JP4606643B2 - 分析対象物を定量する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分析対象物を定量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質は、特異的結合性および高度な生理機能を有するため、ほとんどの生理現象において主役を演じている。このタンパク質を制御できれば生命現象への理解が深まり、より向上した医療基盤の確立が実現できる。
タンパク質は、本来、生理的条件(例えば適度なｐＨ、温度および塩濃度など)下において安定に存在するものである。このような生理的条件下では、タンパク質は折りたたまれ、固有の立体構造を形成することで、特異的な生物機能を発現する。
【０００３】
しかし、高温などの極端な条件では、天然状態で形成されている非共有結合の多くが壊れて固有の立体構造が破壊され、タンパク質の物理的、化学的および生物的な性質が変化しまう。これをタンパク質の変性という。タンパク質の構造変化を検知する方法としては、例えば二次構造の含有率を測るべく、ＣＤスペクトルを測定する方法、タンパク質中で芳香族側鎖を持つ残基が示す２８０ｎｍ付近の紫外吸収または蛍光を測定する方法、さらに、プロトンとアミドプロトンとの間のＪHNα結合定数がもたらす構造情報などを解析すべくＮＭＲスペクトルを測定する方法などの分光学的方法がある。
【０００４】
タンパク質の変性を迅速かつ簡便に評価する方法は、タンパク質を取り扱う際、非常に重要である。こういった方法の目的は、タンパク質の安定化の機構を明らかにすることであり、タンパク質の安定性を評価したり、タンパク質の安定化方法を検討したりすることにある。
特に、定量を目的とした特異結合分析方法では、分析対象物と前記分析対象物に特異的に結合する特異結合物質とを用いて特異結合反応を行うとともに、その濃度を決定するためには、コントロールとして標準物質を用いた補正が必要である。この場合、測定ごとに標準物質を用いて補正を行うと、操作が煩雑になってしまう。このため、あらかじめ標準物質を用いて特異結合反応を行い、濃度換算のための検量線を作成しておく方法が広く用いられている。
なお、特開平９−１７３３０１号公報は、皮膚、毛髪または爪に紫外光を照射し、３３０ｎｍ付近に蛍光極大を有するケラチン中の芳香族アミノ酸の蛍光バンドの波形や極大波長を測定し、基準値と対比して皮膚、毛髪または爪の損傷・劣化の程度を評価する方法を開示している。
また、特開平９−１２４６９９号公報は、ケラチン含有材料を炭素数３のアルコール含有溶液に浸漬して、ケラチン含有材料に含有されるタンパク質を抽出し、タンパク質含有溶液を得る方法を開示している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、この特異結合物質がタンパク質である場合、特異結合物質そのものが保存中に変性し、その反応特性も、特異結合物質の標準物質を用いて検量線を作成する時点に比べて変化するため、実際の濃度換算時に検量線は使用できなくなる恐れがある。また、測定ごとに標準物質を用いて補正を行う場合においても同様のことが言え、標準物質そのものが保存中に変性し、濃度換算のための標準物質として使用できなくなる恐れがある。したがって、製造直後から使用時にわたる長期保存状態においてタンパク質をほとんど変性させないタンパク質安定化方法、およびタンパク質安定性評価方法を開発することが強く望まれている。ところが、このような方法はほとんど知られていないのが現状である。
【０００６】
また特異結合反応のみならず、タンパク質を利用した測定デバイスを作製する場合には、材料および測定デバイス試薬として用いるタンパク質の品質をいかに管理するかが問題となる。例えば、前記測定デバイスを製造する工程においては、材料として用いるタンパク質が変性していないかどうかを常にモニターしておく必要があり、さらに、測定デバイス試薬として用いるタンパク質のロット管理および安定化の検討も必要である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記問題点を解決すべく、本発明は、分析対象物と、前記分析対象物に特異的に結合する被検タンパク質とを反応させ、前記反応に由来して得られる信号の強度を所定時間経過後に少なくとも１回測定し、前記信号の強度に基づいて前記分析対象物を定量する方法であって、（Ａ）様々な変性段階にある基準タンパク質について、各変性段階の基準タンパク質を含む溶液にあらかじめ定められた波長域の励起光を照射することにより、前記各変性段階の基準タンパク質が発するあらかじめ定められた波長域の蛍光を測定し、基準タンパク質の変性段階と蛍光の極大波長との関係を求める工程、（Ｂ）所定の変性段階にある被検タンパク質を含む溶液にあらかじめ定められた波長域の励起光を照射することにより、前記所定の変性段階にある被検タンパク質が発するあらかじめ定められた波長域の蛍光を測定する工程、（Ｃ）工程（Ａ）で求められた前記基準タンパク質の変性段階と蛍光の極大波長との関係および工程（Ｂ）において測定した蛍光の極大波長を指標として、前記所定の変性段階にある被検タンパク質の変性段階を判定し、判定結果に基づいて、前記分析対象物である被検タンパク質を用いる前記特異結合分析方法において濃度換算のために使用する検量線を決定する工程、（Ｄ）分析対象物と前記所定の変性段階にある被検タンパク質とを反応させ、前記反応に由来して得られる信号強度を測定する工程、ならびに（Ｅ）工程（Ｃ）で決定された検量線および工程（Ｄ）において測定した信号強度を指標として、前記分析対象物を定量する工程を有することを特徴とする分析対象物の定量方法を提供する。
【０００８】
工程（Ａ）および（Ｂ）において、前記励起光の波長域が、それぞれ前記基準タンパク質および被検タンパク質の吸収極大を含む波長域であり、測定される蛍光の波長域が２８５〜４５０ｎｍであるのが有効である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法について説明する。
本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法は、（ａ）様々な変性段階にある基準タンパク質について、各変性段階の基準タンパク質を含む溶液にあらかじめ定められた波長域の励起光を照射することにより、前記各変性段階の基準タンパク質が発するあらかじめ定められた波長域の蛍光を測定し、前記基準タンパク質の変性段階と蛍光の極大波長との関係を求める工程、（ｂ）被検タンパク質を含む溶液にあらかじめ定められた波長域の励起光を照射することにより、前記被検タンパク質が発するあらかじめ定められた波長域の蛍光を測定する工程、ならびに（ｃ）工程（ａ）で求められた基準タンパク質の変性段階と蛍光の極大波長との関係および工程（ｂ）において測定した蛍光の極大波長を指標として、前記被検タンパク質の特性を評価する工程を有することを特徴とする。
【００１０】
タンパク質の蛍光は、主として芳香族アミノ酸であるトリプトファンまたはチロシンなどのクロモホアに由来して発現するものである。この蛍光はこれらクロモホアの周りの影響を非常に敏感に反映する。外的環境により、消光の程度が変化してスペクトル強度が変動し、また、蛍光スペクトルは、より疎水的環境においては短波長側にシフトし、親水的環境においては長波長側にシフトする。蛍光スペクトルは感度が高く、非常に低濃度のサンプル(Ａ２８０＝０．１)でも十分な感度が得られる。
【００１１】
数ある蛍光パラメータのなかで、蛍光の極大波長は溶存酸素の影響を受けにくいため、その測定誤差が少なく、また、測定も簡便に行えることから、評価の指標として相応しい。
また、本発明における工程（ａ）および（ｂ）において蛍光を測定するときの励起光の波長域は、タンパク質の吸収極大を含む波長域またはその付近の波長域であるのが好ましく、さらに測定する蛍光の波長域は２８５〜４５０ｎｍであることが好ましい。吸収極大付近の波長を有する励起光を用いることにより、より大きい蛍光強度を得ることができるためである。また、測定する蛍光の波長域には、蛍光の極大波長が含まれているからである。
【００１２】
以上のような本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法は、被検タンパク質を含む溶液にあらかじめ定められた波長域の励起光を照射する投光手段、前記被検タンパク質が発するあらかじめ定められた波長域の蛍光を測定する受光測定手段、および様々な変性段階にある基準タンパク質の変性段階と蛍光の極大波長との関係を具備し、前記関係と、前記受光測定手段で測定した蛍光の極大波長とを指標として、前記被検タンパク質の特性を評価する演算手段を具備するタンパク質の特性評価装置によって実施することができる。
【００１３】
本発明の参考例のタンパク質の特性評価装置における励起光を照射する投光手段としては、従来のものを用いることができ、例えば、一般的には光源、分光フィルター、分散素子(プリズムまたは回折格子など)、およびミラーなどを適宜組み合せて得られる光学系などが考
えられる。
