (21)
  • CCCG is an anticodon whose skeleton is phenylalanine tRNA derived from yeast 3, TRNA (CCCG) lacking CA-0.10 lOD Zl solution of CA (lacking CA from SEQ ID NO: 1) (2.51), 50 mM Tris-HC1PH7.5, lOmM MgCl, lOmM DTT,
  • E. coli T7S30 Extract System for Circlar DNA sold by PROMEGA was used.
  • a vector having an initiation codon, a ⁇ 7 tag sequence, a mutant lysozyme sequence (SEQ ID NO: 3 (nucleic acid) and SEQ ID NO: 4 (amino acid)), a histidine tag sequence, and a termination codon downstream of the T7 promoter region was used.
  • the sequence of the mutated lysozyme was obtained by inserting the CGGG 4 nucleotide sequence into the 44 residue site of lysozyme (position 59 in the sequence listing). 10
  • the compound was confirmed by Western blot analysis (primary antibody: anti-T7 tag antibody (derived from mouse); secondary antibody: anti-mouse IgG—alkaline phosphatase) (FIG. 4).
  • position 83 of streptavidin (position 99 in the sequence listing) becomes CGGG! /, A mutant streptavidin (SEQ ID NO: 5 (nucleic acid) and SEQ ID NO: 6 (amino acid)).
  • 6 in FIG. 6 corresponds to Tyr-C4-N3, 5 corresponds to Tyr-C4-Teoc, 4 corresponds to Hse (ONMeNVOC), and 3 corresponds to Hse (ONHNVOC). , 2 correspond to Hse (ONMeTeoc) and 1 corresponds to Hse (ONHTeoc).
  • lysozyme had a temperature of 30 ° C or 37 ° C was more appropriate than 42 ° C, and reducing the amount of arginine had no effect. Rather, 1-fold more full-length protein was synthesized.
  • sugar chains include sialic acid, N-acetyl-dalcosamine, monosaccharides such as glucose, and disaccharides such as ratatose.
  • the protein produced in Example 7 is mixed with the above monosaccharide.
  • the mixing conditions include, for example, the following conditions.
  • An appropriate amount (for example, 200 microliter) of an acetate buffer (pH 5.6) is added.
  • an appropriate amount of sugar chain solution for example, 200 microliters
  • an appropriate amount of methanol for example, 200 microliters
  • methanol for example, 200 microliters
  • centrifugal filtration is performed using a microcomputer (manufactured by Millipore) at 10,000 rpm Z for 10 minutes at 10 ° C.
  • An appropriate amount of ultrapure water is added to this concentrate (substantially the same amount as the sugar chain solution), and centrifugal filtration is performed again under the same conditions.
  • An appropriate amount of ultrapure water for example, 100 microliters is added to the concentrated solution (which can be reduced to about 1/100) to obtain a glycoprotein having sugar chains bound thereto.
  • E. coli T7 S30 Extract System for Circlar DNA sold by PROMEGA was used as an expression system for protein poor.
  • a vector a vector having an initiation codon, a T7 tag sequence, a mutant streptavidin sequence (SEQ ID NO: 5), a histidine tag sequence, and a termination codon downstream of the T7 promoter region was used.
  • the sequence of the mutant streptavidin was obtained by inserting the 4-base sequence of CGGG into the 83-residue site of streptavidin.
  • DNA was placed at 37 ° C. One hour later, the reaction was stopped by cooling to 0 ° C.
  • the reaction solution was purified using T7 Tag antibody agarose (50 ⁇ l) (ovagen neeri), and the eluate was desalted and concentrated using Microcon YM10 (Millipore) to obtain a 50 ⁇ l solution.
  • a solution 51 containing about 200 ng of the mutant streptavidin was dried by lyophilization, and 31 of 200 mM acetate buffer (pH 4.0) containing 400 mM ratatose was added at 37 ° C.
  • ratatose was changed to ImM-2M (for example, lmM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM, 800mM, 900mM, 1M, 1.25M, 1.5M, 1.75M, 2M);
  • Acetate buffer is changed between pH2.5-7 in 0.2 steps, and the concentration is 10mM-1M ( For example, it changes between 10 mM, 20 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM, 800 mM, 900 mM, 1 M).
  • reaction conditions are varied between 20 ° C and 100 ° C, and the reaction is observed every hour from 1 hour later.
  • ratatose favored the reaction at 10 mM-1 M.
  • the reaction proceeds preferably at an acetate buffer concentration of 50-400 mM, pH 3-6, with a reaction temperature of 25 ° C-80 ° C and a reaction time of 6 hours-15 days. Is preferably observed, and the reaction proceeds.
  • Example 16 Sugar chain elongation reaction of 2 amino-4 [N-methyl-aminooxy] -butyric acid modified with ratatose by enzyme
  • Resin is 0.01% BSA ⁇ 50% containing 0.2% TritonX-100, 3mM CMP-NANA, 30mUa 2,3 sialyltransferase (Rat recombinant, CALBIOCHEM)
  • useful glycoproteins that can be used in medicines, agricultural chemicals, foods, and the like can be easily produced with flexibility and selectivity. Therefore, it is understood that the application extends to various fields.

Landscapes

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Abstract

　簡便に糖鎖を導入できる糖ペプチドの生成のための方法を提供すること。本発明では、糖鎖の導入のための基を保護したアミノ酸を、４塩基コドン法でタンパクに導入することにより、脱保護したのちにその部位に天然の糖鎖を導入することにより、上記課題を解決した。従って、本発明は、以下の工程：（ａ）糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含み、４塩基コドンを認識する改変ｔＲＮＡ改変ｔＲＮＡを提供する工程；（ｂ）該４塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子を提供する工程；（ｃ）該改変核酸分子を転写してｍＲＮＡを生成する工程；および（ｄ）該改変ｔＲＮＡおよび翻訳に必要なセットのｔＲＮＡを含むタンパク質合成系に該ｍＲＮＡを曝してタンパク質を生成する工程、を包含する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質を生産するための方法を提供する。

Description

拡張コドンを利用した糖タンパク質の作製方法
技術分野
[0001] 本発明は、タンパク質に関連する生化学およびィ匕学の分野に関する。より特定する と、本発明は、糖タンパク質およびその合成に関する。
背景技術
[0002] 以下の記載内容には、本発明の理解に有用と思われる情報が含まれている。ここ に提供されて ヽる情報が ヽずれも本発明に対する従来技術であると認めるものでも なければ、明示的または暗黙的に参照した出版物がいずれも本発明に対する従来 技術であると認めるものでもな 、。
[0003] タンパク質の糖鎖による修飾は、タンパク製剤（ホルモン剤など）の血中安定性や血 中保持時間の向上に役立つので重要である力 そのほとんどは現在は動物細胞を 用いてタンパク質に糖鎖修飾して 、る。このような動物細胞をもち 、た天然糖鎖付加 の場合、導入される糖鎖は培養系によって決まり、自由に設計することができないこと と、糖鎖の導入部位や導入率を自由に制御することができないことが難点である。
[0004] 一般に生物に使われている 20種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸を、対応するコ ドンを新たに定義することでタンパクに導入する手法として、 Schultzらの開発した終 止コドンを用いる方法 (非特許文献 1)と宍戸 '芳坂らの提唱した 4塩基コドンを用いる 方法 (非特許文献 2— 4)が知られている。特に、 4塩基コドンを用いる方法では、一 度に使用可能なコドンが理論的には何種類にもなるので、さまざまな非天然アミノ酸 をそれぞれ目的の部位に導入できる利点がある。
[0005] この 4塩基コドンを用いた非天然アミノ酸導入では、これまで、蛍光性のアミノ酸など の 、くつかの例が報告されて 、るが、糖の導入には成功して 、なかった。
[0006] 3塩基コドンでは、ケトン基のついた非天然アミノ酸を導入して、アミノォキシル基を つけた糖鎖を結合させた報告 (非特許文献 5)がある。
非特許文献 l : Schultzet al.， Vol.96, Issue 9, 4780-4785, April 27, 1999
非特許文献 2 : Taki M.et al.FEBS Lett.507,35- 38、 2001 非特許文献 3 : HohsakaT. et al.J. Am. Chem.Soc, 121, 34-40, 1999 非特許文献 4 : Hohsaka T. etal.J. Am. Chem.Soc, 118, 9778-9779, 1996 非特許文献 5 : H. Liu et al.， J. Am. Chem. Soc. 125, 1702-1703 ,2003
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、簡便に糖鎖を導入できる官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質およ びそれから誘導される糖ペプチドの生成のための方法を提供することを課題とする。 課題を解決するための手段
[0008] 本発明では、糖鎖の導入に適したアミノォキシ基などの糖鎖導入のための基を有 するアミノ酸を、 4以上の塩基をコドンとして用いる方法 (例えば、 4塩基コドン法)でタ ンパク質に導入すること、および脱保護したのちにその部位に天然の糖鎖を導入す ることにより、上記課題を解決した。
[0009] 従って、本発明は、以下を提供する。（1)以下の工程：
(a)糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含み、 4塩基コドンを認識する改変 tRNAを提供する工程であって、上記改変 tRNAは 4塩基コドンを認識する、工程；
(b)上記 4塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子を提 供する工程であって、上記核酸配列は上記 4塩基コドンに 1アミノ酸を対応させたとき に、目的の糖タンパク質のタンパク質部分をコードする、工程；
(c)上記改変核酸分子を転写して mRNAを生成する工程；および
(d)上記改変 tRNAおよび翻訳に必要なセットの tRNAを含むタンパク質合成系に 上記 mRNAを曝してタンパク質を生成する工程、を包含する、糖鎖に結合し得る官 能基を有するアミノ酸を含むタンパク質を生産するための方法。
(2)上記糖鎖に結合し得る官能基は、保護されていてもよいアミノォキシ基、保護さ れていてもよい N—アルキルアミノォキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チォセミカルバジ ド基およびシスティン残基力もなる群より選択される少なくとも 1つの基を有する、項 目 1に記載の方法。
(3)糖鎖に結合し得る官能基を含むアミノ酸誘導体が天然アミノ酸に糖鎖に結合し 得る官能基が結合したアミノ酸である、項目 1または 2に記載の方法。 (4)上記糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸は、チロシン、ホモセリおよびセリ ンカもなる群より選択されるアミノ酸またはその誘導体である、項目 1または 2に記載 の方法。
(5)上記 4塩基コドンは、 CGGGである、項目 1一 4のいずれ力 1項に記載の方法。
(6)上記タンパク質合成系は、上記 4塩基コドンの最初の 3塩基力もなるコドンに対応 する tRNAを有しない、項目 1一 5のいずれ力 1項に記載の方法。
(7)上記タンパク質合成系は、上記 4塩基コドンの最初の 3塩基および最後の 3塩基 からなるコドンに対応する tRNAを有しない、項目 1一 6のいずれ力 1項に記載の方 法。
(8)上記改変 tRNAは、アンチコドン部分に上記 4塩基コドンの相補配列を有する、 項目 1一 7のいずれか 1項に記載の方法。
(9)上記タンパク質合成系は、上記改変 tRNAを、上記天然 tRNAに比べて有意に 多い量で含む、項目 1一 8のいずれか 1項に記載の方法。
(10)上記タンパク質合成系は、上記改変 tRNAを、上記天然 tRNAの少なくとも 4倍 の量で含む、項目 1一 9のいずれ力 1項に記載の方法。
(11)上記タンパク質合成系は、上記 4塩基コドンの最初の 3塩基力 なるコドンに対 応する tRNAを他の tRNAよりも有意に少なく含む、項目 1一 10のいずれ力 1項に記 載の方法。
(12)上記タンパク質合成系は、上記 4塩基コドンの最初の 3塩基力 なるコドンに対 応する tRNAを他の tRNAの 1一 0. 01倍含む、項目 1一 11のいずれ力 1項に記載 の方法。
(13)上記 4塩基コドンを 3塩基コドンとして読んだ場合に生成するタンパク質を取り除 く工程をさらに包含する、項目 1一 12のいずれか 1項に記載の方法。
(14)上記 4塩基コドンを 3塩基コドンとして読んだ場合に生成するタンパク質は、上 記 4塩基コドンを 4塩基コドンとして読んだ場合に生成するタンパク質と、有意に分子 量が異なる、項目 1一 13のいずれか 1項に記載の方法。
(15)上記糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸は、以下の式： [化 11]
Figure imgf000005_0001
力 なる群より選択されるアミノ酸またはその保護体であり、該アミノ酸は、上記改変 t
RNAと、該アミノ酸のカルボキシル基において結合することを特徴とする、項目 1一 1 4の!、ずれ力 1項に記載の方法。
(16)上記核酸分子は、直鎖状で提供される、項目 1一 15のいずれ力 1項に記載の 方法。
(17)上記核酸分子は、環状ベクターとして提供される、項目 1一 16のいずれか 1項 に記載の方法。
(18)上記改変 tRNAは、配列番号 1に示される GCGGAUUUAGCUCAGUUG
CACAGAAUUCGCACCAという配列を含む、項目 1一 17のいずれ力 1項に記載 の方法。
(19)上記改変核酸分子は、インビトロ系において機能するプロモーター配列を含む 、項目 1一 18のいずれか 1項に記載の方法。
(20)上記プロモーター配列は、 T7プロモーター配列を含む、項目 19に記載の方法
(21)以下の工程
(A)項目 1一 20のいずれか 1項に記載の方法により、糖鎖に結合し得る官能基を 有するアミノ酸を含むタンパク質を生成する工程;および
(B)上記タンパク質と所望の糖鎖とを結合させて糖タンパク質を生成する工程、を 包含する、糖タンパク質を生産するための方法。
(21— 1)前記糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸が 2 アミノー 4 [N—メチルー アミノォキシ] 酪酸（2- amino- 4- [N- methy卜 aminooxy]- butyric acid)である、項目 21 に記載の方法。 (21— 2)前記 B工程において、前記糖鎖の濃度は、 10mM— 1Mの間である、項目 2 1に記載の方法。
(21— 3)前記 B工程において、前記糖鎖は、酢酸緩衝液
(50mM— 400mM ;pH3— 6)中で行われる、項目 21に記載の方法。
(21— 4)前記 B工程は、 25— 80°Cにて行われる、項目 21に記載の方法。
(21— 5)前記 B工程は、 6時間一 5日間行われる、項目 21に記載の方法。
(21— 6)前記生成した糖タンパク質を精製する工程をさらに包含する、項目 21に記 載の方法。
(22)以下の工程：
(i)糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を保護して保護アミノ酸を生成するェ 程；
(ii) 5，一ホスホー 2，—デォキシリボヌクレオチジルリボヌクレオチド（pdNpN)を提供 する工程；
(iii)上記保護アミノ酸と上記 pdNpNとを脱水縮合して保護 pdNpNアミノ酸を生成 する工程；
(iv) 4塩基コドンを認識する改変 tRNAを提供する工程；
(V)上記改変 tRNAと上記保護 pdNpNアミノ酸とを連結して保護 pdNpNアミノ酸 連結 tRNAを提供する工程；および
(vi)上記保護 pdNpNアミノ酸が連結した改変 tRNAを脱保護して pdNpNアミノ酸 が連結した tRNAを生成する工程、を包含する、糖鎖に結合し得る官能基を有する アミノ酸を含み、 4塩基コドンを認識する改変 tRNAを生産するための方法。
(23)上記 pdNpNにおけるデォキシリボヌクレオチジルは、 β -D-チミジン、 2，-デォ キシ- β -D-シチジン、 2， -デォキシ- β -D-アデノシン、 2， -デォキシ- β - D-グアノシ ン、 2， -デォキシ- β -D-ゥラシルおよび 2， -デォキシ- β -D-イノシンからなる群より選 択される、項目 22に記載の方法。
(24)上記 pdNpNにおけるリボヌクレオチジルは、 β -D-シチジン、 β -D-アデノシン 、 j8 - D-グアノシン、 j8 - D-ゥラシルおよび |8 - D-イノシン力もなる群より選択される、 項目 22に記載の方法。 (25)上記 pdNpNは、 5 ホスホー 2，ーデォキシリボシチジリルリボアデノシン（pdCp A)である、項目 22に記載の方法。
(26)上記アミノ酸は、天然アミノ酸である、項目 22— 25のいずれか 1項に記載の方 法。
(27)上記アミノ酸は、チロシン、ホモセリンおよびセリンカもなる群より選択される、項 目 22— 26のいずれ力 1項に記載の方法。
(28)上記保護は、フルォレ -ルメトキシカルボ-ル（Fmoc)基、ァセチル基、ベンジ ル基、ベンゾィル基、 t ブトキシカルボ-ル基、 tーブチルジメチル基、 N—フタルイミ ジル基、シリル基、トリメチルシリルェチル基、トリメチルシリルェチルォキシカルボ- ル基、 2 トロー 4, 5—ジメトキシベンジル基、 2 トロー 4, 5—ジメトキシベンジルェ チレンォキシカルボ-ル基および力ルバメート基カゝらなる群より選択される保護基で 行われる、項目 22— 27のいずれ力 1項に記載の方法。
(29)上記改変 tRNAと上記保護 pdNpNアミノ酸との連結は、 T4 RNAリガーゼを 用いて行われる、項目 22— 28のいずれか 1項に記載の方法。
(30)上記保護基の保護は、脱水反応によって行われ、上記脱保護は、加水分解に よって行われる、項目 22— 29のいずれ力 1項に記載の方法。
(31)上記改変 tRNAは、配列番号 1に示される GCGGAUUUAGCUCAGUUG
CACAGAAUUCGCACCAという配列を含む、項目 22— 30のいずれ力 1項に記 載の方法。
(32)
A) 4塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変 t RNA;
B)上記 4塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子であつ て、上記核酸配列は上記 4塩基コドンに 1アミノ酸を対応させたときに機能性タンパク 質をコードする、改変核酸分子;および
C)上記改変核酸分子を転写するための転写酵素、翻訳に必要なセットの tRNAお よび mRNAを翻訳するための翻訳酵素を含むタンパク質合成系、を備える、糖鎖に 結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質の製造キット。
(33)
A) 4塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変 t RNA;
B)上記 4塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子であつ て、上記核酸配列は上記 4塩基コドンに 1アミノ酸を対応させたときに機能性タンパク 質をコードする、改変核酸分子；
C)上記改変核酸分子の転写するための転写酵素、翻訳に必要なセットの tRNAお よび mRNAを翻訳するための翻訳酵素を含むタンパク質合成系；
D)糖鎖；および
E)上記糖鎖に結合し得る官能基と上記糖鎖との連結を行うための連結手段、を備え る、糖タンパク質の製造キット。
(34) 4塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変 tRNA0
(35) 4塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変 tRNA,および翻訳に必要なセットの tRNAを含む、糖タンパク質を製造するための 翻訳反応において用いるための糸且成物。
(36) 4塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変 tRNA,翻訳に必要なセットの tRNAおよび mRNAを翻訳するための翻訳酵素を含 むタンパク質合成系（system)。
(37)さらに、核酸分子を転写するための転写酵素、を含む、項目 36に記載のタンパ ク質合成系。
(38) 4塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子、上記核 酸配列は上記 4塩基コドンに 1アミノ酸を対応させたときに機能性タンパク質をコード する、改変核酸分子
(39)項目 1に記載の方法によって調製されたタンパク質を含む、組成物。
(40)項目 21に記載の方法によって調製された糖タンパク質を含む、組成物。
(41)以下の式： [0011] [化 12]
Figure imgf000009_0001
を有する、化合物（式中、 Rはアミノ酸の側鎖から水素が
1 一つ取れたものであり、 R
2 一 Rおよび Rは、それぞれ独立して保護基または水素を表し、 Rは、糖鎖に結合し
4 6 5
得る基を表す)。
(42)上記 Rは、天然アミノ酸の側鎖力も水素が一つ取れたものである、項目 41に記 載の化合物。
(43)上記 R— Rおよび Rは、それぞれ独立して、水素、 Fmoc基、ァセチル基、ベ
2 4 6
