JP4883411B2 - 蛍光強度解析法 - Google Patents
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蛋白質中には、このように複数種類の蛍光基がそれぞれ1つもしくは複数個ずつ存在しうるが、蛍光基の励起波長を選択したりすることにより、ある1種類の蛍光基のみに由来する蛍光強度を測定できることが公知である。例えば、蛋白質中にトリプトファンとチロシンという2種類の蛍光基が存在している場合、トリプトファンのみを選択的に励起できる波長(295 nm など)を用いて蛋白質を励起させることによって、蛋白質中のトリプトファンに由来する蛍光強度を測定することができる。
Harris, D. L. & Hudson, B. S. (1990). Photophysics of tryptophan in bacteriophage T4 lysozymes. Biochemistry 29, 5276-5285. Loewenthal, R., Sancho, J. & Fersht, A. R. (1991). Fluorescence spectrum of barnase: contributions of three tryptophan residues and a histidine-related pH dependence. Biochemistry 30, 6775-6779. Locke, B. C., MacInnis, J. M., Qian, S., Gordon, J. I., Li, E., Fleming, G. R. & Yang, N. C. (1992). Fluorescence studies of rat cellular retinol binding protein II produced in Escherichia coli: an analysis of four tryptophan substitution mutants. Biochemistry 31, 2376-2383. Eftink, M. R., Ramsay, G. D., Burns, L., Maki, A. H., Mann, C.J., Matthews, C. R. & Ghiron, C. A. (1993). Luminescence studies with trp repressor and its single-tryptophan mutants. Biochemistry 32, 9189-198 Clark, P. L., Weston, B. F. & Gierasch, L. M. (1998). Probing the folding pathway of a β-clam protein with single-tryptophan constructs. Fold. Des. 3, 401-412. Demchenko, A. P., Gallay, J., Vincent, M. & Apell, H. J. (1998). Fluorescence heterogeneity of tryptophans in Na,K-ATPase: evidences for temperature-dependent energy transfer. Biophys. Chem. 72, 265-283. Ercelen, S., Kazan, D., Erarslan, A. & Demchenko, A. P. (2001). On the excited-state energy transfer between tryptophan residues in proteins: the case of penicillin acylase. Biophys. Chem. 90, 203-217. Martensson, L. G., Jonasson, P., Freskgard, P. O., Svensson, M., Carlsson, U. & Jonsson, B. H. (1995). Contribution of individual tryptophan residues to the fluorescence spectrum of native and denatured forms of human carbonic anhydrase II. Biochemistry 34, 1011-1021.
ri,jはi番目の蛍光基Dとj番目のアクセプター蛍光体A導入部位との距離である。
上記のFDA等のデータとしては、実測値の他に、既に公知となっているデータを用いることができる。
である。ここで、g は (M, 1)行列、A は(M, N)行列、f は (N, 1)行列である。gi あるいはgは、アクセプター蛍光体Aを含まない蛋白質の蛍光強度FDのデータと、アクセプター蛍光体Aを含む変異型蛋白質の蛍光強度FDAのデータ(M個)から求めることができる。
この他に、蛍光基Dとアクセプター蛍光体Aとしては次のようなものがある(非特許文献9、10)。
Wu, P. & Brand, L. (1994) Resonance energy transfer: Methods and applications. Anal. Biochem. 218, 1-13. Invitrogen社のホームページ:http://probes.invitrogen.com/handbook/sections/0103.html
ただし、本発明の技術的範囲は、上記の蛍光基、アクセプター蛍光体に限定されるものではない。
[実施例1: 蛍光基としてトリプトファンとチロシンの両方を含む蛋白質のトリプトファン蛍光強度]
大腸菌由来の蛋白質であるジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR, EC 1.5.1.3)には、蛍光基として5つのトリプトファン(Trp22、Trp30、Trp47、Trp74、Trp133)、および、4つのチロシンが存在している。ここでは、5つのトリプトファンの蛍光強度を求めることを考える。トリプトファンのアクセプター蛍光体としては、AEDANS(5-(((acetylamino)ethyl)amino)naphthalene-1-sulfonic acid)、ダンシル基、TNB、ピレンなどが知られており、それらのアクセプター蛍光体とトリプトファンのフェルスター距離R0も公知である(非特許文献11)。ここでは、アクセプター蛍光体としてAEDANSを用いた例を記載する。AEDANSとトリプトファンのフェルスター距離は22 Åである(非特許文献11)。
Lakowicz, J. R. (2006). Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd edition, Springer.
