RU2816846C2 - Ферментативный синтез 4’-этинилнуклеозидных аналогов - Google Patents
Ферментативный синтез 4’-этинилнуклеозидных аналогов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2816846C2 RU2816846C2 RU2021102725A RU2021102725A RU2816846C2 RU 2816846 C2 RU2816846 C2 RU 2816846C2 RU 2021102725 A RU2021102725 A RU 2021102725A RU 2021102725 A RU2021102725 A RU 2021102725A RU 2816846 C2 RU2816846 C2 RU 2816846C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cation
- phosphate
- compound
- ethynyl
- reaction
- Prior art date
Links
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 39
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title description 13
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 title description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 110
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 58
- 102000030764 Purine-nucleoside phosphorylase Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 101710101148 Probable 6-oxopurine nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 48
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 17
- WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N Manganese(2+) Chemical class [Mn+2] WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 116
- 108010015133 Galactose oxidase Proteins 0.000 claims description 91
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 84
- 108010021592 Pantothenate kinase Proteins 0.000 claims description 79
- 102100024122 Pantothenate kinase 1 Human genes 0.000 claims description 79
- 108010092060 Acetate kinase Proteins 0.000 claims description 68
- 108700016241 Deoxyribose-phosphate aldolases Proteins 0.000 claims description 60
- 102000030794 deoxyribose-phosphate aldolase Human genes 0.000 claims description 60
- 108010001722 phosphopentomutase Proteins 0.000 claims description 53
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 47
- 102100036629 Phosphoglucomutase-2 Human genes 0.000 claims description 46
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 39
- 108020000005 Sucrose phosphorylase Proteins 0.000 claims description 35
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims description 27
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims description 27
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 26
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 24
- 150000007854 aminals Chemical class 0.000 claims description 22
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 22
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 21
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 20
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 108010042687 Pyruvate Oxidase Proteins 0.000 claims description 17
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 14
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 14
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 14
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 13
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 claims description 13
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 12
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 11
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N acetyl dihydrogen phosphate Chemical compound CC(=O)OP(O)(O)=O LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims description 9
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 claims description 8
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 8
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 7
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 6
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 6
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000011572 manganese Substances 0.000 claims description 6
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 5
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims description 4
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 claims description 4
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000011176 pooling Methods 0.000 claims 5
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 3
- WDBQJSCPCGTAFG-QHCPKHFHSA-N 4,4-difluoro-N-[(1S)-3-[4-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)piperidin-1-yl]-1-pyridin-3-ylpropyl]cyclohexane-1-carboxamide Chemical compound FC1(CCC(CC1)C(=O)N[C@@H](CCN1CCC(CC1)N1C(=NN=C1C)C(C)C)C=1C=NC=CC=1)F WDBQJSCPCGTAFG-QHCPKHFHSA-N 0.000 claims 2
- NUGPIZCTELGDOS-QHCPKHFHSA-N N-[(1S)-3-[4-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)piperidin-1-yl]-1-pyridin-3-ylpropyl]cyclopentanecarboxamide Chemical compound C(C)(C)C1=NN=C(N1C1CCN(CC1)CC[C@@H](C=1C=NC=CC=1)NC(=O)C1CCCC1)C NUGPIZCTELGDOS-QHCPKHFHSA-N 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 24
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 11
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 abstract description 10
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 abstract description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 76
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 75
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 75
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 75
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 75
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 74
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 69
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 69
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 48
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 47
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 40
- -1 deoxyribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 39
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 35
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 35
- GRMKBKTVVCARJI-UHFFFAOYSA-N 2-ethynylpropane-1,2,3-triol Chemical compound OCC(O)(CO)C#C GRMKBKTVVCARJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- IKKXOSBHLYMWAE-QRPMWFLTSA-N islatravir Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@](CO)(C#C)O1 IKKXOSBHLYMWAE-QRPMWFLTSA-N 0.000 description 33
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 32
- OCDZBJSPHIMBAT-YFKPBYRVSA-N (2R)-2-hydroxy-2-(hydroxymethyl)but-3-ynal Chemical compound C(=O)[C@](O)(CO)C#C OCDZBJSPHIMBAT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 30
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 30
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 27
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 26
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 24
- QVLDCOZALMRVRJ-YFKPBYRVSA-N C#C[C@](CO)(COP(O)(O)=O)O Chemical compound C#C[C@](CO)(COP(O)(O)=O)O QVLDCOZALMRVRJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 24
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 22
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 22
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 21
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 20
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 18
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 18
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 18
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- ZYVMKADVRJJTTG-RNFRBKRXSA-N [(2R,3R)-2-ethynyl-2,3-dihydroxy-5-oxopentyl] dihydrogen phosphate Chemical compound P(=O)(O)(O)OC[C@]([C@@H](CC=O)O)(O)C#C ZYVMKADVRJJTTG-RNFRBKRXSA-N 0.000 description 17
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 16
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 15
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 15
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 15
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 15
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 14
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000223195 Fusarium graminearum Species 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 10
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 9
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 9
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 9
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 8
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 8
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 8
- 150000002256 galaktoses Chemical class 0.000 description 8
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 8
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 8
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 229960004418 trolamine Drugs 0.000 description 8
- 101000867659 Bos taurus Catalase Proteins 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000221931 Hypomyces rosellus Species 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfoxide Natural products CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 7
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 7
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 6
- JWUJQDFVADABEY-UHFFFAOYSA-N 2-methyltetrahydrofuran Chemical compound CC1CCCO1 JWUJQDFVADABEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 6
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 6
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 5
- MSWSERRZJBWUIB-YFKPBYRVSA-N P(=O)(O)(O)OC[C@](C=O)(O)C#C Chemical compound P(=O)(O)(O)OC[C@](C=O)(O)C#C MSWSERRZJBWUIB-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000409584 Shewanella halifaxensis Species 0.000 description 5
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- SYTQRRNVYPBNGQ-UHFFFAOYSA-N [2-(acetyloxymethyl)-2-hydroxybut-3-ynyl] acetate Chemical compound CC(=O)OCC(O)(C#C)COC(C)=O SYTQRRNVYPBNGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- IZASLLIUFQPKOG-UHFFFAOYSA-N diazanium;acetyl phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].CC(=O)OP([O-])([O-])=O IZASLLIUFQPKOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 5
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 5
- SKTCDJAMAYNROS-UHFFFAOYSA-N methoxycyclopentane Chemical compound COC1CCCC1 SKTCDJAMAYNROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 5
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 5
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 5
- HZYMOTKCBLYLBK-OAQYLSRUSA-N (2S)-2-(1,3-dibenzylimidazolidin-2-yl)but-3-yne-1,2-diol Chemical compound C1CN(C(N1CC1=CC=CC=C1)[C@@](CO)(O)C#C)CC1=CC=CC=C1 HZYMOTKCBLYLBK-OAQYLSRUSA-N 0.000 description 4
- WKMPTBDYDNUJLF-UHFFFAOYSA-N 2-fluoroadenine Chemical compound NC1=NC(F)=NC2=C1N=CN2 WKMPTBDYDNUJLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004679 31P NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 4
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 4
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 4
- 241000204666 Thermotoga maritima Species 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 description 4
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N benzathine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNCCNCC1=CC=CC=C1 JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 4
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 4
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000006395 oxidase reaction Methods 0.000 description 4
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- MEKOFIRRDATTAG-UHFFFAOYSA-N 2,2,5,8-tetramethyl-3,4-dihydrochromen-6-ol Chemical compound C1CC(C)(C)OC2=C1C(C)=C(O)C=C2C MEKOFIRRDATTAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 3
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 3
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 3
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101900230550 Thermotoga maritima Acetate kinase Proteins 0.000 description 3
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N alpha-D-glucose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 3
- BXRRQHBNBXJZBQ-UHFFFAOYSA-L dichloromanganese;hydrate Chemical compound O.Cl[Mn]Cl BXRRQHBNBXJZBQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- JMMWKPVZQRWMSS-UHFFFAOYSA-N isopropanol acetate Natural products CC(C)OC(C)=O JMMWKPVZQRWMSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940011051 isopropyl acetate Drugs 0.000 description 3
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N isovaleric acid Chemical compound CC(C)CC(O)=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 3
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 3
- 239000003419 rna directed dna polymerase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 3
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Substances C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 241001041927 Alloscardovia omnicolens Species 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N Cu+ Chemical class [Cu+] VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N Cyclohexylaminopropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCNC1CCCCC1 PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101900297506 Human immunodeficiency virus type 1 group M subtype B Reverse transcriptase/ribonuclease H Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229940122313 Nucleoside reverse transcriptase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 2
- 108700006317 Purine-nucleoside phosphorylases Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose 5-phosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 238000005575 aldol reaction Methods 0.000 description 2
- YXJDFQJKERBOBM-TXICZTDVSA-N alpha-D-ribose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O YXJDFQJKERBOBM-TXICZTDVSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012455 biphasic mixture Substances 0.000 description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 2
- 108010037176 copper oxidase Proteins 0.000 description 2
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Cu+2].[O-]S([O-])(=O)=O JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006392 deoxygenation reaction Methods 0.000 description 2
- RJYMRRJVDRJMJW-UHFFFAOYSA-L dibromomanganese Chemical compound Br[Mn]Br RJYMRRJVDRJMJW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 238000010597 enzymatic desymmetrization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N ferricyanide Chemical compound [Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N flavin adenine dinucleotide Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C2=NC(=O)NC(=O)C2=NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N 0.000 description 2
- 235000019162 flavin adenine dinucleotide Nutrition 0.000 description 2
- 239000011714 flavin adenine dinucleotide Substances 0.000 description 2
- 229940093632 flavin-adenine dinucleotide Drugs 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical group [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 2
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 2
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 2
- MIVBAHRSNUNMPP-UHFFFAOYSA-N manganese(2+);dinitrate Chemical compound [Mn+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O MIVBAHRSNUNMPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- MMIPFLVOWGHZQD-UHFFFAOYSA-N manganese(3+) Chemical class [Mn+3] MMIPFLVOWGHZQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QWYFOIJABGVEFP-UHFFFAOYSA-L manganese(ii) iodide Chemical compound [Mn+2].[I-].[I-] QWYFOIJABGVEFP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 description 2
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- JRKICGRDRMAZLK-UHFFFAOYSA-L peroxydisulfate Chemical class [O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O JRKICGRDRMAZLK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 2
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 2
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 2
- 235000008170 thiamine pyrophosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011678 thiamine pyrophosphate Substances 0.000 description 2
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 2
- UQCJFKIZCSWJEH-UHFFFAOYSA-N (1-acetyloxy-2-oxopropyl) acetate Chemical compound CC(=O)OC(C(C)=O)OC(C)=O UQCJFKIZCSWJEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWSERRZJBWUIB-UHFFFAOYSA-N (2-formyl-2-hydroxybut-3-ynyl) dihydrogen phosphate Chemical compound P(=O)(O)(O)OCC(C=O)(O)C#C MSWSERRZJBWUIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFIWXBRSABBKTK-RNFRBKRXSA-N (3R,4R)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)hex-5-ynal Chemical compound C(#C)[C@@]([C@@H](CC=O)O)(O)CO FFIWXBRSABBKTK-RNFRBKRXSA-N 0.000 description 1
- KEJGAYKWRDILTF-JDDHQFAOSA-N (3ar,5s,6s,6ar)-5-[(4r)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl]-2,2-dimethyl-3a,5,6,6a-tetrahydrofuro[2,3-d][1,3]dioxol-6-ol Chemical compound O1C(C)(C)OC[C@@H]1[C@@H]1[C@H](O)[C@H]2OC(C)(C)O[C@H]2O1 KEJGAYKWRDILTF-JDDHQFAOSA-N 0.000 description 1
- LFRDGHVRPSURMV-YFKPBYRVSA-N (4s)-4,5-dihydroxypentanal Chemical compound OC[C@@H](O)CCC=O LFRDGHVRPSURMV-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- XHFVGHPGDLDEQO-ZETCQYMHSA-N (R)-4'-phosphopantothenic acid Chemical compound OP(=O)(O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O XHFVGHPGDLDEQO-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- MIOPJNTWMNEORI-GMSGAONNSA-N (S)-camphorsulfonic acid Chemical compound C1C[C@@]2(CS(O)(=O)=O)C(=O)C[C@@H]1C2(C)C MIOPJNTWMNEORI-GMSGAONNSA-N 0.000 description 1
- IPYNIQBMIIXLIG-UHFFFAOYSA-N 1h-indol-3-ylmethyl(trimethyl)azanium Chemical compound C1=CC=C2C(C[N+](C)(C)C)=CNC2=C1 IPYNIQBMIIXLIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XNIOWJUQPMKCIJ-UHFFFAOYSA-N 2-(benzylamino)ethanol Chemical compound OCCNCC1=CC=CC=C1 XNIOWJUQPMKCIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KBDKAJNTYKVSEK-PYHARJCCSA-N 2-deoxy-D-ribofuranose 1-phosphate Chemical class OC[C@H]1OC(OP(O)(O)=O)C[C@@H]1O KBDKAJNTYKVSEK-PYHARJCCSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-UHFFFAOYSA-N 2-deoxypentose Chemical compound OCC(O)C(O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GJMPSRSMBJLKKB-UHFFFAOYSA-N 3-methylphenylacetic acid Chemical compound CC1=CC=CC(CC(O)=O)=C1 GJMPSRSMBJLKKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- WDRISBUVHBMJEF-MROZADKFSA-N 5-deoxy-D-ribose Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O WDRISBUVHBMJEF-MROZADKFSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- XZWXFWBHYRFLEF-FSPLSTOPSA-N Ala-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 XZWXFWBHYRFLEF-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N Ala-Ser Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- TWXZVVXRRRRSLT-IMJSIDKUSA-N Asn-Cys Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O TWXZVVXRRRRSLT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N Asn-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- QVLDCOZALMRVRJ-UHFFFAOYSA-N C#CC(CO)(COP(O)(O)=O)O Chemical class C#CC(CO)(COP(O)(O)=O)O QVLDCOZALMRVRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIGNSJBCTZRHTO-DFWYDOINSA-N CC([CH2-])=O.OC[C@@H](O)C=O Chemical compound CC([CH2-])=O.OC[C@@H](O)C=O PIGNSJBCTZRHTO-DFWYDOINSA-N 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- BRDJPCFGLMKJRU-UHFFFAOYSA-N DDAO Chemical compound ClC1=C(O)C(Cl)=C2C(C)(C)C3=CC(=O)C=CC3=NC2=C1 BRDJPCFGLMKJRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- KKZFLSZAWCYPOC-VPENINKCSA-N Deoxyribose 5-phosphate Chemical compound O[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 KKZFLSZAWCYPOC-VPENINKCSA-N 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLRHXNIVIZZOON-WFUPGROFSA-L Flavin adenine dinucleotide disodium Chemical compound [Na+].[Na+].C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C2=NC(=O)NC(=O)C2=NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 XLRHXNIVIZZOON-WFUPGROFSA-L 0.000 description 1
- JEFZIKRIDLHOIF-BYPYZUCNSA-N Gln-Gly Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JEFZIKRIDLHOIF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- XITLYYAIPBBHPX-ZKWXMUAHSA-N Gln-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O XITLYYAIPBBHPX-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 108010078851 HIV Reverse Transcriptase Proteins 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- WSDOHRLQDGAOGU-BQBZGAKWSA-N His-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 WSDOHRLQDGAOGU-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N His-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical group [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 229940094881 Nucleoside reverse transcriptase translocation inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-HOTGVXAUSA-N Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- LZLREEUGSYITMX-JQWIXIFHSA-N Ser-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(O)=O)=CNC2=C1 LZLREEUGSYITMX-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 1
- 101900206319 Shewanella halifaxensis Deoxyribose-phosphate aldolase Proteins 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 1
- 101000666920 Streptomyces hygroscopicus subsp. limoneus Validoxylamine A 7'-phosphate phosphatase Proteins 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- ZYVMKADVRJJTTG-NKWVEPMBSA-N [(2R,3S)-2-ethynyl-2,3-dihydroxy-5-oxopentyl] dihydrogen phosphate Chemical compound P(=O)(O)(O)OC[C@]([C@H](CC=O)O)(O)C#C ZYVMKADVRJJTTG-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- GRMKBKTVVCARJI-SMZGMGDZSA-N [2H]C([2H])(C(CO)(C#C)O)O Chemical compound [2H]C([2H])(C(CO)(C#C)O)O GRMKBKTVVCARJI-SMZGMGDZSA-N 0.000 description 1
- BUMPFXRZUYYODO-QRPMWFLTSA-N [[(2r,3s,5r)-5-(6-amino-2-fluoropurin-9-yl)-2-ethynyl-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)(C#C)O1 BUMPFXRZUYYODO-QRPMWFLTSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N acetaldehyde Chemical compound [14CH]([14CH3])=O IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N 0.000 description 1
- HLNYTZYPKARXKH-UHFFFAOYSA-N acetic acid;phosphono acetate Chemical compound CC(O)=O.CC(=O)OP(O)(O)=O HLNYTZYPKARXKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 238000006668 aldol addition reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000798 anti-retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000011914 asymmetric synthesis Methods 0.000 description 1
- CERWAGKVWPWKCH-CAYNQFBISA-N azanium [(2R,3S)-2-ethynyl-3,5-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl hydrogen phosphate Chemical compound C#C[C@]1([C@H](CC(O1)O)O)COP(=O)(O)[O-].[NH4+] CERWAGKVWPWKCH-CAYNQFBISA-N 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N dcm dichloromethane Chemical compound ClCCl.ClCCl DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010918 diastereoselective addition Methods 0.000 description 1
- SMBQBQBNOXIFSF-UHFFFAOYSA-N dilithium Chemical class [Li][Li] SMBQBQBNOXIFSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCIDZIIHRGYJAE-YGFYJFDDSA-L dipotassium;[(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] phosphate Chemical class [K+].[K+].OC[C@H]1O[C@H](OP([O-])([O-])=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O KCIDZIIHRGYJAE-YGFYJFDDSA-L 0.000 description 1
- ORKSTPSQHZNDSC-IDIVVRGQSA-L disodium;[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ORKSTPSQHZNDSC-IDIVVRGQSA-L 0.000 description 1
- SYELZBGXAIXKHU-UHFFFAOYSA-N dodecyldimethylamine N-oxide Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)[O-] SYELZBGXAIXKHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000011930 enantioselective total synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229950010772 glucose-1-phosphate Drugs 0.000 description 1
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- RLQMPLKXFIXRCV-UHFFFAOYSA-L lithium;potassium;acetyl phosphate Chemical compound [Li+].[K+].CC(=O)OP([O-])([O-])=O RLQMPLKXFIXRCV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- GWGVDNZFTPIGDY-UHFFFAOYSA-M magnesium;ethyne;chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[C-]#C GWGVDNZFTPIGDY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002696 manganese Chemical class 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- PGXWDLGWMQIXDT-UHFFFAOYSA-N methylsulfinylmethane;hydrate Chemical compound O.CS(C)=O PGXWDLGWMQIXDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- KVKFRMCSXWQSNT-UHFFFAOYSA-N n,n'-dimethylethane-1,2-diamine Chemical compound CNCCNC KVKFRMCSXWQSNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NOUUUQMKVOUUNR-UHFFFAOYSA-N n,n'-diphenylethane-1,2-diamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1NCCNC1=CC=CC=C1 NOUUUQMKVOUUNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 125000004043 oxo group Chemical group O=* 0.000 description 1
- 229940085991 phosphate ion Drugs 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 239000013557 residual solvent Substances 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- WHRNULOCNSKMGB-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran thf Chemical compound C1CCOC1.C1CCOC1 WHRNULOCNSKMGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WAGFXJQAIZNSEQ-UHFFFAOYSA-M tetraphenylphosphonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=CC=C1[P+](C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 WAGFXJQAIZNSEQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960002363 thiamine pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009901 transfer hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- HHLJUSLZGFYWKW-UHFFFAOYSA-N triethanolamine hydrochloride Chemical compound Cl.OCCN(CCO)CCO HHLJUSLZGFYWKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117957 triethanolamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к способу синтеза 4’-этинил-2’-дезоксинуклеозида, включающему объединение соединения 6.5
с пуриннуклеозид-фосфорилазой и нуклеооснованием в буферном растворе, содержащем соль марганца (II), где 2X+ представляет собой (a) два протона, (b) один протон и один одновалентный катион, (c) два одновалентных катиона, где каждый катион является одинаковым или они отличны друг от друга, или (d) один двухвалентный катион, и где 4’-этинил-2’-дезоксинуклеозид представляет собой
Description
Ссылка на перечень последовательностей, поданный в электронном виде
Перечень последовательностей настоящей заявки подан в электронном виде через EFS-Web в виде ASCII отформатированного перечня последовательностей с названием файла “24608WOPCT-SEQLIST-02JUl2019.txt”, имеющего дату создания 2 июля 2019 г. и размер 80,5 кБ. Этот перечень последовательностей, поданный через EFS-Web, является частью описания изобретения и включен в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте.
Предпосылки создания изобретения
4’-Этинил-2’-дезоксинуклеозидные аналоги известны как обладающие активностью против ВИЧ, СПИДа и связанных с ними заболеваний.
Одним примером 4’-этинилнуклеозидного аналога является 4’-этинил-2-фтор-2’-дезоксиаденозин (EFdA, также известный как MK-8591), который является нуклеозидным ингибитором транслокации обратной транскриптазы, который блокирует репликацию вирусов ВИЧ-1 и SIV in vitro (Kawamoto, A., Kodama, E., Sarafianos S. F. et al, Int. J. Biochem. Cell Biol.; 40(11):2410-20 [2008]; Ohrui, H., Kohgo, S., Hayakawa, H. et al, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 26, 1543-1546 [2007]) и in vivo (Hattori, S., Ide, K., Nakata, H. et al. Antimicrobial. Agents and Chemotherapy, 53, 3887-3893 [2009]). EFdA заявлен в Патенте США № 7339053 (указан в ‘053 патенте как 2’-дезокси-4’-C-этинил-2-фтораденозин). EFdA имеет следующую химическую структуру:
EFdA метаболизируется в клетках до своего активного трифосфатного анаболита, который ингибирует обратную транскриптазу ВИЧ. В отличие от нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (NsRTI) и нуклеотидных ингибиторов обратной транскриптазы (NtRTI), доступных в настоящее время для лечения ВИЧ-инфекции, которые отсутствует 3'-ОН группа для блокирования включения входящего нуклеотида, EFdA сохраняет 3'-ОН группу и действует в качестве терминатора цепи, предотвращая транслокацию праймера:матрицы в активном сайте обратной транскриптазы (RT) и предотвращая связывание входящих дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (dNTP). Кроме того, предполагается, что сморщивание модифицированного рибозного кольца EFdA вносит вклад в ингибирование обратной транскриптазы, помещая 3'-OH в вектор, в котором фосфоперенос от поступающего нуклеотида неэффективен. (Michailidis E, et al., Mechanism of inhibition of HIV-1 reverse transcriptase by 4’-ethynyl-2-fluoro-2’-deoxyadenosine triphosphate, J Biol Chem 284:35681-35691 [2009]; Michailidis E, et al., 4’-Ethynyl-2-fluoro-2’-deoxyadenosine (EFdA) inhibits HIV-1 reverse transcriptase with multiple mechanisms, J Biol Chem 289:24533-24548 [2014]).
