WO2004009709A1 - 非天然型標識化アミノ酸および該アミノ酸-ｔRNA結合体の作製方法 - Google Patents

非天然型標識化アミノ酸および該アミノ酸-ｔRNA結合体の作製方法 Download PDF

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labeled amino
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Takahiro Hohsaka
Masahiko Sisido
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Protein Express Co., Ltd.
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention provides a labeled amino acid in which a labeled compound is bound to an amino acid having an amino acid skeleton containing an aromatic ring such as a benzene ring in a side chain as a non-natural amino acid with or without a spacer. I do.
  • a functional protein having a function derived from the labeled compound can be provided with good reproducibility.
  • the present invention relates to a novel method for producing an aminoacyl-tRNA capable of supporting a labeled amino acid on a tRNA with high yield.
  • Hirao et al. Have developed a protein synthesis system using artificial base pairs (artificial base codon method) (Hirao, I., et al., Nature Biotech., 20, 177-182, 2002).
  • the dinucleotide in which the 3′-terminal dinucleotide of the tRNA is deleted and the unnatural amino acid is bound instead is replaced with an RNA ligase.
  • the unnatural amino acid can be bound to tRNA by using the chemical aminoacylation method of binding to the tRNA.
  • two or more unnatural amino acids can be simultaneously introduced into a protein.
  • introducing unnatural amino acids into proteins in this way has made it possible not only to analyze the structure and function of the protein, but also to produce an artificial protein with some function added artificially. Therefore, by using various unlabeled amino acids in which various labeled substances are bound to an amino acid skeleton, a labeled protein incorporating the labeled substances can be obtained.
  • the labeled protein is directly used by a method corresponding to each labeled substance, or an enzymatic chemical method or the like when the labeled substance is an enzyme substrate or an antigenic substance. Can be detected and / or purified by indirect methods such as enzyme immunochemical techniques, and used for various applications in various medical, pharmaceutical, polymer chemistry, biochemistry, etc. There is expected.
  • the natural protein synthesis system is tolerant of incorporating any of the 20 natural amino acids into the polypeptide chain without distinction, and is considered to have some tolerance for unnatural amino acids.
  • -Introduction of amino acids having a side chain having a bulky molecular structure, such as pyrenylalanine and ferrocenylalanine, into proteins is impossible with a natural protein synthesis system.
  • the ribosome has two tRNA uptake sites, one of which is a polypeptide-bound tRNA force and the other is a tRNA carrying unreacted amino acids.
  • tRNAs with bulky amino acids cannot be incorporated into ribosomes and cannot be introduced into proteins.
  • a fluorescent substance is a substance very highly useful as a labeled substance of a protein.
  • luminescent substances in the visible light region can be detected by widely and widely used detection equipment.
  • various high-sensitivity detection devices have already been developed and are widely used.
  • cell labels and the like are not affected by interference due to intracellular fluorescence, they are extremely useful as labeling compounds.
  • these fluorescent substances have large molecular weights, and when used as a labeling compound for non-natural amino acids, it is difficult to introduce them into proteins by a method using a protein synthesis system.
  • compounds having various functions such as enzyme reactivity, antigenicity, protein binding and intermolecular interaction besides fluorescence and luminescence are useful as labeling compounds. Therefore, it is desired to solve the problem that the possibility of introduction into a protein is limited by a method using a protein synthesis system depending on the molecular weight of a labeled compound. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a labeled amino acid that can be introduced into a protein using a protein synthesis system. Offer. Furthermore, the introduction of the labeled amino acid also provides a functional protein having a function derived from the labeled compound.
  • the present invention provides a novel method for obtaining a labeled amino acid-tRNA conjugate in good yield.
  • the labeled amino acid can be introduced into a protein via a protein synthesis system.
  • the present invention provides the following aspects:
  • the labeled amino acid
  • Labeling compounds include those selected from the group consisting of dye compounds, fluorescent substances, chemical or bioluminescent substances, enzyme substrates, coenzymes, antigenic substances and protein binding substances.
  • the labeled amino acid according to any one of the above 1 to 8,
  • fluorescent substance according to 11 above wherein the fluorescent substance is a compound having a chemical structure of 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene as a basic skeleton, a salt thereof, or a derivative thereof. Labeled amino acids,
  • the labeled amino acid is labeled with a compound containing 4,4-difluo-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaz-s-indacene-3-propionic acid or a salt thereof.
  • the above method achieved by a synthetic system;
  • the labeled amino acid provided by the present invention can be introduced into a protein via a protein synthesis system to synthesize a labeled protein.
  • amino acid refers to any compound having a carboxyl group and an amino group in the same molecule, whether natural or unnatural, "Immobilized amino acid” refers to an amino acid bound to a labeling compound.
  • the “amino acid skeleton” in the present specification contains a carboxyl group, an amino group, and a portion connecting these amino acids in an amino acid.
  • the term “spacer” refers to a moiety that links an amino acid moiety and a labeled compound in a labeled amino acid molecule. That is, when one or more atoms are present between the amino acid side chain and the labeling compound instead of the amino acid side chain in the labeled amino acid molecule being directly bonded to the labeling compound, It is said that the amino acid moiety and the labeling compound are linked via a spacer.
  • the spacer only needs to include at least one or more of (:, 0, N, and S in its main chain.
  • the main chain structure of the spacer is such that 2 to 10, preferably 3 to 8, more preferably 5, 6 or 7 are bonded in a linear manner, and one double bond is contained in the linear structure.
  • the spacer may have one to several, preferably one to five, more preferably one to three ring structures such as a benzene ring and / or a cyclohexyl ring. It may have a cyclic structure such as a benzene ring or a cyclohexyl ring, or a structure in which the cyclic structure is combined with the above-mentioned linear structure.
  • Polypropylene, polyisoptene, polystyrene, polyvinyl, polyvinyl chloride examples include polyolefins such as nyl, polyethers such as polyoxyethylene, polyethylene glycolone, and polyvinyl alcohol, polyamides, polyesters, polyimides, polyurethanes, and polycarbonates.
  • polyolefins such as nyl
  • polyethers such as polyoxyethylene, polyethylene glycolone, and polyvinyl alcohol
  • polyamides, polyesters, polyimides, polyurethanes, and polycarbonates it may be advantageous to bind to an amino acid via a spacer in order to more effectively exert its function in the introduced protein.
  • binding via a spacer reduces steric hindrance to the labeling substance in the introduced protein.
  • the labeled amino acid of the present invention has an aromatic ring in the side chain of the amino acid portion, and a labeled compound is bonded to the aromatic ring via a spacer or without a spacer.
  • a labeled compound is bonded to the aromatic ring via a spacer or without a spacer.
  • aromatic ring generally refers to any unsaturated cyclic compound. Therefore, it also includes a 5- or 6-membered heteroaromatic ring, or a polycyclic compound having two or more, preferably 2 to 5, more preferably 2 to 3 ring structures.
  • the aromatic ring is preferably a benzene ring.
  • phenylalanine, tryptophan, and tyrosine are natural aromatic amino acids containing an aromatic ring in the side chain, and a labeled compound is added to the aromatic ring via a spacer or a spacer. Those bound (without a spacer) can be mentioned as preferred examples of the labeled amino acids of the present invention.
  • the bond between the amino acid having an aromatic ring and the labeling compound and the bond between the amino acid having an aromatic ring and the labeling compound via a spacer may be made by using a bond between appropriate functional groups.
  • the labeled compound is bound with or without a spacer.
  • ком ⁇ онентs such as succinimide ester, isothiocyanate, snorephoninolechloride, NBD-halide and dichlorotriazine are used as probes for amino group labeling, and compounds such as alkyl halide, maleimide and aziridine are used as probe for thiol group labeling.
  • a probe for labeling a carboxy group a diazomethane compound, an aliphatic bromide, a carpoimide or the like can be used.
  • a succinimide ester may be introduced into a labeled compound with or without a spacer, and an amino group may be introduced into the aromatic ring of an amino acid. Both can be connected by a mid bond.
  • Amino acids having an amino group introduced into the aromatic ring include, for example, aminophenylalanine.
  • the functional group used at this time can be selected and introduced as appropriate, and the bonding method can be selected as appropriate.
  • the amide bond can be selectively reacted with the amino groups on the side chain of aminophenylalanine.
  • other amino groups may be protected by Bocation or the like, and then de-Bocated after the reaction. This method can be referred to, for example, the description in “Shinsei Kagaku Experimental Course 1 Protein VI Structure-Function Relationship”.
  • a dinucleotide pdCpA
  • tRNA tRNA
  • tRNA tRNA
  • an aromatic ring is directly bonded to an atom forming the amino acid skeleton, it is indirectly bonded via at least one, one, two or three atoms of C, 0, N and S Is also good.
  • the position at which the spacer or the labeling compound is bonded to the benzene ring may be at the para or meta position with respect to the amino acid skeleton position. Higher, more preferably, particularly preferably in the para position.
  • the labeled compound is bound to the functional group of the aromatic ring with or without a spacer.
  • aminophenylalanine paraaminophenylalanine and metaaminophenylalanine are preferred.
  • a desired function can be added to the labeled amino acid by selecting a labeled compound having a desired function.
  • a protein having a function derived from such a labeled compound is referred to as “functional protein”.
  • the labeling compound used in the present invention may be a dye compound, a fluorescent substance, a chemical / bioluminescent substance, an enzyme substrate, a coenzyme, an antigenic substance and a protein binding substance known to those skilled in the art.
  • a fluorescent substance for use in a protein synthesis system, those having a molecular weight of 1500 or less, preferably 1000 or less, and more preferably 500 or less are good.
  • the fluorescent substance include rhodamine, fluorescein (FITC), Texas red, acridine orange, cyber green, Cy3, Cy5, and BODIPY compounds, and all known fluorescent substances including derivatives thereof. Is mentioned.
  • a compound containing 4,4-difluoro_4-bora-3a, 4a-daza-s-indacene as a basic skeleton or a salt thereof or a derivative thereof in its chemical structure.
  • the compound or a salt thereof or a derivative thereof is also collectively referred to as a BODIPY compound.
  • BODIPY (R) FL, BODIPY (R) TR, BODIPY (R) R6G, BODIPY (R) 558/568, and BODIPY (R) 576/589 which have different fluorescent properties.
  • Chemical or bioluminescent substances such as luciferin and luminogen or derivatives thereof can also be used as labeling compounds in the present invention.
  • the fluorescent labeling compound those having an excitation wavelength in the visible light range (around 400 to 700 nm) and further having an emission wavelength in the visible light range are preferred, and those having a strong emission intensity in an aqueous solution are particularly preferred.
  • BODIPY compounds having an excitation wavelength and an emission wavelength within the visible light range.
  • BODIPY FL is excited by light of 488 nm and has strong emission in the visible light range. It has a great advantage in that it can be excited with high sensitivity and can be easily detected with existing general-purpose equipment.
  • a coenzyme, a substance having antigenicity, a substance known to bind to a specific protein, or the like is appropriately selected according to the function to be imparted to the target protein, and the selected substance is used as a labeling compound. It can be used for the invention. Further, a substrate for a specific enzyme (for example, a substrate for alkaline phosphatase or] 3 galactosidase) can be detected using a color reaction of the enzyme. In addition, proteins labeled with a substance having antigenicity or a substance known to bind to a specific protein can be used in an indirect detection method using an antibody or a binding protein. And has the advantage that purification is simple.
  • a functional protein labeled with biotin using the method of the present invention has a function of binding to avidin or streptavidin via biotin.
  • a detection system for a specific substance by utilizing the binding with avidin or streptavidin which is chemically labeled with a fluorescent compound or the like.