また、本発明の参考例における受光測定手段としても、従来のものを用いることができ、例えばミラー、分光フィルター、分散素子(プリズムもしくは回折格子など)、フォトダイオードまたは光電子増倍管などの受光センサを含む受光光学系と、増幅器などの電気回路要素を組み合せて構成すればよい。
【００１４】
さらに、本発明の参考例における演算手段としては、種々の計算回路を用いることが可能である。なかでも、本発明の参考例の工程を確実に行うため、演算手段は、被検対象であるタンパク質の蛍光の極大波長から、基準であるタンパク質の蛍光の極大波長を減算することのできる計算回路を有することが好ましい。なお、蛍光の極大波長は受光測定手段によって測定された蛍光スペクトルから簡便に求めることができる。
【００１５】
つぎに、本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法を用いて行う特異結合反応を利用した分析対象物の定量方法について説明する。
本発明の特異結合反応を利用した分析対象物の定量方法は、分析対象物と、前記分析対象物に特異的に結合する被検タンパク質とを反応させ、前記反応に由来して得られる信号の強度を所定時間経過後に少なくとも１回測定し、前記信号の強度に基づいて前記被検物質を定量する方法において、（Ａ）様々な変性段階にある基準タンパク質について、各変性段階の基準タンパク質を含む溶液にあらかじめ定められた波長域の励起光を照射することにより、前記各変性段階の基準タンパク質が発するあらかじめ定められた波長域の蛍光を測定し、基準タンパク質の変性段階と蛍光の極大波長との関係を求める工程、（Ｂ）所定の変性段階にある被検タンパク質を含む溶液にあらかじめ定められた波長域の励起光を照射することにより、前記被検タンパク質が発するあらかじめ定められた波長域の蛍光を測定する工程、（Ｃ）工程（Ａ）で求められた基準タンパク質の変性段階と蛍光の極大波長との関係および工程（Ｂ）において測定した蛍光の極大波長を指標として、前記所定の変性段階にある被検タンパク質の変性段階を判定し、判定結果に基づいて、前記分析対象物の濃度換算のために使用する検量線を決定する工程、（Ｄ）分析対象物と前記所定の変性段階にある被検タンパク質とを反応させ、前記反応に由来して得られる信号強度を測定する工程、ならびに（Ｅ）工程（Ｃ）で決定された検量線および工程（Ｄ）において測定した信号強度を指標として、前記分析対象物を定量する工程を有することを特徴とする。
【００１６】
前記特異結合反応に由来して得られる信号の強度の測定は、分析対象物と特異結合物質との特異結合反応が充分に進んで平衡状態に達した後に行うのが望ましい。定性または定量の目的に用いられる特異結合反応においては、一定量の特異結合物質を試薬として用いるため、特異結合反応が平衡状態に達したときの信号の強度は、分析対象物の絶対量に大きく影響を受けることになる。したがって、本発明を用いて、特異結合反応が平衡状態に達したときの信号強度から、試料中の分析対象物を精度良く定量することができる。
【００１７】
定量を目的とした分析方法では、分析対象物を用いて特異結合反応を行うとともに、その濃度を決定するために、コントロールとして標準物質を用いた補正を行うことが必要である。この場合、測定ごとに標準物質を用いて補正を行うと、操作が煩雑になってしまう。したがって、あらかじめ標準物質を用いて特異結合反応を行い、濃度換算のための検量線を作成しておくとよい。
しかし、分析対象物に特異的に結合するタンパク質は、保存中に変性を起こし、変性のために検量線作成時の標準物質に比べて反応特性が変化している恐れがあるため、保存中の変性の段階に応じて検量線を幾つか用意する必要がある。この変性の段階を評価する指標として、本発明では、タンパク質の蛍光特性を利用するのである。
【００１８】
本発明では、分析対象物に特異的に結合する基準タンパク質について、保存試験を行うなどして、さまざまな変性段階にあるタンパク質を用意し、そのそれぞれについて特異結合反応と蛍光測定を行い、変性の段階に応じた検量線と蛍光特性との関係をあらかじめ求めておく。
すなわち、本発明では、工程（Ｃ）において、工程（Ａ）において測定した分析対象物に特異的に結合する基準タンパク質の蛍光特性と、工程（Ｂ）において測定される分析対象物に特異的に結合する所定の変性段階にある被検タンパク質の蛍光特性とを比較することで、変性の段階を判断し、分析対象物の定量方法において濃度換算のために用いるべき検量線を決定する。
【００１９】
ただし、工程（Ｃ）においては、工程（Ａ）で求められた基準タンパク質の変性段階と蛍光の極大波長との関係および工程（Ｂ）において測定された蛍光の極大波長を比較することで、特異的に結合するタンパク質を用いる分析対象物の定量方法において濃度換算のために使用する検量線を決定する。後述する実施例においても示すが、タンパク質の蛍光の極大波長からタンパク質の変性段階を把握し、定量を目的とした分析方法に用いる検量線を求めることができる。
このように、本発明を用いると、保存中にタンパク質の変性が起こる恐れがある場合でも、試料中の分析対象物を、簡便かつ迅速に定性および定量測定することができる。
なお、上記工程（ａ）および工程（Ａ）は測定毎に行ってもよく、また、あらかじめ行って検量線を作成しておいてもよい。
【００２０】
本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法および／または本発明のタンパク質の特性評価装置を用いて、測定デバイス製造に使用するタンパク質溶液の特性評価を行うことができる。タンパク質を利用した測定デバイスを作製する場合、その製造工程において、材料として用いるタンパク質の品質確保、すなわち安定性の確認が重要な課題である。本発明では、基準となるタンパク質を変性させたときの蛍光特性をあらかじめ調べておき、材料として用いるタンパク質の蛍光特性と比較することで、変性を起こしているか否かをモニターすることができ、品質管理や処置条件の最適化に応用できる。
【００２１】
本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法および／または本発明のタンパク質の特性評価装置を用いて、測定デバイス試薬として使用するタンパク質溶液のロット管理や開発を行うこともできる。本発明の参考例では、測定デバイス試薬として使用する溶液中のタンパク質の反応特性と蛍光特性との関係をあらかじめ求めておき、測定デバイスを使用する際に、溶液中のタンパク質の蛍光特性を調べることで、その反応特性を求めることができ、タンパク質のロット管理を可能とする。
【００２２】
また、本発明の参考例においては、測定デバイス試薬として使用するタンパク質を変性させたときの蛍光特性をあらかじめ調べておき、測定デバイス試薬として使用するタンパク質の蛍光特性と比較することで、測定デバイス試薬の開発に応用することができる。例えば、測定デバイス試薬としての安定性を高める添加剤の評価の際に、蛍光特性を調べることでその安定性を評価できる。
このように、本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法および／またはタンパク質の特性評価装置を用い、溶液中のタンパク質の安定性を蛍光特性で評価することによって、測定デバイス製造時の簡便迅速な品質管理を可能とする。
【００２３】
本発明が適用される特異結合反応は、特に制限されず、たとえば、代表的な例として、抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ、受容体を用いたレセプターアッセイなどが挙げられる。
本発明における分析対象物は、それと特異的に結合する特異結合物質を有するものであればよく、例えば、抗体や抗原として機能する各種蛋白質、ポリペプチド、糖蛋白質、多糖類、複合糖脂質、核酸、エフェクター分子、レセプター分子、酵素、インヒビターなどが挙げられる。さらに具体的には、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９などの腫瘍マーカーや、β２−ミクログロブリン（β２ｍ）、フェリチンなどの各種蛋白質、糖蛋白質または複合糖脂質、エストラジオール（Ｅ２）、エストリオール（Ｅ３）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）などの各種ホルモン、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｃ抗原、ＨＢｃ抗体、ＨＣＶ抗体、ＨＩＶ抗体などの各種ウイルス関連抗原またはウイルス関連抗体、各種アレルゲンおよびこれに対応するＩｇＥ抗体、麻薬性薬物、医療性薬物およびこれらの代謝産物、ウイルスおよび腫瘍関連ポリヌクレオチド配列の核酸などが挙げられる。
【００２４】
本発明における試料は、分析対象物が含まれると予測される液体であればよく、例えば、尿、血清、血漿、全血、唾液、涙液、髄液、乳頭などからの分泌液などが挙げられる。前記試料は、粘液、体組織または細胞などの固形分、ゲル状またはゾル状物を、緩衝液、抽出液または溶解液などの液体に懸濁または溶解させたものであってもよい。
