JP4918489B2 - タンパク質と他の分子との相互作用を検出するためのタンパク質プローブ - Google Patents
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Description
本発明は、２種類の蛍光標識アミノ酸を含むタンパク質であって、該タンパク質と他の分子との相互作用を検出するためのタンパク質プローブに関する。
タンパク質と他の分子との相互作用を検出する技術として、表面プラズモン共鳴を利用した検出技術があった。しかしながら、表面プラズモン共鳴を測定するためには、金属薄膜を形成させた基板上にタンパク質を固定化する必要があり、固定化により立体構造が変化することも考えられる。従って、タンパク質と他の分子との相互作用によって生じるタンパク質の立体構造変化を捉えることは困難であった。
また、蛍光標識したタンパク質に他の物質が結合した際の蛍光偏光度の増加を測定することにより、タンパク質と他の物質との結合を測定する技術も存在する。しかし、この方法によって、測定できるのはタンパク質と他の物質との結合の有無であり、タンパク質と他の分子との相互作用によって生じるタンパク質の立体構造変化を捉えることはできなかった。
さらに、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体とエネルギー受容体をタンパク質に結合させることで、タンパク質と他の分子との相互作用によって生じるタンパク質の立体構造変化を、蛍光共鳴エネルギー移動の変化として検出することが行なわれている（特許文献１および２を参照）。
エネルギー供与体とエネルギー受容体を結合させたタンパク質としては、化学修飾によりそれらを結合させたタンパク質、化学合成によりそれらを結合させたタンパク質、遺伝子融合により緑色蛍光タンパク質およびその改変体を結合させたタンパク質、などがある。
例えば、緑色蛍光を発する分子と赤色蛍光を発する分子をタンパク質に結合させることにより、タンパク質と他の分子との相互作用によって生じるタンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動の変化として検出することができる。また、青緑色蛍光タンパク質と黄色蛍光タンパク質をタンパク質のＮ末端とＣ末端に結合させることでも、同様にタンパク質と他の分子との相互作用によって生じるタンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動の変化として検出することができる。
しかしながら、タンパク質と他の分子との相互作用の検出を行なうためには、それに適した部位に受容体と供与体を結合させる必要がある。化学修飾ではエネルギー供与体とエネルギー受容体をそれぞれ狙った部位に特異的に結合させることは困難なため、それにより得られるタンパク質では、他の分子との相互作用を明確に検出することは困難である。一方、化学合成によりエネルギー供与体とエネルギー受容体を結合させたタンパク質は、化学合成できる分子量に限界があるため、分子量が約１万以下のものに限られる。また、遺伝子融合では緑色蛍光タンパク質およびその改変体の結合がタンパク質の活性を大きく低下させ、さらに結合部位はタンパク質のＮ末端とＣ末端に制限されるため、他の分子との相互作用を明確に検出することは困難である。
標識物質で標識された標識非天然アミノ酸をタンパク質に導入する方法として、４塩基コドンを用いた方法等が知られている（特許文献３参照）。該方法によれば、タンパク質の特定部位に標識アミノ酸を導入することが可能である。また、２種類の非天然アミノ酸の導入法も知られており（非特許文献１および２を参照）、これらの方法を組み合わせて用いることで、２種類の標識アミノ酸を特定部位に含むタンパク質を合成することが可能である。
特開２００４−５３４１６号公報
特開２００４−１８７５４４号公報
国際公開第ＷＯ２００４／００９７０９号パンフレット
Ｈｏｈｓａｋａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，１２１９４−１２１９５，１９９９
Ｈｏｈｓａｋａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０，１１０６０−１１０６４，２００１
また、蛍光標識したタンパク質に他の物質が結合した際の蛍光偏光度の増加を測定することにより、タンパク質と他の物質との結合を測定する技術も存在する。しかし、この方法によって、測定できるのはタンパク質と他の物質との結合の有無であり、タンパク質と他の分子との相互作用によって生じるタンパク質の立体構造変化を捉えることはできなかった。
さらに、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体とエネルギー受容体をタンパク質に結合させることで、タンパク質と他の分子との相互作用によって生じるタンパク質の立体構造変化を、蛍光共鳴エネルギー移動の変化として検出することが行なわれている（特許文献１および２を参照）。
エネルギー供与体とエネルギー受容体を結合させたタンパク質としては、化学修飾によりそれらを結合させたタンパク質、化学合成によりそれらを結合させたタンパク質、遺伝子融合により緑色蛍光タンパク質およびその改変体を結合させたタンパク質、などがある。
例えば、緑色蛍光を発する分子と赤色蛍光を発する分子をタンパク質に結合させることにより、タンパク質と他の分子との相互作用によって生じるタンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動の変化として検出することができる。また、青緑色蛍光タンパク質と黄色蛍光タンパク質をタンパク質のＮ末端とＣ末端に結合させることでも、同様にタンパク質と他の分子との相互作用によって生じるタンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動の変化として検出することができる。
しかしながら、タンパク質と他の分子との相互作用の検出を行なうためには、それに適した部位に受容体と供与体を結合させる必要がある。化学修飾ではエネルギー供与体とエネルギー受容体をそれぞれ狙った部位に特異的に結合させることは困難なため、それにより得られるタンパク質では、他の分子との相互作用を明確に検出することは困難である。一方、化学合成によりエネルギー供与体とエネルギー受容体を結合させたタンパク質は、化学合成できる分子量に限界があるため、分子量が約１万以下のものに限られる。また、遺伝子融合では緑色蛍光タンパク質およびその改変体の結合がタンパク質の活性を大きく低下させ、さらに結合部位はタンパク質のＮ末端とＣ末端に制限されるため、他の分子との相互作用を明確に検出することは困難である。
標識物質で標識された標識非天然アミノ酸をタンパク質に導入する方法として、４塩基コドンを用いた方法等が知られている（特許文献３参照）。該方法によれば、タンパク質の特定部位に標識アミノ酸を導入することが可能である。また、２種類の非天然アミノ酸の導入法も知られており（非特許文献１および２を参照）、これらの方法を組み合わせて用いることで、２種類の標識アミノ酸を特定部位に含むタンパク質を合成することが可能である。
本発明は、タンパク質が他の分子と相互作用したときの該タンパク質の立体構造が変化し、近接するようになるタンパク質上の２箇所の部位に、蛍光共鳴エネルギー移動を起こし得る２種類の蛍光物質で標識したアミノ酸をそれぞれ導入したタンパク質であって、蛍光共鳴エネルギー移動によりタンパク質と他の分子との相互作用を検出し得るタンパク質の提供および該タンパク質を用いた相互作用の検出方法の提供を目的とする。
本発明者は、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体とエネルギー受容体をそれぞれ結合させた非天然アミノ酸を、タンパク質の他の分子との相互作用の検出に適した部位に導入したタンパク質が他の分子と相互作用したときに、タンパク質の立体構造が変化し、エネルギー供与体とエネルギー受容体の距離および配向が変化し、蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化することを見出し本発明を完成させた。
この際、本発明者は、４塩基コドン法や終止コドン法等の非天然アミノ酸をタンパク質の特定の位置に導入する方法により、蛍光共鳴エネルギー移動が起こる位置に蛍光標識アミノ酸を導入した。
すなわち、本発明は以下の態様：
１． 蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を含むタンパク質であって、該タンパク質と結合し得る分子と結合したときに立体構造が変化しエネルギー供与体蛍光物質とエネルギー受容体蛍光物質の距離および配向が変化するような位置に２種類の蛍光標識アミノ酸が存在し蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化し得るタンパク質、
２． 蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸の一方がタンパク質のＮ末端またはＣ末端に存在し、もう一方がＮ末端およびＣ末端以外の部位に存在する上記１記載のタンパク質、
３． 蛍光物質で標識したアミノ酸を４塩基コドン法または終止コドン法により導入した上記１または２に記載のタンパク質、
４． タンパク質と結合し得る分子が、タンパク質、核酸、糖および低分子量分子からなる群から選択される上記１〜３のいずれかに記載のタンパク質、
５． エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質が、可視光域に励起波長および発光波長を有する蛍光物質である上記１〜４のいずれかに記載のタンパク質、
６． エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質が、その化学構造に４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンを基本骨格として含む分子又はその塩もしくはその誘導体である上記５記載のタンパク質、
７． エネルギー供与体となる蛍光物質が、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー受容体となる蛍光物質が４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩である上記６のタンパク質、
８． エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質がｐ−アミノフェニルアラニンのパラ位アミノ基に結合している上記１〜７のいずれかに記載のタンパク質、
９． タンパク質が、カルモジュリンまたはマルトース結合タンパク質である上記１〜８のいずれかに記載のタンパク質、
１０． エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識したアミノ酸が、カルモジュリンがカルモジュリン結合タンパク質およびカルシウムイオンと相互作用したときに、蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るカルモジュリン上の位置に存在する、上記９記載のカルモジュリン、
１１． エネルギー供与体となる蛍光物質が、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー受容体となる蛍光物質が，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、それらの蛍光物質で標識したアミノ酸が、カルモジュリンがカルモジュリン結合タンパク質およびカルシウムイオンと相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るカルモジュリン上の位置に存在する、上記１０記載のカルモジュリン、
１２． ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩ならびに，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩をそれぞれカルモジュリンのアミノ酸配列の４０番目とＮ末端、またはカルモジュリンのアミノ酸配列の９９番目とＮ末端に含むカルモジュリン、
１３． エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識したアミノ酸が、マルトース結合タンパク質がマルトースと相互作用したときに、蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るマルトース結合タンパク質上の位置に存在する、上記９記載のマルトース結合タンパク質。
１４． エネルギー供与体となる蛍光物質が、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー受容体となる蛍光物質が，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、それらの蛍光物質で標識したアミノ酸が、マルトース結合タンパク質がマルトースと相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るマルトース結合タンパク質上の位置に存在する、上記１３記載のマルトース結合タンパク質。
１５． ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩ならびに，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩をそれぞれマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列の１７１番目とＮ末端、またはマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列の２８３番目とＮ末端に含むマルトース結合タンパク質。
１６． 上記１〜９のいずれかに記載のタンパク質の製造方法であって、
２種類の４塩基コドンが挿入されたタンパク質のｍＲＮＡを調製する工程であって、４塩基コドンを挿入する位置が前記タンパク質が他の分子と相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るタンパク質上の位置に対応するｍＲＮＡの位置である工程、
蛍光共鳴エネルギー移動を起こし得る２種類の蛍光物質でそれぞれ標識した２種類のアミノ酸であって、前記４塩基コドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡが結合した２種類のアミノ酸を調製する工程、ならびに
前記ｍＲＮＡおよびアミノ酸結合ｔＲＮＡを用いてタンパク質を合成する工程とを含む製造方法、
１７． ２種類の４塩基コドンの一方を終止コドンに置き換えた上記１６記載の方法。
１８． 無細胞翻訳系でタンパク質を合成する上記１６または１７に記載の方法、
１９． タンパク質がカルモジュリンまたはマルトース結合タンパク質である上記１６〜１８のいずれかに記載の方法、
２０． ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩ならびに，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩をそれぞれカルモジュリンのアミノ酸配列の４０番目とＮ末端、またはカルモジュリンのアミノ酸配列の９９番目とＮ末端に含ませる上記１９の方法、
２１． ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩ならびに，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩をそれぞれマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列の１７１番目とＮ末端、またはマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列の２８３番目とＮ末端に含ませる上記１９記載の方法。
２２． 上記１〜９のいずれかに記載のタンパク質と被験分子を接触させ、該タンパク質と被験分子との相互作用による前記タンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより検出し、前記タンパク質と前記被験分子の相互作用を検出する方法、