ンジル基、ベンゾィル基、 t ブトキシカルボ-ル基、 tーブチルジメチル基、 N—フタル ィミジル基、シリル基、トリメチルシリルェチル基、トリメチルシリルェチルォキシカルボ -ル基、 2—-トロー 4, 5—ジメトキシベンジル基、 2—-トロー 4, 5—ジメトキシベンジル エチレンォキシカルボ-ル基および力ルバメート基力もなる群より選択される、項目 4 1または 42に記載の化合物。
(44)上記 Rまたは Rは、保護されていてもよいアミノォキシ基、保護されていてもよ
5 6
い N アルキルアミノォキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チォセミカルバジド基およびシ スティン残基力も水素が一つ取れたものからなる群より選択される基である、項目 41 一 43の!、ずれか 1項に記載の化合物。
(45)以下の式：
[0012] [化 13]
Figure imgf000009_0002
Figure imgf000010_0001
[3ΐ^ ] [8Ϊ00]
Figure imgf000010_0002
m [ειοο]
IZL100/S00ld£/I3d 6 6C9S.0/S00Z OAV [0019] [化 16]
Figure imgf000011_0001
[0021] [化 18]
Figure imgf000011_0002
からなる群より選択される構造を有する、化合物。（46) [0023] [化 20]
Figure imgf000012_0001
に示される基が、アミノ酸のカルボキシル基に置換した、化合物。
[0024] 以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該 分野における周知慣用技術力もその実施形態などを適宜実施することができ、本発 明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
発明の効果
[0025] 本発明によって、従来達成できたものより高い収率で所望のタンパク質および糖タ ンパク質を得ることができること、従来達成できたものより高い選択性を持ってタンパ ク質および糖タンパク質 (例えば、医薬、農薬、食品など)を設計することができるとい う効果が達成された。また、従来設計ができな力つたような糖タンパク質の設計も可能 にした。
図面の簡単な説明
[0026] [図 1]図 1は、改変 tRNAを用いた場合の模式図を示す。
[図 2]図 2は、改変 tRNAを用いてタンパク質合成をする全体像を示す。
[図 3]図 3は、実施例 6における SDS— PAGE電気泳動の結果を示す。左側： tRNA -CA；右側： 2—アミノー 4— [0—[N—トリメチルシリルエトキシカルボ-ル]ァミノ]ヒドロ キシーブチリックァシジルー tRNA (CCCG)。
[図 4]図 4は、実施例 7におけるウェスタンプロット分析の結果を示す。一次抗体:抗 T 7タグ抗体（マウス由来）；二次抗体:抗マウス IgG—アルカリフォスファターゼ。左：変 異リゾチーム配列に 2—アミノー 4— [0—[N—トリメチルシリルエトキシカルボ-ル]ァミノ ]ヒドロキシーブチリックァシジルー tRNA (CCCG)を用いな!/、で発現させたもの；中央 ：野生型リゾチーム配列を発現させたもの；ならびに右：変異リゾチーム配列に 2—アミ ノー 4— [0—[N—トリメチルシリルエトキシカルボ-ル]ァミノ]ヒドロキシーブチリックァシ ジルー tRNA (CCCG)を用いて発現させたもの（上記実験)。
[図 5]図 5は、競合するアミノ酸であるアルギニンの比率を変化させて発現にどのよう な影響があるかどうかを示す実施例 8の結果である。 1： 2—アミノー 4-[0-[N-トリメ チルシリルエトキシカルボ-ル]ァミノ]ヒドロキシーブチリックァシジルー tRNA (CCCG ) (以下 ntrPhe— tRNAともいう。）、 20アミノ酸（容量比はすべて 1) ;2:ntrPhe— tR NA(4容量）、 19アミノ酸： 0. lArg (容量比）； 3:ntrPhe— tRNA、 19アミノ酸： 0. 1 Arg;4:ntrPhe— tRNA、 19アミノ酸： 0. OlArg (容量比）； 5:ntrPhe— tRNA、 19 アミノ酸： Argなし； ntrPhe—tRNA 20アミノ酸なし； 7ntrPhe—tRNA 19アミノ酸 なし。
[図 6A]図 6Aは、実施例 1一 4で製造した糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸 以外の化合物を導入した場合に全長タンパク質が合成されるかどうかを検証する際 に使用した mRNA (ストレプトアビジン 83CGGG (配列番号 6) )の構造を示す。
[図 6B]図 6Bは、実施例 1一 4で製造した糖鎖に結合し得る官能基（1一 6)を有するァ ミノ酸以外の化合物を導入した場合に全長タンパク質が合成されるかどうかを検証し た結果 (右下)を示す。
[図 7]図 7は、タンパク質合成系において、環状核酸分子および直鎖状核酸分子を用 V、た場合の比較を行った結果を示す。 1：環状テンプレート； 2：環状テンプレート (一 1 . His) ;3:直鎖状（mRNA)テンプレート； 4:直鎖状（mRNA)テンプレート（一 1. His )。
[図 8]図 8は、リゾチームの発現における種々の条件を示す。 1:リゾチーム野生型； 2: リゾチーム 44CGGG;3:リゾチーム 44CGGG(+Tyr— N3、 30°C、 0. lArg) ;4:リ ゾチーム 44CGGG(+Tyr— N3、 37°C、 0. lArg) ;5:リゾチーム 44CGGG(+Tyr — N3、 37。C、 20アミノ酸）；6:リゾチーム 44CGGG(+Tyr— N3、 37。C、 1,2ァミノ 酸（0. lArg)) ;7:リゾチーム 44CGGG(+Tyr~N3、 42°C、 0. lArg);8:リゾチ一 ム44。000 (+1½61：(0?«1丁60。）、 37で、 0. lArg) ; 9 :リゾチーム 44CGGG ( + Hser (ONHTeoc) X 2、 37。C、 0. lArg)；
[図 9]図 9は、 2 アミノー 4 [N—メチルーアミノォキシ] 酪酸を導入した変異ストレプト アビジンの合成の結果を、 DHBをマトリックスとして MALDI TOF MASSにより質 量分析した結果である。横軸は、質量電荷比 (mZz)を示し、 a. i.は、絶対強度を示 す。
[図 10]図 10は、実施例 15において、 2-ァミノ- 4- [N-メチルーアミノォキシ] -酪酸を 導入した変異ストレプトアビジンをグルコースで修飾したときの DHBをマトリックスとし て MALDI TOFMASSでの分子量測定結果を示す。横軸は、質量電荷比（mZz)を 示し、 a. i.は、絶対強度を示す。
[図 11]図 11は、実施例 15において、 2-ァミノ- 4- [N-メチルーアミノォキシ] -酪酸を 導入した変異ストレプトアビジンをマルトースで修飾したときの DHBをマトリックスとして 使用したときの MALDITOF MASSでの分子量測定結果を示す。横軸は、質量電荷比 (mZz)を示し、 a. i.は、絶対強度を示す。
[図 12]図 12は、実施例 15において、 2-ァミノ- 4- [N-メチルーアミノォキシ] -酪酸を 導入した変異ストレプトアビジンをマルトトリオースで修飾したときの DHBをマトリックス として使用したときの MALDITOF MASSでの分子量測定結果を示す。横軸は、質量 電荷比 (mZz)を示し、 a. i.は、絶対強度を示す。
[図 13]図 13は、実施例 15において、 2-ァミノ- 4- [N-メチルーアミノォキシ] -酪酸を 導入した変異ストレプトアビジンを N-ァセチルダルコサミンで修飾したときの DHBをマ トリックスとして使用したときの MALDITOF MASSでの分子量測定結果を示す。横軸 は、質量電荷比 (mZz)を示し、 a. i.は、絶対強度を示す。
[図 14]図 14は、実施例 16においてラタトースによる修飾および《2, 3シァリルトラン スフエラーゼ糖鎖伸長反応の DHBをマトリックスとして使用したときの MALDI TOF MASSでの分子量測定結果を示す。横軸は、質量電荷比 (mZz)を示し、 a. i.は、 絶対強度を示す。
配列の説明
配列番号 1 :本発明において使用される tRNA(RNA )の配列を示す。 配列番号 2： RNA (-CA)の配列を示す。
NCCU
配列番号 3：本発明で生産した 4塩基コドンを有するリゾチームの核酸配列 配列番号 4：本発明で生産した 4塩基コドンを有するリゾチームのアミノ酸配列 配列番号 5：本発明で生産した 4塩基コドンを有するストレプトアビジンの核酸配列 配列番号 6：本発明で生産した 4塩基コドンを有するストレプトアビジンのアミノ酸配列 発明を実施するための最良の形態
[0028] 以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及 しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形 の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきで ある。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で 通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義 されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本 発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛 盾する場合、本明細書 (定義を含めて)が優先する。
[0029] (用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
[0030] 本明細書において「糖鎖」とは、単位糖 (単糖および Zまたはその誘導体）が 1っ以 上連なってできたィ匕合物をいう。単位糖が 2つ以上連なる場合は、各々の単位糖同 士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては 、例えば、生体中に含有される多糖類 (グルコース、ガラクトース、マンノース、フコー ス、キシロース、 N—ァセチルダルコサミン、 N—ァセチルガラタトサミン、シアル酸なら びにそれらの複合体および誘導体)の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオ ダリカン、グリコサミノダリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導され た糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細 書では、糖鎖は、「多糖 (ポリサッカリド)」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用さ れ得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖 含有物質の両方を包含することがある。 [0031] 本明細書において「単糖」とは、これより簡単な分子に加水分解されず、一般式 H Oで表される化合物をいう。ここで、 n= 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9および 10である
2n n
ものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ペントース、へキソース、ヘプトー ス、オタトース、ノノースおよびデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒ ドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドース，後者をケトースという。
[0032] 本明細書にぉ 、て「単糖の誘導体」とは、単糖上の一つ以上の水酸基が別の置換 基に置換され、結果生じる物質が単糖の範囲内にないものをいう。そのような単糖の 誘導体としては、カルボキシル基を有する糖 (例えば、 C 1位が酸ィ匕されてカルボン 酸となったアルドン酸（例えば、 D グルコースが酸化された D ダルコン酸）、末端の C原子がカルボン酸となったゥロン酸（D グルコースが酸化された D—グルクロン酸） 、アミノ基またはァミノ基の誘導体 (例えば、ァセチル化されたアミノ基)を有する糖（ 例えば、 N ァセチルー D ダルコサミン、 N ァセチルー D—ガラクトサミンなど）、ァミノ 基およびカルボキシル基を両方とも有する糖 (例えば、 N—ァセチルノイラミン酸 (シァ ル酸）、 N—ァセチルムラミン酸など）、デォキシィ匕された糖 (例えば、 2—デォキシー D リボース）、硫酸基を含む硫酸ィ匕糖、リン酸基を含むリン酸ィ匕糖などがあるがそれら に限定されない。あるいは、へミアセタール構造を形成した糖において、アルコール と反応してァセタール構造のグリコシドもまた、単糖の誘導体の範囲内にある。
[0033] 本明細書にお!ヽて「糖鎖含有物質」とは、糖鎖および糖鎖以外の物質を含む物質 をいう。このような糖鎖含有物質は、生体内に多く見出され、例えば、生体中に含有 される多糖類の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオダリカン、グリコサミノグ リカン、糖脂質などの複合生体分子力も分解または誘導された糖鎖など広範囲なも のが挙げられるがそれらに限定されない。
[0034] 本明細書において「糖タンパク質」または「糖ペプチド」とは、交換可能に使用され、 糖鎖を含むタンパク質またはペプチドをいう。そのような糖タンパク質としては、種々 の有用な機能性タンパク質が含まれ、例えば、酵素、ホルモン、サイト力イン、抗体、 ワクチン、レセプター、血清タンパク質などが挙げられるがそれらに限定されない。
[0035] 本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」 および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸 のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよぐ環状であって もよい。ポリペプチドに含まれるアミノ酸は、天然アミノ酸であっても非天然アミノ酸で あってもよぐ改変されたアミノ酸 (例えば、糖鎖を結合し得る官能基を含むアミノ酸） であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされ たものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマ 一も包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフイド結合形成、グリコシルイ匕 、脂質化、ァセチル化、リン酸ィ匕または任意の他の操作もしくは改変 (例えば、標識 成分との結合体化)。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の 1または 2以上のアナログ を含むポリペプチド (例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様ィ匕合物（例 えば、ぺプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「 核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリ マーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオ チド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌク レオチドの誘導体を含む力、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌク レオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌタレ ォチドとして具体的には、例えば、 2，一 O—メチルーリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチ ド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチォエート結合に変換された誘導体オリゴヌ クレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N3， -P5，ホスホロアミデ ート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリ ン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C 5プロピニルゥラシルで置換された誘導体オリゴ ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C— 5チアゾールゥラシルで置換され た誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンが C 5プロピ-ルシトシ ンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフエノキ サジン修飾シトシン（phenoxazine— modified cytosine)で置換された誘導体オリ ゴヌクレオチド、 DNA中のリボースが 2，一 O プロピルリボースで置換された誘導体ォ リゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが 2'—メトキシエトキシリボース で置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではな 、と示され なければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に 改変された改変体 (例えば、縮重コドン置換体)および相補配列を包含することが企 図される。具体的には、縮重コドン置換体は、 1またはそれ以上の選択された (または 、すべての）コドンの 3番目の位置が混合塩基および Zまたはデォキシイノシン残基 で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzerら、 Nucleic Acid R es. 19 : 5081 (1991) ; Ohtsukaら、 J. Biol. Chem. 260 : 2605-2608 (1985)； Rossoliniら、 Mol. Cell. Probes 8 : 91—98 (1994) )。
[0037] 本明細書にお!、て、「核酸分子」は、核酸、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオ チドと互換可能に使用され、 cDNA、 mRNA、ゲノム DNAなどを含む。核酸分子は 、環状 (例えば、環状ベクター、プラスミドなど)または直鎖状 (例えば、 PCR断片)で 提供され得る。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含ま れ得る。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体 (改変体)」 を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプラ イス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように 「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写 後、最初の核酸転写物は、異なる（別の)核酸スプライス産物が異なるポリペプチドを コードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、ェ キソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来 する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産 物 (組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。
[0038] 本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体 上に一定の順序に配列して 、る。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝 子といい、
その発現を左右するものを調節遺伝子 (たとえば、プロモーター）という。本明細書で は、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。本 明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」な らびに Zまたは「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を 指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現さ れた「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに Zまたは「タンパ ク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれ ば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
[0039] 本明細書において遺伝子 (例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある 2つの遺伝 子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。 2種類の遺伝 子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェン トな条件下でのノ、イブリダィゼーシヨン法によって調べられ得る。 2つの遺伝子配列を 直接比較する場合、その遺伝子配列間で DNA配列が、代表的には少なくとも 50% 同一である場合、好ましくは少なくとも 70%同一である場合、より好ましくは少なくとも 80%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%または 99%同一である場合、それらの遺伝 子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子 (例えば、核酸配列、アミノ酸配列 など)の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみな した場合の、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保 存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる 。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。
[0040] 本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比 較は、配列分析用ツールである BLASTを用いてデフォルトパラメータを用いて算出 される。
[0041] 本明細書において「ターミネータ一」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下 流に位置し、 DNAが mRNAに転写される際の転写の終結、ポリ A配列の付加に関 与する配列である。ターミネータ一は、 mRNAの安定性に関与して遺伝子の発現量 に影響を及ぼすことが知られて 、る。
[0042] 本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、また その頻度を直接的に調節する DNA上の領域をいい、通常 RNAポリメラーゼが結合 して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロ モーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」と 、う。プロモーターの領域は、 通常、推定タンパク質コード領域の第 1ェキソンの上流約 2kbp以内の領域であること が多いので、 DNA解析用ソフトウェアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード 領域を予測すれば、プロモーター領域を推定することはできる。推定プロモーター領 域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限 定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。本明細書では、例えば、 T7プロモータ 一などを使用することができる。本明細書にぉ 、て「インビトロ系にお 、て機能する」と は、プロモーターに関して使用されるとき、インビトロ系（例えば、無細胞系）において 遺伝子の転写を促進することができる活性を有することをいう。そのような活性は、無 細胞系において、適切な遺伝子の上流または下流に目的のプロモーターを配置して 、そのプロモーターがその遺伝子の転写を促進することを確認することによって判定 することができる。
[0043] 本明細書にぉ 、て「ェンノヽンサ一」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用 いられる配列をいう。そのようなェンノ、ンサ一は当該分野において周知である。ェン ハンサ一は複数個用いられ得るが 1個用いられてもよ!/、し、用いなくともよ!/、。
[0044] 本明細書にぉ 、て「作動可能に連結された (る）」とは、所望の配列の発現 (作動） がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、ェンノ、ンサ一など)または翻訳調 節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結 されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置される力 必ず しも隣接して配置される必要はな 、。
[0045] 本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよぐ 例えば、形質転換、形質導入、トランスフエクシヨンなどが挙げられる。 そのような核 酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、 例えば、 Ausubel F. A.ら編（1988)、 Current Protocols in Molecular Bi ology、 Wiley、 New York；、 NY; Sambrook Jら (1987) Molecular Cloning： A Laboratory Manual, 2nd Ed.およびその第三版， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY、別冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1997などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブ ロット、ウェスタンプロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣 用技術を用いて確認することができる。
