CN116744938A - 抗病毒核苷的合成 - Google Patents
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及可用于制备抗病毒核苷的有效合成方法，所述核苷特别是尿苷4‑肟5'‑(2‑甲基丙酸酯){(2R,3S,4R,5R)‑3,4‑二羟基‑5‑[4‑(羟基亚氨基)‑2‑氧代‑3,4‑二氢嘧啶‑1(2H)‑基]氧杂环戊烷‑2‑基}甲基2‑甲基丙酸酯及其药学上可接受的盐、衍生物、互变异构体、异构体和前药，其作为抗病毒剂可以是活性的，以及涉及其组合物和方法。本发明还包括可用于所公开的合成方法的中间体及其制备方法。
Description
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用整体并入本文。所述ASCII拷贝创建于2021年12月13日，命名为25183-WO-PCT_SL.txt，大小为155,715字节。
技术领域
本发明涉及可用于制备核苷的有效合成方法，所述核苷特别是尿苷4-肟5'-(2-甲基丙酸酯){(2R,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-[4-(羟基亚氨基)-2-氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基]氧杂环戊烷-2-基}甲基2-甲基丙酸酯及其药学上可接受的盐、衍生物、互变异构体、异构体和前药，其作为抗病毒剂可以是活性的。本发明还包括可用于所公开的合成方法的中间体及其制备方法。
背景技术
病毒感染，如由东部马脑炎病毒(EEEV)、西部马脑炎病毒(WEEV)和委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、基孔肯雅热病毒(CHIK)、埃博拉病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、寨卡病毒和冠状病毒(如严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV))以及最近的SARS-CoV-2(也称为2019-nCoV)引起的感染，继续在全球引起轻度和重度疾病，直至危及生命和致命。
EEEV、WEEV、VEEV和CHIK病毒是可以通过蚊子叮咬传播给人类的媒介传播的病毒(披膜病毒科(Togaviridae)、甲病毒属(Alphavirus))。马脑炎病毒是CDC B类病原体，并且CHIK病毒是C类病原体。
冠状病毒在人类中引起很大比例的呼吸道疾病，这可能是严重的或危及生命的。2002年出现的SARS-CoV-1在全球造成至少8439例人类疾病和至少812例死亡(WHOCumulative Number of Reported Probable Cases of SARS，从2002年11月1日至2003年7月4日，下载自https://www.who.int/csr/sars/country/2003_07_04/en/，2020年8月12日)。同样，2012年出现了MERS-CoV，全球至少2519例人类疾病，至少866例死亡(WHO MiddleEast respiratory syndrome，MERS situation update，2020年1月，从http://www.emro.who.int/health-topics/mers-cov/mers-outbreaks.html下载，2020年8月12日)。最近，2019年出现了SARS-CoV-2，导致全球至少237,655,302例人类疾病，至少4,846,981例死亡(COVID-19Weekly Operational Update，第75期，2021年10月12日公布，从https://www.who.int/publications/m/item/weekly-operational-update-on-COVID-19---12-October-2021下载，2021年10月19日)。SARS-CoV-2引起称为COVID-19的疾病，其可包括人类严重的呼吸系统疾病，且表现为引起神经系统疾病和并发症，包括头痛、头晕、味觉减退、神经痛、脑病、急性脑血管疾病、意识受损和骨骼肌损伤(Imran Ahmad和FarooqAzam Rathore，Neurological manifestations and complications of COVID-19:Aliterature review，CLIN.NEUROSCI.8-12(2020))。需要进行其他研究，以进一步表征SARS-CoV-2病毒，并确定预防和治疗COVID-19疾病以及其他人类冠状病毒引起的疾病的方法。
发现β-D-N(4)-羟基胞苷(NHC，1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-4-(羟氨基)嘧啶-2(1H)-酮)具有抗瘟病毒和抗肝炎病毒活性。AntimicrobAgents Chemother，2003，47(1)：244-54。β-D-N(4)-羟基胞苷，
衍生物及其制备方法在PCT国际专利申请号PCT/US2015/066144(其公开为WO2016/106050)、PCT国际专利申请号PCT/US2017/021759(其公开为WO2017/156380)和PCT国际专利申请号PCT/US2018/064503(其公开为PCT国际专利申请公开号WO2019/113462)中说明，其通过引用整体并入本文。
然而，NHC已经在食蟹猴中表现出明显低的口服生物利用度，并且某些前药显示出改善口服生物利用度。参见PCT国际专利申请号PCT/US2018/064503，其公开为PCT国际专利申请公开号WO2019/113462。这些前药包括尿苷4-肟5'-(2-甲基丙酸酯){(2R,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-[4-(羟基亚氨基)-2-氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基]氧杂环戊烷-2-基}甲基丙酸酯(化合物B)
以及化合物B的药学上可接受的盐、衍生物、互变异构体、异构体和前药，以及如2021年8月27日提交的PCT国际专利申请号PCT/US2021/048054中公开的特定形式，其通过引用整体并入本文。然而，需要有效且采用绿色化学的合成路线。
发明内容
本发明涉及可用于合成核苷的方法，所述核苷特别是抗病毒核苷尿苷4-肟5’-(2-甲基丙酸酯){(2R,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-[4-(羟基亚氨基)-2-氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基]氧杂环戊烷-2-基}甲基2-甲基丙酸酯(化合物B)
及化合物B的药学上可接受的盐、衍生物、互变异构体、异构体和前药，以及如2021年8月27日提交的PCT国际专利申请号PCT/US2021/048054中公开的特定形式。本发明包括提供可用于产生这种抗病毒核苷的中间体的方法。本发明的方法提供了优于先前已知方法的优点，并且包括获得此类抗病毒核苷的集合的、更有效的途径。
本公开的其他实施方式、方面和特征在随后的描述、实施例和所附权利要求中进一步描述或将从随后的描述、实施例和所附权利要求中显而易见。
具体实施方式
缩写
ATP腺苷5'-三磷酸
DME 1,2-二甲氧基乙烷
EtOAc乙酸乙酯
g/L克/升
h小时
HMDS双(三甲基甲硅烷基)胺，也称为六甲基二硅氮烷
HPLC高效液相色谱
K2HPO4磷酸氢二钾，正磷酸氢二钾
KOH氢氧化钾
MeTHF甲基四氢呋喃
mg毫克
MgCl2氯化镁
ml，mL毫升
mmol毫摩尔
MnCl2氯化锰
MTBE甲基叔丁基醚
N当量浓度，每升溶液的摩尔当量数
RPM每分钟转数
TEoA三乙醇胺
wt％重量百分比
μl，ul微升
μmol微摩尔
在整个公开中可以定义另外的缩写。
定义
下面具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文件中其他地方具体定义的，本文使用的所有其他技术和科学术语具有本公开所涉及领域的普通技术人员通常理解的含义。也就是说，本文使用的术语具有其普通含义，其在每次出现时是独立的。尽管如此并且除非另有说明，否则以下定义适用于整个说明书和权利要求书。化学名称、通用名称和化学结构可以互换使用以描述相同的结构。如果使用化学结构和化学名称两者提及化学化合物，并且在结构和名称之间存在歧义，则以结构为准。除非另有说明，否则无论术语是单独使用还是与其他术语组合使用，这些定义都适用。因此，“烷基”的定义适用于“烷基”以及“羟基烷基”、“卤代烷基”、“-O-烷基”等的“烷基”部分。
如本文和整个本公开所用，除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义：
如本文(包括所附权利要求书)所用，除非上下文另有明确规定，否则词语的单数形式，例如“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括其相应的复数指代。特别地，“一”、“一个”和“该”项各自包括选自列表的单一项以及选自列表的两个或更多个项的混合物。
如本文所用，术语“至少一个”项或“一个或多个”项各自包括选自列表的单一项以及选自列表的两个或更多个项的混合物。例如，“至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶”(或者称为“S-甲基-5-硫代核糖激酶”)、“至少一种MTR激酶”、“MTR激酶”、“至少一种MTR激酶”或“MTR激酶”)是指单一MTR激酶以及两种或更多种不同MTR激酶的混合物。类似地，术语“至少两个”项和“两个或更多个”项各自包括选自列表的两个项的混合物以及选自列表的三个或更多个项的混合物。
如本文所用，术语“COVID-19”是指由SARS-CoV-2感染引起的疾病。感染SARS-CoV-2且已出现症状的受试者被认为患有COVID-19。
在整个说明书和权利要求书中使用的“基本上由……组成(consistsessentially of)”和诸如“主要由……组成(consisting essentially of)”或“实质上由……组成(consisting essentially of)”的变型表示包括任何所述元素或元素组，并且任选地包括与所述元素具有相似或不同性质的其他元素，这些元素不会实质上改变指定剂量方案、方法或组合物的基本或新的性质。
在整个说明书和权利要求书中，词语“包含(comprise)”或如“包括(comprises)”或“含有(comprising)”的变体将被理解为暗示包括所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。术语“例如(e.g.)或比如(for example)”之后的任何示例并不意味着穷举或限制。应当理解，在本文中用语言“包含”描述实施方式的任何地方，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似实施方式。
除非有相反的明确说明，否则本文引用的所有范围都是包括性的；即，该范围包括该范围的上限和下限的值以及其间的所有值。所有范围也旨在包括所有包括的子范围，尽管不一定明确阐述。作为示例，本文所述的温度范围、百分比、等同物范围等包括该范围的上限和下限以及其间的连续统中的任何值。本文提供的数值和术语“约”的使用可以包括±1％、±2％、±3％、±4％、±5％和±10％的变化及其等同数值。用于修饰数值定义的参数(例如抗病毒核苷的剂量，或用本文所述的组合疗法的治疗时间长度)时，“约”意指该参数可以在该参数的所述数值以下或以上变化多达10％；在适当的情况下，所述参数可以四舍五入到最接近的整数。例如，约5mg/kg的剂量可以在4.5mg/kg和5.5mg/kg之间变化。另外，如本文所用的术语“或”表示在适当的情况下可以组合的替代方案；也就是说，术语“或”包括单独列出的每个替代方案及其组合。
如本文所用，术语“烷基”是指具有指定碳原子数的其氢原子之一被键取代的脂族烃基。在不同的实施方式中，烷基含有1至6个碳原子(C1-C6烷基)或1至3个碳原子(C1-C3烷基)。烷基的非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、异戊基、正己基、异己基和新己基。在一个实施方式中，烷基是直链的。在另一个实施方式中，烷基是支链的。
如本文所用，术语“卤素”和“卤代”意指-F(氟)、-Cl(氟)、Br(溴)或-I(碘)。
如本文所用，术语“卤代烷基”是指如上定义的烷基，其中烷基的一个或多个氢原子已被卤素替代。在一个实施方式中，卤代烷基具有1至6个碳原子。在另一个实施方式中，卤代烷基具有1至3个碳原子。在另一个实施方式中，卤代烷基被1至3个卤素原子取代。卤代烷基的非限制性实例包括-CH2F、-CHF2和-CF3。术语“C1-C4卤代烷基”是指具有1至4个碳原子的卤代烷基。
本文所用的术语“烷氧基”是指-O-烷基，其中烷基如上所定义。烷氧基的非限制性实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基和叔丁氧基。烷氧基通过其氧原子与分子的剩余部分键合。
如本文所用，术语“芳基”是指包含约6至约14个碳原子的芳族单环或多环环系统。在一个实施方式中，芳基含有约6至10个碳原子(C6-C10芳基)。在另一个实施方式中，芳基是苯基。芳基的非限制性实例包括苯基和萘基。
化合物中的官能团被称为“受保护”时，该基团为修饰形式，以在化合物进行反应时排除在保护位点处的不期望的副反应。如本文所用，术语“PG”是指保护基团。本领域技术人员将容易设想适用于根据本公开的化合物和方法的保护基团(PG)。合适的保护基团将被本领域普通技术人员以及通过参考标准教科书如，例如T.W.Greene等，Protective Groupsin Organic Synthesis(1991)，Wiley，New York识别。适用于本文的保护基团包括酸不稳定的保护基团。适用于本发明的PG的非限制性实例包括-S(O)2R8、-C(O)OR8、-C(O)R8、-CH2OCH2CH2SiR8和-CH2R8，其中R8选自-C1-8烷基(直链或支链)、-C3-8环烷基、-CH2(芳基)和-CH(芳基)2，其中每个芳基独立地是苯基或萘基，并且每个所述芳基任选独立地是未取代的或被一个或多个(例如1、2或3个)独立地选自-OCH3、-Cl、-Br和-I的基团取代。
术语“取代的”意指指定部分的原子上的一个或多个氢被选自所示基团的基团替代，条件是在现有情况下不超过原子的正常化合价，并且取代产生稳定的化合物。只有当取代基和/或变量的组合产生稳定的化合物时，这种组合才是允许的。“稳定的化合物”或“稳定的结构”是指足够稳健以经受从反应混合物中分离至有用的纯度并配制成有效的治疗剂的化合物。
当任何取代基或变量在任何化合物中出现超过一次时，除非另有说明，否则其在每次出现时的定义独立于其在其他每次出现时的定义。例如，包括表述“-N(C1-C3烷基)2”的基团的描述表示：-N(CH3)(CH2CH3)、-N(CH3)(CH2CH2CH3)和-N(CH2CH3)(CH2CH2CH3)，以及-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2和-N(CH2CH2CH3)2。
还应当注意，在本文的文本、方案、实施例和表中具有不饱和化合价的任何碳或杂原子被假定具有足够的氢原子以满足化合价。这些氢原子中的任何一个或多个可以是氘。
本公开还包括与本文所述的那些化合物相同的同位素标记的化合物，但区别在于事实上一个或多个原子被原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现的原子质量或质量数的原子替代。可以掺入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯和碘的同位素，分别如2H、3H、11C、13C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18F、36Cl和123I。
某些同位素标记的化合物(例如，用3H和14C标记的那些)可用于化合物和/或底物组织分布测定。含氚的(即，3H)和碳-14(即，14C)同位素是特别优选的，因为它们易于制备和可检测性。在发生差向异构化的位点处的同位素取代可以减缓或减少差向异构化过程，从而使化合物的更具活性或更有效的形式保持更长的时间段。同位素标记的化合物，特别是具有较长半衰期(T1/2>1天)的含同位素的那些化合物，通常可以按照与下文方案和/或实施例中公开的那些类似的方法，通过用适当的同位素标记的试剂代替非同位素标记的试剂来制备。
本文的一种或多种化合物可以非溶剂化形式以及与药学上可接受的溶剂(如水、乙醇等)的溶剂化形式存在，并且本公开旨在包括溶剂化和非溶剂化形式。“溶剂化物”意指化合物与一个或多个溶剂分子的物理缔合。这种物理缔合涉及不同程度的离子和共价键合，包括氢键键合。在该方面的某些情况下，溶剂化物能够分离，例如当一个或多个溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时。“溶剂化物”包括溶液相和可分离的溶剂化物。合适的溶剂化物的非限制性实例包括乙醇化物、甲醇化物等。“水合物”是其中溶剂分子是H2O的溶剂化物。
本文的化合物可以含有一个或多个立体中心，且因此可以作为外消旋体、外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和单独的非对映异构体存在。根据分子上各种取代基的性质，可以存在另外的不对称中心。每个这样的不对称中心将独立地产生两种光学异构体，并且混合物中和作为纯的或部分纯化的化合物的所有可能的光学异构体和非对映异构体都包括在本公开内。未指定特定立体化学的本文所述化合物的任何式、结构或名称意在涵盖如上所述的任何和所有现有异构体及其任何比例的混合物。指定立体化学时，本公开意在涵盖纯形式或作为以任何比例与其它异构体的混合物的一部分的特定异构体。
非对映异构体混合物可以基于它们的物理化学差异通过本领域技术人员熟知的方法(如，例如，通过色谱法和/或分级结晶)分离成它们单个非对映异构体。对映异构体可以通过与适当的光学活性化合物(例如，手性助剂，如手性醇或Mosher酰氯)反应将对映异构体混合物转化为非对映异构体混合物，分离非对映异构体并将单独的非对映异构体转化(例如水解)为相应的纯对映异构体来分离。对映异构体也可以通过使用手性HPLC柱分离。
所公开的化合物(包括化合物的盐和溶剂化物的那些以及前药的盐、溶剂化物和酯)的所有立体异构体(例如，几何异构体、光学异构体等)，如由于各种取代基上的不对称碳而可能存在的那些，包括对映异构体形式(其甚至可以在不存在不对称碳的情况下存在)、旋转异构体形式、阻转异构体和非对映异构体形式，都涵盖在本公开的范围内。化合物的单个立体异构体可以例如基本上不含其他异构体，或者可以例如作为外消旋体或与所有其他或其他选择的立体异构体混合。手性中心可具有如IUPAC 1974Recommendations所定义的S或R构型。
本公开还包括所有其分离形式的化合物和合成中间体。例如，所鉴定的化合物旨在涵盖化合物的所有形式，如其任何溶剂化物、水合物、立体异构体和互变异构体。
本领域技术人员将认识到，某些化合物，特别是含有某些杂原子和双键或三键的化合物，可以是互变异构体，容易相互转化的结构异构体。因此，互变异构化合物可以以许多等效的不同方式绘制。此类互变异构体的非限制性实例包括以下示例的那些。
本领域技术人员将认识到，手性化合物，特别是糖，可以以等效的多种不同方式绘制。本领域技术人员将进一步认识到，核糖上的取代基的身份和区域化学位置可以广泛变化，并且无论取代基如何，立体化学等同的相同原理都适用。这种等同物的非限制性实例包括以下示例的那些。
化合物可以形成也在本公开的范围内的盐。除非另有说明，否则本文中对化合物的提及应理解为包括对其盐的提及。如本文所用，术语“盐”表示与无机和/或有机酸形成的酸式盐，以及与无机和/或有机碱形成的碱式盐。此外，当化合物含有碱性部分(如但不限于吡啶或咪唑)和酸性部分(如但不限于羧酸)时，可以形成两性离子(“内盐”)并且包括在如本文所用的术语“盐”内。药学上可接受的(即，无毒的，生理学上可接受的)盐是优选的，尽管其它盐也是有用的。化合物的盐可以例如通过使化合物与介质中的一定量(如当量)的酸或碱反应然后冻干来形成，所述介质如盐在其中沉淀的介质或水性介质。
示例性酸加成盐包括乙酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、草酸盐、磷酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐(也称为对甲苯磺酸盐)等。另外，例如，P.Stahl等，Camille G.(编辑)Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection andUse(2002)Zurich:Wiley-VCH；S.Berge等，J.Pharm.Sci.(1977)66(1)1-19；P.Gould，International J.of Pharmaceutics(1986)33 201-217；Anderson等，The Practice ofMedicinal Chemistry(1996)，Academic Press，New York；和The Orange Book(Food&DrugAdministration，Washington，D.C.)讨论了通常认为适合从碱性药物化合物形成药学上有用的盐的酸。将这些公开内容通过引用并入本文。
示例性的碱式盐包括铵盐，碱金属盐(如钠、锂和钾盐)，碱土金属盐(如钙和镁盐)，与有机碱(例如有机胺)如二环己胺、叔丁胺的盐，以及与氨基酸(如精氨酸、赖氨酸等)的盐。碱性含氮基团可以用诸如低级烷基卤化物(例如甲基、乙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物)、二烷基硫酸盐(例如二甲基、二乙基和二丁基硫酸盐)、长链卤化物(例如癸基、月桂基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物)、芳烷基卤化物(例如苄基和苯乙基溴化物)等试剂季铵化。
所有此类酸式盐和碱式盐旨在是本发明范围内的药学上可接受的盐，并且所有酸式盐和碱式盐被认为等同于用于本发明目的的相应化合物的游离形式。
“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，以表示通过酰胺键共价连接的至少两个氨基酸的聚合物，而不管长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化、脂化、肉豆蔻酰化、泛素化等)。该定义包括D-和L-氨基酸，和D-和L-氨基酸的混合物，以及包含D-和L-氨基酸的聚合物，和D-和L-氨基酸的混合物。蛋白质、多肽和肽可以包括标签，如组氨酸标签，其在确定序列同一性百分比时不应包括在内。
在本文公开的多肽的上下文中使用的“氨基酸”或“残基”是指序列位置处的特定单体。氨基酸在本文中通过其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样，核苷酸可以通过其普遍接受的单字母代码来表示。
用于遗传编码的氨基酸的缩写是常规的，并且如下：丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酸(Glu或E)、谷氨酰胺(Gln或Q)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)，色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。
用于遗传编码核苷的缩写是常规的，并且如下：腺苷(A)；鸟苷(G)；胞苷(C)；胸苷(T)；和尿苷(U)。除非特别描述，否则缩写的核苷可以是核糖核苷或2'-脱氧核糖核苷。核苷可以单独地或在集合的基础上被指定为核糖核苷或2'-脱氧核糖核苷。核酸序列以一串单字母缩写表示时，序列根据常规惯例以5'至3'方向表示，并且未指示磷酸酯。
如本文所用，在酶的上下文中，“衍生自”指定酶和/或编码该酶所基于的基因的起源。例如，SEQ ID NO:7的MTR激酶通过在多代中人工进化编码SEQ ID NO:1的MTR激酶的基因而获得。因此，该进化的MTR激酶“衍生自”SEQ ID NO:1的MTR激酶。
“亲水性氨基酸或残基”是指具有根据Eisenberg等，1984，J.Mol.Biol179：125-142的归一化共有疏水性指数(consensus hydrophobicity scale)呈现出小于零的疏水性的侧链的氨基酸或残基。遗传编码的亲水性氨基酸包括L-Thr(T)、L-Ser(S)、L-His(H)、L-Glu(E)、L-Asn(N)、L-Gln(Q)、L-Asp(D)、L-Lys(K)和L-Arg(R)。
“酸性氨基酸或残基”是指具有当氨基酸包括在肽或多肽中时呈现出小于约6的pK值的侧链的亲水性氨基酸或残基。酸性氨基酸通常由于氢离子的损失而在生理pH下具有带负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括L-Glu(E)和L-Asp(D)。
“碱性氨基酸或残基”是指具有当氨基酸包括在肽或多肽中时呈现出大于约6的pKa值的侧链的亲水性氨基酸或残基。由于与水合氢离子缔合，碱性氨基酸通常在生理pH下具有带正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包括L-Arg(R)和L-Lys(K)。
“极性氨基酸或残基”是指具有在生理pH下不带电荷的侧链但具有至少一个其中由两个原子共有的电子对被一个原子更紧密地保持的键的亲水性氨基酸或残基。遗传编码的极性氨基酸包括L-Asn(N)、L-Gln(Q)、L-Ser(S)和L-Thr(T)。
“疏水性氨基酸或残基”是指具有根据Eisenberg等，1984，J.Mol.Biol.27:338-339的归一化共有疏水性指数呈现出大于零的疏水性的侧链的氨基酸或残基。遗传编码的疏水性氨基酸包括L-Pro(P)、L-Ile(I)、L-Phe(F)、L-Val(V)、L-Leu(L)、L-Trp(W)、L-Met(M)、L-Ala(A)和L-Tyr(Y)。
“芳香族氨基酸或残基”是指具有包括至少一个芳香族或杂芳香族环的侧链的亲水性或疏水性氨基酸或残基。遗传编码的芳香族氨基酸包括L-Phe(F)、L-Tyr(Y)、L-His(H)和L-Trp(W)。L-His(H)组氨酸在本文中也分类为亲水性残基或受限残基。
如本文所用，“受限的氨基酸或残基”是指具有受约束的几何形状的氨基酸或残基。在本文中，受限的残基包括L-Pro(P)和L-His(H)。组氨酸具有受限的几何形状，因为它具有相对小的咪唑环。脯氨酸具有受限的几何形状，因为它也具有五元环。
“非极性氨基酸或残基”是指具有在生理pH下不带电荷的侧链并且具有其中两个原子共有的电子对通常被两个原子中的每一个同等地保持的键的疏水性氨基酸或残基(即，侧链不是极性的)。遗传编码的非极性氨基酸包括L-Gly(G)、L-Leu(L)、L-Val(V)、L-Ile(I)、L-Met(M)和L-Ala(A)。
如本文所用，“脂肪族氨基酸或残基”是指具有脂肪族烃侧链的疏水性氨基酸或残基。遗传编码的脂肪族氨基酸包括L-Ala(A)、L-Val(V)、L-Leu(L)和L-Ile(I)。
L-Cys(C)(和具有含-SH侧链的其他氨基酸)以还原的游离-SH或氧化的二硫桥形式存在于肽中的能力影响到L-Cys(C)为肽贡献净疏水还是亲水特征。虽然根据Eisenberg的归一化一致性指数(Eisenberg等，1984，同上)，L-Cys(C)呈现出0.29的疏水性，但应理解出于本公开的目的，L-Cys(C)被分类为其自身独特的组。注意到半胱氨酸(或“L-Cys”或“[C]”)是不寻常的，因为它可以与其他L-Cys(C)氨基酸或其他含硫烷基或巯基的氨基酸形成二硫桥。“半胱氨酸样残基”包括半胱氨酸和含有可用于形成二硫桥的巯基部分的其它氨基酸。
如本文所用，“小氨基酸或残基”是指具有由总共三个或更少的碳和/或杂原子(不包括α-碳和氢)组成的侧链的氨基酸或残基。根据上述定义，小氨基酸或残基可以进一步分类为脂肪族、非极性、极性或酸性小氨基酸或残基。遗传编码的小氨基酸包括L-Ala(A)、L-Val(V)、L-Cys(C)、L-Asn(N)、L-Ser(S)、L-Thr(T)和L-Asp(D)。
“含羟基的氨基酸或残基”是指含有羟基(-OH)部分的氨基酸。遗传编码的含羟基氨基酸包括L-Ser(S)、L-Thr(T)和L-Tyr(Y)。
如本文所用，“多核苷酸”和“核酸”是指共价连接在一起的两个或更多个核苷酸。多核苷酸可以完全由核糖核苷酸(即，RNA)组成，完全由2'脱氧核糖核苷酸(即，DNA)组成，或由核糖核苷酸和2'脱氧核糖核苷酸的混合物组成。虽然核苷通常通过标准磷酸二酯键连接在一起，但多核苷酸可包括一个或多个非标准键。多核苷酸可以是单链或双链的，或者多核苷酸可以包括单链区和双链区两者。此外，虽然多核苷酸通常由天然存在的编码核碱基(即腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)组成，但它可包括一个或多个修饰的和/或合成的核碱基，如，例如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤等。在一些实施方式中，此类修饰的或合成的核碱基是编码氨基酸序列的核碱基。
如本文所用，“核苷”是指包含核碱基(即，含氮碱基)和5-碳糖(例如，核糖或脱氧核糖)的糖基胺。核苷的非限制性实例包括胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、胸苷和肌苷。相反，术语“核苷酸”是指包含核碱基、5-碳糖和一个或多个磷酸基团的糖基胺。在一些实施方式中，核苷可以被激酶磷酸化以产生核苷酸。
如本文所用，“核苷二磷酸”是指包含核碱基(即，含氮碱基)、5-碳糖(例如，核糖或脱氧核糖)和二磷酸(即，焦磷酸)部分的糖基胺。在本文的一些实施方式中，“核苷二磷酸”缩写为“NDP”。核苷二磷酸的非限制性实例包括胞苷二磷酸(CDP)、尿苷二磷酸(UDP)、腺苷二磷酸(ADP)、鸟苷二磷酸(GDP)、胸苷二磷酸(TDP)和肌苷二磷酸(IDP)。术语“核苷”和“核苷酸”在一些情况下可互换使用。
如本文所用，“核苷三磷酸”是指包含核碱基(即，含氮碱基)、5-碳糖(例如，核糖或脱氧核糖)和三磷酸部分的糖基胺。在一些实施方式中，“核苷三磷酸”缩写为“NTP”。核苷三磷酸的非限制性实例包括胞苷三磷酸(CTP)、尿苷三磷酸(UTP)、腺苷三磷酸(ATP)、鸟苷三磷酸(GTP)、胸苷三磷酸(TTP)和肌苷三磷酸(ITP)。术语“核苷”和“核苷酸”在一些情况下可互换使用。