２３． タンパク質がカルモジュリンまたはマルトース結合タンパク質である上記２２記載の方法、
２４． 上記１〜９のいずれかに記載のタンパク質と被験分子を接触させ、該タンパク質と被験分子との相互作用による前記タンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより検出し、前記タンパク質と相互作用する分子をスクリーニングする方法、
２５． タンパク質がカルモジュリンまたはマルトース結合タンパク質である上記２４記載の方法、
２６． 上記１〜９のいずれかに記載のタンパク質と該タンパク質と相互作用する少なくとも１つの分子および被験化合物を接触させ、該タンパク質と該分子との相互作用を前記タンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより検出し、前記タンパク質と前記分子との相互作用を阻害または増強する化合物をスクリーニングする方法、
２７． タンパク質がカルモジュリンであって、タンパク質と相互作用する分子がカルシウム結合タンパク質およびカルシウムイオンである上記２６記載の方法、ならびに
２８． タンパク質がマルトース結合タンパク質であって、タンパク質と相互作用する分子がマルトースである上記２６記載の方法。
に関する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−２３０７６８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本発明者は、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体とエネルギー受容体をそれぞれ結合させた非天然アミノ酸を、タンパク質の他の分子との相互作用の検出に適した部位に導入したタンパク質が他の分子と相互作用したときに、タンパク質の立体構造が変化し、エネルギー供与体とエネルギー受容体の距離および配向が変化し、蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化することを見出し本発明を完成させた。
この際、本発明者は、４塩基コドン法や終止コドン法等の非天然アミノ酸をタンパク質の特定の位置に導入する方法により、蛍光共鳴エネルギー移動が起こる位置に蛍光標識アミノ酸を導入した。
すなわち、本発明は以下の態様：
１． 蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を含むタンパク質であって、該タンパク質と結合し得る分子と結合したときに立体構造が変化しエネルギー供与体蛍光物質とエネルギー受容体蛍光物質の距離および配向が変化するような位置に２種類の蛍光標識アミノ酸が存在し蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化し得るタンパク質、
２． 蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸の一方がタンパク質のＮ末端またはＣ末端に存在し、もう一方がＮ末端およびＣ末端以外の部位に存在する上記１記載のタンパク質、
３． 蛍光物質で標識したアミノ酸を４塩基コドン法または終止コドン法により導入した上記１または２に記載のタンパク質、
４． タンパク質と結合し得る分子が、タンパク質、核酸、糖および低分子量分子からなる群から選択される上記１〜３のいずれかに記載のタンパク質、
５． エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質が、可視光域に励起波長および発光波長を有する蛍光物質である上記１〜４のいずれかに記載のタンパク質、
６． エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質が、その化学構造に４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンを基本骨格として含む分子又はその塩もしくはその誘導体である上記５記載のタンパク質、
７． エネルギー供与体となる蛍光物質が、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー受容体となる蛍光物質が４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩である上記６のタンパク質、
８． エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質がｐ−アミノフェニルアラニンのパラ位アミノ基に結合している上記１〜７のいずれかに記載のタンパク質、
９． タンパク質が、カルモジュリンまたはマルトース結合タンパク質である上記１〜８のいずれかに記載のタンパク質、
１０． エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識したアミノ酸が、カルモジュリンがカルモジュリン結合タンパク質およびカルシウムイオンと相互作用したときに、蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るカルモジュリン上の位置に存在する、上記９記載のカルモジュリン、
１１． エネルギー供与体となる蛍光物質が、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー受容体となる蛍光物質が，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、それらの蛍光物質で標識したアミノ酸が、カルモジュリンがカルモジュリン結合タンパク質およびカルシウムイオンと相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るカルモジュリン上の位置に存在する、上記１０記載のカルモジュリン、
１２． ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩ならびに，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩をそれぞれカルモジュリンのアミノ酸配列の４０番目とＮ末端、またはカルモジュリンのアミノ酸配列の９９番目とＮ末端に含むカルモジュリン、
１３． エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識したアミノ酸が、マルトース結合タンパク質がマルトースと相互作用したときに、蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るマルトース結合タンパク質上の位置に存在する、上記９記載のマルトース結合タンパク質。
１４． エネルギー供与体となる蛍光物質が、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー受容体となる蛍光物質が，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、それらの蛍光物質で標識したアミノ酸が、マルトース結合タンパク質がマルトースと相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るマルトース結合タンパク質上の位置に存在する、上記１３記載のマルトース結合タンパク質。
１５． ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩ならびに，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩をそれぞれマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列の１７１番目とＮ末端、またはマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列の２８３番目とＮ末端に含むマルトース結合タンパク質。
１６． 上記１〜９のいずれかに記載のタンパク質の製造方法であって、
２種類の４塩基コドンが挿入されたタンパク質のｍＲＮＡを調製する工程であって、４塩基コドンを挿入する位置が前記タンパク質が他の分子と相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るタンパク質上の位置に対応するｍＲＮＡの位置である工程、
蛍光共鳴エネルギー移動を起こし得る２種類の蛍光物質でそれぞれ標識した２種類のアミノ酸であって、前記４塩基コドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡが結合した２種類のアミノ酸を調製する工程、ならびに
前記ｍＲＮＡおよびアミノ酸結合ｔＲＮＡを用いてタンパク質を合成する工程とを含む製造方法、
１７． ２種類の４塩基コドンの一方を終止コドンに置き換えた上記１６記載の方法。
１８． 無細胞翻訳系でタンパク質を合成する上記１６または１７に記載の方法、
１９． タンパク質がカルモジュリンまたはマルトース結合タンパク質である上記１６〜１８のいずれかに記載の方法、
２０． ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩ならびに，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩をそれぞれカルモジュリンのアミノ酸配列の４０番目とＮ末端、またはカルモジュリンのアミノ酸配列の９９番目とＮ末端に含ませる上記１９の方法、
２１． ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩ならびに，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩をそれぞれマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列の１７１番目とＮ末端、またはマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列の２８３番目とＮ末端に含ませる上記１９記載の方法。
２２． 上記１〜９のいずれかに記載のタンパク質と被験分子を接触させ、該タンパク質と被験分子との相互作用による前記タンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより検出し、前記タンパク質と前記被験分子の相互作用を検出する方法、
２３． タンパク質がカルモジュリンまたはマルトース結合タンパク質である上記２２記載の方法、
２４． 上記１〜９のいずれかに記載のタンパク質と被験分子を接触させ、該タンパク質と被験分子との相互作用による前記タンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより検出し、前記タンパク質と相互作用する分子をスクリーニングする方法、
２５． タンパク質がカルモジュリンまたはマルトース結合タンパク質である上記２４記載の方法、
２６． 上記１〜９のいずれかに記載のタンパク質と該タンパク質と相互作用する少なくとも１つの分子および被験化合物を接触させ、該タンパク質と該分子との相互作用を前記タンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより検出し、前記タンパク質と前記分子との相互作用を阻害または増強する化合物をスクリーニングする方法、
２７． タンパク質がカルモジュリンであって、タンパク質と相互作用する分子がカルシウム結合タンパク質およびカルシウムイオンである上記２６記載の方法、ならびに
２８． タンパク質がマルトース結合タンパク質であって、タンパク質と相互作用する分子がマルトースである上記２６記載の方法。
に関する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−２３０７６８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
図１は、蛍光標識アミノ酸のタンパク質への部位特異的導入法の概要を示す図である。
図２は、１分子のタンパク質への２種類の非天然アミノ酸の導入法の概要を示す図である。
図３は、１分子のタンパク質への２種類の蛍光標識アミノ酸のタンパク質への部位特異的導入法の概要を示す図である。
図４は、蛍光共鳴エネルギー移動を利用したタンパク質と他の分子との相互作用の検出法を示す図である。カルモジュリン結合タンパク質との相互作用に伴って、カルモジュリンの構造変化が起き、その結果蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（緑色の分子）から受容体（赤色の分子）へエネルギー移動が起こる。この変化は蛍光スペクトルの変化として検出される。
図５Ａは、２種類の蛍光標識アミノ酸を導入したタンパク質の合成法を示す図である。
図５Ｂは、２種類の蛍光標識アミノ酸を導入したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
図６は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、４０番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態の立体構造（Ａ）およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図７は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、４０番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図８は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、９９番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態の立体構造（Ａ）およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図９は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、９９番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図１０は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、１１３番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態の立体構造（Ａ）およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図１１は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、１１３番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図１２は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、１４８番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態の立体構造（Ａ）およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図１３は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、１４８番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図１４は、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列中、１７１番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質の他の分子と相互作用していない状態の立体構造（Ａ）およびマルトースと相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図１５は、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列中、１７１番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質の他の分子と相互作用していない状態およびマルトースと相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図１６は、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列中、１７６番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質の他の分子と相互作用していない状態の立体構造（Ａ）およびマルトースと相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図１７は、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列中、１７６番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質の他の分子と相互作用していない状態およびマルトースと相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図１８は、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列中、２８３番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質の他の分子と相互作用していない状態の立体構造（Ａ）およびマルトースと相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図１９は、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列中、２８３番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質の他の分子と相互作用していない状態およびマルトースと相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図２は、１分子のタンパク質への２種類の非天然アミノ酸の導入法の概要を示す図である。
