JP2016501879A - Rnaの5’キャップを修飾するための作用物質および方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、例えば、分離および分析目的で、RNAの5’キャップを修飾する作用物質および方法を提供する。一実施態様において、本発明は修飾酵素、すなわち、ランブル鞭毛虫の修飾トリメチルグアノシンシンターゼ2(GlaTgs2)を提供する。GlaTgs2の酵素活性は、野生型酵素と比較して、AdoMet類似体を補因子としてうまく利用できるよう変化されている。【選択図】なし
Description
本発明は、RNAの5’キャップを修飾するための作用物質および方法に関する。
細胞の遺伝型を研究することにより、その状態に関する情報、例えば、細胞の調節過程が正確に進行しているか、または、正常状態と比べてここに変化が存在するかなどに関する重要な情報を得ることができる。こうした情報は、例えば、細胞が変性しているか、ウイルスに感染したか、または、不規則な状態、すなわち病的状態であるかの確認に利用できる。このように、例えば、場合によって疾患があるかどうかの帰納的推理が可能である。
このために、例えば、遺伝子の発現を、細胞内に存在するmRNA分子の分離および分析によって調べることが知られている。このとき、信頼できる情報を得るには、mRNA調製の質がとりわけ重要である。しかしながら、細胞にはmRNAの他に数多くのその他の分子やその他のRNA種、特に非コードRNA(例えば、sRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、miRNAなど)が存在するため、固有の特徴に基づいて選択的な濃縮を行う必要がある。真核生物からmRNAを特異的に分離するには、その特徴、すなわち、いわゆる3’末端のポリA尾部と、5’末端のキャップ構造を利用する(非特許文献1〜8)。これらの特徴を介して、mRNAを、例えば、対応するカラム材料に固定化されている他の分子に通常は非共有的に結合させる(例えば、ポリA尾部を介してオリゴdTカラムに、または5’キャップを介してタンパク質eIF4Eに結合)。mRNAを分離するには、現在、含まれるポリA尾部を主に用いる。これは、キャップ同様、成熟mRNA分子およびmiRNA前駆体(pri−miRNA)の特徴的な構造である。この領域を介して、分子を、固定化された相補的デオキシヌクレオチド(オリゴdT)プローブにハイブリダイズさせ、それにより複合プローブから分離することができる。これに必要なカラム材料(「ビーズ」)は、先行技術で公知であり、一般的に用いられている。
BajakおよびHagedorn(非特許文献7)は、翻訳開始因子eIF4Eの変異体を、キャップ構造を介したRNAの分離に利用する方法を確立した(特許文献1、非特許文献9も参照)。この方法の利点は、RNA分子が、ポリA尾部の長さに関係なく、含まれるキャップ構造のみに基づいて特定および濃縮され、それにより、ポリA尾部が短いRNAも(mRNAもmiRNAの前駆体も)その後の分析に使用できることである。アッセイの実施には、標的分子に対し野生型タンパク質より最大10倍も高い親和性を有するeIF4E変異体を、タンパク質親和性タグ(特にグルタチオン−S−トランスフェラーゼ[GST])を介してグルタチオンビーズに固定化し、プローブを用いて培養する。キャップ構造を有するRNAは、固定化タンパク質に非共有的に結合するため、ビーズを用いて複合プローブから分離できる。このようにして、ポリA尾部の多様な輸送性とは無関係に、C型肝炎ウイルス感染細胞のRNA分子を分離できた。「次世代塩基配列」実験の実施により、ウイルス感染後の宿主細胞内での遺伝子調節の変化に関して、新たな証言が可能となった(非特許文献10)。
この方法の欠点は、RNA分子を直接、共有的にキャリアーに結合させられないことであり、そのため、不純物を分離する際に、洗浄条件の選択が制限されることである。さらに、結合分子とRNA分子との間に1:1の関係があることが多いのも、この方法の使用を制限している。Dalhoff et al.(非特許文献11)は、3つのS−アデノシル−L−メチオニン(AdoMet)依存性DNAメチルトランスフェラーゼによる、この補因子の対応する類似体を用いた、エチル基、プロピル基、プロペニル基、および2−ブチニル基の、2'−デオキシシチジンおよび2'−デオキシアデノシンへの直接転移について記載している。この場合、AdoMet類似体は、硫黄原子のメチル基の代わりに対応する基を運ぶ。Lukinavicius et al.(非特許文献12)は、適切なDNAメチルトランスフェラーゼを用いて、この基をDNAヌクレオシドに転移するために、さらに別のNH2基含有AdoMet類似体を用いている。Motorin et al.も類似のアプローチをとっており、生物物理学的研究用にtRNA分子の部位特異的マーキングを行うために、酵素転移とクリックケミストリーを組み合わせて使用することを記述している(非特許文献13)。ここでは、同様に補助基質S−アデノシル−L−メチオニンの類似体であるAdoEnYnを使用し、tRNA:メチルトランスフェラーゼ(Trm1)を用いて、ペンテニル残基CH≡C−CH=CH−CH2−を、tRNAPheの26位にあるグアノシンの環外N2原子に酵素的に転移させている。次いで、Cu(I)触媒によるアジド−アルキン−1,3−双極性環状付加(CuAAC)を用いて、蛍光体を修飾tRNAPheに結合させる。同様に、Box C/D RNPメチルトランスフェラーゼを用いることによって、RNAの配列特異的なクリック標識を実現している(非特許文献14)。
J.Pease,R.Sooknanan,Nat Meth 2012,9
J.S.Marcus,W.F.Anderson,S.R.Quake,Analytical Chemistry 2006,78,3084−3089
Z.Y.Yang,H.J.Edenberg,R.L.Davis,Nucleic Acids Res 2005,33
M.E.Folkers,D.A.Delker,C.I.Maxwell,C.A.Nelson,J.J.Schwartz,D.A.Nix,C.H.Hagedorn,Plos One 2011,6
Z.Gao,Q.Zhang,Y.Cao,P.Pan,F.Bai,G.Bai,Journal of Chromatography A 2009,1216,7670−7676
U.Schibler,D.Rifat,D.J.Lavery,Methods 2001,24,3−14
E.Z.Bajak,C.H.Hagedorn,Methods in molecular biology(Clifton,N.J.)2008,419,147−160
A.K.Shukla,A.K.Shasany,S.P.S.Khanuja,Indian journal of experimental biology 2005,43,197−201
Gowda,Nucleic Acids Research,2010,38,21,7558−7569
M.Folkers,PLOS one,2011,6,2,el4697,Papic,2012,Viruses,2012,4,581.612
Dalhoff C,Lukinavicius G,Klimasauskas S,Weinhold E.,2006,Nat Chem Biol.2(1):31−32
G.Lukinavicius,V.Lapiene,Z.Stasevskij,C.Dalhoff,E.Weinhold,S.Klimasauskas,J.Am.Chem.Soc.2007,129,2758−2759
Y.Motorin,J.Burhenne,R.Teimer,K.Koynov,S.Willnow,E.Weinhold,M.Helm,Nucleic Acids Research,2010,1−10,doi:10.1093/nar/gkq825
M.Tomkuviene,B.Clouet−d'Orval,I.Cerniauskas,E.Weinhold,S.Klimasauskas,Nucleic Acids Res 2012
S.Hausmann et al,J.Biol.Chem.2008,283,31706−31718
S.F.Altschul et al.(1990),Basic Local Alignment search tool,J.Mol.Biol.215:403−410
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
Henikoff,S.およびHenikoff,J.,Amino acid Substitution matrices from protein blocks.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:10915−10919,1992
http://www.ebi.ac.uk/Tools/similarity.html
H.C.Kolb,M.G.Finn,K.B.Sharpless,2001,Angew.Chem.113,11,2056−2075
H.C.Kolb,M.G.Finn,K.B.Sharpless,2001,Angew.Chem.Int.Ed.40、11,2004−2021
C.N.BowmanおよびC.E.Hoyle,Angew.Chem.Int.Ed.2010、49、1540−1573
S.S.van Berkel,et al.,Angew.Chem.2011,123,8968−8989
E.Lallana et al.,Angew.Chem.2011、123、8956−8966
A.H.El−Sagheerab,T.Brown,Chem.Soc.Rev.2010,39,1388−1405
C.S.McKay,et al.,Chem.Commun.2010,46,931−933
W.Song,et al.,J.Am.Chem.Soc.2008,130,9654−9655
P.M.E.Gramlich,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,8350−8358
C.R.Becer,et al,Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,4900−4908
T.R.Chan,et al.,Org.Lett.2004,6,2853−2855
C.Uttamapinant,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,5852−5856
Y.Wang,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,5330−5333
Y.Wang,W.Song,W.J.Hu,Q.Lin,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2009,48,5330−3
KS−DFT−Kalkulationen,W.Kohn,L.J.Sham,Phys.Rev.1965、140、A1133−1138