如本文所用，“保守氨基酸置换”是指残基用具有相似侧链的不同残基替代，因此通常涉及用相同或相似定义氨基酸类别内的氨基酸置换多肽中的氨基酸。作为实例而非限制，在一些实施方式中，具有脂肪族侧链的氨基酸被另一种脂肪族氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)置换；具有羟基侧链的氨基酸被另一个具有羟基侧链的氨基酸(例如丝氨酸和苏氨酸)置换；具有芳香族侧链的氨基酸被具有芳香族侧链的另一种氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸)置换；具有碱性侧链的氨基酸被另一个具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸和精氨酸)置换；具有酸性侧链的氨基酸被另一个具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)置换；和/或疏水性或亲水性氨基酸分别被另一种疏水性或亲水性氨基酸置换。
如本文所用，“非保守置换”是指用具有显著不同侧链性质的氨基酸置换多肽中的氨基酸。非保守置换可以使用定义组之间而不是定义组内的氨基酸，并且影响(a)置换区域中肽骨架的结构(例如，脯氨酸置换甘氨酸)，(b)电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。作为实例而非限制，示例性非保守置换可以是酸性氨基酸被碱性或脂肪族氨基酸置换；芳香族氨基酸被小氨基酸置换；和亲水性氨基酸被疏水性氨基酸置换。
如本文所用，“缺失”是指通过从参考多肽中去除一个或多个氨基酸来修饰多肽。缺失可以包括去除1个或多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸，或20个或更多个氨基酸，至多为构成参考酶的氨基酸总数的10％，或至多为构成参考酶的氨基酸总数的20％，同时保留酶活性和/或保留进化的酶的改善的性质。缺失可以针对多肽的内部部分和/或末端部分。在各种实施方式中，缺失可包含连续区段或可为不连续的。缺失通常由氨基酸序列中的“-”表示。
如本文所用，“插入”是指通过从参考多肽添加一个或多个氨基酸来修饰多肽。插入可以在多肽的内部部分，或插入到羧基或氨基末端。本文所用的插入包括本领域已知的融合蛋白。插入可以是连续的氨基酸区段或由天然存在的多肽中的一个或多个氨基酸分开。
术语“氨基酸置换组”或“置换组”是指与参考序列相比，多肽序列中的一组氨基酸置换。置换组可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个氨基酸置换。
“功能性片段”和“生物活性片段”在本文中可互换使用，是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽，但其中剩余的氨基酸序列与其所比较的序列中的相应位置相同，并且基本上保留全长多肽的所有活性。
如本文所用，“分离的多肽”是指基本上与其天然伴随的其他污染物(例如蛋白质、脂质和多核苷酸)分离的多肽。该术语包括已经从其天然存在的环境或表达系统(例如，在宿主细胞内或通过体外合成)中除去或纯化的多肽。重组多肽可以存在于细胞内，存在于细胞培养基中，或以各种不同形式制备，如裂解物或分离的制备物。因此，在一些实施方式中，重组多肽可以是分离的多肽。
如本文所用，“基本上纯的多肽”或“纯化的蛋白质”是指其中多肽物质是存在的主要物质的组合物(即，在摩尔或重量基础上，它比组合物中的任何其他单独的大分子物质更丰富)，并且通常当目标物质以摩尔或重量％计占存在的大分子物质的至少约50％时，是基本上纯化的组合物。然而，在一些实施方式中，含酶组合物包含纯度低于50％(例如，约10％、约20％、约30％、约40％或约50％)的酶。通常，基本上纯的酶或多肽组合物占存在于组合物中的所有大分子物质的约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约95％或更多和约98％或更多(以摩尔或重量％计)。在一些实施方式中，将目标物质纯化至基本上均质(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物质)，其中组合物基本上由单一大分子物质组成。溶剂物质、小分子(<500道尔顿)和元素离子物质不被认为是大分子物质。在一些实施方式中，分离的重组多肽是基本上纯的多肽组合物。
“改善的酶性质”是指与参考酶相比表现出任何酶性质的改善的酶。对于本文所述的酶，通常与野生型酶进行比较，尽管在一些实施方式中，参考酶可以是另一种改善的酶。需要改善的酶性质包括但不限于酶活性(其可以用底物的转化百分比表示)、热稳定性、pH活性曲线、辅因子需求、对抑制剂的不应性(例如产物抑制)、立体特异性和立体选择性(包括对映体选择性)。
“增加的酶活性”是指改善的酶的性质，其可以通过与参考酶相比的比活性(例如，产生的产物/时间/蛋白质重量)的增加或底物向产物的转化百分比(例如，使用指定量的酶在指定时间段内起始量的底物向产物的转化百分比)的增加来表示。在实施例中提供了测定酶活性的示例性方法。与酶活性相关的任何性质都可能受到影响，包括Km、Vmax或kcat的经典酶性质，其变化可导致酶活性增加。酶活性的提高可以是相应野生型酶的酶活性的约1.5倍至多达2倍。比天然存在的酶或多肽由其衍生的另一种酶具有5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍、500倍、1000倍、3000倍、5000倍、7000倍或更高的酶活性。在具体的实施方式中，酶表现出比亲本酶的酶活性高150至3000倍、3000至7000倍或超过7000倍的范围内的提高的酶活性。本领域技术人员理解，任何酶的活性都是扩散受限的，使得催化转换速率不能超过底物(包括任何所需的辅因子)的扩散速率。扩散极限的理论最大值或kcat/Km通常约为108至109(M-1s-1)。因此，酶活性的任何改善将具有与酶作用的底物的扩散速率相关的上限。酶活性可以通过用于测量激酶活性的任何一种标准测定法来测量，或通过用能够催化多肽产物和核苷碱基之间的反应以提供核苷的核苷磷酸化酶的偶联测定来测量，或通过用于测定化学反应的任何传统方法来测量，包括但不限于HPLC、HPLC-MS、UPLC、UPLC-MS、TLC和NMR。使用限定的酶制剂、在设定条件下的限定测定和一种或多种限定的底物进行酶活性的比较，如本文进一步详细描述的。通常，比较裂解物时，确定细胞的数量和测定的蛋白质的量，以及使用相同的表达系统和相同的宿主细胞以使由宿主细胞产生并存在于裂解物中的酶量的变化最小化。
如本文所用，“载体”是用于将DNA序列引入细胞中的DNA构建体。在一些实施方式中，载体是与能够实现在合适的宿主中表达在DNA序列中编码的多肽的合适的控制序列可操作地连接的表达载体。在一些实施方式中，“表达载体”具有与DNA序列(例如转基因)可操作地连接以驱动在宿主细胞中的表达的启动子序列，并且在一些实施方式中，还包含转录终止子序列。
如本文所用，术语“表达”包括参与多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译和翻译后修饰。在一些实施方式中，该术语还涵盖多肽从细胞的分泌。
如本文所用，术语“产生”是指通过细胞产生蛋白质和/或其他化合物。该术语旨在涵盖参与多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译和翻译后修饰。在一些实施方式中，该术语还涵盖多肽从细胞的分泌。
如本文所用，如果两个序列在自然界中不关联，则氨基酸或核苷酸序列(例如启动子序列、信号肽、终止子序列等)对于与其可操作地连接的另一个序列是“异源的”。例如，“异源多核苷酸”是通过实验室技术引入宿主细胞中的任何多核苷酸，并且该术语包括从宿主细胞中移出，经受实验室操作，然后重新引入宿主细胞中的多核苷酸。
如本文所用，术语“宿主细胞”和“宿主菌株”是指用于包含本文提供的DNA(例如，编码变体的多核苷酸)的表达载体的合适宿主。在一些实施方式中，宿主细胞是已经用使用本领域已知的重组DNA技术构建的载体转化或转染的原核或真核细胞。
术语“类似物”意指与参考多肽具有大于70％的序列同一性但小于100％的序列同一性(例如，大于75％、78％、80％、83％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)的多肽。在一些实施方式中，“类似物”意指含有一个或多个非天然存在的氨基酸残基(包括但不限于高精氨酸、鸟氨酸和正缬氨酸)以及天然存在的氨基酸的多肽。在一些实施方式中，类似物还包括一个或多个D-氨基酸残基和两个或更多个氨基酸残基之间的非肽键。
如本文所用，“EC”编号是指国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(NC-IUBMB)的酶命名法。IUBMB生物化学分类是基于酶催化的化学反应的酶的数字分类系统。
如本文所用，“ATCC”是指美国典型培养物保藏中心，其生物储存库保藏中心包括基因和菌株。
如本文所用，“NCBI”是指美国国家生物信息中心和其中提供的序列数据库。
“编码序列”是指编码蛋白质的氨基酸序列的核酸部分(例如基因)。
“天然存在的”或“野生型”是指在自然界中发现的形式。例如，天然存在的或野生型多肽或多核苷酸序列是存在于生物体中的序列，其可以从自然界的来源分离并且未通过人为操作有意修饰，唯一的例外是本文鉴定的野生型多肽或多核苷酸序列可以包括标签，如组氨酸标签，在确定序列同一性百分比时不应包括该标签。在本文中，“野生型”多肽或多核苷酸序列可以表示为“WT”。
当用于提及例如细胞、核酸或多肽时，“重组”是指已经以本来不存在于自然界中的方式进行修饰，或与其相同但由合成材料和/或通过使用重组技术的操作产生或衍生的材料或对应于该材料的天然或自然形式的材料。非限制性实例尤其包括表达在天然(非重组)形式的细胞内不存在的基因或表达另外以不同水平表达的天然基因的重组细胞。
“序列同一性百分比”、“同一性百分比”和“百分相同”在本文中用于指多核苷酸序列或多肽序列之间的比较，并且通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定，其中与参考序列相比，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包含添加或缺失(即，空位)以用于两个序列的最佳比对。如下计算百分比：通过确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基或者核酸碱基或氨基酸残基与空位对准以产生匹配位置数的位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。使用BLAST和BLAST 2.0算法进行最佳比对和序列同一性百分比的确定(参见例如Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215:403-410；和Altschul等，1977，Nucleic Acids Res.3389-3402)。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心网站公开获得。
简而言之，BLAST分析涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，与数据库序列中相同长度的字比对时，所述短字匹配或满足一些正值阈值评分T。T被称为邻域字得分阈值(Altschul等，同上)。这些初始邻域字命中充当启动搜索以找到含有它们的更长HSP的种子。然后沿着每个序列在两个方向上延伸字命中，直到可以增加累积比对得分。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数，总是>0)和N(错配残基的罚分，总是<0)计算累积分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积评分。当以下情况时，停止每个方向上的字命中的延伸：累积比对得分从其最大实现值下降量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或低于零；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)3、期望值(E)10和BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff和Henikoff，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)。
许多其他算法是可用的，其在提供两个序列的同一性百分比方面与BLAST类似地起作用。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch，1970，J.MOL.BIOL.48:443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman，1988，N USA 85：2444的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化实施(GCG Wisconsin软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过目视检查(通常参见，Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编辑，Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,(1995Supplement)(Ausubel))来进行。此外，序列比对和序列同一性百分比的确定可以使用GCG Wisconsin软件包(Accelrys，Madison WI)中的BESTFIT或GAP程序，使用提供的默认参数。
“基本同一性”是指在至少20个残基位置的比较窗口上，经常在至少30-50个残基的窗口上，与参考序列相比，具有至少80％的序列同一性，优选至少85％的序列同一性，更优选至少89％的序列同一性，更优选至少95％的序列同一性，甚至更优选至少99％的序列同一性的多核苷酸或多肽序列，其中通过在比较窗口上将参考序列与包含总计为参考序列的20％或更少的缺失或添加的序列进行比较来计算序列同一性百分比。在应用于多肽的具体实施方式中，术语“基本同一性”是指两个多肽序列在最佳比对时，例如通过程序GAP或BESTFIT使用默认空位权重，共有至少80％的序列同一性，优选至少89％的序列同一性，更优选至少95％的序列同一性或更高(例如99％的序列同一性)。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸置换而不同。
在给定氨基酸或多核苷酸序列的编号的上下文中使用的“对应于”、“参考”或“相对于”是指将给定氨基酸或多核苷酸序列与参考序列进行比较时指定参考序列的残基的编号。换句话说，给定聚合物的残基编号或残基位置是相对于参考序列而不是通过给定氨基酸或多核苷酸序列内的残基的实际数字位置来指定的。例如，可以通过引入空位将给定的氨基酸序列与参考序列比对以优化两个序列之间的残基匹配。在这些情况下，尽管存在空位，但是给定氨基酸或多核苷酸序列中的残基的编号是相对于与其比对的参考序列进行的。
“立体选择性”是指一种立体异构体相对于另一种立体异构体在化学或酶促反应中的优先形成。立体选择性可以是部分的，其中一种立体异构体的形成优于另一种立体异构体，或者可以是完全的，其中仅形成一种立体异构体。立体异构体是对映异构体时，立体选择性被称为对映体选择性，即一种对映异构体在两者的总和中的分数(通常报告为百分比)。在本领域中通常可选地报告(通常作为百分比)为根据式[主要对映异构体-次要对映异构体]/[主要对映异构体+次要对映异构体]由其计算的对映异构体过量(EE)。在立体异构体是非对映异构体的情况下，立体选择性被称为非对映体选择性，即两种非对映异构体的混合物中一种非对映异构体的分数(通常报告为百分比)，通常可选地报告为非对映异构体过量(DE)。对映体过量和非对映体过量是立体异构体过量的类型。
“高度立体选择性”是指能够以至少约85％立体异构体过量将底物转化为其相应产物的化学或酶促反应。
“化学选择性”是指在化学或酶促反应中一种产物相对于另一种产物的优先形成。
“转化”是指底物酶促转化为相应的产物。“转化百分比”是指在指定条件下在一段时间内转化为产物的底物百分比。因此，例如，多肽的“酶活性”或“活性”可以表示为底物向产物的“转化百分比”。
“手性醇”是指通式R1-CH(OH)-R2的胺，其中R1和R2不同，且在本文中以其最广泛的含义使用，包括多种不同和混合的功能类型的脂族和脂环族化合物，其特征在于存在与仲碳原子结合的伯羟基，所述仲碳原子除氢原子外还带有(i)形成手性环状结构的二价基团，或(ii)结构或手性彼此不同的两个取代基(除氢以外)。形成手性环状结构的二价基团包括例如2-甲基丁烷-1,4-二基、戊烷-1,4-二基、己烷-1,4-二基、己烷-1,5-二基、2-甲基戊烷-1,5-二基。在仲碳原子上的两个不同的取代基(以上的R1和R2)也可以广泛改变，并且包括烷基、芳烷基、芳基、卤素、羟基、低级烷基、低级烷氧基、低级烷硫基、环烷基、羧基、烷氧羰基、氨基甲酰基、单-和二-(低级烷基)取代的氨基甲酰基、三氟甲基、苯基、硝基、氨基、单-和二-(低级烷基)取代的氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基甲酰氨基、芳基甲酰氨基等，以及被上述基团取代的烷基、芳烷基或芳基。
固定化酶制剂具有许多公认的优点。作为实例，它们可以赋予酶制剂储存期，它们可以改善反应稳定性，它们可以实现在有机溶剂中的稳定性，它们可以帮助从反应流中除去蛋白质。“稳定的”是指固定化酶在含有有机溶剂的溶剂系统中保持其结构构象和/或其活性的能力。稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂系统中每小时损失小于10％的活性。稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂系统中每小时损失小于9％的活性。优选地，稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂系统中每小时损失小于8％的活性。优选地，稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂系统中每小时损失小于7％的活性。优选地，稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂系统中每小时损失小于6％的活性。优选地，稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂系统中每小时损失小于5％的活性。优选地，稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂系统中每小时损失小于4％活性。优选地，稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂系统中每小时损失小于3％的活性。优选地，稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂系统中每小时损失小于2％的活性。优选地，稳定的固定化酶在含有有机溶剂的溶剂系统中每小时损失小于1％的活性。
“热稳定的”是指与未处理的酶相比，在暴露于升高的温度(例如，40℃至80℃)一段时间(例如，0.5h至24h)后保持相似活性(例如超过60％至80％)的多肽。
“溶剂稳定的”是指与未处理的酶相比，在暴露于不同浓度(例如，5％至99％)的溶剂(异丙醇、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、甲苯、乙酸丁酯、甲基正丁基醚等)一段时间(例如，0.5h至24h)后保持相似活性(超过例如60％至80％)的多肽。
“pH稳定的”是指与未处理的酶相比，在暴露于高或低pH(例如4.5至6或8至12)一段时间(例如0.5小时至24小时)后保持相似活性(大于例如60％至80％)的多肽。
“热和溶剂稳定的”是指既热稳定又溶剂稳定的多肽。
如本文所用，术语“生物催化”、“生物催化的”、“生物转化”和“生物合成”是指使用酶对有机化合物进行化学反应。
术语“有效量”是指足以产生所需结果的量。本领域普通技术人员可以通过使用常规实验确定有效量。
术语“分离的”和“纯化的”用于指从与其天然相关的至少一种其他组分中除去的分子(例如，分离的核酸、多肽等)或其他组分。术语“纯化的”不需要绝对纯度，而是旨在作为相对定义。
本文描述了示例性方法和材料，但是与本文描述的那些类似或等同的方法和材料也可以用于本公开的实践或测试。材料、方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。
抗病毒核苷
如本文所用，“抗病毒核苷”是指表现出抗病毒活性的任何核苷化合物，特别是如PCT国际专利申请号PCT/US2018/064503中公开的抗病毒核苷，其作为PCT国际专利申请公开号WO2019/113462公开，其通过引用整体并入本文。特别地，术语“抗病毒核苷”包括化合物B和化合物B的药学上可接受的盐、衍生物、互变异构体、异构体和前药，以及如在2021年8月27日提交的PCT国际专利申请号PCT/US2021/048054中公开的特定形式。此外，术语“抗病毒核苷”包括此类化合物的药学上可接受的盐、衍生物或前药。抗病毒核苷，特别是化合物B和化合物B的药学上可接受的盐、衍生物、互变异构体、异构体和前药，可以用于抗病毒治疗的治疗组合中。
制备抗病毒核苷的方法
本公开提供了制备化合物B及其药学上可接受的盐、衍生物、互变异构体、异构体和前药的方法：
在实施方式中，本公开的方法可以在单一容器中作为“一锅”法进行，或者这些步骤可以顺序进行。在实施方式中，可以任选地分离中间产物。
本公开的方法的第一实施方式包括使5'-异丁酰尿苷与至少一种羟胺源在至少一种激活剂存在下反应以产生化合物B：
在这个第一实施方式的第一个方面中，至少一种羟胺源选自硫酸羟胺、盐酸羟胺、NH2OH及其混合物。在这个第一方面的情况中，至少一种羟胺源是硫酸羟胺。在这个方面的具体情况下，至少一种羟胺源以相对于5'-异丁酰尿苷的量在约1.0至约2.5当量羟胺范围内的量提供，如在约2.2至约2.5当量范围内的量，或约2.5当量的量。
在这第一实施方式的第二个方面中，至少一种激活剂是六甲基二硅氮烷。在该方面的情况中，相对于5'-异丁酰尿苷的量，以约6.0至约8.0当量范围内的量，如约8当量的量提供至少一种激活剂。
在这第一实施方式的第三个方面中，反应在至少一种酸性添加剂的存在下进行。在这第三个方面的情况中，至少一种酸性添加剂选自硫酸氢铵、磷酸二氢铵、硫酸、硫酸氢钠、硫酸氢钾、咪唑硫酸氢盐、三乙胺硫酸氢盐、N-甲基吗啉硫酸氢盐、N-甲基咪唑硫酸氢盐、三氧化硫吡啶复合物、三氟甲磺酸、甲磺酸及其混合物。在具体情况下，至少一种酸性添加剂是硫酸氢铵。在特定情况下，至少一种酸性添加剂相对于5'-异丁酰尿苷的量以约1.5至约3.0当量范围内的量存在。
在这第一实施方式的第四个方面中，反应任选在至少一种催化剂的存在下进行。在该方面的情况中，至少一种催化剂选自路易斯碱催化剂。在这些情况下，至少一种催化剂选自N-甲基咪唑、N-甲基吗啉、1,2,4-三唑、5-(乙硫基)-1H-四唑、咪唑及其混合物。在具体情况下，至少一种催化剂是咪唑。在具体情况下，相对于5'-异丁酰尿苷的量，至少一种催化剂以约0.2至约0.5当量范围内的量存在。
在这第一实施方式的第五个方面中，反应在至少一种溶剂的存在下进行。在该方面的情况中，至少一种溶剂选自水、有机溶剂及其混合物。在这个方面的特定情况下，至少一种溶剂是选自庚烷、甲苯、2-甲基四氢呋喃、四氢呋喃、DME、环丁砜及其混合物的至少一种有机溶剂。在其他具体情况下，至少一种溶剂选自水和有机溶剂的混合物。在这些情况的特定情况中，至少一种溶剂选自水和至少一种有机溶剂的混合物，所述有机溶剂选自庚烷、甲苯、2-甲基四氢呋喃、四氢呋喃、DME、环丁砜及其混合物。
在本公开的方法的第二实施方式中，第一实施方式的方法包括使5-异丁酰基核糖与尿嘧啶在至少一种酶的存在下反应以形成5'-异丁酰尿苷：
在这第二实施方式的第一个方面中，相对于5'-异丁酰基核糖的量，尿嘧啶以约0.5至约1.2当量的量提供，如约0.8当量的量。
在这第二实施方式的第二个方面中，至少一种酶(或者“一种酶”或“多种酶”)选自至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶(或者称为“多种S-甲基-5-硫代核糖激酶”)、至少一种乙酸激酶(或者称为“多种乙酸激酶”)、至少一种丙酮酸氧化酶(或者称为“多种丙酮酸氧化酶”)、至少一种过氧化氢酶(或者称为“多种过氧化氢酶”)、至少一种尿苷磷酸化酶(或者称为“多种尿苷磷酸化酶”)及其混合物。在这第二方面的情况下，至少一种酶选自S-甲基-5-硫代核糖激酶、乙酸激酶、丙酮酸氧化酶、过氧化氢酶和尿苷磷酸化酶，及其混合物。
在这第二实施方式的第二个方面的第一种情况下，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是选自野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶和从商购的野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶定向进化产生的S-甲基-5-硫代核糖激酶的一种或多种S-甲基-5-硫代核糖激酶。在具体情况下，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶选自从商购的野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶定向进化产生的S-甲基-5-硫代核糖激酶，所述野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶具有如下SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。
MSQYHTFTAHDAVAYAQQFAGIDNPSELVSAQEVGDGNLNLVFKVFDRQGVSRAIVKQALPYVRCVGESWPLTLDRARLEAQTLVAHYQHSPQHTVKIHHFDPELAVMVMEDLSDHRIWRGELIANVYYPQAARQLGDYLAQVLFHTSDFYLHPHEKKAQVAQFINPAMCEITEDLFFNDPYQIHERNNYPAELEADVAALRDDAQLKLAVAALKHRFFAHAEALLHGDIHSGSIFVAEGSLKAIDAEFGYFGPIGFDIGTAIGNLLLNYCGLPGQLGIRDAAAAREQRLNDIHQLWTTFAERFQALAAEKTRDAALAYPGYASAFLKKVWADAVGFCGSELIRRSVGLSHVADIDTIQDDAMRHECLRHAITLGRALIVLAERIDSVDELLARVRQYS(SEQ ID NO:1)
在一些情况下，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是具有如上文SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶。在特定的情况中，野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由以下SEQ IDNO:2所示的DNA序列编码。
ATGAGCCAGTATCATACCTTCACCGCGCATGATGCGGTGGCGTATGCGCAGCAATTTGCGGGCATTGATAACCCGAGCGAGCTGGTTAGCGCGCAAGAAGTTGGTGACGGCAACCTGAACCTGGTGTTCAAGGTTTTTGATCGTCAGGGTGTGAGCCGTGCGATCGTTAAACAAGCGCTGCCGTACGTGCGTTGCGTTGGTGAAAGCTGGCCGCTGACCCTGGACCGTGCGCGTCTGGAAGCGCAGACCCTGGTGGCGCACTATCAGCACAGCCCGCAACACACCGTTAAGATCCACCACTTCGATCCGGAGCTGGCGGTGATGGTTATGGAAGACCTGAGCGATCACCGTATTTGGCGTGGTGAGCTGATCGCGAACGTGTACTATCCGCAGGCGGCGCGTCAACTGGGTGACTACCTGGCGCAGGTTCTGTTCCACACCAGCGATTTTTATCTGCACCCGCACGAGAAGAAAGCGCAGGTGGCGCAATTCATTAACCCGGCGATGTGCGAGATCACCGAAGACCTGTTCTTTAACGATCCGTACCAGATTCACGAACGTAACAACTATCCGGCGGAGCTGGAAGCGGATGTGGCGGCGCTGCGTGATGATGCGCAACTGAAGCTGGCGGTTGCGGCGCTGAAACACCGTTTCTTTGCGCATGCGGAGGCGCTGCTGCATGGTGACATTCACAGCGGCAGCATCTTCGTTGCGGAGGGTAGCCTGAAGGCGATCGACGCGGAATTCGGTTACTTTGGCCCGATCGGTTTTGATATTGGTACCGCGATCGGCAACCTGCTGCTGAACTATTGCGGTCTGCCGGGTCAACTGGGTATTCGTGATGCGGCGGCGGCGCGTGAACAGCGTCTGAACGATATCCACCAACTGTGGACCACCTTCGCGGAGCGTTTTCAAGCGCTGGCGGCGGAAAAGACCCGTGACGCGGCGCTGGCGTACCCGGGTTATGCGAGCGCGTTCCTGAAGAAAGTGTGGGCGGATGCGGTTGGTTTTTGCGGCAGCGAGCTGATTCGTCGTAGCGTGGGCCTGAGCCACGTTGCGGACATCGATACCATTCAGGACGATGCGATGCGTCACGAATGCCTGCGTCACGCGATCACCCTGGGTCGTGCGCTGATTGTTCTGGCGGAGCGTATCGACAGCGTGGATGAACTGCTGGCGCGTGTTCGTCAATACAGCTAA(SEQ IDNO:2)在这第一种情况的具体情况中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶包含如下SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列。
MSQYHTFTAHDAVAYAQQFAGIDNPSELVSAQEVGDGNLNLVFKVFDRQGVSRAIVKQALPYVRCVGESWPLTLDRARHEAQTLVAHYQHSPQHTVKIHHFDPELAVMVMEDLSDHRIWRGELIANVYYPQAARQLGDYLAQVLFHTSDFYLHPHEKKAQVAQFINPAMCEITEDLFFNDPYQIHERNNYPAELEADVAALRDDAQLKLAVAALKHRFFAHAEALLHGDIHSGSIFVAEGSLKAIDAEFGYFGPIGFDIGTAIGNLLLNYCGLPGQLGIRDAAAAREQRLNDIHQLWTTFAERFQALAAEKTRDAALAYPGYASAFLKKVWADAVGFCGSELIRRSVGLSHVADIDTIQDDAMRHECLRHAITLGRALIVLAERIDSVDELLARVRQYSLEHHHHHH(SEQ ID NO:3)