図３は、１分子のタンパク質への２種類の蛍光標識アミノ酸のタンパク質への部位特異的導入法の概要を示す図である。
図４は、蛍光共鳴エネルギー移動を利用したタンパク質と他の分子との相互作用の検出法を示す図である。カルモジュリン結合タンパク質との相互作用に伴って、カルモジュリンの構造変化が起き、その結果蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（緑色の分子）から受容体（赤色の分子）へエネルギー移動が起こる。この変化は蛍光スペクトルの変化として検出される。
図５Ａは、２種類の蛍光標識アミノ酸を導入したタンパク質の合成法を示す図である。
図５Ｂは、２種類の蛍光標識アミノ酸を導入したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
図６は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、４０番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態の立体構造（Ａ）およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図７は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、４０番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図８は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、９９番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態の立体構造（Ａ）およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図９は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、９９番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図１０は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、１１３番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態の立体構造（Ａ）およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図１１は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、１１３番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図１２は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、１４８番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態の立体構造（Ａ）およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図１３は、カルモジュリンのアミノ酸配列中、１４８番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したカルモジュリンのカルシウムイオンと相互作用した状態およびカルシウムイオンとカルモジュリン結合タンパク質と相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図１４は、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列中、１７１番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質の他の分子と相互作用していない状態の立体構造（Ａ）およびマルトースと相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図１５は、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列中、１７１番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質の他の分子と相互作用していない状態およびマルトースと相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図１６は、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列中、１７６番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質の他の分子と相互作用していない状態の立体構造（Ａ）およびマルトースと相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図１７は、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列中、１７６番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質の他の分子と相互作用していない状態およびマルトースと相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
図１８は、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列中、２８３番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質の他の分子と相互作用していない状態の立体構造（Ａ）およびマルトースと相互作用した状態の立体構造（Ｂ）を示す図である。
図１９は、マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列中、２８３番目にＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｎ末端にＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質の他の分子と相互作用していない状態およびマルトースと相互作用した状態の蛍光スペクトルを示す図である。
本発明のタンパク質は、１分子のタンパク質中に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のエネルギー供与体（ドナー）となる蛍光物質およびエネルギー移動のエネルギー受容体（アクセプター）となる蛍光物質を含んでいる。本発明のタンパク質は、エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質の両方を含んでいるので二重標識タンパク質ということもある。
本発明のタンパク質は、特定の他の分子と結合等の相互作用をすることができ、該分子と相互作用することにより、立体構造が変化する。この立体構造が変化することにより、上記エネルギー供与体とエネルギー受容体の立体的な位置が変動し、両者の距離および配向が変化し両者の間で起こる蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化する。
タンパク質は限定されず、分子と相互作用することにより立体構造が変化するいかなるタンパク質も含まれる。このようなタンパク質として、例えば、カルモジュリン、ｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼ、ステロイドホルモン受容体、ステロイドホルモン受容体のリガンド結合ドメイン、タンパク質キナーゼＣ、イノシトール−１，４，５−トリホスフェート受容体、レコベリン、マルトース結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質等が挙げられる。
タンパク質の立体構造の変化は、ＣＤ（円偏光二色性）スペクトル、紫外吸収および蛍光吸収スペクトル、ＮＭＲ（核磁気共鳴）スペクトルの変化としてとらえることができ、またシンクロトロン放射線源を用いたＸ線小角散乱法等により立体構造の変化をとらえることができる。
本発明のタンパク質と相互作用する分子は、タンパク質ごとに決まっており、タンパク質、核酸、糖、イオン等のその他の有機または無機の低分子量分子が含まれる。例えば、タンパク質がカルモジュリンの場合、カルモジュリン結合タンパク質やカルシウムイオンが挙げられる。また、ｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼにはｃＧＭＰ、マルトース結合タンパク質にはマルトースが挙げられる。さらに、ステロイドホルモン受容体やＤＮＡ結合タンパク質には、それぞれのタンパク質に特異的なステロイドホルモンやＤＮＡが挙げられる。
本発明に利用可能な蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（ドナー）となる物質およびエネルギー移動のエネルギー受容体（アクセプター）となる物質としては、ＢＯＤＩＰＹ 化合物、ローダミン、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、アクリジンオレンジ、サイバーグリーン、Ｃｙ３、Ｃｙ５等、ならびにこれらの誘導体を含む公知のあらゆる蛍光物質が挙げられる。
本発明に使用するのに特に好ましい蛍光物質として、その化学構造に４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンを基本骨格として含む化合物又はその塩もしくはその誘導体を挙げることができる（本明細書中では、該化合物又はその塩もしくはその誘導体を総称してＢＯＤＩＰＹ化合物とも呼ぶ）。その例としては、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）（励起波長／蛍光波長：５０５ｎｍ／５１３ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ（励起波長／蛍光波長：５８８ｎｍ／６１６ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ６Ｇ（励起波長／蛍光波長：５２８ｎｍ／５５０ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３（励起波長／蛍光波長：４９５／５０３）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８（励起波長／蛍光波長：５５９ｎｍ／５６９ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ−Ｘ（励起波長／蛍光波長：５４２／５７４）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５８０／６０５（励起波長／蛍光波長：５８０／６０５）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ（励起波長／蛍光波長：５８９ｎｍ／６１７ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５６４／５７０（励起波長／蛍光波長：５６５／５７１）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５６４／５７４（励起波長／蛍光波長：５６４／５７０）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５８１／５９１（励起波長／蛍光波長：５８２／５９２）をはじめ、蛍光特性を異にする多種多様なものが、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社（オレゴン州、米国）等から市販されているが、現在市販品として入手可能なものに限定はされない。
また、用いる蛍光物質は、可視光域内（４００〜７００ｎｍ付近）に励起波長を有し、さらに可視光域内に発光波長を有するものが好ましく、水溶液中での発光強度が強いものが特に好ましい。ＢＯＤＩＰＹ化合物には、可視光域内に励起波長および発光波長を有するものが種々あり、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、４８８ｎｍの光で励起され、可視光領域で強い発光を有するため、アルゴンレーザー光によって励起可能であり、既存の汎用機器で高感度かつ容易に検出できるという点で大きな利点を有する。
蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（ドナー）となる蛍光物質およびエネルギー移動のエネルギー受容体（アクセプター）となる蛍光物質は、エネルギー受容体となる物質の励起スペクトルがエネルギー供与体となる物質の放射スペクトルと重複するように選択すればよい。それぞれの蛍光物質の励起波長および蛍光波長は公知であり、また容易に測定することができる。この蛍光物質に固有の励起波長および蛍光波長に基づいて蛍光物質の組合わせを適宜選択することができる。
例えば、エネルギー供与体としてＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、エネルギー受容体としてＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８を選択すればよい。あるいは、エネルギー供与体とエネルギー受容体の組み合わせとして、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬとＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８６、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬとＴＡＭＲＡ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬとＣｙ３、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎとＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、Ａｌｅｘａ４８８とＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８とＣｙ５、などでもよい。