本発明において分析対象物に特異結合するタンパク質は、分析対象物に対して特異的に結合するペプチドであってもよく、例えば、抗体、抗原、糖蛋白質、エフェクター分子、レセプター分子、酵素、インヒビターなどが挙げられる。このなかでは、特異性が高いという点で、抗体であることが好ましい。
【００２５】
本発明における信号としては、分析対象物と、分析対象物に特異的に結合するタンパク質との特異結合反応によって生成し、検出可能なものであればよく、例えば、吸光光度計で計測可能な吸光、蛍光光度計で計測可能な蛍光、発光光度計で計測可能な発光、目視判定および色差計で計測可能な呈色などが挙げられる。
また、測定デバイスとは、材料および／または試薬としてタンパク質を使用するものであればよく、例えば、タンパク質を固定化した免疫クロマトグラフ、酵素や抗体など実験試薬として市販されているタンパク質、タンパク質で標識した化合物などが挙げられる。
【００２６】
つぎに、図面を参照しながら、本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法について説明する。
図１は、本発明の参考例のタンパク質の特性評価装置の構成の一例を示すブロック図である。本発明の参考例におけるタンパク質の特性評価方法を用いるタンパク質の特性評価装置は、光源１と励起波長選択器２によって構成される投光手段と、試料を設置する試料室３と、蛍光波長選択器４と光検出器５によって構成される受光測定手段と、演算装置６とを具備する。光源１からの放射光を、励起波長選択器２を通して分光した後、試料室３に設置したタンパク質を含む溶液に励起光を照射する。励起光の波長域は、上述のように、タンパク質の吸収極大またはその付近の波長（２８０ｎｍ付近）であることが好ましい。吸収極大付近の波長で励起することで、より大きい蛍光強度を得ることができる。
【００２７】
そして、タンパク質が発する蛍光を、蛍光波長選択器４を通した後、光検出器５で受光する。光検出器５において信号は増幅され、蛍光強度に比例する値が演算装置６に入力される。例えば、さまざまな変性段階にある基準タンパク質を用意し、そのそれぞれについてあらかじめ変性の各段階における蛍光特性を調べておき、演算装置６で、被検タンパク質の蛍光特性と基準タンパク質の蛍光特性とを比較することで、被検タンパク質の変性の段階を判断することができる。上述のように、蛍光測定の波長域には、蛍光極大波長が含まれているべきであり、さらに蛍光測定の波長域は２８５〜４５０ｎｍであることが好ましい。
【００２８】
さらに、本発明の参考例におけるタンパク質の特性評価方法を用いた、免疫比濁法（特に免疫比朧法）によって分析対象物を定量する方法を、図面を用いて説明する。図２は、ここで用いる特異結合反応測定装置の構成の一例を示すブロック図である。分析対象物がヒトアルブミンであり、これに特異的に結合するタンパク質が抗ヒトアルブミン抗体である場合について説明する。
図２に示す特異結合反応測定装置は、光源７、セル８および検出器９から構成される。まず、セル８にヒトアルブミン溶液と測定試薬である抗ヒトアルブミン抗体とを加えて、撹拌、混合し、抗原抗体反応を生じさせる。光源７からセル８に光を照射し、検出器９でセル８からの散乱光の測定を行う。検出器９で検出された散乱光の強度は、ヒトアルブミン溶液中のヒトアルブミン量を反映している。
【００２９】
ここでは、あらかじめ既知濃度のヒトアルブミン溶液と保存試験の結果得られたさまざまな変性段階にある抗ヒトアルブミン抗体とを用いて、抗原抗体反応を行い、検出器で検出した散乱光の強度をヒトアルブミン濃度に対してプロットした検量線を用意する。すなわち、抗ヒトアルブミン抗体の変性段階に応じて検量線を用意する。さらに、この検量線の作成に用いたさまざまな変性段階の抗ヒトアルブミン抗体の蛍光特性、例えば蛍光極大波長などの蛍光パラメータをあらかじめ調べておく。
光源１からの放射光を、励起波長選択器２を通して分光した後、抗ヒトアルブミン抗体溶液を設置した試料室３に例えば２８０ｎｍの励起光を照射する。抗ヒトアルブミン抗体溶液が発する蛍光を、蛍光波長選択器４を通した後、光検出器５で受光する。
【００３０】
この抗ヒトアルブミン抗体の変性の段階に応じた検量線と蛍光特性との対応関係を調べておくことで、実際に測定を行うときは、演算装置６で、光検出器５から得られた抗ヒトアルブミン抗体の蛍光極大波長と、検量線作成に用いた抗ヒトアルブミン抗体の蛍光極大波長とを比較し、ヒトアルブミンの濃度換算のために使用するべき検量線を決定することができる。
さらに、この検量線を用いて、特異結合反応後、検出器９で検出された散乱光の強度から、ヒトアルブミン溶液中のヒトアルブミン濃度を計算することができる。検出器９で散乱光を検出するときは、抗原抗体反応が十分進行し、平衡状態に達した後に測定を行うのが望ましい。
【００３１】
さらに、抗体を利用した特異結合反応測定装置に代表させて、その製造工程に本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法を利用した品質管理方法について説明する。
ここで用いる抗体試薬は、分析対象物と特異的に結合することで分析対象物の定量を可能とする。例えば、保存試験を行うなどしてさまざまな変性段階にある抗体を用意し、その変性段階ごとに、抗体の蛍光特性と、結合活性などの必要とする生理活性とをあらかじめ調べ、両者の関係を求めておく。例えば、抗体の変性段階と蛍光極大波長との関係を対応させておくと、材料または試薬として用いる抗体の蛍光極大波長を測定することで、抗体の品質管理が可能となる。
【００３２】
例えば、製造工程において抗体に対して行った処置による変性の有無および度合を、迅速簡便に調べることが可能である。また、製造工程のみならず、測定デバイス使用前に、抗体の蛍光極大波長を測定することで、保存による変性の有無および度合いを、迅速かつ簡便に調べることが可能である。さらに、特異結合反応の反応特性から得られた分析対象物の濃度換算のための検量線と、蛍光極大波長とを対応させておくと、測定試薬として用いる抗体の蛍光極大波長から、その抗体を用いる特異結合反応において濃度換算のために使用する検量線を決定することができる。つまり、測定デバイスを使用する際に、溶液中の抗体の蛍光特性を調べることで、その反応特性を求めることができ、抗体試薬の特性評価を行うことによりそのロット管理が可能となる。
【００３３】
さらに本発明は、抗体試薬の開発にも有用である。例えば、抗体試薬を安定化させるための添加剤の選定時に、添加剤と抗体試薬を混合したときの蛍光特性を調べることで、迅速・簡便に添加剤の影響を評価することが可能になる。
このように、本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法および／またはタンパク質の特性評価装置を用いることで、測定デバイス試薬として使用する溶液中のタンパク質の安定性や反応特性を蛍光特性で評価することによって、測定デバイス製造時の簡便迅速な品質管理や、測定デバイス試薬の開発を可能とする。蛍光測定は測定に要するタンパク質量が少量ですみ、また測定に使用したタンパクが回収、再利用可能なことから品質管理法としてふさわしい。
【００３４】
【実施例】
本発明の実施例について、図面を参照しながらより詳細に説明する。
《実施例１》
図３は、本発明のタンパク質の特性評価方法を用いて測定した抗体の蛍光スペクトルを示すグラフである。抗ヒトアルブミン抗体をリン酸緩衝液（ＰＢＳ−Ａｚ：８ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌのＫＣｌ、０．２ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、２．９ｇ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4−１２Ｈ2Ｏ、０．４ｇ／ｌのＮａＮ3）に混合、攪拌して得られる１ｍｇ／ｍｌ抗ヒトアルブミン抗体溶液をガラス製スクリュー瓶に１ｍｌずつ分注した。これらを、還流させた低温恒温水槽（東京理化器械（株）製のEYELADIGITAL UNI ACE UA‐100)中で、６５℃で２０分間、１時間、３時間、５時間、または７時間加熱した後、氷中に１０分間静置し、４℃で一晩保存して保存サンプルとした。
【００３５】
これらの保存サンプルを、それぞれ振盪器（ScientificIndustries社製のVORTEX‐GENIEII）にかけ（強度３、１０秒間）、低速遠心器（ＴＯＭＹ（株）製のＭＲＸ‐１５０）で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５分間）を行った後、上清を採取してガラス製スクリュー瓶に入れ、４℃で保存し、熱処理抗体溶液として使用した。また、４℃で保存した非加熱抗体溶液（濃度１ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ‐Ａｚ）を自然状態の正常な抗体溶液として使用した。
【００３６】