在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如下SEQ ID NO:4所示的DNA序列编码。
ATGAGCCAGTATCATACCTTCACCGCGCATGATGCGGTGGCGTATGCGCAGCAATTTGCGGGCATTGATAACCCGAGCGAGCTGGTTAGCGCGCAAGAAGTTGGTGACGGCAACCTGAACCTGGTGTTCAAGGTTTTTGATCGTCAGGGTGTGAGCCGTGCGATCGTTAAACAAGCGCTGCCGTACGTGCGTTGCGTTGGTGAAAGCTGGCCGCTGACCCTGGACCGTGCGCGTCATGAAGCGCAGACCCTGGTGGCGCACTATCAGCACAGCCCGCAACACACCGTTAAGATCCACCACTTCGATCCGGAGCTGGCGGTGATGGTTATGGAAGACCTGAGCGATCACCGTATTTGGCGTGGTGAGCTGATCGCGAACGTGTACTATCCGCAGGCGGCGCGTCAACTGGGTGACTACCTGGCGCAGGTTCTGTTCCACACCAGCGATTTTTATCTGCACCCGCACGAGAAGAAAGCGCAGGTGGCGCAATTCATTAACCCGGCGATGTGCGAGATCACCGAAGACCTGTTCTTTAACGATCCGTACCAGATTCACGAACGTAACAACTATCCGGCGGAGCTGGAAGCGGATGTGGCGGCGCTGCGTGATGATGCGCAACTGAAGCTGGCGGTTGCGGCGCTGAAACACCGTTTCTTTGCGCATGCGGAGGCGCTGCTGCATGGTGACATTCACAGCGGCAGCATCTTCGTTGCGGAGGGTAGCCTGAAGGCGATCGACGCGGAATTCGGTTACTTTGGCCCGATCGGTTTTGATATTGGTACCGCGATCGGCAACCTGCTGCTGAACTATTGCGGTCTGCCGGGTCAACTGGGTATTCGTGATGCGGCGGCGGCGCGTGAACAGCGTCTGAACGATATCCACCAACTGTGGACCACCTTCGCGGAGCGTTTTCAAGCGCTGGCGGCGGAAAAGACCCGTGACGCGGCGCTGGCGTACCCGGGTTATGCGAGCGCGTTCCTGAAGAAAGTGTGGGCGGATGCGGTTGGTTTTTGCGGCAGCGAGCTGATTCGTCGTAGCGTGGGCCTGAGCCACGTTGCGGACATCGATACCATTCAGGACGATGCGATGCGTCACGAATGCCTGCGTCACGCGATCACCCTGGGTCGTGCGCTGATTGTTCTGGCGGAGCGTATCGACAGCGTGGATGAACTGCTGGCGCGTGTTCGTCAATACAGCCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA(SEQ ID NO:4)
在这第一种情况的具体情况中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶包含以下SEQID NO:5所示的氨基酸序列。
MSQYHTFTAHDAVAYAQQFAGIDNPSELVSAQEVGDGNLNLVFKVFDRQGVSRAIVKQALPYPRCVGESWPLTLDRARHEAQTLVAHYQHSPQHTVKIHHFDPELAVMVMEDLSDHRIWRGELIANVYYPQAARQLGDYLAQVLFHTSDFYLHPHEKKAQVAQFINPAMCEISEDLIFNDPYQIHERNNYPAELEADVAALRDDAQLKLAVAALKHRFFAHAEALLHGDLHSGSIFVAEGSLKAIDAEFGYFGPIGFDIGTAIGNLLLNYCGLPGQLGIRDAAAAREQRLNDIHQLWTTFAERFQALAAEKTRDAALAYPGYASAFLKKVWADAVGFCGSELIRRSVGLSHVADIDTIQDDAMRHECLRHAITLGRALIVLAERIDSVDELLARVRQYSLEHHHHHH(SEQ ID NO:5)
在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如下SEQ ID NO:6所示的DNA序列编码。
ATGAGCCAGTATCATACCTTCACCGCGCATGATGCGGTGGCGTATGCGCAGCAATTTGCGGGCATTGATAACCCGAGCGAGCTGGTTAGCGCGCAAGAAGTTGGTGACGGCAACCTGAACCTGGTGTTCAAGGTTTTTGATCGTCAGGGTGTGAGCCGTGCGATCGTTAAACAAGCGCTGCCGTACCCCCGTTGCGTTGGTGAAAGCTGGCCGCTGACCCTGGACCGTGCGCGTCATGAAGCGCAGACCCTGGTGGCGCACTATCAGCACAGCCCGCAACACACCGTTAAGATCCACCACTTCGATCCGGAGCTGGCGGTGATGGTTATGGAAGACCTGAGCGATCACCGTATTTGGCGTGGTGAGCTGATCGCGAACGTGTACTATCCGCAGGCGGCGCGTCAACTGGGTGACTACCTGGCGCAGGTTCTGTTCCACACCAGCGATTTTTATCTGCACCCGCACGAGAAGAAAGCGCAGGTGGCGCAATTCATTAACCCGGCGATGTGCGAGATCAGCGAAGACCTGATTTTTAACGATCCGTACCAGATTCACGAACGTAACAACTATCCGGCGGAGCTGGAAGCGGATGTGGCGGCGCTGCGTGATGATGCGCAACTGAAGCTGGCGGTTGCGGCGCTGAAACACCGTTTCTTTGCGCATGCGGAGGCGCTGCTGCATGGTGACCTTCACAGCGGCAGCATCTTCGTTGCGGAGGGTAGCCTGAAGGCGATCGACGCGGAATTCGGTTACTTTGGCCCGATCGGTTTTGATATTGGTACCGCGATCGGCAACCTGCTGCTGAACTATTGCGGTCTGCCGGGTCAACTGGGTATTCGTGATGCGGCGGCGGCGCGTGAACAGCGTCTGAACGATATCCACCAACTGTGGACCACCTTCGCGGAGCGTTTTCAAGCGCTGGCGGCGGAAAAGACCCGTGACGCGGCGCTGGCGTACCCGGGTTATGCGAGCGCGTTCCTGAAGAAAGTGTGGGCGGATGCGGTTGGTTTTTGCGGCAGCGAGCTGATTCGTCGTAGCGTGGGCCTGAGCCACGTTGCGGACATCGATACCATTCAGGACGATGCGATGCGTCACGAATGCCTGCGTCACGCGATCACCCTGGGTCGTGCGCTGATTGTTCTGGCGGAGCGTATCGACAGCGTGGATGAACTGCTGGCGCGTGTTCGTCAATACAGCCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA(SEQ ID NO:6)
在这种情况的特定出现中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶包含以下SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列。
MSQYHTFTADDAVAYAQQFAGIDNPSELVSAQEVGDGNLNLVFKVFDRQGVSRAIVKQALPYPRRVGPSWPLTLDRARHEAQTLVAHYQHSPQHTVKIHHFDPELAVMVMEDLSDHRIWRGELIANVYYPQAARQLGDYLAQVLFHTSDFYLHPHEKKAQVAQFINPAMCEISEDLVFNDPYQIHERNNYPAELEADVAALRDDAQLKLAVAALKHRFFAHAEALLHGDLHTGSIFVAEGSLKVIDAEFGYFGPIGFDIGTAIGNLLLNYCGLPGQLGIRDAAAAREQRLNDIHQLWTTFAERFQALAAEKTRDAALAYPGYASAFLKKVWADAVGFCGSELIRRSVGLAHVADIDTIQDDAMRHECLREAITLGRALIVLAERIDSVDELLARVRQYSLEHHHHHH(SEQ ID NO:7)
在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如下SEQ ID NO:8所示的DNA序列编码。
ATGAGCCAGTATCATACCTTCACCGCGGATGATGCGGTGGCGTATGCGCAGCAATTTGCGGGCATTGATAACCCGAGCGAGCTGGTTAGCGCGCAAGAAGTTGGTGACGGCAACCTGAACCTGGTGTTCAAGGTTTTTGATCGTCAGGGTGTGAGCCGTGCGATCGTTAAACAAGCGCTGCCGTACCCCCGTCGCGTTGGTCCGAGCTGGCCGCTGACCCTGGACCGTGCCCGTCATGAAGCGCAGACCCTGGTTGCGCACTATCAGCACAGCCCGCAACACACCGTTAAGATCCACCACTTCGATCCGGAGCTGGCGGTGATGGTTATGGAAGACCTGAGCGATCACCGTATTTGGCGTGGTGAGCTGATCGCGAACGTGTACTATCCGCAGGCGGCGCGTCAACTGGGTGACTACCTGGCGCAGGTTCTGTTCCACACCAGCGATTTTTATCTGCACCCGCACGAGAAGAAAGCGCAGGTGGCGCAATTCATTAACCCGGCCATGTGCGAAATCAGCGAAGACCTGGTGTTTAACGATCCGTACCAGATTCACGAACGTAACAACTATCCGGCGGAGCTGGAAGCGGATGTGGCGGCGCTGCGTGATGATGCGCAACTGAAGCTGGCGGTTGCGGCGCTGAAACACCGTTTCTTTGCGCATGCGGAGGCGCTGCTGCATGGTGACCTTCACACCGGCAGCATCTTCGTTGCGGAGGGTAGCCTGAAGGTGATCGACGCGGAATTCGGTTACTTTGGCCCGATCGGTTTTGATATTGGTACCGCGATCGGCAACCTGCTGCTGAACTATTGCGGTCTGCCGGGTCAACTGGGTATTCGTGATGCGGCGGCGGCGCGTGAACAGCGTCTGAACGATATCCACCAACTGTGGACCACCTTCGCGGAGCGTTTTCAAGCGCTGGCGGCGGAAAAGACCCGTGACGCGGCGCTGGCGTACCCGGGTTATGCGAGCGCGTTCCTGAAGAAAGTGTGGGCGGATGCGGTTGGTTTTTGCGGCAGCGAGCTGATTCGTCGTAGCGTGGGCCTGGCGCACGTTGCGGACATCGATACCATTCAGGACGATGCGATGCGTCACGAATGCCTGCGTGAAGCGATCACCCTGGGTCGTGCGCTGATTGTTCTGGCGGAGCGCATCGACAGCGTGGATGAACTGCTGGCGCGTGTTCGTCAATACAGCCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA(SEQ ID NO:8)
在这第一种情况的具体出现中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶包含如下SEQID NO:9所示的氨基酸序列。
MSQYHTFTADDAVAYAQQFAGIDNPSELVSAQEVGDGNLNLVFKVFDRQGVSRAIVKQALPYPRAVGPSWPLTLDRARHEAQTLVAHYQHSPQHTVKIHHFDPELAVMVMEDLSDHRIWRGELIANVYYPQAARQLGDYLAQVLFHTSDFYLHPHEKKAQVAQFINPGMCEISEDLSFNDPYQIHERNNYPAELEADVAALRDDAQLKLAVAALKHRFFAHAEALLHGDLHSGSIFVAEGSLKVIDAEFGYFGPIGFDIGTAIGNLLLNYCGLPGQLGIRDAAAAREQRLNDIHQLWTTFAERFQALAAEKTRDAALAYPGYASAFLKKVWADAVGFCGSELIRRSVGLSHVADIDTIQDDAMRHECLRHAITLGRALIVLAETIDSVDELLARVRQYSLEHHHHHH(SEQ ID NO:9)
在这种情况的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如下SEQ ID NO:10所示的DNA序列编码。
ATGAGCCAGTATCATACCTTCACCGCGGATGATGCGGTGGCGTATGCGCAGCAATTTGCGGGCATTGATAACCCGAGCGAGCTGGTTAGCGCGCAAGAAGTTGGTGACGGCAACCTGAACCTGGTGTTCAAGGTTTTTGATCGTCAGGGTGTGAGCCGTGCGATCGTTAAACAAGCGCTGCCGTACCCCCGTGCGGTTGGTCCGAGCTGGCCGCTGACCCTGGACCGTGCGCGTCATGAAGCGCAGACCCTGGTGGCGCACTATCAGCACAGCCCGCAACACACCGTTAAGATCCACCACTTCGATCCGGAGCTGGCGGTGATGGTTATGGAAGACCTGAGCGATCACCGTATTTGGCGTGGTGAGCTGATCGCGAACGTGTACTATCCGCAGGCGGCGCGTCAACTGGGTGACTACCTGGCGCAGGTTCTGTTCCACACCAGCGATTTTTATCTGCACCCGCACGAGAAGAAAGCGCAGGTGGCGCAATTCATTAACCCGGGCATGTGCGAAATCAGCGAAGACCTGAGCTTTAACGATCCGTACCAGATTCACGAACGTAACAACTATCCGGCGGAGCTGGAAGCGGATGTGGCGGCGCTGCGTGATGATGCGCAACTGAAGCTGGCGGTTGCGGCGCTGAAACACCGTTTCTTTGCGCATGCGGAGGCGCTGCTGCATGGTGACCTTCACAGCGGCAGCATCTTCGTTGCGGAGGGTAGCCTGAAGGTGATCGACGCGGAATTCGGTTACTTTGGCCCGATCGGTTTTGATATTGGTACCGCGATCGGCAACCTGCTGCTGAACTATTGCGGTCTGCCGGGTCAACTGGGTATTCGTGATGCGGCGGCGGCGCGTGAACAGCGTCTGAACGATATCCACCAACTGTGGACCACCTTCGCGGAGCGTTTTCAAGCGCTGGCGGCGGAAAAGACCCGTGACGCGGCGCTGGCGTACCCGGGTTATGCGAGCGCGTTCCTGAAGAAAGTGTGGGCGGATGCGGTTGGTTTTTGCGGCAGCGAGCTGATTCGTCGTAGCGTGGGCCTGTCGCACGTTGCGGACATCGATACCATTCAGGACGATGCGATGCGTCACGAATGCCTGCGTCACGCGATCACCCTGGGTCGTGCGCTGATTGTTCTGGCGGAGACCATCGACAGCGTGGATGAACTGCTGGCGCGTGTTCGTCAATACAGCCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA(SEQ ID NO:10)。
在这第一种情况的具体情况中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶包含以下SEQID NO:11所示的氨基酸序列。
MSQYHTFTADDAVAYAQQFAGIDNPSELVSAQEVGDGNLNLVFKVFDRQGVSRAIVKQALPYPRRVGPSWPLTLDRARHEAQTLVAHYQHSPQHTVKIFHFDPELAVMVMEDLSDHRIWRGELIANVYYPQAARQLGDYLAQVLFHTSDFYLHPHEKKRQVAQFINPAMCGISEDLVFNDPYQIHERNNYPAELEAQVAALRDDAQLKLAVAALKHRFFAHAEALLHGDLHTGSIFVKEGSLKVIDAEFGYFGPIGFDIGTAIGNLLLNYCGLPGQLGIRDAAAAREQRLNDIHQLWTTFAERFQALAAEKTRDAALAYPGYASAFLKKVWADAVGFCGSELIRRSVGLAHVADIDTIQDDAMRHECLREAITLGRALIVLAERIDSVDELLARVRQYSLEHHHHHH(SEQ ID NO:11)
在这第一种情况的具体情况中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶包含如下SEQID NO:12所示的氨基酸序列。
MSQYHTFTADDAVAYAQQFAGIDNPSELVSAQEVGDGNLNLVFKVFDRQGVSRSIVKQALPYPRRVGPSWPLTLDRARHEAQTLVAHYQHSPQHTVKIFHFDPELAVMVMEDLSDHRIWRGELIANVYYPQAARQLGDYLAQVLFHTSDFYLHPHEKKRQVAQFINPAMCGISEDLVFNDPYQIHERNNYPAELEAQVAALRDDAQLKLAVAALKHRFFAHAEALLHGDLHTGSIFVKEGSLKVIDAEFGYFGPIGFDIGTAIGNLLLNYCGLPGQLGIRDAAAAREQRLNDIHQLWTTFAERFQALAAEKTRDAALRYPGYASAFLKKVWADAVGFCGSELIRRSVGLAHVADIDTIQDDAMRHECLREAITLGRALIVLAERIDSVDELLARVRQYSLEHHHHHH(SEQ ID NO:12)
在这第一种情况的具体出现中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶包含以下SEQID NO:13所示的氨基酸序列。
MGVTKTPLYETLNESSAVALAVKLGLFPSKSTLTCQEIGDGNLNYVFHIYDQEHDRALIIKQAVPYAKVVGESWPLTIDRARIESSALIRQGEHVPHLVPRVFYSDTEMAVTVMEDLSHLKIARKGLIEGENYPHLSQHIGEFLGKTLFYSSDYALEPKVKKQLVKQFTNPELCDITERLVFTDPFFDHDTNDFEEELRPFVEKLWNNDSVKIEAAKLKKSFLTSAETLIHGDLHTGSIFASEHETKVIDPEFAFYGPIGFDVGQFIANLFLNALSRDGADREPLYEHVNQVWETFEETFSEAWQKDSLDVYANIDGYLTDTLSHIFEEAIGFAGCELIRRTIGLAHVADLDTIVPFDKRIGRKRLALETGTAFIEKRSEFKTITDVIELFKLLVKE(SEQ ID NO:13)
在一些情况下，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是基于SEQ IDNO:1、3、5、7、9、11、12或13的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶，并且可包含与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、12或13的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换，或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是由SEQ ID NO:2、4、6、8或10的DNA序列编码的S-甲基-5-硫代核糖激酶，并且可包含与SEQ ID NO:2、4、6、8或10的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第二实施方式的第二方面的第二情况中，至少一种乙酸激酶是选自野生型乙酸激酶和从商购的野生型乙酸激酶定向进化产生的乙酸激酶的一种或多种乙酸激酶。在具体情况下，至少一种乙酸激酶选自从商购的野生型乙酸激酶定向进化产生的乙酸激酶，所述野生型乙酸激酶具有如下SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
MRVLVINSGSSSIKYQLIEMEGEKVLCKGIAERIGIEGSRLVHRVGDEKHVIERELPDHEEALKLILNTLVDEKLGVIKDLKEIDAVGHRVVHGGERFKESVLVDEEVLKAIEEVSPLAPLHNPANLMGIKAAMKLLPGVPNVAVFDTAFHQTIPQKAYLYAIPYEYYEKYKIRRYGFHGTSHRYVSKRAAEILGKKLEELKIITCHIGNGASVAAVKYGKCVDTSMGFTPLEGLVMGTRSGDLDPAIPFFIMEKEGISPQEMYDILNKKSGVYGLSKGFSSDMRDIEEAALKGDEWCKLVLEIYDYRIAKYIGAYAAAMNGVDAIVFTAGVGENSPITREDVCSYLEFLGVKLDKQKNEETIRGKEGIISTPDSRVKVLVVPTNEELMIARDTKEIVEKIGR(SEQ IDNO:14)
在所述情况中，至少一种乙酸激酶是具有如上SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的野生型乙酸激酶。在这种情况的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的野生型乙酸激酶可以由以下SEQ ID NO:15所示的DNA序列编码。
ATGCGTGTTCTGGTTATTAATAGCGGTAGCAGCAGCATTAAATATCAGCTGATTGAAATGGAAGGTGAAAAAGTTCTGTGTAAAGGTATTGCAGAACGTATTGGTATTGAAGGTAGCCGTCTGGTTCATCGTGTTGGTGATGAAAAACATGTTATTGAACGTGAACTGCCGGATCATGAAGAAGCACTGAAACTGATTCTGAATACCCTGGTTGATGAAAAACTGGGTGTTATTAAAGATCTGAAAGAAATTGACGCAGTTGGTCATCGTGTTGTTCATGGTGGTGAACGTTTTAAAGAAAGCGTTCTGGTTGATGAAGAAGTTCTGAAAGCAATTGAAGAAGTTAGCCCGCTGGCACCGCTGCATAATCCGGCAAATCTGATGGGTATTAAAGCAGCAATGAAACTGCTGCCGGGTGTTCCGAATGTTGCAGTTTTTGATACCGCATTTCATCAGACCATTCCGCAGAAAGCATATCTGTATGCAATTCCGTATGAATATTACGAAAAATACAAAATTCGTCGCTACGGTTTTCATGGTACCAGCCATCGTTATGTTAGCAAACGTGCAGCAGAAATTCTGGGTAAAAAACTGGAAGAACTGAAAATTATCACCTGTCATATTGGTAATGGTGCAAGCGTTGCAGCAGTTAAATATGGTAAATGTGTTGATACCAGCATGGGTTTTACCCCGCTGGAAGGTCTGGTTATGGGTACCCGTAGCGGTGATCTGGATCCGGCAATTCCGTTTTTTATTATGGAAAAAGAGGGTATTAGCCCGCAGGAAATGTATGATATTCTGAATAAAAAAAGCGGCGTTTATGGTCTGAGCAAAGGTTTTAGCAGCGATATGCGTGATATTGAAGAAGCAGCACTGAAAGGTGATGAATGGTGTAAACTGGTTCTGGAAATTTATGATTACCGTATTGCAAAATACATCGGTGCATACGCTGCAGCAATGAATGGTGTTGATGCAATTGTTTTTACCGCAGGTGTTGGTGAAAATAGCCCGATTACCCGTGAAGATGTTTGTAGCTATCTGGAATTTCTGGGTGTTAAACTGGATAAACAGAAAAATGAAGAGACCATTCGTGGTAAAGAAGGTATTATTAGCACCCCGGATAGCCGTGTTAAAGTTCTGGTTGTTCCGACCAATGAAGAACTGATGATTGCACGTGATACCAAAGAAATTGTTGAAAAAATCGGTCGTTAA(SEQ IDNO:15)
在这第二种情况的特定情况中，至少一种乙酸激酶包含如下SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
MGSHHHHHHGSRVLNINSGSSSIKYQLIEMEGEKVLCKGIAERIGIEGSRLVHRVGDEKHVIERELPDHEEALKLILNTLVDEKLGVIKDLKEIDAVGHRVVHGGERFKESVLVDEEVLKAIEEVSPLAPLHNPANLMGIKAAMKLLPGVPNVQVFDTAFHQTIPQKAYLYAIPYEYYEKYKIRRYGFHGISHRYVSKRAAEILGKKLEELKIITCHIGNGASVAAVKYGKCVDTSMGFTPLEGLVMGTRSGDLDPAIPFFIMEKEGISPQEMYDILNKKSGVYGLSKGFSSDMRDNFEAALKGDEWCKLVLEIYDYRIAKYIGAYAAAMNGVDAIVFTAGVGENSPITREDVCKYLEFLGVKLDKQKNEETILGKEGIISTPDSRVKVLVVPTNEELMIARDTKEIVEKIGR(SEQ ID NO:16)
在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的乙酸激酶可以由如下SEQ ID NO:17所示的DNA序列编码。
ATGGGTAGCCATCATCATCATCATCACGGTAGCCGTGTTCTGAATATCAATAGCGGTAGCAGCAGCATTAAATATCAGCTGATTGAAATGGAAGGTGAAAAAGTTCTGTGTAAAGGTATTGCAGAACGTATTGGTATTGAAGGTAGCCGTCTGGTTCATCGTGTTGGTGATGAAAAACATGTTATTGAACGTGAACTGCCGGATCATGAAGAAGCACTGAAACTGATTCTGAATACCCTGGTTGATGAAAAACTGGGTGTTATTAAAGATCTGAAAGAAATTGACGCAGTTGGTCATCGTGTTGTTCATGGTGGTGAACGTTTTAAAGAAAGCGTTCTGGTTGATGAAGAAGTTCTGAAAGCAATTGAAGAAGTTAGCCCGCTGGCACCGCTGCATAATCCGGCAAATCTGATGGGTATTAAAGCAGCAATGAAACTGCTGCCGGGTGTTCCGAATGTTCAAGTTTTTGATACCGCATTTCATCAGACCATTCCGCAGAAAGCATATCTGTATGCAATTCCGTATGAATATTACGAAAAATACAAAATTCGTCGCTACGGTTTTCATGGTATCAGCCATCGTTATGTTAGCAAACGTGCAGCAGAAATTCTGGGTAAAAAACTGGAAGAACTGAAAATTATCACCTGTCATATTGGTAATGGTGCAAGCGTTGCAGCAGTTAAATATGGTAAATGTGTTGATACCAGCATGGGTTTTACCCCGCTGGAAGGTCTGGTTATGGGTACCCGTAGCGGTGATCTGGATCCGGCAATTCCGTTTTTTATTATGGAAAAAGAGGGTATTAGCCCGCAGGAAATGTATGATATTCTGAATAAAAAAAGCGGCGTTTATGGTCTGAGCAAAGGTTTTAGCAGCGATATGCGTGATAATTTTGAAGCAGCACTGAAAGGTGATGAATGGTGTAAACTGGTTCTGGAAATTTATGACTACCGTATTGCAAAATACATCGGTGCATACGCTGCAGCAATGAATGGTGTTGATGCAATTGTTTTTACCGCAGGTGTTGGTGAAAATAGCCCGATCACCCGTGAAGATGTTTGTAAGTATCTGGAATTTCTGGGTGTTAAACTGGATAAACAGAAAAATGAAGAGACTATTCTGGGTAAAGAAGGTATTATTAGCACCCCGGATAGCCGTGTTAAAGTTCTGGTTGTTCCGACCAATGAAGAACTGATGATTGCACGTGATACCAAAGAAATTGTTGAAAAAATCGGTCGTTAA(SEQ ID NO:17)
在这第二种情况的一些情况下，至少一种乙酸激酶是基于SEQ ID NO:14或16的氨基酸序列的乙酸激酶，并且可以包含与SEQ IDNO:14或16的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第二种情况的一些情况下，至少一种乙酸激酶是由SEQ IDNO:15或17的DNA序列编码的乙酸激酶，并且可包含与SEQ IDNO:15或17的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第二实施方式的第二方面的第三情况中，至少一种丙酮酸氧化酶是选自野生型丙酮酸氧化酶和从野生型丙酮酸氧化酶定向进化产生的丙酮酸氧化酶的一种或多种丙酮酸氧化酶。在具体情况下，至少一种丙酮酸氧化酶是具有如下SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的野生型丙酮酸氧化酶。
MSDNKINIGLAVMKILESWGADTIYGIPSGTLSSLMDAMGEEENNVKFLQVKHEEVGAMAAVMQSKFGGNLGVTVGSGGPGASHLINGLYDAAMDNIPVVAILGSRPQRELNMDAFQELNQNPMYDHIAVYNRRVAYAEQLPKLVDEAARMAIAKRGVAVLEVPGDFAKVEIDNDQWYSSANSLRKYEPIAPAAQDIDAAVELLNNSKRPVIYAGIGTMGHGPAVQELARKIKAPVITTGKNFETFEWDFEALTGSTYRVGWKPANETILEADTVLFAGSNFPFSEVEGTFRNVDNFIQIDIDPAMLGKRHHADVAILGDAGLAIDEILNKVDAVEESAWWTANLKNIANWREYINMLETKEEGDLQFYQVYNAINNHADEDAIYSIDVGNSTQTSIRHLHMTPKNMWRTSPLFATMGIAIPGGLGAKNTYPDRQVWNIIGDGAFSMTYPDVVTNVRYNMPVINVVFSNTEYAFIKNKYEDTNKNLFGVDFTDVDYAKIAEAQGAKGFTVSRIEDMDRVMAEAVAANKAGHTVVIDCKITQDRPIPVETLKLDSKLYSEDEIKAYKERYEAANLVPFREYLEAEGLESKYIK(SEQ IDNO:18)