まず、Stratagene社製のQuikChange部位特異的変異導入キットを使用して、AS-DHFRの遺伝子をもったプラスミドに変異を導入し、1つのシステインを持った変異型DHFRの遺伝子を作成した。このプラスミドを大腸菌JM109に形質転換した後、非特許文献13の方法で1システイン含有変異蛋白質を発現・精製した。具体的には、まず2×YT培地中に大腸菌を植菌し、37℃で一晩培養することにより、変異型DHFRを大量発現させた。次に、この大腸菌を遠心分離機で集菌し、フレンチプレスで破砕したあと、破砕液の上清をMTXアガロース親和性カラム(Sigma社製)に流すことにより、変異型DHFRを精製した。精製された変異型DHFRをバッファ(10 mM リン酸カリウム、0.2 mM EDTA、1 mM ジチオスレイトール(DTT)、pH 7.0)に対して透析したあと、DEAE-Toyopearl 650Mイオン交換カラム(東ソー株式会社製)に流して更に精製することにより、高度精製された1システイン含有変異型DHFRを得た。
次に、この蛋白質にMolecular Probes社製のヨードAEDANSを、販売元から供給されたプロトコールおよび非特許文献14に記載の方法を一部修正して共有結合させた。簡単に記述すると、まず、ヨードAEDANSでの修飾の前に、100 μM の蛋白質を10 mM リン酸カリウム(pH 7.8)、0.2 mM EDTA、1 mM DTT、4.5 M 尿素の溶液に入れ、室温で45分放置し、蛋白質を還元させた。そのあと、この溶液を10 mM リン酸カリウム(pH 7.8)、0.2 mM EDTA、4.5 M 尿素で平衡化してあるPD-10カラム(GE Healthcare社製)に通して、DTTを除去した。変異蛋白質(〜60 μM)への蛍光ラベル導入は、10 mM リン酸化カリウム(pH 7.8)、0.2 mM EDTA、4.5 M 尿素と、蛋白質の20倍量のヨードAEDANSを含む溶液中で行った。ラベル化反応は、室温の暗い場所で12時間放置して行わせた。ラベル化された蛋白質は、測定用緩衝液で平衡化してあるPD-10カラムに2回通して精製した。分光学的測定により、変異型DHFR1分子につきAEDANSが1個の割合で結合していることがわかった。
Iwakura, M., Jones, B. E., Luo, J. & Matthews, C. R. (1995). A strategy for testing the suitability of cysteine replacements in dihydrofolate reductase from Escherichia coli. J. Biochem.(Tokyo), 117, 480-488. Arai, M. & Iwakura, M. (2005). Probing the interactions between the folding elements early in the folding of Escherichia coli dihydrofolate reductase by systematic sequence perturbation analysis. J. Mol. Biol. 347, 337-353. Magg, C. & Schmid, F. X. (2004) Rapid collapse precedes the fast two-state folding of the cold shock protein. J. Mol. Biol. 335, 1309-1323.
