KR20010086070A - 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제 - Google Patents

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Abstract

인간을 포함한 포유동물의 혈관신생 및(또는) 심혈관형성을 자극하거나 억제하는 조성물 및 방법이 개시되어 있다. 본원의 조성물로 진단, 예방 또는 치료할 수 있는 질환에는 창상과 같은 외상, 다양한 암, 및 죽상경화증과 심비대증을 포함한 혈관 질환이 포함된다. 또한, 본 발명은 신규 폴리펩티드, 및 이 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본원은 이 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 이종 폴리펩티드 서열에 결합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드 분자, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체, 및 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제 {Promotion or Inhibition of Angiogenesis and Cardiovascularization}
A. 심장 질환 및 인자
약 5백만명의 미국인이 심부전을 앓고 있고, 해마다 약 400,000명의 심부전 환자가 새로 발생한다. 심부전은 미국에서 65세 이상의 사람이 입원하는 가장 빈도가 높은 단일 원인이다. 급성 심근경색을 비롯한 급성 심장 질환의 관리에 있어서 최근의 진보된 연구 결과, 결국 만성 심부전으로 발전될 환자 집단이 팽창되고 있음을 알 수 있다. 1979년부터 1995년까지, 울혈성 심부전 (CHF)으로 인한 입원은 377,000명에서 872,000명으로 늘었고 CHF로 인한 사망은 116%만큼 증가되었다.
CHF는 좌심실 기능저하, 감소된 운동 내성, 손상된 삶의 질 및 매우 단축된 여명에 의해 특징지워지는 증후군이다. 심부전의 필수 조건은 심장이 체조직의 대사 요구를 총족시키기에 충분한 속도로 혈액을 펌프할 수 없다는 점 (달리 말하면불충분한 심박출량)이다.
심부전 환자가 심박출량을 상승시키는 데 있어서, 혈관수축, 증가된 심박수, 증가된 심수축성 및 증가된 혈장량를 비롯하여 적어도 4가지 주요 보정 기작이 활성화된다. 이들 효과는 교감신경계 및 레닌-안지오텐신계에 의해 주로 매개된다 (Eichlorn, American Journal of Medicine, 104: 163-169 (1998)참조). 교감신경계의 증가된 출량은 혈관긴장도, 심박수 및 수축성을 증가시킨다. 안지오텐신 II는 1) 혈관 평활근 수축을 직접 자극시키고, 2) 알도스테린 및 항이뇨 호르몬 분비를 자극하여 혈장량의 팽창을 촉진시키고, 3) 교감-매개 혈관긴장도를 자극시키고, 4) 혈관확장 활성 및 나트륨이뇨 활성을 갖는 브래디키닌의 분해를 촉매시킴으로써 혈압을 상승시킨다 (Review by Brown and Vaughan, Circulation. 97: 1411-1420 (1998) 참조). 아래에 기재한 바와 같이, 안지오텐신 II는 근세포 괴사 (수축 기능을 손상시킴) 및 심장내섬유증 (확장 기능을 손상시키고, 몇 가지 경우에서는 수축 기능을 손상시킴)을 촉진시킴으로써 심장에 대해 직접적으로 유해한 영향을 줄 수도 있다 (Weber, Circulation, 96: 4065-4082 (1998) 참조).
울혈성 심부전 (CHF)의 일관성 있는 특징은 심장비대, 즉 기계적 및 호르몬 자극에 의해 활성화되어 증가된 심박출량에 대한 수요에 심장이 적응할 수 있게 하는 심장의 확장이다 (Morgan and Baker. Circulation, 83: 13-25 (1991) 참조). 이 비대 반응은 고혈압, 대동맥협착증, 심근경색증, 심근병증, 판역류증 및 심장내단락과 같은 다양한 여러 가지 병리학적 상태 (이들은 모두 만성 혈액동력학적 과부하를 초래함)와 종종 관련되어 있다.
비대증은 일반적으로 종양 형성을 수반하지 않으며 자연 성장과는 독립된 기간 또는 구조의 크기 증가로 정의된다. 심장의 비대증은 개별 세포 (근세포)의 질량의 증가, 또는 조직을 구성하는 세포 수의 증가 (과다형성), 또는 둘다의 증가로 인한 것이다. 배아 심장의 확장은 근세포 수의 증가 (이것은 생후 즉시까지만 지속됨)에 주로 달려 있는 반면, 생후 심근세포는 증식능을 상실한다. 개별 세포의 비대증을 통해 추가 성장이 일어난다.