在具体情况下，包含如上SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的野生型丙酮酸氧化酶可以由如下SEQ ID NO:19所示的DNA序列编码。
ATGAGTGATAATAAAATCAACATCGGTCTGGCGGTGATGAAAATTCTGGAAAGTTGGGGCGCAGATACCATTTATGGCATTCCGAGCGGCACCCTGAGTAGCTTAATGGATGCCATGGGTGAAGAAGAAAACAATGTTAAGTTCCTGCAGGTGAAGCATGAAGAAGTGGGCGCAATGGCAGCCGTTATGCAGAGTAAATTTGGCGGTAATCTGGGTGTGACCGTTGGTAGTGGCGGTCCTGGTGCAAGTCATCTGATTAATGGCCTGTATGATGCCGCAATGGATAATATTCCGGTTGTGGCAATTCTGGGTAGCCGTCCTCAGCGTGAACTGAATATGGATGCATTTCAGGAACTGAACCAGAATCCGATGTATGATCATATCGCCGTTTACAATCGCCGTGTGGCCTATGCAGAACAGCTGCCTAAACTGGTGGATGAAGCCGCCCGTATGGCCATTGCTAAACGCGGTGTGGC
AGTTCTGGAAGTTCCGGGTGATTTTGCAAAAGTGGAAATTGATA
ACGACCAGTGGTACAGTAGCGCAAATAGCCTGCGCAAATATGA
ACCGATTGCCCCGGCAGCACAGGATATTGATGCAGCTGTGGAA
CTGCTGAATAATAGTAAACGCCCGGTGATTTACGCAGGTATTGG
TACCATGGGCCATGGCCCTGCAGTTCAAGAACTGGCTCGTAAA
ATTAAGGCACCGGTGATTACCACCGGTAAAAATTTTGAAACCTT
CGAGTGGGACTTCGAAGCCCTGACCGGTTCAACCTATCGTGTGG
GTTGGAAACCGGCAAATGAAACCATTCTGGAAGCCGATACCGT
TCTGTTTGCAGGCAGCAATTTTCCGTTTAGCGAAGTGGAAGGCA
CCTTTCGTAATGTTGATAATTTCATCCAGATCGACATCGACCCG
GCAATGCTGGGTAAACGCCATCATGCAGATGTGGCAATTCTGG
GTGATGCCGGCCTGGCAATTGATGAAATTCTGAATAAGGTGGA
CGCCGTGGAAGAAAGCGCCTGGTGGACCGCAAATCTGAAAAAT
ATTGCAAACTGGCGCGAGTATATCAACATGCTGGAAACCAAAG
AGGAGGGTGATCTGCAGTTTTATCAGGTTTATAACGCGATCAAC
AACCACGCCGATGAAGATGCAATTTATAGCATTGACGTGGGCA
ATAGCACCCAGACCAGCATTCGTCATCTGCACATGACCCCGAA
AAATATGTGGCGCACCAGCCCGCTGTTTGCCACCATGGGTATTG
CAATTCCGGGTGGCCTGGGTGCAAAAAATACCTATCCGGATCG
TCAGGTGTGGAATATTATTGGCGATGGCGCCTTTAGTATGACCT
ATCCGGATGTTGTTACCAATGTTCGCTATAATATGCCGGTTATC
AACGTGGTTTTCAGTAATACCGAGTACGCATTTATCAAGAACAA
GTACGAGGACACCAACAAAAACCTGTTTGGTGTGGATTTCACC
GATGTGGATTATGCCAAAATCGCCGAAGCACAGGGTGCAAAAG
GCTTTACCGTGAGTCGCATTGAAGATATGGATCGTGTTATGGCC
GAAGCCGTGGCCGCAAATAAAGCCGGTCATACCGTTGTGATTG
ATTGTAAAATCACCCAGGACCGTCCGATTCCGGTTGAAACCCTG
AAACTGGATAGCAAACTGTATAGTGAGGACGAAATCAAGGCAT
ATAAGGAACGTTACGAGGCAGCAAATCTGGTGCCGTTTCGTGA
ATATCTGGAAGCCGAAGGTCTGGAAAGCAAATATATTAAGTAA(SEQ ID NO:19)
在这第三种情况的特定出现中，至少一种丙酮酸氧化酶选自具有如下SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的野生型丙酮酸氧化酶：
MTQGKITASAAMLNVLKTWGVDTIYGIPSGTLSSLMDALAEDKDIRFLQVRHEETGALAAVMQAKFGGSIGVAVGSGGPGATHLINGVYDAAMDNTPFLAILGSRPVNELNMDAFQELNQNPMYHGIAVYNKRVAYAEQLPKVIDEACRAAVSKKGPAVVEIPVNFGFQEIDENSYYGSGSYERSFIAPALNEVEIDKAVEILNKAERPVIYAGFGGVKAGEVITELSRKIKAPIITTGKNFEAFEWNYEGLTGSAYRVGWKPANEVVFEADTVLFLGSNFPFAEVYEAFKNTEKFIQVDIDPYKLGKRHALDASILGDAGQAAKAILDKVDAVESTPWWRANVKNNQNWRDYMNKLEGKTEGELQLYQVYNAINKHADQDAIYSIDVGNSTQTSTRHLHMTPKNMWRTSPLFATMGIALPGGIAAKKDNPERQVWNIMGDGAFNMCYPDVITNVQYNLPVINVVFSNAEYAFIKNKYEDTNKHLFGVDFTNADYAKIAEAQGAVGFTVDRIEDIDAVVAEAVKLNKEGKTVVIDARITQHRPLPVEVLELDPKLHSEEAIKAFKEKYEAEELVPFRLFLEEEGLQSRAIK(SEQ IDNO:20)
在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶可以由如下SEQ ID NO:21所示的DNA序列编码。
ATGACCCAGGGTAAAATTACCGCAAGTGCCGCAATGCTGAATGTGCTGAAAACCTGGGGCGTTGATACCATTTATGGTATTCCGAGTGGTACCCTGAGCAGCCTGATGGATGCCTTAGCAGAAGATAAAGATATCCGCTTTCTGCAGGTGCGCCATGAAGAAACCGGCGCATTAGCCGCAGTGATGCAGGCAAAATTTGGTGGCAGCATTGGTGTTGCAGTGGGTAGCGGTGGTCCGGGTGCAACCCACCTGATCAATGGTGTTTATGATGCCGCCATGGATAATACCCCGTTTCTGGCCATTCTGGGTAGTCGCCCTGTGAATGAACTGAATATGGATGCATT
CCAGGAGCTGAATCAGAATCCGATGTATCATGGTATCGCCGTTT
ATAATAAGCGCGTTGCATACGCTGAACAGCTGCCGAAAGTGAT
TGATGAAGCATGCCGTGCAGCCGTGAGCAAAAAAGGCCCTGCA
GTGGTTGAAATTCCGGTTAATTTTGGCTTCCAGGAAATCGATGA
GAACAGTTATTACGGCAGCGGTAGTTATGAACGTAGCTTTATTG
CCCCGGCCCTGAATGAAGTGGAAATTGATAAAGCAGTGGAGAT
CCTGAACAAGGCAGAACGCCCGGTGATTTATGCAGGCTTTGGT
GGCGTGAAAGCAGGTGAAGTGATTACCGAACTGAGCCGCAAAA
TTAAAGCCCCGATTATTACCACCGGCAAAAATTTTGAGGCCTTT
GAATGGAACTACGAGGGACTGACCGGCAGTGCATATCGTGTGG
GTTGGAAACCGGCAAATGAAGTGGTGTTTGAAGCCGATACCGT
GCTGTTTCTGGGTAGCAATTTTCCGTTTGCCGAAGTTTATGAGG
CATTTAAAAACACCGAGAAGTTCATCCAGGTGGATATTGATCC
GTATAAGCTGGGCAAACGTCATGCACTGGATGCAAGTATTCTG
GGTGATGCAGGTCAGGCCGCAAAAGCAATTCTGGATAAAGTTG
ATGCCGTGGAAAGCACCCCGTGGTGGCGTGCAAATGTGAAAAA
TAATCAGAACTGGCGCGACTATATGAACAAACTGGAAGGCAAA
ACCGAGGGTGAACTGCAGCTGTATCAGGTTTATAATGCCATTAA
CAAGCACGCAGACCAGGATGCAATTTATAGTATTGACGTGGGC
AACAGCACCCAGACCAGTACACGTCATCTGCACATGACCCCGA
AAAATATGTGGCGTACCAGCCCGCTGTTTGCAACCATGGGTATT
GCCCTGCCGGGCGGTATTGCTGCAAAAAAAGATAATCCGGAGC
GTCAGGTTTGGAATATTATGGGTGATGGTGCCTTTAACATGTGC
TATCCGGATGTGATTACCAATGTTCAGTACAATCTGCCGGTTAT
TAACGTTGTTTTCAGCAATGCCGAGTACGCATTTATTAAGAACA
AGTACGAGGACACCAACAAGCATCTGTTTGGTGTTGATTTCACC
AACGCCGATTATGCCAAAATTGCCGAAGCACAGGGCGCAGTTG
GTTTTACCGTGGATCGCATTGAAGATATTGACGCAGTGGTTGCC
GAAGCAGTGAAACTGAATAAAGAAGGTAAGACCGTGGTGATTG
ACGCCCGCATTACCCAGCATCGCCCTTTACCTGTGGAAGTGCTG
GAACTGGATCCGAAACTGCATAGTGAAGAAGCAATTAAGGCCT
TTAAGGAGAAGTACGAAGCCGAAGAACTGGTGCCGTTTCGTCT
GTTTCTGGAAGAAGAAGGCCTGCAGAGTCGCGCAATTAAATAA(SEQ ID NO:21)
在这第三种情况的特定情况中，至少一种丙酮酸氧化酶选自具有如下SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的野生型丙酮酸氧化酶：
MSDKKISAGLAALKVMEGWGIDTMYGIPSGTLSGLMNAMGHPENKVKFIQVKHEEIGAMAAVMQYKFGGNIAVTVGSGGPGATHLINGLYDAYMDHIPVLAILGSKPVRELNMDSFQELNQNPMYDHIAVYNRRVATAEQLPHLVDDAIRTAISKRGVAVLEVPADFGFAELDAESIYSTPLYSSGTKYKRYKPVAPEAEEIDEAVEILKASERPVIYAGFGTQGHGDLVEELSRKIKAPVITTGKNFDNFNWDFEALTGSAFRVGWKPANEAVLEADTVLFIGTNFPFSEVEGTFRNVKKFIQIDANPDMLGKRHETDVAILADAGESLKALLAKVEPVADTPWWQANIKNVQNWRDYMNKLEQKTEGPLQAYQVYNAINKLADEDAIFSTDVGDVTQLSTRHLHMNPKQMWRTSPLFATMGIALPGGIGAKNIYPDRQVWNIIGDGAFSMTYPDVVTSVRYDMPMINVIFTNTEYGFIKNKYEDTNEYNFGVDFTDVDYAKVGEAQGAIGLTVNRIEDIDRVMQEAVDYYKQGRVVVVDAKITKDRPIPVETLKLDTNLYSEDVVKAYKEKYEAEALVPFREFLEGEGLKSIYIKEDNDNKFSF(SEQ ID NO:22)
在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶可以由如下SEQ ID NO:23所示的DNA序列编码。
ATGAGTGATAAAAAAATCAGCGCGGGCCTGGCAGCACTGAAAGTTATGGAAGGTTGGGGTATTGATACCATGTATGGTATTCCGAGCGGTACCCTGAGCGGTTTAATGAATGCAATGGGCCATCCGGAAAATAAAGTTAAATTCATCCAGGTGAAGCACGAGGAAATTGGCGCAATGGCAGCCGTTATGCAGTATAAATTTGGTGGCAATATCG
CGGTTACCGTTGGTAGCGGTGGCCCTGGTGCAACCCACCTGATC
AATGGTCTGTATGATGCCTATATGGACCATATTCCGGTTCTGGC
AATTCTGGGTAGTAAACCGGTTCGCGAACTGAATATGGATAGTT
TTCAGGAACTGAACCAGAACCCGATGTATGATCATATTGCCGTT
TACAACCGCCGCGTTGCAACCGCAGAACAGTTACCTCATCTGGT
GGATGATGCAATTCGCACCGCCATTAGTAAACGCGGTGTGGCT
GTTCTGGAAGTTCCGGCAGATTTTGGTTTTGCCGAACTGGATGC
CGAAAGCATTTATAGCACCCCGCTGTATAGTAGTGGCACCAAA
TATAAACGCTACAAGCCGGTTGCACCGGAAGCCGAGGAAATTG
ATGAAGCCGTGGAAATTCTGAAGGCAAGCGAACGTCCGGTTAT
TTATGCCGGTTTTGGTACCCAGGGCCATGGTGATCTGGTGGAAG
AACTGAGTCGCAAAATTAAAGCACCGGTGATTACCACCGGTAA
AAATTTTGATAACTTCAACTGGGACTTCGAGGCACTGACCGGCT
CAGCATTTCGCGTTGGTTGGAAACCGGCCAATGAAGCCGTGCT
GGAAGCCGACACAGTTCTGTTTATTGGCACCAATTTCCCGTTTA
GTGAGGTGGAAGGCACCTTTCGCAATGTTAAAAAATTCATCCA
GATCGACGCAAACCCGGATATGCTGGGTAAACGTCATGAAACC
GATGTTGCCATTCTGGCAGATGCCGGTGAAAGCCTGAAAGCCC
TGCTGGCAAAAGTTGAACCGGTGGCAGATACCCCGTGGTGGCA
GGCAAATATTAAAAATGTGCAGAACTGGCGCGACTATATGAAT
AAACTGGAACAGAAGACCGAGGGCCCGCTGCAGGCATACCAGG
TGTACAATGCAATTAATAAGCTGGCCGATGAGGATGCCATTTTT
AGTACCGATGTGGGTGATGTTACCCAGCTGAGCACCCGTCATCT
GCACATGAATCCGAAACAGATGTGGCGTACCAGTCCGCTGTTT
GCAACCATGGGCATTGCCCTGCCGGGTGGTATTGGAGCAAAAA
ATATTTACCCGGACCGTCAGGTTTGGAATATTATTGGCGATGGC
GCATTTAGCATGACCTATCCGGATGTTGTTACCAGTGTTCGTTA
TGATATGCCGATGATTAACGTGATCTTCACCAATACCGAGTACG
GTTTTATCAAGAACAAGTACGAGGACACCAACGAATATAACTT
CGGCGTGGATTTTACCGATGTGGATTATGCCAAAGTGGGCGAA
GCCCAGGGCGCAATCGGTCTGACCGTGAACAGAATTGAAGATA
TTGACCGCGTGATGCAGGAAGCCGTGGATTATTATAAACAGGG
TCGCGTTGTTGTGGTTGATGCAAAAATTACCAAGGACCGCCCGA
TTCCGGTTGAAACCCTGAAACTGGATACCAATCTGTATAGTGAG
GACGTTGTTAAGGCCTATAAGGAAAAATACGAGGCAGAAGCAC
TGGTTCCGTTTCGCGAATTTCTGGAAGGTGAAGGTCTGAAAAGT
ATCTATATCAAGGAGGACAACGACAACAAGTTCAGTTTTTAA(SEQ ID NO:23)
在这第三种情况的具体情况中，至少一种丙酮酸氧化酶是野生型丙酮酸氧化酶，其包含如下SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
MTVGKTKVSTASLKVLAGWGIDTIYGIPSGTLAPLMEALGEQEETDIKFLQVKHEEVGAMAAVMQWKFGGKLGVCVGSGGPGASHLINGLYDAAMDNTPVLAILGSPPQRELNMDAFQELNQNPMYDHIAVYNRRVAYAEQLPKLIDDAIRTAISKRGVAVLEVPGDFGYKEIANDAFYSSGHSYRDYVSSAINEVDIDAAVEVLNKSKRAVIYAGIGTMGHGPAVQELSRKIKAPIITTAKNFETFDYDFEGLTGSTYRVGWKPANEAVKEADTVLFVGSNFPFAEVEGTFSNVENFIQIDNNPTMLGKRHNADVAILGDAGEAVQMLLEKVAPVEESAWWNANLKNIQNWRDYMTKLETKENGPLQLYQVYNAINKYADEDAIYSIDVGNTTQTSIRHLHMTPKNMWRTSPLFASMGIALPGGIGAKNVYPERQVFNLMGDGAFSMNYQDIVTNVRYNMPVINVVFTNTEYGFIKNKYEDTNTNTFGTEFTDVDYAMIGEAQGAVGFTVSRIEDMDQVMAAAVKANKEGKTVVIDAKITKDRPIPVETLKLDPALYSEEEIKAYKERYEAEELVPFSEFLKAEGLESKVAK(SEQ IDNO:24)
在一些情况下，至少一种丙酮酸氧化酶是基于SEQ ID NO:18、20、22或24的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶，并且可包含与SEQ IDNO:18、20、22或24的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种丙酮酸氧化酶是由SEQ ID NO:19、21或23的DNA序列编码的丙酮酸氧化酶，并且可包含与SEQ IDNO:19、21或23的翻译的参考序列为至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第二实施方式的第二个方面的第四实例中，至少一种过氧化氢酶选自野生型过氧化氢酶和从商购的野生型过氧化氢酶定向进化产生的过氧化氢酶，所述商购的野生型过氧化氢酶包括可从Roche Diagnostics International Ltd以产品号11650645103商购的过氧化氢酶。在这第四种情况的具体情况中，至少一种过氧化氢酶是包含如下SEQ IDNO:52所示的氨基酸序列的野生型过氧化氢酶。
MSEKSAADQIVDRGMRPKLSGNTTRHNGAPVPSENISATAGPQGPNVLNDIHLIEKLAHFNRENVPERIPHAKGHGAFGELHITEDVSEYTKADLFQPGKVTPLAVRFSTVAGEQGSPDTWRDVHGFALRFYTEEGNYDIVGNNTPTFFLRDGMKFPDFIHSQKRLNKNGLRDADMQWDFWTRAPESAHQVTYLMGDRGTPKTSRHQDGFGSHTFQWINAEGKPVWVKYHFKTRQGWDCFTDAEAAKVAGENADYQREDLYNAIENGDFPIWDVKVQIMPFEDAENYRWNPFDLTKTWSQKDYPLIPVGYFILNRNPRNFFAQIEQIALDPGNIVPGVGLSPDRMLQARIFAYADQQRYRIGANYRDLPVNRPINEVNTYSREGSMQYIFDAEGEPSYSPNRYDKGAGYLDNGTDSSSNHTSYGQADDIYVNPDPHGTDLVRAAYVKHQDDDDFIQPGILYREVLDEGEKERLADNISNAMQGISEATEPRVYDYWNNVDENLGARVKELYLQKKA(SEQ IDNO:52)
在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的过氧化氢酶可以由如下SEQ ID NO:53所示的DNA序列编码。
ATGAGCGAAAAGAGCGCGGCGGACCAAATTGTTGATCGTGGTATGCGTCCGAAACTGAGCGGCAACACCACCCGTCACAACGGTGCGCCGGTTCCGAGCGAAAACATCAGCGCGACCGCGGGTCCGCAGGGTCCGAACGTGCTGAACGACATCCACCTGATTGAGAAGCTGGCGCACTTCAACCGTGAAAACGTTCCGGAGCGTATTCCGCACGCGAAAGGTCACGGCGCGTTTGGTGAACTGCACATCACCGAAGACGTGAGCGAGTACACCAAGGCGGACCTGTTCCAACCGGGTAAAGTGACCCCGCTGGCGGTTCGTTTTAGCACCGTTGCGGGCGAGCAAGGTAGCCCGGACACCTGGCGTGATGTTCACGGTTTCGCGCTGCGTTTTTACACCGAGGAAGGTAACTACGATATTGTGGGCAACAACACCCCGACCTTCTTTCTGCGTGACGGTATGAAGTTCCCGGATTTTATCCACAGCCAGAAGCGTCTGAACAAAAACGGCCTGCGTGACGCGGATATGCAGTGGGACTTTTGGACCCGTGCGCCGGAAAGCGCGCACCAAGTTACCTATCTGATGGGTGACCGTGGTACCCCGAAGACCAGCCGTCACCAGGATGGTTTCGGCAGCCACACCTTTCAATGGATCAACGCGGAGGGCAAACCGGTGTGGGTTAAGTACCACTTCAAAACCCGTCAGGGTTGGGACTGCTTTACCGATGCGGAAGCGGCGAAGGTGGCGGGCGAGAACGCGGACTACCAACGTGAAGATCTGTATAACGCGATCGAGAACGGTGACTTCCCGATTTGGGATGTGAAAGTTCAGATCATGCCGTTCGAAGATGCGGAGAACTACCGTTGGAACCCGTTTGACCTGACCAAGACCTGGAGCCAAAAAGATTATCCGCTGATCCCGGTTGGTTACTTTATTCTGAACCGTAACCCGCGTAACTTCTTTGCGCAGATCGAACAAATTGCGCTGGACCCGGGCAACATTGTGCCGGGTGTTGGTCTGAGCCCGGACCGTATGCTGCAGGCGCGTATTTTCGCGTACGCGGATCAGCAACGTTATCGTATCGGTGCGAACTACCGTGACCTGCCGGTTAACCGTCCGATTAACGAAGTGAACACCTATAGCCGTGAGGGCAGCATGCAATACATCTTTGATGCGGAGGGTGAACCGAGCTACAGCCCGAACCGTTATGACAAGGGTGCGGGCTATCTGGACAACGGCACCGACAGCAGCAGCAACCACACCAGCTATGGTCAGGCGGACGATATCTACGTTAACCCGGACCCGCACGGTACCGATCTGGTTCGTGCGGCGTATGTGAAGCACCAGGACGATGACGATTTCATCCAACCGGGCATTCTGTACCGTGAGGTGCTGGACGAGGGTGAAAAAGAGCGTCTGGCGGATAACATTAGCAACGCGATGCAAGGTATCAGCGAAGCGACCGAGCCGCGTGTTTACGACTATTGGAACAACGTGGATGAAAACCTGGGCGCGCGTGTGAAAGAGCTGTACCTGCAGAAGAAAGCGTAA(SEQ IDNO:53)
在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的过氧化氢酶可以由如下SEQ ID NO:54所示的DNA序列编码。
ATGTCCGAAAAATCAGCGGCGGATCAGATTGTAGACCGCGGAATGCGTCCGAAACTGTCCGGAAACACCACCCGCCACAACGGAGCGCCGGTGCCGTCCGAGAACATTAGCGCGACCGCGGGCCCGCAGGGCCCGAACGTGCTCAATGATATCCATCTCATCGAAAAACTCGCGCACTTTAACCGCGAAAACGTGCCGGAGCGTATTCCTCATGCGAAAGGCCACGGCGCATTCGGTGAACTGCATATTACCGAGGATGTAAGCGAATACACCAAAGCGGATCTGTTCCAGCCTGGTAAAGTTACCCCCCTGGCAGTGCGCTTCAGCACAGTGGCAGGTGAACAGGGCAGCCCAGACACCTGGCGCGATGTTCACGGCTTCGCACTGCGCTTCTACACCGAAGAGGGCAACTACGATATTGTAGGTAACAACACCCCGACCTTCTTCCTGCGTGATGGCATGAAATTCCCCGATTTCATTCATTCACAGAAACGTCTCAACAAAAACGGTCTGCGCGACGCGGATATGCAGTGGGACTTCTGGACCCGCGCGCCTGAATCCGCGCACCAGGTAACCTACCTGATGGGTGATCGCGGTACCCCTAAAACCAGCCGCCATCAGGATGGCTTCGGCAGCCACACCTTCCAGTGGATTAACGCAGAAGGTAAACCGGTGTGGGTGAAATACCATTTCAAAACCCGCCAGGGCTGGGACTGCTTCACCGACGCGGAAGCGGCGAAAGTGGCGGGCGAAAACGCAGATTACCAGCGCGAAGATCTCTACAACGCAATCGAAAACGGCGATTTCCCGATTTGGGATGTTAAAGTGCAGATTATGCCTTTCGAGGACGCGGAAAACTACCGCTGGAACCCGTTCGACCTGACCAAAACCTGGTCCCAGAAAGACTACCCGCTGATTCCGGTTGGTTACTTCATTCTGAACCGCAACCCGCGCAACTTCTTCGCACAGATTGAGCAGATCGCGCTGGACCCGGGCAACATTGTGCCTGGCGTTGGCCTGAGCCCGGATCGCATGCTCCAGGCGCGTATTTTCGCGTACGCGGATCAGCAGCGTTACCGCATTGGCGCAAACTACCGCGATCTGCCGGTAAACCGTCCGATTAACGAAGTTAACACCTACTCACGCGAAGGTAGCATGCAGTACATTTTCGATGCAGAGGGCGAACCTAGCTACTCACCTAACCGCTACGATAAAGGCGCGGGCTACCTGGATAACGGTACTGACAGCAGCAGCAACCACACCAGCTACGGCCAGGCAGACGATATTTACGTTAACCCGGATCCGCACGGCACCGATCTGGTGCGTGCTGCATACGTTAAACACCAGGACGACGATGATTTCATTCAGCCGGGCATTCTATACCGCGAGGTTCTGGACGAAGGCGAGAAAGAACGATTGGCGGATAACATTAGCAACGCTATGCAGGGCATTTCCGAGGCAACCGAACCGCGCGTTTACGATTACTGGAACAACGTGGACGAGAACCTCGGCGCACGCGTTAAAGAACTGTACCTCCAGAAAAAAGCTTAA(SEQ ID NO:54)
在一些情况下，至少一种过氧化氢酶与从Roche Diagnostics InternationalLtd以产品号11650645103商购的过氧化氢酶的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些情况下，至少一种过氧化氢酶与参考序列SEQ ID NO:52至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种过氧化氢酶由与从Roche Diagnostics InternationalLtd以产品号11650645103商购的过氧化氢酶的参考序列为至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的DNA序列编码。在一些情况下，至少一种过氧化氢酶由与SEQ ID NO:53或54为至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的DNA序列编码。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第二实施方式的第二个方面的第五个实例中，至少一种尿苷磷酸化酶是选自以下的一种或多种尿苷磷酸化酶：野生型尿苷磷酸化酶和从商购的野生型尿苷磷酸化酶定向进化产生的尿苷磷酸化酶。在特定情况下，至少一种尿苷磷酸化酶选自具有如下SEQ IDNO:25所示的氨基酸序列的野生型尿苷磷酸化酶。
MSKSDVFHLGLTKNDLQGATLAIVPGDPDRVEKIAALMDKPVKLASHREFTTWRAELDGKPVIVCSTGIGGPSTSIAVEELAQLGIRTFLRIGTTGAIQPHINVGDVLVTTASVRLDGASLHFAPLEFPAVADFECTTALVEAAKSIGATTHVGVTASSDTFYPGQERYDTYSGRVVRHFKGSMEEWQAMGVMNYEMESATLLTMCASQGLRAGMVAGVIVNRTQQEIPNAETMKQTESHAVKIVVEAARRLL(SEQ ID NO:25)
在特定的情况中，包含如上SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的野生型尿苷磷酸化酶可以由如下SEQ ID NO:26所示的DNA序列编码。