C.Dalhoff,et al.,Nat.Chem.Biol.2006,2,31−32
W.Peters,S.Willnow,M.Duisken,H.Kleine,T.Macherey,K.E.Duncan,D.W.Litchfield,B.Luscher,E.Weinhold,Angew Chem Int Ed Engl 2010,49,5170
S.Hausmann,S.Shuman,J Biol Chem 2005,280,32101−32106
M.Tomkuviene,B.Clouet−d'Orval,I.Cerniauskas,E.Weinhold,S.Klimasauskas,Programmable sequence−specific click−labeling of RNA using archaeal box C/D RNP methyltransferases,Nucleic Acids Research,2012,40,14,6765
しかしながら、依然として、特定のRNA分子、とりわけmRNA分子を細胞から分離し、分析に供するさらなる方法が必要とされている。
したがって、本発明の課題は、そうしたさらなる方法を提供することである。
この課題は独立請求項の主題によって解決される。本発明の目的にかなった実施態様は従属請求項に記載する。驚くことに、特定の位置で変化した酵素、すなわち、野生型塩基配列がSEQ ID NO:1で示されるランブル鞭毛虫(Giardia lamblia)由来のトリメチルグアノシンシンターゼ2(以下、略して「GlaTgs2」という)が、5'm7GpppNキャップを持つRNA種のマーキングおよび/または分離の新たな可能性を開くことが明らかとなった。このm7GpppNキャップ(英語「m7GpppN cap」)は、N7の位置でメチル化されたグアノシン残基であり、この残基が、以下の式(II)から明らかなように、三リン酸エステル架橋を介してRNA分子の5'末端に結合している(5'−5'結合)。
上式で、R1はOHまたはOCH3である。上式のBは任意の核酸塩基である。用語m7GpppNにおけるNは、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオシド類似体、またはヌクレオチド類似体であり、pppは三リン酸塩架橋、Gはグアノシン、m7はN7のメチル基である。
そのようなキャップを有するのは、例えば真核生物のmRNA分子であるが、特定の非コードRNA種、例えばsnRNA、snoRNA、およびテロメラーゼRNAも同様である。
野生型GlaTgs2(SEQ ID NO:1を参照)は258種のアミノ酸を含有し、補因子であるS−アデノシル−L−メチオニン(AdoMet)を用いて、N2の位置のキャップ−グアノシンのさらなるメチル化(過剰メチル化)を触媒する(非特許文献15)。2つのメチル残基のN2への転移を触媒できるヒトのトリメチルグアノシンシンターゼhTgsとは異なり、ランブル鞭毛虫の酵素は、基質であるジメチル化ヌクレオチドを受容しないようであり、酵素によって、1つのメチル残基のみがN2に転移される。そのため、本明細書では、実際はジメチルグアノシンシンターゼが関係し、トリメチルグアノシンシンターゼは関係ないと思われる。しかしながら、誤解を避けるために、本明細書では、この酵素について、それでもトリメチルグアノシンシンターゼ、または略してTgsという用語を用いる。
AdoMetは「SAM」とも略され、硫黄原子が存在するメチル基を転移する補因子として多様な酵素に寄与する。CH3基が脱離すると、「AdoHcy」または「SAH」とも略されるS−アデノシル−L−ホモシステインが残る。
驚くことに現在になってわかったのが、SEQ ID NO:1で示される野生型GlaTgs2の34位におけるアミノ酸交換により、この位置にあるアミノ酸、バリンが、別のアミノ酸と、好ましくは無極性/疎水性、または極性/中性アミノ酸と、特に好ましくはアラニン、グリシン、またはメチオニンと交換されるに至り、このアミノ酸交換が、結果として生じる酵素の酵素活性を変化させ、AdoMet類似体を補因子として利用できる、すなわち、野生型酵素より有効に利用できるようにするということである。好ましくは、バリンの代わりに導入されるアミノ酸は、トリプトファンまたはロイシンではない。それにより、m7GpppNキャップを持つRNA種の5’末端の標的修飾の可能性が開け、場合によっては、その後のステップでそこにレポーター基を付加、および/または、このRNA種を特異的に固定化することができる。
無極性/疎水性アミノ酸の例には、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、およびフェニルアラニンがある。極性/中性アミノ酸の例には、チロシン、トレオニン、グルタミン、グリシン、セリン、システイン、およびアスパラギンがある。
用語「AdoMet類似体」は、本明細書では、以下の式(I)の化合物と理解される。
上式は、メチル基ではない残基Rを硫黄原子に持つ。したがって、AdoMet(S−アデノシル−L−メチオニン)と同じ基本構造を持つ化合物であり、硫黄原子にはメチル基の代わりに別の残基が結合している。AdoMet類似体は、例えば特許文献2に記載されている。
そのような残基の一例に、プロペニルCH2=CH−CH2−がある。メチルの代わりにこの残基を持つ対応するAdoMet類似体(5’−[(S)−[(3S)−3−アミノ−3−カルボキシプロピル]プロプ−2−エニルスルフォニオ]−5'−デオキシアデノシン)は「AdoPropen」と表され、以下の式(Ia)で示される。
残基Rのこの他の例として、プロピニルCH≡C−CH2−、ブチニルCH≡C−CH2−CH2−、ペント−2−エン−4−イニルCH≡C−CH=CH−CH2−、ベンジルPh−CH2−(Ph=C6H5)、およびアジドブテニルN3−CH2−CH=CH−CH2−がある。本明細書では、プロピニル残基CH≡C−CH2−の場合、AdoMet類似体を「AdoPropin」と呼び、ブチニル残基CH≡C−CH2−CH2−の場合、「AdoButin」、ペント−2−エン−4−イニル-残基CH≡C−CH=CH−CH2−の場合、「AdoEnYn」、ベンジル残基の場合、「AdoBenzyl」、アジドブテニル残基N3−CH2−CH=CH−CH2−の場合、「AdoAzid」と呼ぶ。ペント−2−エン−4−イニル残基については、本明細書では、用語「ペンテニル残基」を用いる。
したがって、第1の実施態様において、本発明は、以下のような分離タンパク質または合成タンパク質を提供する。
a.SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列を示す、もしくは含む、または
b.SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、その相同なアミノ酸配列において、SEQ ID NO:2で示される34位に相当する位置にバリンが存在しない、または
c.SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を示し、もしくは含み、そのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列と85%超、好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも95%同一であり、このとき条件として、その相同なアミノ酸配列において、SEQ ID NO:2で示される34位に相当する位置にバリンが存在しない、または
d.a、b、またはcに示されるアミノ酸配列の少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、80、90、もしくは少なくとも100種のアミノ酸、好ましくは少なくとも110、120、130、140、150、160、170、180、190、もしくは少なくとも200種のアミノ酸、特に好ましくは少なくとも210、220、230、240、もしくは少なくとも250種のアミノ酸の連続部分配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、その部分配列が、SEQ ID NO:2で示される34位にアミノ酸もしくは対応する相同なアミノ酸を含む、および
e.SEQ ID NO:11(ランブル鞭毛虫ATCC50581のGL50581_2635、GenBank No.EET00120.1)で示されるアミノ酸配列を示さない。
a.SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列を示す、もしくは含む、または
b.SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、その相同なアミノ酸配列において、SEQ ID NO:2で示される34位に相当する位置にバリンが存在しない、または
c.SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を示し、もしくは含み、そのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列と85%超、好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも95%同一であり、このとき条件として、その相同なアミノ酸配列において、SEQ ID NO:2で示される34位に相当する位置にバリンが存在しない、または
d.a、b、またはcに示されるアミノ酸配列の少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、80、90、もしくは少なくとも100種のアミノ酸、好ましくは少なくとも110、120、130、140、150、160、170、180、190、もしくは少なくとも200種のアミノ酸、特に好ましくは少なくとも210、220、230、240、もしくは少なくとも250種のアミノ酸の連続部分配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、その部分配列が、SEQ ID NO:2で示される34位にアミノ酸もしくは対応する相同なアミノ酸を含む、および
e.SEQ ID NO:11(ランブル鞭毛虫ATCC50581のGL50581_2635、GenBank No.EET00120.1)で示されるアミノ酸配列を示さない。
タンパク質が「あるアミノ酸配列を示す」という表現は、タンパク質がその配列から成る、すなわち、C末端および/またはN末端にそれ以上のアミノ酸がないことを意味している。タンパク質が「あるアミノ酸配列を含む」という表現は、C末端および/またはN末端にそれ以上のアミノ酸を持たないタンパク質に限定することなく、タンパク質がその配列を含有することを意味しているが、この用語は、タンパク質があるアミノ酸配列を「示す」、すなわち、配列に並ぶアミノ酸のみから成り、かつ、配列に現れる順序で存在するという表現も包括している。