В анализах репликации ВИЧ in vitro EFdA является мощным антиретровирусным препаратом и проявляет сопоставимую противовирусную активность против клинических изолятов всех подтипов, которые были оценены. Он быстро анаболизируется как в линиях лимфоидных клеток, так и в мононуклеарных клетках периферической крови до активного трифосфата in vitro, а внутриклеточный период полужизни EFdA-трифосфата (EFdA-TP) превышает 72 часа. (Stoddart, C. A., Galkina, et al., Oral Administration of the Nucleoside EFdA (4’-Ethynyl-2-Fluoro-2’-Deoxyadenosine) Provides Rapid Suppression of HIV Viremia in Humanized Mice and Favorable Pharmacokinetic Properties in Mice and the Rhesus Macaque, Antimicrob Agents Chemother, 2015 Jul; 59(7): 4190-4198, Published online 2015 May 4).
Было показано, что EFdA обладает эффективностью на животных моделях ВИЧ-инфекции, включая гуманизированные мышиные модели и модель макак-резус, инфицированных SIV. Фармакокинетические исследования перорального введения EFdA на мышах и макаках-резус продемонстрировали быструю абсорбцию и высокие концентрации в плазме. Длительный внутриклеточный период полужизни был продемонстрирован тем фактом, что выделенные мононуклеарные клетки периферической крови макака-резуса были невосприимчивы к инфекции SIV через 24 часа после введения лекарства. (Там же.)
Предыдущие способы синтеза 4'-этинилнуклеозидных аналогов, включая EFdA, страдают умеренной стереоселективностью при образовании C-N связи между этинилдезоксирибозным сахаром и 2-фторадениновым (также называемым 2-фтор-9H-пурин-6-амином) нуклеооснованием. Предыдущие способы синтеза также требуют защитных групп для осуществления реакции гликозилирования, что снижает эффективность синтеза.
Синтез, описанный в Kei Fukuyama, et al., Synthesis EFdA via the Diastereoselective Aldol Reaction of a Protected 3-Keto Furanose, Organic Letters 2015, 17 (4), pp. 828-831; DOI: 10.1021/ol5036535) представляет собой 14-ступенчатый синтез из D-глюкоза диацетонида, в котором используются диастереоселективные реакции для установки трех стереоцентров. Стереохимию аномерного центра контролируют при помощи 2'-ацетокси направляющей группы, которую впоследствии удаляют посредством гидролиза и деоксигенирования. Для этого способа требуются 4 хроматографических очистки и стехиометрическое использование токсичного оловоорганического реагента для поздней стадии деоксигенирования.
В другом пути (см. Mark McLaughlin, et al., Enantioselective Synthesis of 4′-Ethynyl-2-fluoro-2′-deoxyadenosine (EFdA) via Enzymatic Desymmetrization, Organic Letters 2017, 19 (4), pp. 926-929) полностью замещенный 4'-карбинол получают стереоселективно с ферментативной десимметризацией. 3'-стереоцентр устанавливают путем каталитического гидрирования с асимметричным переносом, а аномерную 1'-связь устанавливают с умеренной стереоселективностью с использованием контроля субстрата, с повышением стереохимической чистоты, достигаемым кристаллизацией промежуточного продукта. Этот способ требует 15 стадий, требует использования нескольких защитных групп и образует гликозильную связь между нуклеооснованием и фрагментами сахара с низкой стереоселективностью (1,8:1)
12-стадийный синтез для получения EFdA из R-глицеральдегид ацетонида описан в Kageyama, M., et al., Concise Synthesis of the Anti-HIV Nucleoside EFdA, Biosci. Biotechnol. Biochem, 2012, 76, pp. 1219 - 1225; and Enantioselective Total Synthesis of the Potent Anti-HIV Nucleoside EFdA, Masayuki Kageyama, et al., Organic Letters 2011 13 (19), pp. 5264-5266 [DOI: 10.1021/ol202116k]. В этих способах синтеза используют хиральное исходное вещество для установки 3'-стереоцентра с умеренной диастереоселективностью. После хроматографического разделения стереоизомеров новый стереоцентр используется для направления диастереоселективного присоединения алкина для установки полностью замещенного 4'-стереоцентра. Аномерное 1'-положение устанавливается с низким стереоконтролем, и требуется хроматография для разделения аномеров. Этот путь требует хроматографического разделения диастереоизомеров на двух разных стадиях и начинается с дорогостоящего хирального исходного вещества.
Kohgo, S., et al., Design, Efficient Synthesis, and Anti-HIV Activity of 4′-C-Cyano- and 4′-C-Ethynyl-2′-deoxy Purine Nucleosides, Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 2004, 23, pp. 671-690 [DOI: 10.1081/NCN-120037508] описывает путь синтеза, который начинается с существующего нуклеозида и модифицирует как сахарные части, так и нуклеооснования. Это 18-стадийный синтез, исходящий из 2-амино-2'-дезоксиаденозина, с низким общим выходом 2,5%.
Известно, что ферменты, такие как пурин-нуклеозидфосфорилаза (PNP, EC 2.4.2.1), могут образовывать гликозильную связь в нуклеозидах и нуклеозидных аналогах с высокой стереоселективностью и без использования защитных групп. См., например, обзор: New Trends in Nucleoside Biotechnology, Mikhailopulo, I.A., Miroshnikov, A.I,. Acta Naturae 2010, 2, pp. 36-58. Однако существующий объем сахарных фрагментов, которые могут подвергаться реакции, катализируемой PNP, ограничен α-1-фосфатами природной рибозы и дезоксирибозы, а также небольшим количеством аналогов с небольшими H, NH2 или F заместителями в положениях C2' и C3' и заменами C5' OH группы. Не было никаких сообщений об успешном гликозилировании, катализируемом PNP, с использованием сахаров с углеродными заместителями в кольце или любого замещения в положении C4’.
Доступ к рибозным и дезоксирибоза α-1-фосфатным субстратам для катализируемого PNP гликозилирования был продемонстрирован путем транслокации фосфатной группы из положения 5'-гидроксила в 1'-гидроксил с использованием фермента фосфопентомутазы (PPM, EC 5.4.2.7) (см. Mikhailopulo, I.A., et al. выше). Однако диапазон сахаров, для которых PPM способен катализировать эту реакцию, ограничен рибозой, арабинозой, 2-дезоксирибозой и 2,3-дидезоксирибозой. Не сообщалось о примерах успешной реакции с сахарными фосфатами, содержащими какие-либо дополнительные заместители.
Известно, что ферменты дезоксирибозофосфатальдолазы (DERA, EC 4.1.2.4) катализируют альдольное присоединение ацетальдегида к другим короткоцепочечным альдегидам (см. обзор: Stephen M. Dean, et al., Recent Advances in Aldolase-Catalyzed Asymmetric Synthesis, Adv. Synth. Catal. 2007, 349, pp. 1308-1320; DOI: 10.1002/adsc.200700115). Однако не сообщалось ни о каких примерах с альдегидами, несущими полностью замещенный углерод α относительно альдегида.
Патент США № 7229797 описывает образование дезоксирибонуклеозидов из природного незамещенного дезоксирибозо-1-фосфата с использованием пурин-нуклеозидфосфорилазы (PNP) и дополнительным использованием ферментов, таких как сахарозофосфорилаза, для удаления неорганического фосфатного побочного продукта и поддержания равновесия. Он не раскрывает ферментную инженерию для создания PNP ферментов, которые могут генерировать нуклеозиды из неприродного 4-этинил-D-2-дезоксирибозо-1-фосфата, а также то, что путем конструирования ферментов PPM и DERA для воздействия на неприродные субстраты можно получить 4-этинил-D-2-дезоксирибозо-1-фосфат.
С учетом сложных и длительных вариантов синтеза, разработанных на сегодняшний день для получения 4'-этинилнуклеозидных аналогов, было бы желательно разработать улучшенный ферментативный синтез 4'-этинилнуклеозидных аналогов, таких как EFdA, который сокращает количество стадий процесса, сводит к минимуму использование защитных групп, улучшает стереоселективность гликозилирования и позволяет избежать использования токсичных материалов.
Неожиданно было обнаружено, что PPM ферменты обладают некоторой активностью с 3-атомным этинильным заместителем в 4’ положении рибозы, и что активность PPM фермента может быть улучшена путем введения мутаций в ферменты для успешного развития реакции изомеризации 4-этинил-D-2-дезоксирибозо-5-фосфата (6) до 4-этинил-D-2-дезоксирибозо-1-фосфата (6.5), катализируемой PPM, что предполагает возможность более эффективного способа получения 4'-этинил-2'-дезоксинуклеозидов.
Кроме того, было обнаружено, что PNP ферменты обладают некоторой активностью с 3-атомным этинильным заместителем в положении 4 дезоксирибозы, и что ферментативная активность PNP может быть улучшена путем введения мутаций в ферменты для успешного развития реакции гликозилирования, катализируемой PNP, что предполагает возможность более эффективного способа получения 4'-этинил-2'-дезоксинуклеозидов.
Дальнейшее улучшение общего способа синтеза исходило из открытия, что DERA ферменты, в частности DERA из Shewanella halifaxensis, обладают активностью для альдольной реакции с 2-этинилглицеральдегид-3-фосфатом, который имеет полностью замещенный α-углерод. Это открытие позволило эффективно синтезировать 4-этинил-D-2-дезоксирибозо-5-фосфат, предшественник 4’-этинил-2’-дезоксинуклеозидных аналогов, например, включая EFdA.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение включает использование сконструированных ферментов в новом ферментативном синтезе 4’-этинил-2’-дезоксинуклеозидных аналогов, включая EFdA, который исключает использование защитных групп на промежуточных соединениях, улучшает стереоселективность гликозилирования и значительно уменьшает количество стадий процесса, необходимых для получения указанных соединений, по сравнению с предшествующими способами, среди прочих технологических усовершествований. Изобретение также относится к новым промежуточным соединениям, которые являются неотъемлемой частью ферментативного способа.
Общий способ представлен ниже на Схеме 1 и Схеме 2; последняя схема представляет альтернативный способ для получения соединения 5:
Схема 1
Схема 1A
В способе, описанном в настоящей заявке, можно использовать кислотную форму или соли фосфатных промежуточных соединений, и они не ограничиваются конкретными кислотными или солевыми формами, представленными в иллюстративных примерах стадий способа в настоящей заявке. Для всех фосфатных промежуточных соединений, описанных в настоящей заявке, 2X+ представляет собой любую комбинацию двух протонов, одного протона с одним другим одновалентным катионом, двух одновалентных катионов (одинаковых или отличных друг от друга) или один двухвалентный катион. Фосфатные промежуточные соединения, показанные как -HO3PO-, также могут иметь любую комбинацию двух протонов, одного протона с одним другим одновалентным катионом, двух одновалентных катионов (одинаковых или отличных друг от друга) или один двухвалентный катион, связанную с фосфатной группой. Примеры включают, но не ограничиваются этим, соли кальция, магния или цинка; моно- или динатриевые соли, моно- или дикалиевые соли, моно- или дилитиевые соли; моно- или диаммониевые соли; или одно- или двухвалентные соли с первичными, вторичными или третичными аминами.
Как хорошо известно в данной области техники, промежуточные соединения, показанные или названные на стадиях синтеза как альдегид или гидрат, могут существовать в любой форме или смеси таких форм в реакциях, описанных в настоящей заявке. Например, соединения (4) и (5) показаны на Схеме 1 как гидрат и альдегид, соответственно, но каждый может существовать в форме гидрата или альдегида или их смеси на стадиях реакции, где каждый присутствует. Каждая такая форма охватывается посредством ссылки на номера соединений (4) или (5) в рамках стадий способа, описанных в настоящей заявке:
.
Соединение (3) является ахиральным и может быть показано как любое из следующих:
Соединение (6) может существовать в его кольцевой форме или в виде альдегида или гидрата с открытой цепью, каждое в виде его кислотно или его солевой формы, на стадиях реакции где оно присутствует:
Подробное описание изобретения
4’-Этинил-2’-дезоксинуклеозиды и их аналоги
имеющие аномерную C-N связь, были исследованы на активность против ВИЧ, СПИДа и связанных с ними заболеваний. 4’-Этинил-2’-дезоксинуклеозиды и их аналоги включают 4’-этинил-2’-дезоксирибозу, присоединенную через аномерную C-N связь к пуриновому или пиримидиновому нуклеооснованию (аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил) или модифицированному пуриновому или пиримидиновому нуклеооснованию.
Было обнаружено, что 4’-этинил-2’-дезоксинуклеозидные аналоги, такие как EfdA, можно синтезировать с использованием способа, осуществляемого в одном реакционном сосуде, на конечной стадии путем объединения 4-этинил-D-2-дезоксирибозо-5-фосфата (6) с двумя ферментами фосфопентомутазой (PPM) [например, но не ограничиваясь этим, SEQ ID NO.: 8] и пуриннуклеозид-фосфорилазой (PNP) [например, но не ограничиваясь этим, SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 15], как показано на Схеме 2.
Схема 2
Схема 2A
Как показано на Схеме 2, на конечной стадии синтеза используют 2-ферментную реакцию с необязательным 3-м ферментом для направления равновесия реакции на желаемый конечный продукт. Конечная стадия начинается с соединения (6) или его соли, где (6) представляет собой 4-этинил-2-дезоксирибозо-5-фосфат в кольцевой форме, как показано выше, или в форме его альдегида или гидрата с открытой цепью.
Соединение (6) объединяют с фосфопентомутазой (PPM), пуриннуклеозид-фосфорилазой (PNP), сахарозо-фосфорилазой, сахарозой и нуклеооснованием, например незамещенным или замещенным аденином, в буферном растворе, содержащем соль марганца (II), и доводят, по мере необходимости, до pH в диапазоне около 6,5-8,0 или более, конкретно около 7,0-7,5. Молярное соотношение сахароза:соединение (6) может составлять, но не ограничивается этим, от около 1:1 до 4:1. Компоненты этой реакции, осуществляемой в одном реакционном сосуде, можно объединять в любом порядке.
Реакционную смесь перемешивают в температурных пределах, которые не приводят к денатурации ферментов, например около 30- 45°C, и более конкретно около 35-45°C. До определенного момента более низкие температуры могут работать, но это будет замедлять скорость реакции.
Любой буфер с подходящим pH и содержащий соль марганца (II), можно использовать в реакции. Примеры таких буферов включают, но не ограничиваются этим, следующие: триэтаноламин; PIPES, например пиперазин-N, N′-бис(2-этансульфоновая кислота); MOPS, например 3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота или 3-морфолинопропан-1-сульфоновая кислота; HEPES, например 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота или 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновая кислота; TRIS, например, трис(гидроксиметил)аминометан или 2-амино-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол; и BIS-TRIS метан, например 2-[бис(2-гидроксиэтил)амино]-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол. Более конкретно буфер представляет собой триэтаноламин. Соль марганца (II) в буфере может представлять собой, например, хлорид марганца, хлорид марганца гидрат, бромид марганца, иодид марганца, нитрат марганца и/или сульфат марганца. Концентрация марганца в буфере может быть в диапазоне от около 0,05 мМ до около 10 мМ и, в частности, составляет около 5 мМ.
Равновесие реакции можно направить на высокую конверсию конечного продукта путем расходования неорганической фосфатной соли, являющейся побочным продуктом, путем фосфоролиза сахарозы в D-фруктозу и α-D-глюкоза-1-фосфат, катализируемого сахарозо-фосфорилазой (EC 2.4.1.7), добавленной к реакционной смеси. Однако можно использовать любые другие способы для удаления фосфата в процессе реакции, например, добавление кальция, магния или марганца к реакционной смеси для осаждения фосфатной соли вместо использования сахарозо-фосфорилазы и сахарозы. Этот высокоэффективный и экологически безопасный способ обладает преимуществом образования аномерной связи между сахаром и нуклеооснованием с очень высокой стереоселективностью без использования защитных групп или органических растворителей, и его можно осуществить как реакцию, осуществляемую в одном реакционном сосуде.
После завершения реакции конечный продукт можно выделить с использованием стандартных процедур, известных специалистам в данной области, таких как, но не ограничиваясь этим, выделение путем кристаллизации конечного продукта и его сбор фильтрованием, или экстрагирование в подходящий растворитель с последующей кристаллизацией.
Как показано на Схеме 2A, на конечной стадии синтеза можно альтернативно использовать 3-ферментную реакцию с необязательным 4-м ферментом для направления равновесия реакции на желаемый конечный продукт. Конечная стадия начинается с соединения (5) или его соли, где (5) представляет собой (R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфат или его гидрат.
Соединение (5) объединяют с дезоксирибозо-фосфат-альдолазой (DERA), ацетальдегидом, фосфопентомутазой (PPM), пуриннуклеозид-фосфорилазой (PNP), сахарозо-фосфорилазой, сахарозой и нуклеооснованием или его аналогом, например незамещенным или замещенным аденином, в буферном растворе, содержащем соль марганца (II), и доводят, по мере необходимости, до pH в диапазоне около 4-10, или конкретно около 6,5-8,0, или более конкретно около 7,0-7,5. Молярное соотношение сахароза:соединение (5) может составлять, но не ограничивается этим, от около 1:1 до 4:1. Компоненты этой реакции, осуществляемой в одном реакционном сосуде, можно объединять в любом порядке.
Реакцию осуществляют в диапазоне температур, который не приводят к денатурации ферментов, например около 30-45°C или конкретно около 35-45°C. До определенного момента более низкие температуры могут работать, но это будет замедлять скорость реакции.
Ацетальдегид добавляют в виде раствора, и более конкретно в виде 40% масс. раствора в изопропиловом спирте. В реакции можно использовать любой подходящий раствор ацетальдегида или чистый ацетальдегид. Примеры таких растворов включают, но не ограничиваются этим: раствор ацетальдегида в изопропаноле, раствор ацетальдегида в этаноле, раствор ацетальдегида в воде, раствор ацетальдегида в THF. Молярное соотношение альдегид:соединение (5) может составлять, но не ограничивается этим, от около 0,5:1 до 4:1, и более конкретно 1,5:1.
Любой буфер с подходящим pH и содержащий соль марганца (II) можно использовать в реакции. Примеры таких буферов включают, но не ограничиваются этим, следующие: триэтаноламин; PIPES, например пиперазин-N, N′-бис(2-этансульфоновая кислота); MOPS, например, 3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота или 3-морфолинопропан-1-сульфоновая кислота; HEPES, например 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота или 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновая кислота; TRIS, например, трис(гидроксиметил)аминометан или 2-амино-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол; и BIS-TRIS метан, например 2-[бис(2-гидроксиэтил)амино]-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол. Более конкретно буфер представляет собой триэтаноламин. Соль марганца (II) в буфере может представлять собой, например, хлорид марганца, хлорид марганца гидрат, бромид марганца, иодид марганца, нитрат марганца и/или сульфат марганца. Концентрация марганца в буфере может быть в диапазоне от около 0,05 мМ до около 10 мМ и, в частности, составляет около 5 мМ.
Равновесие реакции можно направить на высокую конверсию конечного продукта путем расходования неорганической фосфатной соли, являющейся побочным продуктом, путем фосфоролиза сахарозы в D-фруктозу и α-D-глюкоза-1-фосфат, катализируемого сахарозо-фосфорилазой (EC 2.4.1.7), добавленной к реакционной смеси. Однако можно использовать любые другие способы для удаления фосфата в процессе реакции, например, добавление кальция, магния или марганца к реакционной смеси для осаждения фосфатной соли вместо использования сахарозо-фосфорилазы и сахарозы. Этот высокоэффективный и экологически безопасный способ обладает преимуществом образования аномерной связи между сахаром и нуклеооснованием с очень высокой стереоселективностью без использования защитных групп или органических растворителей, и его можно осуществить как реакцию, осуществляемую в одном реакционном сосуде.
После завершения реакции конечный продукт можно выделить с использованием стандартных процедур, известных специалистам в данной области, таких как, но не ограничиваясь этим, выделение путем кристаллизации конечного продукта и его сбор фильтрованием, или экстрагирование в подходящий растворитель с последующей кристаллизацией.
Некоторые предшествующие промежуточные соединения, используемые в представленном способе для синтеза конечного продукта 4’-этинил-2’-дезоксинуклеозидов и их аналогов, также получают способами с использованием ферментативных реакций, как показано на Схеме 3; Схеме 3A и Схеме 3B
Схема 3
Схема 3A
Схема 3B
Соединение 4: Оксидазная реакция
Как показано на Схеме 3, (R)-2-этинил-глицеральдегид (4) получают путем взаимодействия галактозооксидазы с 2-этинил-пропан-1,2,3-триолом (3) в буферном растворе, доведенном, по мере необходимости, до pH в диапазоне около 3-10 или более конкретно около 6-8. Можно использовать любой буфер, имеющий подходящий диапазон pH, например, но не ограничиваясь этим, фосфат натрия; ацетат натрия; PIPES, например пиперазин-N, N′-бис(2-этансульфоновая кислота); MOPS, например 3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота или 3-морфолинопропан-1-сульфоновая кислота; HEPES, например 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота или 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновая кислота; TRIS, например, трис(гидроксиметил)аминометан или 2-амино-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол; и BIS-TRIS метан, например 2-[бис(2-гидроксиэтил)амино]-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол; борат; CAPS, например N-циклогексил-3-аминопропансульфоновая кислота; MES, например 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота; CHES, например N-циклогексил-2-аминоэтансульфоновая кислота; глицин; или бицин (N, N-бис(2-гидроксиэтил)глицин); при этом фосфат натрия является предпочтительным.
В реакции для активации галактозооксидазы (GOase) используют как медь, так и пероксидазу. Медь можно вводить в реакционную смесь путем добавления CuSO4, Cu(OAc)2, CuCl2 или других солей Cu(II) или Cu(I). Пероксидаза может представлять собой пероксидазу хрена или пероксидазу, полученную из других организмов, или ее можно заменить окислителем, таким как феррицианид, иридат, соли марганца (III), персульфатные соли и другие одноэлектронные или двухэлектронные окислители, или неорганические или органические окислители. Предпочтительно пероксидаза представляет собой пероксидазу хрена. Каталазу также добавляют для предотвращения дезактивации GOase. Каталаза может происходить от млекопитающих (бык) или из бактериального или грибкового источника, такого как Corynebacterium, Aspergillus или другие организмы, известные в данной области для этой цели.