ATGTCCAAGTCTGATGTTTTTCATCTCGGCCTCACTAAAAACGATTTACAAGGGGCTACGCTTGCCATCGTCCCTGGCGACCCGGATCGTGTGGAAAAGATCGCCGCGCTGATGGATAAGCCGGTTAAGCTGGCATCTCACCGCGAATTCACTACCTGGCGTGCAGAGCTGGATGGTAAACCTGTTATCGTCTGCTCTACCGGTATCGGCGGCCCGTCTACCTCTATTGCTGTTGAAGAGCTGGCACAGCTGGGCATTCGCACCTTCCTGCGTATCGGTACAACGGGCGCTATTCAGCCGCATATTAATGTGGGTGATGTCCTGGTTACCACGGCGTCTGTCCGTCTGGATGGCGCGAGCCTGCACTTCGCACCGCTGGAATTCCCGGCTGTCGCTGATTTCGAATGTACGACTGCGCTGGTTGAAGCTGCGAAATCCATTGGCGCGACAACTCACGTTGGCGTGACAGCTTCTTCTGATACCTTCTACCCAGGTCAGGAACGTTACGATACTTACTCTGGTCGCGTAGTTCGTCACTTTAAAGGTTCTATGGAAGAGTGGCAGGCGATGGGCGTAATGAACTATGAAATGGAATCTGCAACCCTGCTGACCATGTGCGCAAGTCAGGGCCTGCGTGCCGGTATGGTAGCGGGTGTTATCGTTAACCGCACCCAGCAAGAGATCCCGAATGCTGAGACGATGAAACAAACCGAAAGCCATGCGGTGAAAATCGTGGTGGAAGCGGCGCGTCGTCTGCTGTAA(SEQ ID NO:26)
在这第五种情况的特定情况中，至少一种尿苷磷酸化酶是包含如下SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的野生型尿苷磷酸化酶。
MHHHHHHGGSGMSKSDVFHLGLTKNDLQGATLAIVPGDPDRVEKIAALMDKPVKLASHREFTTWRAELDGKPVIVCSTGIGGPSTSIAVEELAQLGIRTFLRIGTTGAIQPHINVGDVLVTTASVRLDGASLHFAPLEFPAVADFECTTALVEAAKSIGATTHVGVTASSDTFYPGQERYDTYSGRVVRHFKGSMEEWQAMGVMNYEMESATLLTMCASQGLRAGMVAGVIVNRTQQEIPNAETMKQTESHAVKIVVEAARRLL(SEQ ID NO:27)
在这第五种情况的具体情况中，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如下SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。
MHHHHHHGGSGMSKSDVFHLGLTKNDLQGATLAIVPGDPDRVEKIAALMDKPVKLASHREFTTWRAELDGKPVIVCSTGIGGPSTSIAVEILAQLGIRTFLRIGTTGAIQPHINVGDVLVTTASVRLDGASLHFAPLEFPAVADFECTTALVEAAKSIGATTHVGVTASSDTFYPGQERYDTYSGRVVRHFKGSMEEWQAMGVMNYEMESATLLTMCASQGLRAGMVAGVIVNRTQQEIPNAETMKQTESHAVKIVVEAARRLL(SEQ ID NO:28)
在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶可以由如下SEQ ID NO:29所示的DNA序列编码。
ATGCACCATCATCATCATCATGGCGGTAGCGGCATGTCCAAGTCTGATGTTTTTCATCTCGGCCTCACTAAAAACGATTTACAAGGGGCTACGCTTGCCATCGTCCCTGGCGACCCGGATCGTGTGGAAAAGATCGCCGCGCTGATGGATAAGCCGGTTAAGCTGGCATCTCACCGCGAATTCACTACCTGGCGTGCAGAGCTGGATGGTAAACCTGTTATCGTCTGCTCTACCGGTATCGGCGGCCCGTCTACCTCTATTGCTGTTGAAATTCTGGCACAGCTGGGCATTCGCACCTTCCTGCGTATCGGTACAACGGGCGCTATTCAGCCGCATATTAATGTGGGTGATGTCCTGGTTACCACGGCGTCTGTCCGTCTGGATGGCGCGAGCCTGCACTTCGCACCGCTGGAATTCCCGGCTGTCGCTGATTTCGAATGTACGACTGCGCTGGTTGAAGCTGCGAAATCCATTGGCGCGACAACTCACGTTGGCGTGACAGCTTCTTCTGATACCTTCTACCCAGGTCAGGAACGTTACGATACTTACTCTGGTCGCGTAGTTCGTCACTTTAAAGGTTCTATGGAAGAGTGGCAGGCGATGGGCGTAATGAACTATGAAATGGAATCTGCAACCCTGCTGACCATGTGCGCAAGTCAGGGCCTGCGTGCCGGTATGGTAGCGGGTGTTATCGTTAACCGCACCCAGCAAGAGATCCCGAATGCTGAGACGATGAAACAAACCGAAAGCCATGCGGTGAAAATCGTGGTGGAAGCGGCGCGTCGTCTGCTGTAA(SEQ ID NO:29)
在这第五种情况的具体情况中，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如下SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。
MHHHHHHGGSGMSESDSFHLGLTKNDLQGATLAILPGDPDRVEKIAALMDKPVKLASWREFTTWRAELDGKPVIVCSTGIGGPSTSIAVEILAQLGIRTFLRIGTTGAIQPHINVGDVLVTTASVRLDGASLHFAPLEFPAVADFECTTALVEAAKSIGATTHVGVTASSDTFYPGQERYDTYSGRVVRHFKGSMEEWQRMGVMNYEMESATLLTMCASQGLRAGMVAGVIVNRTQQELPNAESMKQTESHMVKIVVEAARRLL(SEQ ID NO:30)
在这第五种情况的具体情况中，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如下SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。
MHHHHHHGGSGMSESDSFHMGLTKNDLQGATLAILPGDPARVEKIAALMDNPVKLASWREFTTWRAELDGKPVIVCSTGIGGPSTSIAVEILAQLGIRTFLRIGTTGAIQGHINVGDVLVTTASVRLDGASGHFAPMEFPAVADFECTTALVEAAKSIGATTHVGVTASSDTFYPGQERYDTYSGRVVRRFQGSMEEWQEMGVMNYEMESATLLTMCASQGLRAGMVAGVIVNRTQQELPNAESMKQVESHMVKIVVEAARRLL(SEQ.ID NO:31)
在这第五种情况的具体情况中，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如下SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。
MHHHHHHGGSGMSESDTFHMGLTKNDLQGATLAIVPGDPARVEKIAALMDNPVKLGSWREFITWRAELDGKPVIVCSTGIGGPSTSIAVEILAQLGIRTFLRIGTTGAIQGHINVGDVLVTTASVRLDGASGHFAPYEFPAVADFECTTALVEAAKSIGATTHVGVTASSDTFYPGQERYDTYSGRVVRRFQGSMEEWREMGVMNYEMESATLLTMCASQGLRAGMVAGVIVNRTQQELPNAESMKQVESHMVKIVVEAARRLL(SEQ ID NO:45)
在这第五种情况的具体情况中，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如下SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。
MHHHHHHGGSGMSESDTFHMGLTKNDLQGATLAILPGDPARVEKIAALMDNPVKLGSWREFITWRAELDGKPVIVCSTGIGGPSTSIAVEILAQLGIRTFLRIGTTGAIQGHINVGDVLVTTASVRLDGASGHFAPYEFPAVADFECTTALVEAAKSIGATTHVGVTASSDTFYPGQERYDTYSGRVVRRFQGSMEEWRVMGVMNYEMESATLLTMCASQGLRAGMVAGVIVNRTQQELPNAEDMPQVESHMVKIVVEAARRLL(SEQ ID NO:46)
在这第五种情况的具体情况中，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如下SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。
MHHHHHHGGSGMSESDTFHMGLTKNDLQGATLAILPGDPARVEKIAALMDNPVKLGQWREFITWRAELDGKPVIVCSTGIGGPSTSIAVEILAQLGIRTFLRIGTTGAIQGHINVGDVLVTTASVRLDGASGHFAPYEFPAVADFECTTALVEAAKSCGATTHVGVTASSDTFYPGQERYDTYSGRVVRRFRGSMEEWRVMGVMNYEMESATLLTMCASQGLRAGMVAGVIVNRTQQELPNAESMPQVESFMVKIVVEAARRLL(SEQ ID NO:47)
在这第五种情况的具体情况中，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如下SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。
MHHHHHHGGSGMSESDSFHMGLTKNDLQGATLAIVPGDPARVEKIAALMDNPVKLGQWREFITWRAELDGKPVIVCSTGIGGPSTSIAVEILAQLGIRTFLRIGTTGAIQGHINVGDVLVTTASVRLDGASGHFAPMEFPAVADFECTTALVEAAKSCGATTHVGVTASSDTFYPGQERYDTYSGRVVRRFQGSMEEWREMGVMNYEMESATLLTMCASQGLRAGMVAGVIVNRTQQELPNAESMKQVESHMVKIVVEAARRLL(SEQ ID NO:48)
在这第五种情况的特定情况中，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如下SEQ ID NO.49所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。
MHHHHHHGGSGMSESDSFHMGLTKNDLQGATLAIVPGDPARVEKIAALMDNPVKLGSWREFITWRAELDGKPVIVCSTGIGGPSTSIAVEILAQLGIRTFLRIGTTGAIQGHIGVGDVLVTTASVRLDGASGHFAPYEFPAVADFECTTALVEAAKSCGATTHVGVTASSDTFYPGQERYDTYSGRVVRRFRGSMEEWREMGVMNYEMESATLLTMCAVQGLRAGMVAGVIVNRTQQELPNAEDMKQVESHMVKIVVEAARRLL(SEQ ID NO:49)
在这第五种情况的具体情况中，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如下SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。
MHHHHHHGGSGMSESDSFHMGLTKNDLQGATLAILPGDPARVEKIAALMDNPVKLGSWREFITWRAELDGKPVIVCSTGIGGPSTSIAVEILAQLGIRTFLRIGTTGAIQGHIGVGDVLVTTASVRLDGASGHFAPYEFPAVADFECTTALVEAAKSIGATTHVGVTASSDTFYPGQERYDTYSGRVVRRFQGSMEEWREMGVMNYEMESATLLTMCASQGLRAGMVAGVIVNRTQQELPNAEDMPQVESHMVKIVVEAARRLL(SEQ ID NO:50)
在这第五种情况的具体情况中，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如下SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。
MHHHHHHGGSGMSESDSFHMGLTKNDLQGATLAIVPGDPARVEKIAALMDNPVKLGSWREFITWRAELDGKPVIVCSTGIGGPSTSIAVEILAQLGIRTFLRIGTTGAIQGHINVGDVLVTTASVRLDGASGHFAPMEFPAVADFECTTALVEAAKSIGATTHVGVTASSDTFYPGQERYDTYSGRVVRRFRGSMEEWREMGVMNYEMESATLLTMCASQGLRAGMVAGVIVNRTQQELPEAEDMPQVESHMVKIVVEAARRLL(SEQ ID NO:51)
在一些情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是基于SEQ ID NO:25、27、28、30、31、45、46、47、48、49、50或51的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶，并且可以包含与SEQ ID NO:25、27、28、30、31、45、46、47、48、49、50或51的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守性、保守性以及非保守性和保守性氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是由SEQ ID NO:26或29的DNA序列编码的尿苷磷酸化酶，并且可以包含与SEQ ID NO:26或29的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第二实施方式的第三个方面中，该反应在至少一种溶剂的存在下进行。在这个方面的实例中，至少一种溶剂选自水性溶剂、有机溶剂及其混合物。在这个方面的特定情况下，至少一种溶剂选自水。在这个方面的其他特定情况下，至少一种溶剂选自DME、苯甲醚、叔丁醇、叔戊醇、丙酮、1,2-亚丙基碳酸酯、1,3-二氧杂环戊烷、乙腈、乙酸乙酯、甲基叔丁醚、环戊基甲醚、氯苯、异丙醇、乙酸异丙酯、2-丁酮及其混合物。在这个方面的其他实例中，至少一种溶剂是水和至少一种选自DME、苯甲醚、叔丁醇、叔戊醇、丙酮、1,2-亚丙基碳酸酯、1,3-二氧杂环戊烷、乙腈、乙酸乙酯、甲基叔丁醚、环戊基甲醚、氯苯、异丙醇、乙酸异丙酯、2-丁酮及其混合物的有机溶剂。
在第二实施方式的方面中，反应包括首先使5-异丁酰基核糖与磷酸源在至少一种MTR激酶和至少一种乙酸激酶的存在下反应以产生5-异丁酰基核糖磷酸氢盐，然后使5-异丁酰基核糖磷酸氢盐与尿嘧啶在至少一种尿苷磷酸化酶的存在下反应以形成5'-异丁酰尿苷和磷酸氢盐。在具体方面中，磷酸氢盐在至少一种丙酮酸氧化酶和至少一种过氧化氢酶的存在下反应以再生磷酸源。
在本公开的方法的第三实施方式中，第二实施方式的方法还包括在至少一种脂肪酶的存在下使核糖与至少一种异丁酰基供体反应以形成5-异丁酰基核糖：
在这第三实施方式的第一方面中，至少一种异丁酰基供体选自丙-2-酮O-异丁酰基肟、异丁酸酐及其混合物。在这第一方面的情况中，至少一种异丁酰基供体是异丁酸酐。在这个方面的具体情况下，相对于核糖的量，至少一种异丁酰基供体以约1.0至约3.0当量的量提供，例如约1.5当量的量。
在这第三实施方式的第二个方面中，至少一种脂肪酶选自野生型脂肪酶和从商购的野生型脂肪酶定向进化产生的脂肪酶。在这个方面的情况中，至少一种脂肪酶选自IMMTLL(可从ChiralVision以IMMTLL-T2-150商购获得)、IMMRES(可从ChiralVision以IMMRES-T2-150商购获得)、IMMLIPX(可从ChiralVision以IMMLIPX-T2-150商购获得)、IMMP6-T2-250(可从ChiralVision以IMMP6-T2-250商购获得)、51032(可从Strem Chemicals，Inc.以目录号06-3135商购获得)和/>435(可从Novozymes以目录号3925009-810商购获得，或可从Strem Chemicals，Inc.以目录号06-3132商购获得)。在具体情况下，至少一种脂肪酶是/>435。
在一些情况下，至少一种脂肪酶是与商购的野生型酯酶的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的脂肪酶。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种脂肪酶是与商购的野生型脂肪酶的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的由DNA序列编码的脂肪酶。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第三实施方式的第三个方面中，反应在至少一种溶剂的存在下进行。在这个方面的情况中，至少一种溶剂选自有机溶剂及其混合物。在这个方面的特定情况下，溶剂选自DME、苯甲醚、叔丁醇、叔戊醇、丙酮、1,2-亚丙基碳酸酯、1,3-二氧杂环戊烷、乙腈、乙酸乙酯、甲基叔丁醚、环戊基甲醚、氯苯、异丙醇、乙酸异丙酯、2-丁酮及其混合物。在更具体的情况下，至少一种溶剂选自叔丁醇、叔戊醇、丙酮及其混合物。在仍更具体的情况下，至少一种溶剂是丙酮。
本公开的方法的第四实施方式包括(a)使核糖与至少一种异丁酰基供体在至少一种脂肪酶的存在下反应以形成5'-异丁酰基核糖；(b)使5'-异丁酰基核糖与尿嘧啶在至少一种酶的存在下反应，所述酶选自S-甲基-5-硫代核糖激酶、乙酸激酶、丙酮酸氧化酶、过氧化氢酶；和尿苷磷酸化酶，及其混合物，以形成5'-异丁酰尿苷；和(c)使5'-异丁酰尿苷与至少一种羟胺源在至少一种激活剂存在下反应以产生化合物B：
在第四实施方式的第一个方面中，至少一种异丁酰基供体选自丙-2-酮O-异丁酰基肟、异丁酸酐及其混合物。在这第一方面的情况中，至少一种异丁酰基供体是异丁酸酐。在这个方面的具体情况下，相对于核糖的量，至少一种异丁酰基供体以约1.0至约3.0当量的量提供，如约1.5当量的量。
在这第四实施方式的第二个方面中，至少一种脂肪酶选自野生型脂肪酶和从商购的野生型脂肪酶定向进化产生的脂肪酶。在这个方面的情况中，至少一种脂肪酶选自：IMMTLL(可从ChiralVision以IMMTLL-T2-150商购获得)、IMMRES(可从ChiralVision以IMMRES-T2-150商购获得)、IMMLIPX(可从ChiralVision以IMMLIPX-T2-150商购获得)、IMMP6-T2-250(可从ChiralVision以IMMP6-T2-250商购获得)、51032(可从Strem Chemicals，Inc.以目录号06-3135商购获得)和/>435(可从Novozymes以目录号3925009-810商购获得，或可从Strem Chemicals，Inc.以目录号06-3132商购获得)。在具体情况下，至少一种脂肪酶是/>435。
在一些情况下，至少一种脂肪酶是与商购的野生型酯酶的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的脂肪酶。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种脂肪酶是与商购的野生型脂肪酶的参考序列为至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的由DNA序列编码的脂肪酶。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第三实施方式的第三个方面中，(a)反应在至少一种溶剂的存在下进行。在这个方面的情况中，至少一种溶剂选自有机溶剂及其混合物。在这个方面的特定情况下，溶剂选自DME、苯甲醚、叔丁醇、叔戊醇、丙酮、1,2-亚丙基碳酸酯、1,3-二氧杂环戊烷、乙腈、乙酸乙酯、甲基叔丁醚、环戊基甲醚、氯苯、异丙醇、乙酸异丙酯、2-丁酮及其混合物。在更具体的情况下，至少一种溶剂选自叔丁醇、叔戊醇、丙酮及其混合物。在仍更具体的情况下，至少一种溶剂是丙酮。
在这第四实施方式的第四个方面中，相对于5'-异丁酰基核糖的量，尿嘧啶以约0.5至约1.2当量的量提供，例如约0.8当量的量。
在这第四实施方式的第五个方面中，至少一种酶选自至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种乙酸激酶、至少一种丙酮酸氧化酶、至少一种过氧化氢酶；和至少一种尿苷磷酸化酶，及其混合物。也就是说，在这第五方面的实例中，至少一种酶选自S-甲基-5-硫代核糖激酶、乙酸激酶、丙酮酸氧化酶、过氧化氢酶和尿苷磷酸化酶，及其混合物。
在这第四实施方式的第五个方面的第一种情况中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是选自野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶和从商购的野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶定向进化产生的S-甲基-5-硫代核糖激酶的一种或多种S-甲基-5-硫代核糖激酶。在具体情况下，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶选自从商购的野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶定向进化产生的S-甲基-5-硫代核糖激酶，所述野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶具有如下SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列；在特定的情况中，包含如上SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如上SEQ ID NO:2所示的DNA序列编码。在这个第一种情况的具体情况下，至少一种酶是包含如上SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶；在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如上SEQ ID NO:4所示的DNA序列编码。在这第一种情况的具体情况中，至少一种酶是包含如上SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶；在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如上SEQ ID NO:6所示的DNA序列编码。在这种情况的特定出现中，至少一种酶是包含如上SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶；在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如上SEQID NO:8所示的DNA序列编码。在这种情况的特定出现中，至少一种酶是包含如上SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶；在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如上SEQ ID NO:10所示的DNA序列编码。在这种情况的特定出现中，至少一种酶是包含如上文SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶；在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如上SEQ ID NO:12所示的DNA序列编码。在这种情况的具体出现中，至少一种酶是S-甲基-5-硫代核糖激酶，其包含如上SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列。
在一些情况下，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是基于SEQ IDNO:1、3、5、7、9、11、12或13的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶，并且可包含与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、12或13的参考序列为至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是由SEQ ID NO:2、4、6、8或10的DNA序列编码的S-甲基-5-硫代核糖激酶，并且可包含与SEQ ID NO:2、4、6、8或10的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第四实施方式的第五个方面的第二情况中，至少一种乙酸激酶是选自野生型乙酸激酶和从商购的野生型乙酸激酶定向进化产生的乙酸激酶的一种或多种乙酸激酶。在具体情况下，至少一种乙酸激酶选自从商购的野生型乙酸激酶定向进化产生的乙酸酶，所述野生型乙酸激酶具有如上SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。在具体的出现中，包含如上SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的野生型乙酸激酶可以由如上SEQ ID NO:15所示的DNA序列编码。在这第二种情况的特定出现中，至少一种乙酸激酶是包含如上SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的乙酸激酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ IDNO:16所示的氨基酸序列的乙酸激酶可以由如上SEQ ID NO:17所示的DNA序列编码。
在这第二种情况的一些出现中，至少一种乙酸激酶是基于SEQ ID NO:14或16的氨基酸序列的乙酸激酶，并且可以包含与SEQ IDNO:14或16的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第二种情况的一些出现中，至少一种乙酸激酶是由SEQ IDNO:15或17的DNA序列编码的乙酸激酶，并且可以包含与SEQ IDNO:15或17的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在第四实施方式的第五个方面的第三种情况下，至少一种丙酮酸氧化酶选自野生型丙酮酸氧化酶和从商购的野生型丙酮酸氧化酶定向进化产生的丙酮酸氧化酶。在具体情况下，至少一种丙酮酸氧化酶选自从商购的野生型丙酮酸氧化酶定向进化产生的丙酮酸氧化酶，其具有如上SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。在具体情况下，具有如上SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的野生型丙酮酸氧化酶可以由如上SEQ ID NO:19所示的DNA序列编码。在这第三种情况的具体出现中，至少一种丙酮酸氧化酶是包含如上SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶可以由如上SEQ ID NO:21所示的DNA序列编码。在这第三种情况的具体出现中，至少一种丙酮酸氧化酶是包含如上SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶可以由如上SEQ ID NO:23所示的DNA序列编码。在这第三种情况的具体出现中，至少一种丙酮酸氧化酶是包含如上SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶。
在一些情况下，至少一种丙酮酸氧化酶是基于SEQ ID NO:18、20、22或24的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶，并且可包含与SEQ IDNO:18、20、22或24的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可以包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种丙酮酸氧化酶是由SEQ ID NO:19、21或23的DNA序列编码的丙酮酸氧化酶，并且可包含与SEQ IDNO:19、21或23的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在第四实施方式的第五个方面的第四种情况中，至少一种过氧化氢酶选自野生型过氧化氢酶和从商购的野生型过氧化氢酶定向进化产生的过氧化氢酶，所述商购的野生型过氧化氢酶包括从Roche Diagnostics International Ltd.以产品号11650645103商购的过氧化氢酶。在这第四种情况的特定出现中，至少一种过氧化氢酶是包含如上SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的野生型过氧化氢酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ IDNO:52所示的氨基酸序列的过氧化氢酶可以由如上SEQ ID NO:53所示的DNA序列编码。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的过氧化氢酶可以由如上SEQ ID NO:54所示的DNA序列编码。