  • various dyes and substances detectable by various biochemical, biochemical, and immunochemical detection methods can be used as the labeling compound.
  • one of the commercially available fluorescent dye B0DIPY compounds 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propione
  • the acid (4, 4-Dif luoro-5, 7-Dimethyl_4-Bora-3a, 4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid; BODIPY (registered trademark) -FL) was converted to the side chain of aminophosphorylalanine.
  • BODIPY FL-labeled aminophenylalanine derivative BODIPY FL-AF having the structure shown in Formula I above, which is bonded to a ring. It can be introduced into a protein in a protein synthesis system, and the obtained protein has the fluorescence characteristics of BODIPY (ie, shows strong luminescence in visible light), and is easily detectable. is there.
  • one of the derivatives of the BODIPY compound 6-((4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionyl).
  • BODIPY FL-X-amino-phenylalanine (BODIPY FL-X-AF) represented by the above formula II is obtained.
  • BODIPY FL-X-aminophenylalanine BODIPY FL-X-AF
  • BODIPY R6G-AF BODIPY 576 / 589-AF
  • BODIPY 558 / 568-AF BODIPY 558 / 568-AF
  • BODIPY FL-AF BODIPY FL-AF and BODIPY 558 / 568-AF.
  • the labeled amino acid of the present invention needs to have a binding portion for binding to tRNA, and such a portion includes, for example, dinucleotide (pdCpA).
  • pdCpA dinucleotide
  • pdCpA may be previously bound to the amino acid, and the amino acid-pdCpA may be labeled with an appropriate labeling compound.
  • a labeled amino acid-pdCpA (BODIPY FL-X-AF-pdCpA) having the structure represented by the following formula is obtained.
  • BODIPY FL-X-derived above C0-CH 2 _CH 2 - CH 2 - CH 2 - via a spacer consisting of moieties having C -NH- structure
  • Aminofue two Ruara Nin - pdCpA (AF-pdCpA)
  • BODIPY FL which is a labeling compound are bound.
  • the labeled amino acid can also be introduced into a protein in a protein synthesis system, and the obtained protein has the fluorescence characteristics of BODIPY FL (that is, it shows strong luminescence under visible light). It is easily detectable.
  • BODIPY FL-X is a marker that already contains the spacer in the present invention. It is particularly useful for the synthesis of the labeled amino acid of the present invention as an insight compound.
  • the above-mentioned BODIPY FL-AF or B0DIPY FL-X-AF is particularly preferable. This is because BODIPY FL retains its fluorescent properties and is efficiently incorporated into proteins by the protein synthesis system. For example, when compared to BODIPY FL-labeled lysines, BODIPY FL-K and BODIPY FL-X-K, their incorporation into proteins is significantly higher. See the examples below.
  • a functional protein having the above-mentioned labeled amino acid introduced into a desired protein molecule can be obtained.
  • the protein may be any desired, and may be enzymes and proteins having the property of binding to specific molecules such as antibodies and streptavidin.
  • the present invention also provides a method for synthesizing the functional protein.
  • an aminoaminosyl-tRNA in which a labeled amino acid of the present invention and an anticodon corresponding to a codon designed to specifically encode the labeled amino acid are prepared. It is necessary to.
  • the amino group of an amino acid is protected by Bocation or the like, and after binding to a dinucleotide (pdCpA), deprotection treatment such as deBocation is performed.
  • an amino acid is bound to tRNA by an aminoacyl-tRNA synthetase and then reacted with a labeling compound, or a labeled amino acid is synthesized and conjugated to pdCpA and then bound to tRNA.
  • a labeling compound or a labeled amino acid is synthesized and conjugated to pdCpA and then bound to tRNA.
  • tRNA used in the 4-base codon method, the artificial base codon method, and the stop codon method cannot be aminoacylated.
  • Another disadvantage is that only natural amino acids can be labeled as amino acids.
  • the method of once synthesizing a labeled amino acid, binding it to pdCpA, and then binding it to tRNA requires the use of a labeled compound to perform a number of steps from binding of the labeled compound to obtaining the target product. The yield per volume is very low, which is particularly problematic when labeling with expensive substances such as fluorescent modifiers.
  • the acid or base used as a reaction reagent may degrade the labeled substance.
  • the labeled amino acid-pdCpA conjugate can be efficiently synthesized because the reaction is finally performed with the labeling compound.
  • aminofuranalanine when an amino group is bonded to the aromatic ring of the side chain, it is advantageous in that the amino group of the side chain and the amino group of the side chain can be distinguished and labeled.
  • the labeled amino acid-pdCpA conjugate can be completely and easily separated and purified from the unreacted amino acid-pdCpA by liquid chromatography.
  • various kinds of labeling agents can be easily synthesized.
  • the labeled aminoacyl tRNA produced by such a method can be carried out using a cell-free translation system or a protein synthesis system using living cells.
  • a cell-free translation system it is preferable to use a 4-base codon method, an artificial base codon method, or a stop codon method.
  • the detailed method of the stop codon method is described in Science, 244, p. 182.1989 and J. Am. Chem. Soc., 111, ⁇ ⁇ 8013, 1989, and for the artificial base codon method, Hirao, I., et al., Nature Biotech., 20, 177-182, 2002, and for the 4-base codon method, Hohsaka T., et al., J. Am. Chem.
  • the present invention also includes a functional protein synthesized by the above method. Since such a functional protein has characteristics derived from the labeling compound contained in the molecule, various applications can be considered by utilizing the characteristics.
  • a labeled protein having an amino acid labeled with a fluorescent compound using the method of the present invention, binding the protein with a substance capable of binding to the protein, and measuring the fluorescence polarization of the conjugate, Substances that can bind proteins can be detected.
  • the protein may be reacted with a chip or a plate to which a substance capable of binding to the protein is bound, and the protein may be reacted by measuring the fluorescence after washing or measuring the evanescent fluorescence without washing. It is possible to detect a substance that can bind to the DNA.
  • the protein may be bound to cells and subjected to flow cytometry to separate cells having a receptor for the protein, or to incorporate the protein into cells and to examine the distribution of the protein in the cells. it can.
  • the functional protein of the present invention can be applied to various fields, such as detection of a change in fluorescence or binding to another substance or search for a binding site environment by fluorescence correlation spectroscopy.
  • BODIPY FL-labeled derivatives of streptavidin and ratada anti-lysozyme antibody are shown as examples of the functional protein of the present invention.
  • Figure 1 shows the flow of BODIPY FL-X-AF-pdCpA ((BFLXAF-pdCpA) separated by HPLC. It is a low chart.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of BODIPY FL-X-AF-tRNA synthesis. .
  • Figure 3 shows BODIPY FL-X-AF, BODIPY FL_AF, BODIPY FL-XK, and BODIPY FL-K introduced into streptavidin using the 4-base method, and fluorescence detection of the resulting streptavidin (right) These are the results of the estamplot analysis (left).
  • Figure 4 shows the results of quantifying lysozyme by measuring the fluorescence of an anti-lysozyme antibody (camel antibody) into which BODIPY FL-X-AF was introduced.
  • camel antibody anti-lysozyme antibody
  • FIG. 5A shows the structural formulas of BODIPY FL-AF, BODIPY R6G-AF, BODIPY 558 / 568-AF and BODIPY 576 / 589-AF. These are each introduced into streptavidin by the 4-base method, and the results of fluorescence detection (B) and Western blot analysis (C) of the resulting streptavidin are shown.
  • FIG. 6A shows the structural formulas of Biotin-Lys, Biotin-X-Lys, Biotin-AF, and Biotin-X-AF. Each of these was introduced into the green fluorescent protein by the 4-base method, and the resulting green fluorescent protein was detected by fluorescence detection (B) and subjected to streptavidin-binding Western blot analysis using al force phosphatase (0).
  • the supernatant was removed, and the precipitate was again dissolved by adding 20 L of acetonitrile, 1.4 mL of getyl ether was added, and the mixture was stirred and centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed and dried under reduced pressure.
  • a DMF solution of pdCpA tetra-n-butylammonium (0.044 ⁇ mol / L) was mixed with 1.1 mol of Boc- ⁇ -Nps-lysine cyanomethylester and allowed to react at room temperature for 2 hours. After confirming the progress of the reaction by reverse phase HPLC (eluent: linear gradient of 0.1% trifluoroacetic acid and methanol), 1.4 mL of getyl ether was added to the reaction solution. The mixture was stirred, centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed.
  • the BocLys-pdCpA of 3 mM DMSO solution 5 ⁇ L, BODIPYFL- SE or BODIPYFL-X-SE to 0.1 M DMSO solution 1 Les DMSO 5 Les 0.1 M NaHCO 3 in (Molecular Probes, Inc.) lO ⁇ L was added, on ice For 30 minutes. After neutralization by adding 1.5 ⁇ L of 1 M acetic acid, the mixture was diluted with 0.1% TFA, and the fraction containing the target compound was recovered by reverse phase HPLC (eluent: linear gradient of 0.1% trifluoroacetic acid and methanol). The solvent was removed by a centrifugal concentrator and dissolved in 50% dioxane.
  • I was eccentric.
  • the upper layer was collected, an equal amount of black-mouthed form was added, and the mixture was stirred and centrifuged.
  • the upper layer was collected, 300 L of ethanol was added, mixed gently, and left at -20 ° C for 1 hour. After centrifugation at 15000 rpm for 30 min at 4 ° C, the supernatant was removed, 200 ⁇ of 70% EtOH stored at -20 ° C was added, and the mixture was centrifuged at 15000 rpm for 4 seconds at 4 ° C. Except for the above, it was dried under reduced pressure.
  • ImM was dissolved in potassium acetate ⁇ 4.52 / L.
  • FIG. 2 The schematic diagram of the above synthesis reaction is shown in FIG. 2 taking the synthesis of BODIPY FL-X-AF-tRNA as an example. Introduction of BODIPY FL-labeled aminophenylalanine or lysine into the Tyr83 site of streptavidin
  • Reaction solution (55 ⁇ m in Hepes-KOH (pH 7.5), 210 mM potassium glutamate, 6.9 mM ammonium acetate, 1.7 mM dithiothreitol, 1.2 mM ATP, 0.28 mM GTP, 26 mM phosphoenolpyruvate, 1 mM Spermidine, 1.9% PO Polyethylene glycol-8000, 35 zg / mL folic acid, 12 mM magnesium acetate, 0.1 raM 20 kinds of amino acids, streptavidin mRNA with T7 Tag added to N-terminus and HisTag added to C-terminus.
  • the translation reaction was performed at 37 ° C for 1 hour. Water and 10 L of 2X sample buffer were added to l ⁇ L of the translation reaction solution and heated at 95 ° C for 5 minutes. 5 ⁇ l of the mixture was applied to 15% SDS-PAGE, and after completion, the cells were observed with a Doko Scanner (Moldecular Dynamics FluorImager595, excitation light 488 nm, fluorescence filter 530DF30).
  • BODIPY FL-K (BFLK) and BODIPY FL-X-K (BFLXK) were also confirmed to be introduced into streptavidin in the same manner as B, SOD, BODIPY FL-K and BODIPY FL-X-K.
  • B, SOD, BODIPY FL-K and BODIPY FL-X-K were also confirmed to be introduced into streptavidin in the same manner as B, SOD, BODIPY FL-K and BODIPY FL-X-K.