Реакция протекает в присутствии кислорода. Один из удобных способов включает продувку реакционной смеси воздухом. Альтернативно, можно использовать другие системы для генерации кислорода, такие как пероксид водорода/каталаза, супероксид, или использовать другие методы, известные в данной области техники, для этой цели.
Реакцию можно осуществить с концентрацией субстрата около 10-180 г/л и, в частности, 20-50 г/л. Реакцию можно осуществлять при температуре от около 0-40°C и, в частности, около 10-30°C.
Соединение 8: Образование аминаля
Как проиллюстрировано на Схеме 3A, (R)-2-этинил-глицеральдегид (4) можно выделить в форме его аминаля (например, соединение 8) путем его взаимодействия с любым амином, диамином или аминоспиртом, который образует стабильный N, N-ацеталь или N, O-ацеталь, таким как, но не ограничиваясь этим, N, N’-дибензилэтан-1,2-диамин, N, N’-диметилэтан-1,2-диамин, N, N’-дифенилэтан-1,2-диамин и N-бензилэтаноламин; при этом N, N’-дибензилэтан-1,2-диамин является предпочтительным. Реакцию осуществляют в органическом растворителе при температуре около 50°C или ниже, предпочтительно 20-30°C, чтобы избежать разложения аминаля. Можно использовать любой растворитель, не смешивающийся с водой, например, но не ограничиваясь этим, MTBE, 2-MeTHF, CPME, диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, этилацетат, изопропилацетат, толуол, DCM или их смесь, при этом MTBE является предпочтительным. Реакцию можно осуществить с концентрацией субстрата около 10-100 г/л и, в частности, 20-50 г/л.
Необязательно, аминаль затем можно очистить кристаллизацией из органического растворителя, такого как, но не ограничиваясь этим, MTBE, 2-MeTHF, CPME, диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, этилацетат, изопропилацетат, толуол, DCM или их смесь, при этом MTBE является предпочтительным. Кристаллизацию осуществляют при 50°C или ниже, например при около 40°C, чтобы избежать разложения аминаля.
Реакция протекает в отсутствие кислорода. Один удобный способ включает продувку реакционной смеси при помощи N2. Альтернативно, можно использовать другие системы для исключения кислорода, такие как аргон, гелий или использование других способов, известных в данной области, для этих целей.
Соединение 4: Восстановление альдегида 4 из аминаля 8
(R)-2-Этинил-глицеральдегид (4) может быть восстановлен из его соответствующего аминаля путем его взаимодействия с органической или неорганической кислотой в присутствии не смешиваемого с водой органического растворителя при температуре при 50°C или ниже, например около 0-15°C, чтобы избежать разложения аминаля. Можно использовать любую органическую или неорганическую кислоту, такую как, но не ограничиваясь этим, п-толуолсульфоновая кислотп, метансульфоновая кислотп, камфорсульфоновая кислота, уксусная кислота, хлористоводородная кислота, фосфорная кислота, серная кислота. п-Толуолсульфоновая кислота является предпочтительной в реакции с аминалем 8 из-за низкой растворимости N, N’-дибензилэтан-1,2-диамин бис п-толуолсульфонатной соли в воде. Можно использовать любой растворитель, не смешивающийся с водой, например, но не ограничиваясь этим, MTBE, 2-MeTHF, CPME, диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, этилацетат, изопропилацетат, толуол, DCM или их смесь; при этом MTBE и 2-MeTHF являются предпочтительными. Реакцию можно осуществить с концентрацией субстрата около 5-100 г/л и, в частности, 20-50 г/л.
Необязательно, раствор альдегида 4 можно затем обработать смолой для удаления избытка органической или неорганической кислоты. Обработку смолой можно осуществить с использованием основных смол, таких как DOWEX™ MARATHON™ A смола (гидроксидная форма) и AMBERLYST® 15 смола (водородная форма) или их смесь, предпочтительно смесь DOWEX™ MARATHON™ A смолы (гидроксидная форма) и AMBERLYST® 15 смолы.
Необязательно, затем можно осуществить упаривание в вакууме раствора альдегида 4 или продувку газом для удаления избытка органического растворителя.
Соединение 5: Киназная реакция
Как показано на Схеме 3 и Схеме 3A, (R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфат гидрат (5) получают путем взаимодействия пантотенаткиназы (PanK) дикого типа из E. coli или ее варианта с соединением (4) в буферном растворе, доведенном, по мере необходимости, до pH в диапазоне около 4-10, или конкретно около 6,5-8,5, или более конкретно 5,5-8,5. Можно использовать любой буфер, имеющий подходящий диапазон pH, например, но не ограничиваясь этим, фосфат натрия, PIPES, например пиперазин-N, N′-бис(2-этансульфоновая кислота); BIS-TRIS метан, например 2-[бис(2-гидроксиэтил)амино]-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол; борат; HEPES, например 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота или 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновая кислота; триэтаноламин и TRIS, например TRIS, например трис(гидроксиметил)аминометан или 2-амино-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол; при этом фосфат натрия является предпочтительным. Реакцию можно осуществить в присутствии любой подходящей соли двухвалетного металла, например, но не ограничиваясь этим, соли магния, например хлорида магния, и солей кобальта, марганца, цинка или кальция.
В этой реакции используют аденозин 5’-дифосфат (АДФ) в качестве источника фосфата, который требует восстановления до 5’-трифосфата (АТФ). АТФ может быть образован in situ и дополнительно восстановлен любым способом, известным в данной области, из АДФ, аденозин 5’-монофосфата (АМФ) или аденозина. Например, можно использовать комбинацию ацетилфосфата вместе с ацетаткиназой для восстановления АДФ до АТФ. Например, в присутствии пирувата, фосфата и кислорода комбинация пируватоксидазы и каталазы генерирует ацетилфосфат, и поэтому в присутствии ацетаткиназы может использоваться для восстановления АДФ до АТФ.
Реакцию можно осуществить с концентрацией субстрата около 10-100 г/л и, в частности, около 20-40 г/л. Реакцию можно осуществлять при температуре около 0-40°C и, в частности, при около 10-25°C.
Реакцию также можно осуществить с пантотенаткиназой (PanK), иммобилизованной на смоле, или с PanK и ацетаткиназой, иммобилизованными на смоле. Можно использовать любой подходящий способ иммобилизации фермента, известный в данной области, например, но не ограничиваясь этим, смолу для аффинной хроматографии на иммобилизованных ионах металла (IMAC) или иммобилизацию на аффинной смоле с использованием других биологических меток, ковалентную иммобилизацию, иммобилизацию на ионных смолах, иммобилизацию путем адсорбции, инкапсуляцию и/или сшитые ферменты. Например, можно использовать смолу для аффинной хроматографии на иммобилизованных ионах металла (IMAC), или можно использовать любую подходящую комбинацию IMAC смолы и двухвалентного катиона, где катион может представлять собой, например, но не ограничиваясь этим, никель, кобальт, медь, цинк, железо и/или алюминий. Конкретно, можно использовать IMAC смолу, нагруженную никелем. Предпочтительно, когда и ацетаткиназа и пантотенаткиназа (PanK) иммобилизованы на смоле.
Соединение 9: Киназная реакция
Как показано на Схеме 3B, (S)-2-этинил-пропан-1,2,3-триол 1-фосфат (9) получают путем взаимодействия пантотенаткиназы (PanK) дикого типа из E. coli или ее варианта с соединением (3) в буферном растворе, доведенном, по мере необходимости, до pH в диапазоне от около 4-10, или конкретно около 6,5-8,5, или более конкретно 5,5-8,5. Можно использовать любой буфер, имеющий подходящий диапазон pH, например, но не ограничиваясь этим, фосфат натрия, PIPES, например пиперазин-N, N′-бис(2-этансульфоновая кислота); BIS-TRIS метан, например 2-[бис(2-гидроксиэтил)амино]-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол; борат; HEPES, например 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота или 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновая кислота;, триэтаноламин и TRIS, например трис(гидроксиметил)аминометан или 2-амино-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол, при этом фосфат натрия является предпочтительным. Реакцию можно осуществить в присутствии любой подходящей соли двухвалетного металла, например, но не ограничиваясь этим, соли магния, например хлорида магния, и солей кобальта, марганца, цинка или кальция.
В этой реакции используют аденозин 5’-дифосфат (АДФ) в качестве источника фосфата, который требует восстановления до 5’-трифосфата (АТФ). АТФ может быть образован in situ и дополнительно восстановлен любым способом, известным в данной области, из АДФ, аденозин 5’-монофосфата (АМФ) или аденозина. Например, можно использовать комбинацию ацетилфосфата вместе с ацетаткиназой для восстановления АДФ до АТФ. Альтернативно, (a) комбинацию пируватоксидаза, каталазы и ацетаткиназы в присутствии пирувата, фосфата и кислорода можно использовать для восстановления АДФ до АТФ, или (b) комбинацию пируватоксидазы, каталазы и ацетаткиназы в присутствии пирувата, фосфата и кислорода в комбинации с ацетилфосфатом и ацетаткиназой можно использовать для восстановления АТФ из АДФ.
Реакцию можно осуществить с концентрацией субстрата около 10-100 г/л и, в частности, около 20-40 г/л. Реакцию можно осуществлять при температуре от около 0-40°C и, в частности, при около 10-25°C.
Реакцию также можно осуществить с пантотенаткиназой (PanK), иммобилизованной на смоле, или с PanK и ацетаткиназой, иммобилизованными на смоле. Можно использовать любой подходящий способ иммобилизации фермента, известный в данной области, например, но не ограничиваясь этим, смолу для аффинной хроматографии на иммобилизованных ионах металла (IMAC) или иммобилизацию на аффинной смоле с использованием других биологических меток, ковалентную иммобилизацию, иммобилизацию на ионных смолах, иммобилизацию путем адсорбции, инкапсуляцию и/или сшитые ферменты. Например, можно использовать смолу для аффинной хроматографии на иммобилизованных ионах металла (IMAC), или можно использовать любую подходящую комбинацию IMAC смолы и двухвалентного катиона, где катион может представлять собой, например, но не ограничиваясь этим, никель, кобальт, медь, цинк, железо и/или алюминий. Конкретно, можно использовать IMAC смолу, нагруженную никелем. Предпочтительно, когда и ацетаткиназа и пантотенаткиназа (PanK) иммобилизованы на смоле.
Соединение 5: Оксидазная реакция
Как показано на Схеме 3B, (R)-2-этинил-глицеральдегид гидрат 3-фосфат (5) получают путем взаимодействия галактозооксидазы с (S)-2-этинил-пропан-1,2,3-триол 1-фосфатом (9) в буферном растворе, доведенном, по мере необходимости, до pH в диапазоне около 3-10 или более конкретно около 6-8. Можно использовать любой буфер, имеющий подходящий диапазон pH, такой как, но не ограничиваясь этим, фосфат натрия; ацетат натрия; PIPES, например пиперазин-N, N′-бис(2-этансульфоновая кислота); MOPS, например, 3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота или 3-морфолинопропан-1-сульфоновая кислота; HEPES, например 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота или 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновая кислота; TRIS, например трис(гидроксиметил)аминометан или 2-амино-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол; и BIS-TRIS метан, например 2-[бис(2-гидроксиэтил)амино]-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол; борат; CAPS, например N-циклогексил-3-аминопропансульфоновая кислота; MES, например 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота; CHES, например N-циклогексил-2-аминоэтансульфоновая кислота; глицин; или бицин (N, N-бис(2-гидроксиэтил)глицин); при этом фосфат натрия является предпочтительным.
В реакции для активации галактозооксидазы (GOase) используют как медь, так и пероксидазу. Медь можно вводить в реакционную смесь путем добавления CuSO4, Cu(OAc)2, CuCl2 или других солей Cu(II) или Cu(I). Пероксидаза может представлять собой пероксидазу хрена или пероксидазу, полученную из других организмов, или ее можно заменить окислителем, таким как феррицианид, иридат, соли марганца (III), персульфатные соли и другие одноэлектронные или двухэлектронные окислители, или неорганические или органические окислители. Предпочтительно пероксидаза представляет собой пероксидазу хрена. Каталазу также добавляют для предотвращения дезактивации GOase. Каталаза может происходить от млекопитающих (бычья) или из бактериального или грибкового источника, такого как Corynebacterium, Aspergillus или другие организмы, известные в данной области для этой цели.
Реакция протекает в присутствии кислорода. Один из удобных способов включает продувку реакционной смеси воздухом. Альтернативно, можно использовать другие системы для генерации кислорода, такие как пероксид водорода/каталаза, супероксид, или использовать другие методы, известные в данной области техники, для этой цели.
Реакцию можно осуществить с концентрацией субстрата около 10-180 г/л и, в частности, 20-50 г/л. Реакцию можно осуществлять при температуре около 0-40°C и, в частности, около 10-30°C.
Соединение 6: Дезоксирибозо-фосфат-альдолазная (DERA) реакция
Важным преимуществом этого нового пути для получения соединения (6) по сравнению с предлшествующими известными способами является то, что он создает сахарный каркас при правильном состоянии окисления без использования защитных групп.
4-Этинил-D-2-дезоксирибозо-5-фосфат (6) получают путем взаимодействия дезоксирибозо-фосфат-альдолазы (DERA) с (R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфатом (5) в кислотной или солевой форме и ацетальдегидом в водном растворе, доведенном, по мере необходимости, до pH в диапазоне около 5-9 или более конкретно около 6-8. Примеры солей (5) включают, но не ограничиваются этим, кальциевые, магниевые, цинковые, моно- или ди-Na соли, моно- или ди-K соли, или моно- или ди-Li соли; моно- или ди-аммониевые соли; или одновалентные или двухвалентные соли с первичными, вторичными или третичными аминами. Реакцию можно осуществить в открытом сосуде, или ее предпочтительно осуществляют в герметично закрытом сосуде для предотвращения испарения ацетальдегида.
Реакцию можно осуществить с концентрацией субстрата около 10-100 г/л, конкретно около 30-60 г/л. Ее можно осуществить при температуре около 0-40°C и, в частности, около 25-35°C.
Реакцию можно осуществлять без каких-либо буферов. Альтернативно, можно использовать буферы, например, но не ограничиваясь этим, триэтаноламин; фосфат; MOPS, например 3-(N-морфолино)пропансульфоновую кислоту или 3-морфолинопропан-1-сульфоновую кислоту; HEPES, например 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту или 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновую кислоту; BIS-TRIS метан, например 2-[бис(2-гидроксиэтил)амино]-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол; борат; PIPES, например пиперазин-N, N′-бис(2-этансульфоновая кислота); MES, например 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту; и борат; или другие буферы, имеющие подходящий диапазон pH, которые не содержат никаких первичных амино групп.
Каждую стадию и процедуру способов, описанных в настоящей заявке, которые включают использование одного или нескольких ферментов, осуществляют при температуре, которая не вызывает денатурацию указанных одного или нескольких ферментов. Каждую стадию и процедуру способов, описанных в настоящей заявке, которые включают использование одного или нескольких ферментов, можно осуществить при pH в диапазоне около 3-10 или около 4-10.
“Нуклеооснование” (или “азотистое основание” или “основание”) представляет собой пиримидиновый или пуриновый гетероцикл нуклеиновых кислот, таких как ДНК и РНК. В контексте настоящей заявки нуклеооснование включает аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил, а также нуклеооснования с неприродными модификациями, например, где основание имеет один или несколько неприродных заместителей, или модификацией, влияющей на гетероатом(гетероатомы) в основании, исключая любое изменение аномерной C-N связи.
4’-этинил-2’-дезоксинуклеозид содержит нуклеооснование. В контексте настоящей заявки аналог 4’-этинил-2’-дезоксинуклеозида означает неприродную модификацию основания нуклеозида, например, где основание имеет один или несколько неприродных заместителей, или модификацию, влияющую на гетероатом(гетероатомы) в основании, исключая любое изменение аномерной C-N связи.
В контексте настоящей заявки ферменты “фосфопентомутазы” (“PPM”) (например EC 5.4.2.7) представляют собой ферменты, которые катализируют обратимую изомеризацию рибозо-1-фосфата до рибозо-5-фосфата и родственных соединений, таких как дезоксирибозофосфат и аналоги рибозофосфата и дезоксирибозофосфата.
В контексте настоящей заявки ферменты “пуриннуклеозид-фосфорилазы” (“PNP”) (EC 2.4.2.2) представляют собой ферменты, которые катализируют обратимый фосфоролиз пуриновых рибонуклеозидов и родственных соединений (например, дезоксирибонуклеозидов и аналогов рибонуклеозидов и дезоксирибонуклеозидов) в свободное пуриновое основание и рибозо-1-фосфат (и их аналоги).
В контексте настоящей заявки ферменты “сахарозо-фосфорилазы” (“SP”) (EC 2.4.1.7) представляют собой ферменты, которые катализируют обратимый фосфоролиз сахарозы в D-фруктозное основание и глюкоза-1-фосфат (и их аналоги). Сахарозо-фосфорилазу (SP) в комбинации с сахарозой используют в комбинации с пуриннуклеозид-фосфорилазой (PNP) и фосфомутазой (PPM) для удаления свободных фосфат-ионов из реакции, где комбинация ферментов катализирует образование нуклеозида MK-8591 (EFdA), тогда как в некоторых вариантах осуществления это можно заменить другими способами, известными в данной области.
В контексте настоящей заявки “дезоксирибозо-фосфат-альдолаза” (“DERA”) (например, EC 4.1.2.4) относится к ферменту семейства лиаз, которые обратимо расщепляют или создают углерод-углеродные связи. Дезоксирибозо-фосфат-альдолазы, в контексте настоящей заявки, включают природную (дикого типа) дезоксирибозо-фосфат-альдолазу, а также неприродные сконструированные полипептиды, получаемые путем манипулирования, осуществляемого человеком. Дезоксирибозо-фосфат-альдолаза дикого типа катализирует обратимую реакцию 2-дезокси-D-рибозо-5-фосфата с образованием D-глицеральдегид 3-фосфата и ацетальдегида.
В контексте настоящей заявки “пантотенаткиназа” (“PanK”) относится к ферментам (EC 2.7.1.33), которые в природе фосфорилируют пантотенат с образованием 4’-фосфопантотената. Варианты ферментов, полученные из таких ферментов PanK, могут проявлять улучшенную активность и стереоселективность в отношении 3’OH-группы D-этинилглицеральдегида независимо от того, сохраняют ли такие варианты свою природную функцию в отношении пантотената.
В контексте настоящей заявки ферменты “галактозоксидазы” (“GOase”; EC 1.1.3.9) представляют собой медь-зависимые ферменты, которые в присутствии бимолекулярного кислорода катализируют окисление первичных спиртов до соответствующих альдегидов. Они действуют как регио-, так и энантиоспецифическим образом, делая возможными синтетические подходы, которые не требуют или требуют в незначительной степени защиты функциональных групп и дают желаемый стереоизомер. Способ окисления является мягким и контролируемым, так что активность не приводит к чрезмерному окислению спирта до его соответствующей карбоновой кислоты.
В контексте настоящей заявки термин “пероксидаза хрена” (HRP, EC 1.11.1.7) означает железо-зависимый фермент, который активирует и поддерживает каталитическую активность GOase, окисляя неактивное окислительно-восстановительное состояние активного центра, которое возникает во время нормального каталитического цикла GOase. HRP типа I используется каталитическим образом в примерах, включенных в настоящую заявку, однако он не предназначен исключительно для этой роли, так как существуют другие ферменты, переносящие электрон, которые принадлежат к этому и другим классам ферментов, а также химические реагенты, которые могут выполнять эту роль.
В контексте настоящей заявки термин “каталаза” относится к гем-зависимому ферменту (EC 1.11.1.6), который действует на пероксид водорода, побочный продукт реакций галактозооксидазы или пируватоксидазы, который может сделать ферменты неактивными при содержании перекиси водорода выше определенных уровней. Каталаза используется в качестве каталитического поддерживающего фермента в приведенных примерах для превращения пероксида водорода в воду и кислород, хотя в некоторых вариантах осуществления это можно заменить другими методами, такими как электрохимическое разложение пероксида водорода. Гем-зависимая каталаза используется каталитическим образом в примерах, включенных в настоящую заявку, однако она не предназначена исключительно для этой роли, поскольку существуют другие ферменты, принадлежащие к этому классу, которые могут выполнять эту роль.
В контексте настоящей заявки термин “ацетаткиназа” (“AcK”) относится к ферменту (EC 2.7.2.1), который катализирует образование ацетилфосфата из ацетата и аденозинтрифосфата (АТФ). Он также может катализировать обратную реакцию, когда он фосфорилирует аденозин-5’-дифосфат (АДФ) до аденозин-5’-трифосфата (АТФ) в присутствии ацетилфосфата. Ацетаткиназа используется для рециркуляции АТФ, необходимого для пантотенаткиназы (PanK) в приведенных примерах, тогда как в некоторых вариантах осуществления комбинация рециркуляции ацетилфосфат-ацетаткиназа может быть заменена другими методами, известными в данной области.
В контексте настоящей заявки термин “пируватоксидаза” (“PO”) относится к ферменту (EC 1.2.3.3), зависящему от флавинадениндинуклеотида (FAD) и тиаминдифосфата. Пируватоксидаза представляет собой фермент, принадлежащий к семейству оксидоредуктаз, в частности тех, которые действуют на альдегидную или оксогруппу донора с кислородом в качестве акцептора, и он катализирует химическую реакцию между пируватом, фосфат-ионом и бимолекулярным кислородом с образованием ацетилфосфата, диоксида углерода и пероксид водорода. Пируватоксидаза (PO) используется в комбинации с ацетаткиназой (AcK) и каталазой в качестве каталитической регенерирующей АТФ комбинации в приведенных примерах, где комбинация ферментов катализирует образование АТФ из АДФ в присутствии кислорода, пирувата и фосфат-ионов, хотя в некоторых вариантах осуществления они могут быть заменены другими методами, известными в данной области.
В контексте настоящей заявки термины фермент “дикого типа” и “природный” фермент относятся к форме, встречающейся в природе. Например, полипептидная последовательность дикого типа представляет собой последовательность, присутствующую в организме, которая может быть выделена из природного источника и которая не была намеренно модифицирована осуществляемыми человеком манипуляциями.
В контексте настоящей заявки термины “сконструированный”, “вариант”, “мутант” и “неприродный” при использовании в отношении фермента, включающего полипептид, относятся к материалу или материалу, соответствующему природной или нативной форме материала, который был модифицирован так, как в ином случае он не существовал бы в природе. В некоторых вариантах осуществления полипептид идентичен встречающемуся в природе полипептиду, но его получают или производят из синтетических материалов и/или путем манипуляции с использованием рекомбинантных методов.