[0046] また、ベクターの導入方法としては、細胞に DNAを導入する上述のような方法であ ればいずれも用いることができ、例えば、トランスフエクシヨン、形質導入、形質転換な ど（例えば、リン酸カルシウム法、リボソーム法、 DEAEデキストラン法、エレクトロボレ ーシヨン法、パーティクルガン (遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
[0047] 本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えべ クタ一」とは、 目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるべ クタ一をいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、 昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、ま たは染色体中への糸且込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置 にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適 したベクターを「クロー-ングベクター」という。そのようなクロー-ングベクターは通常
、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローユング部位を含む。そのような制限酵 素部位およびマルチプルクローユング部位は、当該分野において周知であり、当業 者は、 目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明 細書に記載される文献 (例えば、 Sambrookら、前出）に記載されている。
[0048] 本明細書にお!、て「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプ 口モーターにカ卩えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結 されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネータ一、薬剤耐性 遺伝子のような選択マーカーおよび、ェンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物 )の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類力 宿主細胞または タンパク質発現系に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
[0049] 本明細書にぉ ヽて「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生 命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植 物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転 換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられ る細胞は、形質転換体であってもよい。
[0050] 本発明にお ヽて遺伝子操作などにぉ ヽて原核生物細胞が使用される場合、原核 生物糸田胞としては、 Escherichia属、 Serratia属、 Bacillus属、 Brevibacterium属 、 Corynebacterium,禺、 Microbacterium晨、 Pseudomonas厲などに属す 原核 生物細胞、例えば、 Escherichia coli XL1— Blue、 Escherichia coli XL2—B1 ue、 Escherichia coli DH1が例示される。
[0051] 本明細書において遺伝子発現 (たとえば、 mRNA発現、タンパク質発現)の「検出」 または「定量」は、例えば、 mRNAの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方 法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロッ ト法、ドットプロット法または PCR法などが例示される。免疫学的測定方法としては、 例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いる ELISA法、 RIA法、蛍光抗 体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法とし ては、 ELISA法または RIA法などが例示される。アレイ（例えば、 DNAアレイ、プロ ティンアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。 DNAアレイにっ 、て は、（秀潤社編、細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新 PCR法」）に広く概説され ている。プロテインアレイについては、 Nat Genet. 2002 Dec ; 32 Suppl : 526— 32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述にカ卩えて、 RT— PCR、 R ACE法、 SSCP法、免疫沈降法、 two— hybridシステム、インビトロ翻訳などが挙げ られるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析 実験法 ·中村祐輔ラボ'マニュアル、編集'中村祐輔 羊土社 (2002)などに記載され ており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
[0052] 本明細書において「糖鎖に結合し得る」とは、糖鎖に対して、結合 (好ましくは、共 有結合)することができる能力を 、う。
[0053] 本明細書において「共有結合」とは、当該分野における通常の意味で用いられ、電 子対が 2つの原子に共有されて形成する化学結合を 、う。このような共有結合として は、例えば、ォキシム結合、ヒドラゾン結合、チォセミヒドラゾン結合、ペルヒドロチアジ ン環形成およびチアゾリジン環形成などが挙げられるがそれらに限定されない。
[0054] 本明細書において「糖鎖に結合し得る（官能)基」とは、糖鎖が結合することができ る任意の官能基をさす。そのような官能基は、「アルデヒド基と流体中で反応し得る官 能基」であり得る。「アルデヒド基と流体中で反応し得る官能基」とは、糖鎖が水溶液 などの流体中で形成する環状のへミアセタール型と非環状のアルデヒド型との平衡 にお 、て、アルデヒド基と反応して特異的かつ安定な結合をつくることができる性質 を有する官能基をいう。このような官能基としては、アミノォキシ基、 N—アルキルアミノ ォキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チォセミカルバジド基およびシスティン残基などが 挙げられるがそれらに限定されない。アミノォキシ基、 N—アルキルアミノォキシ基、お よびアジド基が好ましい。
[0055] 本明細書において「流体」は、本発明の物質 (例えば、糖鎖に結合し得る（官能)基 を含むアミノ酸)が、糖鎖と相互作用をする環境を提供することができる流体であれば どのようなものでも使用することができる。好ましくは、そのような流体はケト基を含む 物質は実質的に含まない。なぜなら、ケト基を含む物質が有意に含有されている場 合、流体中のアルデヒド基と本発明の物質との反応が充分に進まないからである。し たがって、ケト基を含む物質を含まない形態は必須ではないが、好ましい実施形態 である。
[0056] したがって、本明細書において使用される流体は、糖を環状のへミアセタール型と 非環状のアルデヒド型との平衡にもたらすようなものであることが好まし 、。そのような 流体としては、例えば、水溶液、有機溶媒およびこれらの混合物などが挙げられるが それに限定されない。好ましくは、流体は水溶液である。
[0057] 本明細書にぉ 、て、「フラグメント」とは、全長のタンパク質またはポリヌクレオチド（ 長さが n)に対して、 1一 n— 1までの配列長さを有するタンパク質またはポリヌクレオチ ドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば 、その長さの下限としては、タンノ ク質の場合、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15, 20、 2 5、 30、 40、 50およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していな い整数で表される長さ (例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。また、ポ リヌクレオチドの場合、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15, 20、 25、 30、 40、 50、 75、 100およ びそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙して!/、な!/、整数で表され る長さ（例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、タン ノ ク質およびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の 個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなぐ同じ機能を有する 限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上 下 10%)のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細 書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」 のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。
[0058] 本明細書にぉ 、て「ヌクレオチド」とは、糖部分がリン酸エステルになって 、るヌクレ オシドをいう。本明細書において「ヌクレオシド」とは、塩基と糖とが N-グリコシド結合 をしたィ匕合物をいう。核酸は、塩基がピリミジン塩基またはプリン塩基のヌクレオチド X ピリミジンヌクレオチドおよびプリンヌクレオチド)の重合体 (ポリヌクレオチド)である。糖 部分が D-リボースのものをリボヌクレオチドと!/、 、、 RNAの加水分解によって得られる .糖部分が D- 2，-デォキシリボースのものをデォキシリボヌクレオチドといい、 DNAの 酵素分解によって得られる。天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオ チド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがも とのヌクレオチドと同様の機能を有するものを 、う。そのような誘導体ヌクレオチドおよ びヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオ チドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチォエート、ホスホノレアミデー ト、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、 2—0—メチルリボヌクレオチド、ぺ プチドー核酸 (PNA)が含まれる力 これらに限定されない。
[0059] 本明細書において「アミノ酸」とは、当該分野において通常用いられる意味で用いら れ、カルボキシル基とアミノ基とを有する有機化合物をいう。本明細書においてァミノ 酸は、天然アミノ酸であっても非天然アミノ酸であっても良い。用語「天然のアミノ酸」 とは、生体内に存在する天然のアミノ酸の L 異性体を意味する。天然のアミノ酸とし ては、グリシン、ァラニン、ノ リン、ロイシン、イソロイシン、セリン、ホモセリン、メチォ二 ン、トレオニン、フエ二ルァラニン、チロシン、トリプトファン、システィン、プロリン、ヒス チジン、ァスパラギン酸、ァスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、 γ カルボキシグル タミン酸、アルギニン、オル-チン、およびリジンなどが挙げられる。特に示されない 限り、本明細書でいう全てのアミノ酸は L体である力 D体のアミノ酸を用いた形態も また本発明の範囲内にある。用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然 に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ一 ニトロフエ-ノレァラニン、ホモフエ-ノレァラニン、パラーフノレオ口フエ-ノレァラニン、 3— ァミノ— 2—べンジルプロピオン酸、ホモアルギニンの D体または L体および D—フエ- ルァラニンが挙げられる。また、本発明において天然アミノ酸をもとに改変を施したァ ミノ酸は、天然アミノ酸でない場合は、非天然アミノ酸の範囲に入る。「アミノ酸アナ口 グ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および Zまたは機能に類似する分子を いう。アミノ酸アナログとしては、例えば、ェチォニン、カナバニン、 2—メチルグルタミ ンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構 造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。本明 細書では、アミノ酸の代わりに、アミノ酸アナログまたはアミノ酸模倣物を使用すること ができる。
[0060] アミノ酸は、その一般に公知の 3文字記号力、または IUPAC— IUB Biochemical
Nomenclature Commissionにより推奨される 1文字記号のいずれかにより、本 明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された 1文字コードによ り言及され得る。
[0061] 本明細書において「糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸」は、代表的に、 [0062] [化 21]
Figure imgf000025_0001
を有し、（式中、 Rはアミノ酸の側鎖力 水素が一つ取れたものであり、 R— Rおよ
1 2 4 び Rは、それぞれ独立して保護基または水素を表し、 Rは、糖鎖に結合し得る基)で
6 5
表わされる、化合物で表され得る。
[0063] 本明細書において、アミノ酸の側鎖とは、アミノ酸を RCH(NH )COOHで表したとき
2
に、 Rに相当する基をいう。本明細書では、アミノ酸には、 R R CH(NH)COOH (Rおよ a b a び Rは、任意の基であり、一緒になつて環状の基を形成していても良い）で示される b
イミノ酸を含む。したがって、ィミノ酸の場合は、 Rまたは Rはあるいはその両方相当 a
する基が側鎖に該当し得る。個々で例示的なアミノ酸としては、例えば、グリシン、了 ラニン、ノ リン、ロイシン、イソロイシン、セリン、ホモセリン、メチォニン、トレオニン、フ ヱ二ルァラニン、チロシン、トリプトファン、システィン、プロリン、ヒスチジン、ァスパラギ ン酸、ァスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、 γ カルボキシグルタミン酸、アルギ- ン、オル-チン、およびリジンなどが挙げられるがそれらに限定されない。ここで、プロ リンなどの環状イミノ酸の場合は、 Rと Rまたは Rまた、アミノ酸がグリシンの場合は、 R
1 3 4
1は、単結合を意味し得る。
[0064] ここで、 R— Rおよび Rは、それぞれ独立して、水素（保護されて!、な 、場合）、あ
2 4 6
るいは、 Fmoc基、ァセチル基、ベンジル基、ベンゾィル基、 t ブトキシカルボ-ル基 、 tーブチルジメチル基、 N フタルイミジル基、シリル基、トリメチルシリルェチル基、ト リメチルシリルェチルォキシカルボ-ル基、 2—-トロー 4, 5—ジメトキシベンジル基、 2 -トロー 4, 5—ジメトキシベンジルエチレンォキシカルボ-ル基、アルキレノィル基（ 例えば、ペンテノィル基）、ォキシアルキレノィル基などであり得る。好ましくは、ォキ シカルボ-ル基がリンカ一として結合して 、る。ォキシカルボ-ル基が介在することに よってァミノ基との連結がスムーズになるからである。
[0065] ここで、 Rは、アミノォキシ基、 N アルキルアミノォキシ基、ヒドラジド基、アジド基、
5
チォセミカルバジド基、システィン残基などであり得る。
[0066] 本明細書において、「5，—ホスホー 2，ーデォキシリボヌクレオチジルリボヌクレオチド」
(pdNpN)とは、リボヌクレオチドに、 5 ホスホ— 2—デォキシリボヌクレオチドが結合し た化合物をいい、 3位に任意のアミノ酸を結合させて、 tRNAを作製するための基質 として有用である。代表的な pdNpNとしては、 pdCpA (5 ' ホスホ— 2 ' デォキシリボ シチジリルリボアデノシン）が挙げられるがそれらに限定されない。 pdNpNにおける デォキシリボヌクレオチジルは、 j8— D チミジン、 2 '—デォキシー j8— D—シチジン、 2 ' —デォキシー j8— D アデノシン、 2，ーデォキシー j8— D グアノシン、 2，ーデォキシー j8 —D—ゥラシルおよび 2 '—デォキシ—j8— D イノシンなどであり得る。 pdNpNにおける リボヌクレオチジルは、 β— D—シチジン、 j8— D アデノシン、 β— D—グアノシン、 β— D—ゥラシルおよび β—D イノシンなどであり得る。 pdCpAは以下の式で示される。 [0067] [化 22]
Figure imgf000027_0001
[0068] 本明細書において、「改変 tRNA」とは、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸 を含む、転写 RNA(tRNA)をいう。 tRNAは、細胞内には 20種類のアミノ酸に対し て，それぞれ 1種またはそれ以上の分子種 (isoaccepting tRNA)が存在する。 tR NAは沈降係数 4S、分子量 2— 3万、ヌクレオチド数 70— 90程度の比較的小さい R NAであり、多くの修飾塩基 (例えば、メチルイ匕ヌクレオシド)を含有することが知られ ている。 tRNAのヌクレオチド配列（一次構造）は分子種によって互いに異なる力 い ずれも二次構造としてクローバー葉モデルをとりうるような配列であり，それが折りたた まれて L字型三次構造をとることが知られており、各 tRNA分子のほぼ中央部には、 コドンと相補的なヌクレオチド配列（天然では 3塩基配列であり、本発明にお 、て提供 される改変 tRNAでは 3塩基以外 (例えば、 4塩基以上であり、代表的には 4塩基）と なって！/ヽる）であるアンチコドンループを形成する。 3，末端にそれぞれ特異的なアミノ 酸を結合したアミノアシル tRNA力 リボソーム上で mRNAのコドンと相補的な塩基 対合を形成し次々とコドンをアミノ酸に対応づけることが知られて ヽる。
[0069] そのような改変 tRNAとしては、例えば、 5，一 GCGGAUUUAGCUCAGUUGG
ACAGAAUUCGCACCA (tRNA とも称される；配列番号 1)； 5，— GCG GA
CCCG
U UUA GCU CAG UUG GGA GAG CGC CAG ACU NCCU AA U CUG GAG GUC CUG UGU UCG AUC CAC AGA AUU CGC AC (tRNA (-CA)とも称される; Nは任意の塩基;配列番号 2)が挙げられるが それらに限定されない。例示的な改変 tRNAとしては、例えば、配列番号 2における NCCUの位置に、別の 4塩基配列を置換することによって、本願発明の tRNAを作 製することも可能である。
[0070] 本発明の改変 tRNAにお!/、て用いられ得る 4塩基配列としては、例えば、 CUCU、 CUCA、 CCCU、 CGGU、 CGGGなどのアンチコドンが挙げられるがそれらに限定 されない。
[0071] 本明細書にぉ 、て 4塩基コドン (またはそれ以上の塩基コドン）の「最初の 3塩基」と は、 5，末端から並べた場合に、第 1のヌクレオチドから第 3のヌクレオチドから構成さ れるコドンをいう。同様に、 4塩基コドン (またはそれ以上の塩基コドン）の「最後の 3塩 基」とは、 5，末端から並べた場合に、 3，から数えた場合の第 1のヌクレオチドから第 3 のヌクレオチド力も構成されるコドンをいう。同様に、 4塩基コドン (またはそれ以上の 塩基コドン）の「任意の 3塩基」とは、 5'末端から並べた場合に、任意の 3連続ヌクレオ チドから構成されるコドンをいう。コドンの対応表は、以下の表に示される。以下の表 には、 3塩基コドンのほ力 これまでに報告がある非天然アミノ酸を組み込んだ 4塩基 コドンの代表例が示されている。
[0072] [表 1]
Figure imgf000028_0001
4塩基コドンの例
① CUCU, CUCU
② CCCU
③ CGGU, CGGG
④ AGGU
⑤ GGGU
記号「*」は、停止コドンを意味する。
[0073] 本明細書にぉ 、て「アンチコドン」とは、コドンに相補的な配列またはその配列を有 する分子をいう。例えば、 CGTに対するアンチコドンは、 ACGであり、 A— T (または U )、 C Gの相互の変換および 5'と 3'とを逆にすることによって相補的な配列を作製 することができる。
[0074] 本明細書において、「対応する」コドン、 tRNAとは、遺伝コドン（3塩基コドンにカロえ 、 4塩基およびそれ以上の塩基コドンが存在する場合はそのコドンも含む）の対応表 に従って、対応関係にあるコドンと tRNAとの関係をいう。
[0075] 本明細書において tRNAの量が「有意に多い」とは、その tRNAによって得られるタ ンパク質の合成の量が有意に変更する程度に多い量をいう。代表的には、有意に多 いは、統計学的に多いものをいうが、それに限定されず、当業者は、そのような量を 当該分野において周知の技術を用いて選択することができる。例示的な有意に多い 量としては、例えば、 1. 1倍、 1. 2倍、 1. 3倍、 1. 4倍、 1. 5倍、 2倍、 3倍、 4倍、 5倍 、 10倍、 100倍などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において「有意 に少な!/、」とは、「有意に多 、」と逆の概念を指す。
[0076] 本明細書において「4塩基コドンを 3塩基コドンとして読んだ場合に生成するタンパ ク質」とは、本発明の改変核酸分子をすべてが 3塩基コドンを使用したとして転写およ び翻訳した場合に生成するタンパク質を！、う。 4塩基コドンを 3塩基コドンして読むの で、そのコドン以降のアミノ酸配列が異なり、通常終止コドンがずれることから、生成 するタンパク質の長さが変更される。
[0077] 本明細書において、機能性タンパク質に関し、「改変核酸分子」とは、 4塩基コドン またはその相補体を含み、 4塩基コドンに 1アミノ酸を対応させたときに機能性タンパ ク質をコードするものをいう。ここで、 4塩基コドンには、通常、その 4塩基コドンに対応 する改変 tRNAに結合されたアミノ酸が対応し、本発明では、代表的に、糖鎖に結合 し得る官能基を有するアミノ酸が相当する。 [0078] 改変 tRNAは、当該分野において周知の手法および Hohsaka T. et al. , ( 1996) Am. Chem. Soc. 118, 9778— 9779 ;および Hohsaka, T. , et al . , (1999) 、 J. Am. Chem. Soc. , 121, 34— 40などを参酌して作製 することができる。例示的に説明すると、既存の tRNA (天然のものであっても、すで に改変されたものであっても良い）を用いて、例えば、部位特異的変異誘発などの遺 伝子操作により所望の配列を有するように改変したものをコードするテンプレート DN Aを逆転写して RNAを合成することによって tRNAを作製することができる。
[0079] あるいは、 tRNA (天然のものであっても、すでに改変されたものであっても良い）を コードするテンプレート DNAを T7プロモーター制御下になるように化学合成し、別の tRNA (- CA)のテンプレートを部位特異的変異誘発により作製する。次いで、化学 的に合成したアミノアシルジヌクレオチドを、 T7転写したテンプレート tRNAに対して 、 T4 RNAリガーゼを用いて連結することによって、アミノアシル tRNA (— CA)を作 製することができる。
[0080] 本明細書にぉ 、て、「アミノアシル tRNA合成酵素」とは、特定のアミノ酸を活性ィ匕 して，対応する tRNAに正しく結合させる酵素をいう。一つのアミノ酸とそれに対応す る複数の tRNAに対して、通常、一つの特異的な酵素が存在する力 2以上の特異 的な酵素が存在する場合も存在し、そのような場合は、いずれの酵素も本発明にお いて使用することができる。アミノアシル tRNA合成酵素は、通常、 2段階の反応： (1 ) ATP存在下でアミノ酸をァシルイ匕するアミノ酸活性ィ匕反応；および（2)活性化ァミノ 酸を、対応する tRNAの 3 '—末端アデノシンの 3 ' - (または 2 '—) OH基に転移する転 移反応を触媒する。アミノアシル tRNA合成酵素は、通常の tRNAとアミノ酸との連 結反応に使用されるほか、本発明の改変 tRNAと保護 pdNpNアミノ酸との連結反応 にも用いることができる。改変 tRNAと保護 pdNpNアミノ酸との連結は、 T7リガーゼ などのリガーゼを用いて行うことができる。この場合、アミノ酸は、アミノアシルジヌクレ ォチドとして提供されても良い。
[0081] 本明細書において「転写」とは、当該分野において通常使用される意味と同じ意味 で用いられ、伝子 DNAのヌクレオチド配列を相補的 RNAとして写しとる反応をいう。こ の反応は、通常、生体内（細胞内）で行われる力 必要な材料が存在する限り、無細 胞系でも行われ得る。そのような無細胞系には、当該分野において公知の DNA依 存性 RNAポリメラーゼおよびその補因子および Zまたは調節因子、ならびに必要な ヌクレオチドなどを含み得る。なお、転写の逆の反応 (RNAを铸型とする DNA合成 反応）は、本明細書にぉ 、て「逆転写」 t 、う。
[0082] 本明細書において「翻訳」とは、タンパク質の生合成または人工合成の際に、 mRNA上の塩基配列を読みとつてその情報に対応するアミノ酸を選びだしペプチド鎖 を形成していく過程をいう。翻訳もまた、通常、生体内（細胞内）で行われるが、必要 な材料が存在する限り、無細胞系でも行われ得る。そのような無細胞系は、本明細書 において「タンパク質合成系」という。生体内で行われる場合は、 mRNAはリボソーム と結合し，その mRNA上のコドン（3連塩基）にそれぞれ対応した構造をもつアミノア シル tRNAによって，アミノ酸は順次連結される。無細胞系は、細胞力も取り出したリ ボゾーム系および他の必要なアミノ酸などを含み、これらの系は試験管内で行われ 得る。
[0083] 本明細書においてタンパク質合成系は、翻訳に必要なセットの tRNAおよび mRN Aを翻訳するための翻訳酵素（代表的には、リボソーム RNA=rRNAまたはそれを 含むリボソーム)ならびに他の調節因子を含む。