  • Figure 3 shows the results of Western plot and fluorescence detection. Fluorescence polarization measurement
  • MRNA encoding an anti-lysozyme antibody (derived from ratada) with BODIPY FL-X-AF introduced at the N-terminus of the anti-lysozyme antibody, and with a T7 Tag at the N-terminus and a HisTag at the C-terminus (SEQ ID NO: 1)
  • BODIPY FL-X-AF-tRNA a translation reaction was performed in the presence of BODIPY FL-X-AF-tRNA in the same manner as for streptavidin.
  • 2 mM oxidized glutathione was added instead of dithiothreitol to form disulfide bonds.
  • the solvent was removed by a centrifugal concentrator, and trifluoroacetic acid 100 / zL was added and dissolved under ice cooling, and the mixture was left under ice cooling for 5 minutes. After removing trifluoroacetic acid under reduced pressure, add 200 / _iL of water, take a portion, and hydrolyze with 0.1 M NaOH. The amount of released pdCpA was quantified by reversed-phase HPLC, and the concentration of the recovered target compound was determined. After concentration by centrifugation, it was dissolved in DMS0 to a concentration of 2.2 mM.
  • the translation reaction, SDS-PAGE, and Western plot were performed in the same manner as for the introduction of BODIPY FL-labeled aminophenylalanine or lysine. However, fluorescence was detected using excitation light of 514 nm and a fluorescence filter of 590DF30.
  • the translation reaction and SDS-PAGE were performed in the same manner as for streptavidin using aminoacyl-tRNA to which labeled aminophosphorylalanine or lysine was bound.
  • a sample buffer containing no mercaptoethanol was used, and the heat treatment was performed at 50 ° C for 5 minutes.
  • the labeled amino acid provided by the present invention is efficiently used in a protein synthesis system, and by using this, a protein having a function derived from a labeled compound can be efficiently synthesized in the protein synthesis system. Therefore, the present invention provides an effective new means for efficiently synthesizing a functional protein.
  • SEQ ID NO: 1 shows the sequence of an artificial mRNA of streptavidin fused with a T7 tag and His-Tag labeled with BODIPY-FL.
  • sequence of 64 to 96 encodes the T7 tag
  • sequence of 112 to 589 encodes streptavidin
  • sequence of 590 to 607 encodes His-Tag.
  • 358-361 CGGG sequences encode BODIPY FL-X-AF.
  • SEQ ID NO: 2 shows the sequence of an artificial mRNA of a camel anti-lysozyme antibody fused to a T7 tag labeled with BODIPY-FL and His-Tag.
  • the sequence of 64 to 96 encodes the T7 tag
  • the sequence of 116 to 514 encodes the camel anti-lysozyme antibody
  • the sequence of 515 to 532 encodes the His-Tag.
  • the sequence of 100-103 CGGG encodes BODIPY FL-X-AF.
  • SEQ ID NO: 3 shows the sequence of a green fluorescent protein artificial mRNA fused to a BODIPY-FL-labeled T7 tag and His-Tag.
  • the sequence of 64 to 96 encodes the T7 tag
  • the sequence of 116 to 826 encodes the green fluorescent protein
  • the sequence of 827 to 844 encodes the His-tag.
  • Code. The sequence of 100-103 CGGG encodes a biotin-labeled amino acid.

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Abstract

本発明は､蛋白質合成系を利用して蛋白質内に導入可能な標識化アミノ酸、および標識化合物由来の機能を有する機能性蛋白質に関する。　アミノ酸の側鎖に芳香環が結合しており、該芳香環を介して標識化合物がアミノ酸に結合している､標識化アミノ酸に関し、さらに該標識化アミノ酸が導入された機能性蛋白質にも関する。さらに本発明は､標識化アミノ酸-ｔRNA複合体を収率よく得るための新規方法を提供する。

Description

明 細 書 非天然型標識化ァミノ酸および該ァミノ酸- tRNA結合体の作製方法 技術分野
本発明は、非天然型ァミノ酸として側鎖にベンゼン環等の芳香環を含むアミノ 酸骨格を有するアミノ酸にスぺーサーを介して/または介さずに標識化合物が結 合した標識化アミノ酸を提供する。該標識化アミノ酸は、 これを蛋白質合成系を 利用して蛋白質内に導入することによって、 標識化合物に由来する機能を担持す る機能性蛋白質を再現性よく提供することができる。 さらに本発明は、 標識化ァ ミノ酸を収率よく tRNAに担持させることができるアミノアシル tRNAの新規な作製 方法に関する。 背景技術
機能性基を蛋白質表面に導入する場合、一般に用いられるのが蛋白質の特定残 基への化学修飾である。この化学修飾は簡単であり、一度に多数の特定の残基を修 飾できるというメリットがある反面、修飾部位および Zまたは修飾数の制御の再 現性という点では優れた結果が得られ難いという課題もある。 近年の遺伝子工学 の発展により、 蛋白質中のアミノ酸残基の置換が可能となり、 蛋白質合成系を改 変することで、 ァミノ骨格を有する所望の非天然型アミノ酸を蛋白質中に導入す ることが可能となり、 機能性基を担持する蛋白質を再現性よく合成することが可; 能となった。
蛋白質合成においてアミノ酸はまず tRNAの 3' 末端に結合し、次に蛋白質合成の 場であるリボソームへ運ばれる。リポソームではコドンからアミノ酸への翻訳が 行われる。非天然型ァミノ酸を結合させた tRNAを用いることによって非天然型ァ ミノ酸を蛋白質に組み込むことができる。 P. G. Schultzら及び A. R. Chamber 1 inらは 終止コドン UAGを非天然型ァミノ酸に割り当てることによつて非天然型ァミノ酸 を蛋白質に組み込む終止コ ドン法を報告している（Science, 244, p. 182. 1989、 J. Am. Chem. Soc.， 111, p. 8013， 1989)。しかしながら、終止コドン法の場合、複数の非 天然型アミノ酸を蛋白質に同時に導入することは不可能であり、収率も低いとい う欠点、がある。
宍戸らは、コドンを 4塩基に拡張する 4塩基コドン法を開発した。 mRNAの非天然型 アミノ酸を導入したい部位に 4塩基コドンを組み込み、 tRNAのアンチコドン部位を 対応する 4塩基に置換し、さらに非天然型アミノ酸を結合させておく。これらを用 いて蛋白質合成を行うと、 4塩基コドンに置換した部分ではリボソームの中で 4塩 基のコドン'アンチコドンペアが形成され、 tRNAに結合させた非天然型アミノ酸は 伸長中のぺプチド鎖に組み込まれる。一方、その他の部分は通常通り 3塩基ずつ翻 訳されるので、最終的に得られる蛋白質には 4塩基コドンで指定した部分にのみ非 天然型アミノ酸が導入されていることになる。 詳細には、 Hohsaka T. , et al. , J. Am. Chem. Soc. , 118， 9778—9779, 1996および Hohsaka Τ·， et al.， J. Am. Chem. Soc , 121, 34-40， 1999を参照のこと（該文献は、 参照として本明細書中 に援用することとする）。
さらに、 平尾らは、 人工塩基対による蛋白質の合成系 （人工塩基コドン法） を 開発している （Hirao, I.， et al. , Nature Biotech. , 20， 177-182， 2002) 。
これらの方法において、 非天然型ァミノ酸を tRNAに結合させるための方法とし て、 tRNAの 3 ' 末端のジヌクレオチドを欠落させ、代わりに非天然型アミノ酸を結 合させたジヌクレオチドを RNA連結酵素によって結合させる化学的アミノアシル 化法を用いることで、非天然型アミノ酸を tRNAに結合させることができる。さらに 4塩基コドン法おょぴ人工塩基コドン法では、 複数の非天然型アミノ酸を蛋白質 へ同時に導入することもできる。
このように非天然型アミノ酸を蛋白質へ導入することによって蛋白質の構造 · 機能の解析のみならず、何らかの機能を人工的に付加した人工的な蛋白質の作製 が可能になった。したがって、 非天然型アミノ酸として、 種々の標識物をァミノ 酸骨格に結合させたものを用いることで、 該標識物を取り込んだ標識化蛋白質が 得られる。 それぞれの標識物に応じた方法を用いて、 該標識化蛋白質を直接的に、 または標識物が酵素基質または抗原性物質である場合などは酵素化学的手法また は酵素免疫化学的手法などの間接的手法により、 検出および/または精製するこ とができ、 様々な医学、 薬学、 高分子化学、 生化学等に関連する技術分野におい て様々な用途への利用が期待される。
しかしながら、 tRNAに結合さえすれば、 いかなる非天然型ァミノ酸も蛋白質へ 導入できるわけではない。天然の蛋白質合成系は 20種類の天然アミノ酸ならばど れでも区別なくポリぺプチド鎖に組み込む寛容性を持っており、非天然型ァミノ 酸についてもある程度の許容性をもっていると考えられるが、 1-ピレニルァラ二 ン、フエロセニルァラニンなどのかさ高い分子構造を有する側鎖を持つアミノ酸 を蛋白質に導入することは、 天然の蛋白質合成系では不可能である。天然の蛋白 質合成系では、 リボソームには 2つの tRNA取り込み部位があり、 その 1つにはポリ ぺプチドが結合した tRNA力 他の 1つには未反応のアミノ酸を担持している tRNAが 取り込まれるが、 かさ高いアミノ酸が結合している tRNAはリボソームに取り込ま れることができず、蛋白質に導入できないと推測されている。
標識化合物のうち、 特に、 蛍光物質は、 蛋白質の標識物として非常に有用性の 高い物質である。さらに、 可視光域における発光物質は、 広く一般に普及してい る検出機器によって検出できる。 また、 種々の高感度な検出機器が既に開発され、 普及している。 さらに、 細胞標識等においても細胞内の蛍光発光による干渉作用 を受けないので、標識化合物として非常に有用性が高い。しかしながら、これらの 蛍光物質はその分子量が大きく、非天然型ァミノ酸の標識化合物として使用した 場合、蛋白質合成系を用いた方法ではその蛋白質への導入が困難である。 さらに、 蛍光性、 発光性の他にも、 酵素反応性、 抗原性、 蛋白質結合性および分子間相互 作用性など様々な機能を有する化合物が標識化合物として有用である。 そこで、 標識化合物の分子量によって蛋白質合成系を用いた方法により蛋白質への導入の 可能性が制限されるという問題が、 当該技術において解決されることが望まれて いる。 発明の開示