図1は、DHFRの1システイン含有変異体にAEDANSを結合させた場合と、結合させていない場合の蛍光スペクトルである。チロシンの蛍光を除去するために、励起波長を295 nmに設定し、トリプトファンのみの蛍光スペクトルが測定された。これらは全て同じ蛋白質濃度、同じ装置条件、同じ測定条件で測定されたものである。蛋白質濃度は2 μM、セル長は10 mm、使用装置はAviv社製のATF 105 蛍光分光器、励起側と発光側のバンド幅はともに2 nmである。
アクセプター蛍光体が結合していない蛋白質のトリプトファン由来蛍光強度FDとしては、AEDANSを結合させていない1システイン含有変異型DHFRの蛍光スペクトルのピーク波長(336 nm 付近)における蛍光強度を採用した。また、アクセプター蛍光体が結合した蛋白質のトリプトファン由来蛍光強度FDAとしては、AEDANSを結合させた1システイン含有変異型DHFRの蛍光スペクトルのピーク波長(FDの場合と同じ波長)における蛍光強度を採用した。これらの値を式(3)’に代入することにより、10個の変異型DHFRの有効蛍光共鳴エネルギー移動効率Eeff,jが得られた(表1参照)。
トリプトファンとアクセプター蛍光体の距離ri (i = 1 〜 N)は、トリプトファンのCβ原子からAEDANSを導入した部位のCβ原子までの距離として求めた。DHFRの構造としては、Protein Data Bank に登録されているDHFRの12個のX線結晶構造(PDB コード: 1rx1, 1rx2, 1rx3, 1rx4, 1rx5, 1rx6, 1ra9, 4dfr (A 分子), 4dfr (B 分子), 5dfr, 6dfr, 7dfr)を使用し、それらについての距離データを平均した。
また、DHFRのトリプトファン蛍光の量子収率を公知の方法で求め、式(16)〜(17)の計算を行い、DHFRの各トリプトファン蛍光の量子収率を計算した。その結果も表2に示してある。
蛋白質の中には、トリプトファンを持たず、蛍光基としてチロシンのみを持つものが存在する。枯草菌由来の蛋白質であるSpo0F(125個のアミノ酸からなる)はトリプトファンを持たないが、4つのチロシン(Tyr13、Tyr28、Tyr84、Tyr118)を持つ。チロシンのアクセプター蛍光体として、実施例1の場合と同様にAEDANSを用いることができる。AEDANSの導入は、実施例1と同様である。Spo0F中の3箇所以上にAEDANSを1つずつ導入した変異型Spo0Fを3個以上作成する。励起波長を280 nm に設定してSpo0Fのチロシン由来蛍光スペクトルを測定する。AEDANSが結合していない1システイン含有変異型Spo0Fの蛍光スペクトルのピーク波長付近(310 nm 付近)での蛍光強度をFDとして用い、AEDANSが結合している1システイン含有変異型Spo0Fの蛍光スペクトルのピーク波長付近(FDの場合と同じ波長)での蛍光強度をFDAとして用いる。式(3)’から、3個以上の変異型Spo0Fの有効蛍光共鳴エネルギー移動効率Eeff,jを求める。Protein Data Bank に登録されているSpo0FのX線結晶構造(PDBコード: 1NAT)あるいはNMR構造(PDBコード: 2FSP)から、AEDANS導入部位とチロシンの距離を求める。式(4)からフェルスター距離R0を求める。
以上のデータは公知の方法で得ることができる。これらのデータをもとにして、本発明の解析方法を用いることにより、Spo0Fのチロシン由来蛍光強度に対する4つのチロシンの寄与度を求めることができる。
蛋白質の中には、チロシンを持たず、蛍光基としてトリプトファンのみを持つものが存在しうる。公知の蛋白質工学的手法を用いることにより、そのような蛋白質を作成することも可能である。ストレプトコッカス由来の蛋白質であるProtein AのBドメインには1つのチロシン(Tyr15)存在するが、これをトリプトファンに置換したY15W変異体が報告されている(非特許文献15)。
Sato, S., Religa, T. L., Daggett, V. & Fersht, A. R. (2004). Testing protein-folding simulations by experiment: B domain of protein A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 6952-6956.
以上のデータは公知の方法で得ることができる。これらのデータをもとにして、本発明の解析方法を用いることにより、AW2のトリプトファン由来蛍光強度に対する2つのトリプトファンの寄与度を求めることができる。
実施例1で用いたDHFRには、5つのトリプトファン(Trp22、Trp30、Trp47、Trp74、Trp133)と4つのチロシン(Tyr100、Tyr111、Tyr128、Tyr151)が存在している。トリプトファンとチロシンのアクセプター蛍光体としてAEDANSを採用し、実施例1と同じ方法でAEDANSをDHFRに導入する。AEDANSを結合させていない1システイン含有変異型DHFRと、AEDANSを結合させた1システイン含有変異型DHFRをそれぞれ3個以上作成する。
チロシンの吸収スペクトルはトリプトファンの吸収スペクトルの範囲内にあるため、近紫外領域においては、チロシンのみを選択的に励起する波長は存在しない。そこで励起波長を280 nmに設定し、トリプトファンとチロシンの両方の寄与が存在している蛍光スペクトルを測定する。また、励起波長を295 nm に設定し、トリプトファンのみに由来する蛍光スペクトルを測定する。さらに、AEDANSを結合させていない1システイン含有変異型DHFR の280 nm と295 nm における吸光度A280およびA295を測定する。
AEDANSを結合させていない1システイン含有変異型DHFRとAEDANSを結合させた1システイン含有変異型DHFRそれぞれ3個以上について測定した全ての蛍光スペクトルに対して、この操作を行い、チロシンのみに由来する蛍光スペクトルを求める。ピーク波長付近(310 nm 付近)での蛍光強度を、それぞれFDおよびFDAとして採用する。これをもとにして、式(3)’からEeff,jを計算する。また、実施例1と同じようにして、Protein Data Bank に登録されたX線結晶構造のデータから、アクセプター蛍光体とチロシンの距離を求める。さらに、実施例2と同じようにして、チロシンとAEDANSのフェルスター距離R0を求める。
以上のデータは公知の方法で得ることができる。これらのデータをもとにして、本発明の解析方法を用いることにより、DHFRのチロシン由来蛍光強度に対する4つのチロシンの寄与度を求めることができる。
Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G. & Gray, T. (1995). How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 4, 2411-2423.