本発明のタンパク質において、立体構造に変化が生じたときにエネルギー供与体とエネルギー受容体が蛍光共鳴エネルギー移動を起こすのに適切な配向を保つ相対的位置に存在するようにタンパク質中に含ませる必要がある。
このためには、タンパク質中の特定の部位に蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を導入すればよい。蛍光標識アミノ酸を導入する位置は、蛍光標識アミノ酸を導入するタンパク質によって異なるが、天然タンパク質のアミノ酸配列に基づいて立体構造を解析し、立体構造上近接する位置にあるアミノ酸部位に蛍光標識アミノ酸を導入すればよい。タンパク質の立体構造は、例えば市販のタンパク質立体構造解析ソフトウェアを用いることにより予測することができる。あるいは、エネルギー供与体とエネルギー受容体のどちらか一方をタンパク質のＮ末端あるいはＣ末端に導入しておき、もう一方をタンパク質の内部の数〜数十ヶ所に導入して、その中から本発明に適した導入位置を特定すればよい。
例えば、タンパク質がカルモジュリンである場合、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ）で標識したアミノ酸および，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８）で標識したアミノ酸をそれぞれカルモジュリンのアミノ酸配列の４０番目とＮ末端、またはカルモジュリンのアミノ酸配列の９９番目とＮ末端に導入すればよい。一方、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸で標識したアミノ酸および，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸で標識したアミノ酸をそれぞれカルモジュリンのアミノ酸配列の１１３番目とＮ末端、または１４８番目とＮ末端に導入した場合は、タンパク質が他の分子と相互作用しても充分な蛍光共鳴エネルギー移動の効率の変化が起こらない。カルモジュリンのアミノ酸配列は配列番号２に示す。
また、マルトース結合タンパク質においては、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬで標識したアミノ酸およびＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸をそれぞれマルトース結合タンパク質の１７１番目とＮ末端、または２８３番目とＮ末端に導入すればよい。一方、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬで標識したアミノ酸およびＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸をそれぞれマルトース結合タンパク質の１７６番目とＮ末端に導入した場合は、タンパク質が他の分子と相互作用しても充分な蛍光共鳴エネルギー移動の効率の変化が起こらない。マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号５に示す。
本発明の蛍光標識アミノ酸は、アミノ酸部の側鎖に芳香環を有し、該芳香環に、スペーサーを介してまたはスペーサーを介さずに、蛍光物質が結合しているものが好ましい。
「芳香環」とは、一般的に、あらゆる不飽和環状化合物を指す。したがって、５もしくは６員の複素芳香環、または２個以上、好ましくは２〜５個、さらに好ましくは２〜３個の環構造を含む多環性化合物も含む。特に、芳香環はベンゼン環であることが好ましい。天然型アミノ酸のうち、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンはその側鎖に芳香環を含有する天然型芳香族アミノ酸であり、該芳香環に蛍光物質が（スペーサーを介してまたはスペーサーを介さずに）結合したものは、本発明の蛍光標識アミノ酸の好ましい例として挙げることができる。
芳香環を有するアミノ酸と蛍光物質の結合およびスペーサーを介した芳香環を有するアミノ酸と蛍光物質との結合は、適当な官能基どうしの結合を利用すればよい。タンパク質合成の際にペプチド伸長反応に関与しない、天然型あるいは非天然型アミノ酸の、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、アルデヒド基、アリル基、ハロゲン化アルキル基など種々の官能基のいずれかに蛍光物質を、スペーサーを介して、または介さずに結合する。アミノ基標識用プローブとしてスクシンイミドエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロライド、ＮＢＤ−ハライド、ジクロロトリアジンなどの化合物が、チオール基標識用プローブとしてアルキルハライド、マレイミド、アジリジンなどの化合物が、カルボキシル基標識用プローブとしてジアゾメタン化合物、脂肪族臭化物、カルボジイミドなどが利用できる。例えば、蛍光物質にスペーサーを介して、または介さずに、スクシンイミドエステルを導入し、かつアミノ酸の芳香環にアミノ基を導入しアミド結合により両者を結合させることができる。芳香環にアミノ基を導入したアミノ酸として、例えばアミノフェニルアラニンが挙げられる。この際に用いる官能基は、適宜選択導入できるし、結合方法も適宜選択できる。この際、アミド結合形成反応をｐＨ５程度で行なうことで、他にアミノ基が存在していても、アミノフェニルアラニンの側鎖のアミノ基に選択的に反応させることができる。あるいは、他のアミノ基をＢｏｃ化等により保護し、反応後脱Ｂｏｃ化すればよい。この方法は、例えば、「新生化学実験講座１ 蛋白質ＶＩ 構造機能相関」（社団法人 日本生化学会編 東京化学同人発行、１９９１年３月２０日発行）の記載等を参照すればよい。
「スペーサー」は、蛍光標識アミノ酸分子におけるアミノ酸部と蛍光物質とを連結している部分を指す。即ち、蛍光標識アミノ酸分子内のアミノ酸側鎖と蛍光物質が直接結合しているのではなく、アミノ酸側鎖と蛍光物質との間に１つ以上の原子が存在する場合、該蛍光標識アミノ酸のアミノ酸部と蛍光物質はスペーサーを介して連結しているという。スペーサーは、その主鎖部分にＣ、Ｏ、ＮおよびＳのうちの少なくとも１種を少なくとも１つ以上含んでいればよい。またスペーサーの主鎖構造は、上記原子が２〜１０個、好ましくは３〜８個、さらに好ましくは５、６または７個が直鎖状に結合したものが好ましく、直鎖構造内には、二重結合が１つ以上含まれていてもよい。さらに、スペーサーは、ベンゼン環および／またはシクロヘキシル環などの環状構造を１〜数個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、有していてもよい。また、ベンゼン環やシクロヘキシル環などの環状構造、もしくは環状構造と上記直鎖構造とが組み合わされた構造のものでもよい。具体的には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソプテン、ポリスチレン、ポリビニル、ポリ塩化ビニルなどのポリオレフィン、ポリオキシエチレン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールなどのポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ポリウレタン、ポリカーボネートなどが挙げられる。
蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を、後述のタンパク質合成に用いて本発明のタンパク質を作製するためには、アミノ酸にｔＲＮＡと結合させるために必要な特定の基を結合させておく必要がある。例えば、アミノ酸のカルボキシル基にジヌクレオチド（ｐｄＣｐＡ）を結合させておけば、３’末端のＣＡジヌクレオチドを欠落させたｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ（−ＣＡ））と結合させ、人工アミノアシルｔＲＮＡを作製することができる。
アミノ酸骨格を形成する原子に芳香環が直接結合していても、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳのうちの少なくとも１種の１、２または３個の原子を介して間接的に結合していてもよい。芳香環はベンゼン環である場合、ベンゼン環上にスペーサーまたは蛍光物質が結合する位置は、アミノ酸骨格の位置に対して、パラ位またはメタ位であることが、リボゾームへの取り込み効率がより高くなり、より好ましく、特にパラ位であることが好ましい。
前述のように、芳香環の官能基にスペーサーを介してまたは介さずに蛍光物質を結合させる。アミノフェニルアラニンの場合、パラアミノフェニルアラニン、メタアミノフェニルアラニンが好ましい。
例として、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（４，４−Ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５，７−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−Ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−Ｄｉａｚａ−ｓ−Ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ Ａｃｉｄ；ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−ＦＬ）をアミノフェニルアラニンの側鎖の芳香環に結合させたＢＯＤＩＰＹ ＦＬ標識アミノフェニルアラニン誘導体（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ＡＦ）およびＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８をアミノフェニルアラニンの側鎖の芳香環に結合させたＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８標識アミノフェニルアラニン誘導体（ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８−ＡＦ）の構造をそれぞれ式Ｉおよび式ＩＩに示す。
蛍光物質で標識した標識アミノ酸をタンパク質合成系に用いる場合、標識アミノ酸が結合したアミノアシルｔＲＮＡを合成する必要がある。このため、標識アミノ酸はｔＲＮＡと結合するための結合部分を有する必要があり、該部分として例えばジヌクレオチド（ｐｄＣｐＡ）が挙げられる。この際、あらかじめアミノ酸にｐｄＣｐＡを結合させておき、アミノ酸−ｐｄＣｐＡを適当な蛍光物質で標識すればよい。
例えば、アミノフェニルアラニンにｐｄＣｐＡを結合させたＡＦ−ｐｄＣｐＡをアミノ酸として用いる場合、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬと結合させると、標識アミノ酸−ｐｄＣｐＡ（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ＡＦ−ｐｄＣｐＡ）が得られる。該標識アミノ酸をタンパク質合成系にてタンパク質へ導入することが可能である。
蛍光物質によるアミノ酸の標識法の詳細は、ＷＯ２００４／００９７０９に記載されており、該記載に従って実施することができる。
本発明のタンパク質をタンパク質生合成系で合成するには、蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸と、該蛍光標識アミノ酸を特異的にコードするように設計したコドンに対するアンチコドンとが結合されているアミノアシルｔＲＮＡを作製することが必要である。かかるアミノアシルｔＲＮＡを合成するには、例えば、アミノ酸のアミノ基をＢｏｃ化等により保護し、ジヌクレオチド（ｐｄＣｐＡ）に結合させた後に脱Ｂｏｃ化などの脱保護化の処理をし、得られたアミノ酸−ｐｄＣｐＡと蛍光物質を反応させることによって、芳香環に導入された官能基を介して蛍光物質を結合させ、得られたｐｄＣｐＡと蛍光標識アミノ酸との結合物を液体クロマトグラフィーにより精製し、一方で、３’末端のＣＡジヌクレオチドが欠落したｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ（−ＣＡ））を作製し、これに蛍光標識アミノ酸−ｐｄＣｐＡをリガーゼで結合させることにより得られる。このような、アミノ酸をまずｐｄＣｐＡと結合させた後に蛍光物質と反応させて蛍光標識アミノ酸−ｐｄＣｐＡ結合体を得てもよい。
上記の方法により作製された蛍光物質で標識された蛍光標識アミノアシルｔＲＮＡは、無細胞翻訳系または生細胞によるタンパク質合成系を利用して実施することができる。無細胞翻訳系としては、４塩基コドン法、人工塩基コドン法または終止コドン法を使用することが好ましい。
発現させようとする本発明のタンパク質をコードする遺伝子の特定の部位に４塩基コドンまたはアンバーコドン（終止コドン）を導入し、該遺伝子からＲＮＡポリメラーゼを用いて、本発明のタンパク質のｍＲＮＡを合成することができる。該ｍＲＮＡを用いて本発明のタンパク質を作製することが可能である。
無細胞翻訳系による合成は、発現させようとする遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に導入することなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏで必要な試薬と混合し遺伝子を発現させることにより行うことができる（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ，（１９８８）“Ａ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｈｉｇｈｙｉｅｌｄ”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，１１６２；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）“Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９，８８１−８８６）。市販の無細胞発現キットを用いてタンパク質を発現させることができる。このようなキットとして例えば、Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ）（Ｒｏｃｈｅ）やＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等がある。この際、用いる発現ベクターは限定されないが、それぞれの無細胞翻訳系に適したベクターがあるのでそれを使用すればよい。前者のキット用発現ベクターとして、ｐＩＶＥＸ２．２ｂＮｄｅが挙げられ、後者のキット用発現ベクターとして、ｐＥＸＰ１やｐＥＸＰ２が挙げられる。