本発明は、蛋白質合成系を利用して蛋白質内に導入可能な標識化アミノ酸を提 供する。 さらに、 該標識化アミノ酸が導入されることにより、 標識化合物由来の 機能を有する機能性蛋白質も提供する。
さらに本発明は、標識化アミノ酸- t RNA結合体を収率よく得るための新規方法 を提供する。 該方法によって、 上記標識化アミノ酸の蛋白質合成系を介する蛋白 質への導入が可能である。
本発明は、 以下の態様：
1 . 芳香環を介して標識化合物がアミノ酸に結合している標識化アミノ酸であつ て、 該芳香環が、 天然型アミノ酸の側鎖に含まれているものまたはアミノ酸の側 鎖に結合されたものである、 上記標識化アミノ酸、
2 . アミノ酸がフエ二ルァラニン、 チロシン若しくはトリプトファンまたはそ の誘導体である、 上記 1に記載の標識化アミノ酸、
3 . アミノ酸がァミノフエ二ルァラニンまたはその誘導体である、 上記 2に記 載の標識化アミノ酸、
4 . 上記芳香環においてアミノ酸骨格に対してメタ位またはパラ位に標識化合 物が結合していることを特徴とする、 上記 1〜 3のいずれかに記載の標識化アミ ノ酸、
5 . 上記芳香環においてアミノ酸骨格に対してパラ位に標識化合物が結合して いることを特徴とする、 上記 4に記載の標識化アミノ酸、
6 . アミノ酸と標識化合物とがスぺーサーを介して結合している、 上記 1〜5 のいずれ力 1項に記載の標識化ァミノ酸、
7 . スぺーサ一が C、 0、 Nもしくは Sまたはこれらの組み合わせからなる 2〜 1 8個の原子が直鎖状に結合している直鎖構造を有する、 上記 1〜6のいずれかに 記載の標識化アミノ酸、
8 . スぺーサ一が (、 0、 Nもしくは Sまたはこれらの組み合わせからなる 4〜 1 5個の原子が直鎖状に結合していることを特徴とする、 上記 7に記載の標識化ァ ミノ酸、
9 . 標識化合物が色素化合物、蛍光物質、化学または生物発光物質、 酵素基質、 補酵素、 抗原性物質およぴ蛋白質結合性物質からなる群より選択されるものを含 む、 上記 1〜8のいずれかに記載の標識化アミノ酸、
1 0. 標識化合物が蛍光物質である、 上記 9に記載の標識化アミノ酸、
1 1. 蛍光物質が可視光域に励起波長および発光波長を有する物質である、 上 記 1 0に記載の標識化ァミノ酸、
1 2. 蛍光物質が、 その化学構造に 4， 4-ジフルォロ- 4-ボラ- 3a, 4a -ジァザ- s - ィンダセンを基本骨格として含む化合物又はその塩もしくはその誘導体である、 上記 1 1に記載の標識化ァミノ酸、
1 3. 蛍光物質が、 4, 4 -ジフルォロ- 5, 7-ジメチル- 4 -ボラ- 3a, 4a -ジァザ- s -ィ ンダセン -3-プロピオン酸又はその塩である、 上記 1 1に記載の標識化アミノ酸、
1 4. 下記式（式 I) ：
COOH
Figure imgf000007_0001
で表される、 標識化アミノ酸、
1 5. 下記式（式 II) ：
Figure imgf000007_0002
で表される、 標識化アミノ酸、
1 6 . さらに、 pdCpA基に結合していることを特徴とする、 上記 1〜1 5のい ずれかに記載の標識化アミノ酸、
1 7 . 1個以上の上記 1〜1 5のいずれかに記載の標識化アミノ酸が導入され た機能性蛋白質、
1 8 . 標識化アミノ酸が 4, 4 -ジフルォ口- 5， 7 -ジメチル- 4 -ボラ - 3a， 4a -ジァザ- s -ィンダセン -3-プロピオン酸又はその塩を含む化合物で標識されたものである、 上記 1 7に記載の機能性蛋白質、
1 9 . 1個以上の上記 1 4または 1 5に記載の標識化アミノ酸が導入されてい る、 4， 4-ジフルォロ- 5， 7-ジメチル- 4-ボラ - 3a， 4a-ジァザ- S-インダセン- 3 -プロ ピオン酸又はその塩を含む化合物で標識された機能性蛋白質、
2 0 . 抗体、 ストレプトアビジン誘導体または緑色蛍光蛋白質誘導体である、 上記 1 7〜1 9のいずれかに記載の標識化機能性蛋白質、
2 1 . ラクダ抗リゾチーム抗体誘導体である、 上記 2 0に記載の標識化機能性 蛋白質、
2 2 . 抗原であるリゾチーム分子と結合することにより蛍光偏光が増大するこ とを特徴とする、 上記 2 1に記載のラクダ抗リゾチーム抗体誘導体、
2 3 . 上記 1〜 1 5のいずれかに記載の標識化ァミノ酸が導入された機能性蛋 白質の合成方法であって、 標識化合物の導入が、 無細胞蛋白質合成系または生細 胞による蛋白質合成系により達成される、 上記方法、
2 4 . 蛋白質合成系として 4塩基コドン法、 終止コドン法または人工塩基コド ン法を使用する、 上記 2 3に記載の機能性蛋白質の合成方法、
2 5 . 蛋白質合成系として 4塩基コドン法を使用する、 上記 2 4に記載の機能 性蛋白質の合成方法、
2 6 . 上記 1〜1 5に記載の標識化アミノ酸と、 該アミノ酸をコードするよう に設計されたコドンに対するアンチコドンを有する tRNAとが結合している、 アミ ノアシノレ tRNA、 ならびに、
2 7 . 上記 2 6に記載のアミノアシル tRNAを合成する方法であって、 アミノ酸 に pdCpA基を結合させた後、 該 pdCpA結合アミノ酸を標識化合物と反応させて標識 化アミノ酸- pdCpAを得、 これを tRNA (-CA)と結合させることを特徴とする、 上記 方法、
に関する。
本発明により提供される標識化アミノ酸を蛋白質合成系を介して蛋白質に導入 させ、 標識化蛋白質を合成することが可能である。
本明細書中の 「アミノ酸」 とは、 一般的に用いられている通り、 天然型または 非天然型を問わず、 同一分子内にカルボキシル基とアミノ基を有するあらゆる化 合物を指し、 「標識化アミノ酸」 とは標識化合物と結合したアミノ酸をいう。 本 明細書中の 「アミノ酸骨格」 はアミノ酸中のカルボキシル基、 アミノ基、 および これらを連結している部分を含有する。
本明細書中に用いる 「スぺーサ一」 という用語は、 標識化アミノ酸分子におけ るアミノ酸部と標識化合物とを連結している部分を指す。 即ち、 標識化アミノ酸 分子内のアミノ酸側鎖と標識化合物が直接結合しているのではなく、 アミノ酸側 鎖と標識化合物との間に 1つ以上の原子が存在する場合、 該標識化アミノ酸のァ ミノ酸部と標識化合物はスぺーサーを介して連結しているという。 スぺーサ一は、 その主鎖部分に (：、 0、 Nおよび Sのうちの少なくとも 1種を少なくとも 1つ以上含 んでいればよい。 またスぺーサ一の主鎖構造は、 上記原子が 2〜1 0個、 好まし くは 3〜 8個、 さらに好ましくは 5、 6または 7個が直鎖状に結合したものが好 ましく、 直鎖構造内には、 二重結合が 1つ以上含まれていてもよい。 さらに、 ス ぺーサ一は、 ベンゼン環および/またはシク口へキシル環などの環状構造を 1〜 数個、 好ましくは 1〜5個、 さらに好ましくは 1〜 3個、 有していてもよい。 ま た、 ベンゼン環ゃシクロへキシル環などの環状構造、 もしくは環状構造と上記直 鎖構造とが組み合わされた構造のものでもよい。 具体的には、 ポリエチレン、 ポ リプロピレン、 ポリイソプテン、 ポリスチレン、 ポリビュル、 ポリ塩化ビニルな どのポリオレフイン、 ボリォキシエチレン、 ポリエチレングリコーノレ、 ポリビニ ルアルコールなどのポリエーテル、 ポリアミ ド、 ポリエステル、 ポリイミ ド、 ポ リウレタン、 ポリカーボネートなどが挙げられる。 標識化合物の種類によっては、 導入された蛋白質内においてその機能をより効 果的に発揮するために、 スぺーサーを介してアミノ酸と結合することが有利なも のもある。 例えば、 標識化合物の種類によっては、 スぺーサーを介して結合して いる方が、 導入された蛋白質内での該標識物への立体障害が軽減されるというこ とが考えられる。
さらに、 本発明の標識化アミノ酸は、 アミノ酸部の側鎖に芳香環を有し、 該芳 香環に、 スぺーサーを介してまたはスぺーサーを介さずに、 標識化合物が結合し ているものが好ましい。
本明細書で用いる 「芳香環」 とは、 一般的に、 あらゆる不飽和環状化合物を指 す。 したがって、 5もしくは 6員の複素芳香環、 または 2個以上、 好ましくは 2〜5 個、 さらに好ましくは 2〜3個の環構造を含む多環性化合物も含む。 特に、 芳香環 はベンゼン環であることが好ましい。 天然型アミノ酸のうち、 フエ二ルァラニン、 トリプトファンおよびチロシンはその側鎖に芳香環を含有する天然型芳香族アミ ノ酸であり、 該芳香環に標識化合物が （スぺ一サーを介してまたはスぺーサーを 介さずに） 結合したものは、 本発明の標識化アミノ酸の好ましい例として挙げる ことができる。
芳香環を有するァミノ酸と標識化合物の結合およびスぺーサーを介した芳香環 を有するアミノ酸と標識化合物との結合は、 適当な官能基どうしの結合を利用す ればよい。 蛋白質合成の際にペプチド伸長反応に関与しない、 天然型あるいは非 天然型アミノ酸の、 アミノ基、 チオール基、 カルボキシル基、 水酸基、 アルデヒ ド基、 ァリル基、 ハロゲン化アルキル基など種々の官能基のいずれかに標識化合 物を、 スぺーサーを介して、 または介さずに結合する。 アミノ基標識用プローブ としてスクシンイミ ドエステル、 イソチオシァネート、 スノレホニノレクロライ ド、 NBD-ハライ ド、 ジクロロ トリアジンなどの化合物が、 チオール基標識用プローブ としてアルキルハラィ ド、 マレイミ ド、 アジリジンなどの化合物が、 カルボキシ ル基標識用プローブとしてジァゾメタン化合物、 脂肪族臭化物、 カルポジイミ ド などが利用できる。 例えば、 標識化合物にスぺーサーを介して、 または介さずに、 スクシンィミ ドエステルを導入し、 かつアミノ酸の芳香環にアミノ基を導入しァ ミ ド結合により両者を結合させることができる。 芳香環にアミノ基を導入したァ ミノ酸として、 例えばァミノフエ二ルァラニンが挙げられる。 この際に用いる官 能基は、 適宜選択導入できるし、 結合方法も適宜選択できる。 この際、 アミ ド結 合形成反応を pH5程度で行なうことで、 他にァミノ基が存在していても、 ァミノ フエ二ルァラニンの側鎖のァミノ基に選択的に反応させることができる。 あるい は、 他のアミノ基を Boc化等により保護し、 反応後脱 Boc化すればよい。 この方法 は、 例えば、 「新生化学実験講座 1 蛋白質 VI 構造機能相関」 の記載等を参照 すればよい。
なお、 本発明の標識化アミノ酸を、 後述の蛋白質合成に用いて標識化機能性蛋 白質を作製するためには、 アミノ酸に tRNAと結合させるために必要な特定の基を 結合させておく必要がある。 例えば、 アミノ酸のカルボキシル基にジヌクレオチ ド （pdCpA) を結合させておけば、 3' 末端の CAジヌクレオチドを欠落させた tRNA ( t RNA (-CA) ) と結合させ、 人工アミノアシル t RNAを作製することができる。 アミノ酸骨格を形成する原子に芳香環が直接結合していても、 C、 0、 Nおよび S のうちの少なくとも 1種の 1、 2、 または 3個の原子を介して間接的に結合して いてもよい。 芳香環はベンゼン環である場合、 ベンゼン環上にスぺーサーまたは 標識化合物が結合する位置は、 アミノ酸骨格の位置に対して、 パラ位またはメタ 位であることが、 リボゾームへの取り込み効率がより高くなり、 より好ましく、 特にパラ位であることが好ましい。
前述のように、 芳香環の官能基にスぺーサーを介してまたは介さずに標識化合 物を結合させる。 ァミノフエ二ルァラニンの場合、 パラアミノフエ二ルァラニン、 メタアミノフエ二ルァラニンが好ましい。
本発明の標識化アミノ酸は、 その標識物の特性を有するため、 所望の機能を有 する標識化合物を選択することにより、 標識化ァミノ酸に所望の機能を付加する ことができる。 本明細書中では、 このような標識化合物に由来する機能を有する 蛋白質を 「機能性蛋白質」 と呼ぶ。
本発明において用いる標識化合物は、 当業者には公知の色素化合物、蛍光物質、 化学/生物発光物質、 酵素基質、 補酵素、 抗原性物質および蛋白質結合性物質で あり、 蛋白質合成系に用いるには、 分子量が 1500以下、 好ましくは 1000以下、 さ らに好ましくは 500以下のものがよい。 本発明に利用可能な蛍光物質としては、 ローダミン、 フルォレセイン （FITC) 、 テキサスレッ ド、 ァクリジンオレンジ、 サイバーグリーン、 Cy3、 Cy5、 ならびに BODIPY化合物等、 ならびにこれらの誘導 体を含む公知のあらゆる蛍光物質が挙げられる。
本発明に使用するのに特に好ましい蛍光物質として、 その化学構造に 4， 4-ジフ ルォロ _4 -ボラ - 3a, 4a -ジァザ - s-ィンダセンを基本骨格として含む化合物又はそ の塩もしくはその誘導体を挙げることができる （本明細書中では、 該化合物又は その塩もしくはその誘導体を総称して BODIPY化合物とも呼ぶ） 。 その例としては、 BODIPY (登録商標） FL、 BODIPY (登録商標） TR、 BODIPY (登録商標） R6G、 BODIPY (登録 商標） 558/568および BODIPY (登録商標） 576/589をはじめ、 蛍光特性を異にする多 種多様なものが、 Molecular Probes 社 （オレゴン州、 米国） 等から市販されて いるが、 現在市販品として入手可能なものに限定はされない。