蛍光の測定には、２８０ｎｍの吸光度が０．０５になるようＰＢＳ−Ａｚで希釈した抗体を用いた。光源１からの放射光を、励起波長選択器２を通して分光した後、試料室３に設置した抗体溶液に２８０ｎｍの励起光を照射し、抗体が発する蛍光を、蛍光波長選択器４を通した後、光検出器５で受光した。熱処理抗体溶液を用いた場合は、基準タンパク質の変性段階に応じた蛍光を測定していると言える。ここで、蛍光測定の波長域は、２５０〜４５０ｎｍで行った。図３に示すように、４℃で保存した正常な抗体の蛍光極大波長は、３３３ｎｍであった。６５℃で熱処理した場合、処理時間が長いほど、正常抗体に比べて蛍光極大波長のシフト幅が大きくなっていた。
【００３７】
つぎに、熱処理した抗体の反応特性について、ＥＬＩＳＡ法を用いて調べた。抗原であるヒトアルブミン（和光純薬（株）製）をＰＢＳ（８ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌのＫＣｌ、０．２ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、２．９ｇ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4−１２Ｈ2Ｏ）で２．５μｇ／ｍｌになるよう希釈し、得られた溶液をマイクロプレート（米国Ｃｏｒｎｉｎｇ社製のE.I.A.・R.I.A. 8Well Strip ）の１穴あたり１００μｌずつ分注し、室温で一晩静置した。抗原が固相化されていないネガティブコントロールの穴には、何も入れずに室温で一晩静置した。
【００３８】
翌日、抗原タンパクで被覆されなかったかもしれない部分を、抗原とは無関係のタンパク質（１％Ｃａｓｅｉｎ−ＰＢＳ−Ａｚ）で埋めた。ブロッキングを行うために、穴の中の液を捨てたあと、１％Ｃａｓｅｉｎ−ＰＢＳ−Ａｚを各穴に２００μｌずつ加え、室温に３０分間静置した。ブロッキング後、固相の洗浄を米国ＢＩＯ‐ＲＡＤ社製のMICROPLATE WASHER MODEL 1550を使用し、ＰＢＳで３回行った。
【００３９】
熱処理抗体と４℃で保存した非加熱抗体を、１％Ｃａｓｅｉｎ−ＰＢＳ−Ａｚを用いて１０-6ｍｇ／ｍｌ、１０-5ｍｇ／ｍｌ、３×１０-5ｍｇ／ｍｌ、１０-4ｍｇ／ｍｌ、３×１０-4ｍｇ／ｍｌ、１０-3ｍｇ／ｍｌ、または１０-2ｍｇ／ｍｌに希釈し、抗原被覆の穴と抗原被覆が行われていないネガティブコントロール (ブロッキングタンパクのみを被覆した) の穴とに１００μｌずつ入れ、室温で３時間反応させた後、固相の洗浄を３回行った。バックグラウンド値を得るためのコントロールの穴には、抗体を入れずに、１％Ｃａｓｅｉｎ−ＰＢＳ−Ａｚのみ１００μｌずつ入れ、室温で３時間反応させた後、固相の洗浄を３回行った。
【００４０】
さらに、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ−ヤギ抗体（AffinityPurified Antibody Peroxidase Labeled Goat anti-RabbitIgG(H+L) Human Serum Absorbed (KirkegaardPerry Laboratories社製）)を１％Ｃａｓｅｉｎ−ＰＢＳで０．１（ｍｇ／ｍｌ）に希釈して、各穴に１００μｌずつ入れ、室温で３０分間反応させた後、固相の洗浄を３回行った。ついで、基質として、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（和光純薬（株）製）を使用し、酵素反応を行った。反応液（８０ｍｇのＯＰＤ、２０ｍｌのＰＣＢ（３５．８ｇ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4、２０ｍｌの無水クエン酸（２１ｇ／ｌ（ｐＨ５.０））、８μｌの３０％Ｈ2Ｏ2）を使用直前に調整し、各穴に１００μｌずつ入れ、室温で３分間反応させた。
【００４１】
マイクロプレートの穴に反応液を入れたときと同じ順序、同じ速さで反応停止液（４ＮＨ2ＳＯ4)を各穴に２５μｌ入れ、各穴の酵素反応の時間を一定にした。酵素反応停止後、自動吸光度測定器MICROPLATE READER MPR A4（ＴＯＹＯ ＳＯＤＡ社製）で、４９２ｎｍの吸光度を測定し、抗体の結合活性を求めた。図４に６５℃で熱処理した抗体について、図３から求めた蛍光極大波長とＥＬＩＳＡ法で求めた結合活性とをプロットしたグラフを示した。
【００４２】
６５℃で熱処理した場合、蛍光極大波長は、処理時間に依存して長波長側にシフトしていた。一方、結合活性は処理時間に依存して小さくなっていた。抗体の蛍光極大波長が長波長側にシフトするにつれて、結合活性も小さくなる傾向にある。抗体の蛍光極大波長のシフトは、熱処理による抗体の構造変化、つまり、抗体の変性の度合を反映している。したがって、抗体の変性の段階に応じて蛍光極大波長のシフト幅が大きくなっているのが分かった。以上のように図４を利用して、工程（ｃ）を実施することができた。すなわち、蛍光特性から、タンパク質の特性評価を行うことができた。
【００４３】
《実施例２》
本実施例においては、免疫比朧法を用いてヒトアルブミン量の測定を行った。測定装置としては、図２に示す光源７、セル８および検出器９から構成されるものを用いた。抗体として、４５℃で保存試験を行った（保存日数０日、５０日、１００日、１５０日、２００日）抗ヒトアルブミン抗体を、抗原としてはヒトアルブミン（和光純薬（株）製）を用いた。４重量％ポリエチレングリコール６０００を含むｐＨ７．４の０．０５Ｍモプス溶液で希釈したヒトアルブミン溶液（抗原濃度：０ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌまたは２ｍｇ／ｄｌ）１８７μｌを入れたセル８に、抗ヒトアルブミン抗体溶液（抗体濃度：３ｍｇ／ｍｌ）７μｌを添加し、セル８内で撹拌混合し、抗原抗体反応を生じさせた（分析対象物とこれに特異的に結合するタンパク質との反応）。
【００４４】
そして、光源７からセル８に光を照射し、検出器９でセル８からの散乱光の測定を行った。検出器９で検出された散乱光の強度は、ヒトアルブミン溶液中のヒトアルブミン量を反映していたため、その信号強度から分析対象物の定性および定量が可能であった。
散乱光の測定は、抗体溶液を加える１０秒前から開始し、０．５秒間隔で３００秒間継続した。測定終了後、得られた測定値の２００〜３００秒の間に見られる定常領域の平均値を求め、各ヒトアルブミン濃度における測定値とした。図５に、縦軸に光散乱強度を、横軸に反応系に加えたヒトアルブミン溶液濃度をプロットしたときの測定結果を示し検量線を作成した。
【００４５】
光散乱強度が高いほど、抗原抗体反応による複合体が多く形成されたことがわかった。また、図５から、保存日数により、抗体の反応特性が変化していることがわかった。このことから、定量を目的とした特異結合反応では、抗体の変性段階に応じた検量線が必要であることがわかった。さらに、各抗ヒトアルブミン抗体について蛍光極大波長を測定した結果を表１に示した。なお、０日保存後の抗体を用いた場合が工程（ａ’）であり、５０〜２００日保存後の抗体を用いた場合が工程（ｂ’）であった。
【００４６】
【表１】
【００４７】
表１から、保存日数により、抗体の蛍光特性が変化しているのがわかる。
以上より、本発明にしたがって、抗体の蛍光極大波長から抗体の変性段階を把握し、定量を目的とした特異結合反応に必要な検量線を求めることができることがわかる。
【００４８】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、サンプルの損失が少ない分析対象物を定量する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の一実施の形態において用いたタンパク質の特性評価装置の構成を示すブロック図
【図２】 本発明の一実施の形態において用いた特異結合反応測定装置の構成を示すブロック図
【図３】 同タンパク質の特性評価装置を用いて測定した抗体の蛍光スペクトルを示すグラフ
【図４】 抗体の蛍光極大波長と結合活性との関係を示したグラフ
【図５】 本発明の一実施の形態において測定した光散乱強度とヒトアルブミン溶液濃度との関係を示したグラフ
【符号の説明】
１ 光源
２ 励起波長選択器
３ 試料室
４ 蛍光波長選択器
５ 光検出器
６ 演算装置
７ 光源
８ セル
９ 検出器
【発明の属する技術分野】
本発明は、分析対象物を定量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質は、特異的結合性および高度な生理機能を有するため、ほとんどの生理現象において主役を演じている。このタンパク質を制御できれば生命現象への理解が深まり、より向上した医療基盤の確立が実現できる。
タンパク質は、本来、生理的条件(例えば適度なｐＨ、温度および塩濃度など)下において安定に存在するものである。このような生理的条件下では、タンパク質は折りたたまれ、固有の立体構造を形成することで、特異的な生物機能を発現する。
【０００３】