В контексте настоящей заявки “процент идентичности последовательностей”, “процент идентичности” и “идентичность в процентах” по отношению к ферментам используются для обозначения сравнений между полинуклеотидными последовательностями или полипептидными последовательностями и определяются путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, где часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (то есть гэпы) по сравнению с эталонной последовательностью для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых либо идентичное основание нуклеиновой кислоты, либо аминокислотный остаток встречается в обеих последовательностях, либо основание нуклеиновой кислоты или аминокислотный остаток выравнивают с гэпом для получения количества совпадающих положений, деля количество совпадающих положений на общее количество положений в окне сравнения и умножая результат на 100 с получением процента идентичности последовательностей. Определение оптимального выравнивания и процента идентичности последовательностей осуществляют с использованием алгоритмов BLAST и BLAST 2.0 (см., например, Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410 и Altschul et al., 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402). Программное обеспечение для осуществления анализов BLAST общедоступно на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации.
Вкратце, анализ BLAST включает сначала идентификацию пар последовательностей с высокой оценкой (HSP) путем определения коротких слов длины W в искомой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторой положительно оцениваемой пороговой оценке T при выравнивании со словом такой же длины в последовательности из базы данных. T обозначается как порог оценки соседнего слова (Altschul. et al., см. выше). Эти начальные совпадения соседних слов действуют как семена для инициирования поиска, чтобы найти более длинные HSP, содержащие их. Затем совпадения слов расширяются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока может быть увеличена совокупная оценка выравнивания. Совокупные баллы рассчитываются с использованием, для нуклеотидных последовательностей, параметров M (поощрительный балл за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл за несовпадающие остатки; всегда <0). Для аминокислотных последовательностей используется оценочная матрица для расчета совокупного балла. Расширение совпадений слов в каждом направлении прекращается, когда: совокупная оценка выравнивания падает на величину X от максимального достигнутого значения; совокупная оценка становится равной нулю или ниже из-за накопления одного или нескольких отрицательно оцениваемых выравниваний остатков; либо достигнут конец любой последовательности. Параметры алгоритма BLAST W, T и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) использует по умолчанию длину слова (W), равную 11, ожидание €, равное 10, M=5, N= -4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP использует по умолчанию длину слова (W), равную 3, ожидание €(E), равное 10, и матрицу оценки BLOSUM62 (см. Henikoff and Henikoff, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 89: 10915).
Доступно множество других алгоритмов, которые работают аналогично BLAST, обеспечивая процент идентичности для двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно осуществить, например, с использованием алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, алгоритма выравнивания гомологии Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, метода поиска сходства Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, компьютеризированных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения GCG Wisconsin) или путем визуального осмотра (см. Current Protocols в Molecular Biology, F. M. Ausubel. et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)). Кроме того, для определения выравнивания последовательностей и процента идентичности последовательностей можно использовать программы BESTFIT или GAP в пакете программ GCG Wisconsin (Accelerys, Madison WI) с использованием параметров по умолчанию.
“Существенная идентичность” относится к полинуклеотидной или полипептидной последовательности, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более по сравнению с эталонной последовательностью в пределах окна сравнения, состоящего по меньшей мере из 20 положений остатков, часто в диапазоне по меньшей мере 30-50 остатков, где процент идентичности последовательностей определяется путем сравнения эталонной последовательности с последовательностью, которая включает делеции или добавления, которые составляют 20 или менее процентов эталонной последовательности в окне сравнения. В конкретных вариантах осуществления, применяемых к полипептидам, термин “существенная идентичность” означает, что две полипептидные последовательности при оптимальном выравнивании, например, при помощи программ GAP или BESTFIT с использованием штрафов за открытие гэпа по умолчанию, имеют по меньшей мере 80-процентную идентичность последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 89-процентную идентичность последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 95-процентную идентичность последовательностей или более (например, идентичность последовательностей 99%). Предпочтительно, положения остатков, которые не являются неидентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами.
“Стереоселективность” относится к преимущественному образованию в химической или ферментативной реакции одного стереоизомера по сравнению с другим. Стереоселективность может быть частичной, когда образование одного стереоизомера предпочтительнее другого, или может быть полной, когда образуется только один стереоизомер. Когда стереоизомеры являются энантиомерами, стереоселективность указывается как энантиоселективность, доля (обычно указываемая в процентах) одного энантиомера в сумме обоих. В данной области ее обычно альтернативно указывают (обычно в процентах) как энантиомерный избыток (э.и.), рассчитанный в соответствии с формулой [основной энантиомер - второстепенный энантиомер]/[основной энантиомер+второстепенный энантиомер]. Если стереоизомеры представляют собой диастереоизомеры, стереоселективность указывается как диастереоселективность, доля (обычно указывается в процентах) одного диастереомера в смеси двух диастереомеров, обычно также указывается как диастереомерный избыток (д.и.). Энантиомерный избыток и диастереомерный избыток являются типами стереомерного избытка.
Фраза “подходящие реакционные условия” относится к тем условиям в реакционном растворе для ферментативного превращения (например, диапазоны загрузки фермента, загрузки субстрата, температуры, pH, буферы, сорастворители и т.д.), при которых каждый полипептид, используемый в настоящем изобретении, способен превращать субстрат в желаемое соединение, являющееся продуктом. В настоящей заявке представлены некоторые иллюстративные подходящие реакционные условия.
Используемый в настоящей заявке термин “субстрат” в контексте процесса реакции ферментативного превращения относится к соединению или молекуле, на которые действуют сконструированные ферменты, используемые в настоящей заявке.
Используемый в настоящей заявке термин “продукт” в контексте процесса ферментативного превращения относится к соединению или молекуле, полученным в результате действия ферментативного полипептида на субстрат.
В контексте настоящей заявки термин “увеличение” выхода продукта (например, аналога 4'-этинил-2'-дезоксирибозы фосфата или аналога 4'-этинил-2'-дезоксинуклеозида) реакции происходит, когда конкретный компонент, присутствующий во время реакции (например, фермент), вызывает образование большего количества продукта по сравнению с реакцией, осуществляемой в тех же условиях с тем же субстратом, но в отсутствие представляющего интерес компонента.
В контексте настоящей заявки термины “уравновешивание” или “равновесие” относятся к процессу, приводящему к устойчивой концентрации химических веществ в химической или ферментативной реакции (например, взаимопревращение двух видов A и B), включая взаимопревращение стереоизомеров, что определяется константой скорости прямой и константой скорости обратной химической или ферментативной реакции.
“Энантиомерный избыток” (э.и.) является показателем чистоты, используемым для хиральных веществ. Он отражает степень, в которой образец содержит один энантиомер в большем количестве, чем другой. Например, рацемическая смесь имеет э.и. 0%, в то время как один полностью чистый энантиомер имеет э.и. 100%; и образец с 70% одного энантиомера и 30% другого имеет э.и. 40% (70% - 30%). Диастереомерный избыток (д.и.) рассчитывается так же, как и э.и., когда в смеси присутствуют только два диастереоизомера.
"Белок", “фермент”, "полипептид" и "пептид" используются взаимозаменяемо для обозначения полимера по меньшей мере из двух аминокислот, ковалентно связанных амидной связью, независимо от длины или посттрансляционной модификации (например, гликозилирования, фосфорилирования, липидирования, миристилирования, 10 убиквитинирования и т.д.). В это определение включены D- и L-аминокислоты, а также смеси D- и L-аминокислот.
В контексте настоящей заявки термин “около” означает допустимую ошибку для конкретного значения. В некоторых случаях “около” означает в пределах 0,05%, 0,5%, 1,0% или 2,0% от нижнего и верхнего предела заданного диапазона значений. Что касается pH, “около” означает плюс или минус 0,5.
В контексте настоящей заявки термин “по существу чистый” полипептид или “очищенный” белок относится к композиции, в которой вид полипептида является преобладающим присутствующим видом (т.е. в молярном или массовом отношении он преобладает по сравнению с любыми другими отдельными макромолекулярными видами в композиции), и обычно представляет собой по существу очищенную композицию, когда целевой вид составляет по меньшей мере около 50 процентов от присутствующих макромолекулярных частиц в молях или % масс. Однако в некоторых вариантах осуществления композиция, содержащая полипептид, включает полипептид, который имеет чистоту менее 50% (например, около 10%, около 20%, около 30%, около 40% или около 50%). Как правило, по существу чистая полипептидная композиция включает около 60% или более, около 70% или более, около 80% или более, около 90% или более, около 95% или более и около 98% или более всех макромолекулярных видов, в молях или % масс., присутствующих в композиции. В некоторых вариантах осуществления полипептид очищают до существенной гомогенности (т.е. загрязняющие примеси не могут быть обнаружены в композиции обычными методами детекции), при этом композиция состоит по существу из одного макромолекулярного вида. Растворители, малые молекулы (<500 Дальтон) и элементарные ионы не считаются макромолекулярными видами. В некоторых вариантах осуществления выделенные полипептиды представляют собой по существу чистые полипептидные композиции.
В контексте настоящей заявки термин “улучшенное свойство” фермента относится по меньшей мере к одному улучшенному свойству фермента. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретеним используются сконструированные полипептиды PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP и/или GOase, которые демонстрируют улучшение любого ферментного свойства по сравнению с эталонным PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP или GOase полипептидом, соответственно, и/или PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP или GOase полипептидом дикого типа, соответственно, и/или другим сконструированным PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP или GOase полипептидом, соответственно. Таким образом, уровень “улучшения” можно определить и сравнить между различными полипептидами, включая полипептиды дикого типа, а также сконструированные полипептиды. Улучшенные свойства включают, но не ограничиваются этим, такие свойства, как повышенная экспрессия белка, повышенное продуцирование целевого продукта, повышенная специфичность или сродство к субстрату (т.е. повышенная активность в отношении субстрата), повышенная термоактивность, повышенная термостабильность, повышенная pH активность, повышенная стабильность, повышенная ферментативная активность, повышенная специфическая активность, повышенная резистентность к ингибированию субстрата или конечного продукта, повышенная химическая стабильность, улучшенная хемоселективность, улучшенная устойчивость к растворителю, повышенная устойчивость к кислому pH, повышенная устойчивость к протеолитической активности (т.е. пониженная чувствительность к протеолизу), уменьшенная агрегация, повышенная растворимость и измененный температурный профиль. В дополнительных вариантах осуществления этот термин используется в отношении по меньшей мере одного улучшенного свойства PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP и/или GOase ферментов. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении используются сконструированные PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP и/или GOase полипептиды, которые демонстрируют улучшение любого ферментного свойства по сравнению с эталонным PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP и/или GOase полипептидом, соответственно; и/или полипептидом дикого типа, и/или другим сконструированным PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP и/или GOase полипептидом, соответственно. Таким образом, уровень “улучшения” можно определить и сравнить между различными полипептидами, включая полипептиды дикого типа, а также сконструированные полипептиды.
В контексте настоящей заявки термин “конверсия” (“конв” или “конв.”) относится к ферментативному преобразованию (или биотрансформации) субстрата(субстратов) в соответствующий продукт(продукты). “Процент” конверсии относится к проценту субстрата, который превращается в продукт за определенный период времени при определенных условиях. Таким образом, “ферментативная активность” или “активность” полипептида может быть выражена как процент конверсии субстрата в продукт за определенный период времени.
В контексте настоящей заявки термин “стереоселективность” относится к преимущественному образованию в химической или ферментативной реакции одного стереоизомера по сравнению с другим. Стереоселективность может быть частичной, когда образование одного стереоизомера предпочтительнее другого, или может быть полной, когда образуется только один стереоизомер. Когда стереоизомеры являются энантиомерами, стереоселективность указывается как энантиоселективность, доля (обычно указываемая в процентах) одного энантиомера в сумме обоих. В данной области ее обычно альтернативно указывают (обычно в процентах) как энантиомерный избыток (э.и.), рассчитанный в соответствии с формулой [основной энантиомер - второстепенный энантиомер]/[основной энантиомер+второстепенный энантиомер]. Если стереоизомеры представляют собой диастереоизомеры, стереоселективность указывается как диастереоселективность, доля (обычно указывается в процентах) одного диастереомера в смеси двух диастереомеров, обычно также указывается как диастереомерный избыток (д.и.). Энантиомерный избыток и диастереомерный избыток являются типами стереомерного избытка.
Настоящее изобретение включает использование сконструированных PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP и GOase полипептидов, в частности полипептидов, имеющих SEQ ID NO: 1-21, и указанные последовательности, которые включают одну или несколько консервативных аминокислотных замен, которые могут называться консервативно модифицированными вариантами каждой из SEQ ID NO. 1-21.
В контексте настоящей заявки термин “консервативная” аминокислотная замена относится к заменам аминокислот в белке другими аминокислотами, имеющими аналогичные характеристики (например, кислотные, основные, положительно или отрицательно заряженные, полярные или неполярные, размер боковой цепи, гидрофобность/гидрофильность, конформация и жесткость скелета и т.д.) так, чтобы изменения можно было часто осуществлять без изменения биологической активности белка. Это включает одну или несколько замен аминокислоты в полипептиде другой аминокислотой в пределах того же или подобного определенного класса аминокислот. Специалисты в данной области должно быть понятно, что, как правило, замены отдельных аминокислот в несущественных областях полипептида существенно не изменяют биологическую активность (см., например, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)). Кроме того, замены структурно или функционально схожих аминокислот с меньшей вероятностью нарушат биологическую активность. В качестве примера, а не ограничения, в некоторых вариантах осуществления аминокислота с алифатической боковой цепью заменена другой алифатической аминокислотой (например, аланин, валин, лейцин и изолейцин); аминокислота с гидроксильной боковой цепью заменена другой аминокислотой с гидроксильной боковой цепью (например, серин и треонин); аминокислота, имеющая ароматические боковые цепи, заменена другой аминокислотой, имеющей ароматическую боковую цепь (например, фенилаланин, тирозин, триптофан и гистидин); аминокислота с основной боковой цепью заменена другой аминокислотой с основной боковой цепью (например, лизин и аргинин); аминокислота с кислотной боковой цепью заменена другой аминокислотой с кислотной боковой цепью (например, аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота); и/или гидрофобная или гидрофильная аминокислота заменена другой гидрофобной или гидрофильной аминокислотой, соответственно. Дополнительные иллюстративные консервативные аминокислотные замены представлены в Таблице 1.
ТАБЛИЦА 1 Иллюстративные консервативные аминокислотные замены |
|
Исходный остаток | Консервативная замена |
Ala (A) | Gly; Ser |
Arg (R) | Lys; His |
Asn (N) | Gln; His |
Asp (D) | Glu; Asn |
Cys (C) | Ser; Ala |
Gln (Q) | Asn |
Glu (E) | Asp; Gln |
Gly (G) | Ala |
His (H) | Asn; Gln |
Ile (I) | Leu; Val |
Leu (L) | Ile; Val |
Lys (K) | Arg; His |
Met (M) | Leu; Ile; Tyr |
Phe (F) | Tyr; Met; Leu |
Pro (P) | Ala |
Ser (S) | Thr |
Thr (T) | Ser |
Trp (W) | Tyr; Phe |
Tyr (Y) | Trp; Phe |
Val (V) | Ile; Leu |
Термин "набор аминокислотных замен" или "набор замен" относится к группе аминокислотных замен в полипептидной последовательности по сравнению с эталонной последовательностью. Набор замен может включать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или больше аминокислотных замен.
“Функциональный фрагмент” относится к полипептиду, который имеет амино-концевую и/или карбокси-концевую делецию(делеции) и/или внутренние делеции, но где оставшаяся аминокислотная последовательность идентична соответствующим положениям в последовательности, с которой ее сравнивают (например, полноразмерный сконструированный фермент PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP или GOase, используемый в настоящем изобретении), и которая сохраняет практически всю активность полноразмерного полипептида.
В контексте настоящей заявки термин “делеция” относится к модификации полипептида путем удаления одной или нескольких аминокислот из эталонного полипептида. Делеции могут включать удаление 1 или более аминокислот, 2 или более аминокислот, 5 или более аминокислот, 10 или более аминокислот, 15 или более аминокислот или 20 или более аминокислот, до 10% от общего количества аминокислот или до 20% от общего количества аминокислот, составляющих эталонный фермент, при сохранении ферментативной активности и/или сохранении улучшенных свойств сконструированного PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP или GOase фермента. Делеции могут быть направлены на внутренние части и/или концевые части полипептида. В различных вариантах осуществления делеция может включать непрерывный сегмент или может быть прерывистой. Делеции обычно обозначаются как “-” в аминокислотных последовательностях.
В контексте настоящей заявки термин “вставка” относится к модификации полипептида путем добавления одной или нескольких аминокислот из эталонного полипептида. Вставки могут иметь место во внутренних частях полипептида или на карбокси- или амино-конце. Используемые вставки включают слитые белки, как известно в данной области. Вставка может представлять собой непрерывный сегмент аминокислот или может быть разделена одной или несколькими аминокислотами в природном полипептиде.
Дополнительные акронимы и аббревиатуры, используемые в настоящей заявке, являются следующими:
ЖХ-МС | жидкостная хроматография/ масс-спектрометрия | г/л | грамм(граммов) на литр |
THF | тетрагидрофуран | мл | миллилитр(s) |
ЯМР | спектроскопия ядерного магнитного резонанса | ммоль | миллимоль |
RT или rt | комнатная температура (температура окружающей среды, около 25°C) | мг | миллиграмм |
ст.см3/мин | стандартных кубических сантиметров в минуту | кг | килограмм |
об/мин | оборотов в минуту | N | нормальный |
M | моль/молярность | конв. | конверсия |
мМ | миллимолярный | ЯМР | ядерный магнитный резонанс |
мкл | микролитр(микролитры) | водн. | водный |
DMSO | диметилсульфоксид | ч | час(часы) |
TsOH | п-толуолсульфоновая кислота | ВЭЖХ | высоко-эффективная жидкостная хроматография |
Bn | бензил | DCM | дихлорметан |
CPME | циклопентилметиловый эфир | 2-MeTHF | 2-метилтетрагидрофуран |
MTBE | метил трет-бутиловый эфир | ESI | электрораспылительная ионизация |
HR-MS | масс-спектрометрия высокого разрешения |
Экспериментальные процедуры
Получение 2-этинил-2-гидроксипропан-1,3-диил диацетата (2)
Способ A:
К -35°C раствору диацетоксиацетона (1) (159 г, 914,0 ммоль) в THF (1000 мл) добавляли 1600 мл 0,5 M раствора этинилмагний хлорида в THF, поддерживая температуру ниже -20°C. Когда реакция завершалась, добавляли по каплям уксусную кислоту (78 мл) в 400 мл метил трет-бутилового эфира (MTBE), поддерживая температуру ниже -20°C. Затем добавляли MTBE (800 мл) и смесь нагревали до комнатной температуры. Добавляли насыщенный раствор NaCl в воде (1000 мл) с последующим добавлением насыщенного раствора NH4Cl в воде (1050 мл). Органический слой отделяли, сушили над Na2SO4 и упаривали с получением соединения (2) в виде масла (160 г, 88%). 1H ЯМР (CDCl3, 500 МГц): δ 4,26 (дд, 4 H), 2,55 (с, 1H), 2,14 (с, 6H).
Получение 2-этинил-пропан-1,2,3-триола (3)
Способ B:
К раствору 2-этинил-2-гидроксипропан-1,3-диил диацетата (2) (70 г, 350 ммоль) в этаноле добавляли 0,5M раствор метоксилата натрия в метаноле (69,9 мл, 35,0 ммоль) при комнатной температуре (комн.темп). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов (ч) для достижения завершения реакции. Растворители выпаривали и остаток снова растворяли в 100 мл воды и экстрагировали при помощи 3 × 50 мл MTBE. Водный слой продували азотом для удаления остаточных растворителей с получением 40,9% раствора 2-этинил-пропан-1,2,3-триола (3) (108 г, 100% выход), как определено методом ядерного магнитного резонанса(ЯМР) (малеиновая кислота в качестве внутреннего стандарта). 1H ЯМР (D2O, 500 МГц): δ 3,60 (дд, 4 H), 2,85 (с, 1H).
Альтернативные получения (R)-2-этинил-глицеральдегида (4)
Способ C1:
В перемешиваемом реакторе 2-этинил-пропан-1,2,3-триол (3) (1,1 г, 9,47 ммоль) в натрий-фосфатном буфере (30 мл, 100 мМ, pH 7,0), содержащем пеногаситель 204 (Sigma A6426, 1 капля ~ 20 мкл), нагревали до 30°C с продувкой воздухом при 12,5 ст.см3/мин. Галактозооксидазу (GOase, SEQ ID NO.: 1) (250 мг), пероксидазу хрена* (Тип I, 5 мг) и бычью каталазу** (5 мг), растворенные в натрий-фосфатном буфере (5 мл 100 мМ, pH 7,0), добавляли в реактор, с последующим добавлением водного раствора CuSO4 (100 мМ, 150 мл). Реакционную смесь перемешивали при 600 об/мин с продувкой воздухом в течение 47ч с получением (R)-2-этинил-глицеральдегида (4) при 47% конверсии (по данным ЯМР) и 72% э.и. (Продукт не выделяли). 1H ЯМР (D2O, 500 МГц): δ 4,29 (с, 1H), 3,65 (дд, 2H), 2,83 (с, 1H).
* Пероксидаза хрена: дикого типа пероксидаза из хрена Типа I, коммерчески доступная от SIGMA (P8125), выделена из корней хрена (Amoracia rusticana).
** Бычья каталаза: гем-зависимая каталаза из бычьего источника, коммерчески доступная от Sigma (C1345)
Способ C2:
В перемешиваемый 100-л снабженный кожухом реактор, загруженный деионизированной водой (56,2 кг), добавляли дигидрофосфат натрия (1,212 кг, 10 моль). pH доводили до 7,02 с использованием 10 N раствор гидроксида натрия (852,6 г) при 25°C. В реактор загружали пеногаситель 204 (A6426, 10 мл), затем CuSO4•5H2O (6,5 г). Добавляли галактозооксидазу (451,2 г) (SEQ ID NO.: 10) и перемешивали в течение 15 минут при продувке воздухом. Добавляли пероксидазу хрена* (200,2 г) и каталазу** (502,6 г) и реактор промывали водой (2,0 кг). Затем добавляли раствор 2-этинил-пропан-1,2,3-триола (3) в воде (9,48%, 30,34 кг, 24,72 моль) с последующим добавлением дополнительной порции пеногасителя 204 (A6426, 10 мл). Реакционную смесь продували воздухом и перемешивали в течение ночи с получением 94,0 кг (R)-2-этинил-глицеральдегида (4) при 66% конверсии (по данным ЯМР) и 84% э.и. Выход 60%: 1H ЯМР (D2O, 500 МГц): δ 4,29 (с, 1H), 3,65 (дд, 2H), 2,83 (с, 1H).
* Пероксидаза хрена: дикого типа пероксидаза из очищенного хрена, коммерчески доступная от Toyobo (PEO-301), выделенная из корней хрена (Amoracia rusticana).