ルシフェリン、 ルミジェン等の化学もしくは生物発光物質またはその誘導体も 標識化化合物として本発明に用いることができる。 蛍光標識化合物としては、 可 視光域内 （400〜700nm付近） に励起波長を有し、 さらに可視光域内に発光波長を 有するものが好ましく、 水溶液中での発光強度が強いものが特に好ましい。 BODIPY化合物には、 可視光域内に励起波長および発光波長を有するものが種々あ り、 例えば、 BODIPY FLは、 488nmの光で励起され、 可視光領域で強い発光を有す るため、 アルゴンレーザー光によって励起可能であり、 既存の汎用機器で高感度 かつ容易に検出できるという点で大きな利点を有する。
さらに、 補酵素類、 抗原性を有する物質および特定の蛋白質に結合することが 判っている物質などの中から、 対象とする蛋白質に付与したい機能に応じて適宜 選んで、 それを標識化合物として本発明に用いることができる。 さらに、 特定の 酵素に対する基質は （例えば、 アルカリホスファターゼまたは ]3ガラク トシダー ゼに対する基質等） その酵素による呈色反応を利用して検出することができる。 また、 抗原性を有する物質、 特定の蛋白質に結合することが判っている物質で 標識された蛋白質は、 抗体または結合する蛋白質を用いた間接的検出法に用いる ことができる、 および、 精製が簡便であるという利点を有している。 例えば、 本 発明の方法を用いてビォチンで標識した機能性蛋白質は、 ピオチンを介してアビ ジンまたはストレプトアビジンと結合するという機能を有しており、 この機能を 利用すれば、 本発明の方法によりまたは化学的に蛍光化合物等で標識したァビジ ンもしくはストレプトアビジンとの結合を利用して特定の物質の検出系を確立す ることが可能である。 この他、 種々の色素、 ならびに、 さまざまな生化学的、 ィ匕 学的、 免疫化学的な検出方法で検出可能な物質を標識化合物に用いることができ ることが、 当業者には理解できる。
本発明の特定の態様においては、 市販の蛍光色素 B0DIPY化合物の 1つである 4, 4-ジフルォロ- 5, 7 -ジメチル- 4-ボラ- 3a， 4a-ジァザ- s -ィンダセン- 3-プロピオ ン酸 (4, 4-Dif luoro-5, 7- Dimethyl_4 - Bora - 3a， 4a - Diaza-s-Indacene - 3 - Propionic Acid； BODIPY (登録商標） -FL)をァミノフエ二ルァラニンの側鎖の芳 香環に結合させた、 上記式 Iに示す構造を有する BODIPY FL標識化ァミノフエニル ァラニン誘導体 （BODIPY FL-AF) が提供される。 これは、 蛋白質合成系にて蛋白 質への導入が可能であり、 得られる蛋白質は、 BODIPYの蛍光特性（即ち、 可視光 にて強い発光を示す）を有しており、 容易に検出可能である。
さらに別の態様では、 BODIPY化合物の誘導体の 1つである 6 -（（4, 4-ジフルォ ロ- 5, 7 -ジメチル- 4 -ボラ- 3a， 4a -ジァザ- s-ィンダセン- 3-プロピオニル）了ミノ） へキサン酸 (6- ( (4, 4 - Dif luoro- 5, 7-Dimethyl-4-Bora-3a, 4a - Diaza- s-Indacene- 3-Propionyl) Amino) Hexanoic Acid； BODIPY (登録商標) FL- X) を標識化合物と して用いる場合、 BODIPY FL - X由来の - CO- CH2 - CH2- CH2- CH2- CH2 - NH-の構造を有す る部分をスぺーサ一として BODIPY FLがアミノ酸に結合した BODIPY標識化ァミノ 酸が得られる。
例えば、 アミノ酸として、 パラアミノフエ二ルァラニンを用いると、 上記式 IIで 示される、 BODIPY FL - X-ァミノフエ二ルァラエン （BODIPY FL-X - AF) が得られる。
BODIPY FL-X -ァミノフエ二ルァラニン （BODIPY FL- X - AF) の他、 BODIPY R6G - AF、 BODIPY 576/589- AFおよび BODIPY 558/568- AFも、 本発明において好ましい標 識化アミノ酸であるが、 特に BODIPY FL-AFおよび BODIPY 558/568- AFが好ましい。 本発明の標識化アミノ酸を蛋白質合成系に用いる場合、 本発明の標識化ァミノ 酸が結合したアミノアシル t RNAを合成する必要がある。 このため、 本発明の標 識化ァミノ酸は t RNAと結合するための結合部分を有する必要があり、 該部分と して例えばジヌクレオチド （pdCpA) が挙げられる。 この際、 あらかじめァミノ 酸に pdCpAを結合させておき、 アミノ酸 - pdCpAを適当な標識化合物で標識すれば よい。
例えば、 ァミノフエ二ルァラニンに pdCpAを結合させた AF - pdCpAをアミノ酸と して用いる場合、 BODIPY FL - Xと結合させると、 下記式 （式 III) ：
Figure imgf000014_0001
で示される構造を有する標識化アミノ酸- pdCpA (BODIPY FL- X - AF - pdCpA)が得られ る。 該化合物において、 上述の通り BODIPY FL- X由来の - C0-CH2_CH2- CH2- CH2- C -NH-の構造を有する部分からなるスぺーサーを介して、 ァミノフエ二ルァラ ニン - pdCpA (AF-pdCpA) と標識化合物である BODIPY FLが結合している。 該標識 化アミノ酸もまた、 蛋白質合成系にて蛋白質への導入が可能であり、 得られる蛋 白質は、 BODIPY FLの蛍光特性（即ち、 可視光にて強い発光を示す）を有しており、 容易に検出可能である。
このように、 BODIPY FL- Xは、 本発明におけるスぺーサ一が既に含有された標 識化合物として本発明の標識化アミノ酸の合成に特に有用である。
本発明における標識化アミノ酸としては、 上記の BODIPY FL- AFまたは B0DIPY FL - X- AFが特に好ましい。 BODIPY FLの蛍光特性を保持し、 かつ、 蛋白質合成系に よって蛋白質中に効率よく取り込まれるからである。 例えば、 BODIPY FL標識化 リジンである BODIPY FL-Kおよび BODIPY FL-X-Kと比較した場合、 その蛋白質中へ の取り込みは有意に高い。 後述の実施例参照のこと。
本発明による標識化アミノ酸を蛋白質に導入することにより、 所望の蛋白質分 子内に上記標識化アミノ酸が導入された機能性蛋白質が得られる。 該蛋白質は、 所望の任意のものであってよく、 酵素、 ならびに抗体およびストレプトアビジン などの特定の分子に結合する特性を有する蛋白質であってもよい。
本発明はまた、 上記機能性蛋白質を合成する方法を提供する。 機能性蛋白質を 蛋白質生合成系で合成するには、 本発明の標識化アミノ酸と、 該標識化アミノ酸 を特異的にコードするように設計したコドンに対するアンチコドンとが結合され ているァミノァシル t RNAを作製することが必要である。 かかるァミノアシル tRNAを合成するには、 例えば、 アミノ酸のアミノ基を Boc化等により保護し、 ジ ヌクレオチド （pdCpA) に結合させた後に脱 Boc化などの脱保護化の処理をし、 得 られたアミノ酸一 pdCpAと標識化合物を反応させることによって、 芳香環に導入 された官能基を介して標識化合物を結合させ、 得られた PdCpAと標識化アミノ酸 との結合物を液体クロマトグラフィーにより精製し、 一方で、 3 ' 末端の CAジヌ クレオチドが欠落した t RNA ( t RNA (- CA) ) を作製し、 これに標識化アミノ酸- pdCpAをリガーゼで結合させることにより得られる。 このような、 アミノ酸をま ず pdCpAと結合させた後に標識化合物と反応させて標識化ァミノ酸 - pdCpA結合体 を得るという上記標識化アミノ酸 - PdCpA結合体の作製方法も本発明に包含される。 従来の方法では、 アミノ酸を tRNAにアミノアシル tRNA合成酵素により結合させた 後に標識化合物と反応させるか、 または標識化アミノ酸をー且合成した後に pdCpAと接合させ、 それを tRNAに結合させていた。 しかし、 アミノ酸- tRNA結合体 を標識化する方法では、 ひ -アミノ基と側鎖のアミノ基を区別して標識すること が困難であり、 また、 反応しなかったアミノ酸 - tRNA結合物を取り除くことも困 難である。 その結果、 目的の標識化アミノ酸- tRNA結合物の収率、 および標識化 アミノ酸の蛋白質への導入効率が大きく低下してしまう。 さらには、 アミノアシ ル tRNA合成酵素は一般にアンチコ ドン部分も認識しているために、 4塩基コドン 法や人工塩基コドン法、 終止コ ドン法に用いる tRNAをアミノアシル化することが できない。 また、 アミノ酸として天然のアミノ酸しか標識することができない、 という欠点がある。 一方、 標識化アミノ酸を一旦合成した後に pdCpAと結合させ、 さらにそれを tRNAに結合させる方法では、 標識化合物を結合させてから目的物を 得るまでに何ステップも反応を行なうために標識化合物の使用量あたりの収率が 非常に低くなり、 蛍光修飾剤のような高価な物質を用いて標識する場合には特に 問題となる。 さらには、 標識化アミノ酸を pdCpAと結合させる際に反応試薬とし て使用する酸や塩基によって標識物質の分解が起こる可能性もある。
本発明による標識化ァミノ酸- tRNA結合物の作製法では、 最後に標識化合物と 反応させるため、 効率よく標識化アミノ酸- pdCpA結合物を合成できる。 また、 了 ミノフヱ二ルァラニンの場合は、 側鎖の芳香環にアミノ基が結合している場合に はひ-アミノ基と側鎖のアミノ基を区別して標識することができるという点でも 有利である。 また、 液体クロマトグラフィーにより標識化アミノ酸- pdCpA結合物 を反応しなかったァミノ酸- pdCpAから完全に簡単に分離精製することができる。 さらには、 最後のステップで標識化合物で標識するため、 様々な種類の標識化剤 について合成することが容易にできる。
かかる方法により作製された標識化ァミノアシル tRNAは、 無細胞翻訳系または 生細胞による蛋白質合成系を利用して実施することができる。 無細胞翻訳系とし ては、 4塩基コドン法、 人工塩基コドン法または終止コ ドン法を使用することが 好ま しい。 終止コ ドン法の詳細な方法は、 Science, 244, p. 182. 1989および J. Am. Chem. Soc. , 111, ρ· 8013, 1989を、 人工塩基コ ドン法については Hirao, I. , et al. , Nature Biotech. , 20, 177-182， 2002の記載を、 4塩基コ ドン法につい ては Hohsaka T. , et al.， J. Am. Chem. Soc.， 118， 9778 - 9779, 1996および Hohsaka T.， et al. , J. Am. Chem. Soc. , 121， 34—40, 1999の記載を参照にさ れたい。 また、 生細胞による蛋白質合成系により非天然型アミノ酸を導入した蛋 白質を得るには、 ァミノアシル t RNA及び mRNAを細胞内へマイクロインジェクシ ヨンにより注入する方法が知られており （Sciene, 268， p. 439, 1995) 、 この手 法により生細胞に本発明の機能性蛋白質を発現させることができる。
所定の蛋白質分子の任意の位置に任意の数の標識化アミノ酸を導入できるとい う点で、 4塩基コドン法を利用する方が有利な場合がある。
したがって、 本発明は上記方法により合成された、 機能性蛋白質も包含する。 かかる機能性蛋白質は、 その分子内に含む標識化合物に由来する特性を有してい るので、 この特性を利用してさまざまな応用が考えられる。
例えば、 本発明の方法を用いて蛍光化合物で標識したアミノ酸を有する標識化 蛋白質を得て、 該蛋白質と該蛋白質と結合し得る物質を結合させ、 結合体の蛍光 偏光を測定することにより、 前記蛋白質を結合し得る物質を検出することができ る。 あるいは、 該蛋白質と結合し得る物質を結合させたチップやプレートなどに、 該蛋白質を反応させ、 洗浄後蛍光を測定するか、 または未洗浄でエバネッセント 蛍光を測定することによつても、 前記蛋白質に結合し得る物質を検出することが できる。 さらには、 一分子蛍光測定法により、 該蛋白質の分子運動の様子あるい は特定の蛋白質への結合などを直接観察することも可能である。 また、 該蛋白質 を細胞に結合させてフローサイ トメ トリーを行い、 該蛋白質に対するレセプター を持つ細胞を分離したり、 該蛋白質を細胞へ取り込ませ、 該蛋白質の細胞内での 分布を調べたりすることもできる。 蛍光変化の検出や蛍光相関分光法により他の 物質との結合や結合部位環境の探索等、 様々な分野に本発明の機能性蛋白質を応 用することが可能である。 後述の実施例において、 本発明の機能性蛋白質の例と して、 ストレプトアビジンおよびラタダ抗リゾチーム抗体の BODIPY FL標識化誘 導体を示している。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2002- 209736号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 BODIPY FL-X-AF-pdCpA ( (BFLXAF-pdCpA)を HPLCにより分離した際のフ ローチャートである。
図 2は、 BODIPY FL- X-AF - tRNA合成の該略図である。 .