在一些情况中，至少一种过氧化氢酶与从Roche Diagnostics InternationalLtd.以产品号11650645103商购的过氧化氢酶的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些情况下，至少一种过氧化氢酶与参考序列SEQ ID NO:52至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种过氧化氢酶由与从Roche Diagnostics InternationalLtd.以商品号11650645103商购的过氧化氢酶的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的DNA序列编码。在一些情况下，至少一种过氧化氢酶由与SEQ ID NO:53或54为至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的DNA序列编码。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第四实施方式的第五个方面的第五种情况中，至少一种尿苷磷酸化酶选自野生型尿苷磷酸化酶和从商购的野生型尿苷磷酸化酶定向进化产生的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的野生型尿苷磷酸化酶。在特定的出现中，包含如上SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的野生型尿苷磷酸化酶可以由如上SEQ ID NO:26所示的DNA序列编码。在这第五种情况的特定出现中，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在这第五种情况的特定出现时，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶可以由如上SEQ ID NO:29所示的DNA序列编码。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。
在一些情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是基于SEQ ID NO:25、27、28、30、31、45、46、47、48、49、50或51的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶，并且可以包含与SEQ ID NO:25、27、28、30、31、45、46、47、48、49、50或51的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是由SEQ ID NO:26或29的DNA序列编码的尿苷磷酸化酶，并且可包含与SEQ ID NO:26或29的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第四实施方式的第六个方面中，(b)反应在至少一种溶剂的存在下进行。在这个方面的实例中，至少一种溶剂选自水性溶剂、有机溶剂及其混合物。在这个方面的特定情况下，至少一种溶剂选自水。在这个方面的其他特定情况下，至少一种溶剂选自DME、苯甲醚、叔丁醇、叔戊醇、丙酮、1,2-亚丙基碳酸酯、1,3-二氧杂环戊烷、乙腈、乙酸乙酯、甲基叔丁醚、环戊基甲醚、氯苯、异丙醇、乙酸异丙酯、2-丁酮及其混合物。在这个方面的更多实例中，至少一种溶剂是水和选自DME、苯甲醚、叔丁醇、叔戊醇、丙酮、1,2-亚丙基碳酸酯、1,3-二氧杂环戊烷、乙腈、乙酸乙酯、甲基叔丁醚、环戊基甲醚、氯苯、异丙醇、乙酸异丙酯、2-丁酮及其混合物的有机溶剂。
在这第四实施方式的第七个方面中，至少一种羟胺源选自硫酸羟胺、羟胺HCl、NH2OH及其混合物。在这第七个方面的实例中，至少一种羟胺源是硫酸羟胺。在这个方面的具体情况种，至少一种羟胺源以相对于5'-异丁酰尿苷的量提供约1.0至约2.5当量羟胺的范围内的羟胺的量提供，如约2.2至约2.5当量范围内的量，或约2.5当量的量。
在这第四实施方式的第八个方面中，至少一种激活剂是六甲基二硅氮烷。在这个方面的具体情况下，相对于5'-异丁酰尿苷的量，至少一种激活剂以约6.0至约8.0当量范围内的量提供，例如约8当量的量。
在这第四实施方式的第九个方面中，(c)反应在至少一种酸性添加剂的存在下进行。在这第九个方面的情况中，至少一种酸性添加剂选自：硫酸氢铵、磷酸二氢铵、硫酸、硫酸氢钠、硫酸氢钾、咪唑硫酸氢盐、三乙胺硫酸氢盐、N-甲基吗啉硫酸氢盐、N-甲基咪唑硫酸氢盐、三氧化硫吡啶复合物、三氟甲磺酸、甲磺酸及其混合物。在具体情况下，至少一种酸性添加剂是硫酸氢铵。在具体情况下，相对于5'-异丁酰尿苷的量，至少一种酸性添加剂以约1.5至约3.0当量范围内的量存在。
在这第四实施方式的第十个方面中，(c)反应任选在至少一种催化剂的存在下进行。在这个方面的某些情况下，至少一种催化剂选自路易斯碱催化剂。在这第十个方面的情况中，至少一种催化剂选自N-甲基咪唑、N-甲基吗啉、1,2,4-三唑、5-(乙硫基)-1H-四唑、咪唑及其混合物。在具体情况下，至少一种催化剂是咪唑。在特定情况下，相对于5'-异丁酰尿苷的量，至少一种催化剂以约0.2至约0.5当量范围内的量存在。
在这第四实施方式的第十一个方面中，(c)反应在至少一种溶剂的存在下进行。在这个方面的实例中，至少一种溶剂选自有机溶剂及其混合物。在这个方面的特定情况下，至少一种溶剂选自庚烷、甲苯、2-甲基四氢呋喃、四氢呋喃、DME、环丁砜及其混合物。
在本公开的方法的第五实施方式中，第一实施方式的方法包括使尿苷在至少一种脂肪酶的存在下与至少一种异丁酰基供体反应以形成5'-异丁酰尿苷：
在这第五实施方式的第一个方面中，至少一种异丁酰基供体选自丙-2-酮O-异丁酰基肟、异丁酸酐及其混合物。在这第一个方面的实例中，至少一种异丁酰基供体是异丁酸酐。在这个方面的具体情况下，相对于核糖的量，至少一种异丁酰基供体以约1.0至约3.0当量范围的量提供，如约1.5当量的量。
在这第五实施方式的第二个方面中，至少一种脂肪酶选自野生型脂肪酶和从商购的野生型脂肪酶定向进化产生的脂肪酶。在这个方面的情况中，至少一种脂肪酶选自：IMMTLL(可从ChiralVision以IMMTLL-T2-150商购获得)、IMMRES(可从ChiralVision以IMMRES-T2-150商购获得)、IMMLIPX(可从ChiralVision以IMMLIPX-T2-150商购获得)、IMMP6-T2-250(可从ChiralVision以IMMP6-T2-250商购获得)、51032(可从Strem Chemicals，Inc.以目录号06-3135商购获得)和/>435(可从Novozymes以目录号3925009-810商购获得，或可从Strem Chemicals，Inc.以目录号06-3132商购获得)。在具体情况下，至少一种脂肪酶是/>435。
在一些情况下，至少一种脂肪酶是与商购的野生型脂肪酶的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的脂肪酶。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种脂肪酶是由与商购的野生型脂肪酶的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的DNA序列编码的脂肪酶。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第五实施方式的第三个方面中，(a)反应在至少一种溶剂的存在下进行。在这个方面的情况中，至少一种溶剂选自有机溶剂及其混合物。在这个方面的特定情况下，溶剂选自DME、苯甲醚、叔丁醇、叔戊醇、丙酮、1,2-亚丙基碳酸酯、1,3-二氧杂环戊烷、乙腈、乙酸乙酯、甲基叔丁醚、环戊基甲醚、氯苯、异丙醇、乙酸异丙酯、2-丁酮及其混合物。在更具体的情况下，至少一种溶剂选自叔丁醇、叔戊醇、丙酮及其混合物。在仍更具体的情况下，所述至少一种溶剂是丙酮。
在本公开的方法的第六实施方式中，第五实施方式的方法还包括在至少一种酶的存在下使核糖与尿嘧啶反应以形成尿苷：
在这第六实施方式的第一个方面中，相对于核糖的量，以约0.4至约1.2当量范围的量来提供尿苷，如约0.8当量的量。
在这第六实施方式的第二个方面中，至少一种酶选自至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种乙酸激酶、至少一种丙酮酸氧化酶、至少一种过氧化氢酶、至少一种尿苷磷酸化酶、至少一种核糖激酶(或者称为“多种核糖激酶”)、至少一种磷酸戊糖变位酶(或者称为“多种磷酸戊糖变位酶”)和至少一种蔗糖磷酸化酶(或者称为“多种蔗糖磷酸化酶”)，及其混合物。
在这第二个方面的情况中，至少一种酶是选自至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种乙酸激酶、至少一种丙酮酸氧化酶、至少一种过氧化氢酶、至少一种尿苷磷酸化酶、至少一种核糖激酶、至少一种磷酸戊糖变位酶和至少一种蔗糖磷酸化酶的至少两种酶的混合物。在一些情况下，至少一种酶是选自至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种乙酸激酶、至少一种丙酮酸氧化酶、至少一种过氧化氢酶、至少一种尿苷磷酸化酶、至少一种核糖激酶、至少一种磷酸戊糖变位酶和至少一种蔗糖磷酸化酶的至少三种酶的混合物。在另外的情况下，至少一种酶是选自至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种乙酸激酶、至少一种丙酮酸氧化酶、至少一种过氧化氢酶、至少一种尿苷磷酸化酶、至少一种核糖激酶、至少一种磷酸戊糖变位酶和至少一种蔗糖磷酸化酶的至少四种酶的混合物。在另外的情况下，至少一种酶是选自至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种乙酸激酶、至少一种丙酮酸氧化酶、至少一种过氧化氢酶、至少一种尿苷磷酸化酶、至少一种核糖激酶、至少一种磷酸戊糖变位酶和至少一种蔗糖磷酸化酶的至少五种酶的混合物。在特定情况下，至少一种酶是至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种乙酸激酶、至少一种丙酮酸氧化酶、至少一种过氧化氢酶和至少一种尿苷磷酸化酶的混合物。在其他特定情况下，至少一种酶是至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种乙酸激酶、至少一种尿苷磷酸化酶和至少一种蔗糖磷酸化酶的混合物。在另外的特定情况下，至少一种酶是至少一种乙酸激酶、至少一种丙酮酸氧化酶、至少一种过氧化氢酶、至少一种尿苷磷酸化酶、至少一种核糖激酶和至少一种磷酸戊糖变位酶的混合物。在其他特定情况下，至少一种酶是至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种乙酸激酶、至少一种尿苷磷酸化酶、至少一种核糖激酶、至少一种磷酸戊糖变位酶和至少一种蔗糖磷酸化酶的混合物。在更进一步的特定情况下，至少一种酶是至少一种乙酸激酶、至少一种尿苷磷酸化酶和选自至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种丙酮酸氧化酶、至少一种过氧化氢酶、至少一种核糖激酶、至少一种磷酸戊糖变位酶和至少一种蔗糖磷酸化酶的至少两种酶的混合物。
在这第六实施方式的第二个方面的第一种情况中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是选自野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶和从商购的野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶定向进化产生的S-甲基-5-硫代核糖激酶的一种或多种S-甲基-5-硫代核糖激酶。在具体情况下，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶选自从商购的野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶定向进化产生的S-甲基-5-硫代核糖激酶，所述野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶具有如上SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列；在具体的出现中，包含如上SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如上SEQ ID NO:2所示的DNA序列编码。在这第一种情况的具体出现中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是S-甲基-5-硫代核糖激酶，其包含如上SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。在此类出现的具体情况中，包含如上SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如上SEQ ID NO:4所示的DNA序列编码。在这第一种情况的具体出现中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是包含如上SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如上SEQ ID NO:6所示的DNA序列编码。在这种情况的特定出现中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是包含如上SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如上SEQ ID NO:8所示的DNA序列编码。在这种情况的具体出现中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是包含如上SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQID NO:9所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如上SEQ ID NO:10所示的DNA序列编码。在这种情况的具体出现中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是包含如上SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如上SEQ IDNO:12所示的DNA序列编码。在这种情况的具体出现中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是包含如上SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶。
在一些情况下，至少一种酶是基于SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、12或13的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶，并且可包含与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、12或13的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种酶是由SEQ ID NO:2、4、6、8或10的DNA序列编码的S-甲基-5-硫代核糖激酶，并且可包含与SEQ IDNO:2、4、6、8或10的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第六实施方式的第二个方面的第二种情况中，至少一种乙酸激酶是选自野生型乙酸激酶和从商购的野生型乙酸激酶定向进化产生的乙酸激酶的一种或多种乙酸激酶。在具体情况下，至少一种乙酸激酶选自从商购的野生型乙酸激酶定向进化产生的乙酸激酶，所述野生型乙酸激酶具有如上SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。在具体的出现中，包含如上SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的野生型乙酸激酶可以由如上SEQ ID NO:15所示的DNA序列编码。在这第二种情况的特定出现中，至少一种乙酸激酶是包含如上SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的乙酸激酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的乙酸激酶可以由如上SEQ ID NO:17所示的DNA序列编码。
在这第二种情况的一些情况下，至少一种乙酸激酶是基于SEQ ID NO:14或16的氨基酸序列的乙酸激酶，并且可以包含与SEQ IDNO:14或16的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第二种情况的一些情况下，至少一种乙酸激酶是由SEQ IDNO:15或17的DNA序列编码的乙酸激酶，并且可包含与SEQ IDNO:15或17的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第六实施方式的第二个方面的第三种情况中，至少一种丙酮酸氧化酶是选自野生型丙酮酸氧化酶和从商购的野生型丙酮酸氧化酶定向进化产生的丙酮酸氧化酶的一种或多种丙酮酸氧化酶。在具体情况下，至少一种丙酮酸氧化酶选自从商购的野生型丙酮酸氧化酶定向进化产生的丙酮酸氧化酶，所述野生型丙酮酸氧化酶具有如上SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的。在具体情况下，具有如上SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列的野生型丙酮酸氧化酶可以由如上SEQ IDNO:19所示的DNA序列编码。在这第三种情况的具体出现中，至少一种丙酮酸氧化酶是包含如上SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶可以由如上SEQ ID NO:21所示的DNA序列编码。在这第三种情况的具体出现中，至少一种丙酮酸氧化酶是包含如上SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶可以由如上SEQ ID NO:23所示的DNA序列编码。在这第三种情况的具体出现中，至少一种丙酮酸氧化酶是包含如上SEQID NO:24所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶。
在一些情况下，至少一种丙酮酸氧化酶是基于SEQ ID NO:18、20、22或24的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶，并且可包含与SEQ IDNO:18、20、22或24的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种丙酮酸氧化酶是由SEQ ID NO:19、21或23的DNA序列编码的丙酮酸氧化酶，并且可包含与SEQ IDNO:19、21或23的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或任何组合这类变化。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第六实施方式的第二个方面的第四种情况中，至少一种过氧化氢酶是选自野生型过氧化氢酶和从商购的野生型过氧化氢酶定向进化产生的过氧化氢酶的一种或多种过氧化氢酶。在特定情况下，至少一种过氧化氢酶选自从商购的野生型过氧化氢酶定向进化产生的过氧化氢酶，所述商购的野生型过氧化氢酶包括从Roche DiagnosticsInternational Ltd.以产品号11650645103商购的过氧化氢酶。在这第四种情况的特定情况下，至少一种过氧化氢酶是包含如上SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的野生型过氧化氢酶。在此类情况的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的过氧化氢酶可以由如上SEQ ID NO:53所示的DNA序列编码。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ IDNO:52所示的氨基酸序列的过氧化氢酶可以由如上SEQ ID NO:54所示的DNA序列编码。
在一些情况下，至少一种过氧化氢酶与从Roche Diagnostics InternationalLtd.以产品号11650645103商购的过氧化氢酶的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些情况下，至少一种过氧化氢酶与参考序列SEQ ID NO:52至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种过氧化氢酶由与可从Roche DiagnosticsInternational Ltd.以产品号11650645103商购的过氧化氢酶的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的DNA序列编码。在一些情况下，至少一种过氧化氢酶由与SEQ ID NO:53或54至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的DNA序列编码。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第六实施方式的第二个方面的第五种情况中，至少一种尿苷磷酸化酶是选自野生型尿苷磷酸化酶和从商购的野生型尿苷磷酸化酶定向进化产生的尿苷磷酸化酶的一种或多种尿苷磷酸化酶。在特定情况下，至少一种尿苷磷酸化酶选自从商购的野生型尿苷磷酸化酶定向进化产生的尿苷磷酸化酶，所述野生型尿苷磷酸化酶具有如上SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。在特定的出现中，包含如上SEQ IDNO:25所示的氨基酸序列的野生型尿苷磷酸化酶可以由如上SEQ IDNO:26所示的DNA序列编码。在这第五种情况的特定出现中，至少一种尿苷磷酸化酶选自具有如上SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在这第五种情况的特定出现时，至少一种尿苷磷酸化酶选自具有如上SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶可以由如上SEQ ID NO:29所示的DNA序列编码。在特定情况下，至少一种尿苷磷酸化酶选自具有如上文SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶选自具有如上SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ IDNO:47所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在特定情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。
在一些情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是基于SEQ ID NO:25、27、28、30、31、45、46、47、48、49、50或51的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶，并且可以包含与SEQ ID NO:25、27、28、30、31、45、46、47、48、49、50或51的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是由SEQ ID NO:26或29的DNA序列编码的尿苷磷酸化酶，并且可包含与SEQ ID NO:26或29的翻译的参考序列为至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在第二个方面的第六种情况下，至少一种核糖激酶是选自野生型核糖激酶和从商购野生型核糖激酶定向进化产生的核糖激酶的一种或多种核糖激酶。在具体出现中，至少一种核糖激酶是野生型核糖激酶，其包含如下SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
MQNAGSLVVLGSINADHILNLQSFPTPGETVTGNHYQVAFGGKGANQAVAAGRSGANIAFIACTGDDSIGESVRQQLATDNIDITPVSVIKGESTGVALIFVNGEGENVIGIHAGANAALSPALVEAQRERIANASALLMQLESPLESVMAAAKIAHQNKTIVALNPAPARELPDELLALVDIITPNETEAEKLTGIRVENDEDAAKAAQVLHEKGIRTVLITLGSRGVWASVNGEGQRVPGFRVQAVDTIAAGDTFNGALITALLEEKPLPEAIRFAHAAAAIAVTRKGAQPSVPWREEIDAFLDRQR(SEQ IDNO:32)
在具体的出现中，包含如上SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的野生型核糖激酶可以由如下SEQ ID NO:33所示的DNA序列编码。
ATGCAAAACGCAGGCAGCCTCGTTGTTCTTGGCAGCATTAATGCTGACCACATTCTTAATCTTCAATCTTTTCCTACTCCAGGCGAAACCGTAACCGGTAACCACTATCAGGTTGCATTTGGCGGCAAAGGCGCGAATCAGGCTGTGGCTGCTGGGCGTAGCGGTGCGAATATCGCGTTTATTGCCTGTACGGGTGATGACAGCATTGGTGAGAGCGTTCGCCAGCAGCTCGCCACTGATAACATTGATATTACTCCGGTCAGCGTGATCAAAGGCGAATCAACAGGTGTGGCGCTGATTTTTGTTAATGGCGAAGGTGAGAATGTCATCGGTATTCATGCCGGCGCTAATGCTGCCCTTTCCCCGGCGCTGGTGGAAGCGCAACGTGAGCGTATTGCCAACGCGTCAGCATTATTAATGCAGCTGGAATCACCACTCGAAAGTGTGATGGCAGCGGCGAAAATCGCCCATCAAAATAAGACTATCGTTGCGCTTAACCCGGCTCCGGCTCGCGAACTTCCTGACGAACTGCTGGCGCTGGTGGACATTATTACGCCAAACGAAACGGAAGCAGAAAAGCTCACCGGTATTCGTGTTGAAAATGATGAAGATGCAGCGAAGGCGGCGCAGGTACTGCATGAAAAAGGTATCCGTACTGTACTGATTACTTTAGGAAGTCGTGGTGTATGGGCTAGCGTGAATGGTGAAGGTCAGCGCGTTCCTGGATTCCGGGTGCAGGCTGTCGATACCATTGCTGCCGGAGATACCTTTAACGGTGCGTTAATCACGGCATTGCTGGAAGAAAAACCATTGCCAGAGGCGATTCGTTTTGCCCATGCTGCCGCTGCGATTGCCGTAACACGTAAAGGCGCACAACCTTCCGTACCGTGGCGTGAAGAGATCGACGCATTTTTAGACAGGCAGAGGTAA(SEQ ID NO:33)
在一些情况下，至少一种核糖激酶是基于SEQ ID NO:32的氨基酸序列的核糖激酶，并且可包含与SEQ ID NO:32的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非氨基酸序列差异。保守性、保守性以及非保守性和保守性氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种核糖激酶是由SEQ ID NO:33的DNA序列编码的核糖激酶，并且可包含与SEQ ID NO:33的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在第二个方面的第七种情况中，至少一种磷酸戊糖变位酶是选自野生型磷酸戊糖变位酶和从商购的野生型磷酸戊糖变位酶定向进化产生的磷酸戊糖变位酶的一种或多种磷酸戊糖变位酶。在具体的出现中，至少一种磷酸戊糖变位酶是野生型磷酸戊糖变位酶，其包含如下SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
MKRAFIMVLDSFGIGATEDAERFGDVGADTLGHIAEACAKGEADNGRKGPLNLPNLTRLGLAKAHEGSTGFIPAGMDGNAEVIGAYAWAHEMSSGKDTPSGHWEIAGVPVLFEWGYFSDHENSFPQELLDKLVERANLPGYLGNCHSSGTVILDQLGEEHMKTGKPIFYTSADSVFQIACHEETFGLDKLYELCEIAREELTNGGYNIGRVIARPFIGDKAGNFQRTGNRHDLAVEPPAPTVLQKLVDEKHGQVVSVGKIADIYANCGITKKVKATGLDALFDATIKEMKEAGDNTIVFTNFVDFDSSWGHRRDVAGYAAGLELFDRRLPELMSLLRDDDILILTADHGCDPTWTGTDHTREHIPVLVYGPKVKPGSLGHRETFADIGQTLAKYFGTSDMEYGKAMF(SEQ ID NO:34)
在具体的出现中，包含如上SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的野生型磷酸戊糖变位酶可以由如下SEQ ID NO:35所示的DNA序列编码。