本明細書で使用する用語「タンパク質」は、ペプチド結合により互いに結び付いている任意の数のアミノ酸から成るポリマーを指し、用語「ペプチド」および「ポリペプチド」を含む。タンパク質におけるアミノ酸の直鎖状配列は「アミノ酸配列」と呼ぶ。
用語「合成」は、本明細書では、「人工的に作られた」ことを意味し、そのままでは、すなわち、それが有するアミノ酸配列が、自然に存在しないタンパク質を含む。「分離する」は、本明細書では、タンパク質がその本来の、すなわち自然な環境から、例えば、真核生物細胞または原核生物細胞から取り出されたことを意味する。
タンパク質に関する用語「相同(な)」は、あるタンパク質のアミノ酸配列が、それと比較される別のタンパク質のそれと、大幅に一致するが完全には同一でないということを意味する。本明細書では、例えば、あるタンパク質が、1種のアミノ酸を除いて、ランブル鞭毛虫のトリメチルグアノシンシンターゼと同一のアミノ酸配列を示すことを意味する。本明細書では、同一または類似の残基が存在するかどうかを、ある配列における位置を、別の配列における対応する位置とそのつど比較および確認することによって、2つのタンパク質間に相同性が存在することが確認できる。同一または類似のアミノ酸が特定の最小限部分を占めていれば、互いに比較した2つの配列は相同である。同一性とは、2つの配列を比較したときに、同等部分にそれぞれ同じアミノ酸があることを言う。このとき、場合によっては、配列の隙間の考慮し、参照配列をできるだけうまく整列させる必要があるかもしれない。これに関して、類似のアミノ酸とは、化学物理的性質が同じ、または同等であるアミノ酸である。あるアミノ酸を、化学物理的性質が同じ、または同等の別のアミノ酸と交換することは、「保存的交換」と言う。アミノ酸の物理化学的性質の例には、例えば、疎水性や電荷がある。特に、そのような同一でないアミノ酸、つまりコンピュータープログラム「Basic Local Alignment Search Tool」、略してBLAST(非特許文献16;例えば、非特許文献17参照)に基づいたBLOSUM62置換行列(非特許文献18)で「Positive」とされる、すなわちBLOSUM62置換行列に正のスコアを持つアミノ酸が、類似のアミノ酸と見なされる。本発明の目的のために、アミノ酸の少なくとも45%、好ましくは少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%が同一または類似、好ましくは同一であれば、2つの配列間に相同関係があるものとする。特に、コンピュータープログラムBLAST(非特許文献16;例えば、非特許文献17参照)を使用し、標準初期設定パラメーター(「Expect Threshold」=10、「Word size」=3、「Existence Gap Costs」=11、「Extension Gap Costs」=1)とBLOSUM62置換行列(非特許文献18)とを用いて、同一性または類似性(「Positives」)、好ましくは、少なくとも45%、好ましくは少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性が得られる場合に、2つの配列間に相同関係があるものとする。このとき、好ましくは、最小長が20、好ましくは最小長が25、30、35、40、45、50、60、80、もしくは100、さらに好ましくは最小長が120、140、160、180、もしくは200アミノ酸、または最小長が各アミノ酸配列のアミノ酸の25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、もしくは95%であるものとする。特に好ましくは、各タンパク質の完全な長さであるものとする。当業者には、その専門知識に基づいて、利用可能なBLASTプログラムのどれが、例えばBLASTpが、相同関係の確認のために考慮されるか容易に明らかである。さらに、必要に応じて、比較すべき2つ以上の配列の相同関係の判断に用いることのできる、当業者には既知のこの他のプログラムも存在する。そのようなプログラムは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所(EMBL)のウェブサイトで利用できる(例えば、非特許文献19参照)。特に、本出願における「相同」は、一致、すなわちアミノ酸配列における少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも99%、特に好ましくは少なくとも99.5%の同一性を意味する。「相同」は、特に、トリメチルグアノシンシンターゼを別のタンパク質と比較して、60以下、好ましくは50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、または11以下、特に好ましくは9、8、7、6、5、4、3、2以下、または1つの位置で、何らかのアミノ酸が不足している、または追加されていることも意味し得る。
用語「アルキル」は、直鎖アルキル基(例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、およびオクチル)ならびに分岐鎖アルキル基(例えば、イソプロピル、tert−ブチル、イソブチル)などの飽和脂肪族(非芳香族)基を含む。この用語は、O−、N−、S−、またはP−アルキル基(例えば、−O−メチル)、すなわち、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子を介して化合物に結合しているアルキル基も含む。
表現「Cn−Cm」では、nおよびmがそれぞれ正の整数であり、かつ、mがnより大きいが、この「Cn−Cm」は、ある化合物または残基の炭素(C)原子の数の範囲を意味する。この表現は、本明細書において、範囲限界値nとmとの間の整数の中間値全体を、詳しく言うと互いに独立して、明示的に含むものとする。したがって、表現「C1−C10」(n=1、m=10)は、1〜10、すなわち1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の炭素原子を持つ化合物、基、または残基を意味する。したがって、「C1−C10」は、同時に例えば「C2−C6」、すなわち2、3、4、5、もしくは6個の炭素原子、または「C1−C4」、すなわち1、2、3、もしくは4個の炭素原子、または「C4−C9」、すなわち4、5、6、7、8、または9個の炭素原子を含む。相応に、用語「C2−C10アルキル」は、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の炭素原子を持つアルキル基を意味し、n=2からm=10までの範囲にある、nおよびmの値の組み合わせ全体、例えば、「C5−C7アルキル」、すなわち5、6、または7個の炭素原子を持つアルキルを含む。
用語「アルケニル」は、直鎖および分岐鎖アルケニル基を含む、少なくとも1つのC−C二重結合を持つ不飽和脂肪族(非芳香族)基を意味する。この用語は、O−、N−、S−、またはP−アルケニル基(例えば、−O−プロペニル)、すなわち、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子を介して化合物に結合しているアルケニル基も含む。用語「C2−C10アルケニル」は、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の炭素原子を持つアルケニル基を意味する。
用語「アルキニル」は、直鎖および分岐鎖アルキニル基を含む、少なくとも1つのC−C三重結合を持つ不飽和脂肪族(非芳香族)基を意味する。この用語は、O−、N−、S−、またはP−アルケニル基(例えば、−O−ブチニル)、すなわち、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子を介して化合物に結合しているアルキニル基も含む。用語「C2−C10アルキニル」は、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の炭素原子を持つアルキニル基を意味する。
用語「アルケニニル」は、直鎖および分岐鎖アルケニニル基を含む、少なくとも1つのC−C二重結合および少なくとも1つのC−C三重結合を持つ不飽和脂肪族(非芳香族)基を意味する。この用語は、O−、N−、S−、またはP−アルケニニル基、すなわち、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子を介して化合物に結合しているアルケニニル基も含む。用語「C4−C10アルケニニル」は、4、5、6、7、8、9、または10個の炭素原子を持つアルケニニル基を意味する。
用語「シクロアルキル」は、脂環式基、すなわち環状飽和脂肪族(非芳香族)基、例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルを意味する。この用語は、O−、N−、S−、またはP−シクロアルキル基、すなわち、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子を介して化合物に結合しているシクロアルキル基も含む。用語「シクロアルケニル」、「シクロアルキニル」、および「シクロアルケニニル」は、相応に、上述の定義に従って、環状脂肪族(非芳香族)アルケニル、アルキニル、またはアルケニニルを意味し、二重結合および/または三重結合が、環、すなわち環系の内部または外部に存在し得る。
用語「ヘテロアルキル」は、炭化水素構造の1つまたは複数の炭素原子が、別の原子(ヘテロ原子)、例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子と置換されているアルキル基を意味する。この用語は、O−、N−、S−、またはP−ヘテロアルキル基、すなわち、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子を介して化合物に結合しているヘテロアルキル基も含む。用語「ヘテロアルキル」は、炭化水素構造の1つまたは複数の炭素原子が、別の原子、例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子と置換されているシクロアルキルも含む。用語「ヘテロアルケニル」、「ヘテロアルキニル」、「ヘテロアルケニニル」は、相応に、炭化水素構造の1つまたは複数の炭素原子が、別の原子(ヘテロ原子)、例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子と置換されているアルケニル、アルキニル、およびアルケニニル、ならびにシクロアルケニル、シクロアルキニル、およびシクロアルケニニルと理解される。用語「C1−C10ヘテロアルキル」は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の炭素原子および少なくとも1つのヘテロ原子を持つアルキル基を意味する。相応のことが、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、およびヘテロアルケニニルについても該当する。