強い蛍光を発し、かつ、強い光を照射しても分解されにくい蛍光基であるAlexa Fluor色素等を蛋白質に共有結合的にラベルし、その蛍光を指標にして蛋白質の機能やフォールディングに伴う運動をモニターする技術が近年、開発されている。非特許文献17では、DHFRのAsn37にAlexa Fluor 555色素(以下Alexa555と略す)を共有結合的にラベルしてDHFRの機能発現に伴う運動を観測した例が報告されている。この変異型DHFRにもう一つAlexa555を導入したとき、これら2つのAlexa555の蛍光強度寄与度を求めることを考える。
Alexa555のアクセプター蛍光体として、Alexa647、Alexa660、Cy5などを用いることができるが、ここではAlexa647を用いた場合を記載する。本発明の解析方法を適用するためには、Alexa647が1つとAlexa555を2つ含む変異型DHFR1個以上についての蛍光強度のデータが必要となる。2つのAlexa555と1つのAlexa647は、非特許文献17などに記載されている公知の方法でDHFRにラベル導入することができる。Alexa647非結合型DHFRのAlexa555由来蛍光強度と、Alexa647結合型DHFRのAlexa555由来蛍光強度を測定し、FDとFDAを得る。Alexa555の蛍光は、励起波長514 nm 程度、蛍光波長550 〜 600 nm 程度で測定できる。式3からEeff,jを計算する。また、実施例1と同じようにして、Protein Data Bank に登録されたX線結晶構造のデータから、Alexa555とAlexa647の距離を求める。Alexa555からAlexa647への蛍光共鳴エネルギー移動のフェルスター距離は公知である(51 Å)。
以上のデータは公知の方法で得ることができる。これらのデータをもとにして、本発明の解析方法を用いることにより、DHFRにラベルされたAlexa555由来蛍光強度に対する2つのAlexa555の寄与度を求めることができる。
Antikainen, N. M., Smiley, R. D., Benkovic, S. J. & Hammes, G. G. (2005). Conformation coupled enzyme catalysis: single-molecule and transient kinetics investigation of dihydrofolate reductase. Biochemistry, 44, 16835-16843.
Claims (2)
- (1)アクセプター蛍光体Aを蛋白質に導入した変異型蛋白質M個を用いて得られる、蛍光基Dに由来するj番目(j = 1 〜 M)の変異型蛋白質の蛍光強度FDAのデータ、および、アクセプター蛍光体Aが存在しない場合の蛍光基Dに由来する蛋白質の蛍光強度FDのデータを次の式(3)’に代入して、j番目の変異型蛋白質の全蛍光基Dからアクセプター蛍光体Aへの有効蛍光共鳴エネルギー移動効率Eeff,jを求める。
ri,jはi番目の蛍光基Dとj番目のアクセプター蛍光体A導入部位との距離である。 - 前記手順(1)において、アクセプター蛍光体Aを蛋白質に導入した変異型蛋白質をM個を作製し、得られた蛍光基Dに由来するj番目(j = 1 〜 M)の変異型蛋白質の蛍光強度FDAのデータを使用して有効蛍光共鳴エネルギー移動効率Eeff,jを求めることを特徴とする請求項1に記載の蛍光強度解析方法。
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