ATGAAACGTGCATTTATTATGGTGCTGGACTCATTCGGCATCGGCGCTACAGAAGATGCAGAACGCTTTGGTGACGTCGGGGCTGACACCCTGGGTCATATCGCAGAAGCTTGTGCCAAAGGCGAAGCTGATAACGGTCGTAAAGGCCCGCTCAATCTGCCAAATCTGACCCGTCTGGGGCTGGCGAAAGCACACGAAGGTTCTACCGGTTTCATTCCGGCGGGAATGGACGGCAACGCTGAAGTTATCGGCGCGTACGCATGGGCGCACGAAATGTCATCCGGTAAAGATACCCCGTCTGGTCACTGGGAAATTGCCGGTGTCCCGGTTCTGTTTGAGTGGGGATATTTCTCCGATCACGAAAACAGCTTCCCGCAAGAGCTGCTGGATAAACTGGTCGAACGCGCTAATCTGCCGGGTTACCTCGGTAACTGCCACTCTTCCGGTACGGTCATTCTGGATCAACTGGGCGAAGAGCACATGAAAACCGGCAAGCCGATTTTCTATACCTCCGCTGACTCCGTGTTCCAGATTGCCTGCCATGAAGAAACTTTCGGTCTGGATAAACTCTACGAACTGTGCGAAATCGCCCGTGAAGAGCTGACCAACGGCGGCTACAATATCGGTCGTGTTATCGCTCGTCCGTTTATCGGCGACAAAGCCGGTAACTTCCAGCGTACCGGTAACCGTCACGACCTGGCTGTTGAGCCGCCAGCACCGACCGTGCTGCAGAAACTGGTTGATGAAAAACACGGCCAGGTGGTTTCTGTCGGTAAAATTGCGGACATCTACGCCAACTGCGGTATCACCAAAAAAGTGAAAGCGACTGGCCTGGACGCGCTGTTTGACGCCACCATCAAAGAGATGAAAGAAGCGGGTGATAACACCATCGTCTTCACCAACTTCGTTGACTTCGACTCTTCCTGGGGCCACCGTCGCGACGTCGCCGGTTATGCCGCGGGTCTGGAACTGTTCGACCGCCGTCTGCCGGAGCTGATGTCTCTGCTGCGCGATGACGACATCCTGATCCTCACCGCTGACCACGGTTGCGATCCGACCTGGACCGGTACTGACCACACGCGTGAACACATTCCGGTACTGGTATATGGCCCGAAAGTAAAACCGGGCTCACTGGGTCATCGTGAAACCTTCGCGGATATCGGCCAGACTCTGGCAAAATATTTTGGTACTTCTGATATGGAATATGGCAAAGCCATGTTCTAA(SEQ ID NO:35)
在这第七种情况的具体出现中，至少一种磷酸戊糖变位酶是包含如下SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的磷酸戊糖变位酶。
MKRAFIMVLDSFGIGATEDAERFGDVGADTLGHIAEACAKGEADNGRKGPLNLPNLTRLGLAKAHEGSTGFIPAGMDGNAEVIGAYAWAHEMSSGKDTPSGHWEIAGVPVLFEWGYFSDHENSFPQELLDKLVERANLPGYLGNCHSSGTVILDQLGEEHMKTGKPIFYTSADSVFQIACHEETFGLDKLYELCEIAREELTNGGYNIGRVIARPFIGDKAGNFQRTGNRRDLAVEPPAPTVLQKLVDEKHGQVVSVGKIADIYANCGITKKVKATGLDALFDATIKEMKEAGDNTIVFTNFVDFDSSWGHRRDVAGYAAGLELFDRRLPELMSLLRDDDILILTADHGCDPTWTGTDHTREHIPVLVYGPKVKPGSLGHRETFADIGQTLAKYFGTSDMEYGKAMFHHHHHH(SEQ ID NO:36)
在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的磷酸戊糖变位酶可由如下SEQ ID NO:37所示的DNA编码。
ATGAAACGTGCATTTATTATGGTGCTGGACTCATTCGGCATCGGCGCTACAGAAGATGCAGAACGCTTTGGTGACGTCGGGGCTGACACCCTGGGTCATATCGCAGAAGCTTGTGCCAAAGGCGAAGCTGATAACGGTCGTAAAGGCCCGCTCAATCTGCCAAATCTGACCCGTCTGGGGCTGGCGAAAGCACACGAAGGTTCTACCGGTTTCATTCCGGCGGGAATGGACGGCAACGCTGAAGTTATCGGCGCGTACGCATGGGCGCACGAAATGTCATCCGGTAAAGATACCCCGTCTGGTCACTGGGAAATTGCCGGTGTCCCGGTTCTGTTTGAGTGGGGATATTTCTCCGATCACGAAAACAGCTTCCCGCAAGAGCTGCTGGATAAACTGGTCGAACGCGCTAATCTGCCGGGTTACCTCGGTAACTGCCACTCTTCCGGTACGGTCATTCTGGATCAACTGGGCGAAGAGCACATGAAAACCGGCAAGCCGATTTTCTATACCTCCGCTGACTCCGTGTTCCAGATTGCCTGCCATGAAGAAACTTTCGGTCTGGATAAACTCTACGAACTGTGCGAAATCGCCCGTGAAGAGCTGACCAACGGCGGCTACAATATCGGTCGTGTTATCGCTCGTCCGTTTATCGGCGACAAAGCCGGTAACTTCCAGCGTACCGGTAACCGTCGTGACCTGGCTGTTGAGCCGCCAGCACCGACCGTGCTGCAGAAACTGGTTGATGAAAAACACGGCCAGGTGGTTTCTGTCGGTAAAATTGCGGACATCTACGCCAACTGCGGTATCACCAAAAAAGTGAAAGCGACTGGCCTGGACGCGCTGTTTGACGCCACCATCAAAGAGATGAAAGAAGCGGGTGATAACACCATCGTCTTCACCAACTTCGTTGACTTCGACTCTTCCTGGGGCCACCGTCGCGACGTCGCCGGTTATGCCGCGGGTCTGGAACTGTTCGACCGCCGTCTGCCGGAGCTGATGTCTCTGCTGCGCGATGACGACATCCTGATCCTCACCGCTGACCACGGTTGCGATCCGACCTGGACCGGTACTGACCACACGCGTGAACACATTCCGGTACTGGTATATGGCCCGAAAGTAAAACCGGGCTCACTGGGTCATCGTGAAACCTTCGCGGATATCGGCCAGACTCTGGCAAAATATTTTGGTACTTCTGATATGGAATATGGCAAAGCCATGTTCCATCATCATCACCATCATTAA(SEQ ID NO:37)
在这第七种情况的具体出现中，至少一种磷酸戊糖变位酶是包含如下SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的磷酸戊糖变位酶。
MKRAFIMVLDSFGIGATEDAEKFGDVGADTLGHIAEACAKGEADNGRKGPLNVPNLTRLGLAKAHEGSTGFIPAGMDGNAEVIGAYAWAHEMSSGKDTPSGHWEIAGVPVLFEWGYFSDLENSFPQELLDKLVERANLPGYLGNCHSSGTVILDQLGEEHMKTGKPIFYTSADSVFQIACHEETFGLDKLYELCEIAREELTNGGYNIGRVIARPFIGDKAGNFQRTGNRRDLAVEPPAPTVLQKLVDEKHGQVVGVGKIADIYANCGITKKVKATGLDALFDTTIKEMKEAGDNTIVFTNFVDFDSSWGHRRDVAGYAAGLELFDRRLPELMSLLRDDDILILTADHGCDPTWTGTDHTREHIPVLVYGPKVKPGSLGHRETFADIGQTLAKYFGTSDMEYGKAMFHHHHHH(SEQ ID NO:38)
在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的磷酸戊糖变位酶可以由如下SEQ ID NO:39所示的DNA序列编码。
ATGAAACGTGCATTTATTATGGTGCTGGACTCATTCGGCATCGGCGCTACAGAAGATGCAGAAAAGTTTGGTGACGTCGGGGCTGACACCCTGGGTCATATCGCAGAAGCTTGTGCCAAAGGCGAAGCTGATAACGGTCGTAAAGGCCCGCTCAATGTGCCAAATCTGACCCGTCTGGGGCTGGCGAAAGCGCACGAAGGCTCTACCGGTTTCATTCCGGCGGGAATGGACGGCAACGCTGAAGTTATCGGCGCGTACGCATGGGCGCACGAAATGTCATCCGGTAAAGATACCCCGTCTGGTCACTGGGAAATTGCCGGTGTCCCGGTTCTGTTCGAGTGGGGATATTTCTCCGATCTGGAAAACAGCTTCCCGCAAGAGCTGCTGGATAAACTGGTCGAACGCGCTAATCTGCCGGGTTACCTCGGTAACTGCCACTCTTCCGGTACGGTCATTCTGGATCAACTGGGCGAAGAGCACATGAAAACCGGCAAGCCGATTTTCTATACCTCCGCTGACTCCGTGTTCCAGATTGCCTGCCATGAAGAAACTTTCGGTCTGGATAAACTCTACGAACTGTGCGAAATCGCCCGTGAAGAGCTGACCAACGGCGGCTACAATATCGGTCGTGTTATCGCTCGTCCGTTTATCGGCGACAAAGCCGGTAACTTCCAGCGTACCGGTAACCGTCGTGACCTGGCTGTTGAGCCGCCAGCACCGACCGTGCTGCAGAAACTGGTTGATGAAAAACACGGCCAGGTGGTAGGCGTCGGTAAAATTGCGGACATCTACGCCAACTGCGGTATCACCAAAAAAGTGAAAGCGACTGGCCTGGACGCGCTGTTTGACACTACCATCAAAGAGATGAAAGAAGCGGGTGATAACACCATCGTCTTCACCAACTTCGTTGACTTCGACTCTTCCTGGGGCCACCGTCGCGACGTCGCCGGTTATGCCGCGGGTCTGGAACTGTTCGACCGCCGTCTGCCGGAGCTGATGTCTCTGCTGCGCGATGACGACATCCTGATCCTCACCGCTGACCACGGTTGCGATCCGACCTGGACCGGTACTGACCACACGCGTGAACACATTCCGGTACTGGTATATGGCCCGAAAGTAAAACCGGGCTCACTGGGTCATCGTGAAACCTTCGCGGATATCGGCCAGACTCTGGCAAAATATTTTGGTACTTCTGATATGGAATATGGCAAAGCCATGTTCCATCATCATCACCATCATTAA(SEQ ID NO:39)
在一些情况下，至少一种磷酸戊糖变位酶是基于SEQ ID NO:34、36或38的氨基酸序列的磷酸戊糖变位酶，并且可以包含与SEQ IDNO:34、36或38的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种磷酸戊糖变位酶是由SEQ ID NO:35、37或39的DNA序列编码的磷酸戊糖变位酶，并且可包含与SEQ IDNO:35、37或39的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在第二个方面的第八种情况中，至少一种蔗糖磷酸化酶是选自野生型蔗糖磷酸化酶和从商购的野生型蔗糖磷酸化酶定向进化产生的蔗糖磷酸化酶的一种或多种蔗糖磷酸化酶。在具体出现中，至少一种蔗糖磷酸化酶是野生型蔗糖磷酸化酶，其包含如下SEQ IDNO:40所示的氨基酸序列：
MKNKVQLITYADRLGDGTLKSMTETLRKHFEGVYEGVHILPFFTPFDGADAGFDPVDHTKVDPRLGSWDDVAELSTTHDIMVDTIVNHMSWESEQFQDVMAKGEDSEYYPMFLTMSSIFPDGVTEEDLTAIYRPRPGLPFTHYNWGGKTRLVWTTFTPQQVDIDTDSEMGWNYLLSILDQLSQSHVSQIRLDAVGYGAKEKNSSCFMTPKTFKLIERIKAEGEKRGLETLIEVHSYYKKQVEIASKVDRVYDFAIPGLLLHALEFGKTDALAQWIDVRPNNAVNVLDTHDGIGVIDIGSDQMDRSLAGLVPDEEVDALVESIHRNSKGESQEATGAAASNLDLYQVNCTYYAALGSDDQKYIAARAVQFFMPGVPQVYYVGALAGSNDMDLLKRTNVGRDINRHYYSAAEVASEVERPVVQALNALGRFRNTLSAFDGEFSYSNADGVLTMTWADDATRATLTFAPKANSNGASVARLEWTDAAGEHATDDLIANPPVVA(SEQ ID NO:40)
在这第八种情况的具体出现中，所述至少一种蔗糖磷酸化酶是包含如下SEQ IDNO:41所示的氨基酸序列的蔗糖磷酸化酶。
MKNKVQLITYADRLGDGTLKSMTETLRKHFEGVYEGVHILPFFTPFDGADAGFDPVDHTKVDPRLGSWDDVAELSTTHDIMVDTIVNHMSWESEQFQDVMAKGEDSEYYPMFLTMSSIFPDGVTEEDLTAIYRPRPGLPFTHYNWGGKTRLVWTTFTRQQVDIDTDSEMGWNYLLSILDQLSQSHVSQIRLDAVGYGAKEKNSSCFLTPKTFKLVERIKAEGEKRGLETLIEVHSYYKKQVEIASKVDRVYDFAIPGLLLHALEFGKTDALAQWIDVRPNNAVNVLDTHDGIGVIDIGSDQMDRSLAGLVPDEEVDALVESIHRNSKGESQEATGAAASNLDLYQVNCTYYAALGSDDQKYIAARAVQFFMPGVPQVYYVGALAGSNDMDLLKRTNSGRGINRHYYSAAEVASEVERPVVQALNALGRFRNTLSAFDGEFSYSNADGVLTMTWADDATRATLTFAPKANSNGASVARLEWTDAAGEHATDDLIANPPVVA(SEQ ID NO:41)
在具体情况下，包含如上SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的蔗糖磷酸化酶可以由如下SEQ ID NO:42所示的DNA序列编码。
ATGAAGAACAAAGTTCAACTGATTACCTATGCGGATCGTCTGGGTGACGGCACCCTGAAGAGCATGACCGAGACCCTGCGTAAACACTTCGAGGGTGTTTATGAAGGCGTGCACATCCTGCCGTTCTTTACCCCGTTCGATGGTGCGGACGCGGGCTTTGATCCGGTTGACCACACCAAAGTGGACCCGCGTCTGGGTAGCTGGGACGATGTGGCGGAACTGAGCACCACCCACGATATCATGGTTGACACCATTGTGAACCACATGAGCTGGGAGAGCGAACAGTTCCAAGATGTTATGGCGAAGGGCGAGGACAGCGAATACTATCCGATGTTCCTGACCATGAGCAGCATTTTTCCGGATGGTGTGACCGAGGAAGACCTGACCGCGATCTATCGTCCGCGTCCGGGTCTGCCGTTCACCCACTATAACTGGGGTGGCAAAACCCGTCTGGTTTGGACCACCTTTACCCGTCAGCAAGTGGACATTGATACCGACAGCGAGATGGGTTGGAACTACCTGCTGAGCATCCTGGATCAGCTGAGCCAAAGCCACGTTAGCCAAATTCGTCTGGACGCGGTGGGTTATGGCGCGAAGGAGAAAAACAGCAGCTGCTTCCTGACCCCGAAGACCTTTAAACTGGTCGAACGTATTAAGGCGGAGGGTGAAAAACGTGGCCTGGAGACCCTGATCGAAGTTCACAGCTACTATAAGAAACAGGTGGAGATTGCGAGCAAGGTGGATCGTGTTTACGACTTTGCGATCCCGGGTCTGCTGCTGCATGCGCTGGAATTTGGCAAAACCGATGCGCTGGCGCAATGGATTGACGTTCGTCCGAACAACGCGGTGAACGTTCTGGATACCCACGACGGTATCGGCGTTATCGATATTGGTAGCGATCAGATGGACCGTAGCCTGGCGGGTCTGGTGCCGGATGAGGAAGTTGACGCGCTGGTTGAGAGCATCCACCGTAACAGCAAGGGTGAAAGCCAGGAAGCGACCGGCGCGGCGGCGAGCAACCTGGACCTGTACCAAGTTAACTGCACCTACTATGCGGCGCTGGGTAGCGACGATCAGAAATATATTGCGGCGCGTGCGGTGCAGTTCTTTATGCCGGGCGTGCCGCAAGTTTACTATGTGGGTGCGCTGGCGGGCAGCAACGATATGGACCTGCTGAAGCGTACCAACAGTGGTCGTGGCATCAACCGTCACTACTATAGCGCGGCGGAAGTGGCGAGCGAGGTGGAACGTCCGGTGGTTCAGGCGCTGAACGCGCTGGGCCGTTTCCGTAACACCCTGAGCGCGTTCGATGGTGAATTTAGCTACAGCAACGCGGACGGCGTTCTGACCATGACCTGGGCGGATGATGCGACCCGTGCGACCCTGACCTTTGCGCCGAAGGCGAACAGCAACGGTGCGAGCGTGGCGCGTCTGGAGTGGACCGATGCGGCGGGTGAACATGCGACCGACGATCTGATCGCGAACCCGCCGGTGGTTGCGTAA(SEQ IDNO:42)
在这第八种情况的具体出现中，至少一种蔗糖磷酸化酶是包含如下SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的蔗糖磷酸化酶。
MKNKVQLITYADRLGDGTLKSMTETLRKHFEGVYEGVHILPFFTPFDGADAGFDPVDHTKVDPRLGSWDDVAELSTTHDIMVDTIVNHMSWESEQFQDVMAKGEDSEYYPMFLTMSSIFPDGVTEEDLTAIYRPRPGLPFTHYNWGGKTRLVWTTFTRQQVDIDTDSEMGWNYLLSILDQLSQSHVSQIRLDAVGYGAKEKNSSCFLTPKTFKLVERIKAEGEKRGLETLIEVHSYYKKQVEIASKVDRVYDFAIPGLLLHALEFGKTDALAQWIDVRPNNAVNVLDTHDGIGVIDIGSDQMDRSLAGLVPDEEVDALVESIHRNSKGESQEATGAAASNLDLYQVNCTYYAALGSDDQKYIAARAVQFFMPGVPQVYYVGALAGSNDMDLLKRTNSGRGINRHYYSAAEVASEVERPVVQALNALGRFRNTLSAFDGEFSYSNADGVLTMTWADDATRATLTFAPKANSNGASVARLEWTDAAGEHATDDLIANPPVVAGQTGHHHHHH(SEQ ID NO:43)
在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的蔗糖磷酸化酶可以由如下SEQ ID NO:44所示的DNA序列编码。
ATGAAGAACAAAGTTCAACTGATTACCTATGCGGATCGTCTGGGTGACGGCACCCTGAAGAGCATGACCGAGACCCTGCGTAAACACTTCGAGGGTGTTTATGAAGGCGTGCACATCCTGCCGTTCTTTACCCCGTTCGATGGTGCGGACGCGGGCTTTGATCCGGTTGACCACACCAAAGTGGACCCGCGTCTGGGTAGCTGGGACGATGTGGCGGAACTGAGCACCACCCACGATATCATGGTTGACACCATTGTGAACCACATGAGCTGGGAGAGCGAACAGTTCCAAGATGTTATGGCGAAGGGCGAGGACAGCGAATACTATCCGATGTTCCTGACCATGAGCAGCATTTTTCCGGATGGTGTGACCGAGGAAGACCTGACCGCGATCTATCGTCCGCGTCCGGGTCTGCCGTTCACCCACTATAACTGGGGTGGCAAAACCCGTCTGGTTTGGACCACCTTTACCCGTCAGCAAGTGGACATTGATACCGACAGCGAGATGGGTTGGAACTACCTGCTGAGCATCCTGGATCAGCTGAGCCAAAGCCACGTTAGCCAAATTCGTCTGGACGCGGTGGGTTATGGCGCGAAGGAGAAAAACAGCAGCTGCTTCCTGACCCCGAAGACCTTTAAACTGGTCGAACGTATTAAGGCGGAGGGTGAAAAACGTGGCCTGGAGACCCTGATCGAAGTTCACAGCTACTATAAGAAACAGGTGGAGATTGCGAGCAAGGTGGATCGTGTTTACGACTTTGCGATCCCGGGTCTGCTGCTGCATGCGCTGGAATTTGGCAAAACCGATGCGCTGGCGCAATGGATTGACGTTCGTCCGAACAACGCGGTGAACGTTCTGGATACCCACGACGGTATCGGCGTTATCGATATTGGTAGCGATCAGATGGACCGTAGCCTGGCGGGTCTGGTGCCGGATGAGGAAGTTGACGCGCTGGTTGAGAGCATCCACCGTAACAGCAAGGGTGAAAGCCAGGAAGCGACCGGCGCGGCGGCGAGCAACCTGGACCTGTACCAAGTTAACTGCACCTACTATGCGGCGCTGGGTAGCGACGATCAGAAATATATTGCGGCGCGTGCGGTGCAGTTCTTTATGCCGGGCGTGCCGCAAGTTTACTATGTGGGTGCGCTGGCGGGCAGCAACGATATGGACCTGCTGAAGCGTACCAACAGTGGTCGTGGCATCAACCGTCACTACTATAGCGCGGCGGAAGTGGCGAGCGAGGTGGAACGTCCGGTGGTTCAGGCGCTGAACGCGCTGGGCCGTTTCCGTAACACCCTGAGCGCGTTCGATGGTGAATTTAGCTACAGCAACGCGGACGGCGTTCTGACCATGACCTGGGCGGATGATGCGACCCGTGCGACCCTGACCTTTGCGCCGAAGGCGAACAGCAACGGTGCGAGCGTGGCGCGTCTGGAGTGGACCGATGCGGCGGGTGAACATGCGACCGACGATCTGATCGCGAACCCGCCGGTGGTTGCGGGCCAAACTGGCCACCATCACCATCACCATTAGTAA(SEQ ID NO:44)
在一些情况下，至少一种蔗糖磷酸化酶是基于SEQ ID NO:40、41或43的氨基酸序列的蔗糖磷酸化酶，并且可包含与SEQ ID NO:40、41或43的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种蔗糖磷酸化酶是由SEQ ID NO:42或44的DNA序列编码的蔗糖磷酸化酶，并且可包含与SEQ ID NO:42或44的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第六实施方式的第三个方面中，反应在至少一种溶剂的存在下进行。在这个方面的实例中，至少一种溶剂选自水性溶剂、有机溶剂及其混合物。在这个方面的特定情况下，至少一种溶剂选自水。在这个方面的其他特定情况下，至少一种溶剂选自DME、苯甲醚、叔丁醇、叔戊醇、丙酮、1,2-亚丙基碳酸酯、1,3-二氧杂环戊烷、乙腈、乙酸乙酯、甲基叔丁醚、环戊基甲醚、氯苯、异丙醇、乙酸异丙酯、2-丁酮及其混合物。在这个方面的再进一步的实例中，至少一种溶剂是水和至少一种选自DME、苯甲醚、叔丁醇、叔戊醇、丙酮、1,2-亚丙基碳酸酯、1,3-二氧杂环戊烷、乙腈、乙酸乙酯、甲基叔丁醚、环戊基甲醚、氯苯、异丙醇、乙酸异丙酯、2-丁酮及其混合物的有机溶剂。
本公开的方法的第七实施方式包括(a)使核糖与尿嘧啶在至少一种酶的存在下反应以形成尿苷；(b)使尿苷与至少一种异丁酰基供体在至少一种脂肪酶的存在下反应以形成5'-异丁酰尿苷；和(c)使5'-异丁酰尿苷与至少一种羟胺源在至少一种激活剂的存在下反应以产生化合物B：
在这第七实施方式的第一个方面中，相对于核糖的量，尿嘧啶以约0.5至约1.2当量的量提供，如约0.8当量的量。
在这第七实施方式的第二个方面中，至少一种酶选自至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种乙酸激酶、至少一种丙酮酸氧化酶、至少一种过氧化氢酶、至少一种尿苷磷酸化酶、至少一种核糖激酶、至少一种磷酸戊糖变位酶和至少一种蔗糖磷酸化酶，及其混合物。
在这第二个方面的情况中，至少一种酶是选自至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种乙酸激酶、至少一种丙酮酸氧化酶、至少一种过氧化氢酶、至少一种尿苷磷酸化酶、至少一种核糖激酶、至少一种磷酸戊糖变位酶和至少一种蔗糖磷酸化酶的至少两种酶的混合物。在一些情况下，至少一种酶是选自至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种乙酸激酶、至少一种丙酮酸氧化酶、至少一种过氧化氢酶、至少一种尿苷磷酸化酶、至少一种核糖激酶、至少一种磷酸戊糖变位酶和至少一种蔗糖磷酸化酶的至少三种酶的混合物。在另外的情况下，至少一种酶是选自至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种乙酸激酶、至少一种丙酮酸氧化酶、至少一种过氧化氢酶、至少一种尿苷磷酸化酶、至少一种核糖激酶、至少一种磷酸戊糖变位酶和至少一种蔗糖磷酸化酶的至少四种酶的混合物。在另外的情况下，至少一种酶是选自至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种乙酸激酶、至少一种丙酮酸氧化酶、至少一种过氧化氢酶、至少一种尿苷磷酸化酶、至少一种核糖激酶、至少一种磷酸戊糖变位酶和至少一种蔗糖磷酸化酶的至少五种酶的混合物。在特定情况下，至少一种酶是至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种乙酸激酶、至少一种丙酮酸氧化酶、至少一种过氧化氢酶和至少一种尿苷磷酸化酶的混合物。在其他特定情况下，至少一种酶是至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种尿苷磷酸化酶和至少一种蔗糖磷酸化酶的混合物。在另外的特定情况下，至少一种酶是至少一种乙酸激酶、至少一种丙酮酸氧化酶、至少一种过氧化氢酶、至少一种尿苷磷酸化酶、至少一种核糖激酶和至少一种磷酸戊糖变位酶的混合物。在其他特定情况下，至少一种酶是至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种乙酸激酶、至少一种尿苷磷酸化酶、至少一种核糖激酶、至少一种磷酸戊糖变位酶和至少一种蔗糖磷酸化酶的混合物。在更进一步的特定情况下，至少一种酶是至少一种乙酸激酶、至少一种尿苷磷酸化酶和选自至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种丙酮酸氧化酶、至少一种过氧化氢酶、至少一种核糖激酶、至少一种磷酸戊糖变位酶和至少一种蔗糖磷酸化酶的至少两种酶的混合物。
在这第七实施方式的第二个方面的第一种情况中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶和从商购的野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶定向进化产生的S-甲基-5-硫代核糖激酶的一种或多种S-甲基-5-硫代核糖激酶。在具体情况下，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶选自从商购的野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶定向进化产生的S-甲基-5-硫代核糖激酶，所述野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶具有如上SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；在具体的出现中，包含如上SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的野生型S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如上SEQ ID NO:2所示的DNA序列编码。在这第一种情况的具体出现中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是S-甲基-5-硫代核糖激酶，其包含如上SEQID NO:3所示的氨基酸序列。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如上SEQ ID NO:4所示的DNA序列编码。在这第一种情况的具体出现中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是包含如上SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶。在这种情况的具体实例中，S-甲基-5-硫代核糖激酶包含如上SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列的DNA序列可以由如上SEQ ID NO:6所示的DNA序列编码。在这种情况的具体出现中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是包含如上SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQID NO:7所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如上SEQ ID NO:8所示的DNA序列编码。在这种情况的具体出现中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是包含如上SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如上SEQ IDNO:10所示的DNA序列编码。在这种情况的具体出现中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是包含如上SEQID NO:11所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶可以由如上SEQ ID NO:12所示的DNA序列编码。在这种情况的具体出现中，至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶是包含如上SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶。