[0084] タンパク質合成は、代表的に、以下の 4段階の反応工程を含む。（1)アミノ酸の活 性ィ匕：各アミノ酸はそのアミノ酸に特異的なアミノアシル tRNA合成酵素の上で、 AT P存在下にァシル化され活性化される.続いて同じ酵素上で，対応する tRNAの 3' 末端アデノシンにエステル結合してアミノアシル tRNAを形成する。この段階は、アミ ノ酸とそのアミノ酸に対するアンチコドンを担った tRNAを結合する。すなわち遺伝情 報とアミノ酸を正確に直接結びつける点で、タンパク質生合成の正確さを維持するの に重要である。本発明では、この段階において、改変 tRNAを使用することができる 。 （2)合成開始:タンパク質生合成は、通常、開始コドン (AUG)力も開始される。開 始コドンは、原核細胞ではホルミルメチォ-ル tRNA (f Met— tRNA)、真核細胞で はメチォニル tRNAにより認識される。まずタンパク質鎖開始因子 'GTPの介助によ り、 mRNAがリボソーム上の正しい位置に固定され、 mRNA上の開始コドンに f Met tRNAが結合した開始複合体が形成される。（3)タンパク質鎖の延長： mRNA上の 次のコドンで規定されるアミノアシル tRNA力 延長因子 · GTP · Mg2+の介助により 複合体上に結合し、次のコドンと塩基対を形成する。この段階で f Metは次のアミノ酸 のァミノ基に転移しペプチド結合を形成する。この反応は、リボソームサブユニット中 の rRNA (原核細胞では 23SrRNA)により触媒される。次いでリボソームは、 mRNA 上を 1コドン分だけ 5'→3 '方向へ移動する。このサイクルを繰り返すことで、 mRNA の示す遺伝コドンどおりにペプチド鎖は順次 C末端方向に延長する。（4)合成の終 結：次のアミノアシル tRNAが入る位置に終止コドンが来ると、 tRNAの代わりにタン ノ ク質鎖終止因子が結合し、新生タンパク質鎖を tRNAから切り離してリボソームか ら遊離させる。リボソームは次の蛋白質生合成に再利用される。遊離した新生タンパ ク質鎖は折り畳まれ、プロセッシングを受けるとか何らかの翻訳後修飾を受けるなど で，最終的な生物活性をもった立体構造のタンパク質が生成される。
[0085] タンパク質合成系は、好ましくは、転写に必要な因子を含み得る。このような場合、 無細胞発現系とも称される。
[0086] 改変 tRNAを用いた場合の模式図は、図 1に示す。また、改変 tRNAを用いてタン パク質合成をする全体像を図 2に示す。
[0087] 本明細書において使用される 4塩基コドンは、 3塩基コドンで読まれた場合には通 常終止コドンが別の場所に移動することからフラグメントとして翻訳が終結する力また はより長 、タンパク質として翻訳されることから、 4塩基コドンで翻訳された生成物とは 区別できることから、 3塩基コドンと共存することができるので， 自然界の 3塩基コドンに よる 20種類のアミノ酸の体系を大きく崩すことなしに導入できる。
[0088] 本明細書において、物質 (例えば、細胞、核酸またはタンパク質などの生物学的因 子）の「単離」とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の物 質 (例えば、糖鎖または糖鎖含有物質である場合、糖鎖または糖鎖含有物質以外の 因子、あるいは、目的とする糖鎖または糖鎖含有物質以外の糖鎖または糖鎖含有物 質;核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む 核酸;タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以 外のアミノ酸配列を含むタンパク質など)力も実質的に分離または精製されたものを いう。「単離された」、糖鎖または糖鎖含有物質には、本発明の精製方法によって精 製された糖鎖または糖鎖含有物質が含まれる。したがって、単離された糖鎖または糖 鎖含有物質は、化学的に合成した糖鎖または糖鎖含有物質を包含する。
[0089] 本明細書において、物質 (例えば、糖鎖、核酸またはタンパク質などの生物学的因 子)の「精製」とは、その物質に天然に随伴する因子の少なくとも一部を除去すること をいう。したがって、精製および分離は、その形態が一部重複する。したがって、通常 、精製された物質 (例えば、糖鎖または糖鎖含有物質のような生物学的因子）におけ るその物質の純度は、その物質が通常存在する状態よりも高い (すなわち濃縮されて いる）が、天然に随伴する因子が低減されている限り、濃縮されていない状態も「精製 」の概念に包含される。
[0090] 本明細書において物質 (例えば、糖鎖または糖鎖含有物質のような生物学的因子 )の「濃縮」とは、その物質が濃縮前に試料に含まれている含有量よりも高い濃度に 上昇させる行為をいう。従って、濃縮もまた、精製および分離と、その概念が一部重 複する。したがって、通常、濃縮された物質 (例えば、糖鎖または糖鎖含有物質のよう な生物学的因子）は、その物質が通常存在する状態における不純物の含有量は低 減されているが、目的とする物質の含有量が増カロしている限り、ある特定の不純物が 増加して!/、てもよく、「精製」されて 、な 、状態も「濃縮」の概念に包含される。
[0091] (細胞系を用いる場合のタンパク質の製造方法）
本発明のタンパク質をコードする DNAを組み込んだ組換え体ベクターを保有する 微生物、動物細胞などに由来する形質転換体を、本発明の改変 tRNAおよび Zまた は糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を用いて、通常の培養方法に従って培 養し、本発明のタンパク質を生成蓄積させ、本発明の培養物より本発明のタンパク質 を採取することにより、本発明のタンパク質または糖タンパク質を製造することができ る。
[0092] 本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の 方法に従って行うことができる。大腸菌等の原核生物ある 、は酵母等の真核生物を 宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、本発明の生物が資化し得 る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地 であれば天然培地、合成培地の!/、ずれを用いてもょ 、。 [0093] 炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フ ラタトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解 物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のァ ルコール類を用いることができる。
[0094] 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の各種無機酸または有機酸のアンモ-ゥム塩、その他含 窒素物質、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼィ ン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物 等を用いることができる。
[0095] 無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸 マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム 等を用いることができる。培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条 件下で行う。
[0096] 培養温度は 15— 40°Cがよぐ培養時間は、通常 5時間一 7日間である。培養中 pH は、 3. 0-9. 0に保持する。 pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、 尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピ シリンまたはテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
[0097] プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微 生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例 えば、 lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するとき にはイソプロピル β D チォガラタトピラノシド等を、 trpプロモーターを用いた発現 ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に 添加してもよい。遺伝子を導入した植物の細胞または器官は、ジャーフアーメンター を用いて大量培養することができる。培養する培地としては、一般に使用されている ムラシゲ ·アンド'スターグ（MS)培地、ホワイト（White)培地、またはこれら培地にォ ーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添カ卩した培地等を用いることができる。
[0098] 例えば、動物細胞を用いる場合、本発明の細胞を培養する培地は、一般に使用さ れている RPMI 1640培地 [The Journal of the American Medical Associ ation, 199, 519 (1967) ]、 Eagleの MEM培地 [Science, 122, 501 (1952) ]、 DMEM培地 [Virology, 8, 396 (1959) ]、 199培地 [Proceedings of the So ciety for the Biological Medicine, 73, 1 (1950) ]またはこれら培地にゥシ 胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
[0099] 培養は、通常 pH6— 8、 25— 40°C、 5%C02存在下等の条件下で 1一 7日間行う 。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物 質を培地に添加してもよい。
[0100] (タンパク質の精製および単離）
本発明のタンパク質をコードする核酸配列で形質転換された形質転換体の培養物 から、本発明のタンパク質を単離または精製するためには、当該分野で周知慣用の 通常の酵素の単離または精製法を用いることができる。例えば、本発明のタンパク質 が本発明のタンパク質製造用形質転換体の細胞外に本発明のタンパク質が分泌さ れる場合には、その培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得す る。その可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒によ る沈澱法、ジェチルアミノエチル（DEAE)— Sepharoseゝ DIAION 11?八—75 (三 菱ィ匕学)等榭脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S— Sepharose FF (Ph armacia)等の榭脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース 、フエ-ルセファロース等の榭脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用い たゲルろ過法、ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電 点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
[0101] 本発明のタンパク質が本発明のタンパク質製造用形質転換体の細胞内に溶解状 態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、 その細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナ ィザ一、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。その無細胞抽出液 を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩 法、有機溶媒による沈澱法、ジェチルアミノエチル（DEAE)— Sepharose、 DIAIO N HPA— 75 (三菱ィ匕学)等榭脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S— Se pharose FF (Pharmacia)等の榭脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブ チルセファロース、フエ-ルセファロース等の榭脂を用いた疎水性クロマトグラフィー 法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォー カシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることによって、精製 標品を得ることができる。
[0102] 本発明のタンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を 回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈澱画分より、通常の方法により本 発明のタンパク質を回収後、そのタンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶ィ匕 する。この可溶ィ匕液を、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃 度をタンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、本発明の タンパク質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製 標品を得ることができる。
[0103] また、通常のタンパク質の精製方法 ϋ. Evan. Sadlerら： Methods in Enzymol ogy, 83, 458]に準じて精製できる。また、本発明のタンパク質を他のタンパク質と の融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたァ フィ-ティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる [山川彰夫，実験医学 ( Experimental Medicine) , 13, 469— 474 (1995) ]。例えば、 Loweらの方法 [Ρ roc. Natl. Acad. Sci. , USA, 86, 8227— 8231 (1989)、 GenesDevelop. , 4 , 1288 (1990) ]に記載の方法に準じて、本発明のタンパク質をプロテイン Aとの融 合タンパク質として生産し、ィムノグロブリン Gを用いるァフィユティークロマトグラフィ 一により精製することができる。
[0104] また、本発明のタンパク質を FLAGペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗 F LAG抗体を用いるァフィユティークロマトグラフィーにより精製することができる [Proc . Natl. Acad. Sci. , USA, 86, 8227 (1989) , Genes Develop. , 4, 1288 (1 990) ]。
[0105] さらに、本発明のタンパク質自身に対する抗体を用いたァフィユティークロマトダラ フィ一で精製することもできる。本発明のタンパク質は、公知の方法 Q[. Biomolecula r NMR, 6, 129— 134、 Science, 242, 1162— 1164、 Biochem. , 110, 166 —168 (1991) ]に準じて、 in vitro転写 ·翻訳系を用いてを生産することができる。 [0106] 上記で取得されたタンパク質のアミノ酸情報を基に、 Fmoc法 (フルォレニルメチル ォキシカルボ-ル法）、 tBoc法（t ブチルォキシカルボ-ル法）等の化学合成法によ つても本発明のタンパク質を製造することができる。また、 Advanced ChemTech, Applied Biosystems、 Pharmacia Biotech、 Protein Technology Instrum ent、 Synthecell— Vega、 PerSeptive、島津製作所等のペプチド合成機を利用し 化学合成することもできる。
[0107] 精製した本発明のタンパク質の構造解析は、タンパク質ィ匕学で通常用いられる方 法、例えば遺伝子クローユングのためのタンパク質構造解析 (平野久著、東京化学 同人発行、 1993年）に記載の方法により実施可能である。
[0108] (変異型タンパク質の作製方法）
本発明タンパク質のアミノ酸の欠失、置換もしくは付カ卩は、出願前周知技術である 部位特異的変異誘発法により実施することができる。力かる 1もしくは数個のアミノ酸 が欠失、置換もしくは付加は、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, S econd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press "989)、 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1一 38, John Wiley & S ons ( 1987-1997) , Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Nat 1. Acad. Sci. , USA, 79, 6409 (1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic A cids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1 985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 81, 5662 (1984) , Science, 224, 143 1 (1984)、 PCT WO85/00817 (1985) , Nature, 316, 601 (1985)等に記載 の方法に準じて調製することができる。
[0109] (有機化学）
本明細書において「アルキル」とは、メタン、ェタン、プロパンのような脂肪族炭化水 素（アルカン)力も水素原子が一つ失われて生ずる 1価の基をいい、一般に C H
n 2n+ l 一で表される（ここで、 nは正の整数である）。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり得 る。本明細書において「置換されたアルキル」とは、以下に規定する置換基によって アルキルの Hが置換されたアルキルをいう。これらの具体例は、 C1一 C2アルキル、 C1一 C3アルキル、 C1一 C4アルキル、 C1一 C5アルキル、 C1一 C6アルキル、 C1 一 C7アルキル、 CI一 C8アルキル、 C1一 C9アルキル、 C1一 C10アルキル、 C1一 C11アルキルまたは C1一 C12アルキル、 C1一 C2置換されたアルキル、 C1一 C3置 換されたアルキル、 C1一 C4置換されたアルキル、 C1一 C5置換されたアルキル、 C 1一 C6置換されたアルキル、 C1一 C7置換されたアルキル、 C1一 C8置換されたァ ルキル、 C1一 C9置換されたアルキル、 C1一 C10置換されたアルキル、 C1一 C11 置換されたアルキルまたは C1一 C 12置換されたアルキルであり得る。ここで、例えば C 1一 C 10アルキルとは、炭素原子を 1一 10個有する直鎖または分枝状のアルキル を意味し、メチル（CH—）、ェチル（C H一）、 n プロピル（CH CH CH一）、イソプ
3 2 5 3 2 2 口ピル（（CH ) CH—）、 n ブチル（CH CH CH CH一）、 n ペンチル（CH CH C
3 2 3 2 2 2 3 2
H CH CH -)、 n—へキシル（CH CH CH CH CH CH -)、 n—ヘプチル（CH C
2 2 2 3 2 2 2 2 2 3
H CH CH CH CH CH -)、 n—ォクチル（CH CH CH CH CH CH CH CH
2 2 2 2 2 2 3 2 2 2 2 2 2 2
)、 n—ノ-ル（CH CH CH CH CH CH CH CH CH -)、 n—デシル（CH CH C
3 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2
H CH CH CH CH CH CH CH一）、 C (CH ) CH CH CH (CH ) CH C
2 2 2 2 2 2 2 2 3 2 2 2 3 2 2
H (CH ) などが例示される。また、例えば、 C1一 C10置換されたアルキルとは、 C1
3 2
一 C10アルキルであって、そのうち 1または複数の水素原子が置換基により置換され ているものをいう。
[0110] 本明細書において「置換されていてもよいアルキル」とは、上で定義した「アルキル」 または「置換されたアルキル」の 、ずれであってもよ 、ことを意味する。
[0111] 本明細書において「アルキレン」とは、メチレン、エチレン、プロピレンのような脂肪 族炭化水素 (アルカン)力も水素原子が二つ失われて生ずる 2価の基を 、 、、一般に — C H 一で表される（ここで、 nは正の整数である）。アルキレンは、直鎖または分枝 n 2n
鎖であり得る。本明細書において「置換されたアルキレン」とは、以下に規定する置換 基によってアルキレンの Hが置換されたアルキレンをいう。これらの具体例は、 C1一 C2アルキレン、 C1一 C3アルキレン、 C1一 C4アルキレン、 C1一 C5アルキレン、 C1 一 C6アルキレン、 C1一 C7アルキレン、 C1一 C8アルキレン、 C1一 C9アルキレン、 C 1一 C10アルキレン、 C1一 C11アルキレンまたは C1一 C12アルキレン、 C1一 C2置 換されたアルキレン、 C1一 C3置換されたアルキレン、 C1一 C4置換されたアルキレ ン、 C1一 C5置換されたアルキレン、 C1一 C6置換されたアルキレン、 C1一 C7置換 されたアルキレン、 C1一 C8置換されたアルキレン、 C1一 C9置換されたアルキレン、 C1一 C10置換されたアルキレン、 C1一 C11置換されたアルキレンまたは C1一 C12 置換されたアルキレンであり得る。ここで、例えば C1一 C10アルキレンとは、炭素原 子を 1一 10個有する直鎖または分枝状のアルキレンを意味し、メチレン (一 CH—)、
2 エチレン（一 C H一）、 n プロピレン (一 CH CH CH一）、イソプロピレン (一（CH ) C
2 4 2 2 2 3 2 一）、 n—ブチレン (一 CH CH CH CH一）、 n ペンチレン (一 CH CH CH CH CH
2 2 2 2 2 2 2 2 2 一）、 n—へキシレン (一 CH CH CH CH CH CH一）、 n ン (一 CH CH C
2 2 2 2 2 2 —へプチレ
2 2
H CH CH CH CH -)、 n—オタチレン (― CH CH CH CH CH CH CH CH -)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
、 n—ノニレン (一 CH CH CH CH CH CH CH CH CH一）、 n—デシレン (一 CH C
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
H CH CH CH CH CH CH CH CH ）、一 CH C (CH )—などが例示される。
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2
また、例えば、 C1一 C10置換されたアルキレンとは、 C1一 C10アルキレンであって、 そのうち 1または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。本明細 書において「アルキレン」は、酸素原子および硫黄原子力も選択される原子を 1また はそれ以上含んで!/ヽてもよ!/ヽ。
[0112] 本明細書において「置換されていてもよいアルキレン」とは、上で定義した「アルキレ ン」または「置換されたアルキレン」の 、ずれであってもよ 、ことを意味する。
[0113] 本明細書において「シクロアルキル」とは、環式構造を有するアルキルをいう。「置換 されたシクロアルキル」とは、以下に規定する置換基によってシクロアルキルの Hが置 換されたシクロアルキルをいう。具体例としては、 C3— C4シクロアルキル、 C3— C5 シクロアルキル、 C3— C6シクロアルキル、 C3— C7シクロアルキル、 C3— C8シクロ アルキル、 C3— C9シクロアルキル、 C3— C10シクロアルキル、 C3— C11シクロアル キル、 C3— C12シクロアルキル、 C3— C4置換されたシクロアルキル、 C3— C5置換 されたシクロアルキル、 C3— C6置換されたシクロアルキル、 C3— C7置換されたシク 口アルキル、 C3— C8置換されたシクロアルキル、 C3— C9置換されたシクロアルキ ル、 C3— C10置換されたシクロアルキル、 C3— C11置換されたシクロアルキルまた は C3— C12置換されたシクロアルキルであり得る。例えば、シクロアルキルとしては、 シクロプロピル、シクロへキシルなどが例示される。
[0114] 本明細書において「置換されていてもよいシクロアルキル」とは、上で定義した「シク 口アルキル」または「置換されたシクロアルキル」の 、ずれであってもよ 、ことを意味す る。
[0115] 本明細書において「ァルケニル」とは、分子内に二重結合を一つ有する脂肪族炭 化水素から水素原子が一つ失われて生ずる 1価の基を 、 、、一般に C H 一で表
n 2n-l される（ここで、 nは 2以上の正の整数である）。「置換されたァルケニル」とは、以下に 規定する置換基によってァルケ-ルの Hが置換されたァルケ-ルを!、う。具体例とし ては、 C2— C3ァノレケニノレ、 C2— C4ァノレケニノレ、 C2— C5ァノレケニノレ、 C2— C6ァ ルケ-ル、 C2— C7アルケ-ル、 C2— C8アルケ-ル、 C2— C9アルケ-ル、 C2— C 10ァルケ-ル、 C2— C11ァルケ-ルまたは C2— C12ァルケ-ル、 C2— C3置換さ れたァルケ-ル、 C2— C4置換されたァルケ-ル、 C2— C5置換されたァルケ-ル、 C2— C6置換されたァルケ-ル、 C2— C7置換されたァルケ-ル、 C2— C8置換され たァルケ-ル、 C2— C9置換されたァルケ-ル、 C2— C10置換されたァルケ-ル、 C2— C11置換されたァルケ-ルまたは C2— C12置換されたァルケ-ルであり得る。 ここで、例えば C2— C10アルキルとは、炭素原子を 2— 10個含む直鎖または分枝状 のァルケ-ルを意味し、ビュル（CH =CH— )、ァリル（CH =CHCH―)、 CH CH
2 2 2 3
=CH—などが例示される。また、例えば、 C2— C 10置換されたァルケ-ルとは、 C2 一 C 10ァルケ-ルであって、そのうち 1または複数の水素原子が置換基により置換さ れているものをいう。
[0116] 本明細書において「置換されていてもよいァルケ-ル」とは、上で定義した「ァルケ -ル」または「置換されたァルケ-ル」の 、ずれであってもよ 、ことを意味する。