「アジドアルキル」は、本明細書では、アジド基−N3を持つアルキルと理解される。この用語は、アジド基を持つ環状アルキルおよびヘテロアルキルも含む。「アジドアルケニル」、「アジドアルキニル」、および「アジドアルケニニル」は、相応に、アルケニル、アルキニル、およびアルケニニル、環状アルケニル、環状アルキニル、および環状アルケニニル、ならびにヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、およびヘテロアルケニニルと理解される。
用語「置換(された)」は、炭化水素構造の1つまたは複数の炭素原子において水素原子と置き換えられた1つまたは複数の置換基が存在することを意味する。そうした置換基の例には、オキソ基、ヒドロキシル基、リン酸基、シアン基、およびアミノ基のほか、例えば、ハロゲン(例えば、F、Cl、Br、I)、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールがある。
「核酸」は、そのモノマーがヌクレオチドであるポリマーと理解される。ヌクレオチドは、糖残基と、窒素含有複素環式有機塩基(ヌクレオチド塩基または核酸塩基)と、リン酸基とから成る化合物である。糖残基は、通常、5炭糖、つまりDNAではデオキシリボース、RNAではリボースである。ヌクレオチドの結合は、リン酸基を介して、通常、ヌクレオシド(核酸塩基および糖から成る化合物)の糖成分の3'炭素原子と、隣のヌクレオシドの糖成分の5'炭素原子との間のホスホジエステル架橋によって行われる。本明細書で使用する用語「核酸」は、例えばDNA、RNA、およびDNA/RNA混合配列を含む。
「核酸塩基」は、RNAまたはDNA中に存在する有機塩基と理解される。核酸塩基は、プリン(R)とピリミジン(Y)に大別される。プリンは、グアニン(G)およびアデニン(A)であり、ピリミジンは、シトシン(C)、チミン(T)、およびウラシル(U)である。リン酸化ヌクレオシド、例えばヌクレオシド一リン酸(NMP)、ヌクレオシド二リン酸(NDP)、およびヌクレオシド三リン酸(NTP)も、ヌクレオチドと言う。一リン酸基、二リン酸基(ピロリン酸基)、または三リン酸基は、通常、ヌクレオシドの糖成分5'炭素原子に結合しているが、例えば3'炭素原子と結合していてもよい。
「ヌクレオシド」は、本明細書では、グリコシド結合を介して結合している、糖残基(糖成分)と有機塩基(塩基成分)、例えば複素環式有機塩基、特に窒素含有複素環式有機塩基とから成る有機分子と理解される。糖残基はたいていの場合5炭糖、例えばデオキシリボースまたはリボースであるが、別の糖、例えば3炭糖、4炭糖、または6炭糖であってもよい。したがって、特に、ヌクレオシドは以下の一般式(III)の化合物と理解される。
上式で、Bは窒素含有複素環式有機塩基、例えば核酸塩基であり、R3およびR4は、互いに独立したHまたはOHである。
「ヌクレオシド類似体」は、本明細書では、ヒトの体内に自然には存在しないが、ヒトの体内に自然に存在するヌクレオシドに構造的に類似するため、例えば細胞および/またはウイルスの酵素から、基本的に天然のヌクレオシドに応じて加工、例えばリン酸化し、RNA鎖またはDNA鎖に挿入できる化合物と理解される。ヌクレオシド類似体はそれ自体がヌクレオシドであってよい。しかしながら、例えば、上述の性質を有する別の化合物、例えば、複素環式塩基、ならびに糖でない非環式残基および/もしくは残基から成る化合物、または炭素環式化合物と糖残基とから成る化合物であってもよい。ヌクレオシド類似体は、上述の意味においてそれ自体がヌクレオシドであるか、またはヌクレオシドに構造的および/または機能的に類似している。ヌクレオシド類似体は、狭義の意味では、糖成分または塩基成分を必ずしも含有する必要はないため、本明細書では、塩基成分に類似する成分(塩基類似体)または糖成分に類似する成分(糖類似体)についても述べる。本明細書で糖成分または塩基成分について述べる場合、文脈から明確に他のものが示されない限り、ヌクレオシド類似体の対応する類似成分を含むものとする。ヌクレオシド類似体の例には、例えば、AZT(3'−アジド−2',3'−ジデオキシチミジン、アジドチミジン)、2',3'−ジデオキシイノシン(ジダノシン)、2',3'−ジデオキシシチジン(ザルシタビン)、および2−アミノ−9−((2−ヒドロキシエトキシ)メチル)−1H−プリン−6(9H)−オン(アシクロビル)がある。ヌクレオシドホスホネートもヌクレオシド類似体であってよい。
「ヌクレオチド」は、本明細書では、リン酸化ヌクレオシド、例えばヌクレオシド一リン酸(NMP)、ヌクレオシド二リン酸(NDP)、およびヌクレオシド三リン酸(NTP)と理解される。一リン酸基、二リン酸基(ピロリン酸基)、または三リン酸基は、通常、ヌクレオシドの糖成分5'炭素原子に結合しているが、例えば3'炭素原子と結合していてもよい。「ヌクレオチド類似体」は、相応に、リン酸化ヌクレオシド類似体と理解される。
「総代謝回転数」(英語:Total Turnover Number[TTN])は、1モルの補因子または酵素から総反応時間の間に作られる生成物のmol数と理解される。
本発明によるタンパク質は、好ましくは、以下の式(I)に示す化合物の残基Rの、m7GTP、つまりm7GpppNのグアノシン、または以下の式(II)の化合物のN2への転移を酵素的に触媒する。
上式で、RNAはリボ核酸を意味し、R1はOHまたはOCH3を意味し、Nはヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオシド類似体、またはヌクレオチド類似体を意味し、Bは核酸塩基を表し、そしてRは、置換または非置換C2-10アルキル、置換または非置換C2-10アルケニル、置換または非置換C2-10アルキニル、置換または非置換C4-10アルケニニル、置換または非置換C3-12シクロアルキル、置換または非置換C3-12シクロアルケニル、置換または非置換C5-12シクロアルキニル、置換または非置換C5-12シクロアルケニニル、置換または非置換C1-10ヘテロアルキル、置換または非置換C2-10ヘテロアルケニル、置換または非置換C2-10ヘテロアルキニル、置換または非置換C4-10ヘテロアルケニニル、置換または非置換C1-10アジドアルキル、置換または非置換C2-10アジドアルケニル、置換または非置換C2-10アジドアルキニル、置換または非置換C4-10アジドアルケニニル、置換または非置換ベンジル、プロペニルCH2=CH−CH2−、プロピニルCH≡C−CH2−、ブチニルCH≡C−CH2−CH2−、ペンテニルCH≡C−CH=CH−CH2−、およびアジドブテニルN3−CH2−CH=CH−CH2−から成る基から選択される。ベンジルの場合、パラ配位での置換が好ましく、アルケン、アルキン、またはアジドによる置換が特に好ましい。
本発明によるタンパク質が、式(I)に示すAdoMet類似体の残基Rの転移を触媒するということは、AdoMetを補因子としても利用できず、メチル基をm7GpppNキャップのN2に転移することを意味するわけではない。むしろ、生理学的条件下でのAdoMet類似体との反応が、本発明によるタンパク質によって、少なくとも同様に、好ましくは、野生型酵素と比べて、より高い割合で、補因子に対してより高い親和性で、より大きい収量で、および/またはより高い総代謝回転数(Total Turnover Number[TTN])で触媒されることを意味する。
好ましくは、本発明によるタンパク質の総代謝回転数TTNが、5より大きく、好ましくは、≧6、≧7、≧8、≧9、または≧10、および/または、本発明によるタンパク質の総代謝回転数TTNが、それぞれ平均値および同一のAdoMet類似体、好ましくはAdoPropenに関して、野生型酵素の総代謝回転数の少なくとも2倍である。さらに好ましくは、本発明によるタンパク質では、AdoPropenに対するAdoMetの総代謝回転数、すなわちTTNAdoMet:TTNAdoPropenが、≦20、特に好ましくは、≦15、さらに好ましくは、≦14、≦13、≦12、≦11、または≦10である。
本発明によるタンパク質によって触媒される、S−アデノシル−L−メチオニン類似体の残基Rの、mRNAへの転移は、以下の再現図で示される。
本発明によるタンパク質が、SEQ ID NO:2の部分配列のみを示す、または含む場合、特に好ましくは、そのタンパク質が、上述の転移反応の少なくとも1つを触媒する。
好ましくは、本発明によるタンパク質が以下である。
a.SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示されるアミノ酸配列を示す、もしくは含む、または
b.SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、その相同なアミノ酸配列において、SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示される34位に相当する位置にバリンが存在しない、または
c.SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示されるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を示し、もしくは含み、その相同なアミノ酸配列が、SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示されるアミノ酸配列と85%超、好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも95%同一であり、このとき条件として、そのアミノ酸配列において、SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示される34位に相当する位置にバリンが存在しない、または
d.a、b、またはcに示されるアミノ酸配列の少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、80、90、もしくは少なくとも100種のアミノ酸、好ましくは少なくとも110、120、130、140、150、160、170、180、190、もしくは少なくとも200種のアミノ酸、特に好ましくは少なくとも210、220、230、240、もしくは少なくとも250種のアミノ酸の連続部分配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、その部分配列が、SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示される34位にアミノ酸もしくは対応する相同なアミノ酸、を含む、および
e.SEQ ID NO:11で示されるアミノ酸配列を示さない。
a.SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示されるアミノ酸配列を示す、もしくは含む、または