しかし、高温などの極端な条件では、天然状態で形成されている非共有結合の多くが壊れて固有の立体構造が破壊され、タンパク質の物理的、化学的および生物的な性質が変化しまう。これをタンパク質の変性という。タンパク質の構造変化を検知する方法としては、例えば二次構造の含有率を測るべく、ＣＤスペクトルを測定する方法、タンパク質中で芳香族側鎖を持つ残基が示す２８０ｎｍ付近の紫外吸収または蛍光を測定する方法、さらに、プロトンとアミドプロトンとの間のＪHNα結合定数がもたらす構造情報などを解析すべくＮＭＲスペクトルを測定する方法などの分光学的方法がある。
【０００４】
タンパク質の変性を迅速かつ簡便に評価する方法は、タンパク質を取り扱う際、非常に重要である。こういった方法の目的は、タンパク質の安定化の機構を明らかにすることであり、タンパク質の安定性を評価したり、タンパク質の安定化方法を検討したりすることにある。
特に、定量を目的とした特異結合分析方法では、分析対象物と前記分析対象物に特異的に結合する特異結合物質とを用いて特異結合反応を行うとともに、その濃度を決定するためには、コントロールとして標準物質を用いた補正が必要である。この場合、測定ごとに標準物質を用いて補正を行うと、操作が煩雑になってしまう。このため、あらかじめ標準物質を用いて特異結合反応を行い、濃度換算のための検量線を作成しておく方法が広く用いられている。
なお、特開平９−１７３３０１号公報は、皮膚、毛髪または爪に紫外光を照射し、３３０ｎｍ付近に蛍光極大を有するケラチン中の芳香族アミノ酸の蛍光バンドの波形や極大波長を測定し、基準値と対比して皮膚、毛髪または爪の損傷・劣化の程度を評価する方法を開示している。
また、特開平９−１２４６９９号公報は、ケラチン含有材料を炭素数３のアルコール含有溶液に浸漬して、ケラチン含有材料に含有されるタンパク質を抽出し、タンパク質含有溶液を得る方法を開示している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、この特異結合物質がタンパク質である場合、特異結合物質そのものが保存中に変性し、その反応特性も、特異結合物質の標準物質を用いて検量線を作成する時点に比べて変化するため、実際の濃度換算時に検量線は使用できなくなる恐れがある。また、測定ごとに標準物質を用いて補正を行う場合においても同様のことが言え、標準物質そのものが保存中に変性し、濃度換算のための標準物質として使用できなくなる恐れがある。したがって、製造直後から使用時にわたる長期保存状態においてタンパク質をほとんど変性させないタンパク質安定化方法、およびタンパク質安定性評価方法を開発することが強く望まれている。ところが、このような方法はほとんど知られていないのが現状である。
【０００６】
また特異結合反応のみならず、タンパク質を利用した測定デバイスを作製する場合には、材料および測定デバイス試薬として用いるタンパク質の品質をいかに管理するかが問題となる。例えば、前記測定デバイスを製造する工程においては、材料として用いるタンパク質が変性していないかどうかを常にモニターしておく必要があり、さらに、測定デバイス試薬として用いるタンパク質のロット管理および安定化の検討も必要である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記問題点を解決すべく、本発明は、分析対象物と、前記分析対象物に特異的に結合する被検タンパク質とを反応させ、前記反応に由来して得られる信号の強度を所定時間経過後に少なくとも１回測定し、前記信号の強度に基づいて前記分析対象物を定量する方法であって、（Ａ）様々な変性段階にある基準タンパク質について、各変性段階の基準タンパク質を含む溶液にあらかじめ定められた波長域の励起光を照射することにより、前記各変性段階の基準タンパク質が発するあらかじめ定められた波長域の蛍光を測定し、基準タンパク質の変性段階と蛍光の極大波長との関係を求める工程、（Ｂ）所定の変性段階にある被検タンパク質を含む溶液にあらかじめ定められた波長域の励起光を照射することにより、前記所定の変性段階にある被検タンパク質が発するあらかじめ定められた波長域の蛍光を測定する工程、（Ｃ）工程（Ａ）で求められた前記基準タンパク質の変性段階と蛍光の極大波長との関係および工程（Ｂ）において測定した蛍光の極大波長を指標として、前記所定の変性段階にある被検タンパク質の変性段階を判定し、判定結果に基づいて、前記分析対象物である被検タンパク質を用いる前記特異結合分析方法において濃度換算のために使用する検量線を決定する工程、（Ｄ）分析対象物と前記所定の変性段階にある被検タンパク質とを反応させ、前記反応に由来して得られる信号強度を測定する工程、ならびに（Ｅ）工程（Ｃ）で決定された検量線および工程（Ｄ）において測定した信号強度を指標として、前記分析対象物を定量する工程を有することを特徴とする分析対象物の定量方法を提供する。
【０００８】
工程（Ａ）および（Ｂ）において、前記励起光の波長域が、それぞれ前記基準タンパク質および被検タンパク質の吸収極大を含む波長域であり、測定される蛍光の波長域が２８５〜４５０ｎｍであるのが有効である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法について説明する。
本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法は、（ａ）様々な変性段階にある基準タンパク質について、各変性段階の基準タンパク質を含む溶液にあらかじめ定められた波長域の励起光を照射することにより、前記各変性段階の基準タンパク質が発するあらかじめ定められた波長域の蛍光を測定し、前記基準タンパク質の変性段階と蛍光の極大波長との関係を求める工程、（ｂ）被検タンパク質を含む溶液にあらかじめ定められた波長域の励起光を照射することにより、前記被検タンパク質が発するあらかじめ定められた波長域の蛍光を測定する工程、ならびに（ｃ）工程（ａ）で求められた基準タンパク質の変性段階と蛍光の極大波長との関係および工程（ｂ）において測定した蛍光の極大波長を指標として、前記被検タンパク質の特性を評価する工程を有することを特徴とする。
【００１０】
タンパク質の蛍光は、主として芳香族アミノ酸であるトリプトファンまたはチロシンなどのクロモホアに由来して発現するものである。この蛍光はこれらクロモホアの周りの影響を非常に敏感に反映する。外的環境により、消光の程度が変化してスペクトル強度が変動し、また、蛍光スペクトルは、より疎水的環境においては短波長側にシフトし、親水的環境においては長波長側にシフトする。蛍光スペクトルは感度が高く、非常に低濃度のサンプル(Ａ２８０＝０．１)でも十分な感度が得られる。
【００１１】
数ある蛍光パラメータのなかで、蛍光の極大波長は溶存酸素の影響を受けにくいため、その測定誤差が少なく、また、測定も簡便に行えることから、評価の指標として相応しい。
また、本発明における工程（ａ）および（ｂ）において蛍光を測定するときの励起光の波長域は、タンパク質の吸収極大を含む波長域またはその付近の波長域であるのが好ましく、さらに測定する蛍光の波長域は２８５〜４５０ｎｍであることが好ましい。吸収極大付近の波長を有する励起光を用いることにより、より大きい蛍光強度を得ることができるためである。また、測定する蛍光の波長域には、蛍光の極大波長が含まれているからである。
【００１２】
以上のような本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法は、被検タンパク質を含む溶液にあらかじめ定められた波長域の励起光を照射する投光手段、前記被検タンパク質が発するあらかじめ定められた波長域の蛍光を測定する受光測定手段、および様々な変性段階にある基準タンパク質の変性段階と蛍光の極大波長との関係を具備し、前記関係と、前記受光測定手段で測定した蛍光の極大波長とを指標として、前記被検タンパク質の特性を評価する演算手段を具備するタンパク質の特性評価装置によって実施することができる。
【００１３】
本発明の参考例のタンパク質の特性評価装置における励起光を照射する投光手段としては、従来のものを用いることができ、例えば、一般的には光源、分光フィルター、分散素子(プリズムまたは回折格子など)、およびミラーなどを適宜組み合せて得られる光学系などが考
えられる。
また、本発明の参考例における受光測定手段としても、従来のものを用いることができ、例えばミラー、分光フィルター、分散素子(プリズムもしくは回折格子など)、フォトダイオードまたは光電子増倍管などの受光センサを含む受光光学系と、増幅器などの電気回路要素を組み合せて構成すればよい。
【００１４】
さらに、本発明の参考例における演算手段としては、種々の計算回路を用いることが可能である。なかでも、本発明の参考例の工程を確実に行うため、演算手段は、被検対象であるタンパク質の蛍光の極大波長から、基準であるタンパク質の蛍光の極大波長を減算することのできる計算回路を有することが好ましい。なお、蛍光の極大波長は受光測定手段によって測定された蛍光スペクトルから簡便に求めることができる。
【００１５】
つぎに、本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法を用いて行う特異結合反応を利用した分析対象物の定量方法について説明する。