** Бычья каталаза: гем-зависимая каталаза из бычьего источника, коммерчески доступная от Sigma (C1345).
Описанную выше реакцию также осуществляли с использованием галактозооксидазы(SEQ ID NO.: 11) и продукт (4) получали при 67% конверсии (по данным ЯМР) и 88% э.и. с выходом 59%: 1H ЯМР (D2O, 500 МГц): δ 4,29 (с, 1H), 3,65 (дд, 2H), 2,83 (с, 1H).
Способ C3:
В 100-мл EasyMax сосуд, снабженный барботером и регулятором потока, загружали воду (82 мл) и PIPES калиевый буфер (5 мл, 0,5 M). pH доводили до 7,5 с использованием 5 M KOH раствора при 25°C. Добавляли пеногаситель 204 (200 мкл) с последующим добавлением модифицированной галактозооксидазы (SEQ ID NO.: 17, 450 мг порошкообразного фермента) и сульфата меди(II) пентагидрата (100 мкл, 100 мМ). Реакционную смесь продували воздухом при 125 стандартных кубических сантиметров в минуту (ст.см3/мин) в течение 15 мин. Загружали бычью каталазу (C1345, Sigma-Aldrich, 150 мг, 2000-5000 Ед./мг, 0,75 МЕд.) с последующим добавлением пероксидазы хрена (HRP, Toyobo PEO-301, 100 мг, 130 Ед./мг, 1,3 кЕд.) и водный раствор 2-этинил-пропан-1,2,3-триола (3) (25% масс., 12 мл, 25,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 30°C с продувкой воздухом при 125 ст.см3/мин и осуществляли отбор проб с использованием EasySampler через 20ч, достигая 70% конверсии и образования соединения (4) ((R)-2-этинил-глицеральдегид) с 58% выходом и 99% э.и. 1H ЯМР (D2O, 500 МГц): δ 4,29 (с, 1H), 3,65 (дд, 2H), 2,83 (с, 1H). Неочищенный реакционный поток непосредственно использовали на последующей стадии фосфорилирования.
Способ C4: Окисление иммобилизованной галактозооксидазой
Процедура иммобилизации фермента:
Nuvia IMAC Ni-нагруженную смолу (16 мл в расчете на насыпной объем) добавляли в фильтр-воронку и промывали связывающим буфером (10 колоночных объемов, 160 мл; 500 мМ хлорида натрия, 50 мМ фосфата натрия, 15 мМ имидазола, pH 8,0) для удаления исходного содержащего смолу раствора. В сосуде лиофилизированные порошки модифицированной галактозооксидазы (SEQ ID NO.: 17, 2,00 г) ресуспендировали в растворе сульфата меди (II) (100 мкМ; 5,00 мл), с последующим добавлением связывающего буфера (50 мл) и смолы. Раствор смешивали с использованием вращающегося смесителя при 20°C в течение 5ч. Смолу фильтровали и промывали связывающим буфером (10 колоночных объемов, 160 мл) и калиевым PIPES буфером (10 колоночных объемов, 160 мл; 50 мМ, pH 7,5), и ее непосредственно использовали в реакции.
Процедура реакции:
В 100-мл EasyMax сосуд, снабженный барботером и регулятором потока, загружали воду (82 мл) и PIPES калиевый буфер (5 мл, 1 M). pH доводили до 7,5 с использованием 5 M KOH раствора при 25°C. Добавляли пеногаситель 204 (200 мкл) с последующим добавлением модифицированной галактозооксидазы, иммобилизованной на смоле (SEQ ID NO.: 17, 750 мг порошкообразного фермента на 6 мл смолы), и сульфата меди(II) пентагидрата (100 мкл, 100 мМ). Реакционную смесь продували воздухом при 125 стандартных кубических сантиметров в минуту (ст.см3/мин) в течение 15 мин. Добавляли бычью каталазу (C1345, Sigma-Aldrich, 210 мг, 2000-5000 Ед./мг, 1,05 МЕд.) с последующим добавлением пероксидазы хрена (HRP, Toyobo PEO-301, 100 мг, 130 Ед./мг, 1,3 кЕд.) и водного раствора 2-этинил-пропан-1,2,3-триола (3) (25% масс., 13 мл, 29,4 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 25°C с продувкой воздухом при 125 ст.см3/мин. Через 22ч реакция достигала 91% конверсии, с получением 200 мМ раствора (R)-2-этинил-глицеральдегида (4) (100 мл, 68% выход, 97% э.и. 1H ЯМР (D2O, 500 МГц): δ 4,29 (с, 1H), 3,65 (дд, 2H), 2,83 (с, 1H). Неочищенный реакционный поток непосредственно использовали на последующей стадии фосфорилирования.
Способ C5: Необязательное выделение альдегида через образование аминаля (8)
Стадия 1: Получение (S)-2-(1,3-дибензилимидазолидин-2-ил)бут-3-ин-1,2-диола
В 100-л снабженный кожухом цилиндрический сосуд снабженный устройством для барботирования азота, механической мешалкой и термопарой, загружали неочищенный оксидазный реакционный поток, содержащий (R)-2-этинил-глицеральдегид ((4), 26,0 кг, 1,85% масс. альдегида, 3,64 моль) и создавали инертную атмосферу N2. Водный раствор нагревали до 20°C и добавляли N, N-диметилдодекан-1-амин оксид (DDAO) (30% масс. в воде, 798 г, 0,96 моль) с последующим добавлением MTBE (55,3 кг, 76 л) и N, N’-дибензилэтан-1,2-диамина (1,55 кг, 6,43 моль). Коричневую бифазную смесь перемешивали в течение ночи при 20°C в атмосфере азота. Через 17 часов перемешивание прекращали и органическую фазу удаляли и отбрасывали. Получали светло-коричневый MTBE раствор (S)-2-(1,3-дибензилимидазолидин-2-ил)бут-3-ин-1,2-диола (56,5 кг, 2,02% масс. аминаля, 3,39 ммоль, 93% выход).
Шесть аналогичных MTBE растворов обрабатывали вместе на одной стадии дистилляции и кристаллизации (в общей сложности 374,4 кг раствора, содержащего 7,91 кг аминаля).
В 50-л снабженный кожухом цилиндрический сосуд, снабженный механической мешалкой, дистилляционной насадкой (холодильник при -20°C) и термопарой, загружали раствор аминаля (45 л). В сосуде создавали вакуум (65-95 тор) и температуру кожуха устанавливали на 40°C. Растворитель удаляли дистилляцией до достижения объема 35 л. В этот момент внутренняя температура была 6,1°C, и начинало кристаллизоваться не совсем белое твердое вещество. медленно добавляли оставшийся MTBE раствор, поддерживая постоянный объем 35-40 л и внутреннюю температуру 0-10°C. Когда весь MTBE раствор был добавлен, объем уменьшался до 25 л. Дистилляцию останавливали, в сосуде создавали инертную атмосферу азота и температуру кожуха снижали до 10°C. Полученную бледно-желтую суспензию подвергали старению при этой температуре в течение 2 часов и твердые частицы собирали фильтрованием. Фильтровальную лепешку промывали холодным (-2°C) MTBE (12,7 кг) и затем сушили под потоком азота в течение 7 часов. (S)-2-(1,3-дибензилимидазолидин-2-ил)-бут-3-ин-1,2-диол получали в виде не совсем белого кристаллического твердого вещества (5,75 кг). 1H ЯМР (500 МГц, DMSO-d 6) δ 7,42-7,35 (м, 4H), 7,32 (тд, J=7,5, 1,6 Гц, 4H), 7,27-7,21 (м, 2H), 5,10 (т, J=5,6 Гц, 1H), 5,03 (с, 1H), 4,28 (д, J=13,3Гц, 1H), 4,16 (д, J=13,3 Гц, 1H), 3,76 (с, 1H), 3,70-3,58 (м, 4H), 3,21 (д, J=0,9 Гц, 1H), 2,90-2,80 (м, 2H), 2,60-2,51 (м, 2H), 13C ЯМР (126 МГц, DMSO-d 6) δ 140,0, 140,0, 128,5, 128,3, 128,2, 128,1, 126,8, 126,8, 88,6, 86,9, 75,0, 74,0, 66,4, 60,7, 60,5, 50,4, 50,3, 39,5. HR-MS (ESI) Аминаль (M+H+) C21H25N2O2+ рассчитано 337,1911; найдено 337,1922.
Стадия 2: Получение (R)-2-этинил-глицеральдегида (4) из аминаля (8)
В 4-л снабженный кожухом цилиндрический сосуд, снабженный устройством для барботирования азота и механической мешалкой, загружали TsOH•H2O (12,0 г, 63,1 ммоль), воду (60 мл), (S)-2-(1,3-дибензилимидазолидин-2-ил)бут-3-ин-1,2-диол (110 г, 327 ммоль) и MTBE (1700 мл). Бифазную смесь помещали в атмосферу азота и температуру кожуха устанавливали на 15°C. Добавляли раствор TsOH•H2O (114 г, 599,3 ммоль) в воде (600 мл) по каплям в течение 1,5 часа при перемешивании верхнеприводной мешалкой (200 об/мин). Когда добавление было завершено, температуру кожуха понижали до 5°C и полученную суспензию подвергали старению в течение 1 часа. Твердые частицы удаляли фильтрованием и промывали холодной водой (270 мл). Бифазный раствор переносили в делительную воронку и органическую фазу удаляли и отбрасывали. Водную фазу обрабатывали DOWEX™ MARATHON™ A смолой (гидроксидная форма, 11,0 г) и AMBERLYST® 15 смолой (водородная форма, 11,0 г) при продувке N2 при скорости 200 ст.см3/мин в течение 24 часов для удаления остаточного MTBE. Смолы удаляли фильтрованием с получением бесцветного водного раствора (R)-2-гидрокси-2-(гидроксиметил)бут-3-иналя (774 г, 4,6% масс. альдегида, 82% выход). 1H ЯМР (500 МГц, D2O) δ 5,01 (с, 1H), 3,77 (д, J=11,7 Гц, 1H), 3,73 (д, J=11,7 Гц, 1H), 2,92 (с, 1H). 13C ЯМР (126 МГц, D2O) δ 129,4, 125,4, 90,3, 81,0, 76,0, 73,9, 65,3. HRMS (ESI) Альдегидный димер (2M+Na+) C10H12NaO6 + рассчитано 251,0526; найдено 251,0530.
Альтернативные получения (R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфата (5):
Способ D1: Ацетаткиназа: система АТФ-восстановления
В перемешиваемом реакторе к раствору динатриевой соли аденозиндифосфата (40 мг, 0,087 ммоль) и хлорида магния (38 мг, 0,400 ммоль) в HEPES буфере (66 мМ, pH 7,5, 30 мл) добавляли (R)-2-этинил-глицеральдегид (4) (1,9 мл, 210 г/л раствор в воде, 3,51 ммоль) с последующим добавлением ацетаткиназы (SEQ ID NO.: 3) (40 мг) и пантотенаткиназы (SEQ ID NO.: 2) (120 мг). Реакционную смесь нагревали до 25°C и добавляли по каплям раствор ацетилфосфат литиево-калиевой соли (1,3 г, 7,01 ммоль) в HEPES буфере (50 мМ, pH 7,5, 10 мл) в течение 4 часов, поддерживая pH при 7,5 с использованием 5M гидроксида натрия. Реакционную смесь перемешивали в течение 18 часов с получением (R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфата (5) при 85% конверсии (по данным ВЭЖХ) (Продукт не выделяли). 1H ЯМР (D2O, 400 МГц): δ 5,02 (с, 1H), 4,00 (дкв., 2 H), 2,88 (с, 1H). ЖХ-МС: (ES, m/z): рассчитано для C5H7O6P (M-H): 193,1; найдено 193,0.
Способ D2: Пируватоксидаза: система АТФ-восстановления
В перемешиваемом реакторе в раствор пирувата натрия (3,11 г, 28 ммоль) и фосфорной кислоты (0,523 мл, 7,71 ммоль) в 76 мл воды pH 7,5 загружали (R)-2-этинил-глицеральдегид (4) (3,8 мл, 210 г/л раствор в воде, 7,01 ммоль), динатриевую соль аденозиндифосфата (80 мг, 0,174 ммоль), тиаминпирофосфат (40 мг, 0,086 ммоль), гидрат динатриевой соли флавинадениндинуклеотида (64 мг, 0,077 ммоль) и хлорид магния (400 мкл, 1 M раствор в воде, 0,4 ммоль). pH снова доводили до 7,5 водным раствором 5M гидроксида натрия и объем реакции снова доводили до 80 мл при помощи воды. Добавляли ацетаткиназу (SEQ ID NO.: 3) (80 мг), пируватоксидазу (SEQ ID NO.: 4) (80 мг, лиофилизированный не содержащий клетки экстракт), пантотенаткиназу (SEQ ID NO.: 2) (400 мг) и каталазу (800 мкл, суспензия сульфата аммония CAT-101, Biocatalytics). Реакционную смесь перемешивали при 500 об/мин и 30°C с продувкой воздухом в течение 72 часов с получением (R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфата 5 при 95% конверсии (по данным ВЭЖХ) (Продукт не выделяли). 1H ЯМР (D2O, 400 МГц): δ 5,02 (с, 1H), 4,00 (дкв., 2 H), 2,88 (с, 1H). ЖХ-МС: (ES, m/z): рассчитано для C5H7O6P (M-H): 193,1; найдено 193,0.
Описанную выше реакцию также осуществляли с использованием пантотенаткиназы (SEQ ID NO.: 13) и продукт 5 получали при 66% конверсии. (Продукт не выделяли). 1H ЯМР (D2O, 400 МГц): δ 5,02 (с, 1H), 4,00 (дкв., 2 H), 2,88 (с, 1H).
Способ D3: Ацетаткиназа: система АТФ-восстановления с использованием иммобилизованных ферментов
Процедура иммобилизации ферментов:
NUVIA™ никель-нагруженную смолу для аффинной хроматографии на иммобилизованных ионах металла (IMAC) (168 мл в расчете на насыпной объем) добавляли в фильтр-воронку и промывали связывающим буфером (1,6 л; 500 мМ хлорида натрия, 50 мМ фосфата натрия, pH 8,0). В сосуде пантотенаткиназу (8,4 г) (SEQ ID NO.: 12) и ацетаткиназу (2,8 г) (SEQ ID NO.: 3) растворяли в связывающем буфере (500 мл). Промытую смолу загружали в сосуд и раствор перемешивали в течение 4 часов при 20°C. Смолу фильтровали и промывали сначала связывающим буфером (1,6 л), затем пиперазин-N, N′-бис(2-этансульфоновая кислота) (PIPES) буфером (840 мл; 50 мМ, pH 6,5). Промытую смолу использовали непосредственно на следующей стадии.
Процедура реакции:
В 1-л реактор загружали раствор (R)-2-этинил-глицеральдегида (4) в воде (608,7 г, 4,6% масс., 212 ммоль) и охлаждали до 5°C. К охлажденному раствору добавляли пиперазин-N, N′-бис(2-этансульфоновая кислота) (PIPES) буфер (32,7 мл, 1 M, pH 6,5, 32,7 ммоль), хлорид магния (9,33 мл, 1 M, 9,33 ммоль), ацетилфосфат диаммониевую соль (51,8 г, 265 ммоль), гидрат динатриевой соли аденозиндифосфата (1,17 г, 2,12 ммоль) и воду (192 мл). Раствор оставляли для перемешивания и pH доводили до 6,4 с использованием 5 N KOH. Реакционную смесь нагревали до 20°C и добавляли 168 мл смолы с ко-иммобилизованными пантотенаткиназой (SEQ ID NO.: 12) и ацетаткиназой (SEQ ID NO.: 3). Реакционную смесь перемешивали в течение 10 часов, используя 5 N KOH для поддержания pH=6,4, с получением (R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфата (5) при 92% конверсии (по данным ВЭЖХ) и с 91% выходом (по данным 31P ЯМР с тетрафенилфосфоний хлоридом в качестве внутреннего стандарта) (продукт не выделяли). 1H ЯМР (D2O, 400 МГц): δ 5,02 (с, 1H), 4,00 (дкв., 2 H), 2,88 (с, 1H). ЖХ-МС: (ES, m/z): рассчитано для C5H7O6P (M-H): 193,1; найдено 193,0.
Получение 4-этинил-D-2-дезоксирибозо-5-фосфата (6)
Способ E:
К раствору (R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфата (5) (5, 20 мл, 5,3 ммоль) в воде добавляли раствор ацетальдегида в воде (40% масс., 2,02 мл, 15,9 ммоль) при комнатной температуре с последующим добавлением дезоксирибозо-фосфат-альдолазы (DERA) (SEQ ID NO.: 6), 25 мг раствора в триэтаноламин гидрохлоридном буфере (1 мл, 1 M, pH 7,0). Реактор герметично закрывали и смесь перемешивали в течение ночи при 30°C и 600 об/мин с получением 4-этинил-D-2-дезоксирибозо-5-фосфата (6) при 99% конв. и 99% э.и., 99% д.и. в виде 1:1 смеси аномеров (Продукт не выделяли). α-аномер: 1H ЯМР (D2O, 600 МГц) δ 5,31 (т, 1H), 4,13 (т, 1H), 3,81-3,72 (м, 2H), 2,89 (с, 1H), 2,42-2,34 (м, 1H), 1,87-1,79 (м, 1H); 13C ЯМР (D2O, 151 МГц) δ 97,7 (с), 81,4 (д), 79,4 (с), 78,9 (с), 71,1 (с), 67,7 (д), 39,6 (с). β-аномер: 1H ЯМР (D2O, 600 МГц) δ 5,40 (дд, 1H), 4,28 (т, 1H), 3,88-3,80 (м, 2H), 2,87 (с, 1H), 2,13-2,06 (м, 1H), 2,04-1,97 (м, 1H); 13C ЯМР (D2O, 151 МГц) δ 97,3 (с), 82,2 (д), 78,7 (с), 78,5 (с), 71,3 (с), 68,4 (д), 39,6 (с). ЖХ-МС: (ES, m/z): рассчитано для C7H10O7P (M-H): 237,0; найдено 237,0
Альтернативные получения (2R,3S,5R)-5-(6-амино-2-фтор-9H-пурин-9-ил)-2-этинил-2-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-3-ола моногидрата (7) [альтернативное название 4’-этинил-2-фтор-2’-дезоксиаденозин или EFdA]
Способ F1:
Аммоний ((2R,3S)-2-этинил-3,5-дигидрокситетрагидрофуран-2-ил)метил гидрофосфат (1,00 г, 3,91 ммоль) растворяли в 10 мл pH 7,5 буфера (100 мМ триэтаноламин HCl, содержащий 5 мМ MnCl2). pH раствора доводили до 7,3 при помощи 5 N NaOH. К раствору добавляли 2-фтораденин (0,599 г, 3,91 ммоль) и сахарозу (2,68 г, 7,82 ммоль). Раствор ферментов получали путем растворения фосфопентомутазы (SEQ ID NO.: 8) (100 мг), пуриннуклеозид-фосфорилазы (SEQ ID NO.: 9) (50 мг) и сахарозо-фосфорилазы (SEQ ID NO.: 7) (10 мг) в 10 мл pH 7,5 буфера. Раствор ферментов добавляли к смеси реагентов и полученную суспензию встряхивали при 40°C. Через 20 ч суспензию охлаждали до 0°C и фильтровали, промывая холодной водой. Твердое вещество сушили в вакууме с получением указанного в заголовке соединения (1,12 г, 92%) в виде единственного изомера.
1H ЯМР: (300 МГц, DMSO-d6, м.д.): δ 7,68 (шир.с, 2H), 7,32 (д, J=2,0 Гц, 1H), 6,44 (т, J=5,8 Гц, 1H), 5,52 (д, J=5,6 Гц, 1H), 5,27 (т, J=6,0 Гц, 1H), 4,44 (кв., J=6,4 Гц, 1H), 3,60 (кв., J=6,0 Гц, 1H), 3,53 (кв., J=6,4 Гц, 1H), 3,48 (с, 1H), 2,48-2,41 (м, 1H), 2,37-2,30 (м, 1H). 13C ЯМР (150,92 МГц, DMSO-d6, м.д.) δ 158,5 (д, JCF=203,5), 157,6 (д, JCF=21,2), 150,2 (д, JCF=20,2), 139,7 (д, JCF=2,4), 117,4 (д, JCF=4,0), 85,1, 82,0, 81,4, 78,7, 70,1, 64,2, 38,1. ЖХ-МС: (ES, m/z): рассчитано для C12H12FN5O3 (M+Na): 316,0822; найдено 316,0818.
PPM и PNP ферменты, использумые на этой стадии, каждый был получен в результате мутаций, исходя из ферментов из E. coli (Escherichia coli). Сахарозо-фосфорилазу (SP), использумую на этой стадии, получали из Alloscardovia omnicolens; SP, выделенную из других организмов, также можно использовать.
Способ F2:
К водному раствору (R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфата (5) (950 мл, 157 ммоль), содержащему пиперазин-N, N′-бис(2-этансульфоновая кислота) (PIPES) буфер при pH около 5,5-6,0, добавляли триэтаноламин (7,09 г, 47,5 ммоль). pH раствора доводили от 7,1 до 7,6 с использованием гидроксида калия (8 мл, 8M). Добавляли хлорид марганца(II) гидрат (0,592 г, 4,70 ммоль) с последующим добавлением сахарозы (161 г, 470 ммоль), получая pH=7,5. К раствору добавляли следующие ферменты: дезоксирибозо-фосфат-альдолазу (SEQ ID NO.: 14) (461 мг), сахарозо-фосфорилазу (SEQ ID NO.: 7) (494 мг), фосфопентомутазу (SEQ ID NO.: 8)(2,63 г) и пуриннуклеозид-фосфорилазу (SEQ ID NO.: 15) (659 мг). После растворения ферментов добавляли 2-фтораденин (19,80 г, 125 ммоль). Реакционную смесь нагревали до 35°C и добавляли ацетальдегид (40% масс. в изопропиловом спирте, 29,8 мл, 235 ммоль). После взаимодействия в течение 2ч в смесь вносили в качестве затравки EFdA кристаллический продукт (0,96 г, 2 моль%). После взаимодействия в течение 26 ч при 35°C суспензию охлаждали до 0°C и твердые частицы собирали фильтрованием, промывая водой два раза (40 мл каждый раз). Твердые частицы сушили при продувке азотом. Выход 43,2 г, 92% масс., 96,2% скорректированный. 1H ЯМР: (300 МГц, DMSO-d6, м.д.): δ 7,68 (шир.с, 2H), 7,32 (д, J=2,0 Гц, 1H), 6,44 (т, J=5,8 Гц, 1H), 5,52 (д, J=5,6 Гц, 1H), 5,27 (т, J=6,0 Гц, 1H), 4,44 (кв., J=6,4 Гц, 1H), 3,60 (кв., J=6,0 Гц, 1H), 3,53 (кв., J=6,4 Гц, 1H), 3,48 (с, 1H), 2,48-2,41 (м, 1H), 2,37-2,30 (м, 1H). 13C ЯМР (150,92 МГц, DMSO-d6, м.д.) δ 158,5 (д, JCF=203,5), 157,6 (д, JCF=21,2), 150,2 (д, JCF=20,2), 139,7 (д, JCF=2,4), 117,4 (д, JCF=4,0), 85,1, 82,0, 81,4, 78,7, 70,1, 64,2, 38,1. ЖХ-МС: (ES, m/z): рассчитано для C12H12FN5O3 (M+Na): 316,0822; найдено 316,0818.