図 3は、 4塩基法により、 BODIPY FL-X-AF, BODIPY FL_AF、 BODIPY FL-X-Kおよ び BODIPY FL - Kをス トレプトァビジンに導入させて、 その生成されたストレプト アビジンの蛍光検出 （右） およぴゥエスタンプロッ ト分析 （左） の結果である。 図 4は、 BODIPY FL- X- AFを導入した抗リゾチーム抗体（ラクダ抗体）の蛍光を測 定することにより、 リゾチームの定量を行った結果である。 右側には、 反応の模 式図を示している。
図 5 Aは、 BODIPY FL— AF、 BODIPY R6G- AF、 BODIPY 558/568-AFおよび BODIPY 576/589- AFの構造式を示している。 これらをそれぞれ 4塩基法により、 ストレプ トァビジンに導入させて、 その生成されたス トレプトァビジンの蛍光検出 (B) およびウェスタンプロット分析 （C) の結果である。
図 6 Aは、 Biotin— Lys、 Biotin— X- Lys、 Biotin— AFおよび Biotin- X- AFの構造式 を示している。 これらをそれぞれ 4塩基法により、 緑色蛍光蛋白質に導入させて、 その生成された緑色蛍光蛋白質の蛍光検出 （B) およびス トレプトアビジン結合 アル力リフォスファターゼによるウェスタンブロッ ト分析 (0 の結果である。 発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を示し、 本発明をより具体的に説明するが、 本発明はこれらによ つて制限されるものではない。
BODIPY FL-AF-pdCpA, BODIPY FL-X-AF-pdCpA, BODIPY FL-K-pdCpAおよび BODIPY FL- X- K- pdCpAの合成
AF - pdCpAの合成
pdCpA 1;etra_n—butylanimoniumの DMF溶液 (0. 044 μ mol/ μ L) 5 Uこ、 di— Boc— aminophenylalanine cyanomethylester 1. 1 ^ molをカロえ、 室温で 2時間反応させ た。 HPLCにより反応の進行を確認した後、 反応液にジェチルエーテル 1. 4mL加え た。 撹拌し、 15000rpmで 5分間遠心し、 上清を取り除いた。 沈殿にァセトニトリ ル 20 /z Lを加えて溶解させ、 ジェチルエーテル 1. 4mLを加え、 撹拌し、 15000rpmで 5分間遠心した。 上清を取り除き、 再び沈殿にァセトニトリル 20 Lを加えて溶解 させ、 ジェチルエーテル 1. 4mLを加えて撹拌し、 15000rpmで 5分間遠心した。 上清 を取り除き、 減圧乾燥した。
ここへ、 氷冷しながらトリフルォロ酢酸 100 ^a Lを加え、 軽く撹拌して溶解させ、 10分間氷上に置いた。 トリフルォロ酢酸を減圧除去し、 ジェチルエーテル 1. 4mL を加えて撹拌後、 遠心し上清を取り除いた。 ジェチルエーテルによる洗浄をさら に 2回行なった。 減圧乾燥した後、 DMS0 40 しに溶解させた。
B0DIPY FL-AF-pdCpA, BODIPY FL- X- AF_pdCpAの合成
AF - pdCpAの DMS0溶液 8 しに、 BODIPYFL- SEまたは BODIPYFL-X- SE ( Mol ecular Probes社製） の 0. 1M DMS0溶液を 1 L、 DMS0を 7 レ 0. 1M pyridine- HC1 (pH 5. 0) を 16 L加え、 37°Cで 12時間反応させた。 逆相 HPLC (溶離液： 0. 1%トリフルォロ 酢酸とメタノールのリニアグラジェント） により目的物を含むフラクションを回 収し （HPLCのチャート有り） 、 遠心濃縮機により溶媒を除去した。 一部を取って 0. 1M NaOHにより加水分解を行い、 遊離した pdCpAの量を HPLCにより定量し、 回収 した目的物の濃度を決定した。 2. 2raMとなるように DMS0に溶解させた。
BocLvs - pdCpAの合成 '
pdCpA tetra- n - butylammoniumの DMF溶液 ( 0. 044 μ mol/ L) こ、 ひ - Boc - ε -Nps-lysine cyanomethylester 1. 1 molをカ卩え、 室温で 2時間反応させた。 逆 相 HPLC (溶離液： 0. 1%トリフルォ口酢酸とメタノールのリニアグラジェント） に より反応の進行を確認した後、 反応液にジェチルエーテル 1. 4mL加えた。 撹拌し、 15000rpmで 5分間遠心し、 上清を取り除いた。 沈殿にァセトニトリル 20 μ Lを加え て溶解させ、 ジェチルエーテル l. ½Lを加え、 撹拌し、 15000rpmで 5分間遠心した。 上清を取り除き、 再び沈殿にァセトニトリル 20 を加えて溶解させ、 ジェチル エーテル 1. 4mLを加え、 撹拌し、 15000rpmで 5分間遠心した。 上清を取り除き、 減 圧乾燥した。
これを、 200 μ L の 40mM Sodium thiosulfate, 50mM Sodium acetate, pH 4. 7 に溶解させ、 室温で 1時間放置した。 逆相 HPLCにより目的のピークを分取し、 遠 心濃縮機により溶媒を除去した。 3mMとなるように DMS0に溶解させた。 BODIPY FL-K-pdCpA BODIPY FL- X- K-pdCpAの合成
BocLys-pdCpAの 3mM DMSO溶液 5 μ Lに、 BODIPYFL- SEまたは BODIPYFL-X-SE (Molecular Probes社製） の 0.1M DMSO溶液を 1 レ DMSOを 5 レ 0.1M NaHC03を lO^ L加え、 氷上で 30分間反応させた。 1M酢酸を 1.5μ L加え中和した後、 0.1% TFAで希釈して逆相 HPLC (溶離液： 0.1%トリフルォロ酢酸とメタノールのリニア グラジェント） により目的物を含むフラクションを回収した。 遠心濃縮機により 溶媒を除去し、 ジォキサン 50^ に溶解させた。 4Μ HC1水溶液を 50 L加え、 室温 で 2時間置いた。 2M酢酸アンモニゥム 50 しを加え、 逆相 HPLCにより目的物を含む フラクションを回収した。 遠心濃縮機により溶媒を除去した。 一部を取って 0.1M NaOHにより加水分解を行い、 遊離した pdCpAの量を逆相 HPLCにより定量し、 回収 した目的物の濃度を決定した。 2.2mMとなるように匪 S0に溶解させた。
アミノアシル- tRNAの合成
5xLigation Buffer (275raM Hepes-Na pH7.5, 75mM MgCl2, 16.5mM DTT, 5mM ATP) 4 μ L、 200 μ M tRNA (- CA) 2.5 L、 アミノアシル- pdCpAの DMSO溶液 2 L、 0.1% BSA 0.4〃丄、 T4 RNA Ligase (25 units/ μ L) 1.2/_tL、 水 9.9 Lを混合し、 4°Cで 2時間反応させた。 3M AcOK ρΗ4·5を 10/zL、 水 70/_iLをカ卩え、 等量のフエ ノール/クロ口ホルム =1/1(0.3M AcOK pH4.5で飽和させたもの）を加え撹拌し、 遠 心した。 上層を回収し、 等量のクロ口ホルムを加え、 撹拌、 遠心した。 上層を回 収し、 エタノール 300 Lを加え、 軽く混合し、 - 20°Cで 1時間置いた。 15000rpm 30min 4°Cで遠心した後、 上清を除き、 - 20°Cで保存してある 70% EtOH 200μίを 加え、 15000rpm 4°Cで 5秒遠心した。 上淸を除き、 減圧乾燥した。 ImM 酢酸カリ ゥム ρΗ4·5 2 / Lに溶解させた。
BODIPY FL- X- AF- tRNAの合成を例として上記合成反応の該略図を図 2に示す。 ストレプトアビジンの Tyr83部位への BODIPY FL標識化アミノフヱ二ルァラニンま たはリジンの導入
反応液 （ΙΟμϋ に、 55 mM Hepes-KOH (pH 7.5)， 210 mM グルタミン酸カリ ゥム， 6.9 mM 酢酸アンモニゥム， 1.7 mM ジチオスレィ トール， 1.2 mM ATP, 0.28 mM GTP, 26 mMホスホェノールピルビン酸， 1 mMスペルミジン， 1.9 % ポ リエチレングリコール- 8000， 35 z g/mL 葉酸， 12 mM 酢酸マグネシウム， 0. 1 raM 20種類のアミノ酸、 N末端に T7 Tagおよび C末端に HisTagを付加したス トレプ トァビジンの mRNAであって、 Tyr83部分のコ ドンを上記標識化アミノ酸をコード する CGGGに置換したもの （配列番号 1 ) ( S / g/ ^ L) を 1 大腸菌抽出液 (Promega社製） を 2 ^ L、 上記アミノアシル -tRNA溶液を 1 L混合した。 37°Cで 1 時間翻訳反応を行なった。 翻訳反応液 l ^ Lに、 水 と 2 Xサンプルバッファー 10 Lを力 Dえ、 95°C5分間加熱した。 このうちの 5 μ ίを 15% SDS- PAGEに流し、 終了 後、 堂光スキャナー (Moldecular Dynamics社製 FluorImager595、 励起光 488nm、 蛍光フィルター 530DF30) で観察した。 同じゲルについて、 抗 T7tag抗体を用いた ウェスタンブロット分析を行なった。 BODIPY FL - AF-tRNAおよび BODIPY FL-X-AF - tRNAを加えて翻訳反応を行なった場合、 ウェスタンブロット分析において野生型 ストレプトアビジンと同じ位置にバンドが見られること、 及び、 そのバンドが蛍 光を発することから、 BODIPY FL AF (BFLAF)および BODIPY FL-X-AF (BFLXAF)がス トレプトアビジンへ導入されたことが確認された。 なお、 BODIPY FL - K (BFLK)お よび BODIPY FL- X- K (BFLXK)も、 同様にストレプトアビジンへの導入が確認された 力 S、 BODIPY FL-Kおよび BODIPY FL - X- Kともに、 BODIPY FL-AFおよび BODIPY FL- X_ AFに比べて、 ウェスタンプロッティングおよび蛍光スキャナーで検出される蛋白 質量が非常に低かった。 ウェスタンプロットおよび蛍光検出の結果を図 3に示す。 蛍光偏光度測定