[0117] 本明細書において「ァルケ二レン」とは、分子内に二重結合を一つ有する脂肪族炭 化水素から水素原子が二つ失われて生ずる 2価の基を 、 、、一般に - C H -で表
n 2n-2 される（ここで、 nは 2以上の正の整数である）。「置換されたァルケ-レン」とは、以下 に規定する置換基によってァルケ-レンの Hが置換されたァルケ-レンを!、う。具体 例としては、 C2— C25ァルケ-レンまたは C2— C25置換されたァルケ-レンが挙げ られ、なかでも特に C2— C3アルケ-レン、 C2— C4アルケ-レン、 C2— C5アルケ- レン、 C2一 C6アルケニレン、 C2一 C7アルケニレン、 C2一 C8アルケニレン、 C2一 C 9ァルケ-レン、 C2— C10ァルケ-レン、 C2— C11ァルケ-レンまたは C2— C12ァ ルケ-レン、 C2— C3置換されたァルケ-レン、 C2— C4置換されたァルケ-レン、 C 2— C5置換されたァルケ-レン、 C2— C6置換されたァルケ-レン、 C2— C7置換さ れたァルケ-レン、 C2— C8置換されたァルケ-レン、 C2— C9置換されたァルケ- レン、 C2— C10置換されたァルケ-レン、 C2— C11置換されたァルケ-レンまたは C2— C12置換されたァルケ-レンが好ましい。ここで、例えば C2— C10アルキルと は、炭素原子を 2— 10個含む直鎖または分枝状のァルケ-レンを意味し、 CH = C H -、 -CH = CHCH -、— (CH ) C = CH-などが例示される。また、例えば、 C2—
2 3
C 10置換されたァルケ-レンとは、 C2— C10ァルケ-レンであって、そのうち 1また は複数の水素原子が置換基により置換されて 、るものを 、う。本明細書にぉ 、て「ァ ルケ-レン」は、酸素原子および硫黄原子力 選択される原子を 1またはそれ以上含 んでいてもよい。
[0118] 本明細書において「置換されていてもよいァルケ-レン」とは、上で定義した「アル ケ-レン」または「置換されたァルケ-レン」の 、ずれであってもよ 、ことを意味する。
[0119] 本明細書において「シクロアルケ-ル」とは、環式構造を有するァルケ-ルをいう。「 置換されたシクロアルケ-ル」とは、以下に規定する置換基によってシクロアルケ-ル の Hが置換されたシクロアルケ-ルをいう。具体例としては、 C3— C4シクロアルケ- ル、 C3— C5シクロアルケ-ル、 C3— C6シクロアルケ-ル、 C3— C7シクロアルケ- ル、 C3— C8シクロアルケ-ル、 C3— C9シクロアルケ-ル、 C3— C10シクロアルケ -ル、 C3— C 11シクロアルケ-ル、 C3— C 12シクロアルケ-ル、 C3— C4置換され たシクロアルケ-ル、 C3— C5置換されたシクロアルケ-ル、 C3— C6置換されたシク ロアルケ-ル、 C3— C7置換されたシクロアルケ-ル、 C3— C8置換されたシクロアル ケ -ル、 C3— C9置換されたシクロアルケ-ル、 C3— C10置換されたシクロアルケ- ル、 C3— C11置換されたシクロアルケ-ルまたは C3— C12置換されたシクロアルケ -ルであり得る。例えば、好ましいシクロアルケ-ルとしては、 1ーシクロペンテ-ル、 2 —シクロへキセニルなどが例示される。
[0120] 本明細書において「置換されていてもよいシクロアルケ-ル」とは、上で定義した「シ クロアルケ-ル」または「置換されたシクロアルケ-ル」の 、ずれであってもよ 、ことを 意味する。 [0121] 本明細書において「アルキニル」とは、アセチレンのような、分子内に三重結合を一 つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる 1価の基を 、い、一 般に C H 一で表される（ここで、 nは 2以上の正の整数である）。「置換されたアルキ n 2n— 3
-ル」とは、以下に規定する置換基によってアルキ-ルの Hが置換されたアルキ-ル をいう。具体例としては、 C2— C3アルキ-ル、 C2— C4アルキ-ル、 C2— C5アルキ ニル、 C2— C6アルキ-ル、 C2— C7アルキ-ル、 C2— C8アルキ-ル、 C2— C9ァ ルキ -ル、 C2— C10アルキ-ル、 C2— C11アルキ-ル、 C2— C12アルキ-ル、 C2 一 C3置換されたアルキ-ル、 C2— C4置換されたアルキ-ル、 C2— C5置換された アルキ -ル、 C2— C6置換されたアルキ-ル、 C2— C7置換されたアルキ-ル、 C2 一 C8置換されたアルキ-ル、 C2— C9置換されたアルキ-ル、 C2— C10置換され たアルキ-ル、 C2— CI 1置換されたアルキ-ルまたは C2— C12置換されたアルキ -ルであり得る。ここで、例えば、 C2— C10アルキ-ルとは、例えば炭素原子を 2— 1 0個含む直鎖または分枝状のアルキ-ルを意味し、ェチニル（CH≡C—）、 1 プロピ -ル（CH C≡C— )などが例示される。また、例えば、 C2— C10置換されたアルキ-
3
ルとは、 C2— C10アルキ-ルであって、そのうち 1または複数の水素原子が置換基 により置換されて 、るものを 、う。
[0122] 本明細書において「置換されていてもよいアルキ-ル」とは、上で定義した「アルキ
-ル」または「置換されたアルキ-ル」の 、ずれであってもよ 、ことを意味する。
[0123] 本明細書において「アルコキシ」とは、アルコール類のヒドロキシ基の水素原子が失 われて生ずる 1価の基をいい、一般に C H O—で表される（ここで、 nは 1以上の整
n 2n+ l
数である)。「置換されたアルコキシ」とは、以下に規定する置換基によってアルコキシ の Hが置換されたアルコキシをいう。具体例としては、 C1一 C2アルコキシ、 C1一 C3 アルコキシ、 C1一 C4アルコキシ、 C1一 C5アルコキシ、 C1一 C6アルコキシ、 C1一 C 7アルコキシ、 C1一 C8アルコキシ、 C1一 C9アルコキシ、 C1一 C10アルコキシ、 C1 一 C11アルコキシ、 C1一 C12アルコキシ、 C1一 C2置換されたアルコキシ、 C1一 C3 置換されたアルコキシ、 C1一 C4置換されたアルコキシ、 C1一 C5置換されたアルコ キシ、 C1一 C6置換されたアルコキシ、 C1一 C7置換されたアルコキシ、 C1一 C8置 換されたアルコキシ、 C1一 C9置換されたアルコキシ、 C1一 C10置換されたアルコキ シ、 CI一 CI 1置換されたアルコキシまたは CI一 C12置換されたアルコキシであり得 る。ここで、例えば、 C1一 C10アルコキシとは、炭素原子を 1一 10個含む直鎖または 分枝状のアルコキシを意味し、メトキシ（CH O—）、エトキシ（C H O—）、 n プロポキ
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シ（CH CH CH 0-)などが例示される。
3 2 2
[0124] 本明細書において「置換されていてもよいアルコキシ」とは、上で定義した「アルコキ シ」または「置換されたアルコキシ」の 、ずれであってもよ 、ことを意味する。
[0125] 本明細書にぉ 、て「ヘテロ環 (基)」とは、炭素およびへテロ原子をも含む環状構造 を有する基をいう。ここで、ヘテロ原子は、 0、 Sおよび N力もなる群より選択され、同 一であっても異なっていてもよぐ 1つ含まれていても 2以上含まれていてもよい。へテ 口環基は、芳香族系または非芳香族系であり得、そして単環式または多環式であり 得る。ヘテロ環基は置換されていてもよい。
[0126] 本明細書において「置換されていてもよいへテロ環 (基)」とは、上で定義した「へテ 口環 (基)」または「置換されたへテロ環 (基)」の 、ずれであってもよ 、ことを意味する
[0127] 本明細書において「アルコール」とは、脂肪族炭化水素の 1または 2以上の水素原 子をヒドロキシル基で置換した有機化合物をいう。本明細書においては、 ROHとも表 記される。ここで、 Rは、アルキル基である。好ましくは、 Rは、 C1一 C6アルキルであり 得る。アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、 1 プロパノール、 2—プロ パノールなどが挙げられるがそれらに限定されない。
[0128] 本明細書にぉ 、て「炭素環基」とは、炭素のみを含む環状構造を含む基であって、 前記の「シクロアルキル」、「置換されたシクロアルキル」、「シクロアルケ-ル」、「置換 されたシクロアルケ-ル」以外の基を 、う。炭素環基は芳香族系または非芳香族系で あり得、そして単環式または多環式であり得る。「置換された炭素環基」とは、以下に 規定する置換基によって炭素環基の Hが置換された炭素環基を 、う。具体例として は、 C3— C4炭素環基、 C3— C5炭素環基、 C3— C6炭素環基、 C3— C7炭素環基 、 C3— C8炭素環基、 C3— C9炭素環基、 C3— C10炭素環基、 C3— C11炭素環基 、 C3— C12炭素環基、 C3— C4置換された炭素環基、 C3— C5置換された炭素環 基、 C3— C6置換された炭素環基、 C3— C7置換された炭素環基、 C3— C8置換さ れた炭素環基、 C3— C9置換された炭素環基、 C3— C10置換された炭素環基、 C3 一 C11置換された炭素環基または C3— C12置換された炭素環基であり得る。炭素 環基はまた、 C4一 C7炭素環基または C4一 C7置換された炭素環基であり得る。炭 素環基としては、フエニル基力 水素原子が 1個欠失したものが例示される。ここで、 水素の欠失位置は、化学的に可能な任意の位置であり得、芳香環上であってもよぐ 非芳香環上であってもよ 、。
[0129] 本明細書にぉ 、て「置換されて 、てもよ 、炭素環基」とは、上で定義した「炭素環基 」または「置換された炭素環基」の 、ずれであってもよ ヽことを意味する。
[0130] 本明細書にぉ 、て「ヘテロ環基」とは、炭素およびへテロ原子をも含む環状構造を 有する基をいう。ここで，ヘテロ原子は、 0、 Sおよび N力もなる群より選択され、同一 であっても異なっていてもよく、 1つ含まれていても 2以上含まれていてもよい。ヘテロ 環基は、芳香族系または非芳香族系であり得、そして単環式または多環式であり得 る。「置換されたへテロ環基」とは、以下に規定する置換基によってへテロ環基の Hが 置換されたへテロ環基をいう。具体例としては、 C3— C4炭素環基、 C3— C5炭素環 基、 C3— C6炭素環基、 C3— C7炭素環基、 C3— C8炭素環基、 C3— C9炭素環基 、 C3— C10炭素環基、 C3— C11炭素環基、 C3— C12炭素環基、 C3— C4置換さ れた炭素環基、 C3— C5置換された炭素環基、 C3— C6置換された炭素環基、 C3 一 C7置換された炭素環基、 C3— C8置換された炭素環基、 C3— C9置換された炭 素環基、 C3— C10置換された炭素環基、 C3— C11置換された炭素環基または C3 一 C 12置換された炭素環基の 1つ以上の炭素原子をへテロ原子で置換したものであ り得る。ヘテロ環基はまた、 C4一 C7炭素環基または C4一 C7置換された炭素環基 の炭素原子を 1つ以上へテロ原子で置換したものであり得る。ヘテロ環基としては、 チェニル基、ピロリル基、フリル基、イミダゾリル基、ピリジル基などが例示される。水 素の欠失位置は、化学的に可能な任意の位置であり得、芳香環上であってもよぐ非 芳香環上であってもよい。
[0131] 本明細書において、炭素環基またはへテロ環基は、下記に定義されるように 1価の 置換基で置換され得ることに加えて、 2価の置換基で置換され得る。そのような二価 の置換は、ォキソ置換 ( = O)またはチォキソ置換（ = S)であり得る。 [0132] 本明細書にぉ 、て「ハロゲン」とは、周期表 7B族に属するフッ素 (F)、塩素（C1)、 臭素（Br)、ヨウ素（I)などの元素の 1価の基をいう。
[0133] 本明細書にぉ 、て「ヒドロキシ」とは、 OHで表される基を 、う。「置換されたヒドロキ シ」とは、ヒドロキシの Hが下記で定義される置換基で置換されて 、るものを 、う。
[0134] 本明細書にぉ 、て「チオール」とは、ヒドロキシ基の酸素原子を硫黄原子で置換し た基 (メルカプト基)であり、 SHで表される。「置換されたチオール」とは、メルカプト の Hが下記で定義される置換基で置換されて 、る基を 、う。
[0135] 本明細書において「シァノ」とは、—CNで表される基をいう。「ニトロ」とは、 -NOで
2 表される基をいう。「ァミノ」とは、 NHで表される基をいう。「置換されたァミノ」とは、
2
ァミノの Hが以下で定義される置換基で置換されたものをいう。
[0136] 本明細書において「カルボキシ」とは、 COOHで表される基をいう。「置換された力 ルボキシ」とは、カルボキシの Hが以下に定義される置換基で置換されたものをいう。
[0137] 本明細書にぉ 、て「チォカルボキシ」とは、カルボキシ基の酸素原子を硫黄原子で 置換した基をいい、 -C ( = S) OH、 -C ( = 0) SHまたは- CSSHで表され得る。「置 換されたチォカルボキシ」とは、チォカルボキシの Hが以下に定義される置換基で置 換されたものをいう。
[0138] 本明細書において「ァシル」とは、カルボン酸から OHを除いてできる 1価の基をいう 。ァシル基の代表例としては、ァセチル（CH CO— )、ベンゾィル（C H CO—)などが
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挙げられる。「置換されたァシル」とは、ァシルの水素を以下に定義される置換基で置 換したものをいう。
[0139] 本明細書にぉ 、て「アミド」とは、アンモニアの水素を酸基 (ァシル基)で置換した基 であり、好ましくは、 CONHで表される。「置換されたアミド」とは、アミドが置換され
2
たものをいう。
[0140] 本明細書において「カルボ-ル」とは、アルデヒドおよびケトンの特性基である (C
=〇）—を含むものを総称したものをいう。「置換されたカルボ-ル」は、下記において 選択される置換基で置換されているカルボ-ル基を意味する。
[0141] 本明細書にぉ 、て「チォカルボ-ル」とは、カルボニルにおける酸素原子を硫黄原 子に置換した基であり、特性基 (C = S)—を含む。チォカルボ-ルには、チオケトン およびチォアルデヒドが含まれる。「置換されたチォカルボ-ル」とは、下記において 選択される置換基で置換されたチォカルボニルを意味する。
[0142] 本明細書にぉ 、て「スルホ -ル」とは、特性基である—SO —を含むものを総称した
2
ものをいう。「置換されたスルホニル」とは、下記において選択される置換基で置換さ れたスルホニルを意味する。
[0143] 本明細書にぉ 、て「スルフィエル」とは、特性基である— SO—を含むものを総称した ものをいう。「置換されたスルフィエル」とは、下記において選択される置換基で置換 されて!/、るスルフィエルを意味する。
[0144] 本明細書において「ァリール」とは、芳香族炭化水素の環に結合する水素原子が 1 個離脱して生ずる基をいい、本明細書において、炭素環基に包含される。
[0145] 本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換 基中の 1または 2以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。 水素原子を 1つ除去して 1価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子 を 2つ除去して 2価の置換基に置換することも可能である。
[0146] 本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換 基中の 1または 2以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。 水素原子を 1つ除去して 1価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子 を 2つ除去して 2価の置換基に置換することも可能である。
[0147] 本発明における置換基としては、アルキル、シクロアルキル、ァルケ-ル、シクロア ルケ-ル、アルキ -ル、アルコキシ、炭素環基、ヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、チ オール、シァ入ニトロ、アミ入カルボキシ、力ルバモイル、ァシル、ァシルァミノ、チォ カルボキシ、アミド、置換されたカルボ-ル、置換されたチォカルボ-ル、置換された スルホ-ルまたは置換されたスルフィエルが挙げられるがそれらに限定されな 、。こ のような置換基は、本発明において、アミノ酸の設計のときに、適宜利用することがで きる。
[0148] 好ましくは、置換基は、複数存在する場合それぞれ独立して、水素原子またはアル キルであり得るが、複数の置換基全てが水素原子であることはない。より好ましくは、 独立して、置換基は、複数存在する場合それぞれ独立して、水素および C1一 C6ァ ルキルカもなる群より選択され得る。置換基は、すべてが水素以外の置換基を有して いても良いが、好ましくは、少なくとも 1つの水素、より好ましくは、 2— n (ここで nは置 換基の個数)の水素を有し得る。置換基のうち水素の数が多いことが好ましくあり得る 。大きな置換基または極性のある置換基は本発明の効果 (特に、アルデヒド基との相 互作用）に障害を有し得る力もである。従って、水素以外の置換基としては、好ましく は、 C1一 C6アルキル、 C1一 C5アルキル、 C1一 C4アルキル、 C1一 C3アルキル、 C1一 C2アルキル、メチルなどであり得る。ただし、本発明の効果を増強し得ることも あることから、大きな置換基を有することもまた好ましくあり得る。
[0149] 本明細書において、 Cl、 C2、、、 Cnは、炭素数を表す。従って、 C1は炭素数 1個 の置換基を表すために使用される。
[0150] 本明細書において、「光学異性体」とは、結晶または分子の構造が鏡像関係にあつ て、重ねあわせることのできない一対の化合物の一方またはその組をいう。立体異性 体の一形態であり、他の性質は同じであるにもかかわらず、旋光性のみが異なる。
[0151] 本明細書において「保護反応」とは、 Bocのような保護基を、保護が所望される官能 基に付加する反応をいう。保護基により官能基を保護することによって、より反応性の 高い官能基の反応を抑制し、より反応性の低い官能基のみを反応させることができる 。保護反応は、例えば、脱水反応により行うことができる。
[0152] 本明細書にぉ ヽて「脱保護反応」とは、 Bocのような保護基を脱離させる反応を ヽぅ 。脱保護反応としては、 PdZCを用いる還元反応のような反応が挙げられる。脱保護 反応は、例えば、加水分解により行うことができる。
[0153] 本明細書にぉ 、て「保護基」としては、例えば、フルォレニルメトキシカルボ-ル（F moc)基、ァセチル基、ベンジル基、ベンゾィル基、 t ブトキシカルボ-ル基、 tーブチ ルジメチル基、シリル基、トリメチルシリルェチル基、 N-フタルイミジル基、トリメチルシ リルェチルォキシカルボ-ル基、 2—-トロー 4, 5—ジメトキシベンジル基、 2--トロ- 4, 5-ジメトキシベンジルォキシカルボ-ル基、力ルバメート基などが代表的な保護基と して挙げられる。保護基は、例えば、アミノ基、カルボキシル基などの反応性の官能 基を保護するために用いることができる。反応の条件や目的に応じ、種々の保護基を 使い分けることができる。ヒドロキシ基の保護基にはァセチル基、ベンジル基、シリル 基またはそれらの誘導体など力 ァミノ基の保護基にはァセチル基のほかべンジル ォキシカルボ-ル基、 t ブトキシカルボニル基またはそれらの誘導体などを使用する ことができる。アミノォキシ基および N-アルキルアミノォキシ基の保護基として、トリメ チルシリルェチルォキシカルボ-ル基、 2-ニトロ- 4, 5-ジメトキシベンジルォキシカ ルポニル基またはそれらの誘導体が好まし 、。
[0154] 本発明の各方法において、 目的とする生成物は、反応液から夾雑物 (未反応減量 、副生成物、溶媒など)を、当該分野で慣用される方法 (例えば、抽出、蒸留、洗浄、 濃縮、沈澱、濾過、乾燥など）によって除去した後に、当該分野で慣用される後処理 方法 (例えば、吸着、溶離、蒸留、沈澱、析出、クロマトグラフィーなど)を組み合わせ て処理して単離し得る。
[0155] (糖鎖が結合した糖タンパク質の製造）
本願発明の糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質と糖鎖とを 用いて、糖鎖が結合した糖タンパク質を製造することができる。糖鎖が結合した糖タ ンパク質の製造は、 2つの材料を、適切な緩衝液の存在下で混合し、適切な温度で 、適切な時間反応させることによって、行うことができる。そのような条件の選択は、本 明細書の記載に基づ 、て行うことができる。
[0156] 本発明において製造される糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパ ク質を、例えば、 E. coliなどの発現系により製造した後、製造されたタンパク質を適 切な手段 (例えば、ァフィユティー精製クロマトグラフィーなど）により精製し、必要に 応じて凍結乾燥させる。
[0157] その後、製造された糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質を、 所望の糖鎖 (例えば、ラタトース、マンノペンタオースなどのオリゴマンノース、ルイス b 、シァリルルイス Xなど）と適切な緩衝液の存在下で混合する。ここで用いられる緩衝 液としては、例えば、酢酸緩衝系、燐酸緩衝系、トリス緩衝系などを用いることができ る。
[0158] 本発明において、使用される糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタン パク質および糖鎖の濃度は、反応が進む限り、どのような濃度で使用してもよい。また 、 1 : 1での反応が想定されることから、ほぼ同モル濃度で反応させることが望ましいが それに限定されない。従って、使用される相対比としては、例えば、 1 : 10— 10: 1な どを使用することができる。そのような相対比は、糖鎖に結合し得る官能基を有するァ ミノ酸を含むタンパク質と、使用される糖鎖との相対関係に依存することが理解され、 そのような相対関係は、本明細書に基づいて当業者が理解することができる。
[0159] 使用される糖鎖の絶対濃度としては、例えば、 ImM— 2Mなどを挙げることができ 、好ましくは、 10mM— 1Mなどを挙げることができる。
[0160] 使用される糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質の濃度とし てもまた、例えば、 ImM— 2Mなどを挙げることができ、好ましくは、 10mM— 1Mな どを挙げることができる。
[0161] 本発明では、糖鎖の付加反応は、接触が起こる限り、原理的に進むことが理解され る力 好ましくは、例えば、 25°C— 80°Cで反応が進むことが理解される。適切な温度 の上限としては、例えば、 80°C、 70°C、 60°C、 50°C、 42°C、 40°Cなどが挙げられる がそれらに限定されない。そのような温度は、タンパク質の種類にもより、熱変性しや すいタンパク質は、上限が、例えば、 37°Cなどであり得る。適切な温度の下限として は、例えば、 25°C、 30°C、 32°C、 37°Cなどであり得る。適切な温度の下限は、反応 速度との関係から、必要な時間を考慮して当業者は適宜決定することができる。
[0162] 反応時間もまた、当業者が、本明細書の記載を参酌して、適宜決定することができ る。そのような時間としては、例えば、 6時間一 5日などを挙げることができるがそれら に限定されない。
[0163] 反応時間の下限としては、例えば、数時間（1時間、 2時間、 3時間、 4時間、 5時間 、 6時間など)、 1日、数日（2— 3日）などを挙げることができるが、それらに限定されず 、当業者は、反応速度および効率などを考慮して本明細書の記載に基づいて適宜 決定することができる。反応時間の上限としては、例えば、数日（2— 3日）、 5日、 6日 、 10日などを挙げることができるがそれらに限定されない。生産された糖タンパク質 が分解したり、変性しない程度に反応時間の上限を設定することが望ましい。
[0164] (本明細書において用いられる一般技術）
本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当 該分野の技術範囲内にある、マイクロフルイデイクス、微細加工、有機化学、生化学 、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野における周知慣 用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細 書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。
[0165] 微細加工については、例えば、 Campbell, S. A. (1996) . The Science and
Engineering of Microelectronic Fabrication, Oxford University Pres s ;Zaut， P. V. (1996) . Micromicroarray Fabrication : a Practical Guide to Semiconductor Processing, Semiconductor Services； Madou, M. J. ( 1997) . Fundamentals of Microfabrication, CRC1 5 Press ;Rai—Choud hury, P. (1997) . Handbook of Microlithography, Micromachining, & Microfabrication: Microlithographyなどに記載されており、これらは本明細書に おいて関連する部分が参考として援用される。
[0166] 本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手 法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、 Maniatis, Τ· e t al. (1989) . Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその 3rd Ed. (2001)； Ausubel, F. M.， et al. eds, Cur rent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc.， N Y， 10158 (2000) ;Innis, M. A. (1990) . PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Academic Press ;Innis, M. A. et al. (1995 ) . PCR Strategies, Academic Press ; Sninsky, J. J. et al. (1999) . PCR Applications : Protocols for Functional Genomics, Academic Press ; G ait, M. J. (1985) . Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach, IR L Press ; Gait, M. J. (1990) . Oligonucleotide Synthesis : A Practical A pproach, IRL Press ; Eckstein, F. (1991) . Oligonucleotides and Analog ues : A Practical Approac , IRL Press ; Adams, R. L. et al. (1992) . Th e Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall； Shabarova, Z. et al. (1994) . Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, We inheim ; Blackburn, G. M. et al. (1996) . Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press ;Hermanson, G. T. (199o) . Bioc onjugate Techniques, Academic Press ; Method in Enzymology 230、 242、 247、 Academic Press, 1994 ;別冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実 験法」羊土社、 1997 ;畑中、西村ら、糖質の科学と工学、講談社サイェンティフイク、 1997 ;糖鎖分子の設計と生理機能 日本化学会編、学会出版センター、 2001など に記載されており、これらは本明細書において関連する部分 (全部であり得る）が参 考として援用される。