b.SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、その相同なアミノ酸配列において、SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示される34位に相当する位置にバリンが存在しない、または
c.SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示されるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を示し、もしくは含み、その相同なアミノ酸配列が、SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示されるアミノ酸配列と85%超、好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも95%同一であり、このとき条件として、そのアミノ酸配列において、SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示される34位に相当する位置にバリンが存在しない、または
d.a、b、またはcに示されるアミノ酸配列の少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、80、90、もしくは少なくとも100種のアミノ酸、好ましくは少なくとも110、120、130、140、150、160、170、180、190、もしくは少なくとも200種のアミノ酸、特に好ましくは少なくとも210、220、230、240、もしくは少なくとも250種のアミノ酸の連続部分配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、その部分配列が、SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示される34位にアミノ酸もしくは対応する相同なアミノ酸、を含む、および
e.SEQ ID NO:11で示されるアミノ酸配列を示さない。
好ましくは、SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列の34位に、イソロイシンまたはトレオニンが存在しない。特に好ましくは、SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列の34位に、アラニン、グリシン、またはメチオニン、好ましくはアラニンが存在する。SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列の76位に、好ましくはアスパラギン酸、トレオニン、ロイシン、もしくはバリン、特に好ましくはアスパラギン酸が存在し、および/またはSEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列の92位に好ましくはアルギニンもしくはアラニンが存在する。特に好ましくは、SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列の34位にアラニン、SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列の76位にアスパラギン酸、SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列の92位にアルギニンまたはアラニンが存在する。
残基Rは、好ましくはプロペニルCH2=CH−CH2−、プロピニルCH≡C−CH2−、ブチニルCH≡C−CH2−CH2−、ペンテニルCH≡C−CH=CH−CH2−、ベンジルPh−CH2−、またはアジドブテニルN3−CH2−CH=CH−CH2−、特に好ましくはプロペニルCH2=CH−CH2−、ベンジルPh−CH2−、またはペンテニルCH≡C−CH=CH−CH2−である。
別の実施態様では、本発明は、本発明によるタンパク質をコードする核酸にも関係する。
さらに別の実施態様では、本発明は、RNA分子、特にmRNA分子のm7GpppNキャップを修飾する方法に関係し、m7GpppNキャップを持つRNA分子を、以下の式(I)で示されるAdoMet類似体の存在下で、本発明の第1の実施態様によるタンパク質に接触させるステップを含む。
上式で、Rは、置換または非置換C2-10アルキル、置換または非置換C2-10アルケニル、置換または非置換C2-10アルキニル、置換または非置換C4-10アルケニニル、置換または非置換C3-12シクロアルキル、置換または非置換C3-12シクロアルケニル、置換または非置換C5-12シクロアルキニル、置換または非置換C5-12シクロアルケニニル、置換または非置換C1-10ヘテロアルキル、置換または非置換C2-10ヘテロアルケニル、置換または非置換C2-10ヘテロアルキニル、置換または非置換C4-10ヘテロアルケニニル、置換または非置換C1-10アジドアルキル、置換または非置換C2-10アジドアルケニル、置換または非置換C2-10アジドアルキニル、置換または非置換C4-10アジドアルケニニル、置換または非置換ベンジルPh−CH2−、プロペニルCH2=CH−CH2−、プロピニルCH≡C−CH2−、ブチニルCH≡C−CH2−CH2−、ペンテニルCH≡C−CH=CH−CH2−、およびアジドブテニルN3−CH2−CH=CH−CH2−から成る基から選択され、このとき、m7GpppNキャップのグアノシンのN2への残基Rの転移が行われることを条件とする。
残基Rは、好ましくはプロペニルCH2=CH−CH2−、プロピニルCH≡C−CH2−、ブチニルCH≡C−CH2−CH2−、ペンテニルCH≡C−CH=CH−CH2−、ベンジルPh−CH2−、またはアジドブテニルN3−CH2−CH=CH−CH2−、特に好ましくはプロペニルCH2=CH−CH2−、ベンジルPh−CH2−、またはペンテニルCH≡C−CH=CH−CH2−である。
特に好ましいのは、この方法において、SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列を示す本発明によるタンパク質を使用し、かつ、このタンパク質において、SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列の34位にアラニン、グリシン、またはメチオニンが、好ましくはアラニンが、SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列の76位にアスパラギン酸、トレオニン、ロイシン、またはバリンが、好ましくはアスパラギン酸が、SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列の92位にアルギニンまたはアラニンが存在し、かつ、AdoMet類似体として、AdoPropen、AdoEnYn、またはAdoBenzylが用いられる場合である。さらに好ましくは、SEQ ID NO:2で示される34位にアラニン、SEQ ID NO:2で示される76位にアスパラギン酸、SEQ ID NO:2で示される92位にアルギニンまたはアラニンが存在するタンパク質を、AdoPropen、AdoEnYn、またはAdoBenzylの存在下で、適切な条件のもとで、RNA、好ましくはmRNAと接触させ、酵素反応を進行させる。
m7GpppNキャップの酵素修飾に続いて、グアノシンのN2に転移させた残基Rを、例えば酵素的方法または非酵素的化学的方法でさらに修飾することができる。
好ましい手段は、生体直交型化学反応、好ましくは生体直交型クリック反応を用いて、残基Rの化学修飾を行うことである。そのような反応は、当業者には既知であり、例えば、光クリック法、チオール−エン クリック法、および環状付加反応、例えばCu(I)触媒によるヒュスゲン付加環化がある(例えば、非特許文献20〜32参照)。
「光クリック反応」は、ピラゾリン環状付加物の形成下での、アルケンとニトリル−イミンとの1,3−双極性環状付加と理解される。このとき、シクロ付加物の形成の基本的な前提条件として、用いられた遊離体の類似のフロンティア軌道エネルギーが受け入れられる。そのため、光クリック反応では、ニトリル−イミンにおける最高被占軌道のエネルギーの変化によって反応性に影響が及ぶため、タイプIの環状付加の1つと見なすことができることが示されている(非特許文献33参照)。光クリック反応は、生体直交性だけでなく、非蛍光遊離体からの蛍光生成物の形成も傑出しており、これはとりわけ、生細胞で適用する際に背景信号を回避するのに有利である。mRNAキャップの光クリックに基づく機能付与が可能かどうかの手掛かりは、当業者は例えば、コーン−シャム密度汎関数理論計算(非特許文献34)を用いて得ることができる。
本発明による方法のこの好ましい実施形態を用いて、5’末端にキャップ構造を持つ、またはそのようなキャップ構造を付加することができるRNAの5’末端のキャップ構造を、2つのステップ、または、場合によってはそれより多いステップから成る方法で、化学酵素的手段によって特異的に修飾することができる。第1のステップでは、本発明によるタンパク質を用いて、メチル残基の代わりに残基Rをm7GpppNキャップのN2に転移させることにより、キャップ構造を酵素的に修飾する。第2のステップ、つまり化学的ステップで、この残基で修飾したRNAを適切な分子、例えば適切なバイオマーカー(例えば、ビオチン)を用いて、例えばクリックケミストリーの公知の方法で置換し、さらに修飾できる。キャップ構造を介したRNAの固定化を可能にするカラム材料も、この分子に数えられる。この固定化は、例えば、非共有の相互作用により、対応するマトリックスを用いて、直接的または間接的に行うことができる。固定化は、共有結合を用いて行うこともできる。そうすることで、相互作用は例えばマトリックスで安定が増し、これにより、例えば、別の成分をより効率的に分離できる厳重な洗浄ステップが可能になる。それと同時に、例えば、複雑な細胞溶解物からmRNAを特異的に分離できる。
さらに別の実施態様において、本発明は、本発明の第1の実施態様によるタンパク質と、以下の式で示されるAdoMet類似体とを含む検査キットに関する。
上式で、Rは、置換または非置換C2-10アルキル、置換または非置換C2-10アルケニル、置換または非置換C2-10アルキニル、置換または非置換C4-10アルケニニル、置換または非置換C3-12シクロアルキル、置換または非置換C3-12シクロアルケニル、置換または非置換C5-12シクロアルキニル、置換または非置換C5-12シクロアルケニニル、置換または非置換C1-10ヘテロアルキル、置換または非置換C2-10ヘテロアルケニル、置換または非置換C2-10ヘテロアルキニル、置換または非置換C4-10ヘテロアルケニニル、置換または非置換C1-10アジドアルキル、置換または非置換C2-10アジドアルケニル、置換または非置換C2-10アジドアルキニル、置換または非置換C4-10アジドアルケニニル、置換または非置換ベンジルPh−CH2−、プロペニルCH2=CH−CH2−、プロピニルCH≡C−CH2−、ブチニルCH≡C−CH2−CH2−、ペンテニルCH≡C−CH=CH−CH2−、およびアジドブテニルN3−CH2−CH=CH−CH2−から成る基から選択される。