本発明の特異結合反応を利用した分析対象物の定量方法は、分析対象物と、前記分析対象物に特異的に結合する被検タンパク質とを反応させ、前記反応に由来して得られる信号の強度を所定時間経過後に少なくとも１回測定し、前記信号の強度に基づいて前記被検物質を定量する方法において、（Ａ）様々な変性段階にある基準タンパク質について、各変性段階の基準タンパク質を含む溶液にあらかじめ定められた波長域の励起光を照射することにより、前記各変性段階の基準タンパク質が発するあらかじめ定められた波長域の蛍光を測定し、基準タンパク質の変性段階と蛍光の極大波長との関係を求める工程、（Ｂ）所定の変性段階にある被検タンパク質を含む溶液にあらかじめ定められた波長域の励起光を照射することにより、前記被検タンパク質が発するあらかじめ定められた波長域の蛍光を測定する工程、（Ｃ）工程（Ａ）で求められた基準タンパク質の変性段階と蛍光の極大波長との関係および工程（Ｂ）において測定した蛍光の極大波長を指標として、前記所定の変性段階にある被検タンパク質の変性段階を判定し、判定結果に基づいて、前記分析対象物の濃度換算のために使用する検量線を決定する工程、（Ｄ）分析対象物と前記所定の変性段階にある被検タンパク質とを反応させ、前記反応に由来して得られる信号強度を測定する工程、ならびに（Ｅ）工程（Ｃ）で決定された検量線および工程（Ｄ）において測定した信号強度を指標として、前記分析対象物を定量する工程を有することを特徴とする。
【００１６】
前記特異結合反応に由来して得られる信号の強度の測定は、分析対象物と特異結合物質との特異結合反応が充分に進んで平衡状態に達した後に行うのが望ましい。定性または定量の目的に用いられる特異結合反応においては、一定量の特異結合物質を試薬として用いるため、特異結合反応が平衡状態に達したときの信号の強度は、分析対象物の絶対量に大きく影響を受けることになる。したがって、本発明を用いて、特異結合反応が平衡状態に達したときの信号強度から、試料中の分析対象物を精度良く定量することができる。
【００１７】
定量を目的とした分析方法では、分析対象物を用いて特異結合反応を行うとともに、その濃度を決定するために、コントロールとして標準物質を用いた補正を行うことが必要である。この場合、測定ごとに標準物質を用いて補正を行うと、操作が煩雑になってしまう。したがって、あらかじめ標準物質を用いて特異結合反応を行い、濃度換算のための検量線を作成しておくとよい。
しかし、分析対象物に特異的に結合するタンパク質は、保存中に変性を起こし、変性のために検量線作成時の標準物質に比べて反応特性が変化している恐れがあるため、保存中の変性の段階に応じて検量線を幾つか用意する必要がある。この変性の段階を評価する指標として、本発明では、タンパク質の蛍光特性を利用するのである。
【００１８】
本発明では、分析対象物に特異的に結合する基準タンパク質について、保存試験を行うなどして、さまざまな変性段階にあるタンパク質を用意し、そのそれぞれについて特異結合反応と蛍光測定を行い、変性の段階に応じた検量線と蛍光特性との関係をあらかじめ求めておく。
すなわち、本発明では、工程（Ｃ）において、工程（Ａ）において測定した分析対象物に特異的に結合する基準タンパク質の蛍光特性と、工程（Ｂ）において測定される分析対象物に特異的に結合する所定の変性段階にある被検タンパク質の蛍光特性とを比較することで、変性の段階を判断し、分析対象物の定量方法において濃度換算のために用いるべき検量線を決定する。
【００１９】
ただし、工程（Ｃ）においては、工程（Ａ）で求められた基準タンパク質の変性段階と蛍光の極大波長との関係および工程（Ｂ）において測定された蛍光の極大波長を比較することで、特異的に結合するタンパク質を用いる分析対象物の定量方法において濃度換算のために使用する検量線を決定する。後述する実施例においても示すが、タンパク質の蛍光の極大波長からタンパク質の変性段階を把握し、定量を目的とした分析方法に用いる検量線を求めることができる。
このように、本発明を用いると、保存中にタンパク質の変性が起こる恐れがある場合でも、試料中の分析対象物を、簡便かつ迅速に定性および定量測定することができる。
なお、上記工程（ａ）および工程（Ａ）は測定毎に行ってもよく、また、あらかじめ行って検量線を作成しておいてもよい。
【００２０】
本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法および／または本発明のタンパク質の特性評価装置を用いて、測定デバイス製造に使用するタンパク質溶液の特性評価を行うことができる。タンパク質を利用した測定デバイスを作製する場合、その製造工程において、材料として用いるタンパク質の品質確保、すなわち安定性の確認が重要な課題である。本発明では、基準となるタンパク質を変性させたときの蛍光特性をあらかじめ調べておき、材料として用いるタンパク質の蛍光特性と比較することで、変性を起こしているか否かをモニターすることができ、品質管理や処置条件の最適化に応用できる。
【００２１】
本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法および／または本発明のタンパク質の特性評価装置を用いて、測定デバイス試薬として使用するタンパク質溶液のロット管理や開発を行うこともできる。本発明の参考例では、測定デバイス試薬として使用する溶液中のタンパク質の反応特性と蛍光特性との関係をあらかじめ求めておき、測定デバイスを使用する際に、溶液中のタンパク質の蛍光特性を調べることで、その反応特性を求めることができ、タンパク質のロット管理を可能とする。
【００２２】
また、本発明の参考例においては、測定デバイス試薬として使用するタンパク質を変性させたときの蛍光特性をあらかじめ調べておき、測定デバイス試薬として使用するタンパク質の蛍光特性と比較することで、測定デバイス試薬の開発に応用することができる。例えば、測定デバイス試薬としての安定性を高める添加剤の評価の際に、蛍光特性を調べることでその安定性を評価できる。
このように、本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法および／またはタンパク質の特性評価装置を用い、溶液中のタンパク質の安定性を蛍光特性で評価することによって、測定デバイス製造時の簡便迅速な品質管理を可能とする。
【００２３】
本発明が適用される特異結合反応は、特に制限されず、たとえば、代表的な例として、抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ、受容体を用いたレセプターアッセイなどが挙げられる。
本発明における分析対象物は、それと特異的に結合する特異結合物質を有するものであればよく、例えば、抗体や抗原として機能する各種蛋白質、ポリペプチド、糖蛋白質、多糖類、複合糖脂質、核酸、エフェクター分子、レセプター分子、酵素、インヒビターなどが挙げられる。さらに具体的には、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９などの腫瘍マーカーや、β２−ミクログロブリン（β２ｍ）、フェリチンなどの各種蛋白質、糖蛋白質または複合糖脂質、エストラジオール（Ｅ２）、エストリオール（Ｅ３）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）などの各種ホルモン、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｃ抗原、ＨＢｃ抗体、ＨＣＶ抗体、ＨＩＶ抗体などの各種ウイルス関連抗原またはウイルス関連抗体、各種アレルゲンおよびこれに対応するＩｇＥ抗体、麻薬性薬物、医療性薬物およびこれらの代謝産物、ウイルスおよび腫瘍関連ポリヌクレオチド配列の核酸などが挙げられる。
【００２４】
本発明における試料は、分析対象物が含まれると予測される液体であればよく、例えば、尿、血清、血漿、全血、唾液、涙液、髄液、乳頭などからの分泌液などが挙げられる。前記試料は、粘液、体組織または細胞などの固形分、ゲル状またはゾル状物を、緩衝液、抽出液または溶解液などの液体に懸濁または溶解させたものであってもよい。
本発明において分析対象物に特異結合するタンパク質は、分析対象物に対して特異的に結合するペプチドであってもよく、例えば、抗体、抗原、糖蛋白質、エフェクター分子、レセプター分子、酵素、インヒビターなどが挙げられる。このなかでは、特異性が高いという点で、抗体であることが好ましい。
【００２５】
本発明における信号としては、分析対象物と、分析対象物に特異的に結合するタンパク質との特異結合反応によって生成し、検出可能なものであればよく、例えば、吸光光度計で計測可能な吸光、蛍光光度計で計測可能な蛍光、発光光度計で計測可能な発光、目視判定および色差計で計測可能な呈色などが挙げられる。
また、測定デバイスとは、材料および／または試薬としてタンパク質を使用するものであればよく、例えば、タンパク質を固定化した免疫クロマトグラフ、酵素や抗体など実験試薬として市販されているタンパク質、タンパク質で標識した化合物などが挙げられる。
【００２６】