[0167] (医薬'ィ匕粧品など、およびそれを用いる治療、予防など）
別の局面において、本発明は、医薬 (例えば、ワクチン等の医薬品、健康食品、残 さタンパク質又は脂質は抗原性を低減した医薬品）およびィ匕粧品に関する。この医 薬およびィ匕粧品は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医 薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意 の物質が挙げられる。
[0168] そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤 、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増 量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および/または薬学的アジュバント挙 げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、単離された多能 性幹細胞、またはその改変体もしくは誘導体を、 1つ以上の生理的に受容可能なキ ャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切 なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、 非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
[0169] 本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエン トに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不 活性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クェン酸塩、または他の有機酸;ァス コルビン酸、 α—トコフエロール;低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清ァ ルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビュルピロリ ドン）；アミノ酸 (例えば、グリシン、グルタミン、ァスパラギン、アルギニンまたはリジン） ；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデ キストリンを含む）；キレート剤（例えば、 EDTA)；糖アルコール (例えば、マン-トー ルまたはソルビトール）；塩形成対イオン (例えば、ナトリウム）；ならびに Zあるいは非 イオン性表面活性化剤（例えば、 Tween、プル口ニック (pluronic)またはポリエチレ ングリコール（PEG) )。
[0170] 例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと 混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤 (例 えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希 釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、 pH7. 0-8 . 5の Tris緩衝剤または pH4. 0-5. 5の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソル ビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
[0171] 本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医 薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用 される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る 。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、 pH、等張性、安定性などを考慮 することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は 、経口投与、非経口投与 (例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与 、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など)であり得る 。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製 剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。
[0172] 本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安 定化剤 (日本薬局方第 14版またはその最新版、 Remington' s Pharmaceutical sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed. , MacK Publishing Compan y, 1990などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合すること〖こ よって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
[0173] 本発明の処置方法において使用される糖鎖組成物の量は、使用目的、対象疾患（ 種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類など を考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体 (ま たは患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患 (種類、重篤度など)、患者 の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決 定することができる。頻度としては、例えば、毎日 数ケ月に 1回（例えば、 1週間に 1 回ー1ヶ月に 1回）の投与が挙げられる。 1週間ー1ヶ月に 1回の投与を、経過を見なが ら施すことが好ましい。
[0174] 本発明が化粧品として使用されるときもまた、当局の規定する規制を遵守しながら 化粧品を調製することができる。
[0175] (農薬）
本発明の組成物は、農薬の成分としても用いることができる。農薬組成物として処 方される場合、必要に応じて、農学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤 などを含み得る。
[0176] 本発明の組成物が、農薬として使用される場合は、除草剤 (ビラゾレートなど)、殺 虫'殺ダニ剤 (ダイアジノンなど)、殺菌剤 (プロべナゾールなど)、植物成長調整剤 ( 例、ノクロブトラゾールなど）、殺線虫剤（例、べノミルなど）、共力剤（例、ピぺ口-ル ブトキサイドなど）、誘引剤 (例、オイゲノールなど）、忌避剤 (例、クレオソートなど）、 色素 (例、食用青色 1号など)、肥料 (例、尿素など)などもまた必要に応じて混合され 得る。
[0177] (保健'食品）
本発明はまた、保健'食品分野においても利用することができる。このような場合、 上述の経口医薬として用いられる場合の留意点を必要に応じて考慮すべきである。 特に、特定保健食品のような機能性食品'健康食品などとして使用される場合には、 医薬に準じた扱いを行うことが好ましい。好ましくは、本発明の糖鎖組成物は、低ァレ ルゲン食品としても用いることができる。
[0178] (好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本 発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に 限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参 酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
[0179] (糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質の生産および糖タン パク質を生産するための方法） 1つの局面において、本発明は、（a)糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を 含み、 4塩基コドンを認識する改変 tRNAを提供する工程；（b)該 4塩基コドンまたは その相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子を提供する工程であって、該核酸 配列は該 4塩基コドンに 1アミノ酸を対応させたときに、目的の糖タンパク質のタンパ ク質部分をコードする、工程；（c)該改変核酸分子を転写して mRNAを生成するェ 程；および (d)該改変 tRNAおよび翻訳に必要なセットの tRNAを含むタンパク質合 成系に該 mRNAを曝してタンパク質を生成する工程を含む、糖鎖に結合し得る官能 基を有するアミノ酸を含むタンパク質を生産するための方法を提供する。本発明では また、別の局面において、本発明のこの糖タンパク質生産するための基質となるタン ノ^質を生産する方法によって得られたタンパク質と所望の糖鎖とを結合させて糖タ ンパク質を生成する工程、を包含する、糖タンパク質 (例えば、生物学的に活性を有 する糖タンパク質)を製造するための方法を提供する。本発明では、糖タンパク質を、 所望の位置に、所望の糖鎖を導入した形態で提供することができ、あるいは、そのた めの基質を提供することができ、し力も、その操作が容易であり、従来より高い収率で 所望の糖タンパク質を得ることができること、従来より高い選択性を持って糖タンパク 質 (例えば、医薬、農薬、食品など)を設計することができるという点で有用であり、顕 著な効果を奏する。
[0180] 本発明の方法において、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含み、 4塩基 コドンまたはそれ以上の塩基 (例えば、 5塩基)を認識する改変 tRNAは、任意のアミ ノ酸の任意の基 (例えば、側鎖中の水素）を糖鎖に結合し得る官能基に置換して糖 鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を得、およびその糖鎖に結合し得る官能基を 有するアミノ酸を tRNAに結合することによって提供することができる。このような改変 tRNAは、例えば、 3塩基コドンを認識するアンチコドンの部分を所望の 4塩基コドン または 5塩基コドンなどを認識するアンチコドンに置換するように変異を入れることに よって作製することができる。そのような変異は、当該分野において周知の部位特異 的変異誘発方法などを用いて導入することができる。
[0181] 本発明にお 、て、 4塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸 分子は、当該分野において周知の任意の方法を用いて作製することができる。その ような作製方法としては、例えば、 PCR、オリゴヌクレオチド自動合成などによって D NAを生成することなどが挙げられるがそれらに限定されない。ここで、本発明の改変 核酸分子は、 4塩基コドンに 1アミノ酸を対応させたときに目的の糖タンパク質のタン パク質部分をコードする核酸配列を含むように構築される。当業者は、どのような核 酸配列を含む核酸分子であっても、そのような核酸分子を任意に設計し、作製するこ とができることが理解される。
[0182] 本発明において、改変核酸分子の転写による mRNAの生成は、当該分野におい て周知の任意の転写方法を用いて実施することができる。そのような mRNAの生成 は、テンプレートとなる DNA (例えば、本発明の改変核酸分子）およびその転写を触 媒する酵素（例えば、 DNA依存性 RNAポリメラーゼ）、基質となる RNA分子、およ び必要に応じて他の調節因子、補因子などを用いて行うことができる。
[0183] 本発明において、改変 tRNAおよび翻訳に必要なセットの tRNAを含むタンパク質 合成系に mRNAを曝してタンパク質を生成することもまた、当該分野にお!、て周知 の任意の系（例えば、無細胞合成系、あるいは細胞合成系など）を用いて実施するこ とができる。翻訳に必要なセットの tRNAは、目的とするタンパク質において含まれる べきアミノ酸を含む tRNAを少なくとも 1種類ずつ含むことで十分である。従って、目 的とするタンパク質が 20種類のアミノ酸力も構成されるときは、通常、その 20種類の アミノ酸に対応する tRNAを少なくとも 1つずつ有する。好ましくは、 64種類のコドン すべてに対応する tRNAを含むことが有利であるがそれに限定されない。コドン数が 少ない場合は、それに応じて本発明の改変核酸分子の核酸配列を変更することによ つて、目的の糖タンパク質を生産することができる。目的とするタンパク質が 19種類 以下のアミノ酸で構成される場合は、 19種類以下のアミノ酸に対応する tRNAを含 むことで十分であり得る。
[0184] 本発明にお ヽて、タンパク質と所望の糖鎖とを結合させて糖タンパク質を生成する 技術もまた、当該分野において公知の化学的方法または酵素学的方法などを用い て実施することができる。化学的方法であれば、本発明の糖鎖に結合し得る官能基 力 糖と結合する条件に本発明の方法で生成したタンパク質と所望の糖鎖とを含む 反応混合物を曝すことによって実現される。酵素学的方法であれば、脱水縮合など を触媒する酵素を適切な条件下で本発明の方法で生成したタンパク質と所望の糖鎖 とを含む反応混合物を曝すことによって実現される。
[0185] 1つの実施形態において、本発明において、使用される糖鎖に結合し得る官能基 を有するアミノ酸を含むタンパク質および糖鎖の濃度は、反応が進む限り、どのような 濃度で使用してもよい。また、 1 : 1での反応が想定されることから、ほぼ同モル濃度で 反応させることが望ましいがそれに限定されない。従って、使用される相対比としては 、例えば、 1 : 10— 10 : 1、 5 : 1— 1 : 5、 2 : 1— 1 : 2などを使用することができる。そのよ うな相対比は、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質と、使用さ れる糖鎖との相対関係に依存することが理解され、そのような相対関係は、本明細書 に基づいて当業者が理解することができる。糖鎖の濃度としては、任意の濃度を使用 することができ、例えば、 ImM— 2M、 10mM— 1M、 50mM— 500mMなどの間で あればどのような濃度でもよい。好ましくは 50mM— 300mMであり得る。
[0186] 1つの実施形態において、本発明において使用される糖鎖に結合し得る官能基を 有するアミノ酸を含むタンパク質の濃度としてもまた、例えば、 ImM— 2Mなどを挙げ ることができ、例えば、 10mM— 1M、 20mM— 500mM、 50mM— 200mMなどを 挙げることができるがそれらに限定されない。
[0187] 1つの実施形態において、糖鎖とタンパク質との結合反応は、接触が起こる限り、原 理的に進むことが理解されることから任意の温度で行うことができ、好ましくは、例え ば、 25°C— 80°Cが使用される。適切な温度の上限としては、例えば、 80°C、 70°C、 60°C、 50°C、 42°C、 40°Cなどが挙げられるがそれらに限定されない。そのような温 度は、タンパク質の種類にもより、熱変性しやすいタンパク質は、上限が、例えば、 37 °Cなどであり得る。適切な温度の下限としては、例えば、 25°C、 30°C、 32°C、 37°Cな どであり得る。適切な温度の下限は、反応速度との関係から、必要な時間を考慮して 当業者は適宜決定することができる。従って、例えば、使用可能な温度範囲としては 、 25°C— 60°C、 25°C— 50°C、 30°C— 42°Cなどが例示され得るがそれらに限定さ れない。
[0188] 反応時間もまた、当業者が、本明細書の記載を参酌して、適宜決定することができ る。そのような時間としては、例えば、 6時間一 5日などを挙げることができるがそれら に限定されない。反応時間の下限としては、例えば、数時間（1時間、 2時間、 3時間 、 4時間、 5時間、 6時間など）、 1日、数日（2— 3日）などを挙げることができるが、それ らに限定されず、当業者は、反応速度および効率などを考慮して本明細書の記載に 基づいて適宜決定することができる。反応時間の上限としては、例えば、数日（2— 3 日）、 5日、 6日、 10日などを挙げることができるがそれらに限定されない。生産された 糖タンパク質が分解したり、変性しない程度に反応時間の上限を設定することが望ま しい。
[0189] 反応したものの同一性は、質量分析、 NMRなどによって分析することができる。
[0190] 本発明の好ましい実施形態では、使用され得る糖鎖に結合し得る官能基は、ァミノ ォキシ基、 N—アルキルアミノォキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チォセミカルバジド基 およびシスティン残基などが挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、 アミノォキシ基、 N—アルキルアミノォキシ基などを使用することができる。最も好ましく は、アミノォキシ基である。これらの官能基は、保護基によって保護されていてもよい
[0191] 本発明の好ましい実施形態では、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸は、天 然アミノ酸に糖鎖に結合し得る官能基を含むアミノ酸誘導体であり得るがそれらに限 定されない。天然アミノ酸の形態に近いアミノ酸誘導体を使用する方が、もともと有す る生物学的活性を保持する可能性が高いからであるが、所望の生物学的活性などを 有する限り、天然アミノ酸以外のアミノ酸に糖鎖に結合し得る官能基を含むアミノ酸 誘導体を使用してもよいことが理解される。好ましいアミノ酸としては、例えば、チロシ ン、ホモセリン、セリンまたはその誘導体が挙げられるがそれらに限定されない。
[0192] 本発明の改変 tRNAにおいて使用される 4塩基コドンとしては、 CUCU、 CUCA、 CCCU、 CGGU、 CGGGなどのアンチコドンが挙げられるがそれらに限定されず、よ り好ましくは CGGGが使用される。
[0193] 1つの好ましい実施形態において、本発明において使用されるタンパク質合成系は 、 4 (またはそれ以上の）塩基コドンの最初の 3塩基力もなるコドンに対応する tRNAを 有しない。このような 3塩基コドンは、本発明の 4塩基コドンなどと競合するからである 。そのような場合は、除かれる 3塩基コドンに対応するコドンを、あらかじめ目的のタン ノ ク質をコードする核酸配列から除くか別のコドン (好ましくは、同じアミノ酸をコード する）に変更しておくことが好ましい。
[0194] 別の好ましい実施形態では、本発明において使用されるタンパク質合成系は、 4塩 基コドンの最初の 3塩基および最後の 3塩基からなるコドンに対応する tRNAを有し ない。あるいは、 5塩基以上のコドンが用いられる場合は、その 5塩基以上のコドンに おける任意の 3塩基コドンに対応する tRNAを有しないことが好ましい。上記同様、そ のような場合は、除かれる 3塩基コドンに対応するコドンを、あらかじめ目的のタンパク 質をコードする核酸配列から除くか別のコドン (好ましくは、同じアミノ酸をコードする） に変更しておくことが好まし 、。
[0195] 好まし 、実施形態にぉ 、て、本発明の改変 tRNAの 4塩基コドンの認識は、その改 変 tRNAがアンチコドンとして 4塩基コドンの相補配列を有することによって達成され る。そのような 4塩基コドンの相補配列を tRNAに含ませる技術は、当該分野におい て周知であり、部位特異的変異誘発方法などを用いて、対応する DNAレベルで行う こと〖こよって行うことが例示される。
[0196] 本発明において使用されるタンパク質合成系は、本発明の改変 tRNAを、天然 tR NAに比べて有意に多い量で含むことが好ましい。ここで、改変 tRNAは、競合する 3 塩基コドン (例えば、最初の 3連続のコドンなど）を有する天然 tRNAに比較して有意 に多い量で含まれることで十分であり得る。ここで、好ましくは、タンパク質合成系は、 本発明の改変 tRNAを、天然 tRNAまたは特定の競合する tRNAの少なくとも 1. 1 倍、少なくとも 1. 2倍、少なくとも 1. 3倍、少なくとも 1. 4倍、少なくとも 1. 5倍、少なく とち 2倍、少なくとち 3倍、少なくとち 4倍、少なくとち 5倍、少なくとち 10倍、少なくとち 10 0倍、少なくとも 1000倍の量で含んでいてもよい。 1一 100倍の範囲が好ましいようで あるが、それに限定されない。
[0197] あるいは、本発明において使用されるタンパク質合成系は、 4塩基コドンの最初の 3 塩基からなるコドンに対応する tRNAを他の tRNAよりも有意に少なく含んでいてもよ い。ここで、好ましくは、 4塩基コドンの最初の 3塩基からなるコドンに対応する tRNA を他の tRNAの 1一 0. 01倍、より好ましくは 0. 5—0. 1倍含む。
[0198] 好ましい実施形態において、本発明の方法では、 4塩基コドンを 3塩基コドンとして 読んだ場合に生成するタンパク質が混入することが予測されることから、本発明の方 法は、そのようなタンパク質を取り除く工程をさらに包含し得る。このようなタンパク質 除去は、分子量の違!、または存在する 2種類のタンパク質にお 、て相違するアミノ酸 配列に起因する活性に基づいて分離し、必要でないものを取り除くことによって実施 することができる。例えば、分子量カラム、ァフィユティーカラム、電気泳動などが挙げ られるがそれらに限定されない。
[0199] 従って、本発明において、 4塩基コドンを 3塩基コドンとして読んだ場合に生成する タンパク質力 塩基コドンを 4塩基コドンとして読んだ場合に生成するタンパク質と、有 意に分子量が異なるように設計されることが好ましい。そのような設計は、当該分野に おいて周知の技術を用いて、遺伝コドンを参酌しながら実施することができる。
[0200] 好ましい実施形態において、本発明において使用される糖鎖に結合し得る官能基 を有するアミノ酸としては、以下の式：
[0201] [化 23]
Figure imgf000059_0001
力もなる群より選択される化合物およびその保護体が挙げられる。ここで、このアミノ 酸は、代表的には、本発明の改変 tRNAと、そのアミノ酸自体のカルボキシル基にお いて結合する。
[0202] 本発明の核酸分子は、直鎖状または環状ベクターとして提供される。当該分野に おいて、インビトロで翻訳を行うタンパク質合成系には、直鎖状の核酸分子をテンプ レートとして用いるものと、環状 DNAをテンプレートとして用いるものとが存在する。 直鎖状のものは、代表的に mRNAを直接使用することによって翻訳がなされる。環 状 DNAを用いるものは、タンパク質をコードする核酸を含むベクターとして提供され る。このようなキットは、例えば、 Promegaなどから市販されており、本明細書におい てはいずれも使用することができる。 mRNAをテンプレートとして用いるものは、例示 的に、 RNAポリメラーゼのプロモーターに T7プロモーターを導入して、転写をインビ トロで行うように設計されている。環状 DNAを用いるものは、例示的に、 T7プロモー ターを有するベクターから、転写および翻訳を反応液中において行うことができる。こ のようなキットとしては、例えば、 E. coliT7S30 Extract System for Circlar DN A, TNT Coupled Reticulocyte Lysate System Kitなどをあげることができ る。従って、本発明の改変核酸分子は、インビトロ系において機能するプロモーター 配列を含んでいてもよい。ここで、このプロモーター配列は、代表的に、 T7プロモー ター配列であり得る。
[0203] 本発明にお 、て使用される、改変 tRNAとしては、例えば、配列番号 1、配列番号 2 に示す配列またはその改変体を含む。ここで、改変 tRNAの改変体は、アンチコドン 、アミノアシルイ匕などの部位に実質的に改変を含まず、 tRNAの機能を有する限り、 どのような改変を有していてもよい。従って、改変 tRNAの改変体には、核酸配列に おいて 1または複数個の置換、付加、または欠失が含まれていても良いことが理解さ れる。
[0204] 本明細書の方法では、 mRNAへの転写およびタンパク質への翻訳は、同じ工程で 同時に行っても、別々に行っても良い。同じ工程で行う方が好ましい。工程数が減少 するカゝらである。
[0205] (糖鎖導入のための tRNAを生産するための方法）
別の局面において、本発明は、（i)糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を保 護して保護アミノ酸を生成する工程；（ii) 5'—ホスホー 2'—デォキシリボヌクレオチジル リボヌクレオチド (pdNpN)を提供する工程； (iii)該保護アミノ酸と該 pdNpNとを脱水 縮合して保護 pdNpNアミノ酸を生成する工程； (iv) 4塩基コドンを認識する改変 tRN Aを提供する工程；（V)該改変 tRNAと該保護 pdNpNアミノ酸とを連結して保護 pdN pNアミノ酸連結 tRNAを提供する工程；および (vi)該保護 pdNpNアミノ酸が連結し た改変 tRN Aを脱保護して pdNpNアミノ酸が連結した tRN Aを生成する工程、を包 含する、糖鎖導入のための tRNAを生産するための方法を提供する。