４塩基コドン法においては、ｍＲＮＡの非天然型アミノ酸を導入したい部位に４塩基コドンを組み込み、ｔＲＮＡのアンチコドン部位を対応する４塩基に置換し、さらに非天然型アミノ酸を結合させておく。これらを用いてタンパク質合成を行うと、４塩基コドンに置換した部分ではリボソームの中で４塩基のコドン・アンチコドンペアが形成され、ｔＲＮＡに結合させた非天然型アミノ酸は伸長中のペプチド鎖に組み込まれる。一方、その他の部分は通常通り３塩基ずつ翻訳されるので、最終的に得られるタンパク質には４塩基コドンで指定した部分にのみ非天然型アミノ酸が導入されていることになる。４塩基コドン法は、Ｈｏｈｓａｋａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，９７７８−９７７９，１９９６およびＨｏｈｓａｋａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，３４−４０，１９９９の記載に従って実施することができる。また、終止コドン法は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，ｐ．１８２．１９８９およびＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１，ｐ．８０１３，１９８９、人工塩基コドン法は、Ｈｉｒａｏ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０，１７７−１８２，２００２の記載に従って行うことができる。また、生細胞によるタンパク質合成系により非天然型アミノ酸を導入したタンパク質を得るには、アミノアシルｔＲＮＡ及びｍＲＮＡを細胞内へマイクロインジェクションにより注入する方法が知られており（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，ｐ．４３９，１９９５）、この手法により生細胞に本発明のタンパク質を発現させることができる。
得られたタンパク質はあらかじめＨｉｓタグを導入しておくことにより、Ｈｉｓ−ｔａｇアフィニティービーズ等を用いて精製することができる。
所定のタンパク質分子の任意の位置に２種類の蛍光標識アミノ酸を導入できるという点で、４塩基コドン法、または４塩基コドン法と終止コドン法を組合せた方法を利用するのが望ましい。
このようにして得られた、本発明のタンパク質を用いてタンパク質と該タンパク質と他の分子の相互作用を検出することができる。本発明のタンパク質に他の分子を相互作用させることにより、本発明のタンパク質の立体構造が変化し、エネルギー受容体とエネルギー供与体の距離および配向が変化する。該状態のタンパク質にエネルギー供与体の励起光を照射すると、エネルギー供与体とエネルギー受容体の間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こるが、エネルギー受容体とエネルギー供与体の距離および配向が変化することにより、ＦＲＥＴの効率も変化する。これを測定することによりタンパク質の構造変化を検出することができる。
本発明は、本発明のタンパク質と被験分子を接触させ、蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより、タンパク質と被験分子の相互作用を検出する方法も包含する。また、特定のタンパク質と相互作用する分子をスクリーニングする方法も包含する。さらに、本発明のタンパク質を、該タンパク質と被験分子との相互作用を阻害または増強する化合物のスクリーニングに用いることもできる。このような化合物は、前記タンパク質が関与する疾患、障害等の治療薬剤として用いることができる。
励起光の光源としては、ブロードな紫外光や可視光をフィルターや分光器を用いて所望の波長範囲とした光源を用いてもよいし、レーザー等の単色光を用いてもよい。レーザー光源を使う場合は、ヘリウムカドミウムレーザー（４４２ｎｍ）が一般的であるが、ブルーダイオードレーザー（４０５ｎｍ）、アルゴンイオンレーザー（４５７ｎｍ）、ＬＤ励起固体レーザー（ｄｉｏｄｅ−ｐｕｍｐｅｄ ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ ｌａｓｅｒ）（４３０ｎｍ）等を用いてもよい。二光子励起法であれば８００ｎｍ付近のパルスレーザーを用いてもよい。
本発明において、エネルギー供与体である蛍光物質またはエネルギー受容体である蛍光物質の両方またはいずれかの物質からの蛍光を測定すればよい。蛍光共鳴エネルギー移動が起こると、エネルギー受容体からの蛍光強度が増加し、エネルギー供与体からの蛍光強度は減少する。反対に、蛍光共鳴エネルギー移動が起こらない場合、あるいは蛍光共鳴エネルギー移動効率が低い場合、エネルギー受容体からの蛍光強度が減少し、エネルギー供与体からの蛍光強度が増加する。所定の波長を単波長で測定してもよいし、一定の範囲の波長について蛍光スペクトルを測定してもよい。エネルギー受容体またはエネルギー供与体からの蛍光の増加と減少の程度を測定することにより、タンパク質の立体構造の変化、すなわち他の分子との相互作用を検出することができる。この際、エネルギー供与体からの蛍光強度とエネルギー受容体からの蛍光強度の比を測定し、比から蛍光共鳴エネルギー移動が起きたかどうかを判断することもできる。蛍光の測定は、定常光励起発光を測定する方法で行うこともできるし、時間分解蛍光測定法により行うこともできる。蛍光測定は、通常用いられている蛍光分光光度計により行うことができる。また、市販の蛍光共鳴エネルギー移動解析装置を用いてもよい。
本発明は、本発明のタンパク質を含む、タンパク質の相互作用研究用試薬もしくはキット、ならびにタンパク質と相互作用する分子のスクリーニング試薬もしくはキットをも包含する。
例えば、具体的には、以下のようにして本発明のタンパク質を合成し、該タンパク質を用いて他の分子との相互作用を検出することができる。
（ｉ） タンパク質をコードする遺伝子の特定部位に４塩基コドンＧＧＧＴおよびＣＧＧＧを挿入する。
（ｉｉ） Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてカルモジュリンのｍＲＮＡを合成する。
（ｉｉｉ） ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−アミノフェニルアラニン（エネルギー供与体を含む非天然アミノ酸）を結合させたｔＲＮＡ（アンチコドンにＣＣＣＧを有するもの）と、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８−アミノフェニルアラニン（エネルギー受容体を含む非天然アミノ酸）を結合させたｔＲＮＡ（アンチコドンにＡＣＣＣを有するもの）を合成する。
（ｉｖ） 上記ｍＲＮＡとｔＲＮＡを大腸菌無細胞翻訳系へ加える。
（ｖ） 合成された二重蛍光標識カルモジュリンをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
（ｖｉ） 二重蛍光標識カルモジュリンをＨｉｓ−ｔａｇアフィニティビーズにより精製する。
（ｖｉｉ） カルシウムイオンおよびカルモジュリン結合タンパク質を混合して蛍光スペクトルを測定する。
また、以下のようにして本発明のタンパク質を合成し、該タンパク質を用いて他の分子との相互作用を検出することができる。
（ｉ） タンパク質をコードする遺伝子の特定部位に４塩基コドンＣＧＧＧおよびアンバーコドンＵＡＧを挿入する。
（ｉｉ） Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてマルトース結合タンパク質のｍＲＮＡを合成する。
（ｉｉｉ） ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−アミノフェニルアラニン（エネルギー供与体を含む非天然アミノ酸）を結合させたｔＲＮＡ（アンチコドンにＣＣＣＧを有するもの）と、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８−アミノフェニルアラニン（エネルギー受容体を含む非天然アミノ酸）を結合させたｔＲＮＡ（アンチコドンにＣＴＡを有するもの）を合成する。
（ｉｖ） 上記ｍＲＮＡとｔＲＮＡを大腸菌無細胞翻訳系へ加える。
（ｖ） 合成された二重蛍光標識マルトース結合タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
（ｖｉ） 二重蛍光標識マルトース結合タンパク質をＨｉｓ−ｔａｇアフィニティビーズにより精製する。
（ｖｉｉ） マルトースおよびマルトース結合タンパク質を混合して蛍光スペクトルを測定する。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
本発明のタンパク質は、特定の他の分子と結合等の相互作用をすることができ、該分子と相互作用することにより、立体構造が変化する。この立体構造が変化することにより、上記エネルギー供与体とエネルギー受容体の立体的な位置が変動し、両者の距離および配向が変化し両者の間で起こる蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化する。
タンパク質は限定されず、分子と相互作用することにより立体構造が変化するいかなるタンパク質も含まれる。このようなタンパク質として、例えば、カルモジュリン、ｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼ、ステロイドホルモン受容体、ステロイドホルモン受容体のリガンド結合ドメイン、タンパク質キナーゼＣ、イノシトール−１，４，５−トリホスフェート受容体、レコベリン、マルトース結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質等が挙げられる。
タンパク質の立体構造の変化は、ＣＤ（円偏光二色性）スペクトル、紫外吸収および蛍光吸収スペクトル、ＮＭＲ（核磁気共鳴）スペクトルの変化としてとらえることができ、またシンクロトロン放射線源を用いたＸ線小角散乱法等により立体構造の変化をとらえることができる。
本発明のタンパク質と相互作用する分子は、タンパク質ごとに決まっており、タンパク質、核酸、糖、イオン等のその他の有機または無機の低分子量分子が含まれる。例えば、タンパク質がカルモジュリンの場合、カルモジュリン結合タンパク質やカルシウムイオンが挙げられる。また、ｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼにはｃＧＭＰ、マルトース結合タンパク質にはマルトースが挙げられる。さらに、ステロイドホルモン受容体やＤＮＡ結合タンパク質には、それぞれのタンパク質に特異的なステロイドホルモンやＤＮＡが挙げられる。
本発明に利用可能な蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（ドナー）となる物質およびエネルギー移動のエネルギー受容体（アクセプター）となる物質としては、ＢＯＤＩＰＹ 化合物、ローダミン、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、アクリジンオレンジ、サイバーグリーン、Ｃｙ３、Ｃｙ５等、ならびにこれらの誘導体を含む公知のあらゆる蛍光物質が挙げられる。
本発明に使用するのに特に好ましい蛍光物質として、その化学構造に４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンを基本骨格として含む化合物又はその塩もしくはその誘導体を挙げることができる（本明細書中では、該化合物又はその塩もしくはその誘導体を総称してＢＯＤＩＰＹ化合物とも呼ぶ）。その例としては、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）（励起波長／蛍光波長：５０５ｎｍ／５１３ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ（励起波長／蛍光波長：５８８ｎｍ／６１６ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ６Ｇ（励起波長／蛍光波長：５２８ｎｍ／５５０ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３（励起波長／蛍光波長：４９５／５０３）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８（励起波長／蛍光波長：５５９ｎｍ／５６９ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ−Ｘ（励起波長／蛍光波長：５４２／５７４）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５８０／６０５（励起波長／蛍光波長：５８０／６０５）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ（励起波長／蛍光波長：５８９ｎｍ／６１７ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５６４／５７０（励起波長／蛍光波長：５６５／５７１）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５６４／５７４（励起波長／蛍光波長：５６４／５７０）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５８１／５９１（励起波長／蛍光波長：５８２／５９２）をはじめ、蛍光特性を異にする多種多様なものが、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社（オレゴン州、米国）等から市販されているが、現在市販品として入手可能なものに限定はされない。
また、用いる蛍光物質は、可視光域内（４００〜７００ｎｍ付近）に励起波長を有し、さらに可視光域内に発光波長を有するものが好ましく、水溶液中での発光強度が強いものが特に好ましい。ＢＯＤＩＰＹ化合物には、可視光域内に励起波長および発光波長を有するものが種々あり、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、４８８ｎｍの光で励起され、可視光領域で強い発光を有するため、アルゴンレーザー光によって励起可能であり、既存の汎用機器で高感度かつ容易に検出できるという点で大きな利点を有する。
蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（ドナー）となる蛍光物質およびエネルギー移動のエネルギー受容体（アクセプター）となる蛍光物質は、エネルギー受容体となる物質の励起スペクトルがエネルギー供与体となる物質の放射スペクトルと重複するように選択すればよい。それぞれの蛍光物質の励起波長および蛍光波長は公知であり、また容易に測定することができる。この蛍光物質に固有の励起波長および蛍光波長に基づいて蛍光物質の組合わせを適宜選択することができる。
例えば、エネルギー供与体としてＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、エネルギー受容体としてＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８を選択すればよい。あるいは、エネルギー供与体とエネルギー受容体の組み合わせとして、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬとＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８６、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬとＴＡＭＲＡ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬとＣｙ３、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎとＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、Ａｌｅｘａ４８８とＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８とＣｙ５、などでもよい。
本発明のタンパク質において、立体構造に変化が生じたときにエネルギー供与体とエネルギー受容体が蛍光共鳴エネルギー移動を起こすのに適切な配向を保つ相対的位置に存在するようにタンパク質中に含ませる必要がある。
このためには、タンパク質中の特定の部位に蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を導入すればよい。蛍光標識アミノ酸を導入する位置は、蛍光標識アミノ酸を導入するタンパク質によって異なるが、天然タンパク質のアミノ酸配列に基づいて立体構造を解析し、立体構造上近接する位置にあるアミノ酸部位に蛍光標識アミノ酸を導入すればよい。タンパク質の立体構造は、例えば市販のタンパク質立体構造解析ソフトウェアを用いることにより予測することができる。あるいは、エネルギー供与体とエネルギー受容体のどちらか一方をタンパク質のＮ末端あるいはＣ末端に導入しておき、もう一方をタンパク質の内部の数〜数十ヶ所に導入して、その中から本発明に適した導入位置を特定すればよい。