Альтернативные получения (S)-2-этинил-пропан-1,2,3-триол l 1-фосфата (9) :
Способ G1: Ацетаткиназа: система АТФ-восстановления с использованием ферментов SEQ. ID No.: 2 и SEQ. ID No.: 3
В 50-мл реактор загружали раствор 2-этинил-пропан-1,2,3-триола (3) в воде (9,29 г, 9,46% масс., 7,57 ммоль), калиевый PIPES буфер (1,02 мл, 1 M, pH 6,5, 1,02 ммоль), хлорид магния (292 мкл, 1 M, 0,292 ммоль), ацетилфосфат диаммониевую соль (1,851 г, 89% масс., 9,46 ммоль), аденозиндифосфат динатриевую соль гидрат (АДФ , 42 мг, 0,076 ммоль, 0,01 экв.) и воду (28 мл). pH доводили до 6,4 с использованием 5 M KOH, раствор нагревали до 20°C и добавляли модифицированную пантотенаткиназу PanK SEQ. ID No.: 2 (264 мг) и ацетаткиназу AcK SEQ. ID No.: 3 (88 мг). Реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов, поддерживая pH при 6,4 с использованием 5 N KOH. Конечная реакционная смесь содержала (S)-2-этинил-пропан-1,2,3-триол 1-фосфат (9) при >95% э.и. и 99% конверсии (по данным 31P ЯМР). Продукт не выделяли. 1H ЯМР (D2O, 500 МГц) δ 3,89 (м, 2H), 3,72 (д, J=11,6 Гц, 1 H), 3,65 (д, J=11,6 Гц, 1H), 2,93 (с, 1H). 13C ЯМР (D2O, 126 МГц) δ 82,9 (с), 75,1 (с), 71,0 (д, J=6,9 Гц), 67,0 (д, J=4,5 Гц), 64,7 (с). 31P ЯМР (D2O, 202 МГц) δ 3,39. HRMS: (ESI, m/z): рассчитано для [M-1]- C5H8O6P: 195,0058; Найдено 195,0068 [M-H]-: 195,0058.
Способ G2: Ацетаткиназа: система АТФ-восстановления с использованием фермента SEQ. ID No.: 20 и фермента SEQ. ID No.: 21
В снабженный кожухом реактор загружали водный раствор 2-этинил-пропан-1,2,3-триола (3) (11,47 кг, 8,7% масс., 8,61 моль) и воду (7,5 кг) с последующим добавлением 1M BIS-TRIS метанового буфера pH 6,5 (1 л) и хлорида магния (41,4 г). Добавляли АТФ (48 г, 0,086 моль, 0,01 эквивалента) и диаммоний ацетилфосфат (2,021 кг, 89%, 10,33 ммоль), раствор нагревали до 20°C и pH раствора снова доводили до 6,8 с использованием KOH (270,4 г). Затем загружали модифицированную пантотенаткиназу SEQ. ID No.: 20 (20,4 г) и модифицированную ацетаткиназу SEQ. ID No.: 21 (3 г) в виде твердых веществ. Реакционную смесь перемешивали при 20°C в течение 16ч, за это время pH снижался до 5,5. Получали количественную конверсию 2-этинил-пропан-1,2,3-триола (3), судя по данным 1H и 31P ЯМР. Такой полученный раствор (S)-2-этинил-пропан-1,2,3-триол 1-фосфата (9) (397 мМ, 22,5 кг, 98% выход) использовали на последующей стадии окисления без какой-либо дополнительной очистки. 1H ЯМР (D2O, 500 МГц) δ 3,89 (м, 2H), 3,72 (д, J=11,6 Гц, 1 H), 3,65 (д, J=11,6 Гц, 1H), 2,93 (с, 1H).
Способ G3: Ацетаткиназа: система АТФ-восстановления с использованием фермента SEQ. ID No.: 20 и фермента SEQ. ID No.: 21 с дейтерированным соединением (3) для определения абсолютной стереохимии и демонстрации десимметризирующего фосфорилирования.
Модифицированную пантотенаткиназу SEQ. ID No.: 20 (100 мкл 10 г/л раствора в воде) и модифицированную ацетаткиназу SEQ. ID No.: 21 (100 мкл 2 г/л раствора в воде) добавляли к раствору, содержащему диаммоний ацетилфосфат (41 мг), 2-этинил-пропан-1,1-d2-1,2,3-триол ((R)-3-d2, 20 мг, 170 мкмоль), хлорид магния (10 мкл 1 M раствора в воде), АДФ (10 мкл 100 г/л раствора в воде) и натрийфосфатный буфер (10 мкл 1 M раствора в воде) в воде (800 мкл) при pH 6,5. Реакционную смесь инкубировали в течение 24ч при комнатной температуре с получением дейтерированных 2-этинил-пропан-1,2,3-триол 1-фосфатных аналогов (S)-9-( 3,3-d2 ) и (S)-9-( 1,1-d2 ) в соотношении 95:5 и с общим выходом 99%. Соотношение фосфорилированных соединений, определенное методом 31P ЯМР, составляло ~95:5, подтверждая стереоселективное фосфорилирование 2-этинил-пропан-1,2,3-триола (3) по про-(S) гидроксильной группе (т.е. десимметризирующее фосфорилирование). 1H ЯМР (D2O, 500 МГц) δ 3,89 (м, 2H), 3,72 (д, J=11,6 Гц, 1 H), 3,65 (д, J=11,6 Гц, 1H), 2,93 (с, 1H). 13C ЯМР (D2O, 126 МГц) δ 82,9 (с), 75,1 (с), 71,0 (д, J=6,9 Гц), 67,0 (д, J=4,5 Гц), 64,7 (с).
Способ G4: Ацетаткиназа: система АТФ-восстановления с использованием иммобилизованных ферментов SEQ. ID No.: 20 и SEQ. ID No.: 21
Процедура иммобилизации ферментов:
Nuvia IMAC Ni-нагруженную смолу (75 мл в расчете на насыпной объем) добавляли в фильтр-воронку и промывали водой (9 колоночных объемов, 3 × 225 мл) и связывающим буфером (1 колоночный объем, 75 мл; 500 мМ хлорида натрия, 50 мМ фосфата натрия, 15 мМ имидазола, pH 8,0). В сосуде пантотенаткиназу (SEQ ID NO.: 20, 6,0 г) в виде лиофилизированного порошка ресуспендировали в связывающем буфере (200 мл) и добавляли промытую смолу. Раствор смешивали с использованием вращающегося смесителя при 25°C в течение 6ч. Смолу фильтровали и промывали связывающим буфером (6 колоночных объемов, 6×225 мл) и BIS-TRIS буфером (8 колоночных объемов, 600 мл; 50 мМ, pH 6,2).
Процедура реакции:
Водный раствор 2-этинил-пропан-1,2,3-триола (3) (574 г, 8,7% масс., 0,430 моль) и воды (350 мл) загружали в снабженный кожухом реактор с последующим добавлением 1M BIS-TRIS метанового буфера pH 6,5 (50 мл) и хлорида магния (2,033 г, 0,01 моль). Добавляли АТФ (2,37 г, 0,0043 моль, 0,01 эквивалент) и диаммоний ацетилфосфат (101 г, 89%, 0,530 ммоль, 1,2 экв.), раствор нагревали до 20°C и pH раствора снова доводили до 6,8 с использованием 5M KOH. Затем загружали смолу с иммобилизованной пантотенаткиназой SEQ. ID No.: 20 (25 мл) и модифицированной ацетаткиназой SEQ. ID No.: 21 (0,15 г) в виде твердых веществ. Реакционную смесь перемешивали при 20°C в течение 16ч, за это время pH снижался до 5,5. Получали количественную конверсию 2-этинил-пропан-1,2,3-триола (3) в (S)-2-этинил-пропан-1,2,3-триол 1-фосфат (9), судя по данным 1H и 31P ЯМР. 1H ЯМР (D2O, 500 МГц) δ 3,89 (м, 2H), 3,72 (д, J=11,6 Гц, 1 H), 3,65 (д, J=11,6 Гц, 1H), 2,93 (с, 1H).
Альтернативные получения (R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфата (5):
Способ H1: Иммобилизованные галактозооксидазы SEQ ID No.: 16
Процедура иммобилизации ферментов:
Nuvia IMAC Ni-нагруженную смолу (10 мл в расчете на насыпной объем) добавляли в фильтр-воронку и промывали связывающим буфером (10 колоночных объемов, 100 мл; 500 мМ хлорида натрия, 50 мМ фосфата натрия, 15 мМ имидазола, pH 8,0) для удаления исходного содержащего смолу раствора и получения 16 г промытой смолы. В сосуде лиофилизированные порошки модифицированной галактозооксидазы (SEQ ID NO.: 16, 750 мг) ресуспендировали в растворе сульфата меди (II) (100 мкМ; 5,00 мл) с последующим добавлением связывающего буфера (20 мл) и промытой смолы (3,0 г). Раствор смешивали с использованием вращающегося смесителя при 20°C в течение 5ч. Смолу фильтровали и промывали связывающим буфером (10 колоночных объемов, 100 мл) и BIS-TRIS буфером (10 колоночных объемов, 100 мл; 50 мМ, pH 7,5), и ее использовали непосредственно в реакции гликозилирования.
Процедура реакции:
Смолу с иммобилизованной галактозооксидазой SEQ ID NO.: 16 (3,0 г) добавляли к раствору (S)-2-этинил-пропан-1,2,3-триол 1-фосфата (9, 5,4 ммоль, 270 мМ, 20 мл) в BIS-TRIS метановом буфере (35 мМ, pH доводили до 7,2), с последующим добавлением раствора сульфата меди (II) в воде (30 мкл, 100 мМ) и пероксидазы хрена (PEO-301, 18 мг) и бычьей каталазы (C1345, 120 мг), ресуспендированных в воде (600 мкл). Реакционную смесь герметично закрывали газопроницаемой мембраной и интенсивно встряхивали при 22°C в течение 4 дней для достижения конечной конверсии 77% и получения (R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфата (5) при 95% э.и. Несущую ферменты смолу отфильтровывали и раствор (R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфата (5) использовали непосредственно в реакции гликозилирования. 1H ЯМР (D2O, 400 МГц): δ 5,02 (с, 1H), 4,00 (дкв., 2 H), 2,88 (с, 1H). ЖХ-МС: (ES, m/z): рассчитано для C5H7O6P (M-H): 193,1; найдено 193,0.
Способ H2: Иммобилизованные галактозооксидазы SEQ ID No.: 17
Процедура иммобилизации ферментов:
Nuvia IMAC Ni-нагруженную смолу (10 мл в расчете на насыпной объем) добавляли в фильтр-воронку и промывали связывающим буфером (10 колоночных объемов, 100 мл; 500 мМ хлорида натрия, 50 мМ фосфата натрия, 15 мМ имидазола, pH 8,0) для удаления исходного содержащего смолу раствора и получения 16 г промытой смоле. В сосуде лиофилизированные порошки модифицированной галактозооксидазы (SEQ ID NO.: 16, 750 мг) ресуспендировали в растворе сульфата меди (II) (100 мкМ; 5,00 мл) с последующим добавлением связывающего буфера (20 мл) и промытой смолы (3,0 г). Раствор смешивали с использованием вращающегося смесителя при 20°C в течение 5ч. Смолу фильтровали и промывали связывающим буфером (10 колоночных объемов, 100 мл) и BIS-TRIS метановым буфером (10 колоночных объемов, 100 мл; 50 мМ, pH 7,5) и ее непосредственно использовали в реакции.
Процедура реакции:
Смолу с иммобилизованной модифицированной галактозооксидазой SEQ ID NO.: 17 (3,0 г) добавляли к раствору (S)-2-этинил-пропан-1,2,3-триол 1-фосфата (9, 5,4 ммоль, 270 мМ, 20 мл) в BIS-TRIS метановом буфере (35 мМ, pH доводили до 7,2), с последующим добавлением раствора сульфата меди (II) в воде (30 мкл, 100 мМ) и пероксидазы хрена (PEO-301, 18 мг) и бычьей каталазы (C1345, 120 мг), ресуспендированных в воде (600 мкл). Реакционную смесь герметично закрывали газопроницаемой мембраной и интенсивно встряхивали при 22°C в течение 4 дней до достижения конечной конверсии 77% и получения (R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфата (5) при 95% э.и. Несущую ферменты смолу отфильтровывали и раствор (R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфата (5) использовали непосредственно в реакции гликозилирования. 1H ЯМР (D2O, 400 МГц): δ 5,02 (с, 1H), 4,00 (дкв., 2 H), 2,88 (с, 1H). ЖХ-МС: (ES, m/z): рассчитано для C5H7O6P (M-H): 193,1; найдено 193,0.
Способ H3: Иммобилизованные галактозооксидазы SEQ ID No.: 18
Процедура иммобилизации ферментов:
Nuvia IMAC Ni-нагруженную смолу (3 мл в расчете на насыпной объем) добавляли в фильтр-воронку и промывали связывающим буфером (10 колоночных объемов, 30 мл; 500 мМ хлорида натрия, 50 мМ фосфата натрия, 15 мМ имидазола, pH 8,0) для удаления исходного содержащего смолу раствора и получения 2,4 г промытой смолы. В сосуде лиофилизированные порошки модифицированной галактозооксидазы (SEQ ID NO.: 18, 75 мг) ресуспендировали в растворе сульфата меди (II) (100 мкМ; 1,00 мл) с последующим добавлением связывающего буфера (5 мл) и промытой смолы (400 мг). Раствор смешивали с использованием вращающегося смесителя при 20°C в течение 5ч. Смолу фильтровали и промывали связывающим буфером (10 колоночных объемов, 4 мл) и BIS-TRIS метановым буфером (10 колоночных объемов, 4 мл; 50 мМ, pH 7,5) и использовали непосредственно в реакции.
Процедура реакции:
Иммобилизованную модифицированную GOase SEQ ID NO.: 18 добавляли (400 мг) к раствору (S)-2-этинил-пропан-1,2,3-триол 1-фосфата ((9), 5,4 ммоль, 270 мМ, 1 мл) в BIS-TRIS метановом буфере (35 мМ, pH доводили до 7,2), с последующим добавлением пероксидазы хрена (PEO-301, 1 мг) и каталазы из Corynebacterium glutamicum (Roche, лиофилизат, #11650645103, 3 мг) ресуспендировали в воде (100 мкл). Реакционную смесь герметично закрывали газопроницаемой мембраной и интенсивно встряхивали при 30°C в течение 48ч. Конечная конверсия через 2 дня достигала 90%, и (R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфат (5) получали с >99% э.и. Несущую ферменты смолу отфильтровывали и раствор (R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфата (5) использовали непосредственно без дополнительной очистки. 1H ЯМР (D2O, 400 МГц): δ 5,02 (с, 1H), 4,00 (дкв., 2 H), 2,88 (с, 1H). ЖХ-МС: (ES, m/z): рассчитано для C5H7O6P (M-H): 193,1; найдено 193,0.
Способ H4: Иммобилизованные галактозооксидазы SEQ ID No.: 19
Процедура иммобилизации ферментов:
Nuvia IMAC Ni-нагруженную смолу (3 мл в расчете на насыпной объем) добавляли в фильтр-воронку и промывали связывающим буфером (10 колоночных объемов, 30 мл; 500 мМ хлорида натрия, 50 мМ фосфата натрия, 15 мМ имидазола, pH 8,0) для удаления исходного содержащего смолу раствора и получения 2,4 г промытой смолы. В сосуде лиофилизированные порошки модифицированной галактозооксидазы (SEQ ID NO.: 19, 75 мг) ресуспендировали в растворе сульфата меди (II) (100 мкМ; 1,00 мл), с последующим добавлением связывающего буфера (5 мл) и промытой смолы (400 мг). Раствор смешивали с использованием вращающегося смесителя при 20°C в течение 5ч. Смолу фильтровали и промывали связывающим буфером (10 колоночных объемов, 4 мл) и BIS-TRIS метановым буфером (10 колоночных объемов, 4 мл; 50 мМ, pH 7,5) и использовали непосредственно в реакции.
Процедура реакции:
Иммобилизованную модифицированную GOase SEQ ID NO.: 18 добавляли (400 мг) к раствору (S)-2-этинил-пропан-1,2,3-триол 1-фосфата (9, 5,4 ммоль, 270 мМ, 1 мл) в BIS-TRIS метановом буфере (35 мМ, pH доводили до 7,2) с последующим добавлением пероксидазы хрена (PEO-301, 1 мг) и каталазы из Corynebacterium glutamicum (Roche, лиофилизат, #11650645103, 3 мг), ресуспендированных в воде (100 мкл). Реакционную смесь герметично закрывали газопроницаемой мембраной и интенсивно встряхивали при 30°C в течение 48ч. Конечная конверсия через 2 дня достигала 100%, и (R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфат (5) получали при >99% э.и. Несущую ферменты смолу отфильтровывали и раствор (R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфата (5) использовали непосредственно без дополнительной очистки. 1H ЯМР (D2O, 400 МГц): δ 5,02 (с, 1H), 4,00 (дкв., 2 H), 2,88 (с, 1H). ЖХ-МС: (ES, m/z): рассчитано для C5H7O6P (M-H): 193,1; найдено 193,0.
“Аминокислоты” обозначаются их общеизвестными однобуквенными символами, которые рекомендованы Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Для целей настоящего описания коды, используемые для генетически кодируемых аминокислот для ферментов, используемых в способах, описанных в настоящей заявке, показаны в Таблице 2:
ТАБЛИЦА 2 | |||
Аминокислота | Однобуквенный код | Аминокислота | Однобуквенный код |
аланин | A | изолейцин | I |
аргинин | R | лейцин | L |
аспарагин | N | лизин | K |
аспарагиновая кислота | D | метионин | M |
аспарагин или аспарагиновая кислота | B | фенилаланин | F |
цистеин | C | пролин | P |
глутаминовая кислота | E | серин | S |
глутамин | Q | треонин | T |
глутамин или глутаминовая кислота | Z | триптофан | W |
глицин | G | тирозин | Y |
гистидин | H | валин | V |
Номера ID последовательностей для ферментов, используемых или которые можно использовать в способах синтеза EfdA, описанных в настоящей заявке, и в проиллюстрированных стадиях способа в экспериментальных процедурах, описанных в настоящей заявке, представлены, но не ограничиваются этим, в Таблице 3.