[0206] 本発明の方法において、アミノ酸の保護は、当該分野において周知の任意の方法 を用いて行うことができる。アミノ酸の保護は、カルボキシル基、アミノ基、および Zま たは側鎖の反応性の官能基のいずれかまたはその複数の組み合わせまたはすベて に対して行うことができる。例えば、ァミノ基には、ァセチル基、 2—二トロー 4, 5 ジメト キシベンジルォキシカルボ-ル基、ベンジルォキシカルボ-ル基， t ブトキシカルボ -ル基などのォキシカルボ-ル基が結合した基などを保護基として使用することがで きる。あるいは、カルボキシル基には、アルキルカルボ-ル、ベンジルカルボ-ル、シ ァノメチルォキシカルボニルまたはその誘導体などとして保護することができる。
[0207] 本発明の方法において、 5' ホスホー 2'—デォキシリボヌクレオチジルリボヌクレオ チド (pdNpN)は、当該分野において周知の任意の方法によって生成することができ る。あるいは、巿販の製品を使用しても良い。ここで、 pdNpNにおけるデォキシリボヌ クレオチジルは、 13—D チミジン、 2，ーデォキシー β D—シチジン、 2，ーデォキシー β —D アデノシン、 2，ーデォキシー β—D グアノシン、 2，ーデォキシー β—D—ゥラシル、 2しデォキシ jS -D-イノシンであり得る。 pdNpNにおけるリボヌクレオチジルは、 β —D—シチジン、 j8— D アデノシン、 β— D—グアノシン、 j8— D—ゥラシノレ、 j8— D イノ シンなどであり得る。
[0208] 好ましい実施形態では、本発明において用いられる pdNpNは、 5 ' ホスホー 2'—デ ォキシリボシチジリルリボアデノシン (pdCpA)である。本発明で用いる 4塩基コドンを 用いた拡張コドンを利用したタンパク質の合成において首尾よく合成が進拔すること が知られている力 である。
[0209] 本発明にお 、て、保護アミノ酸と pdNpNとを脱水縮合することによって、保護 pdNp Nアミノ酸を生成する技術もまた、当該分野において周知の技術によって達成するこ とができる。そのような技術としては、例えば、適切な条件下で、保護アミノ酸と、 pdN pNとを混合して必要に応じて触媒を混合してやることによって実施する方法などがあ る。そのような技術においては、例えば、 pdNpNは、反応性の少ない溶媒 (例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなど）に溶解することができる。反 応は、ァセトニトリルを用いることができる。
[0210] 本発明の方法にぉ 、て、 4塩基コドンを認識する改変 tRNAは、当該分野にお!、て 周知の方法を用いて生成することができる。例えば、既知の tRNAのアンチコドン部 分に、部位特異的変異誘発方法によってその 4塩基コドンを認識する配列 (代表的 にはその 4塩基コドンのアンチコドン)を置換することによって作製することができる。 [0211] 本発明の方法において、改変 tRNAと保護 pdNpNアミノ酸とを連結して保護 pdNp Nアミノ酸連結 tRNAを提供する方法は、当該分野にお!、て周知の任意の方法を用 いて実行することができる。そのような連結方法では、例えば、 T4RNAリガーゼを使 用することができる。
[0212] 本発明の方法において、保護 pdNpNアミノ酸が連結した改変 tRNAを脱保護して pdNpNアミノ酸が連結した tRNAを生成する技術もまた、当該分野にお!、て周知の 任意の脱保護方法を用いて実施することができる。
[0213] 本発明の pdNpNアミノ酸が連結した tRNAにおいて、使用されるアミノ酸材料とし ては、天然アミノ酸または非天然アミノ酸が挙げられる。いずれを使用しても良いが、 好ましくは、挿入された糖タンパク質において目的の活性 (例えば、生物学的活性） が損なわれていないことが好ましい。従って、 1つの実施形態では、天然アミノ酸を用 いることが好ましくあり得る。そのようなアミノ酸としては、例えば、チロシン、ホモセリン 、セリンなどを挙げることができるがそれらに限定されない。
[0214] 本発明の方法において使用される保護基としては、 Fmoc基、ァセチル基、ベンジ ル基、ベンゾィル基、 t ブトキシカルボ-ル基、 tーブチルジメチル基、 N—フタルイミ ジル基、シリル基、トリメチルシリルェチル基、トリメチルシリルェチルォキシカルボ- ル基、 2—-トロー 4, 5—ジメトキシベンジル基、 2—-トロー 4, 5—ジメトキシベンジルォ キシカルボニル基、力ルバメート基などを挙げることができ、それらは、保護されるべ き官能基の種類に応じて適宜選択することができる。
[0215] 本発明の方法における保護 ·脱保護反応は、脱水縮合および加水分解の組み合 わせであり得るがそれに限定されない。
[0216] (改変 tRNA)
1つの局面において、本発明は、 4塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能 基を有するアミノ酸を含む改変 tRNAを提供する。このような改変 tRNAは、上記のよ うな本発明の方法を用いて生成することができるがそれに限定されない。改変 tRNA は、酉己列番号 1に示される GCGGAUUUAGCUCAGUUGGGAGAGCGCCAG
ACCAという配列またはその改変体を含み得る。この場合、改変体において、コドン を認識する部分 (代表的には、アンチコドン）は改変されていないことが好ましい。
[0217] (糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質の生産キットおよび糖 タンパク質の生産キット）
別の局面において、本発明は、 A) 4塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能 基を有するアミノ酸を含む改変 tRNA;B)該 4塩基コドンまたはその相補体を含む核 酸配列を含む改変核酸分子、該核酸配列は該 4塩基コドンに 1アミノ酸を対応させた ときに機能性タンパク質をコードする、改変核酸分子； C)該改変核酸分子の転写す るための転写酵素、翻訳に必要なセットの tRNAおよび mRNAを翻訳するための翻 訳酵素を含むタンパク質合成系を備える、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸 を含むタンパク質の生産キットを提供する。あるいは、本発明は、 A) 4塩基コドンを認 識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変 tRNA； B)該 4塩基コ ドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子、該核酸配列は該 4塩 基コドンに 1アミノ酸を対応させたときに機能性タンパク質をコードする、改変核酸分 子; C)該改変核酸分子の転写するための転写酵素、翻訳に必要なセットの tRNAお よび mRNAを翻訳するための翻訳酵素を含むタンパク質合成系； D)糖鎖；および E )該糖鎖に結合し得る官能基と該糖鎖との連結を行うための連結手段、を備える、糖 タンパク質の製造キットを提供する。ここで、 4塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し 得る官能基を有するアミノ酸を含む改変 tRNA ;4塩基コドンまたはその相補体を含 む核酸配列を含む改変核酸分子、該核酸配列は該 4塩基コドンに 1アミノ酸を対応さ せたときに機能性タンパク質をコードする、改変核酸分子;改変核酸分子の転写する ための転写酵素、翻訳に必要なセットの tRNAおよび mRNAを翻訳するための翻訳 酵素を含むタンパク質合成系は、本明細書の他の部分 (特に、糖タンパク質を製造 するための方法）において説明されるような形態を採ることができる。
[0218] 本発明のキットにおいて含まれるべき糖鎖は、その糖タンパク質に含まれるべき糖 鎖であることが好ましいが、より短い糖鎖を連結してその後伸長してもよぐあるいは、 より長 、糖鎖を連結して後に切断しても良 、。
[0219] 本発明のキットにおいて含まれるべき、糖鎖に結合し得る官能基と該糖鎖との連結 を行うための連結手段は、その官能基とその糖鎖との連結を触媒することができる限 り、どのような手段であっても良い。代表的には、加水分解活性のある酵素が挙げら れるがそれに限定されず、触媒の不存在下であっても、平衡反応によって、連結され ることができることが本発明の特徴の一つであることが理解されるべきである。従って 、本発明において用いられるこの連結手段は、単なる溶媒 (水または有機溶媒など） であってもよい。
[0220] (糖タンパク質を製造するための翻訳反応にお 、て用いるための組成物）
別の局面において、本発明は、 4塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基 を有するアミノ酸を含む改変 tRNA、および翻訳に必要なセットの tRNAを含む、糖 タンパク質を製造するための翻訳反応において用いるための組成物を提供する。糖 ペプチドを生成するためのこのような tRNAのセットにおいて含まれるべき、改変 tRN Aは、本明細書において別の場所 (特に、改変 tRNA)において説明したような任意 の形態をとることができることが理解されるべきである。
[0221] (タンパク質合成系）
別の局面において、本発明は、 4塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基 を有するアミノ酸を含む改変 tRNA、翻訳に必要なセットの tRNAおよび mRNAを翻 訳するための翻訳酵素を含むタンパク質合成系を提供する。このようなタンパク質合 成系は、本明細書の他の部分 (特に、糖タンパク質を製造するための方法）において 説明されるような形態を採ることができる。翻訳酵素としては、例えば、天然の細胞の リボゾーム抽出物を用いてもよい。そのようなリボソーム抽出物を利用した合成系は、 市販されており、そのような製品を利用しても良い。好ましくは、このようなタンパク質 合成系は、さらに、核酸分子の転写するための転写酵素、を含み得る。
[0222] (改変核酸分子）
別の局面において、本発明は、 4塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を 含む改変核酸分子、該核酸配列は該 4塩基コドンに 1アミノ酸を対応させたときに機 能性タンパク質をコードする、改変核酸分子を提供する。このような核酸分子は、従 来のタンパク質合成系では、何ら意味のないタンパク質を合成することになるが、本 発明の技術を用いれば、目的の糖タンパク質を合成するための核酸分子に相当する ことが理解される。このような改変核酸分子は、本明細書の他の部分 (特に、糖タンパ ク質を製造するための方法）において説明されるような形態を採ることができる。
[0223] (糖タンパク質）
別の局面において、本発明は、本発明の糖タンパク質の製造方法によって調製さ れた糖タンパク質を含む組成物を提供する。このような組成物は、医薬、農薬、化粧 品、特定保健食品、食品、工業用材料など種々の用途に使用される組成物であり得 る。特に、医薬品などにおいて、特定の糖鎖を有するタンパク質が所望される場合に 、簡便に選択性をもって作製することを本発明は達成しており、その意味で有用性は 高い。
[0224] (化合物）
別の局面において、本発明は、以下の式：
[0225] [化 24]
Figure imgf000065_0001
を有する、化合物（式中、 Rはアミノ酸の側鎖から水素が一つ取れたものであり、 R
1 2 一 Rおよび Rは、それぞれ独立して保護基または水素を表し、 Rは、糖鎖に結合し
4 6 5
得る基を表す)を提供する。ここで、このような改変核酸分子は、本明細書の他の部 分 (特に、糖タンパク質を製造するための方法および糖鎖導入のための tRNAを生 産するための方法）において説明されるような任意の形態を採ることができる。ここで 、好ましくは、 Rは、天然アミノ酸の側鎖力も水素が一つ取れたものであり得る。
[0226] 保護基である R— Rおよび Rは、それぞれ独立して、水素、フルォレニルメトキシ
2 4 6
カルボ-ル（Fmoc)基、ァセチル基、ベンジル基、ベンゾィル基、 t ブトキシカルボ -ル基、 tーブチルジメチル基、 N フタルイミジル基、シリル基、トリメチルシリルェチ ル基、トリメチルシリルェチルォキシカルボ-ル基、 2—-トロー 4, 5—ジメトキシベンジ ル基、 2—二トロー 4, 5—ジメトキシベンジルォキシカルボ-ル基などから選択され得る 。好ましい実施形態では、カルボキシル基の保護基である、 Rは、 2—二トロー 4, 5—
2
ジメトキシベンジルォキシカルボ-ル基、トリメチルシリルエチレンォキシカルボ-ル 基、ベンジルォキシカルボ-ル基，アルキ-ルメチル基、 t ブトキシカルボ-ル基ま たはその誘導体などであり得る。好ましくは、ァミノ基の保護基である、 Rおよび Rは
3 4
、少なくとも一方が保護されていることが重要であり、より好ましくは、これらの保護基 は、ァセチル基、ベンジルォキシカルボ-ル基， t ブトキシカルボ-ル基などの保護 基であり得る。
[0227] 糖鎖に結合し得る基である Rは、アミノォキシ基、 N アルキルアミノォキシ基、ヒド
5
ラジド基、アジド基、チォセミカルバジド基およびシスティン残基などの基力 水素が 一つ取れたものであり得る。保護されていない場合は、 Rおよび Rと一緒になつて、
5 6
アミノォキシ基、 N アルキルアミノォキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チォセミカルバ ジド基およびシスティン残基などであり得る。
[0228] 従って、本発明は、例えば、以下の式：
[0229] [化 25]
Figure imgf000066_0001
で示される構造を有する化合物およびそれらの保護体を提供する。この化合物は、 糖鎖を結合し得る官能基を有するアミノ酸の代表例である。
[0230] 別の好ましい実施形態では、本発明は、以下の式：
[0231] [化 26]
Figure imgf000066_0002
0233
Figure imgf000067_0001
または
Figure imgf000067_0002
に示される構造を有する化合物を提供する。糖鎖を結合する官能基を有しその官能 基が保護された代表的なアミノ酸の例である。
[0236] 別の好ましい実施形態では、本発明は、以下の式：
[0237] [化 27]
Figure imgf000067_0003
に示される構造を有する化合物を提供する。この化合物は、アミノ酸のアミノ基および カルボキシル基が保護され、かつ、糖鎖を結合する官能基が保護された、本発明の 糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸の代表例である。
[0238] 別の好ましい実施形態において、本発明は、以下の中間体または生成物を提供す る。このような中間体は、本発明の糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸および Zまたは改変 tRNAを製造する際に生じる中間体または生成物である。 [0239] [化 28]
Figure imgf000068_0001
[0241] [化 30]
O— H2
Figure imgf000068_0002
Figure imgf000068_0003
[0243] [化 32]
Figure imgf000069_0001
[0244] これらにぉ 、て、アミノ酸の側鎖、糖鎖に結合し得る官能基、ヌクレオチドの塩基な どが別の例に変更されたィ匕合物もまた、本発明の範囲内に含まれることが理解される
[0245] 本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、そ の全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援 用される。
[0246] 以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきた力 本発 明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求 の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、 本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に 基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引 用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載さ れているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであるこ とが理解される。
実施例
[0247] 以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定 されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、 和光純薬、 Promegaから市販されているものを使用した。
[0248] (実施例 1： N— (4 ペンテノィル) L ホモセリン tert ブチルエステルの合成） まず、本発明の例示として、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を合成した。 合成にあたり、まず、アミノ酸のアミノ基およびカルボキシル基を保護した。アミノ酸と してはホモセリンを使用した。
[0249] [化 33]
Figure imgf000070_0001
[0250] 200mlのナス型フラスコに L ホモセリン（2. 0g、 16. 8mmol)を入れて水 6ml、メ タノール 4mlで溶かした。 0°Cに冷やした後、このフラスコに 4 ペンテノイツク無水物（ 3. 68ml, 20. lmmol)とトリエチノレアミン（2. 81ml, 20. lmmol)をカロえた。 0。Cで 30分、室温で 12時間反応させた。反応溶液を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフ ィー（クロ口ホルム：メタノール：水 = 65： 15： 1)により粗精製化した。これを 200mlの ナス型フラスコに入れて、 N, N—ジメチルホルムアミド 25mlに溶かした。このフラスコ にベンジルトリエチルァミンクロリド (4. Og、 17. 6mmol)を加えて室温で 5分間撹拌 する。さらに炭酸カリウム（22. lg、 160mmol)と tert—ブチルブロミド（26. 5ml、 23 Ommol)をカ卩えて 55°Cで 6時間撹拌する。氷水をカ卩えて酢酸ェチルで 3回抽出し、 飽和食塩水で良く洗った後、硫酸マグネシウムで乾燥した。吸引ろ過し、溶液をエバ ポーレーターで除去し、シリカゲルクロマトグラフィー（へキサン：酢酸ェチル = 3： 2) により分取して表題ィ匕合物（2. 29g、収率 53%)を得た。
[0251] 1H-NMR δ (CDC1 ): 6.39 (1H, d, J=7.20 Hz) (NH— ),5.85〜5.78 (1H, m) (C=CH— ),
3
5.1广 5.02 (2H, m)(-C=CH ), 4.65— 4.60 (1H, m) ( α— H), 3.78 (lH'dd, J=4.55,
2
9.34Hz) (— OH),3.71— 3.65 (1H, m) ( γ— H ), 3.56— 3.50 (1H, m) ( γ— H ),2.45—
2 2
2.35(4H,m) (C=C- CH -,C=C-C-CH -),2.21—2.15 (1H, m) ( j8 -H ), 1.54— 1.50
2 2 2
(1H, m) ( β -Η ), 1.48 (9H, s) ((CH ) - C- ) [0252] (実施例 2： 2- (N— (4—ペンテノィル））アミノー 4 [O— [N フタルイミジル]ァミノ]ヒ ドロキシー酪酸 tert ブチルエステルの合成）
次に、実施例 1で合成したアミノ酸にお ヽて糖鎖に結合し得る官能基の連結を行つ た。
[0253] [化 34]
Figure imgf000071_0001
[0254] 100mlのナス型フラスコに N— (4—ペンテノィル） L ホモセリン tert ブチルエステ ル（422mg、 1. 64mmol)を入れてテトラヒドロフラン 10mlで溶かし、トリフエ-ルホス フィン（517mg、 1. 97mmol)と N—ヒドロキシフタルイミド（321mgゝ 1. 97mmol)を 窒素ガス充填下において加える。ジェチルァゾジカルボキシレート（310 1、 1. 97 mmol)をゆっくり滴下し、室温で 2時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し、シリカゲルク 口マトグラフィー（へキサン：酢酸ェチル = 2： 1)により分取して表題化合物（557mg、 収率 84%)を得た。
[0255] 1H-NMR δ (CDC1 ): 7.86—7.77 (4Η, m) (― Ph), 7.13 (1H, d, J=7.93 Hz)
3
(NH- ),5.88— 5.84 (1H, m)(C=CH- ), 5.10— 4.98 (2H, m) (- C=CH ), 4.73—4.70 (1H,
2
m) ( a -H), 4.31— 4.29(2H, m) ( γ— H ),2.46—2.41 (4H, m) (C=C— CH
2 2
-, C=C-C-CH -),2.33— 2.28(2H,m) ( β -Η ),1.46 (9H, s) ((CH )— C―)。
2 2 3 3
[0256] (実施例 3： 2- (N— (4—ペンテノィル） )アミノー 4—アミノォキシー酪酸 tert—ブチルェ ステルの合成）
実施例 2に引き続いて、実施例 1で合成したアミノ酸において糖鎖に結合し得る官 能基の連結を行った。 [0257] [化 35]
Figure imgf000072_0001
[0258] (式中、記号は前記と同義を示す。 )
25mlのナス型フラスコに 2— (N— (4—ペンテノィル））アミノー 4— [O— [N—フタルイミ ジル]ァミノ]ヒドロキシー酪酸 tert—ブチルエステル（156mg、 388 μ mol)を入れて 4 0%メチルァミン (メタノール溶液） 2mlに溶かす。室温で 45分間撹拌した後、反応液 を減圧濃縮する。析出した結晶を減圧濾過し、濾液を濃縮した後、シリカゲルクロマト グラフィー（トルエン：酢酸ェチル = 1： 5)により分取して表題化合物（94mg、収率 89 %)を得た。
[0259] 1H-NMR δ (CDC1 ): 6.03 (1H, d, J=7.19 Hz) (NH— ),5.88— 5.80 (1H, m)
3
(C=CH-),5.44(2H, bs)(— O— NH ), 5.10
2 一 5.00 (2H, m)(— C=CH ), 4.60— 4.56 (1H, m)
2
( a -H), 3.76— 3.71(2H, m) ( γ— H ),2.43— 2.31 (4H, m) (C=C— CH―, C=C— C— CH -),
2 2 2
2.11— 1.96 (2H,m) ( j8 -H ),1.48(9H, s) ((CH )— C―)。
2 3 3
[0260] (実施例 4： 2— (N— (4—ペンテノィル））アミノー 4— [0—[N—トリメチルシリルエトキシ カルボ-ル]ァミノ]ヒドロキシー酪酸シァノメチルエステルの合成）
次に、導入した糖鎖に結合し得る官能基を保護する反応を行った。
[0261] [化 36]
Figure imgf000072_0002
25mlフラスコに 2— (N— (4—ペンテノィル））アミノー 4—アミノォキシー酪酸 tert—ブチ ルエステル（44mg、 162 mol)をいれてトリフルォロ酢酸 lmlを加える。 0°Cで 30分 、室温で 1時間撹拌する。窒素ガスでトリフルォロ酢酸を除去する。これを水 500 1、 ジォキサン lmlに溶かし、トリエチルァミン（67 μ 1、 480 μ mol)とトリメチルシリルエト キシカルボ-ルスクシンイミド（62mg240 μ mol)を加えた。室温で 18時間撹拌した 後、酢酸ェチルで薄めて分液した。 5%クェン酸水溶液、飽和食塩水で良く洗った後 、硫酸マグネシウムで乾燥した。吸引ろ過し、溶液をエバポーレーターで除去した。こ れをァセトニトリル 700 1に溶かし、窒素ガス充填下 0°Cに冷やした後、トリェチルァ ミン（67 1、 480 mol)とクロロアセトニトリノレ（101 1、 1. 6mmol)をカロえた。撹拌 しながら室温へ温度を上げて 24時間反応した後、酢酸ェチルで薄めて分液した。飽 和食塩水で良く洗った後、硫酸マグネシウムで乾燥した。吸引ろ過し、溶液をエバポ 一レーターで除去した。シリカゲルクロマトグラフィー（へキサン：酢酸ェチル = 1： 1) により分取して表題ィ匕合物（42mg、収率 65%)を得た。 1H-NMR δ (CDC1 ): 7.84
3
(1H， bs) (NH-), 7.59 (1H， s)(— O— NH— )， 5.88—5.82 (1H， m)(C=CH- )，5.10 4.99 (2H, m) (— C=CH ),4.84—4.81 (1H， m) ( a— H)， 4.76 (2H,dd, J=15.65， 33.46Hz)
2
(-0-CH -CN),4.30— 4.23 (2H, m) (— O— CH— C— Si)，4.00 3.95 (2H, m) ( y -H
2 2 2
),2.44—2.39 (4H, m) (C=C- CH―， C=C— C— CH -),2.31—2.26 (1H， m) ( β -H )， 2.12
2 2 2
—2.07 (1H， m) ( β -Η ),1.03 (2H,t, J=8.62Hz) (-〇- C- CH -Si), 0.06 (9H， s) ((CH )
2 2 3 3
- Sト)。
(実施例 5： 5，一ホスホー 2，ーデォキシシチジル（3，— 5，）— 2，（3，）— O— [2— (N— (4 —ペンテノィル））アミノー 4— [0—[N—トリメチルシリルエトキシカルボ-ル]ァミノ]ヒドロ 次に、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を、ジヌクレオチド (pdCpA)に連 糸 ptし/こ。
[0264] [化 37]
Figure imgf000074_0001
[0265] 1. 7mlエツペンチューブに、 5，一ホスホ— 2しデォキシシチジル（3，一 5，）アデノシ ン（pdCpA)の 1. 0OD/ μ IN, N—ジメチルホルムアミド溶液（5 1、 220nmol)と 2 — (N— (4—ペンテノィル））アミノー 4— [0—[N—トリメチルシリルエトキシカルボ-ル]ァ ミノ]ヒドロキシー酪酸シァノメチルエステル（770 g、 1. 92 mol)をカ卩えて 1時間反 応させる。反応液にジェチルエーテル 1. 5mlをカ卩えて遠心分離し、上澄みを取り除 く。ァセトニトリル 20 1を加えて溶かし、ジェチルエーテル 1. 5mlを加えて遠心分離 し、上澄みを取り除く。再度、ァセトニトリル 20 1を加えて溶かし、ジェチルエーテル 1. 5mlをカ卩えて遠心分離した後、上澄みを取り除く。逆相 HPLC (水:メタノール 0. 1 M酢酸アンモ-ゥム pH4. 5 = 80 : 20力も 0 : 100)にて分離、凍結乾燥した後、ジメ チルスルホキシド 30 μ 1に溶解させた。これにより表題化合物のジメチルホルスルホキ シド溶液 30 1 (0. 0556ODZ l、 73. 3nmol、 33%)を得た。
[0266] 質量分析（ESI— MS) : [M— H— ] 977. 2620 (計算値 977. 2633)。
[0267] (実施例 6： 2—アミノー 4— [0—[N—トリメチルシリルエトキシカルボ-ル]ァミノ]ヒドロ キシーブチリックァシジルー tRNA (CCCG)の合成）