本発明による検査キットの特に好ましい実施形態では、AdoMet類似体が、AdoPropen、AdoEnYn、またはAdoBenzylであり、タンパク質が、SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列を示し、SEQ ID NO:2で示される34位にアラニン、SEQ ID NO:2で示される76位にアスパラギン酸、SEQ ID NO:2で示される92位にアルギニンまたはアラニンを持つ。
以下に、具体的に説明することのみを目的として、本発明を実施例に基づいて詳述する。
1.S−アデノシル−L−メチオニン類似体の合成
1.1 5'−[(S)−[(3S)−3−アミノ−3−カルボキシプロピル]プロプ−2−エニルスルフォニオ]−5'−デオキシアデノシン(AdoPropen)の合成
AdoMet類似体AdoPropenは、Dalhoff et al.の方法(非特許文献35)に従って生成した。AdoPropenを合成するために、20mgのS−アデノシル−L−ホモシステイン(52μmol)を、撹拌しながら1:1のギ酸:酢酸3mLに溶解した。この溶液を氷浴で10分間撹拌して冷却してから、264μL(3.12mmol)の3−ブロモプロペンを加えた。次いで、この反応液を4日間室温で撹拌し、冷たい脱塩水30mLを加えて反応を止めた。水相は、3回、それぞれ5mLのジエチルエーテルで抽出し、次いで、減圧下で脱水した。得られた固体を、5mLの脱塩水+0.01%TFAに溶解し、RP−HPLCで精製した。
1.1 5'−[(S)−[(3S)−3−アミノ−3−カルボキシプロピル]プロプ−2−エニルスルフォニオ]−5'−デオキシアデノシン(AdoPropen)の合成
AdoMet類似体AdoPropenは、Dalhoff et al.の方法(非特許文献35)に従って生成した。AdoPropenを合成するために、20mgのS−アデノシル−L−ホモシステイン(52μmol)を、撹拌しながら1:1のギ酸:酢酸3mLに溶解した。この溶液を氷浴で10分間撹拌して冷却してから、264μL(3.12mmol)の3−ブロモプロペンを加えた。次いで、この反応液を4日間室温で撹拌し、冷たい脱塩水30mLを加えて反応を止めた。水相は、3回、それぞれ5mLのジエチルエーテルで抽出し、次いで、減圧下で脱水した。得られた固体を、5mLの脱塩水+0.01%TFAに溶解し、RP−HPLCで精製した。
1.2 5'−[(S)−[(3S)−3−アミノ−3−カルボキシプロピル]ペント−2−エン−4−イニルスルフォニオ]−5'−デオキシアデノシン(AdoEnYn)の合成
AdoMet類似体AdoEnYnは、Peters et al.の方法(非特許文献36)に従って生成した。
AdoMet類似体AdoEnYnは、Peters et al.の方法(非特許文献36)に従って生成した。
AdoMet類似体AdoEnYnを合成するために、ペント−2−エン−4イン−1−オールを、第1のステップで、メタンスルホン酸エステルに置換した。そのために、240mg(6.00mmol)の水酸化ナトリウムを6mLのジクロルメタンで再懸濁し、426μL(5.50mmol)のメタンスルホニルクロライドを添加して、この懸濁液を氷浴で冷却した。次いで、(E)−および(Z)−ペント−2−エン−4イン−1−オール(472μL、6.02mmol)の混合物を添加し、反応混合物を16時間室温で撹拌した。50mLの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で抽出を行った。溶媒を真空で取り除き、活性アルコールを、メタン酸およびエタン酸(1:1)の1mL溶液に直接溶解した。この溶液を、7.2mg(19μmol)のS−アデノシル−L−ホモシステインに添加し、室温で14時間撹拌した。次いで、これを30mLのddH2Oに加え、50mLのジエチルエーテルで3回抽出した。水相を凍結乾燥させた。残渣を、0.01%TFAを加えた2.5mLのddH2Oに入れ、HR−ESI−MSを用いて分析した。次いで、分取HPLCで精製を行った。
1.3 5'−[(S)−[(3S)−3−アミノ−3−カルボキシプロピル]ベンジル]−5'−デオキシアデノシン(AdoBenzyl)の合成
AdoMet類似体AdoBenzylは、Dalhoff et al.の方法(非特許文献35)に従って生成した。AdoBenzylを合成するために、9.2mgのS−アデノシル−L−ホモシステイン(24μmol)を、撹拌しながら1:1のギ酸:酢酸1.38mLに溶解した。この溶液を氷浴で10分間撹拌して冷却してから、171.2μL(1.44mmol)の臭化ベンジルを加えた。次いで、この反応液を4日間室温で撹拌し、冷たい脱塩水15mLを加えて反応を止めた。水相は、3回、それぞれ2.5mLのジエチルエーテルで抽出し、次いで、減圧下で脱水した。得られた固体を、2.5mLの脱塩水+0.01%TFAに溶解し、RP−HPLCで精製した。
AdoMet類似体AdoBenzylは、Dalhoff et al.の方法(非特許文献35)に従って生成した。AdoBenzylを合成するために、9.2mgのS−アデノシル−L−ホモシステイン(24μmol)を、撹拌しながら1:1のギ酸:酢酸1.38mLに溶解した。この溶液を氷浴で10分間撹拌して冷却してから、171.2μL(1.44mmol)の臭化ベンジルを加えた。次いで、この反応液を4日間室温で撹拌し、冷たい脱塩水15mLを加えて反応を止めた。水相は、3回、それぞれ2.5mLのジエチルエーテルで抽出し、次いで、減圧下で脱水した。得られた固体を、2.5mLの脱塩水+0.01%TFAに溶解し、RP−HPLCで精製した。
2.HPLCと組み合わせた活性アッセイ
WT−GlaTgs2(SEQ ID NO:1)およびSEQ ID NO:4〜10で示される本発明によるタンパク質により酵素的に触媒された転移であって、合成によって生成されたAdoMet類似体に存在する残基プロペニル(AdoPropen)、ペンテニル(AdoEnYn)、およびベンジル(AdoBenzyl)の、m7GpppA(A=アデニン)のグアノシンのN2原子への転移を、HPLCと組み合わせた活性アッセイを用いて調べた。容量8μLを用いた一般的な調合物を表1にまとめる。
WT−GlaTgs2(SEQ ID NO:1)およびSEQ ID NO:4〜10で示される本発明によるタンパク質により酵素的に触媒された転移であって、合成によって生成されたAdoMet類似体に存在する残基プロペニル(AdoPropen)、ペンテニル(AdoEnYn)、およびベンジル(AdoBenzyl)の、m7GpppA(A=アデニン)のグアノシンのN2原子への転移を、HPLCと組み合わせた活性アッセイを用いて調べた。容量8μLを用いた一般的な調合物を表1にまとめる。
表1:m7GpppAを使用した活性アッセイに用いた成分
反応緩衝液2:50mM Tris;10mM MgCl2;100mM NH4OAc;pH8.4
MTANは5'−メチルチオアデノシン/S−アデノシルホモシステインヌクレオシダーゼを指す。LuxSはS−リボシルホモシステインリアーゼを指す。
MTANは5'−メチルチオアデノシン/S−アデノシルホモシステインヌクレオシダーゼを指す。LuxSはS−リボシルホモシステインリアーゼを指す。
より容量の多い10μLまたは20μLの調合物では、それに応じて適合させた。使用するAdoMet類似体の量は、AdoMet類似体のジアステレオマーのクロマトグラム上のピーク面積が、m7GpppAによって引き起こされたシグナルの面積に一致するように合わせた。反応は、通常、反応開始直後(t0)および37℃で3時間後(t180)に止め、分析HPLCとMALDI−TOFとを用いて調べた。
以下の表2では、GlaTgs2−WTの活性を、調べたGlaTgs2変異体と比較している。ここでは、AdoMet類似体としてAdoPropenを用いた。
表2:AdoPropenを用いた、GlaTgs2−WTおよびGlaTgs2変異体の活性。
TTN=Total Turnover Number(総代謝回転数)。アミノ酸交換は、当業者に既知の方法(元のアミノ酸−位置−新しいアミノ酸)で記載しており、アミノ酸は1文字コードを用いた。例えば、V34Aは、元のアミノ酸バリンが、34位でアラニンに置換されたことを意味する。
本発明によるタンパク質は、野生型酵素に匹敵する、またはそれより高い活性を少なくとも1つの活性を有することが示される。
酵素量が同じ場合、例えば、変異体GlaTgs2−V34Aから、AdoPropenではm7GpppAの95%が、AdoEnYnでは10%が置換された。例えば、変異体GlaTgs2−V34Aでは、ベンジルの転移も確認できた。
AdoPropenに関してSEQ ID NO:4で示されるGlaTgs2変異体の酵素パラメーターを表3に示す。
表3:AdoPropenに関するGlaTgs2−WTおよびGlaTgs2−V34Aの酵素パラメーター
GlaTgs2変異体GlaTgs2-V34A(SEQ ID NO:4)は、野生型酵素GlaTgs2−WTと比べて、AdoPropenに対する親和性が高く、AdoPropenとの活性が高い。熱安定性は野生型酵素と同程度である。AdoMetに関する動力学的パラメーターは野生型酵素と同程度である(非特許文献37参照)。
3.熱安定性
タンパク質の安定性は、一定の範囲内での周囲温度の上昇といった変性影響に耐える能力、および天然立体配座を維持する能力を示す。熱安定性の尺度として、T50値を用いることができる。T15/50は、15分間保温した後に酵素がその活性を50%失う温度である。T50を測定するために、分析対象のタンパク質をサーマルサイクラーで15分間さまざまな温度で加熱し、その一方で、タンパク質のプローブを氷上で培養した。次いで、先に加熱したタンパク質で活性試験を実施した。このとき、氷上で培養したプローブを活性が100%の基準として用いた。値を標準化した後、T15/50を、ボルツマン−フィットを用い、ソフトウェアOriginを使って測定した。
タンパク質の安定性は、一定の範囲内での周囲温度の上昇といった変性影響に耐える能力、および天然立体配座を維持する能力を示す。熱安定性の尺度として、T50値を用いることができる。T15/50は、15分間保温した後に酵素がその活性を50%失う温度である。T50を測定するために、分析対象のタンパク質をサーマルサイクラーで15分間さまざまな温度で加熱し、その一方で、タンパク質のプローブを氷上で培養した。次いで、先に加熱したタンパク質で活性試験を実施した。このとき、氷上で培養したプローブを活性が100%の基準として用いた。値を標準化した後、T15/50を、ボルツマン−フィットを用い、ソフトウェアOriginを使って測定した。
表4から明らかなように、GlaTgs2変異体GlaTgs2−V34A(SEQ ID NO:4)、GlaTgs2−V34G(SEQ ID NO:5)、およびGlaTgs2−V34M(SEQ ID NO:6)は類似の熱安定性を有したか、または、より高い熱安定性、すなわちより高温に対する高い安定性を示した。