例えば、タンパク質がカルモジュリンである場合、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ）で標識したアミノ酸および，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８）で標識したアミノ酸をそれぞれカルモジュリンのアミノ酸配列の４０番目とＮ末端、またはカルモジュリンのアミノ酸配列の９９番目とＮ末端に導入すればよい。一方、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸で標識したアミノ酸および，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸で標識したアミノ酸をそれぞれカルモジュリンのアミノ酸配列の１１３番目とＮ末端、または１４８番目とＮ末端に導入した場合は、タンパク質が他の分子と相互作用しても充分な蛍光共鳴エネルギー移動の効率の変化が起こらない。カルモジュリンのアミノ酸配列は配列番号２に示す。
また、マルトース結合タンパク質においては、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬで標識したアミノ酸およびＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸をそれぞれマルトース結合タンパク質の１７１番目とＮ末端、または２８３番目とＮ末端に導入すればよい。一方、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬで標識したアミノ酸およびＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８で標識したアミノ酸をそれぞれマルトース結合タンパク質の１７６番目とＮ末端に導入した場合は、タンパク質が他の分子と相互作用しても充分な蛍光共鳴エネルギー移動の効率の変化が起こらない。マルトース結合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号５に示す。
本発明の蛍光標識アミノ酸は、アミノ酸部の側鎖に芳香環を有し、該芳香環に、スペーサーを介してまたはスペーサーを介さずに、蛍光物質が結合しているものが好ましい。
「芳香環」とは、一般的に、あらゆる不飽和環状化合物を指す。したがって、５もしくは６員の複素芳香環、または２個以上、好ましくは２〜５個、さらに好ましくは２〜３個の環構造を含む多環性化合物も含む。特に、芳香環はベンゼン環であることが好ましい。天然型アミノ酸のうち、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンはその側鎖に芳香環を含有する天然型芳香族アミノ酸であり、該芳香環に蛍光物質が（スペーサーを介してまたはスペーサーを介さずに）結合したものは、本発明の蛍光標識アミノ酸の好ましい例として挙げることができる。
芳香環を有するアミノ酸と蛍光物質の結合およびスペーサーを介した芳香環を有するアミノ酸と蛍光物質との結合は、適当な官能基どうしの結合を利用すればよい。タンパク質合成の際にペプチド伸長反応に関与しない、天然型あるいは非天然型アミノ酸の、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、アルデヒド基、アリル基、ハロゲン化アルキル基など種々の官能基のいずれかに蛍光物質を、スペーサーを介して、または介さずに結合する。アミノ基標識用プローブとしてスクシンイミドエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロライド、ＮＢＤ−ハライド、ジクロロトリアジンなどの化合物が、チオール基標識用プローブとしてアルキルハライド、マレイミド、アジリジンなどの化合物が、カルボキシル基標識用プローブとしてジアゾメタン化合物、脂肪族臭化物、カルボジイミドなどが利用できる。例えば、蛍光物質にスペーサーを介して、または介さずに、スクシンイミドエステルを導入し、かつアミノ酸の芳香環にアミノ基を導入しアミド結合により両者を結合させることができる。芳香環にアミノ基を導入したアミノ酸として、例えばアミノフェニルアラニンが挙げられる。この際に用いる官能基は、適宜選択導入できるし、結合方法も適宜選択できる。この際、アミド結合形成反応をｐＨ５程度で行なうことで、他にアミノ基が存在していても、アミノフェニルアラニンの側鎖のアミノ基に選択的に反応させることができる。あるいは、他のアミノ基をＢｏｃ化等により保護し、反応後脱Ｂｏｃ化すればよい。この方法は、例えば、「新生化学実験講座１ 蛋白質ＶＩ 構造機能相関」（社団法人 日本生化学会編 東京化学同人発行、１９９１年３月２０日発行）の記載等を参照すればよい。
「スペーサー」は、蛍光標識アミノ酸分子におけるアミノ酸部と蛍光物質とを連結している部分を指す。即ち、蛍光標識アミノ酸分子内のアミノ酸側鎖と蛍光物質が直接結合しているのではなく、アミノ酸側鎖と蛍光物質との間に１つ以上の原子が存在する場合、該蛍光標識アミノ酸のアミノ酸部と蛍光物質はスペーサーを介して連結しているという。スペーサーは、その主鎖部分にＣ、Ｏ、ＮおよびＳのうちの少なくとも１種を少なくとも１つ以上含んでいればよい。またスペーサーの主鎖構造は、上記原子が２〜１０個、好ましくは３〜８個、さらに好ましくは５、６または７個が直鎖状に結合したものが好ましく、直鎖構造内には、二重結合が１つ以上含まれていてもよい。さらに、スペーサーは、ベンゼン環および／またはシクロヘキシル環などの環状構造を１〜数個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、有していてもよい。また、ベンゼン環やシクロヘキシル環などの環状構造、もしくは環状構造と上記直鎖構造とが組み合わされた構造のものでもよい。具体的には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソプテン、ポリスチレン、ポリビニル、ポリ塩化ビニルなどのポリオレフィン、ポリオキシエチレン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールなどのポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ポリウレタン、ポリカーボネートなどが挙げられる。
蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を、後述のタンパク質合成に用いて本発明のタンパク質を作製するためには、アミノ酸にｔＲＮＡと結合させるために必要な特定の基を結合させておく必要がある。例えば、アミノ酸のカルボキシル基にジヌクレオチド（ｐｄＣｐＡ）を結合させておけば、３’末端のＣＡジヌクレオチドを欠落させたｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ（−ＣＡ））と結合させ、人工アミノアシルｔＲＮＡを作製することができる。
アミノ酸骨格を形成する原子に芳香環が直接結合していても、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳのうちの少なくとも１種の１、２または３個の原子を介して間接的に結合していてもよい。芳香環はベンゼン環である場合、ベンゼン環上にスペーサーまたは蛍光物質が結合する位置は、アミノ酸骨格の位置に対して、パラ位またはメタ位であることが、リボゾームへの取り込み効率がより高くなり、より好ましく、特にパラ位であることが好ましい。
前述のように、芳香環の官能基にスペーサーを介してまたは介さずに蛍光物質を結合させる。アミノフェニルアラニンの場合、パラアミノフェニルアラニン、メタアミノフェニルアラニンが好ましい。
例として、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（４，４−Ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５，７−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−Ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−Ｄｉａｚａ−ｓ−Ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ Ａｃｉｄ；ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−ＦＬ）をアミノフェニルアラニンの側鎖の芳香環に結合させたＢＯＤＩＰＹ ＦＬ標識アミノフェニルアラニン誘導体（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ＡＦ）およびＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８をアミノフェニルアラニンの側鎖の芳香環に結合させたＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８標識アミノフェニルアラニン誘導体（ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８−ＡＦ）の構造をそれぞれ式Ｉおよび式ＩＩに示す。
例えば、アミノフェニルアラニンにｐｄＣｐＡを結合させたＡＦ−ｐｄＣｐＡをアミノ酸として用いる場合、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬと結合させると、標識アミノ酸−ｐｄＣｐＡ（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ＡＦ−ｐｄＣｐＡ）が得られる。該標識アミノ酸をタンパク質合成系にてタンパク質へ導入することが可能である。
蛍光物質によるアミノ酸の標識法の詳細は、ＷＯ２００４／００９７０９に記載されており、該記載に従って実施することができる。
本発明のタンパク質をタンパク質生合成系で合成するには、蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸と、該蛍光標識アミノ酸を特異的にコードするように設計したコドンに対するアンチコドンとが結合されているアミノアシルｔＲＮＡを作製することが必要である。かかるアミノアシルｔＲＮＡを合成するには、例えば、アミノ酸のアミノ基をＢｏｃ化等により保護し、ジヌクレオチド（ｐｄＣｐＡ）に結合させた後に脱Ｂｏｃ化などの脱保護化の処理をし、得られたアミノ酸−ｐｄＣｐＡと蛍光物質を反応させることによって、芳香環に導入された官能基を介して蛍光物質を結合させ、得られたｐｄＣｐＡと蛍光標識アミノ酸との結合物を液体クロマトグラフィーにより精製し、一方で、３’末端のＣＡジヌクレオチドが欠落したｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ（−ＣＡ））を作製し、これに蛍光標識アミノ酸−ｐｄＣｐＡをリガーゼで結合させることにより得られる。このような、アミノ酸をまずｐｄＣｐＡと結合させた後に蛍光物質と反応させて蛍光標識アミノ酸−ｐｄＣｐＡ結合体を得てもよい。
上記の方法により作製された蛍光物質で標識された蛍光標識アミノアシルｔＲＮＡは、無細胞翻訳系または生細胞によるタンパク質合成系を利用して実施することができる。無細胞翻訳系としては、４塩基コドン法、人工塩基コドン法または終止コドン法を使用することが好ましい。
発現させようとする本発明のタンパク質をコードする遺伝子の特定の部位に４塩基コドンまたはアンバーコドン（終止コドン）を導入し、該遺伝子からＲＮＡポリメラーゼを用いて、本発明のタンパク質のｍＲＮＡを合成することができる。該ｍＲＮＡを用いて本発明のタンパク質を作製することが可能である。
無細胞翻訳系による合成は、発現させようとする遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に導入することなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏで必要な試薬と混合し遺伝子を発現させることにより行うことができる（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ，（１９８８）“Ａ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｈｉｇｈｙｉｅｌｄ”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，１１６２；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）“Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９，８８１−８８６）。市販の無細胞発現キットを用いてタンパク質を発現させることができる。このようなキットとして例えば、Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ）（Ｒｏｃｈｅ）やＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等がある。この際、用いる発現ベクターは限定されないが、それぞれの無細胞翻訳系に適したベクターがあるのでそれを使用すればよい。前者のキット用発現ベクターとして、ｐＩＶＥＸ２．２ｂＮｄｅが挙げられ、後者のキット用発現ベクターとして、ｐＥＸＰ１やｐＥＸＰ２が挙げられる。
４塩基コドン法においては、ｍＲＮＡの非天然型アミノ酸を導入したい部位に４塩基コドンを組み込み、ｔＲＮＡのアンチコドン部位を対応する４塩基に置換し、さらに非天然型アミノ酸を結合させておく。これらを用いてタンパク質合成を行うと、４塩基コドンに置換した部分ではリボソームの中で４塩基のコドン・アンチコドンペアが形成され、ｔＲＮＡに結合させた非天然型アミノ酸は伸長中のペプチド鎖に組み込まれる。一方、その他の部分は通常通り３塩基ずつ翻訳されるので、最終的に得られるタンパク質には４塩基コドンで指定した部分にのみ非天然型アミノ酸が導入されていることになる。４塩基コドン法は、Ｈｏｈｓａｋａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，９７７８−９７７９，１９９６およびＨｏｈｓａｋａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，３４−４０，１９９９の記載に従って実施することができる。また、終止コドン法は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，ｐ．１８２．１９８９およびＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１，ｐ．８０１３，１９８９、人工塩基コドン法は、Ｈｉｒａｏ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０，１７７−１８２，２００２の記載に従って行うことができる。また、生細胞によるタンパク質合成系により非天然型アミノ酸を導入したタンパク質を得るには、アミノアシルｔＲＮＡ及びｍＲＮＡを細胞内へマイクロインジェクションにより注入する方法が知られており（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，ｐ．４３９，１９９５）、この手法により生細胞に本発明のタンパク質を発現させることができる。
得られたタンパク質はあらかじめＨｉｓタグを導入しておくことにより、Ｈｉｓ−ｔａｇアフィニティービーズ等を用いて精製することができる。
所定のタンパク質分子の任意の位置に２種類の蛍光標識アミノ酸を導入できるという点で、４塩基コドン法、または４塩基コドン法と終止コドン法を組合せた方法を利用するのが望ましい。
このようにして得られた、本発明のタンパク質を用いてタンパク質と該タンパク質と他の分子の相互作用を検出することができる。本発明のタンパク質に他の分子を相互作用させることにより、本発明のタンパク質の立体構造が変化し、エネルギー受容体とエネルギー供与体の距離および配向が変化する。該状態のタンパク質にエネルギー供与体の励起光を照射すると、エネルギー供与体とエネルギー受容体の間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こるが、エネルギー受容体とエネルギー供与体の距離および配向が変化することにより、ＦＲＥＴの効率も変化する。これを測定することによりタンパク質の構造変化を検出することができる。