抗リゾチーム抗体の N末端に BODIPY FL - X-AFが導入され、 さらに N末端側に T 7 Tag, C末端側に HisTagが付加された抗リゾチーム抗体 （ラタダ由来） をコードす る mRNA (配列番号 2 ) を用いて、 BODIPY FL- X- AF- tRNAの存在下で、 ス トレプト アビジンと同様に翻訳反応を行なった。 ただしジスルフィ ド結合形成のために、 ジチオスレィ トールの代りに 2mM酸化型グルタチオンを加えた。 金属キレート力 ラム （Clontech社製 TAL0N) により精製し、 溶出液にリゾチームを添加しながら 蛍光偏光度測定を行なった （Panvera社製 BEACON2000を使用） 。 その結果、 リゾ チームの添加に伴って、 蛍光偏光度が増加していくことが確認された。 これは N 末端に BODIPY FL- X-AFが導入された抗リゾチーム抗体に、 抗原であるリゾチーム が結合したために、 分子運動が抑制され、 BODIPY FL-X- AFの示す蛍光偏光度が増 加したためである。 図 4に測定の結果を示す。
BODIPY R6G-AF- pdCpA、 BODIPY 558/568- AF-pdCpA、 BODIPY 576/589- AF-pdCpAの 合成
AF- pdCpAの DMS0溶液 10 μ Lに、 B0DIPYR6G- SE、 BODIPY 558/568- SE、 または B0DIPY576/589-SE (Molecular Probes社製） の 0. 1M DMS0溶液を 5 μ L、 DMS0を 15 μ L, 0. 1M ピリジン - HCl (pH 5· 0)を 20 i L加え、 37°Cで 48時間反応させた。 逆相 HPLC (溶離液： 0. 1%トリフルォ口酢酸とメタノールのリニアグラジェント） によ り 目的物を含むフラクショ ンを回収し、 遠心濃縮機を用いて溶媒を除去した。 0. 1%トリフルォロ酢酸に溶解させ、 一部を取って 0. 1M NaOHにより加水分解を行 い、 遊離した pdCpAの量を HPLCにより定量し、 回収した目的物の濃度を決定した。 2. 2mMとなるように DMS0に溶解させた。
BioAF-pdCpA, B i oX-AF-p dCpA (O ^-f^
AF— pdCpAの DMS0溶液 10 μ Lに、 Biot in- SEまたは Biot in- X- SE ( Sigma社製） の 0. 1M DMS0溶液を 5 レ DMS0を 5 レ 0. 1M ピリジン - HC1 (pH 5. 0)を 20 μ L加え、 37°Cで 24時間反応させた。 逆相 HPLC (溶離液： 0. 1%トリフルォロ酢酸とメタノ一 ルのリニアグラジェント） により目的物を含むフラクションを回収し、 遠心濃縮 機により溶媒を除去した。 一部を取って 0. 1M NaOHにより加水分解を行い、 遊離 した pdCpAの量を HPLCにより定量し、 回収した目的物の濃度を決定した。 2. 2mMと なるように DMS0に溶解させた。
Bi oK-pdCpA, BioX- K- pdCpAの合成
BocLys— pdCpAの 3mM DMS0溶 ί夜 4 Uこ、 Biot in— SEまた ίま Biot in— X—SE (S i gma社 製） の 0. 1M DMS0溶液を 2 L、 DMS0を 2 レ 0. 1M NaHC03を 8 μ L加え、 氷上で 30分 間反応させた。 1M酢酸を 1. 2 ^し加え中和した後、 0. 1°/。 TFAで希釈して逆相 HPLC (溶離液： 0· 1%トリフルォロ酢酸とメタノールのリニアグラジェント） により目 的物を含むフラクションを回収した。 遠心濃縮機により溶媒を除去し、 氷冷下ト リフルォロ酢酸 100 /z Lを加え溶解させ、 氷冷下 5分間置いた。 トリフルォロ酢酸 を減圧除去した後、 水 200 /_i Lを加え、 一部を取って 0. 1M NaOHにより加水分解を 行い、 遊離した pdCpAの量を逆相 HPLCにより定量し、 回収した目的物の濃度を決 定した。 遠心濃縮後、 2. 2mMとなるように DMS0に溶解させた。
ス ト レプ トアビジンの Tyr83部位への BODIPY R6G、 B0DIPY 558/568、 B0DIPY 576/589標識化ァミノフエ二ルァラニンの導入
BODIPY FL標識化アミノフヱ二ルァラニンまたはリ ジンの導入と同様に、 翻訳 反応、 SDS-PAGEおよびウェスタンプロッ トを行なった。 ただし、 蛍光検出は励起 光 514nm、 蛍光フィルター 590DF30を使用して行なった。 BODIPY R6G-AF (BR6GAF)、 BODIPY 558/568 - AF (B558AF)、 BODIPY 576/589 - AF (B576AF)を結合させたアミノア シル tRNAを加えて翻訳反応を行なった場合、 ウェスタンプロット分析において野 生型ストレプトアビジンと同じ位置にバンドが見られること、 及び、 そのバンド が蛍光を発することから、 これらの標識化ァミノフエ二ルァラニンがストレプト アビジンへ導入されたことが確認された。 ウェスタンブロットおよび蛍光検出の 結果を図 5に示す。
緑色蛍光蛋白質の N末端部位へのピオチン標識化アミノフエ二ルァラニンまたは リジンの導入
N末端に T7Tagおよび C末端に Hi sTagを付加した緑色蛍光蛋白質の mRNAであって、 N末端部分のコ ドンを上記標識化アミノ酸をコードする CGGGに置換したもの （配 列番号 3 ) と、 ピオチン標識化ァミノフエ二ルァラニンまたはリジンを結合させ たアミノアシル tRNAを使用して、 ストレプトアビジンの場合と同様に翻訳反応と SDS - PAGEとを行なった。 ただし、 緑色蛍光蛋白質の蛍光検出を行なう場合は、 -メルカプトエタノールを含まないサンプルバッファーを使用し、 加熱処理は 50°C5分間で行なった。 抗 T7tag抗体によるウェスタンプロット分析はストレプト ァビジンの場合と同様に行い、 ストレプトァビジン結合アル力リフォスファタ一 ゼによるウェスタンブロット分析は、 ストレプトァビジン (Sigma社製) 2 μ g/mL とビォチン標識アルカリフォスファターゼ （Calbiochem社製） l _i g/mLの混合溶 液により行なった。 ビォチン標識化アミノ酸を結合させたアミノアシル tRNAを加 えて翻訳反応を行った場合、 抗 T7抗体を用いたウェスタンブロット分析において 野生型緑色蛍光蛋白質と同じ位置にバンドが見られること （データは示していな レ、） 、 緑色蛍光蛋白質に由来する蛍光バンドが観察されること、 及び、 ストレプ トァビジン結合アル力リフォスファターゼによるウェスタンプロッ ト分析によつ てバンドが検出されることが確認された。 これらのことより、 ピオチン標識化ァ ミノフヱ二ルァラニンまたはリジンが蛋白質へ導入されたことが確認された。 ゥ エスタンプロットおよび蛍光検出の結果を図 6に示す。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明により提供される標識化アミノ酸は蛋白質合成系に効率的に使用され、 これを用いることにより標識化合物に由来する機能を有する蛋白質を蛋白質合成 系で効率よく合成することができる。 したがって、 本発明により、 機能性蛋白質 を効率よく合成するための有効な新規手段を提供された。
配列表フリーテキスト
配列番号 1は、 BODIPY- FLで標識された T7タグおよび His- Tagと融合したストレ プトァビジンの人工的 mRNAの配列を示す。 該配列中、 64〜96の配列は T7タグをコ ードし、 112〜589の配列がストレプトアビジンをコードし、 590〜607の配列が His-Tagをコードしている。 358〜361の CGGGの配列が、 BODIPY FL-X-AFをコード している。
配列番号 2は、 BODIPY - FLで標識された T7タグおよぴ His - Tagと融合したラクダ 抗リゾチーム抗体の人工的 mRNAの配列を示す。 該配列中、 64〜96の配列は T7タグ をコードし、 116〜514の配列がラクダ抗リゾチーム抗体をコードし、 515〜532の 配列が His- Tagをコードしている。 100〜103の CGGGの配列が、 BODIPY FL-X-AFを コードしている。
配列番号 3は、 BODIPY - FLで標識された T7タグおよび His - Tagと融合した緑色蛍 光蛋白質の人工的 mRNAの配列を示す。 該配列中、 64〜96の配列は T7タグをコード し、 116〜826の配列が緑色蛍光蛋白質をコードし、 827〜844の配列が His- Tagを コードしている。 100〜103の CGGGの配列が、 ピオチン標識化アミノ酸をコードし ている。

Claims

請求の範囲
1 . 芳香環を介して標識化合物がアミノ酸に結合している標識化アミノ酸で あって、 該芳香環が、 天然型アミノ酸の側鎖に含まれているものまたはアミノ酸 の側鎖に結合されたものである、 上記標識化アミノ酸。
2 . アミノ酸がフエ二ルァラニン、 チロシン若しくはトリプトファンまたは その誘導体である、 請求項 1に記載の標識化アミノ酸。
3 . アミノ酸がァミノフエ二ルァラニンまたはその誘導体である、 請求項 2 に記載の標識化アミノ酸。
4 . 上記芳香環においてアミノ酸骨格に対してメタ位またはパラ位に標識化 合物が結合していることを特徴とする、 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の標 識化アミノ酸。 .