表4:野生型と比較した、GlaTgs2変異体GlaTgs2−V34A、GlaTgs2−V34M、GlaTgs2−V34Gの熱安定性
4.クリックケミストリーを用いた、酵素的に修飾したRNAキャップの化学修飾
4.1 チオール−エンクリック(TEC)を用いたビオチン化
800μΜのm7GpppAを、酵素的にプロペニル2m7GpppA 1(a2m7GpppA;m7GpppAのN2がプロペニル)にアルケニル化し、1/10容量の1M過塩素酸の添加、または68℃で5分間保温して反応を止めた。
4.1 チオール−エンクリック(TEC)を用いたビオチン化
800μΜのm7GpppAを、酵素的にプロペニル2m7GpppA 1(a2m7GpppA;m7GpppAのN2がプロペニル)にアルケニル化し、1/10容量の1M過塩素酸の添加、または68℃で5分間保温して反応を止めた。
調合物を遠心分離機にかけ、置換にビオチン−チオール2を用いた。これを約30秒間アルゴンで脱気し、空気がない状態で、1mMラジカル開始剤VA−044およびビオチン−チオール2(約50倍モル過剰)と混合した。調合物を44℃で8時間培養し、HPLCおよびMALDI−TOF−MSで分析した。
VA044=2,2'−アゾビス[2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン]ジヒドロクロリド
4.2 Cuクリック反応を用いた蛍光標識
Cuクリック反応を、Tomkuviene et al.(非特許文献38)に従って実施した。まず、約100μΜペント−2−エン−4−イニル2m7GpppA(p2m7GpppAまたはEnYn2m7GpppA)4を酵素的に生成し、1/10容量の1M過塩素酸を添加して反応を止めた。
Cuクリック反応を、Tomkuviene et al.(非特許文献38)に従って実施した。まず、約100μΜペント−2−エン−4−イニル2m7GpppA(p2m7GpppAまたはEnYn2m7GpppA)4を酵素的に生成し、1/10容量の1M過塩素酸を添加して反応を止めた。
Cuクリック反応では、300mM CuBr溶液(DMSO/tBuOH 3:1中)を新たに添加し、111mM TBTA溶液(DMSO/tBuOH 3:1中)で1:10に希釈した。
次いで、10μLの酵素触媒反応に対し、8μLのDMSO/tBuOH、3μLの30mM CuBr溶液(TBTA中)、2,5μLのEterneonアジド5(Eterneon−Azid 480/635、Jena Bioscience GmbH,Kat.Nr.CLK−FA15−1)(DMSO/tBuOH中、2.5mM)を用いた。反応は、適宜ボルテックスしながら37℃で1時間培養し、ゲル電気泳動分析を行った。TBTA=トリス[(1−ベンジル−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)メチル]アミン)、DMSO=ジメチルスルホキシド。
4.3 交差メタセシスを用いた蛍光標識
交差メタセシスを用いて、以下の一般的な図に従ってアリル修飾mRNAキャップの蛍光標識を行った。この蛍光標識では、フルオレセインo−アクリレート8、または他の蛍光標識化アクリレートと、第二世代Hoveyda−Grubbs触媒10を用いた。
交差メタセシスを用いて、以下の一般的な図に従ってアリル修飾mRNAキャップの蛍光標識を行った。この蛍光標識では、フルオレセインo−アクリレート8、または他の蛍光標識化アクリレートと、第二世代Hoveyda−Grubbs触媒10を用いた。
このために、例えばアリル修飾mRNAキャップ7と、DMSOに溶解したフルオレセインo−アクリレート8、ならびに30%tBuOH水溶液に加えた2mol%のHoveyda−Grubbs触媒10の2つの同等物とを、同様に30%tBuOH水溶液中で、室温または37℃にて5時間、遮光して培養した。分析は、20%のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析と、インゲル蛍光検出とを用いて行った。
4.4 光クリック反応を用いたキャップ構造の機能付与
以下に、一例として、光クリック反応を用いたアルケニル化mRNAキャップ、およびアルキニル化mRNAキャップの蛍光標識について説明する。これは、テトラゾール11および12のニトリル−イミン11aおよび12aをキャップ類似体m7GpppAで置換した。
以下に、一例として、光クリック反応を用いたアルケニル化mRNAキャップ、およびアルキニル化mRNAキャップの蛍光標識について説明する。これは、テトラゾール11および12のニトリル−イミン11aおよび12aをキャップ類似体m7GpppAで置換した。
4.4.1 アルケニル化mRNAキャップの蛍光標識
まず、1mM m7GpppAを、AdoPropenおよびGlaTgs2−V34Aの存在下でa2m7GpppAに置換し、次いで、結果として生じる混合物を68℃に加熱し、透析して、置換されなかったAdoPropenを取り除く。置換されなかったAdoPropenを取り除くことで、これが次の光クリック反応で同様にニトリル−イミンと反応するのを防げる。このステップの後、a2m7GpppAの水溶液を、アセトニトリルおよびテトラゾール11(617μΜ)と混ぜ、丁寧に混合した後、黒いマイクロタイタープレートで5分間、254nmで照射した。このとき、反応物と光源との距離を最低限にして照射することが、効果的な実施のために必須であり、間隔を広げると、反応性の高いニトリル−イミンが形成されなかった、または最小限しか形成されなかったと見られることが示された。プローブで得られた成分は、最大20時間4℃で保温した後、ゲル電気泳動的に分離し、蛍光生成物の形成に関して分析した。このとき、ゲルは365nmの波長で照らして撮影した。アルケニル化キャップa2m7GpppAの存在下で実施した反応では、青緑色の蛍光を発する生成物が検出できた。UVシャドウイングを用いたゲルの平行分析により、検出された蛍光生成物は、電気泳動の移動度が小さく、そのため、おそらくキャップより分子量が大きいことが示された。これは、対応するバンドが、期待された光クリック生成物(P1−アデノシン(5')−P3−[N2−エチル−2−(4−(4−メトキシフェニル)−2−フェニルピラゾリン),7−メチルグアノシン(5')]三リン酸;別名:N2−メトキシピラゾリンエチル−m7GpppA)14を示す可能性と一致しており、その理由は、この生成物が、電荷が同じ場合、キャップ類似体a2m7GpppA 13よりも分子量が大きいからと思われる。対照調合物では、相応する蛍光シグナルは検出されなかった。対照は、酵素なし、AdoPropenなし、m7GpppAなし、および変性酵素の存在下で生物交換を実施した。したがって、これらの対照すべてで、光クリック反応の基質を意味するはずのアルケニル化キャップの形成が確認できなかった。したがって、a2m7GpppAが非存在下で、光クリック反応後に蛍光生成物が観察できなかったことから、テトラゾール11を用いてのアルケニル化キャップの蛍光標識は、効果的かつ特異的に実施することができた。
これは、HPLC−ESI−TOF−MSを用いた質量分光分析でも検証した。この分析では、反応混合物において、期待された光クリック生成物14の質量が検出できた(ber.[M]+=1051.23m/z;det.[M]+=1051.23m/z)。
細胞における適用可能性に関しても、テトラゾール11およびa2m7GpppA13の光クリック反応をさらに特徴付けるために、最初の動力学的分析を実施した。反応は上述のように実施したが、プローブの一部を、それぞれ保温の5、30、120、および240分後に、蛍光生成物の検出によって分析した。この際、光クリック生成物14が5分後に早くも検出された。検出された蛍光強度に基づいて、それより後の時点ではさらなる置換は認められなかった。そのことから、その動力学に基づいて、この反応が、生細胞におけるmRNAの可視化にも適しているということがわかる。というのも、保温後短時間で早くも目に見えるシグナルが得られるからである。その他の点では、5分後にUV光(λ=254nm)を照射してPC3細胞を調べると、細胞の形態への影響は認められたものの、その活力への影響は認められなかったことから、検査時にUV照射によって細胞を死滅させることなく、適用が可能であることが明らかとなった。したがって、遊離体であるa2m7GpppAを用いて、高い反応速度で蛍光生成物を形成するのに加え、テトラゾールの活性化のために照射を持続することも、生細胞における適用に適合している。
上述した光クリック反応は、ニトリル−イミン12aとa2m7GpppA 13との組み合わせについても効果的に実施でき、対応する光クリック生成物(P1−アデノシン(5')−P3−[N2−エチル−2−(4−(4−メチルベンゾエート)−2−フェニルピラゾリン),7−メチルグアノシン(5')]三リン酸;別名:N2−ベンゾナートピラゾリンエチル−m7GpppA)16を得た。
この際、テトラゾール11と12の光クリック生成物は、a2m7GpppAと発光極大において見たところ異なることが観察された。したがって、in vivoでも任意の波長で放射蛍光体を発生させるために、場合によっては、光クリック反応を用いることができる。
4.4.2 アルキニル化mRNAキャップの蛍光標識
ニトリル−イミン11aとp2m7GpppA 15との組み合わせについても光クリック反応を行った。
ニトリル−イミン11aとp2m7GpppA 15との組み合わせについても光クリック反応を行った。
上述した、テトラゾール11を用いてa2m7GpppAを蛍光標識するための光クリック反応を、アルキニル化キャップ類似体p2m7GpppA 15を修飾するために使用した。そのために、AdoEnYnを用いたm7GpppAの生物交換を、GlaTgs2−V34Aを用いて、かつ、対照として、変性酵素の存在下で実施した。これにより、両方の調合物に同じ成分が存在するが、対照では光クリック遊離体p2m7GpppAの形成が生じないことが保証された。254nmの波長の照射により光クリック反応を開始した後、反応調合物および対照調合物を4℃で20時間培養し、得られた成分をゲル電気泳動的に分離してから、蛍光シクロ付加物の形成に関して特徴付けた。365nmの波長でゲルを照射すると、反応混合物で蛍光バンドが検出できた。これは対照では出現せず、対応するピラゾリン(P1−アデノシン(5')−P3−[N2−ブト−2−エン−4−(4−(4−メトキシフェニル)−2−フェニルピラゾリン)イル,7−メチルグアノシン(5')]三リン酸;別名:N2−メトキシピラゾリンブテニル−m7GpppA)17に分類できた。
Claims (13)
- 分離タンパク質または合成タンパク質であって、
a.SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列を示す、もしくは含む、または