本発明は、本発明のタンパク質と被験分子を接触させ、蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより、タンパク質と被験分子の相互作用を検出する方法も包含する。また、特定のタンパク質と相互作用する分子をスクリーニングする方法も包含する。さらに、本発明のタンパク質を、該タンパク質と被験分子との相互作用を阻害または増強する化合物のスクリーニングに用いることもできる。このような化合物は、前記タンパク質が関与する疾患、障害等の治療薬剤として用いることができる。
励起光の光源としては、ブロードな紫外光や可視光をフィルターや分光器を用いて所望の波長範囲とした光源を用いてもよいし、レーザー等の単色光を用いてもよい。レーザー光源を使う場合は、ヘリウムカドミウムレーザー（４４２ｎｍ）が一般的であるが、ブルーダイオードレーザー（４０５ｎｍ）、アルゴンイオンレーザー（４５７ｎｍ）、ＬＤ励起固体レーザー（ｄｉｏｄｅ−ｐｕｍｐｅｄ ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ ｌａｓｅｒ）（４３０ｎｍ）等を用いてもよい。二光子励起法であれば８００ｎｍ付近のパルスレーザーを用いてもよい。
本発明において、エネルギー供与体である蛍光物質またはエネルギー受容体である蛍光物質の両方またはいずれかの物質からの蛍光を測定すればよい。蛍光共鳴エネルギー移動が起こると、エネルギー受容体からの蛍光強度が増加し、エネルギー供与体からの蛍光強度は減少する。反対に、蛍光共鳴エネルギー移動が起こらない場合、あるいは蛍光共鳴エネルギー移動効率が低い場合、エネルギー受容体からの蛍光強度が減少し、エネルギー供与体からの蛍光強度が増加する。所定の波長を単波長で測定してもよいし、一定の範囲の波長について蛍光スペクトルを測定してもよい。エネルギー受容体またはエネルギー供与体からの蛍光の増加と減少の程度を測定することにより、タンパク質の立体構造の変化、すなわち他の分子との相互作用を検出することができる。この際、エネルギー供与体からの蛍光強度とエネルギー受容体からの蛍光強度の比を測定し、比から蛍光共鳴エネルギー移動が起きたかどうかを判断することもできる。蛍光の測定は、定常光励起発光を測定する方法で行うこともできるし、時間分解蛍光測定法により行うこともできる。蛍光測定は、通常用いられている蛍光分光光度計により行うことができる。また、市販の蛍光共鳴エネルギー移動解析装置を用いてもよい。
本発明は、本発明のタンパク質を含む、タンパク質の相互作用研究用試薬もしくはキット、ならびにタンパク質と相互作用する分子のスクリーニング試薬もしくはキットをも包含する。
例えば、具体的には、以下のようにして本発明のタンパク質を合成し、該タンパク質を用いて他の分子との相互作用を検出することができる。
（ｉ） タンパク質をコードする遺伝子の特定部位に４塩基コドンＧＧＧＴおよびＣＧＧＧを挿入する。
（ｉｉ） Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてカルモジュリンのｍＲＮＡを合成する。
（ｉｉｉ） ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−アミノフェニルアラニン（エネルギー供与体を含む非天然アミノ酸）を結合させたｔＲＮＡ（アンチコドンにＣＣＣＧを有するもの）と、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８−アミノフェニルアラニン（エネルギー受容体を含む非天然アミノ酸）を結合させたｔＲＮＡ（アンチコドンにＡＣＣＣを有するもの）を合成する。
（ｉｖ） 上記ｍＲＮＡとｔＲＮＡを大腸菌無細胞翻訳系へ加える。
（ｖ） 合成された二重蛍光標識カルモジュリンをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
（ｖｉ） 二重蛍光標識カルモジュリンをＨｉｓ−ｔａｇアフィニティビーズにより精製する。
（ｖｉｉ） カルシウムイオンおよびカルモジュリン結合タンパク質を混合して蛍光スペクトルを測定する。
また、以下のようにして本発明のタンパク質を合成し、該タンパク質を用いて他の分子との相互作用を検出することができる。
（ｉ） タンパク質をコードする遺伝子の特定部位に４塩基コドンＣＧＧＧおよびアンバーコドンＵＡＧを挿入する。
（ｉｉ） Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてマルトース結合タンパク質のｍＲＮＡを合成する。
（ｉｉｉ） ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−アミノフェニルアラニン（エネルギー供与体を含む非天然アミノ酸）を結合させたｔＲＮＡ（アンチコドンにＣＣＣＧを有するもの）と、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８−アミノフェニルアラニン（エネルギー受容体を含む非天然アミノ酸）を結合させたｔＲＮＡ（アンチコドンにＣＴＡを有するもの）を合成する。
（ｉｖ） 上記ｍＲＮＡとｔＲＮＡを大腸菌無細胞翻訳系へ加える。
（ｖ） 合成された二重蛍光標識マルトース結合タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
（ｖｉ） 二重蛍光標識マルトース結合タンパク質をＨｉｓ−ｔａｇアフィニティビーズにより精製する。
（ｖｉｉ） マルトースおよびマルトース結合タンパク質を混合して蛍光スペクトルを測定する。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を含むカルモジュリンの作製
４塩基コドンＧＧＧＴおよびＣＧＧＧを含むカルモジュリン遺伝子の作製
カルモジュリン遺伝子（配列番号１）を鋳型として、４塩基コドンＣＧＧＧ導入用のオリゴヌクレオチド（例：４０番目に導入する場合の配列は５’−ＴＧＴＴＧＧＧＴＴＣＴＧＣＣＣＧＣＡＧＴＧＡＣＣＴＣＡＴ−３’；配列番号３）を用いてＰＣＲを行ない、変異導入を行なった。これをＴ７プロモーター、Ｔ７ｔａｇ配列、４塩基コドンＧＧＧＴを含む発現ベクターに組み込んだ。Ｔ７プロモーターの上流と下流のプライマーを用いてＰＣＲを行ない、カルモジュリン遺伝子断片を増幅させた。１００μＬのＰＣＲ反応から５０μＬのカルモジュリン遺伝子ＤＮＡを得た。
ｍＲＮＡの合成
４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２０ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＤＴＴ，４ｍＭ ＮＴＰ，２ｍＭ ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ，１０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ，ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ４０ｕｎｉｔｓ，ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ １ｕｎｉｔ，Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍａｒａｓｅ １００ｕｎｉｔｓ、カルモジュリン遺伝子ＤＮＡ ５μＬを含む１００μＬの反応液を３７℃で６時間反応させた。合成されたｍＲＮＡは酢酸アンモニウム沈殿の後、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿によって精製した。８μｇ／μＬとなるように水に溶解させた。
ＢＯＤＩＰＹ標識アミノ酸−ｔＲＮＡの合成
５ｘＬｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（２７５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｎａ ｐＨ７．５，７５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１６．５ｍＭ ＤＴＴ，５ｍＭ ＡＴＰ）４μＬ、２００μＭ ｔＲＮＡ（−ＣＡ）２．５μＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｐｄＣｐＡのＤＭＳＯ溶液 ２μＬ、０．１％ ＢＳＡ ０．４μＬ、Ｔ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（２５ｕｎｉｔｓ／μＬ）１．２μＬ、水９．９μＬを混合し、４℃で２時間反応させた。３Ｍ ＡｃＯＫ ｐＨ４．５を１０μＬ、水７０μＬを加え、等量のフェノール／クロロホルム＝１／１（０．３Ｍ ＡｃＯＫ ｐＨ４．５で飽和させたもの）を加え撹拌し、遠心した。上層を回収し、等量のクロロホルムを加え、撹拌、遠心した。上層を回収し、エタノール３００μＬを加え、軽く混合し、−２０℃で１時間置いた。１５０００ｒｐｍ ３０ｍｉｎ ４℃で遠心した後、上清を除き、−２０℃で保存してある７０％ＥｔＯＨ ２００μＬを加え、１５０００ｒｐｍ４℃で５秒遠心した。上清を除き、減圧乾燥した。１ｍＭ 酢酸カリウムｐＨ４．５２μＬに溶解させた。ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙａｌａｌａｎｉｎｅについても同様に合成した。
二重蛍光標識カルモジュリンの無細胞翻訳系による合成
反応液（１０μＬ）に、５５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５），２１０ｍＭ グルタミン酸カリウム，６．９ｍＭ 酢酸アンモニウム，１．７ｍＭ ジチオスレイトール，１．２ｍＭ ＡＴＰ，０．２８ｍＭ ＧＴＰ，２６ｍＭ ホスホエノールピルビン酸，１ｍＭ スペルミジン，１．９％ ポリエチレングリコール−８０００，３５μｇ／ｍＬ 葉酸，１２ｍＭ 酢酸マグネシウム，０．１ｍＭ ２０種類のアミノ酸、カルモジュリン ｍＲＮＡ（４塩基コドンＧＧＧＴとＣＧＧＧが導入されたもの）８μｇ／μＬを１μＬ、大腸菌抽出液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を２μＬ、蛍光標識アミノ酸−ｔＲＮＡ溶液を１μＬ混合した。３７℃で１時間翻訳反応を行なった。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析
翻訳反応液１μＬに、水９μＬと２×サンプルバッファー１０μＬを加え、９５℃５分間加熱した。このうちの５μＬを１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、この電気泳動ゲルを蛍光スキャナー（日立ソフトウェアエンジニアリング社製 ＦＭＢＩＯ−ＩＩＩ）で観察した。４８８ｎｍ励起／５２０ｎｍ検出、および、５３２ｎｍ励起／６０５ｎｍ検出により、２つの蛍光標識アミノ酸が導入されていることを確認した。
ＨｉｓＴａｇ アフィニティー精製
無細胞翻訳系の反応液５０μＬを３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、７．５Ｍ ｕｒｅａに希釈して２００μＬとし、Ｎｉ−ＮＴＡ磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）２０μＬと混合して３０分間振とうした。磁石によりビーズを集めて上清を捨て、洗浄バッファー（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２）１ｍＬにより４回洗浄した。溶出バッファー（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）５０μＬを加え、１時間振とうした後、磁石によりビーズを集めて上清を回収した。３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０により平衡化したゲルろ過スピンカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）により脱塩を行なった。
蛍光スペクトル測定
精製した二重蛍光標識カルモジュリン溶液１０μＬを測定バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１％ ＰＥＧ８０００）１９０μＬと混合して、石英セルに移した。蛍光分光器を使用して、励起波長４９０ｎｍ／検出波長５０５ｎｍ〜６５０ｎｍにより蛍光スペクトルを測定した。カルモジュリン結合ペプチド Ｍ１３（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ；配列番号４）とマルトース結合タンパク質の融合タンパク質（ＭＢＰ−Ｍ１３）を添加しながら、蛍光スペクトル測定を行なった。結果を図７、図９、図１１、図１３に示す。
４塩基コドンＧＧＧＴおよびＣＧＧＧを含むカルモジュリン遺伝子の作製
カルモジュリン遺伝子（配列番号１）を鋳型として、４塩基コドンＣＧＧＧ導入用のオリゴヌクレオチド（例：４０番目に導入する場合の配列は５’−ＴＧＴＴＧＧＧＴＴＣＴＧＣＣＣＧＣＡＧＴＧＡＣＣＴＣＡＴ−３’；配列番号３）を用いてＰＣＲを行ない、変異導入を行なった。これをＴ７プロモーター、Ｔ７ｔａｇ配列、４塩基コドンＧＧＧＴを含む発現ベクターに組み込んだ。Ｔ７プロモーターの上流と下流のプライマーを用いてＰＣＲを行ない、カルモジュリン遺伝子断片を増幅させた。１００μＬのＰＣＲ反応から５０μＬのカルモジュリン遺伝子ＤＮＡを得た。
ｍＲＮＡの合成
４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２０ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＤＴＴ，４ｍＭ ＮＴＰ，２ｍＭ ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ，１０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ，ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ４０ｕｎｉｔｓ，ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ １ｕｎｉｔ，Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍａｒａｓｅ １００ｕｎｉｔｓ、カルモジュリン遺伝子ＤＮＡ ５μＬを含む１００μＬの反応液を３７℃で６時間反応させた。合成されたｍＲＮＡは酢酸アンモニウム沈殿の後、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿によって精製した。８μｇ／μＬとなるように水に溶解させた。
ＢＯＤＩＰＹ標識アミノ酸−ｔＲＮＡの合成
５ｘＬｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（２７５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｎａ ｐＨ７．５，７５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１６．５ｍＭ ＤＴＴ，５ｍＭ ＡＴＰ）４μＬ、２００μＭ ｔＲＮＡ（−ＣＡ）２．５μＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｐｄＣｐＡのＤＭＳＯ溶液 ２μＬ、０．１％ ＢＳＡ ０．４μＬ、Ｔ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（２５ｕｎｉｔｓ／μＬ）１．２μＬ、水９．９μＬを混合し、４℃で２時間反応させた。３Ｍ ＡｃＯＫ ｐＨ４．５を１０μＬ、水７０μＬを加え、等量のフェノール／クロロホルム＝１／１（０．３Ｍ ＡｃＯＫ ｐＨ４．５で飽和させたもの）を加え撹拌し、遠心した。上層を回収し、等量のクロロホルムを加え、撹拌、遠心した。上層を回収し、エタノール３００μＬを加え、軽く混合し、−２０℃で１時間置いた。１５０００ｒｐｍ ３０ｍｉｎ ４℃で遠心した後、上清を除き、−２０℃で保存してある７０％ＥｔＯＨ ２００μＬを加え、１５０００ｒｐｍ４℃で５秒遠心した。上清を除き、減圧乾燥した。１ｍＭ 酢酸カリウムｐＨ４．５２μＬに溶解させた。ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙａｌａｌａｎｉｎｅについても同様に合成した。