在一些情况下，至少一种酶是基于SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、12或13的氨基酸序列的S-甲基-5-硫代核糖激酶，并且可包含与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、12或13的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种酶是由SEQ ID NO:2、4、6、8或10的DNA序列编码的S-甲基-5-硫代核糖激酶，并且可包含与SEQ IDNO:2、4、6、8或10的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第七实施方式的第二个方面的第二和情况中，至少一种乙酸激酶是选自野生型乙酸激酶和从商购的野生型乙酸激酶定向进化产生的乙酸激酶的一种或多种乙酸激酶。在具体情况下，至少一种乙酸激酶选自从商购的野生型乙酸激酶定向进化产生的乙酸激酶，所述野生型乙酸激酶具有如上SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。在具体的出现中，包含如上SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的野生型乙酸激酶可以由如上SEQ ID NO:15所示的DNA序列编码。在这第二种情况的特定出现中，至少一种乙酸激酶是包含如上SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的乙酸激酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的乙酸激酶可以由如上SEQ ID NO:17所示的DNA序列编码。
在这第二种情况的一些情况下，至少一种乙酸激酶是基于SEQ ID NO:14或16的氨基酸序列的乙酸激酶，并且可以包含与SEQ IDNO:14或16的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第二种情况的一些情况下，至少一种乙酸激酶是由SEQ IDNO:15或17的DNA序列编码的乙酸激酶，并且可包含与SEQ IDNO:15或17的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第七实施方式的第二个方面的第三种情况中，至少一种丙酮酸氧化酶是选自野生型丙酮酸氧化酶和从商购的野生型丙酮酸氧化酶定向进化产生的丙酮酸氧化酶的一种或多种丙酮酸氧化酶。在具体情况下，至少一种丙酮酸氧化酶选自从具有如上SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列的商购的野生型丙酮酸氧化酶定向进化产生的丙酮酸氧化酶。在具体情况下，具有如上SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的野生型丙酮酸氧化酶可以由如上SEQ ID NO:19所示的DNA序列编码。在这第三种情况的具体出现中，至少一种丙酮酸氧化酶是包含如上SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶可以由如上SEQ ID NO:21所示的DNA序列编码。在这第三种情况的具体出现中，至少一种丙酮酸氧化酶是包含如上SEQIDNO:22所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶可以由如上SEQ ID NO:23所示的DNA序列编码。在这第三种情况的具体出现中，至少一种丙酮酸氧化酶是包含如上SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶。
在一些情况下，至少一种丙酮酸氧化酶是基于SEQ ID NO:18、20、22或24的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶，并且可包含与SEQ IDNO:18、20、22或24的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种丙酮酸氧化酶是由SEQ ID NO:19、21或23的DNA序列编码的丙酮酸氧化酶，并且可包含与SEQ IDNO:19、21或23的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％，97％，98％或99％相同的序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第七实施方式的第二个方面的第四种情况中，至少一种过氧化氢酶是选自野生型过氧化氢酶和从商购的野生型过氧化氢酶定向进化产生的过氧化氢酶的一种或多种过氧化氢酶。在特定情况下，至少一种过氧化氢酶选自从商购的野生型过氧化氢酶定向进化产生的过氧化氢酶，所述商购的野生型过氧化氢酶包括从Roche DiagnosticsInternational Ltd.以产品号11650645103商购的过氧化氢酶。在这第四种情况的特定情况下，至少一种过氧化氢酶是包含如上SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的野生型过氧化氢酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的过氧化氢酶可以由如上SEQ ID NO:53所示的DNA序列编码。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ IDNO:52所示的氨基酸序列的过氧化氢酶可以由如上SEQ ID NO:54所示的DNA序列编码。
在一些情况下，至少一种过氧化氢酶与从Roche Diagnostics InternationalLtd.以产品号11650645103商购的过氧化氢酶的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些情况下，至少一种过氧化氢酶与参考序列SEQ ID NO:52为至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种过氧化氢酶由与从Roche Diagnostics InternationalLtd.以产品号11650645103商购的过氧化氢酶的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的DNA序列编码。在一些情况下，至少一种过氧化氢酶由与SEQ ID NO:53或54至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的DNA序列编码。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第七实施方式的第二个方面的第五种情况中，至少一种尿苷磷酸化酶是选自野生型尿苷磷酸化酶和从商购的野生型尿苷磷酸化酶定向进化产生的尿苷磷酸化酶的一种或多种尿苷磷酸化酶。在特定情况下，至少一种尿苷磷酸化酶选自从商购的野生型尿苷磷酸化酶定向进化产生的尿苷磷酸化酶，所述野生型尿苷磷酸化酶具有如上SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。在特定的出现中，包含如上SEQ IDNO:25所示的氨基酸序列的野生型尿苷磷酸化酶可以由如上SEQ IDNO:26所示的DNA序列编码。在这第五种情况的特定出现中，至少一种尿苷磷酸化酶选自具有如上SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在这第五种情况的特定出现时，至少一种尿苷磷酸化酶选自具有如上SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶可以由如上SEQ ID NO:29所示的DNA序列编码。在特定情况下，至少一种尿苷磷酸化酶选自具有如上文SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶选自具有如上SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在特定情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ IDNO:47所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。在具体情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是具有如上SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶。
在一些情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是基于SEQ ID NO:25、27、28、30、31、45、46、47、48、49、50或51的氨基酸序列的尿苷磷酸化酶，并且可以包含与SEQ ID NO:25、27、28、30、31、45、46、47、48、49、50或51的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种尿苷磷酸化酶是由SEQ ID NO:26或29的DNA序列编码的尿苷磷酸化酶，并且可包含与SEQ ID NO:26或29的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在第二个方面的第六种情况下，至少一种核糖激酶是选自野生型核糖激酶和从商购野生型核糖激酶定向进化产生的核糖激酶的一种或多种核糖激酶。在具体出现时，至少一种核糖激酶是野生型核糖激酶，其包含如上SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。在特定的情况下，包含如上SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的野生型核糖激酶可以由如上SEQ IDNO:33所示的DNA序列编码。
在一些情况下，至少一种核糖激酶是基于SEQ ID NO:32的氨基酸序列的核糖激酶，并且可包含与SEQ ID NO:32的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种核糖激酶是由SEQ ID NO:33的DNA序列编码的核糖激酶，并且可包含与SEQ ID NO:33的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在第二个方面的第七种情况中，至少一种磷酸戊糖变位酶是选自野生型磷酸戊糖变位酶和从商购的野生型磷酸戊糖变位酶定向进化产生的磷酸戊糖变位酶的一种或多种磷酸戊糖变位酶。在具体的出现中，至少一种磷酸戊糖变位酶是野生型磷酸戊糖变位酶，其包含如上文SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。在具体的出现中，包含如上SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的野生型磷酸戊糖变位酶可以由如上SEQ ID NO:35所示的DNA序列编码。在这第七种情况的具体出现时，至少一种磷酸戊糖变位酶是包含如上文SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的磷酸戊糖变位酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ IDNO:36所示的氨基酸序列的磷酸戊糖变位酶可以由如上SEQ IDNO:37所示的DNA序列编码。在这第七种情况的具体出现中，至少一种磷酸戊糖变位酶是包含如上SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的磷酸戊糖变位酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的磷酸戊糖变位酶可以由如上SEQ ID NO:39所示的DNA序列编码。
在一些情况下，至少一种磷酸戊糖变位酶是基于SEQ ID NO:34、36或38的氨基酸序列的磷酸戊糖变位酶，并且可包含与SEQ IDNO:34、36或38的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种磷酸戊糖变位酶是由SEQ ID NO:35、37或39的DNA序列编码的磷酸戊糖变位酶，并且可包含与SEQ IDNO:35、37或39的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在第二个方面的第八种情况中，至少一种蔗糖磷酸化酶是选自野生型蔗糖磷酸化酶和从商购的野生型蔗糖磷酸化酶定向进化产生的蔗糖磷酸化酶的一种或多种蔗糖磷酸化酶。在具体情况下，至少一种蔗糖磷酸化酶是野生型蔗糖磷酸化酶，其包含如上SEQ IDNO:40所示的氨基酸序列。在这第八种情况的具体出现时，至少一种蔗糖磷酸化酶是包含如上SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的蔗糖磷酸化酶。在具体的出现中，包含如上SEQ IDNO:41所示的氨基酸序列的蔗糖磷酸化酶可以由如上SEQ ID NO:42所示的DNA序列编码。在这第八种情况的具体出现时，至少一种蔗糖磷酸化酶是包含如上SEQ IDNO:43所示的氨基酸序列的蔗糖磷酸化酶。在此类出现的具体实例中，包含如上SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的蔗糖磷酸化酶可以由如上SEQ ID NO:44所示的DNA序列编码。
在一些情况下，至少一种蔗糖磷酸化酶是基于SEQ ID NO:40、41或43的氨基酸序列的蔗糖磷酸化酶，并且可以包含与SEQ IDNO:40、41或43的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种蔗糖磷酸化酶是由SEQ ID NO:42或44的DNA序列编码的蔗糖磷酸化酶，并且可包含与SEQ ID NO:42或44的翻译的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第七实施方式的第三个方面中，(a)反应在至少一种溶剂的存在下进行。在这个方面的情况中，至少一种溶剂选自水性溶剂、有机溶剂及其混合物。在这个方面的特定情况下，至少一种溶剂选自水。在这个方面的其他特定情况下，至少一种溶剂选自DME、苯甲醚、叔丁醇、叔戊醇、丙酮、1,2-亚丙基碳酸酯、1,3-二氧杂环戊烷、乙腈、乙酸乙酯、甲基叔丁醚、环戊基甲醚、氯苯、异丙醇、乙酸异丙酯、2-丁酮及其混合物。在这个方面的再更多情况中，至少一种溶剂是水和至少一种选自DME、苯甲醚、叔丁醇、叔戊醇、丙酮、1,2-亚丙基碳酸酯、1,3-二氧杂环戊烷、乙腈、乙酸乙酯、甲基叔丁醚、环戊基甲醚、氯苯、异丙醇、乙酸异丙酯、2-丁酮及其混合物的有机溶剂。
在这第七实施方式的第四个方面中，至少一种异丁酰基供体选自丙-2-酮O-异丁酰肟、异丁酸酐及其的混合物。在这第四个方面的情况中，至少一种异丁酰基供体是异丁酸酐。在这个方面的具体情况下，相对于核糖的量，至少一种异丁酰基供体以约1.0至约3.0当量的量提供，如约1.5当量的量。
在这第七实施方式的第五个方面中，至少一种脂肪酶选自野生型脂肪酶和从商购的野生型脂肪酶定向进化产生的脂肪酶。在这个方面的情况中，至少一种脂肪酶选自IMMTLL(可从ChiralVision以IMMTLL-T2-150商购获得)、IMMRES(可从ChiralVision以IMMRES-T2-150商购获得)、IMMLIPX(可从ChiralVision以IMMLIPX-T2-150商购获得)、IMMP6-T2-250(可从ChiralVision以IMMP6-T2-250商购获得)、51032(可从Strem Chemicals，Inc.以目录号06-3135商购获得)和/>435(可从Novozymes以目录号3925009-810商购获得，或可从Strem Chemicals，Inc.以目录号06-3132商购获得)。在具体情况下，至少一种脂肪酶是/>435。
在一些情况下，至少一种脂肪酶是与商购的野生型酯酶的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的脂肪酶。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，氨基酸序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在一些情况下，至少一种脂肪酶是由与商购的野生型脂肪酶的参考序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的DNA序列编码的脂肪酶。这些差异可以是氨基酸插入、缺失、置换或这些变化的任何组合。在一些情况下，序列差异可包括非保守、保守以及非保守和保守氨基酸置换的组合。
在这第七实施方式的第六个方面中，(b)反应在至少一种溶剂的存在下进行。在这个方面的情况中，至少一种溶剂选自有机溶剂及其混合物。在这个方面的特定情况下，溶剂选自DME、苯甲醚、叔丁醇、叔戊醇、丙酮、1,2-亚丙基碳酸酯、1,3-二氧杂环戊烷、乙腈、乙酸乙酯、甲基叔丁醚、环戊基甲醚、氯苯、异丙醇、乙酸异丙酯、2-丁酮及其混合物。在更特别的情况下，至少一种溶剂选自叔丁醇、叔戊醇、丙酮及其混合物。在再更特别的情况下，至少一种溶剂是丙酮。
这第七实施方式的第七个方面中，至少一种羟胺源选自羟胺硫酸盐、羟胺HCl、NH2OH及其混合物。在这第七个方面的实例中，至少一种羟胺源是硫酸羟胺。在这个方面的具体情况下，至少一种羟胺源以相对于5'-异丁酰尿苷的量以约1.0至约2.5当量羟胺的范围的量来提供羟胺，如约2.2至约2.5当量范围内的量，或约2.5当量的量。
在这第七实施方式的第八个方面中，至少一种激活剂是六甲基二硅氮烷。在这个方面的具体情况下，相对于5'-异丁酰尿苷的量，至少一种激活剂以约6.0至约8.0当量范围内的量来提供，如约8当量的量。
在这第七实施方式的第九个方面中，(c)反应在至少一种酸性添加剂的存在下进行。在这第九个方面的情况中，至少一种酸性添加剂选自硫酸氢铵、磷酸二氢铵、硫酸、硫酸氢钠、硫酸氢钾、咪唑硫酸氢盐、三乙胺硫酸氢盐、N-甲基吗啉硫酸氢盐、N-甲基咪唑硫酸氢盐、三氧化硫吡啶复合物、三氟甲磺酸、甲磺酸及其混合物。在具体情况下，至少一种酸性添加剂是硫酸氢铵。在具体情况下，相对于5'-异丁酰尿苷的量，至少一种酸性添加剂以约1.5至约3.0当量范围内的量存在。
在这第七实施方式的第十个方面中，(c)反应任选在至少一种催化剂的存在下进行。在这个方面的某些情况下，至少一种催化剂选自路易斯碱催化剂。在这第十各方面的情况中，至少一种催化剂选自N-甲基咪唑、N-甲基吗啉、1,2,4-三唑、5-(乙硫基)-1H-四唑、咪唑及其混合物。在具体情况下，至少一种催化剂是咪唑。在具体情况下，相对于5'-异丁酰尿苷的量，至少一种催化剂以约0.2至约0.5当量范围内的量存在。
在这第七实施方式的第十一个方面中，反应在至少一种溶剂的存在下进行。在这个方面的情况中，至少一种溶剂选自有机溶剂及其混合物。在这个方面的特定情况下，至少一种溶剂选自庚烷、甲苯、2-甲基四氢呋喃、四氢呋喃、DME、环丁砜及其混合物。
在第八实施方式中，本公开提供了选自以下的化合物：
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及其盐。
实施例
实施例1：5-异丁酰基核糖的合成
向2L容器中装入核糖(50g)、435(5g，可商购自Novozymes(目录号#3925009-810))、丙酮(1L)和异丁酸酐(2.0当量)。将内容物加热并在50℃下老化12h。将混合物冷却，过滤，并将固体用丙酮冲洗。将滤液在真空下浓缩至大约150ml总体积。加入MTBE(200mL)，有机溶液用各自100mL水萃取四次。将含水混合物在真空下部分浓缩至332g的最终重量。
实施例2：5'-异丁酰尿苷的合成
在反应容器中，加入大约20mL水，然后加入丙酮酸(2.455g)、KH2PO4(0.777g)和MgCl2-6H2O(102mg)。用50wt％KOH水溶液(约3.5mL)将所得溶液的pH调节至7.1。向混合物中加入5'-异丁酰基核糖(4.912g)，并将总体积调节至大约45mL。此外，将焦磷酸硫胺素(51.4mg)、三磷酸腺苷二钠盐水合物(67.5mg)和黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐(9.3mg)和消泡剂(35μL)加载到混合物中。用50wt％KOH水溶液将所得溶液的pH调节至7.0。在另一个瓶中装入SEQ ID NO:9的MTR-激酶(375mg)、SEQ ID NO:16的乙酸激酶(12.5mg)、SEQ ID NO:18的丙酮酸氧化酶(12.5mg)、过氧化氢酶(12.5ml，从Roche Diagnostics InternationalLtd.以产品号11650645103商购)，然后加入5mL含有10mM MgCl2的100mM三乙醇胺水性缓冲液(pH 7.0)，以制备酶混合物的水溶液。在100mL反应器中加入尿嘧啶(1.78g)和SEQ IDNO:28的尿苷磷酸化酶(356mg)，然后加入45mL以上制备的溶液。通过使用顶置式搅拌器在25℃下搅拌混合物，然后加入酶溶液(5mL)。将混合物在25℃下搅拌，同时通过管道喷射空气以在溶液中供应氧64h。通过HPLC检查溶液以显示5'-异丁酰尿苷的形成。
将混合物转移到具有硅藻土(3g)、MeTHF(45mL)和硫酸铵(15g)的圆底烧瓶中，并在75℃下加热30min。将混合物冷却至环境温度，过滤，弃去水相。将有机相用水洗涤两次(每次2mL)。将溶剂交换为EtOAc，并加入庚烷以使产物结晶，然后在0℃至5℃下老化。收集结晶产物并用EtOAc:庚烷的1:1.5混合物洗涤，得到((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基异丁酸酯(4.1g)。
实施例3：尿苷4-肟5’-(2-甲基丙酸)的合成
在氮气下设置具有顶置式搅拌器的100mL容器。向容器中加入HMDS(68.0mL，320mmol)，并将反应温度升至76℃。加入咪唑(1.362g，20.00mmol)，并将混合物在78℃下搅拌30min，在此期间所有咪唑都溶解。加入硫酸氢铵(11.51g，100mmol)，将温度调节至75℃的外部温度，并将混合物搅拌30min。加入硫酸羟胺(8.21g，50.0mmol)。加入((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基异丁酸酯(12.57g，40mmol)，并将反应混合物在75℃至85℃搅拌老化6h，然后冷却至室温。
加入水(30.00ml)，并使用3mL水和2份庚烷(5.00ml)将混合物转移到分液漏斗中以完成转移。弃去水相。将有机相用水(10.00ml)洗涤两次，并弃去水相。一次性加入甲酸(6.00ml，156mmol)，并将混合物在50℃下搅拌1h。在搅拌下加入水(25.00ml)，并使用水(10.00ml)和庚烷(5.00ml)将混合物转移至分液漏斗。分离水相，并将有机相用水(10.00ml)萃取。弃去有机相。将合并的水性萃取物用氢氧化铵(1.01mL，72.0mmol)碱化。加入EtOAc(50.0ml)和硫酸铵(40.0g，302mmol)，并将混合物加热至50℃，得到两个均质相。在50℃下分离各相，并将水相用EtOAc(50.0ml)萃取。将EtOAc萃取物合并并浓缩至大约40mL体积。添加EtOAc(50.0ml)，并将混合物浓缩至大约40mL体积。再次加入EtOAc(50.0ml)，并将混合物浓缩至大约40mL体积。将所得浆液在回流(75℃至80℃)下保持15min，并在30min内逐渐冷却至60℃。加入MTBE(40.0ml)，然后将混合物经2h冷却至0℃。过滤浆液，滤饼用MTBE(40.0ml)洗涤并在氮气流下，以提供((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-((Z)-4-(肟基)-2-氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-2-基)甲基异丁酸酯(11.0g，33.3mmol)。
实施例4：从尿苷合成5'-异丁酰尿苷
向尿苷(100mg，0.409mmol)在DME(2000μl)中的悬浮液中加入435(5mg，5wt％，从Novozymes商购(目录号#3925009-810))，然后加入磷酸二氢钾(55.7mg，0.409mmol)。添加异丁酸酐(64.8mg，0.409mmol)，并将混合物在振荡器上加热至40℃。到24h，反应进行以得到85％的5’-异丁酰尿苷。
应当理解，各种上述和其他特征和功能或其替代方案可以期望地组合到许多其他不同的系统或应用中。此外，本领域技术人员随后可以进行各种替代、修改、变化或改进，这些替代、修改、变化或改进也旨在由所附权利要求涵盖。
Claims (26)
1.一种用于制备化合物B或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物的方法
所述方法包括使5'-异丁酰尿苷与至少一种羟胺源在至少一种激活剂的存在下反应以产生化合物B。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种羟胺源选自硫酸羟胺、NH2OH及其混合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种激活剂是六甲基二硅氮烷。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中步骤(c)在至少一种酸性添加剂的存在下进行。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中步骤(c)在至少一种催化剂的存在下进行。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一种催化剂选自N-甲基咪唑、N-甲基吗啉、1,2,4-三唑、5-(乙硫基)-1H-四唑、咪唑及其混合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述至少一种催化剂是咪唑。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其还包括在至少一种酶的存在下使5-异丁酰基核糖与尿嘧啶反应以形成5'-异丁酰尿苷。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种酶选自至少一种S-甲基-5-硫代核糖激酶、至少一种乙酸激酶、至少一种丙酮酸氧化酶、至少一种过氧化氢酶、至少一种尿苷磷酸化酶及其混合物。
10.根据权利要求8所述的方法，还包括在至少一种脂肪酶的存在下使核糖与至少一种异丁酰基供体反应以形成5-异丁酰基核糖。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种异丁酰基供体选自丙-2-酮O-异丁酰基肟、异丁酸酐及其混合物。
12.根据权利要求8-11任一项所述的方法，还包括在至少一种脂肪酶的存在下使尿苷与至少一种异丁酰基供体反应以形成5'-异丁酰尿苷。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一种异丁酰基供体选自丙-2-酮O-异丁酰基肟、异丁酸酐及其混合物。
14.根据权利要求12或13任一项所述的方法，还包括在至少一种酶的存在下使核糖与尿嘧啶反应以形成尿苷。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少一种酶选自S-甲基-5-硫代核糖激酶、乙酸激酶、丙酮酸氧化酶、过氧化氢酶、尿苷磷酸化酶、核糖激酶、磷酸戊糖变位酶和蔗糖磷酸化酶。
16.一种用于制备化合物B或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物的方法
所述方法包括：
(a)使核糖与至少一种异丁酰基供体在至少一种脂肪酶的存在下反应以形成5'-异丁酰基核糖；
(b)使5'异丁酰基核糖与尿嘧啶在至少一种酶的存在下反应以形成5'-异丁酰尿苷，所述酶选自S-甲基-5-硫代核糖激酶、乙酸激酶、丙酮酸氧化酶、过氧化氢酶；和尿苷磷酸化酶；和
(c)使5'-异丁酰尿苷与至少一种羟胺源在至少一种激活剂的存在下反应以产生化合物B；
其中
所述至少一种异丁酰基供体选自丙-2-酮O-异丁酰基肟、异丁酸酐及其混合物；
所述至少一种酶选自S-甲基-5-硫代核糖激酶、乙酸激酶、丙酮酸氧化酶、过氧化氢酶；和尿苷磷酸化酶；
所述至少一种羟胺源选自硫酸羟胺、NH2OH及其混合物；和
所述至少一种激活剂是六甲基二硅氮烷。
17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(c)在至少一种酸性添加剂的存在下进行。
18.根据权利要求16或17任一项所述的方法，其中步骤(c)在至少一种催化剂的存在下进行。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种催化剂选自N-甲基咪唑、N-甲基吗啉、1,2,4-三唑、5-(乙硫基)-1H-四唑、咪唑及其混合物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种催化剂是咪唑。
21.一种用于制备化合物B或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物的方法
所述方法包括
(a)使核糖与尿嘧啶在至少一种酶的存在下反应以形成尿苷；
(b)使尿苷与至少一种异丁酰基供体在至少一种脂肪酶的存在下反应以形成5'-异丁酰尿苷；和
(c)使5'-异丁酰尿苷与至少一种羟胺源在至少一种激活剂的存在下反应以产生化合物B；
其中
所述至少一种酶选自S-甲基-5-硫代核糖激酶、乙酸激酶、丙酮酸氧化酶、过氧化氢酶、尿苷磷酸化酶、核糖激酶、磷酸戊糖变位酶和蔗糖磷酸化酶；
所述至少一种异丁酰基供体选自丙-2-酮O-异丁酰基肟、异丁酸酐及其混合物；
所述至少一种羟胺源选自硫酸羟胺、NH2OH及其混合物；和
至少一种激活剂是六甲基二硅氮烷。
22.根据权利要求21所述的方法，其中步骤(c)在至少一种酸性添加剂的存在下进行。
23.根据权利要求21或22任一项所述的方法，其中步骤(c)在至少一种催化剂的存在下进行。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述至少一种催化剂选自N-甲基咪唑、N-甲基吗啉、1,2,4-三唑、5-(乙硫基)-1H-四唑、咪唑及其混合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一种催化剂是咪唑。
26.选自以下的化合物及其盐：
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