つぎに、図面を参照しながら、本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法について説明する。
図１は、本発明の参考例のタンパク質の特性評価装置の構成の一例を示すブロック図である。本発明の参考例におけるタンパク質の特性評価方法を用いるタンパク質の特性評価装置は、光源１と励起波長選択器２によって構成される投光手段と、試料を設置する試料室３と、蛍光波長選択器４と光検出器５によって構成される受光測定手段と、演算装置６とを具備する。光源１からの放射光を、励起波長選択器２を通して分光した後、試料室３に設置したタンパク質を含む溶液に励起光を照射する。励起光の波長域は、上述のように、タンパク質の吸収極大またはその付近の波長（２８０ｎｍ付近）であることが好ましい。吸収極大付近の波長で励起することで、より大きい蛍光強度を得ることができる。
【００２７】
そして、タンパク質が発する蛍光を、蛍光波長選択器４を通した後、光検出器５で受光する。光検出器５において信号は増幅され、蛍光強度に比例する値が演算装置６に入力される。例えば、さまざまな変性段階にある基準タンパク質を用意し、そのそれぞれについてあらかじめ変性の各段階における蛍光特性を調べておき、演算装置６で、被検タンパク質の蛍光特性と基準タンパク質の蛍光特性とを比較することで、被検タンパク質の変性の段階を判断することができる。上述のように、蛍光測定の波長域には、蛍光極大波長が含まれているべきであり、さらに蛍光測定の波長域は２８５〜４５０ｎｍであることが好ましい。
【００２８】
さらに、本発明の参考例におけるタンパク質の特性評価方法を用いた、免疫比濁法（特に免疫比朧法）によって分析対象物を定量する方法を、図面を用いて説明する。図２は、ここで用いる特異結合反応測定装置の構成の一例を示すブロック図である。分析対象物がヒトアルブミンであり、これに特異的に結合するタンパク質が抗ヒトアルブミン抗体である場合について説明する。
図２に示す特異結合反応測定装置は、光源７、セル８および検出器９から構成される。まず、セル８にヒトアルブミン溶液と測定試薬である抗ヒトアルブミン抗体とを加えて、撹拌、混合し、抗原抗体反応を生じさせる。光源７からセル８に光を照射し、検出器９でセル８からの散乱光の測定を行う。検出器９で検出された散乱光の強度は、ヒトアルブミン溶液中のヒトアルブミン量を反映している。
【００２９】
ここでは、あらかじめ既知濃度のヒトアルブミン溶液と保存試験の結果得られたさまざまな変性段階にある抗ヒトアルブミン抗体とを用いて、抗原抗体反応を行い、検出器で検出した散乱光の強度をヒトアルブミン濃度に対してプロットした検量線を用意する。すなわち、抗ヒトアルブミン抗体の変性段階に応じて検量線を用意する。さらに、この検量線の作成に用いたさまざまな変性段階の抗ヒトアルブミン抗体の蛍光特性、例えば蛍光極大波長などの蛍光パラメータをあらかじめ調べておく。
光源１からの放射光を、励起波長選択器２を通して分光した後、抗ヒトアルブミン抗体溶液を設置した試料室３に例えば２８０ｎｍの励起光を照射する。抗ヒトアルブミン抗体溶液が発する蛍光を、蛍光波長選択器４を通した後、光検出器５で受光する。
【００３０】
この抗ヒトアルブミン抗体の変性の段階に応じた検量線と蛍光特性との対応関係を調べておくことで、実際に測定を行うときは、演算装置６で、光検出器５から得られた抗ヒトアルブミン抗体の蛍光極大波長と、検量線作成に用いた抗ヒトアルブミン抗体の蛍光極大波長とを比較し、ヒトアルブミンの濃度換算のために使用するべき検量線を決定することができる。
さらに、この検量線を用いて、特異結合反応後、検出器９で検出された散乱光の強度から、ヒトアルブミン溶液中のヒトアルブミン濃度を計算することができる。検出器９で散乱光を検出するときは、抗原抗体反応が十分進行し、平衡状態に達した後に測定を行うのが望ましい。
【００３１】
さらに、抗体を利用した特異結合反応測定装置に代表させて、その製造工程に本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法を利用した品質管理方法について説明する。
ここで用いる抗体試薬は、分析対象物と特異的に結合することで分析対象物の定量を可能とする。例えば、保存試験を行うなどしてさまざまな変性段階にある抗体を用意し、その変性段階ごとに、抗体の蛍光特性と、結合活性などの必要とする生理活性とをあらかじめ調べ、両者の関係を求めておく。例えば、抗体の変性段階と蛍光極大波長との関係を対応させておくと、材料または試薬として用いる抗体の蛍光極大波長を測定することで、抗体の品質管理が可能となる。
【００３２】
例えば、製造工程において抗体に対して行った処置による変性の有無および度合を、迅速簡便に調べることが可能である。また、製造工程のみならず、測定デバイス使用前に、抗体の蛍光極大波長を測定することで、保存による変性の有無および度合いを、迅速かつ簡便に調べることが可能である。さらに、特異結合反応の反応特性から得られた分析対象物の濃度換算のための検量線と、蛍光極大波長とを対応させておくと、測定試薬として用いる抗体の蛍光極大波長から、その抗体を用いる特異結合反応において濃度換算のために使用する検量線を決定することができる。つまり、測定デバイスを使用する際に、溶液中の抗体の蛍光特性を調べることで、その反応特性を求めることができ、抗体試薬の特性評価を行うことによりそのロット管理が可能となる。
【００３３】
さらに本発明は、抗体試薬の開発にも有用である。例えば、抗体試薬を安定化させるための添加剤の選定時に、添加剤と抗体試薬を混合したときの蛍光特性を調べることで、迅速・簡便に添加剤の影響を評価することが可能になる。
このように、本発明の参考例のタンパク質の特性評価方法および／またはタンパク質の特性評価装置を用いることで、測定デバイス試薬として使用する溶液中のタンパク質の安定性や反応特性を蛍光特性で評価することによって、測定デバイス製造時の簡便迅速な品質管理や、測定デバイス試薬の開発を可能とする。蛍光測定は測定に要するタンパク質量が少量ですみ、また測定に使用したタンパクが回収、再利用可能なことから品質管理法としてふさわしい。
【００３４】
【実施例】
本発明の実施例について、図面を参照しながらより詳細に説明する。
《実施例１》
図３は、本発明のタンパク質の特性評価方法を用いて測定した抗体の蛍光スペクトルを示すグラフである。抗ヒトアルブミン抗体をリン酸緩衝液（ＰＢＳ−Ａｚ：８ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌのＫＣｌ、０．２ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、２．９ｇ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4−１２Ｈ2Ｏ、０．４ｇ／ｌのＮａＮ3）に混合、攪拌して得られる１ｍｇ／ｍｌ抗ヒトアルブミン抗体溶液をガラス製スクリュー瓶に１ｍｌずつ分注した。これらを、還流させた低温恒温水槽（東京理化器械（株）製のEYELADIGITAL UNI ACE UA‐100)中で、６５℃で２０分間、１時間、３時間、５時間、または７時間加熱した後、氷中に１０分間静置し、４℃で一晩保存して保存サンプルとした。
【００３５】
これらの保存サンプルを、それぞれ振盪器（ScientificIndustries社製のVORTEX‐GENIEII）にかけ（強度３、１０秒間）、低速遠心器（ＴＯＭＹ（株）製のＭＲＸ‐１５０）で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５分間）を行った後、上清を採取してガラス製スクリュー瓶に入れ、４℃で保存し、熱処理抗体溶液として使用した。また、４℃で保存した非加熱抗体溶液（濃度１ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ‐Ａｚ）を自然状態の正常な抗体溶液として使用した。
【００３６】
蛍光の測定には、２８０ｎｍの吸光度が０．０５になるようＰＢＳ−Ａｚで希釈した抗体を用いた。光源１からの放射光を、励起波長選択器２を通して分光した後、試料室３に設置した抗体溶液に２８０ｎｍの励起光を照射し、抗体が発する蛍光を、蛍光波長選択器４を通した後、光検出器５で受光した。熱処理抗体溶液を用いた場合は、基準タンパク質の変性段階に応じた蛍光を測定していると言える。ここで、蛍光測定の波長域は、２５０〜４５０ｎｍで行った。図３に示すように、４℃で保存した正常な抗体の蛍光極大波長は、３３３ｎｍであった。６５℃で熱処理した場合、処理時間が長いほど、正常抗体に比べて蛍光極大波長のシフト幅が大きくなっていた。
【００３７】
つぎに、熱処理した抗体の反応特性について、ＥＬＩＳＡ法を用いて調べた。抗原であるヒトアルブミン（和光純薬（株）製）をＰＢＳ（８ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌのＫＣｌ、０．２ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、２．９ｇ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4−１２Ｈ2Ｏ）で２．５μｇ／ｍｌになるよう希釈し、得られた溶液をマイクロプレート（米国Ｃｏｒｎｉｎｇ社製のE.I.A.・R.I.A. 8Well Strip ）の１穴あたり１００μｌずつ分注し、室温で一晩静置した。抗原が固相化されていないネガティブコントロールの穴には、何も入れずに室温で一晩静置した。