b.SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、前記相同なアミノ酸配列において、SEQ ID NO:2で示される34位に相当する位置にバリンが存在しない、または
c.SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を示し、もしくは含み、前記アミノ酸配列が、SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列と85%超、好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも95%同一であり、このとき条件として、前記相同なアミノ酸配列において、SEQ ID NO:2で示される34位に相当する位置にバリンが存在しない、または
d.a、b、またはcに示される前記アミノ酸配列の少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、80、90、もしくは少なくとも100種のアミノ酸、好ましくは少なくとも110、120、130、140、150、160、170、180、190、もしくは少なくとも200種のアミノ酸、特に好ましくは少なくとも210、220、230、240、もしくは少なくとも250種のアミノ酸の連続部分配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、前記部分配列が、SEQ ID NO:2で示される34位にアミノ酸もしくは対応する相同なアミノ酸を含む、および
e.SEQ ID NO:11で示されるアミノ酸配列を示さない
タンパク質。 - 以下の一般式(I)の化合物の残基Rの、m7GTP、つまりm7GpppNのグアノシン、または以下の式(II)の化合物のN2への転移を酵素的に触媒するタンパク質であって、
上式で、RNAはリボ核酸を意味し、R1はOHまたはOCH3を意味し、Nはヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオシド類似体、またはヌクレオチド類似体を意味し、Bは核酸塩基を表し、そしてRは、置換または非置換C2-10アルキル、置換または非置換C2-10アルケニル、置換または非置換C2-10アルキニル、置換または非置換C4-10アルケニニル、置換または非置換C3-12シクロアルキル、置換または非置換C3-12シクロアルケニル、置換または非置換C5-12シクロアルキニル、置換または非置換C5-12シクロアルケニニル、置換または非置換C1-10ヘテロアルキル、置換または非置換C2-10ヘテロアルケニル、置換または非置換C2-10ヘテロアルキニル、置換または非置換C4-10ヘテロアルケニニル、置換または非置換C1-10アジドアルキル、置換または非置換C2-10アジドアルケニル、置換または非置換C2-10アジドアルキニル、置換または非置換C4-10アジドアルケニニル、置換または非置換ベンジル、プロペニルCH2=CH−CH2−、プロピニルCH≡C−CH2−、ブチニルCH≡C−CH2−CH2−、ペンテニルCH≡C−CH=CH−CH2−、およびアジドブテニルN3−CH2−CH=CH−CH2−から成る基から選択される、請求項1に記載のタンパク質。 - a.SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示されるアミノ酸配列を示す、もしくは含む、または
b.SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、前記相同なアミノ酸配列において、SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示される34位に相当する位置にバリンが存在しない、または
c.SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示されるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を示し、もしくは含み、前記相同なアミノ酸配列が、SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示されるアミノ酸配列と85%超、好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも95%同一であり、このとき条件として、前記相同なアミノ酸配列において、SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示される34位に相当する位置にバリンが存在しない、または
d.a、b、またはcに示される前記アミノ酸配列の少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、80、90、もしくは少なくとも100種のアミノ酸、好ましくは少なくとも110、120、130、140、150、160、170、180、190、もしくは少なくとも200種のアミノ酸、特に好ましくは少なくとも210、220、230、240、もしくは少なくとも250種のアミノ酸の連続部分配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、前記部分配列が、SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、または10で示される34位にアミノ酸もしくは相当する相同なアミノ酸、を含む、および
e.SEQ ID NO:11で示されるアミノ酸配列を示さない、
請求項1または2に記載のタンパク質。 - SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列の34位に、アラニン、グリシン、またはメチオニン、好ましくはアラニンが存在する、請求項1〜3のうちいずれか一項に記載のタンパク質。
- SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列の76位に、アスパラギン酸、トレオニン、ロイシン、もしくはバリン、好ましくはアスパラギン酸が存在し、および/またはSEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列の92位に、アルギニンもしくはアラニンが存在する、請求項1〜4のうちいずれか一項に記載のタンパク質。
- RがプロペニルCH2=CH−CH2−、プロピニルCH≡C−CH2−、ブチニルCH≡C−CH2−CH2−、ペンテニルCH≡C−CH=CH−CH2−、ベンジルPh−CH2−、またはアジドブテニルN3−CH2−CH=CH−CH2−、好ましくはプロペニルCH2=CH−CH2−、ベンジルPh−CH2−、またはペンテニルCH≡C−CH=CH−CH2−である、請求項1〜5のうちいずれか一項に記載のタンパク質。
- 請求項1〜6のうちいずれか一項によるタンパク質をコードする核酸。
- RNA分子、特にmRNA分子のm7GpppNキャップを修飾する方法であって、m7GpppNキャップを持つRNA分子を、以下の式(I)で示されるAdoMet類似体の存在下で、請求項1〜6のうちいずれか一項によるタンパク質に接触させるステップを含む方法であって、
上式で、Rは、置換または非置換C2-10アルキル、置換または非置換C2-10アルケニル、置換または非置換C2-10アルキニル、置換または非置換C4-10アルケニニル、置換または非置換C3-12シクロアルキル、置換または非置換C3-12シクロアルケニル、置換または非置換C5-12シクロアルキニル、置換または非置換C5-12シクロアルケニニル、置換または非置換C1-10ヘテロアルキル、置換または非置換C2-10ヘテロアルケニル、置換または非置換C2-10ヘテロアルキニル、置換または非置換C4-10ヘテロアルケニニル、置換または非置換C1-10アジドアルキル、置換または非置換C2-10アジドアルケニル、置換または非置換C2-10アジドアルキニル、置換または非置換C4-10アジドアルケニニル、置換または非置換ベンジルPh−CH2−、プロペニルCH2=CH−CH2−、プロピニルCH≡C−CH2−、ブチニルCH≡C−CH2−CH2−、ペンテニルCH≡C−CH=CH−CH2−、およびアジドブテニルN3−CH2−CH=CH−CH2−から成る基から選択され、このとき、m7GpppNキャップのグアノシンのN2への残基Rの転移が行われることを条件とする方法。 - 前記RNAを、AdoPropenまたはAdoEnYnの存在下でタンパク質と接触させ、前記タンパク質が、SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列を示し、かつ、前記タンパク質が、SEQ ID NO:2で示される34位にアラニン、SEQ ID NO:2で示される76位にアスパラギン酸、SEQ ID NO:2で示される92位にアルギニンまたはアラニンを持つ、請求項8に記載の方法。
- m7GpppNキャップのグアノシンのN2に転移された残基Rを、続いて化学修飾するステップを含む、請求項8または9に記載の方法。
- 前記残基Rの化学修飾を、光クリック反応を用いて行う、請求項10に記載の方法。
- 請求項1〜6のうちいずれか一項によるタンパク質と、以下の式(I)で示されるAdoMet類似体とを含む検査キットであって、
上式で、Rは、置換または非置換C2-10アルキル、置換または非置換C2-10アルケニル、置換または非置換C2-10アルキニル、置換または非置換C4-10アルケニニル、置換または非置換C3-12シクロアルキル、置換または非置換C3-12シクロアルケニル、置換または非置換C5-12シクロアルキニル、置換または非置換C5-12シクロアルケニニル、置換または非置換C1-10ヘテロアルキル、置換または非置換C2-10ヘテロアルケニル、置換または非置換C2-10ヘテロアルキニル、置換または非置換C4-10ヘテロアルケニニル、置換または非置換C1-10アジドアルキル、置換または非置換C2-10アジドアルケニル、置換または非置換C2-10アジドアルキニル、置換または非置換C4-10アジドアルケニニル、置換または非置換ベンジルPh−CH2−、プロペニルCH2=CH−CH2−、プロピニルCH≡C−CH2−、ブチニルCH≡C−CH2−CH2−、ペンテニルCH≡C−CH=CH−CH2−、およびアジドブテニルN3−CH2−CH=CH−CH2−から成る基から選択される検査キット。 - 前記AdoMet類似体が、AdoPropen、AdoEnYn、またはAdoBenzylであり、前記タンパク質が、SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列を示し、かつ、前記タンパク質が、SEQ ID NO:2で示される34位にアラニン、SEQ ID NO:2で示される76位にアスパラギン酸、SEQ ID NO:2で示される92位にアルギニンまたはアラニンを持つ、請求項12に記載の検査キット。
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