5 . 上記芳香環においてアミノ酸骨格に対してパラ位に標識化合物が結合し ていることを特徴とする、 請求項 4に記載の標識化ァミノ酸。
6 . アミノ酸と標識化合物とがスぺーサーを介して結合している、 請求項 1
〜 5のいずれ力 1項に記載の標識化アミノ酸。
7 . スぺーサ一が C、 0、 Nもしくは Sまたはこれらの組み合わせからなる 2〜
1 8個の原子が直鎖状に結合している直鎖構造を有する、 請求項 1〜6のいずれ 力 1項に記載の標識化ァミノ酸。
8 . スぺーサ一が C、 0、 Nもしくは Sまたはこれらの組み合わせからなる 4〜
1 5個の原子が直鎖状に結合していることを特徴とする、 請求項 7に記載の標識 化アミノ酸。
9 . 標識化合物が色素化合物、蛍光物質、化学または生物発光物質、 酵素基質、 補酵素、 抗原性物質およぴ蛋白質結合性物質からなる群より選択されるものを含 む、 請求項 1〜8のいずれか 1項に記載の標識化アミノ酸。
1 0 . 標識化合物が蛍光物質である、 請求項 9に記載の標識化アミノ酸。
1 1 . 蛍光物質が可視光域に励起波長および発光波長を有する物質である、 請求項 1 0に記載の標識化ァミノ酸。
1 2. 蛍光物質が、 その化学構造に 4, 4-ジフルォロ- 4 -ボラ- 3a, 4a-ジァザ - s-ィンダセンを基本骨格として含む化合物又はその塩もしくはその誘導体である、 請求項 1 1に記載の標識化ァミノ酸。
1 3. 蛍光物質が、 4, 4-ジフルォロ- 5, 7 -ジメチル _4 -ボラ - 3a, 4a-ジァザ - s - インダセン -3-プロピオン酸又はその塩である、 請求項 1 1に記載の標識化アミ ノ酸。
1 4. 下記式 （式 I) ：
Figure imgf000027_0001
で表される、 標識化アミノ酸 c
1 5. 下記式 （式 II) ：
Figure imgf000027_0002
で表される、 標識化アミノ酸。
1 6. さらに、 pdCpA基に結合していることを特徴とする、 請求項 1〜 1 5 のいずれか 1項に記載の標識化アミノ酸。
1 7 . 1個以上の請求項 1〜 1 5のいずれ力 項に記載の標識化ァミノ酸が 導入されている機能性蛋白質。
1 8 . 標識化アミノ酸が 4, 4-ジフルォロ- 5， 7 -ジメチル- 4-ボラ _3a， 4a -ジァ ザ- s-ィンダセン- 3-プロピオン酸又はその塩を含む化合物で標識されたものであ る、 請求項 1 7に記載の機能性蛋白質。
1 9 . 1個以上の請求項 1 4または 1 5に記載の標識化アミノ酸が導入され ている、 4， 4-ジフルオロ- 5， 7-ジメチル- 4-ボラ - 3a， 4a-ジァザ- S-ィンダセン- 3- プ口ピオン酸又はその塩を含む化合物で標識された機能性蛋白質。
2 0 . 抗体、 ストレプトアビジン誘導体または緑色蛍光蛋白質誘導体である、 請求項 1 7〜1 9のいずれか 1項に記載の標識化機能性蛋白質。
2 1 . ラクダ抗リゾチーム抗体誘導体である、 請求項 2 0に記載の標識化機 能性蛋白質。
2 2 . 抗原であるリゾチーム分子と結合することにより蛍光偏光が増大する ことを特徴とする、 請求項 2 1に記載のラクダ抗リゾチーム抗体誘導体。
2 3 . 請求項 1〜1 5のいずれか 1項に記載の標識化アミノ酸が導入された 機能性蛋白質の合成方法であって、 標識化合物の導入が、 無細胞蛋白質合成系ま たは生細胞による蛋白質合成系により達成される、 上記方法。
2 4 . 蛋白質合成系として 4塩基コドン法、 終止コドン法または人工塩基コ ドン法を使用する、 請求項 2 3に記載の機能性蛋白質の合成方法。
2 5 . 蛋白質合成系として 4塩基コドン法を使用する、 請求項 2 4に記載の 機能性蛋白質の合成方法。
2 6 . 請求項 1〜1 5に記載の標識化アミノ酸と、 該アミノ酸をコードする ように設計されたコドンに対するアンチコドンを有する tRNAとが結合している、 アミノアシル tRNA。
2 7 . 請求項 2 6記載のアミノアシル tRNAを合成する方法であって、 アミノ酸 に pdCpA基を結合させた後、 該 pdCpA結合アミノ酸を標識化合物と反応させて標識 化アミノ酸 -pdCpAを得、 これを tRNA (-CA)と結合させることを特徴とする、 上記 LZ
0.6800/C00Zdf/X3d 60 600請 OAV
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005075639A1 (ja) * 2004-02-06 2005-08-18 Shionogi Co., Ltd. 拡張コドンを利用した糖タンパク質の作製方法
WO2007018315A1 (ja) * 2005-08-09 2007-02-15 Japan Science And Technology Agency タンパク質と他の分子との相互作用を検出するためのタンパク質プローブ
JP2007097423A (ja) * 2005-09-30 2007-04-19 Protein Express:Kk 新規な非天然アミノ酸のタンパク質への導入法
WO2007046472A1 (ja) * 2005-10-19 2007-04-26 Olympus Corporation タンパク質の重合度を測定する方法
JP2008503217A (ja) * 2004-06-18 2008-02-07 アンブレツクス・インコーポレイテツド 新規抗原結合ポリペプチド及びそれらの使用
WO2011105610A1 (ja) * 2010-02-26 2011-09-01 国立大学法人名古屋大学 インスレーター及びその利用
JP2012526822A (ja) * 2009-05-11 2012-11-01 セレクター，インコーポレイティド 蛍光リン脂質エーテル化合物、組成物、及びその使用
US8871181B2 (en) 2009-05-11 2014-10-28 Cellectar, Inc. Fluorescent phospholipid ether compounds, compositions, and methods of use
WO2023048291A1 (ja) 2021-09-24 2023-03-30 富士フイルム株式会社 ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ、ポリペプチド合成用試薬、非天然アミノ酸の導入方法、ポリペプチドの作製方法、核酸ディスプレイライブラリの作製方法、核酸－ポリペプチド連結体及びスクリーニング方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006087821A1 (ja) * 2005-02-21 2006-08-24 Olympus Corporation タンパク質とサンプルとの反応を検出する方法
KR100925345B1 (ko) * 2008-01-10 2009-11-09 주식회사 인트론바이오테크놀로지 시험관 전사법으로 준비된 ｔＲＮＡ로부터 제조된 표지자를이용한 시험관 번역법으로 생산되는 단백질의 선택적표지방법
US20090286968A1 (en) 2008-04-25 2009-11-19 Auburn University 2-Quinoxalinol Salen Compounds and Uses Thereof
CN104650610A (zh) * 2015-01-28 2015-05-27 天津理工大学 一种不对称近红外bodipy荧光染料及其制备和应用
CN106221280B (zh) * 2016-08-09 2017-10-13 东莞理工学院 一种含bodipy类共轭单元有机染料敏化剂及其制备方法
CN108794518B (zh) * 2018-04-04 2020-06-19 安徽师范大学 一种以bodipy为基本骨架的有机共轭分子材料及其制备方法
CN114560819B (zh) * 2020-11-27 2023-09-19 中国海洋大学 取代三嗪化合物、其制备方法及在氨基酸、肽、蛋白、细胞标记中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10330299A (ja) * 1997-05-28 1998-12-15 Aisin Seiki Co Ltd アミノ酸含有物質の蛍光標識物質
WO2000013026A1 (en) * 1998-08-31 2000-03-09 Amersham Pharmacia Biotech, Inc. Energy transfer dyes
JP2001139596A (ja) * 1999-11-11 2001-05-22 Japan Science & Technology Corp 発蛍光性ポリアミノ酸誘導体

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2382063A1 (en) * 1999-09-17 2001-03-22 Shiv Kumar Charge-modified nucleic acid terminators

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10330299A (ja) * 1997-05-28 1998-12-15 Aisin Seiki Co Ltd アミノ酸含有物質の蛍光標識物質
WO2000013026A1 (en) * 1998-08-31 2000-03-09 Amersham Pharmacia Biotech, Inc. Energy transfer dyes
JP2001139596A (ja) * 1999-11-11 2001-05-22 Japan Science & Technology Corp 発蛍光性ポリアミノ酸誘導体

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIRAO I. ET AL.: "An unnatural base pair for incorporating amino acid analogs into proteins", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 20, February 2002 (2002-02-01), pages 177 - 182, XP001068466 *
HOHSAKA T. ET AL.: "Efficient incorporationof nonnatural amino acids with large aromatic groups into streptavidin in in vitro protein synthesizing systems", J. AM. CHEM. SOC., vol. 121, no. 1, 1999, pages 34 - 40, XP000953102 *
HOHSAKA T. ET AL.: "Incorporation of nonnatural amino acids into streptavidin through in vitro frame-shift suppression", J. AM. CHEM. SOC., vol. 118, no. 40, 1996, pages 9778 - 9779, XP002973328 *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005075639A1 (ja) * 2004-02-06 2005-08-18 Shionogi Co., Ltd. 拡張コドンを利用した糖タンパク質の作製方法
JP2008503217A (ja) * 2004-06-18 2008-02-07 アンブレツクス・インコーポレイテツド 新規抗原結合ポリペプチド及びそれらの使用
US9175083B2 (en) 2004-06-18 2015-11-03 Ambrx, Inc. Antigen-binding polypeptides and their uses
JP4918489B2 (ja) * 2005-08-09 2012-04-18 独立行政法人科学技術振興機構 タンパク質と他の分子との相互作用を検出するためのタンパク質プローブ
WO2007018315A1 (ja) * 2005-08-09 2007-02-15 Japan Science And Technology Agency タンパク質と他の分子との相互作用を検出するためのタンパク質プローブ
JP2007097423A (ja) * 2005-09-30 2007-04-19 Protein Express:Kk 新規な非天然アミノ酸のタンパク質への導入法
WO2007046472A1 (ja) * 2005-10-19 2007-04-26 Olympus Corporation タンパク質の重合度を測定する方法
JP2012526822A (ja) * 2009-05-11 2012-11-01 セレクター，インコーポレイティド 蛍光リン脂質エーテル化合物、組成物、及びその使用
US8871181B2 (en) 2009-05-11 2014-10-28 Cellectar, Inc. Fluorescent phospholipid ether compounds, compositions, and methods of use
JP2015007118A (ja) * 2009-05-11 2015-01-15 セレクター，インコーポレイティド 蛍光リン脂質エーテル化合物、組成物、及びその使用
JP2015166372A (ja) * 2009-05-11 2015-09-24 セレクター，インコーポレイティド 蛍光リン脂質エーテル化合物、組成物、及びその使用
JP2016193907A (ja) * 2009-05-11 2016-11-17 セレクター，インコーポレイティド 蛍光リン脂質エーテル化合物、組成物、及びその使用
US9616140B2 (en) 2009-05-11 2017-04-11 Cellectar Biosciences, Inc. Fluorescent phospholipid ether compounds, compositions, and methods of use
WO2011105610A1 (ja) * 2010-02-26 2011-09-01 国立大学法人名古屋大学 インスレーター及びその利用
WO2023048291A1 (ja) 2021-09-24 2023-03-30 富士フイルム株式会社 ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ、ポリペプチド合成用試薬、非天然アミノ酸の導入方法、ポリペプチドの作製方法、核酸ディスプレイライブラリの作製方法、核酸－ポリペプチド連結体及びスクリーニング方法

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