ТАБЛИЦА 3 | |
SEQ ID NO: | ФЕРМЕНТ И АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ |
1 | Галактозооксидаза (GOase) = Вариант галактозооксидазы из Fusarium graminearum (ранее известный как Dactylium dendroides ) MASAPIGSAIPRNNWAVTCDSAQSGNECNKAIDGNKDTFWHTFYGANGDPKPPHTYTIDMKTTQNVNGLSVLPRQDGNQNGWIGRHEVYLSSDGTNWGSPVASGSWFADSTTKYSNFETRPARYVRLVAITEANGQPWTSIAEINVFQASSYTAPQPGLGRWGPTIDLPIVPAAAAIEPTSGRVLMWSSYRNDAFEGSPGGITLTSSWDPSTGIVSDRTSTVTKHDMFCPGISMDGNGQIVVDETATGGNDAKKTSLYDSSSDSWIPGPDMQVARGYQSSATMSDGRVFTIGGSFSGGRVEKNGEVYSPSSKTWTSLPNAKVNPMLTADKQGLYRSDNHAWLFGWKKGSVFQAGPSTAMNWYYTSGSGDVKSAGKRQSNRGVAPDAMCGNAVMYDAVKGKILTFGGSPDYEDSDATTNAHIITLGEPGTSPNTVFASNGLYFARTFHTSVVLPDGSTFITGGQRRGIPTEDSTPVFTPEIYVPEQDTFYKQNPNSIVRAYHSISLLLPDGRVFNGGGGLCGDCTTNHFDAQIFTPNYLYDSNGNLATRPKITRTSTQSVKVGGRITISTDSSISKASLIRYGTATHTVNTDQRRIPLTLTNNGGNSYSFQVPSDSGVALPGYWMLFVMNSAGVPSVASTIRVTQGGGGSWSHPQFEK |
2 | Пантотенаткиназа (PanK) = Вариант пантотенаткиназы из E. coli MSIKEQTLMTPYLQFDRNQWAALRDSVPMTLSEDEIARLKGINEDLSLEEVAEIYLPLSRLLNFYISSNLRRQAVLEQFLGTNGQRIPYIISIAGSVAVGKSTTARVLQALLSRWPEHRRVELITTDGFLHPNQVLKERGLMKKKGFPESYDMHRLVKFVSDLKSGVPNVTAPVYSHLIYDVIPDGDKTVVQPDILILEGLNVLQSGMDYPHDPHHVFVSDFVDFSIYVDAPEDLLQTWYINRFLKFREGAFTDPDSYFHNYAKLTKEEAIKTAMTIWKEMNWLNLKQNILPTRERASLILTKSANHAVEEVRLRK |
SEQ ID NO: | ФЕРМЕНТ И АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ |
3 | Ацетаткиназа (AcK) = ацетаткиназа дикого типа из Thermotoga maritima MGSHHHHHHGSRVLVINSGSSSIKYQLIEMEGEKVLCKGIAERIGIEGSRLVHRVGDEKHVIERELPDHEEALKLILNTLVDEKLGVIKDLKEIDAVGHRVVHGGERFKESVLVDEEVLKAIEEVSPLAPLHNPANLMGIKAAMKLLPGVPNVAVFDTAFHQTIPQKAYLYAIPYEYYEKYKIRRYGFHGTSHRYVSKRAAEILGKKLEELKIITCHIGNGASVAAVKYGKCVDTSMGFTPLEGLVMGTRSGDLDPAIPFFIMEKEGISPQEMYDILNKKSGVYGLSKGFSSDMRDIEEAALKGDEWCKLVLEIYDYRIAKYIGAYAAAMNGVDAIVFTAGVGENSPITREDVCSYLEFLGVKLDKQKNEETIRGKEGIISTPDSRVKVLVVPTNEELMIARDTKEIVEKIGR |
4 | Пируватоксидаза (PO) = пируватоксидаза дикого типа из Streptococcus thermophilus MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTVGKTKVSTASLKVLAGWGIDTIYGIPSGTLAPLMEALGEQEETDIKFLQVKHEEVGAMAAVMQWKFGGKLGVCVGSGGPGASHLINGLYDAAMDNTPVLAILGSPPQRELNMDAFQELNQNPMYDHIAVYNRRVAYAEQLPKLIDDAIRTAISKRGVAVLEVPGDFGYKEIANDAFYSSGHSYRDYVSSAINEVDIDAAVEVLNKSKRAVIYAGIGTMGHGPAVQELSRKIKAPIITTAKNFETFDYDFEGLTGSTYRVGWKPANEAVKEADTVLFVGSNFPFAEVEGTFSNVENFIQIDNNPTMLGKRHNADVAILGDAGEAVQMLLEKVAPVEESAWWNANLKNIQNWRDYMTKLETKENGPLQLYQVYNAINKYADEDAIYSIDVGNTTQTSIRHLHMTPKNMWRTSPLFASMGIALPGGIGAKNVYPERQVFNLMGDGAFSMNYQDIVTNVRYNMPVINVVFTNTEYGFIKNKYEDTNTNTFGTEFTDVDYAMIGEAQGAVGFTVSRIEDMDQVMAAAVKANKEGKTVVIDAKITKDRPIPVETLKLDPALYSEEEIKAYKERYEAEELVPFSEFLKAEGLESKVAK |
5 | Дезоксирибозо-фосфат-альдолаза (DERA) = дезоксирибозо-фосфат-альдолаза дикого типа из Shewanella halifaxensis MSDLKKAAQQAISLMDLTTLNDDDTDQKVIELCHKAKTPAGDTAAICIYPRFIPIARKTLNEIGGDDIKIATVTNFPHGNDDIAIAVLETRAAVAYGADEVDVVFPYRALMEGNETVGFELVKACKEACGEDTILKVIIESGVLADPALIRKASELSIDAGADFIKTSTGKVAVNATLEAAEIMMTVISEKNPKVGFKPAGGVKDAAAAAEFLGVAARLLGDDWATPATFRFGASSLLTNLLHTLELADAPQGAQGY |
6 | Дезоксирибозо-фосфат-альдолаза (DERA) = Вариант дезоксирибозо-фосфат-альдолазы (DERA) из Shewanella halifaxensis MCDLKKAAQRAISLMDLTTLNDDDTDQKVIELCHKAKTPAGDTAAIVIYPRFIPIARKTLNEIGGLDIKIVTVTNFPHGNDDIAIAVLETRAAVAYGADEVDVVFPYRALMEGNETVGFELVKACKEACGEDTILKVIIESGVLKDPALIRKASEISIDAGADFIKTSTGKVAVNATLEAAEIIMTVISEKNPKVGFKPAGGIKDAAAAAEFLGVAARLLGDDWATPATFRFGATDLLTNLLHTLELADAPQGAQGY |
7 | Сахарозо-фосфорилаза (SP) = сахарозо-фосфорилаза дикого типа из Alloscardovia omnicolens MKNKVQLITYADRLGDGTLKSMTETLRKHFEGVYEGVHILPFFTPFDGADAGFDPVDHTKVDPRLGSWDDVAELSTTHDIMVDTIVNHMSWESEQFQDVMAKGEDSEYYPMFLTMSSIFPDGVTEEDLTAIYRPRPGLPFTHYNWGGKTRLVWTTFTPQQVDIDTDSEMGWNYLLSILDQLSQSHVSQIRLDAVGYGAKEKNSSCFMTPKTFKLIERIKAEGEKRGLETLIEVHSYYKKQVEIASKVDRVYDFAIPGLLLHALEFGKTDALAQWIDVRPNNAVNVLDTHDGIGVIDIGSDQMDRSLAGLVPDEEVDALVESIHRNSKGESQEATGAAASNLDLYQVNCTYYAALGSDDQKYIAARAVQFFMPGVPQVYYVGALAGSNDMDLLKRTNVGRDINRHYYSAAEVASEVERPVVQALNALGRFRNTLSAFDGEFSYSNADGVLTMTWADDATRATLTFAPKANSNGASVARLEWTDAAGEHATDDLIANPPVVA |
8 | Фосфопентомутаза (PPM) = Вариант фосфопентомутазы из E. coli MKRAFIMVLDSFGIGATEDAERFGDVGADTLGHIAEACAKGEADNGRKGPLNLPNLTRLGLAKAHEGSTGFIPAGMDGNAEVIGAYAWAHEMSSGKDSVSGHWEIAGVPVLFEWGYFSDHENSFPQELLDKLVERANLPGYLGNCRSSGTVILDQLGEEHMKTGKPIFYTSAASVFQIACHEETFGLDKLYELCEIAREELTNGGYNIGRVIARPFIGDKAGNFQRTGNRRDLAVEPPAPTVLQKLVDEKHGQVVSVGKIADIYANCGITKKVKATGLDALFDATIKEMKEAGDNTIVFTNFVDFDSSWGHRRDVAGYAAGLELFDRRLPELMSLLRDDDILILTADHGCDPTWTGTDHTREHIPVLVYGPKVKPGSLGHRETFADIGQTLAKYFGTSDMEYGKAMF |
9 | Пуриннуклеозид-фосфорилаза (PNP) = Вариант пуриннуклеозид-фосфорилазы из E. coli MATPHINAEMGDFADVVLMPGDPLRAKYIAETFLEDAREVNNVRGMLGFTGTYKGRKISVMGHGAGIPSCSIYTKELITDFGVKKIIRVGSCGAVLPHVKLRDVVIGMGACTDSKVNRIRFKDHDFAAIADFDMVRNAVDAAKALGIDARVGNLFSADLFYSPDGEMFDVMEKYGILGVEMEAAGIYGVAAEFGAKALTICTVSDHIRTHEQTTAAERQTTFNDMIKIALESVLLGDKE |
10 | Галактозооксидаза (GOase) = Вариант галактозооксидазы из Fusarium graminearum (ранее известный как Dactylium dendroides ) MASAPIGVAIPRNNWAVTCDSAQSGNECNKAIDGNKDTFWHTQYGVNGDPKPPHTITIDMKTVQNVNGLSVLPRQDGNQNGWIGRHEVYLSSDGVNWGSPVASGSWFADSTTKYSNFETRPARYVRLVAITEANGQPWTSIAEINVFQASSYTAPQPGLGRWGPTIDLPIVPSAAAIEPTSGRVLMWSSYRQDAFEGSPGGITLTSSWDPSTGIVSDRTSTVTKHDMFCPGISMDGNGQIVVSGGNDAKKTSLYDSSSDSWIPGPDMQVARGYQSSATMSDGRVFTIGGSFSGGQVEKNGEVYSPSSKTWTSLPNAKVNPMLTADKQGLYRSDNHAWLFGWKKGSVFQAGPSTAMNWYYTSGSGDVKSAGKRQSNRGVAPDAMCGNAVMYDAVKGKILTFGGSPDYEDSDATTNAHIITLGEPGTSPNTVFASNGLYFARTFHTSVVLPDGSTFITGGQQRGIPTEDSTPVFTPEIYVPEQDTFYKQNPNSIVRAYHSISLLLPDGRVFNGGGGLCGDCTTNHFDAQIFTPNYLYDSNGNLATRPKITRTSTQSVVVGGWITIWTDMSISAASLIRYGTATHTVNTDQRRIPLTLTNNGGNSYSFQVPSDSGVALPGYWMLFVMNSAGVPSVASTIRVTQGQTGHHHHHH |
11 | Галактозооксидаза (GOase) = Вариант галактозооксидазы из Fusarium graminearum (ранее известный как Dactylium dendroides ) MASAPIGVAIPRNNWAVTCDSAQSGNECNKAIDGNKDTFWHTQYGVNGDPKPPHTITIDMKTVQNVNGLSVLPRQDGNQNGWIGRHEVYLSSDGVNWGSPVASGSWFADSTTKYSNFETRPARYVRLVAITEANGQPWTSIAEINVFQASSYTAPQPGLGRWGPTIDLPIVPSAAAIEPTSGRVLMWSSYRQDAFEGSPGGITLTSSWDPSTGIVSDRTSTVTGHDMFCPGISMDGNGQIVVSGGNDAKKTSLYDSSSDSWIPGPDMQVARGYNSSATMSDGRVFTIGGSFSGGQVEKNGEVYSPSSKTWTSLPNAKVNPMLTADKQGLYRSDNHAWLFGWKKGSVFQAGPSTAMNWYYTSGSGDVKSAGKRQSNRGVAPDAMCGNAVMYDAVKGKILTFGGSPDYQDSDATTNAHIITLGEPGTSPNTVFASNGLLFARTFHTSVVLPDGSTFITGGQQRGIPTEDSTPVFTPEIYVPEQDTFYKQNPNSIVRAYHSISLLLPDGRVFNGGGGLCGDCETNHFDAQIFTPNYLYDSNGNLATRPKITRTSTQSVVVGGWITIWTDMSISAASLIRYGTATHTVNTDQRRIPLTLTNNGGNSYSFQVPSDSGVALPGYWMLFVMNSAGVPSVASTINVTQGQTGHHHHHH |
12 | Пантотенаткиназа (PanK) = Вариант пантотенаткиназы из E. coli MSIKEQTLMTPYLQLDRNQWAALRDSNPMTLSEDEIARLKGINEDLSLEEVAEVYLPLSRLLNFYISSNLRRQAVLEQFLGTNGQRIPYIISIAGSVAVGKSTTARVLQALLSRWPEHRRVELITTDGFLHPNQVLKERGLMKKKGFPESYDMHRLMKFVKDLKSGVPNVTAPVYSHLIYDVIPDGDKTVVQPDILILEGLNVLQSGMDYPHDPHHVFVSDFVDFSIYVDAPEDLLQTWYINRFLKFREGAFTDPDSYFHGYAKLTKEEAIKTAMTIWKEMNHLNLKQNILPTRERASLILTKSANHIVEEVRLRK |
13 | Пантотенаткиназа (PanK) = Вариант пантотенаткиназы из E. coli MHHHHHHGGMSIKEQTLMTPYLQLDRNQWAALRDSNPMTLSEDEIARLKGINEDLSLEEVAEVYLPLSRLLNFYISSNLRRQAVLEQFLGTNGQRIPYIISIAGSVAVGKSTTARVLQALLSRWPEHRRVEHITTDGFLHPNQVLKERGLMGKKGFPESYDMHRLMKFVKDLKSGVPNVTAPVYSHLIYDVIPDGDKTVVQPDILILEGLNVLQSGMDYPHDPHHVFVSDFVDFSIYVDAPEDLLQTWYINRFLKFREGAFTDPDSYFHGYAKLTKEEAIKTAMTIWKEMNHLNLKQNILPTRERASLILTKSANHIVEEVRLRK |
14 | Дезоксирибозо-фосфат-альдолаза (DERA) = Вариант дезоксирибозо-фосфат-альдолазы (DERA) из Shewanella halifaxensis MHHHHHHCDLKKAAQRAISLMDLTTLNDDDTDQKVIELCHKAKTPAGDTAAIVIYPRFIPIARKTLNEIGGLDIKIVTVTNFPHGNDDIAIAVLETRAAVAYGADEVDVVFPYRALMEGNETVGFELVKACKEACGEDTILKVIIESGVLKDPALIRKASEISIDAGADFIKTSTGKVAVNATLEAAEIIMTVISEKNPKVGFKPAGGIKDAAAAAEFLGVAARLLGDDWATPATFRFGATDLLTNLLHTLELADAPQGAQGY |
15 | Пуриннуклеозид-фосфорилаза (PNP) = Вариант пуриннуклеозид-фосфорилазы из E. coli MATPHINAEMGDFADVVLMPGDPLRAKYIAETFLEDAREVNNVRGMLGFTGTYKGRKISVMGHGMGIPSCSIYTKELITDFGVKKIIRVGSCGAVLPHVKLRDVVIGMGACTDSKVNRIRFKDHDFAAIADFDMVRNAVDAAKALGIDARVGNLFSADLFYSPDGEMFDVMEKYGILGVEMEAAGIYGVAAEFGAKALTICTVSDHIRTHEQTTAAERQTTFNDMIKIALESVLLGDKE |
16 | Галактозооксидаза (GOase) = Вариант галактозооксидазы из Fusarium graminearum (ранее известный как Dactylium dendroides ) MASAPIGVAIPRNNWAVTCDSAQSGNECNKAIDGNKDTFWHTQYGVNGDPKPPHTITIDMKTVQNVNGLSVLPRQDGNQNGWIGRHEVYLSSDGVNWGSPVASGSWFADSTTKYSNFETRPARYVRLVAITEANGQPWTSIAEINVFQASSYTAPQPGLGRWGPTIDLPIVPSAAAIEPTSGRVLMWSSYRQDAFEPSPGGITLTSSWDPSTGIVSDRTSTVTGHDMFCPGISMDGNGQIVVSGGNDAKKTSLYDSSSDSWIPGPDMQVARGYNSSATMSDGRVFTIGGSYSGGQVEKNGEVYSPSSKTWTSLPNAKVNPMLTADKQGLYRSDNHAWLFGWKKGSVFQAGPSTAMNWYYTSGSGDVKSAGKRQSDRGVAPDAMCGNAVMYDAVKGKILTFGGSPDYQDSDATTNAHIITLGEPGTSPNTVFASNGLLFARTFHTSVVLPDGSVFITGGQQRGVPLEDSTPVFTPEIYVPEQDTFYKQNPNSIVRAYHSISLLLPDGRVFNGGGGLCGDCETNHFDAQIFTPNYLYDSNGNLATRPKITRTSTQSVVVGGWITIWTDMSISAASLIRYGTATHTVNTDQRRIGLTLTNNGGNSYSFQVPSDSGVALPGYWMLFVMNSAGVPSVASTINVTQGQTGHHHHHH |
17 | Галактозооксидаза (GOase) = Вариант галактозооксидазы из Fusarium graminearum (ранее известный как Dactylium dendroides ) MASAPIGVAIPRNNWAVTCDSAQSGNECIKAIDGNKDTFWHTQYGVNGDPKPPHTITIDMKTVQNVNGLSVLPRQDGNQNGWIGRHEVYLSSDGVNWGSPVASGSWFADSTTKYSNFETRPARYVRLVAITEANGQPWTSIAEINVFQASSYTAPQPGLGRWGPTIDLPIVPSAAAIEPTSGRVLMWSSYRQDAFEDSPGGITLTSSWDPSTGIVSDRTSTVTGHDMFCPGISMDGNGQIVVSGGNDAKKTSLYDSSSDSWIPGPDMQVARGYNSSATMSDGRVFTIGGSYSGGQVEKNGEVYSPSSKTWTSLPNAKVNPMLTADKQGLYRSDNHAWLFGWKKGSVFQAGPSTAMNWYYTSGSGDVKSAGKRQSDRGVAPDAMCGNAVMYDAVKGKILTFGGSPDYQDSDATTNAHIITLGEPGTSPNTVFASNGLLFARTFHTSVVLPDGSVFITGGQQRGVPLEDSTPVFTPEIYVPEQDTFYKQNPNSIVRAYHSISLLLPDGRVFNGGGGLCGDCETNHFDAQIFTPNYLYDSNGNLATRPKITRTSTQSVVVGGWITIWTDMSISAASLIRYGTATHTVNTDQRRIGLTLTNNGGNSYSFQVPSDSGVALPGYWMLFVMNSAGVPSVASTINVTQGQTGHHHHHH |
18 | Галактозооксидаза (GOase) = Вариант галактозооксидазы из Fusarium graminearum (ранее известный как Dactylium dendroides ) MASAPIGVAIPRNNWAVTCDSAQSGNECIKAIDGNKDTFWHTQYGVNGDPKPPHTITIDMKTVQNVNGLSVLPRQDGNQNGWIGRHEVYLSSDGVNWGSPVASGSWFADSTTKYSNFETRPARYVRLVAITEANGQPWTSIAEINVFQASSYTAPQPGLGRWGPTIDLPIVPSAAAIEPTSGRVLMWSSYRQDAFEDSPGGITLTSSWDPSTGIVSDRTSTVTGHDMFCPGISMDGNGQIVVSGGNDAKKTSLYDSSSDSWIPGPDMQVARGYNSSATMSDGRVFTIGGSYSGGQVEKNGEVYSPSSKTWTSLPNAKVNPMLTADKRGLYRSDNHAWLFGWKKGSVFQAGPSTAMNWYYTSGSGDVKSAGKRQSDRGVAPDAMCGNAVMYDAVKGKILTFGGSPDYQDSDATTNAHIITLGEPGTSPNTVFASNGLLFARTFHTSVVLPDGSVFITGGQQRGVPLEDSTPVFTPEIYVPEQDTFYKQNPNSIVRAYHSISLLLPDGRVFNGGGGLCGDCETNHFDAQIFTPNYLYDSNGNLATRPKITRTSTQSVVVGGWITIWTDMSISAASLIRYGTATHTVNTDQRRIGLTLTNNGGNSYSFQVPSDSGVALPGYWMLFVMNSAGVPSVASTINVTQGQTGHHHHHH |
19 | Галактозооксидаза (GOase) = Вариант галактозооксидазы из Fusarium graminearum (ранее известный как Dactylium dendroides ) MASAPIGVAIPRNNWAVTCDSAQSGNECIKAIDGNKDTFWHTQYGVNGDPKPPHTITIDMKTVQNVNGLSVLPRQDGNQNGWIGRHEVYLSSDGVNWGSPVASGSWFADSTTKYSNFETRPARYVRLVAITEANGQPWTSIAEINVFQASSYTAPQPGLGRWGPTIDLPIVPSAAAIEPTSGRVLMWSSYRQDAFRDSPGGITLTSSWDPSTGIVSDRTSTVTGHDMFCPGISMDGNGQIVVSGGNDAKKTSLYDSSSDSWIPGPDMQVARGYNSSATMSDGRVFTIGGSYSGGQVEKNGEVYSPSSKTWTSLPNAKVNPMLTADKQGLYRSDNHAWLFGWKKGSVFQAGPSTAMNWYYTSGSGDVKSAGKRQSDRGVAPDAMCGNAVMYDAVKGKILTFGGSPDYQDSDATTNAHIITLGEPGTSPNTVFASNGLLFARTFHTSVVLPDGSVFITGGQQRGVPLEDSTPVFTPEIYVPEQDTFYKQNPNSIVRAYHSISLLLPDGRVFNGGGGLCGDCETNHFDAQIFTPNYLYDSNGNLATRPKITRTSTQSVVVGGWITIWTDMSISAASLIRYGTATHTVNTDQRRIGLTLTNNGGNSYSFQVPSDSGVALPGYWMLFVMNSAGVPSVASTINVTQGQTGHHHHHH |
20 | Пантотенаткиназа (PanK) = Вариант пантотенаткиназы из E. coli MHHHHHHGGSGSIKEQTLMTPYLQLDRNQWAALRDSNPMTLSEDEIARLKGINEDLSLEEVAEVYLPLSRLLNFYISSNLRRQAQLEQFLGTNGQRIPYIISIAGSVAVGKSTFARVLQALLSRWPEHRRVEHITTDGFLHPNQVLKERGLMGKKGFPESYDMHRLMKFVKDLKSGVPNVTAPVYSHLIYDVIPDGDKTVVQPDILILEGLNVLQSGMDYPHDPHHVFVSDFVDFSIYVDAPEDLLQTWYINRFLKFREGAFTDPDSYFHGYAKLTKEEAIKTAMTIWKEMNHVNLKQNILPTRERASLILTKSANHIVEEVRLRK |
21 | Ацетаткиназа (AcK) = Вариант ацетаткиназы из Thermotoga maritima MGSHHHHHHGSRVLNINSGSSSIKYQLIEMEGEKVLCKGIAERIGIEGSRLVHRVGDEKHVIERELPDHEEALKLILNTLVDEKLGVIKDLKEIDAVGHRVVHGGERFKESVLVDEEVLKAIEEVSPLAPLHNPANLMGIKAAMKLLPGVPNVQVFDTAFHQTIPQKAYLYAIPYEYYEKYKIRRYGFHGISHRYVSKRAAEILGKKLEELKIITCHIGNGASVAAVKYGKCVDTSMGFTPLEGLVMGTRSGDLDPAIPFFIMEKEGISPQEMYDILNKKSGVYGLSKGFSSDMRDNLEAALKGDEWCKLVLEIYDYRIAKYIGAYAAAMNGVDAIVFTAGVGENSPITREDVCKYLEFLGVKLDKQKNEETIRGKEGIISTPDSRVKVLVVPTNEELMIARDTKEIVEKIGR |
Пероксидаза хрена: пероксидаза дикого типа из хрена Типа I, коммерчески доступная от SIGMA (P8125), выделена из корней хрена (Amoracia rusticana).
Каталаза: (1) каталаза дикого типа из бычьей печени коммерчески доступа от SIGMA (C1345); или (2) CAT-101, Biocatalytics; или (3) из Corynebacterium glutamicum (Roche, #11650645103).
Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения включают, но не ограничиваются этим, использование следующих ферментов на стадиях способа синтеза, описанного в настоящей заявке, для получения 4’-этинил 2’-дезоксинуклеозида или его аналога, например EFdA.
А. Пуриннуклеозид-фосфорилаза.
1A. Сконструированная пуриннуклеозид-фосфорилаза, включающая полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO.: 9 или SEQ ID NO.: 15, или ее функциональный фрагмент, где полипептидная последовательность указанной сконструированной пуриннуклеозид-фосфорилазы включает по меньшей мере одну аминокислотную замену или набор аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO.: 15.
2A. Сконструированная пуриннуклеозид-фосфорилаза по п. 1A, где указанная сконструированная пуриннуклеозид-фосфорилаза включает полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO.: 15.
3A. Сконструированная пуриннуклеозид-фосфорилаза, которая состоит из полипептидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO.: 15.
4А. Сконструированная пуриннуклеозид-фосфорилаза по любому из пп. 1A-3A, которая включает по меньшей мере одно улучшенное свойство по сравнению с пуриннуклеозид-фосфорилазой дикого типа E. coli .
5A. Сконструированная пуриннуклеозид-фосфорилаза по п. 4A, где указанное улучшенное свойство включает улучшенную активность в отношении субстрата-соединения 6,5 (в его кольцевой форме или в виде альдегида или гидрата с открытой цепью, или соли любого из вышеуказанных) по сравнению с пуриннуклеозид-фосфорилазой дикого типа E. coli .
6A. Сконструированная пуриннуклеозид-фосфорилаза по п. 4A, где указанное улучшенное свойство включает повышенную продукцию EFdA (соединение 7) по сравнению с пуриннуклеозид-фосфорилазой дикого типа E. coli .
7A. Сконструированная пуриннуклеозид-фосфорилаза по любому из пп. A1-6A, где указанная сконструированная пуриннуклеозид-фосфорилаза является очищенной.