二重蛍光標識カルモジュリンの無細胞翻訳系による合成
反応液（１０μＬ）に、５５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５），２１０ｍＭ グルタミン酸カリウム，６．９ｍＭ 酢酸アンモニウム，１．７ｍＭ ジチオスレイトール，１．２ｍＭ ＡＴＰ，０．２８ｍＭ ＧＴＰ，２６ｍＭ ホスホエノールピルビン酸，１ｍＭ スペルミジン，１．９％ ポリエチレングリコール−８０００，３５μｇ／ｍＬ 葉酸，１２ｍＭ 酢酸マグネシウム，０．１ｍＭ ２０種類のアミノ酸、カルモジュリン ｍＲＮＡ（４塩基コドンＧＧＧＴとＣＧＧＧが導入されたもの）８μｇ／μＬを１μＬ、大腸菌抽出液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を２μＬ、蛍光標識アミノ酸−ｔＲＮＡ溶液を１μＬ混合した。３７℃で１時間翻訳反応を行なった。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析
翻訳反応液１μＬに、水９μＬと２×サンプルバッファー１０μＬを加え、９５℃５分間加熱した。このうちの５μＬを１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、この電気泳動ゲルを蛍光スキャナー（日立ソフトウェアエンジニアリング社製 ＦＭＢＩＯ−ＩＩＩ）で観察した。４８８ｎｍ励起／５２０ｎｍ検出、および、５３２ｎｍ励起／６０５ｎｍ検出により、２つの蛍光標識アミノ酸が導入されていることを確認した。
ＨｉｓＴａｇ アフィニティー精製
無細胞翻訳系の反応液５０μＬを３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、７．５Ｍ ｕｒｅａに希釈して２００μＬとし、Ｎｉ−ＮＴＡ磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）２０μＬと混合して３０分間振とうした。磁石によりビーズを集めて上清を捨て、洗浄バッファー（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２）１ｍＬにより４回洗浄した。溶出バッファー（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）５０μＬを加え、１時間振とうした後、磁石によりビーズを集めて上清を回収した。３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０により平衡化したゲルろ過スピンカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）により脱塩を行なった。
蛍光スペクトル測定
精製した二重蛍光標識カルモジュリン溶液１０μＬを測定バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１％ ＰＥＧ８０００）１９０μＬと混合して、石英セルに移した。蛍光分光器を使用して、励起波長４９０ｎｍ／検出波長５０５ｎｍ〜６５０ｎｍにより蛍光スペクトルを測定した。カルモジュリン結合ペプチド Ｍ１３（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ；配列番号４）とマルトース結合タンパク質の融合タンパク質（ＭＢＰ−Ｍ１３）を添加しながら、蛍光スペクトル測定を行なった。結果を図７、図９、図１１、図１３に示す。
実施例２ アンバーコドンＴＡＧおよび４塩基コドンＣＧＧＧを含むマルトース結合タンパク質遺伝子の作製
マルトース結合タンパク質（配列番号５）を鋳型として、部位特異的変異導入法により１番目のリジンに対応するコドンをアンバーコドンＴＡＧに置換して、Ｔ７プロモーターとＴ７ｔａｇ配列を含む発現ベクターに組み込んだ。さらに再度部位特異的変異導入法により１７１番目、１７６番目、あるいは２８３番目のアミノ酸に対応するコドンを４塩基コドンＣＧＧＧに置換した。Ｔ７プロモーターの上流とＴ７ターミネーターの下流のプライマーを用いてＰＣＲを行ない、マルトース結合タンパク質遺伝子断片を増幅させた。１００μＬのＰＣＲ反応から５０μＬのマルトース結合タンパク質遺伝子ＤＮＡを得た。
ｍＲＮＡの合成
カルモジュリン遺伝子の場合と同様の操作により、マルトース結合タンパク質のｍＲＮＡを合成した。
ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅを付加したアンバーサプレッサーｔＲＮＡの合成
カルモジュリンの場合と同様の操作により、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｔＲＮＡを合成した。ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｔＲＮＡは、マイコプラズマカプリコラムのＴｒｐ１ ｔＲＮＡの改変体（配列番号６）を用いて合成した。
二重蛍光標識マルトース結合タンパク質の無細胞翻訳系による合成
カルモジュリンの場合と同様の操作により、二重蛍光標識マルトース結合タンパク質を合成した。
蛍光スペクトル測定
カルモジュリンの場合と同様の操作によりＨｉｓＴａｇ アフィニティー精製した二重蛍光標識マルトース結合タンパク質溶液１０μＬを、測定バッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ ＰＥＧ、０．００５％ Ｂｒｉｇ３５）と混合して、石英セルに移した。蛍光分光器を使用して、励起波長４９０ｎｍ／検出波長５０５ｎｍ〜６５０ｎｍにより、マルトースの非存在下および０．１ｍＭマルトース存在下で蛍光スペクトルを測定した。結果を図１５、図１７および図１９に示す。
マルトース結合タンパク質（配列番号５）を鋳型として、部位特異的変異導入法により１番目のリジンに対応するコドンをアンバーコドンＴＡＧに置換して、Ｔ７プロモーターとＴ７ｔａｇ配列を含む発現ベクターに組み込んだ。さらに再度部位特異的変異導入法により１７１番目、１７６番目、あるいは２８３番目のアミノ酸に対応するコドンを４塩基コドンＣＧＧＧに置換した。Ｔ７プロモーターの上流とＴ７ターミネーターの下流のプライマーを用いてＰＣＲを行ない、マルトース結合タンパク質遺伝子断片を増幅させた。１００μＬのＰＣＲ反応から５０μＬのマルトース結合タンパク質遺伝子ＤＮＡを得た。
ｍＲＮＡの合成
カルモジュリン遺伝子の場合と同様の操作により、マルトース結合タンパク質のｍＲＮＡを合成した。
ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅを付加したアンバーサプレッサーｔＲＮＡの合成
カルモジュリンの場合と同様の操作により、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｔＲＮＡを合成した。ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｔＲＮＡは、マイコプラズマカプリコラムのＴｒｐ１ ｔＲＮＡの改変体（配列番号６）を用いて合成した。
二重蛍光標識マルトース結合タンパク質の無細胞翻訳系による合成
カルモジュリンの場合と同様の操作により、二重蛍光標識マルトース結合タンパク質を合成した。
蛍光スペクトル測定
カルモジュリンの場合と同様の操作によりＨｉｓＴａｇ アフィニティー精製した二重蛍光標識マルトース結合タンパク質溶液１０μＬを、測定バッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ ＰＥＧ、０．００５％ Ｂｒｉｇ３５）と混合して、石英セルに移した。蛍光分光器を使用して、励起波長４９０ｎｍ／検出波長５０５ｎｍ〜６５０ｎｍにより、マルトースの非存在下および０．１ｍＭマルトース存在下で蛍光スペクトルを測定した。結果を図１５、図１７および図１９に示す。
実施例に示すように、本発明の蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を含むタンパク質であって、該タンパク質と結合し得る分子と結合したときに立体構造が変化しエネルギー供与体蛍光物質とエネルギー受容体蛍光物質の距離および配向が変化するような位置に２種類の蛍光標識アミノ酸が存在し蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化し得るタンパク質に他の分子が相互作用すると蛍光共鳴エネルギー移動の効率に変化が生じる。
本発明のタンパク質は、タンパク質の種類に応じて、蛍光共鳴エネルギーが充分起こり得る位置に蛍光標識アミノ酸が導入されているので、効率よくタンパク質と他の分子との相互作用を検出することができる。
本発明のタンパク質を用いることにより、タンパク質と他の分子との相互作用を検出し、解析することができ、タンパク質と相互作用する分子のスクリーニングを行うことができる。また、タンパク質と他の分子との相互作用を増強または阻害する化合物のスクリーニングを行うこともでき、該化合物は前記タンパク質が関与する疾患の治療等に用いる薬剤として利用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
本発明のタンパク質は、タンパク質の種類に応じて、蛍光共鳴エネルギーが充分起こり得る位置に蛍光標識アミノ酸が導入されているので、効率よくタンパク質と他の分子との相互作用を検出することができる。
本発明のタンパク質を用いることにより、タンパク質と他の分子との相互作用を検出し、解析することができ、タンパク質と相互作用する分子のスクリーニングを行うことができる。また、タンパク質と他の分子との相互作用を増強または阻害する化合物のスクリーニングを行うこともでき、該化合物は前記タンパク質が関与する疾患の治療等に用いる薬剤として利用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
Claims (17)
- 蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を含むタンパク質であって、該タンパク質と結合し得る分子と結合したときに立体構造が変化しエネルギー供与体蛍光物質とエネルギー受容体蛍光物質の距離および配向が変化するような位置に２種類の蛍光標識アミノ酸が存在し蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化し得るタンパク質を被験分子と接触させ、該タンパク質と被験分子との相互作用による前記タンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより検出し、前記タンパク質と前記被験分子の相互作用を検出する方法。
- 蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸の一方がタンパク質のN末端またはC末端に存在し、もう一方がN末端およびC末端以外の部位に存在する請求項１記載の方法。
- 蛍光物質で標識したアミノ酸を４塩基コドン法または終止コドン法により導入した請求項１または２に記載の方法。
- タンパク質と結合し得る分子が、タンパク質、核酸、糖および低分子量分子からなる群から選択される請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質が、可視光域に励起波長および発光波長を有する蛍光物質である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質が、その化学構造に4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセンを基本骨格として含む分子又はその塩もしくはその誘導体である請求項５記載の方法。
- エネルギー供与体となる蛍光物質が、4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー受容体となる蛍光物質が、4,4-ジフルオロ-5-(2-チエニル)-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸又はその塩である請求項６記載の方法。
- エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質がp-アミノフェニルアラニンのパラ位アミノ基に結合している請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- タンパク質が、カルモジュリンまたはマルトース結合タンパク質である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法に用いる、２種類の蛍光標識アミノ酸を含むカルモジュリンであって、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識したアミノ酸をそれぞれカルモジュリンのアミノ酸配列の40番目とN末端、またはカルモジュリンのアミノ酸配列の99番目とN末端に含み、カルモジュリンがカルモジュリン結合タンパク質およびカルシウムイオンと相互作用したときに、蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するカルモジュリン。
- エネルギー供与体となる蛍光物質が、4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー受容体となる蛍光物質が、4-ジフルオロ-5-(2-チエニル)-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸又はその塩である、請求項１０記載のカルモジュリン。
- 請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法に用いる、２種類の蛍光標識アミノ酸を含むマルトース結合タンパク質であって、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識したアミノ酸が、マルトース結合タンパク質をそれぞれマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列の171番目とN末端、またはマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列の283番目とN末端に含み、マルトースと相互作用したときに、蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するマルトース結合タンパク質。
- エネルギー供与体となる蛍光物質が、4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー受容体となる蛍光物質が、4-ジフルオロ-5-(2-チエニル)-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸又はその塩である、請求項１２記載のマルトース結合タンパク質。
- 請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法によりタンパク質と被験分子との相互作用による前記タンパク質の立体構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより検出し、前記タンパク質と相互作用する分子をスクリーニングする方法。
- タンパク質がカルモジュリンまたはマルトース結合タンパク質である請求項１４記載の方法。
- タンパク質がカルモジュリンであって、タンパク質と相互作用する分子がカルシウム結合タンパク質およびカルシウムイオンである請求項１５記載の方法。
- タンパク質がマルトース結合タンパク質であって、タンパク質と相互作用する分子がマルトースである請求項１５記載の方法。
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