次に、実施例 5にお ヽて糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を連結したジヌ クレオチドを、 tRNAに連結した。 [0268] 10 1中に、 5，—ホスホ— 2しデォキシシチジル（3，—5，）—2，（3，）— O— [2— (N— ( 4—ペンテノィル））アミノー 4— [0—[N—トリメチルシリルエトキシカルボ-ル]ァミノ]ヒド 口キシープチリックァシジル]アデノシンのジメチルスルホキシド溶液（2 1)、酵母菌 由来のフエ-ルァラニン tRNAを骨格としたアンチコドンが CCCGであり 3，末端の C Aが欠落した tRNA(CCCG)— CA (配列番号 1から CAが欠損したもの）の 0. lOD Z l溶液（2. 5 1)、 50mM Tris— HC1PH7. 5、 lOmM MgCl、 lOmM DTT、
2
ImM ATP、 0. 005% BSA、 T4RNAリガーゼ（40ユニット）を含む反応液を 4°Cで 反応させた。 2時間後、酢酸カリウム（PH5. 5)を終濃度 0. 3Mになるように加え、フ ェノール：クロ口ホルム：イソアミルアルコール = 25 : 24 : 1 (pH5. 2)およびクロ口ホル ムによって抽出した。 3倍量のエタノールを力卩ぇー 30°Cに 15分静置、 30分間遠心し た後上澄みを捨てた。— 30°Cに冷やした 70%エタノールを少量カ卩えて 5分間遠心し た後上澄みを捨て、減圧下において乾燥させた。これを 50mM I溶液 (水:テトラヒド
2
口フラン = 1 : 1)に溶解し 30分間静置した。酢酸カリウム (PH5. 5)を終濃度 0. 3M になるように加え、さらに 3倍量のエタノールを加え 30°Cに 15分静置、 30分間遠心 した後上澄みを捨てた。— 30°Cに冷やした 70%エタノールを少量カ卩えて 5分間遠心 した後上澄みを捨て、減圧下において乾燥し、表題化合物を得た。
[0269] これを、電気泳動により、実際に合成されていることを確認した（図 3)。電気泳動は 、 8%ポリアクリルアミドー 7M尿素電気泳動 120ボルト 60分の条件で行った。
[0270] (実施例 7： 2 アミノー 4— [0—[N—トリメチルシリルエトキシカルボ-ル]ァミノ]ヒドロ キシー酪酸を導入したリゾチームの合成）
次に、実施例 6において合成した tRNAを用いて、タンパク質を合成した。以下に その手順を示す。
[0271] PROMEGA社から販売されて!、る「E. coli T7S30Extract System for Circla r DNA」を使用した。ベクターには T7プロモーター領域下流に開始コドン、 Τ7タグ 配列、変異リゾチーム配列（配列番号 3 (核酸)および配列番号 4 (アミノ酸)）、ヒスチ ジンタグ配列、終始コドンをもつものを使用した。変異リゾチームの配列はリゾチーム の 44残基部位 (配列表では 59位）に CGGGの 4塩基配列を挿入したものを使用した 。 10 1の反応溶液中に、 1^^\(じじじ0)—じ八の0. lODZw l溶液 2. 5 1力ら合 成した 2—アミノー 4— [0—[N—トリメチルシリルエトキシカルボ-ル]ァミノ]ヒドロキシー ブチリックァシジルー tRNA(CCCG) (ImM酢酸カリウム 1 μ 1に溶解）、 S30Extract (3 1)、 S30premix (4 1)、ベクター (533 g)、 0. ImMアミノ酸混合物を含む溶 液を 37°Cに静置した。 1時間後、 0°Cに冷やし反応を停止させ表題化合物を得た。
[0272] この化合物を、ウェスタンプロット分析 (一次抗体:抗 T7タグ抗体 (マウス由来）；ニ 次抗体：抗マウス IgG—アルカリフォスファターゼ）により確認した（図 4)。
[0273] (実施例 8 :競合する tRNAの影響）
次に、実施例 6— 7に記載の手順に代えて、リゾチーム配列の代わりに、ストレブトァ ビジンの 83位（配列表では 99位）が CGGGになって!/、る変異ストレプトアビジン（配 列番号 5 (核酸)、配列番号 6 (アミノ酸)）を用いて、同様の発現実験を行った。
[0274] 本実施例では、競合するアミノ酸がアルギニンであることがわ力つているので、図 5 右上に示されるように、競合するアミノ酸であるアルギニンの比率を変化させて発現 にどのような影響があるかどうかを観察した。その結果を図 5に示す。
[0275] その結果、図 5からも明らかなように、レーン 2および 3から、本発明の改変（アミノア シル) tRNAの量が多 、ほど、全長配列のタンパク質の発現が顕著に増加して 、た。 また、レーン 1、 3および 4の記載から明らかなように、アルギニンは、ストレプトァビジ ンの場合は、 1一 0. 01倍のすべてでタンパク質の発現が見られ、好ましくは 0. 1倍 程度であることがわ力つた。
[0276] このように、競合するアミノ酸は、他のアミノ酸より少なく存在させることが好ま 、こ とが実証された。ただし、その量は、 目的とするタンパク質の種類およびアミノ酸含量 によるよつである。
[0277] (実施例 9：他のアミノ酸誘導体）
次に、実施例 1一 4で製造した糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸に代えて、 図 6Bに表される化合物を導入した場合に全長タンパク質が合成されるかどうかを検 iEした。
[0278] これらの化合物の合成は、実施例 1一 4に準じた。
[0279] これらの糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を用いて、実施例 5— 7に記載さ れるように、タンパク質を合成した。 mRNAとしては、ストレプトアビジン 83CGGG ( 配列番号 6)を使用した。その構造は、図 6Aに示す。その結果を図 6Bに示す。
[0280] 示されるように、 V、ずれの糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を用いても、全 長タンパク質が合成されることが明らかになった。これらの結果から、ストレブトァビジ ンへの糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸の導入効率を算出した結果を以下 の表に示す。
[0281] [表 2]
|(全長 /全長 +フラグメント） ) 100| Tyr_C4-N3 32.0 % Tyr-C4-Teoc 6.9 %
Hse(ONHTeoc) 12.7 % Hse(ONMeTeoc) 14.7 %
Hse(ONHNVOC) 7.9 % Hse(ONMeNVOC) 6.9 %
[0282] ここで、図 6における 6が Tyr-C4-N3に相当し、 5が Tyr-C4-Teocに相当し、 4が Hse(ONMeNVOC)に相当し、 3が Hse(ONHNVOC)に相当し、 2が Hse(ONMeTeoc) に相当し、 1が Hse(ONHTeoc)に相当する。
[0283] (実施例 10：環状核酸分子および直鎖状核酸分子の比較）
次に、タンパク質合成系において、環状核酸分子および直鎖状核酸分子を用いた 場合の比較を行った。
[0284] 環状核酸分子での合成系は、実施例 7に準じた。
[0285] 直鎖状核酸分子での合成系としては、実施例 7における環状用のキットに代えて直 鎖状核酸分子のための合成系を用 ヽた。
[0286] 発現させたタンパク質はリゾチームであり、その結果は、図 7に示す。
[0287] 示されるように、環状核酸分子および直鎖状核酸分子のいずれを用いても、リゾチ ームの発現が見られた力 環状核酸分子の方が、 100 : 77で多かった。
[0288] (実施例 11 :条件検討）
次に、発現の条件を種々検討した。その条件は、図 8に示す。図 8に示した条件以 外は、実施例 7に記載されるように、実験を行った。
[0289] その結果は、図 8に示されるように、リゾチームとしては、温度としては、 30°Cまたは 42°Cより 37°Cが適切であり、アルギニンの量は減らしても効果がなぐむしろ 1倍の 方がより多く全長タンパク質が合成された。
[0290] 以下の表に示すように、リゾチームおよびストレプトアビジンは、アルギニンの含量 が顕著に異なる。
[0291] [表 3] リ、/チーム ストレ: トア^ン
総アミノ酸 (アミノ酸の数） = 184 総アミノ酸 (アミノ酸の数)
分子量 = 20914.90 分子量： 19038.75
アミノ酸 カウント アミノ酸 カウント
Ala(A) 16 Ala(A) 26
Arg(RJ 13 Arg(R) 4
Asn(N) 12 Asn(N) 10
Asp(D) 10 Asp(D) 8
Cys(C) 2 ys(C) 0
ln(Q) 7 8
Glu(E) 9 Glu(E) 6
Gly(G) 14 Gly(G) 21
His(H) 7 His(H) 9
Ik'(I) 10 Ilc(I) 4
Leu(L) 16 Leu(L) 8
Lys(K) 13 Lys( ) 8
Met(M) 8 Met(M) 4
Plie(F) 6 Phe(F) 3
Pro(P) 3 Pro(P) 4
Ser(S) 7 Ser(S) 15
Thr(T) 13 Thr(T) 21
Trp( ) 3 Trp(W) 6
Tyr l ) 6 T" (Y) 6
Val(V) 9 Val(V) 10
総数 184 総数 181
[0292] 従って、競合するアミノ酸 (ここでは、アルギニン)の含量が多 、場合は、そのアミノ 酸を減少させると、そのタンパク質の合成自体に影響が出ることから、好ましくないこ とが明らかになった。このように、タンパク質のアミノ酸含量などをも考慮することによ つて、適切な条件を検討することができることが明らかになった。
[0293] (実施例 12：糖鎖の導入）
次に、実施例 7で製造したタンパク質を用いて、糖鎖の導入実験を行う。導入される 糖鎖としては、例えば、シアル酸、 N ァセチルーダルコサミン、グルコースなどの単糖 、ラタトースなどの二糖を挙げることができる。
[0294] 実施例 7で製造したタンパク質と、上記単糖とを混合する。混合する条件は、例え ば、以下のような条件がある。
[0295] 酢酸緩衝液 (pH5. 6)を適量 (例えば、 200マイクロリットル）添加する。そこに、糖 鎖溶液適量（例えば、 200マイクロリットル）、メタノール適量（例えば、 200マイクロリツ トル）（糖鎖とほぼ等量)を添加し 37°Cで 12時間程度放置する。例えば、マイクロコン (ミリポア社製)を用いて 10, 000回転 Z分、 10° Cの条件で 40分間遠心濾過を行う 。この濃縮液に超純水を適量 (糖鎖溶液とほぼ等量)添加し、再度同条件により遠心 濾過を行う。濃縮液（100分の 1量程度にまで減少させることができる）に超純水適量 (例えば、 100マイクロリットル)を添加し糖鎖が結合した糖タンパク質を得ることがで きる。
[0296] (実施例 13： 2 アミノー 4 [N—メチルーアミノォキシ] 酪酸を導入した変異ストレブ トァビジンの合成とラタトースによる糖鎖修飾）
糖鎖が結合した糖タンパク質の製造例として、 2 アミノー 4 [N—メチルーアミノォキ シ] 酪酸 (以下の化学式)を導入した変異ストレプトアビジンを製造した。その手順お よび結果を以下に示す。
[0297] [化 38]
Figure imgf000079_0001
タンパク貧の発現系として、 PROMEGA社から販売されている「E. coli T7 S30 Extract System for Circlar DNA」を使用した。ベクターとしては、 T7プロモ ータ領域下流に開始コドン、 T7タグ配列、変異ストレプトアビジン配列（配列番号 5) 、ヒスチジンタグ配列、終始コドンをもつものを使用した。変異ストレプトアビジンの配 列はストレプトアビジンの 83残基部位に CGGGの 4塩基配列を挿入したものを使用 した。 200 μ 1の反応溶液中に、 tRNA(CCCG)— CAの 0. 130D/ μ 1溶液 11 μ 1 力も合成した 2—ァミノ- 4— [N-メチルーアミノォキシ] -ブチリックァシジル -tRNA (C CCG) (ImM 酢酸カリウム 20 μ 1に溶解）、 S30 Extract (60 μ 1)、 S30premix ( 80 1)、ベクター（1. 68 /ζ 8)、0. ImMアミノ酸混合物を含む溶液（いずれも「E. c oil T7 ¾30 Extract system ior Circlar
DNA」に添付される）を 37°Cに静置した。 1時間後、 0°Cに冷やし反応を停止させ た。この反応液を、 T7 Tag antibody agarose (50 μ 1) ( ovagenネエリを用 ヽて 精製し、溶出液を Microcon YM10 (Millipore社）を用いて脱塩濃縮し 50 μ 1の溶 液を得た。このうち約 200ngの変異ストレプトアビジンを含む溶液 5 1を凍結乾燥に より乾燥させた。 400mMのラタトースを含む 200mMの酢酸緩衝液（pH4. 0)を 3 1加えて、 37°Cにお 、て 2日間反応させた。反応後、 MagneHis Ni— particles (2 μ 1) (Promega社)を用 、て精製した。 C4 Zip Tip (millipore社)を用 ヽて脱塩後、 2, 5—ジヒドロ安息香酸（2, 5-dihydroxybenzoic acid) =DHB)をマトリックスとし て MALDI TOF MASSにて分子量測定を行った。 2—アミノー 4— [N—メチルーアミ ノォキシ] -酪酸を導入した変異ストレプトアビジン (分子量理論値 18875. 3、測定 値 18869. 2)とラタトースにより修飾された変異ストレプトアビジン (分子量理論値 19199. 6、測定値 19195. 4)力確認された（図 9)。
[0299] (実施例 14 :糖鎖が結合した糖タンパク質の製造条件の検討）
次に、変異タンパク質と、糖鎖との結合の際の条件を検討する。
[0300] 実施例 13において、ラタトースを、 ImM— 2Mにまで変化させ（例えば、 lmM、 2 mM、 5mM、 10mM、 20mM、 50mM、 100mM、 150mM、 200mM、 300mM、 400mM、 500mM、 600mM、 700mM、 800mM、 900mM、 1M、 1. 25M、 1. 5 M、 1. 75M、 2M)；酢酸緩衝液は、 pH2. 5— 7の間を 0. 2刻みで変化させ、濃度 は、 10mM— 1M (例えば、 10mM、 20mM、 50mM、 100mM、 150mM、 200m M、 300mM、 400mM、 500mM、 600mM、 700mM、 800mM、 900mM、 1M) の間を変化させる。
[0301] 反応条件は、 20°C— 100°Cの間を変化させ、反応は、 1時間後から 1時間おきに観 察する。
[0302] 上記実験を行うことにより、例えば、ラタトースは 10mM— 1Mにおいて反応が好ま しく進行し、酢酸緩衝液の濃度は、 50— 400mM、 pH3— 6において反応が好ましく 進行し、反応温度としては、 25°C— 80°C、反応時間としては、 6時間一 5日間のもの が好ましく反応が進行することが観察される。
[0303] (実施例 15： 2 アミノー 4 [N—メチルーアミノォキシ] 酪酸を導入した変異ストレプト アビジンの糖鎖修飾）
(グルコースによる修飾）
約 200ngの変異ストレプトアビジンを 400mMのグルコースを含む lOOmMアセテート バッファ（PH4. 0)に溶解し 37°Cで 44時間反応させた。反応後、
MagneHisM- particles (2 μ \) (Promega社）を用いて精製した。 C4 Zip Tip (millipore 社）を用いて脱塩後、 DHBをマトリックスとして MALDITOF MASSにて分子量測定を 行った。結果を図 10に示す。グルコースにより特異的に修飾された変異ストレブトァ ビジン (分子量理論値 19037.5、測定値 [M+H] 19034.3)が確認された。収率約 60 %。
[0304] (マルトースによる修飾）
約 200ngの変異ストレプトアビジンを 400mMのグルコースを含む lOOmMアセテート バッファ（PH4. 0)に溶解し 37°Cで 44時間反応させた。反応後、
MagneHisM- particles (2 μ \) (Promega社）を用いて精製した。 C4 Zip Tip (millipore 社）を用いて脱塩後、 DHBをマトリックスとして MALDITOF MASSにて分子量測定を 行った。結果を図 1 1に示す。マルトースにより特異的に修飾された変異ストレプトアビ ジン (分子量理論値 19199.6、測定値 [M+H] 19206.8)が確認された。収率約 50%。
[0305] (マルトトリオースによる修飾）
約 200ngの変異ストレプトアビジンを 400mMのグルコースを含む lOOmMアセテート バッファ（PH4. 0)に溶解し 37°Cで 44時間反応させた。反応後、
MagneHisM- particles (2 μ \) (Promega社）を用いて精製した。 C4 Zip Tip (millipore 社）を用いて脱塩後、 DHBをマトリックスとして MALDITOF MASSにて分子量測定を 行った。結果を図 12に示す。マルトトリオースにより特異的に修飾された変異ストレブ トァビジン (分子量理論値 19361.7、測定値 [M+H] 19368.5)が確認された。収率約 2 0% [0306] (N-ァセチルダルコサミンによる修飾）
約 200ngの変異ストレプトアビジンを 400mMのグルコースを含む lOOmMアセテート バッファ（PH4. 0)に溶解し 37°Cで 44時間反応させた。反応後、
MagneHisM- particles (2 μ \) (Promega社）を用いて精製した。 C4 Zip Tip (millipore 社）を用いて脱塩後、 DHBをマトリックスとして MALDITOF MASSにて分子量測定を 行った。結果を図 13に示す。 N-ァセチルダルコサミンにより特異的に修飾された変 異ストレプトアビジン (分子量理論値 19078.5、測定値 [M+H] 19073.1)が確認された 。収率約 40%。
[0307] (実施例 16：ラタトースにより修飾された 2 アミノー 4 [N—メチルーアミノォキシ]ー酪 酸の酵素による糖鎖伸長反応）
(ラタトースによる修飾および α 2, 3シァリルトランスフェラーゼによる糖鎖伸長反応
)
約 200ngの変異ストレプトアビジンを 400mMのグルコースを含む lOOmMアセテート バッファ（PH4. 0)に溶解し 37°Cで 44時間反応させた。反応後、
MagneHisNi- particles (2 μ \) (Promega社）を用いて榭脂に固定化した後、洗浄した 。榭脂を 0.01 % BSAゝ 0.2% TritonX- 100、 3mM CMP- NANA、 30 mU a 2, 3シァリル トランスフェラーゼ（Rat recombinant, CALBIOCHEM)を含む 50 mM
HEPES-Nabuffer (pH 7.5)に懸濁させて、 37°Cで 22時間振とうさせる。反応後、榭脂 に固定ィ匕されているタンパク質を精製した。 C4 Zip Tip (millipore社)を用いて脱塩後 、 DHBをマトリックスとして MALDITOF MASSにて分子量測定を行った。結果を図 14 に示す。シァリルラタトースにより特異的に修飾された変異ストレプトアビジン (分子量 理論値 19490.9、測定値 [M-H] 19488.2)が確認された。収率約 10%。
[0308] 以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきた力 本発 明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求 の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、 本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に 基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引 用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載さ れているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであるこ とが理解される。
産業上の利用可能性
本発明により、医薬、農薬、食品などで使用され得る、有用な糖タンパク質を、自在 にし力も選択性よぐ簡便に製造することができるようになった。従って、その用途は、 種々の分野に及ぶことが理解される。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の工程：
(a)糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含み、 4塩基コドンを認識する改変 tRNAを提供する工程；
(b)該 4塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子を提供 する工程であって、該核酸配列は該 4塩基コドンに 1アミノ酸を対応させたときに、目 的の糖タンパク質のタンパク質部分をコードする、工程；
(c)該改変核酸分子を転写して mRNAを生成する工程；および
(d)該改変 tRNAおよび翻訳に必要なセットの tRNAを含むタンパク質合成系に該 mRNAを曝してタンパク質を生成する工程、を包含する、糖鎖に結合し得る官能基 を有するアミノ酸を含むタンパク質を生産するための方法。
[2] 前記糖鎖に結合し得る官能基は、保護されて ヽてもよ ヽァミノォキシ基、保護されて いてもよい N—アルキルアミノォキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チォセミカルバジド基 およびシスティン残基からなる群より選択される少なくとも 1つの基を有する、請求項 1 に記載の方法。
[3] 糖鎖に結合し得る官能基を含むアミノ酸が天然アミノ酸に糖鎖に結合し得る官能基 が結合したアミノ酸である、請求項 1に記載の方法。
[4] 前記糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸は、チロシン、ホモセリンおよびセリン 力もなる群より選択されるアミノ酸またはその誘導体である、請求項 1に記載の方法。
[5] 前記糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸は、以下の式：
[化 1]
Figure imgf000084_0001
力 なる群より選択されるアミノ酸またはその保護体であり、該アミノ酸は、前記改変 t RNAと、該アミノ酸のカルボキシル基において結合することを特徴とする、請求項 1 に記載の方法。
[6] 前記改変 tRNAは、配列番号 1に示される GCGGAUUUAGCUCAGUUGGGA
AGAAUUCGCACCAと!、う配列を含む、請求項 1に記載の方法。
[7] 前記改変核酸分子は、インビトロ系にお 、て機能するプロモーター配列を含む、請 求項 1に記載の方法。
[8] 前記プロモーター配列は、 T7プロモーター配列を含む、請求項 7に記載の方法。
[9] (A)請求項 1に記載の方法により、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含 むタンパク質を生成する工程；および
(B)該タンパク質と所望の糖鎖とを結合させて糖タンパク質を生成する工程、を包 含する、糖タンパク質を生産するための方法。
[10] 以下の工程：
(i)糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を保護して保護アミノ酸を生成するェ 程；
(ii) 5，一ホスホー 2，—デォキシリボヌクレオチジルリボヌクレオチド（pdNpN)を提供 する工程；
(iii)該保護アミノ酸と該 PdNpNとを脱水縮合して保護 pdNpNアミノ酸を生成する 工程；
(iv) 4塩基コドンを認識する改変 tRNAを提供する工程；
(V)該改変 tRNAと該保護 pdNpNアミノ酸とを連結して保護 pdNpNアミノ酸連結 t RNAを提供する工程；および
(vi)該保護 pdNpNアミノ酸が連結した改変 tRNAを脱保護して pdNpNアミノ酸が 連結した tRNAを生成する工程、を包含する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミ ノ酸を含み、 4塩基コドンを認識する改変 tRNAを生産するための方法。
[11] 前記 pdNpNにおけるデォキシリボヌクレオチジルは、 β - D-チミジン、 2 ' -デォキシ- β - D-シチジン、 2， -デォキシ- 13 -D-アデノシン、 2， -デォキシ- 13 -D-グアノシン、 2， -デォキシ- β -D-ゥラシルおよび 2 ' -デォキシ- β -D-イノシンカゝらなる群より選択され る、請求項 10に記載の方法。
[12] 前記アミノ酸は、チロシン、ホモセリンおよびセリンカ なる群より選択される、請求項 10に記載の方法。
[13] 前記保護は、フルォレニルメトキシカルボ-ル基、ァセチル基、ベンジル基、ベンゾィ ル基、 t ブトキシカルボ-ル基、 tーブチルジメチル基、 N フタルイミジル基、シリル 基、トリメチルシリルェチル基、トリメチルシリルェチルォキシカルボ-ル基、 2—-トロ 4, 5—ジメトキシベンジル基、 2—-トロー 4, 5—ジメトキシベンジルォキシカルボ-ル 基および力ルバメート基カゝらなる群より選択される保護基で行われる、請求項 10に記 載の方法。
[14] 4塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変 tRN A。
[15] 請求項 1に記載の方法によって調製されたタンパク質を含む、組成物。
[16] 請求項 9に記載の方法によって調製された糖タンパク質を含む、組成物。
[17] 以下の式：
[化 2]
Figure imgf000086_0001
を有する、化合物（式中、 Rはアミノ酸の側鎖から水素が一つ取れたものであり、 R
1 2 一 Rおよび Rは、それぞれ独立して保護基または水素を表し、 Rは、糖鎖に結合し
4 6 5
得る基を表す)。
[18] 前記 R— Rおよび Rは、それぞれ独立して、水素、フルォレニルメトキシカルボ-ル
2 4 6
基、ァセチル基、ベンジル基、ベンゾィル基、 t ブトキシカルボ-ル基、 tーブチルジメ チル基、 N フタルイミジル基、シリル基、トリメチルシリルェチル基、トリメチルシリルェ チルォキシカルボ-ル基、 2—-トロー 4, 5—ジメトキシベンジル基および 2—-トロー 4, 5—ジメトキシベンジルォキシカルボ二ル基カもなる群より選択される、請求項 17に記 載の化合物。
[19] 前記 Rは、保護されて!、もよ!/、ァミノォキシ基、保護されて 、てもよ!、N-アルキルァ ミノォキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チォセミカルバジド基およびシスティン残基から なる群より選択される基力も水素が一つ取れたものである、請求項 17に記載の化合 物。
以下の式：
[化 3]
Figure imgf000087_0001
[化 4]
Figure imgf000087_0002
Figure imgf000088_0001
Figure imgf000088_0002
Figure imgf000088_0003
Figure imgf000088_0004
Figure imgf000088_0005
TZ.l00/S00Zdf/X3d Z8 6C9S.0/S00Z OAV
Figure imgf000089_0001
Figure imgf000089_0002
に示される基が、アミノ酸のカルボキシル基に置換した、化合物,
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