【００３８】
翌日、抗原タンパクで被覆されなかったかもしれない部分を、抗原とは無関係のタンパク質（１％Ｃａｓｅｉｎ−ＰＢＳ−Ａｚ）で埋めた。ブロッキングを行うために、穴の中の液を捨てたあと、１％Ｃａｓｅｉｎ−ＰＢＳ−Ａｚを各穴に２００μｌずつ加え、室温に３０分間静置した。ブロッキング後、固相の洗浄を米国ＢＩＯ‐ＲＡＤ社製のMICROPLATE WASHER MODEL 1550を使用し、ＰＢＳで３回行った。
【００３９】
熱処理抗体と４℃で保存した非加熱抗体を、１％Ｃａｓｅｉｎ−ＰＢＳ−Ａｚを用いて１０-6ｍｇ／ｍｌ、１０-5ｍｇ／ｍｌ、３×１０-5ｍｇ／ｍｌ、１０-4ｍｇ／ｍｌ、３×１０-4ｍｇ／ｍｌ、１０-3ｍｇ／ｍｌ、または１０-2ｍｇ／ｍｌに希釈し、抗原被覆の穴と抗原被覆が行われていないネガティブコントロール (ブロッキングタンパクのみを被覆した) の穴とに１００μｌずつ入れ、室温で３時間反応させた後、固相の洗浄を３回行った。バックグラウンド値を得るためのコントロールの穴には、抗体を入れずに、１％Ｃａｓｅｉｎ−ＰＢＳ−Ａｚのみ１００μｌずつ入れ、室温で３時間反応させた後、固相の洗浄を３回行った。
【００４０】
さらに、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ−ヤギ抗体（AffinityPurified Antibody Peroxidase Labeled Goat anti-RabbitIgG(H+L) Human Serum Absorbed (KirkegaardPerry Laboratories社製）)を１％Ｃａｓｅｉｎ−ＰＢＳで０．１（ｍｇ／ｍｌ）に希釈して、各穴に１００μｌずつ入れ、室温で３０分間反応させた後、固相の洗浄を３回行った。ついで、基質として、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（和光純薬（株）製）を使用し、酵素反応を行った。反応液（８０ｍｇのＯＰＤ、２０ｍｌのＰＣＢ（３５．８ｇ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4、２０ｍｌの無水クエン酸（２１ｇ／ｌ（ｐＨ５.０））、８μｌの３０％Ｈ2Ｏ2）を使用直前に調整し、各穴に１００μｌずつ入れ、室温で３分間反応させた。
【００４１】
マイクロプレートの穴に反応液を入れたときと同じ順序、同じ速さで反応停止液（４ＮＨ2ＳＯ4)を各穴に２５μｌ入れ、各穴の酵素反応の時間を一定にした。酵素反応停止後、自動吸光度測定器MICROPLATE READER MPR A4（ＴＯＹＯ ＳＯＤＡ社製）で、４９２ｎｍの吸光度を測定し、抗体の結合活性を求めた。図４に６５℃で熱処理した抗体について、図３から求めた蛍光極大波長とＥＬＩＳＡ法で求めた結合活性とをプロットしたグラフを示した。
【００４２】
６５℃で熱処理した場合、蛍光極大波長は、処理時間に依存して長波長側にシフトしていた。一方、結合活性は処理時間に依存して小さくなっていた。抗体の蛍光極大波長が長波長側にシフトするにつれて、結合活性も小さくなる傾向にある。抗体の蛍光極大波長のシフトは、熱処理による抗体の構造変化、つまり、抗体の変性の度合を反映している。したがって、抗体の変性の段階に応じて蛍光極大波長のシフト幅が大きくなっているのが分かった。以上のように図４を利用して、工程（ｃ）を実施することができた。すなわち、蛍光特性から、タンパク質の特性評価を行うことができた。
【００４３】
《実施例２》
本実施例においては、免疫比朧法を用いてヒトアルブミン量の測定を行った。測定装置としては、図２に示す光源７、セル８および検出器９から構成されるものを用いた。抗体として、４５℃で保存試験を行った（保存日数０日、５０日、１００日、１５０日、２００日）抗ヒトアルブミン抗体を、抗原としてはヒトアルブミン（和光純薬（株）製）を用いた。４重量％ポリエチレングリコール６０００を含むｐＨ７．４の０．０５Ｍモプス溶液で希釈したヒトアルブミン溶液（抗原濃度：０ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌまたは２ｍｇ／ｄｌ）１８７μｌを入れたセル８に、抗ヒトアルブミン抗体溶液（抗体濃度：３ｍｇ／ｍｌ）７μｌを添加し、セル８内で撹拌混合し、抗原抗体反応を生じさせた（分析対象物とこれに特異的に結合するタンパク質との反応）。
【００４４】
そして、光源７からセル８に光を照射し、検出器９でセル８からの散乱光の測定を行った。検出器９で検出された散乱光の強度は、ヒトアルブミン溶液中のヒトアルブミン量を反映していたため、その信号強度から分析対象物の定性および定量が可能であった。
散乱光の測定は、抗体溶液を加える１０秒前から開始し、０．５秒間隔で３００秒間継続した。測定終了後、得られた測定値の２００〜３００秒の間に見られる定常領域の平均値を求め、各ヒトアルブミン濃度における測定値とした。図５に、縦軸に光散乱強度を、横軸に反応系に加えたヒトアルブミン溶液濃度をプロットしたときの測定結果を示し検量線を作成した。
【００４５】
光散乱強度が高いほど、抗原抗体反応による複合体が多く形成されたことがわかった。また、図５から、保存日数により、抗体の反応特性が変化していることがわかった。このことから、定量を目的とした特異結合反応では、抗体の変性段階に応じた検量線が必要であることがわかった。さらに、各抗ヒトアルブミン抗体について蛍光極大波長を測定した結果を表１に示した。なお、０日保存後の抗体を用いた場合が工程（ａ’）であり、５０〜２００日保存後の抗体を用いた場合が工程（ｂ’）であった。
【００４６】
【表１】
表１から、保存日数により、抗体の蛍光特性が変化しているのがわかる。
以上より、本発明にしたがって、抗体の蛍光極大波長から抗体の変性段階を把握し、定量を目的とした特異結合反応に必要な検量線を求めることができることがわかる。
【００４８】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、サンプルの損失が少ない分析対象物を定量する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の一実施の形態において用いたタンパク質の特性評価装置の構成を示すブロック図
【図２】 本発明の一実施の形態において用いた特異結合反応測定装置の構成を示すブロック図
【図３】 同タンパク質の特性評価装置を用いて測定した抗体の蛍光スペクトルを示すグラフ
【図４】 抗体の蛍光極大波長と結合活性との関係を示したグラフ
【図５】 本発明の一実施の形態において測定した光散乱強度とヒトアルブミン溶液濃度との関係を示したグラフ
【符号の説明】
１ 光源
２ 励起波長選択器
３ 試料室
４ 蛍光波長選択器
５ 光検出器
６ 演算装置
７ 光源
８ セル
９ 検出器
Claims (2)
- 分析対象物と、前記分析対象物に特異的に結合する被検タンパク質とを反応させ、前記反応に由来して得られる信号の強度を所定時間経過後に少なくとも１回測定し、前記信号の強度に基づいて前記分析対象物を定量する方法であって、
（Ａ）様々な変性段階にある基準タンパク質について、各変性段階の基準タンパク質を含む溶液にあらかじめ定められた波長域の励起光を照射することにより、前記各変性段階の基準タンパク質が発するあらかじめ定められた波長域の蛍光を測定し、前記基準タンパク質の変性段階と蛍光の極大波長との関係を求める工程、
（Ｂ）所定の変性段階にある被検タンパク質を含む溶液にあらかじめ定められた波長域の励起光を照射することにより、前記所定の変性段階にある被検タンパク質が発するあらかじめ定められた波長域の蛍光を測定する工程、
（Ｃ）工程（Ａ）で求められた前記基準タンパク質の変性段階と蛍光の極大波長との関係および工程（Ｂ）において測定した蛍光の極大波長を指標として、前記所定の変性段階にある被検タンパク質の変性段階を判定し、判定結果に基づいて、前記分析対象物の濃度換算のために使用する検量線を決定する工程、
（Ｄ）分析対象物と前記所定の変性段階にある被検タンパク質とを反応させ、前記反応に由来して得られる信号強度を測定する工程、ならびに
（Ｅ）工程（Ｃ）で決定された検量線および工程（Ｄ）において測定した信号強度を指標として、前記分析対象物を定量する工程を有することを特徴とする分析対象物の定量方法。 - 工程（Ａ）および（Ｂ）において、前記励起光の波長域が、それぞれ前記基準タンパク質および被検タンパク質の吸収極大を含む波長域であり、測定される蛍光の波長域が２８５〜４５０ｎｍであることを特徴とする請求項１記載の分析対象物の定量方法。
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