8A. Сконструированная пуриннуклеозид-фосфорилаза по любому из пп. 1A-7A, где по меньшей мере одна аминокислотная замена (т.е. одна или несколько аминокислотных замен) представляет собой консервативную аминокислотную замену(замены).
B. Фосфопентомутаза.
1B. Сконструированная фосфопентомутаза, включающая полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO.: 8, или ее функциональный фрагмент, где полипептидная последовательность указанной сконструированной фосфопентомутазы включает по меньшей мере одну аминокислотную замену или набор аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 8.
2B. Сконструированная фосфопентомутаза по п. 1B, где указанная сконструированная фосфопентомутаза включает полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична SEQ ID NO.: 8.
3B. Сконструированная фосфопентомутаза, которая состоит из полипептидной последовательности, представленной в SEQ ID NO.: 8.
4B. Сконструированная фосфопентомутаза по любому из пп. 1B-3B, которая включает по меньшей мере одно улучшенное свойство по сравнению с фосфопентомутазой дикого типа E. coli .
5B. Сконструированная фосфопентомутаза по п. 4B, где указанное улучшенное свойство включает улучшенную активность в отношении субстрата-соединения 6 (в его кольцевой форме или в виде альдегида или гидрата с открытой цепью, или соли любого из вышеуказанных) по сравнению с фосфопентомутазой дикого типа E. coli .
6B. Сконструированная фосфопентомутаза по п. 4B, где указанное улучшенное свойство включает повышенную продукцию соединения 6,5 или соединения 7 (EFdA) по сравнению с фосфопентомутазой дикого типа E. coli .
7B. Сконструированная фосфопентомутаза по любому из пп. 1B-6B, где указанная сконструированная фосфопентомутаза является очищенной.
8B. Сконструированная фосфопентомутаза по любому из пп. 1B-7B, где по меньшей мере одна аминокислотная замена (т.е. одна или несколько аминокислотных замен) представляет собой консервативную аминокислотную замену(замены).
C. Дезоксирибозо-фосфат-альдолаза.
1C. Дезоксирибозо-фосфат-альдолаза, которая состоит из полипептидной последовательности дикого типа из Shewanella halifaxensis , представленной в SEQ ID NO.: 5.
2C. Сконструированная дезоксирибозо-фосфат-альдолаза, которая состоит из полипептидной последовательности, представленной в SEQ ID NO.: 6 или SEQ ID NO.: 14.
3C. Сконструированная дезоксирибозо-фосфат-альдолаза, где указанная сконструированная дезоксирибозо-фосфат-альдолаза включает полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 или SEQ ID NO.: 14.
4C. Сконструированная дезоксирибозо-фосфат-альдолаза, включающая полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 или SEQ ID NO.: 14, или ее функциональный фрагмент, где полипептидная последовательность указанной сконструированной дезоксирибозо-фосфат-альдолазы включает по меньшей мере одну аминокислотную замену или набор аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 или SEQ ID NO.: 14.
5C. Дезоксирибозо-фосфат-альдолаза по любому из пп. 1C-4C, которая обладает активностью в отношении субстрата-соединения 5 ((R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфата, его гидрата или соли любого из вышеуказанных).
6C. Дезоксирибозо-фосфат-альдолаза по любому из пп. 1C-5C, которая включает способность к образованию соединения 6 (4-этинил-D-2-дезоксирибозо-5-фосфата или формы его альдегида или гидрата с открытой цепью, или соли любого из вышеуказанных) без необходимости в защитных группах на субстрате-соединении 5 ((R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфате, его гидрате или соли любого из вышеуказанных) в процессе реакции.
7C. Сконструированная дезоксирибозо-фосфат-альдолаза по любому из пп. 2C-6C, где дезоксирибозо-фосфат-альдолаза обладает улучшенным свойством, которое включает повышенную продукцию соединения 6 (4-этинил-D-2-дезоксирибозо-5-фосфата, или формы его альдегида или гидрата с открытой цепью, или соли любого из вышеуказанных), по сравнению с дезоксирибозо-фосфат-альдолазой дикого типа Shewanella halifaxensis .
8C. Дезоксирибозо-фосфат-альдолаза по любому из пп. 1C-7C, где указанная дезоксирибозо-фосфат-альдолаза является очищенной.
9C. Сконструированная дезоксирибозо-фосфат-альдолаза по любому из пп. 2C-7C, где по меньшей мере одна аминокислотная замена (т.е. одна или несколько аминокислотных замен) представляет собой консервативную аминокислотную замену(замены).
D. Пантотенаткиназа.
1D. Сконструированная пантотенаткиназа, включающая полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 13 или SEQ ID NO.: 20, или ее функциональный фрагмент, где полипептидная последовательность указанной сконструированной пантотенаткиназы включает по меньшей мере одну аминокислотную замену или набор аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 13 или SEQ ID NO.: 20.
2D. Сконструированная пантотенаткиназа по п. 1D, где указанная сконструированная пантотенаткиназа включает полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 13 или SEQ ID NO.: 20.
3D. Сконструированная пантотенаткиназа, которая состоит из полипептидной последовательности, представленной в SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 13 или SEQ ID NO.: 20.
4D. Сконструированная пантотенаткиназа по любому из пп. 1D-3D, которая включает по меньшей мере одно улучшенное свойство по сравнению с пантотенаткиназой дикого типа E. coli.
5D. Сконструированная пантотенаткиназа по п. 4D, где указанное улучшенное свойство включает улучшенную активность в отношении субстрата-соединения 4 ((R)-2-этинил-глицеральдегида или его гидратированной формы) по сравнению с пантотенаткиназой дикого типа e. coli.
6D. Сконструированная пантотенаткиназа по п. 5D, где указанное улучшенное свойство включает повышенную продукцию соединения 5 ((R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфата) по сравнению с пантотенаткиназой дикого типа.
7D. Сконструированная пантотенаткиназа по п. 4D, где указанное улучшенное свойство включает улучшенную активность в отношении субстрата-соединения 3 (2-этинил-пропан-1,2,3-триола) по сравнению с пантотенаткиназой дикого типа e. coli.
8D. Сконструированная пантотенаткиназа по п. 7D, где указанное улучшенное свойство включает повышенную продукцию соединения 9 ((S)-2-этинил-пропан-1,2,3-триол 1-фосфата) по сравнению с пантотенаткиназой дикого типа.
9D. Сконструированная пантотенаткиназа по любому из пп. 1D-8D, где указанная пантотенаткиназа является очищенной.
10D. Сконструированная пантотенаткиназа по любому из пп. 1D-9D, где по меньшей мере одна аминокислотная замена (т.е. одна или несколько аминокислотных замен) представляет собой консервативную аминокислотную замену(замены).
E. Галактозооксидаза.
1E.Сконструированная галактозооксидаза, включающая полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO.: 1, 10, 11, 16, 17, 18 или 19, или ее функциональный фрагмент, где полипептидная последовательность указанной сконструированной галактозооксидазы включает по меньшей мере одну аминокислотную замену или набор аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NOs.: 1, 10, 11, 16, 17, 18 или 19.
2E. Сконструированная галактозооксидаза по п. 1E, где указанная сконструированная галактозооксидаза включает полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична SEQ ID NOs.: 1, 10, 11, 16, 17, 18 или 19.
3E. Сконструированная галактозооксидаза, которая состоит из полипептидной последовательности, представленной в SEQ ID NOs.: 1, 10, 11, 16, 17, 18 или 19.
4E. Сконструированная галактозооксидаза по любому из пп. 1E-3E, которая включает по меньшей мере одно улучшенное свойство по сравнению с галактозооксидазой дикого типа F. graminearum.
5E. Сконструированная галактозооксидаза по п. 4E, где указанное улучшенное свойство включает улучшенную активность в отношении субстрата, который представляет собой первичный спирт, по сравнению с галактозооксидазой дикого типа F. graminearum.
6E. Сконструированная галактозооксидаза по п. 4E, где указанное улучшенное свойство включает улучшенную активность в отношении субстрата-соединения 3 (2-этинил-пропан-1,2,3-триол) по сравнению с галактозооксидазой дикого типа F. graminearum.
7E. Сконструированная галактозооксидаза по п. 6E, где указанное улучшенное свойство включает повышенную продукцию соединения 4 ((R)-2-этинил-глицеральдегида или его гидратированной формы) по сравнению с галактозооксидазой дикого типа F. graminearum.
8E. Сконструированная галактозооксидаза по п. 4E, где указанное улучшенное свойство включает улучшенную активность в отношении субстрата-соединения 9 ((S)-2-этинил-пропан-1,2,3-триол 1-фосфат) по сравнению с галактозооксидазой дикого типа F. graminearum.
9E. Сконструированная галактозооксидаза по п. 8E, где указанное улучшенное свойство включает повышенную продукцию соединения 5 ((R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфата или его гидратированной формы) по сравнению с галактозооксидазой дикого типа F. graminearum.
10E. Сконструированная галактозооксидаза по любому из пп. 1E-9E, где указанная галактозооксидаза является очищенной.
11E. Сконструированная галактозооксидаза по любому из пп. 1E-10E, где по меньшей мере одна аминокислотная замена (т.е. одна или несколько аминокислотных замен) представляет собой консервативную аминокислотную замену(замены).
F. Ацетаткиназа.
1F. Ацетаткиназа, которая состоит из полипептидной последовательности дикого типа из Thermotoga maritima, представленной в SEQ ID NO.: 3 или SEQ ID NO.: 21.
2F. Сконструированная ацетаткиназа, где указанная сконструированная ацетаткиназа включает полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична SEQ ID NO.: 3 или SEQ ID NO.: 21.
3F. Сконструированная ацетаткиназа, включающая полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO.: 3 или SEQ ID NO.: 21, или ее функциональный фрагмент, где полипептидная последовательность указанной сконструированной ацетаткиназы включает по меньшей мере одну аминокислотную замену или набор аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO.: 3 или SEQ ID NO: 21.
4F. Ацетаткиназа по п. 2F или 3F, которая включает по меньшей мере одно улучшенное свойство по сравнению с ацетаткиназой дикого типа T. maritima.
5F. Ацетаткиназа по п. 4F, где указанное улучшенное свойство включает улучшенную активность для рецикла АТФ-кофактора в реакции фосфорилирования в отношении субстрата-соединения 4 ((R)-2-этинил-глицеральдегида или его гидратированной формы) по сравнению с ацетаткиназой дикого типа Thermotoga maritima.
6F. Ацетаткиназа по п. 5F, где указанное улучшенное свойство включает повышенную продукцию соединения 5 ((R)-2-этинил-глицеральдегид 3-фосфата или его гидрата, или соли любого из вышеуказанных) по сравнению с ацетаткиназой дикого типа Thermotoga maritima.
7F. Ацетаткиназа по п. 4F, где указанное улучшенное свойство включает улучшенную активность для рецикла АТФ-кофактора в реакции фосфорилирования в отношении субстрата-соединения 3 (2-этинил-пропан-1,2,3-триол) по сравнению с ацетаткиназой дикого типа Thermotoga maritima.
8F. Ацетаткиназа по п. 7F, где указанное улучшенное свойство включает повышенную продукцию соединения 9 ((S)-2- этинил-пропан-1,2,3-триол 1-фосфата или соли любого из вышеуказанных) по сравнению с ацетаткиназой дикого типа Thermotoga maritima.
9F. Ацетаткиназа по любому из пп. 1F-8F, где указанная ацетаткиназа является очищенной.
10F. Сконструированная ацетаткиназа по любому из пп. 2F-7F, где по меньшей мере одна аминокислотная замена (т.е. одна или несколько аминокислотных замен) представляет собой консервативную аминокислотную замену(замены).
Claims (97)
1. Способ синтеза 4’-этинил-2’-дезоксинуклеозида, включающий объединение соединения 6.5:
,
с пуриннуклеозид-фосфорилазой и нуклеооснованием в буферном растворе, содержащем соль марганца (II),
где 2X+ представляет собой (a) два протона, (b) один протон и один одновалентный катион, (c) два одновалентных катиона, где каждый катион является одинаковым или они отличны друг от друга, или (d) один двухвалентный катион, и где 4’-этинил-2’-дезоксинуклеозид представляет собой
.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий выделение
.
3. Способ по п. 1 для синтеза 4’-этинил-2’-дезоксинуклеозида, дополнительно включающий объединение соединения 6
и фосфопентомутазы с пуриннуклеозид-фосфорилазой и нуклеооснованием в буферном растворе, содержащем соль марганца (II).
4. Способ по п. 3, дополнительно включающий удаление неорганического фосфатного побочного продукта из реакционной смеси.
5. Способ по п. 4, включающий удаление неорганического фосфатного побочного продукта из реакционного раствора путем (a) добавления сахарозо-фосфорилазы и сахарозы к реакционной смеси или (b) добавления кальция, магния или марганца к реакционной смеси.
6. Способ по любому из пп. 3-5, дополнительно включающий выделение 4’-этинил-2’-дезоксинуклеозида.
7. Способ по п. 3, дополнительно включающий стадию синтеза соединения 6, где синтез включает объединение соединения 5
с ацетальдегидом и дезоксирибозо-фосфат-альдолазой в водном растворе с получением соединения 6;
где 2X+ представляет собой (a) два протона, (b) один протон и один одновалентный катион, (c) два одновалентных катиона, где каждый катион является одинаковым или они отличны друг от друга, или (d) один двухвалентный катион.
8. Способ по п. 7, где реакцию осуществляют в герметично закрытом сосуде.
9. Способ по п. 7 или 8, дополнительно включающий стадию синтеза соединения 5, где синтез включает объединение соединения 4
с пантотенаткиназой в буферном растворе в присутствии соли двухвалетного металла с АТФ в качестве источника фосфата, где АТФ восстанавливают in situ,
с получением соединения 5.
10. Способ по п. 9, где АТФ восстанавливают in situ с использованием (a) ацетилфосфата и ацетаткиназы, или (b) пируватоксидазы, каталазы и ацетаткиназы в присутствии пирувата, фосфата и кислорода, или (c) комбинации вышеуказанных.
11. Способ по п. 10, где (a) пантотенаткиназа является иммобилизованной или (b) пантотенаткиназа и ацетаткиназа являются иммобилизованными.
12. Способ по п. 9, дополнительно включающий стадию синтеза соединения 4, где синтез включает объединение соединения 3
с (a)галактозооксидазой, медью, каталазой и (b)пероксидазой или окислителем;
в присутствии кислорода в буферном растворе с получением соединения 4.
13. Способ по п. 12, где галактозооксидаза является иммобилизованной.
14. Способ синтеза 4’-этинил-2’-дезоксинуклеозида, включающий объединение соединения 5
, ацетальдегида и нуклеооснования с дезоксирибозо-фосфат-альдолазой, фосфопентомутазой и пуриннуклеозид-фосфорилазой в буферном растворе, содержащем соль марганца (II),
где 2X+ представляет собой (a) два протона, (b) один протон и один одновалентный катион, (c) два одновалентных катиона, где каждый катион является одинаковым или они отличны друг от друга, или (d) один двухвалентный катион, и
где 4’-этинил-2’-дезоксинуклеозид представляет собой
.
15. Способ по п. 14, дополнительно включающий удаление неорганического фосфатного побочного продукта из реакционной смеси.
16. Способ по п. 15, включающий удаление неорганического фосфатного побочного продукта из реакционной смеси путем (a) добавления сахарозо-фосфорилазы и сахарозы к реакционной смеси или (b) добавления кальция, магния или марганца к реакционной смеси.
17. Способ по любому из пп. 14-16, дополнительно включающий выделение 4’-этинил-2’-дезоксинуклеозида.
18. Способ по п. 17, дополнительно включающий выделение
.
19. Способ синтеза соединения 6.5
,
включающий объединение соединения 6
с фосфопентомутазой в буферном растворе, содержащем соль марганца (II),
где 2X+ представляет собой (a) два протона, (b) один протон и один одновалентный катион, (c) два одновалентных катиона, где каждый катион является одинаковым или они отличны друг от друга, или (d) один двухвалентный катион.
20. Способ синтеза соединения 6
,
включающий объединение соединения 5
с ацетальдегидом и дезоксирибозо-фосфат-альдолазой в водном растворе с получением соединения 6;
где 2X+ представляет собой (a) два протона, (b) один протон и один одновалентный катион, (c) два одновалентных катиона, где каждый катион является одинаковым или они отличны друг от друга, или (d) один двухвалентный катион.
21. Способ синтеза соединения 5
,
включающий объединение соединения 4
с пантотенаткиназой в буферном растворе в присутствии соли двухвалетного металла с АТФ в качестве источника фосфата, где АТФ восстанавливают in situ, и
где 2X+ представляет собой (a) два протона, (b) один протон и один одновалентный катион, (c) два одновалентных катиона, где каждый катион является одинаковым или они отличны друг от друга, или (d) один двухвалентный катион.
22. Способ по п. 21, где АТФ восстанавливают in situ с использованием (a) ацетилфосфата и ацетаткиназы, или (b) пируватоксидазы, каталазы и ацетаткиназы в присутствии пирувата, фосфата и кислорода, или (c) комбинации вышеуказанных.
23. Способ по п. 22, где (a) пантотенаткиназа является иммобилизованной или (b) пантотенаткиназа и ацетаткиназа являются иммобилизованными.
24. Способ синтеза соединения 4
,
включающий объединение соединения 3
с (а) галактозооксидазой, медью, каталазой и (b) пероксидазой или окислителем;
в присутствии кислорода, в буферном растворе с получением соединения 4.
25. Способ по п. 24, где галактозооксидаза является иммобилизованной.
26. Способ выделения соединения 4
,
включающий
(1) взаимодействие соединения 4 с амином, диамином или аминоспиртом, который образует стабильный N, N-ацеталь или N, O-ацеталь, в органическом растворителе, который не смешивается с водой,
в отсутствие кислорода с образованием аминаля; и
(2) взаимодействие аминаля с органической или неорганической кислотой в присутствии не смешиваемого с водой органического растворителя для восстановления соединения 4.
27. Способ синтеза соединения 5
,
включающий объединение соединения 9
с галактозооксидазой в буферном растворе в присутствии кислорода, каталазы и либо пероксидазы, либо химического окислителя,
с получением соединения 5,
где 2X+ представляет собой (a) два протона, (b) один протон и один одновалентный катион, (c) два одновалентных катиона, где каждый указанный катион является одинаковым или они отличны друг от друга, или (d) один двухвалентный катион.
28. Способ синтеза соединения 9
,
включающий объединение соединения 3
с пантотенаткиназой в буферном растворе в присутствии соли двухвалетного металла с АТФ в качестве источника фосфата, где АТФ восстанавливают in situ,
с получением соединения (9),
где 2X+ представляет собой (a) два протона, (b) один протон и один одновалентный катион, (c) два одновалентных катиона, где каждый указанный катион является одинаковым или они отличны друг от друга, или (d) один двухвалентный катион.
29. Соединение
.
30. Соединение
,
где 2X+ представляет собой (a) два протона, (b) один протон и один одновалентный катион, (c) два одновалентных катиона, где каждый указанный катион является одинаковым или они отличны друг от друга, или (d) один двухвалентный катион.
31. Соединение
,
где 2X+ представляет собой (a) два протона, (b) один протон и один одновалентный катион, (c) два одновалентных катиона, где каждый указанный катион является одинаковым или они отличны друг от друга, или (d) один двухвалентный катион.
32. Соединение
,
где 2X+ представляет собой (a) два протона, (b) один протон и один одновалентный катион, (c) два одновалентных катиона, где каждый указанный катион является одинаковым или они отличны друг от друга, или (d) один двухвалентный катион.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/695,508 | 2018-07-09 | ||
US62/822,320 | 2019-03-22 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2021102725A RU2021102725A (ru) | 2022-08-09 |
RU2816846C2 true RU2816846C2 (ru) | 2024-04-05 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020022722A1 (en) * | 1999-05-12 | 2002-02-21 | Hiroshi Ohrui | 4'-C-ethynyl pyrimidine nucleoside compounds |
RU2628298C2 (ru) * | 2013-03-27 | 2017-08-15 | Пфайзер Айрлэнд Фармасьютикалс | Способ и промежуточные соединения для получения прегабалина |
US20180002366A1 (en) * | 2014-03-28 | 2018-01-04 | Merck Sharp & Dohme Corp. | 4'-substituted nucleoside reverse transcriptase inhibitors |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020022722A1 (en) * | 1999-05-12 | 2002-02-21 | Hiroshi Ohrui | 4'-C-ethynyl pyrimidine nucleoside compounds |
RU2628298C2 (ru) * | 2013-03-27 | 2017-08-15 | Пфайзер Айрлэнд Фармасьютикалс | Способ и промежуточные соединения для получения прегабалина |
US20180002366A1 (en) * | 2014-03-28 | 2018-01-04 | Merck Sharp & Dohme Corp. | 4'-substituted nucleoside reverse transcriptase inhibitors |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
KAGEYAMA. et al. Concise Synthesis of the Anti-HIV Nucleoside EFdA. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2012, vol.76, pp. 1219 - 1225. McLaughlin M. et al. Enantioselective Synthesis of 4'-Ethynyl-2-fluoro-2'-deoxyadenosine (EFdA) via Enzymatic Desymmetrization. Organic Letters, 2017, vol.19(4), pp. 926-929. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA3105823C (en) | Enzymatic synthesis of 4'-ethynyl nucleoside analogs | |
US11485960B2 (en) | RNA polymerase variants for co-transcriptional capping | |
US9193958B2 (en) | Method of enzymatically synthesizing 3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate | |
KR20160030876A (ko) | 약제학적 활성 성분들로써 뉴클레오시드 유사체들의 생물촉매적 생산 | |
JP2016501879A (ja) | Rnaの5’キャップを修飾するための作用物質および方法 | |
RU2816846C2 (ru) | Ферментативный синтез 4’-этинилнуклеозидных аналогов | |
AU2018344883B2 (en) | Cellular transport system for transferring a sulfonic acid construct carrying a cargo into the cytoplasm of a cell | |
WO2022133205A1 (en) | Synthesis of antiviral nucleosides | |
WO2022173507A1 (en) | Synthesis of uridine | |
KR20220119128A (ko) | D-자일룰로오스 4-에피머라아제, 그 변이체 및 용도 | |
JP7510573B2 (ja) | 抗ウイルス性ヌクレオシドの合成 | |
CN116744938A (zh) | 抗病毒核苷的合成 | |
WO2021236859A1 (en) | Synthesis of fluorinated nucleotides | |
US20230174992A1 (en) | Reductase enzymes and processes for making and using reductase enzymes | |
CN116897210A (zh) | S-甲基硫核糖激酶多肽以及s-甲基硫核糖激酶多肽的制备和使用方法 | |
JP4469954B2 (ja) | 糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する耐熱性酵素 | |
JP2008148584A (ja) | アセチル化アミノ糖及びアセチル化アミノ糖ヌクレオチド合成活性を有する耐熱性酵素 |