성숙 근세포의 비대증은 개별 근섬유의 부하를 감소시켜 손상된 심장기능에 대한 단기 반응으로서 초기에는 유익하다. 그러나, 장기간 지속되는 심각한 부하로 인해 비대화된 세포가 퇴화되기 시작하고 결국 사멸한다 (Katz A.M. ed., Physiology of the Heart (New York: Raven Press, 1992) pp. 638-668). 심비대증은 심부전의 임상 과정에서 사망률 및 이환률에 대한 상당한 위험 인자이다 (Katz, Trends Cardiovasc. Med., 5: 37-44 (1995)). 심비대증의 원인 및 병리학의 추가적인 세부사항은 예를 들어, 문헌 (Heart Disease. A Textbook of Cardiovascular Medicine, Braunwald, E. ed. (W.B. Saunders Co., 1998), Chapter 14, "Pathophysiology of Heart Failure")을 참조한다.
세포 수준에서, 심장은 근세포와 일반적으로 비근세포라고 불리는 주변 지지세포로 구성되어 있다. 비근세포는 주로 섬유아세포/중간엽세포이지만 내피세포 및 평활근세포도 포함한다. 실제로, 근세포가 대부분의 성숙 심근 덩어리를 구성하더라도 이들은 심장에 존재하는 총 세포수의 약 30%만을 차지한다. 호르몬 자극, 생리적인 자극, 혈액동력학적인 자극 및 병리적인 자극에 반응하여 성숙 심실근세포는 비대 과정의 활성화를 통해 증가된 부하에 적응할 수 있다. 이 반응은 심방나트륨이뇨 펩티드 (ANP)의 유전자를 비롯하여 동시다발적인 세포 분열 및 배아 유전자의 활성화 없이 근세포 크기의 증가 및 개별 심근세포의 수축성 단백질 함량의 증가에 의해 특징지워진다 (Chin et al., FASEB J., 5: 3037-3046 (1991); Chien et al., Annu. Rev. Physiol., 55: 77-95 (1993)). 세포외 매트릭스내 및 심근내 관상동맥 주변에 있는 간질 콜라겐의 축적과 관련된 근세포 크기의 증가라는 결과로서의 심근 질량의 증가는 인간에서 압력 부하에 의해 파생되는 좌심실 비대증에서 서술된 바 있다 (Caspari et al., Cardiovasc. Res., 11: 554-558 (1997); Schwarz et al., Am. J. Cardiol., 42: 895-903 (1978); Hess et al., Circulation, 63: 360-371 (1981); Pearlman et al., Lab. Invest., 46: 158-164 (1982)).
또한, 비근세포를 지지하는 세포에 의해 생성되는 파라크린 인자가 심비대증의 발달에 부가적으로 관여하고, 다양한 비근세포로부터 유래한 비대 인자 (예를 들어, 백혈구 억제 인자 (LIF) 및 엔도텔린)이 확인되었다고 보고된 바 있다 (Metcalf, Growth Factors, 7: 169-173 (1992); Kurzrock et al., Endocrine Reviews, 12: 208-217 (1991); Inoue et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2863-2867 (1989); Yanagisawa and Masaki, Trends Pharm. Sci., 10: 374-378 (1989); 미국 특허 제5,573,762호 (1996년 11월 12일 발행)). 심비대증의 잠재적인 매개제로 확인된 예시적인 추가 인자로는 카디오트로핀-1 (CT-1) (Pennica et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92: 1142-1146 (1995)), 카테콜아민, 아드레노코르티코스테로이드, 안지오텐신, 프로스타글란딘이 있다.
현재, 심비대증의 치료는 기저 심질환에 따라 다양하다. 카테콜아민, 아드레노코르티코스테로이드, 안지오텐신, 프로스타글란딘, LIF, 엔도텔린 (엔도텔린-1, -2 및 -3과 빅 엔도텔린을 포함함) 및 CT-1은 비대증의 잠재적인 매개제로 확인된 인자들이다. 예를 들어, 베타-아드레날린성 수용체 차단 약물 (베타-차단제, 예를 들어 프로프라놀올, 티몰올, 테르타롤올, 카테올올, 나돌올, 베탁솔올, 펜부톨올, 아세토부톨올, 아테놀올, 메토프롤올, 카베딜올 등) 및 베라파밀은 비대성 심근병증의 치료에 광범위하게 사용되어 왔다. 증상 (예: 가슴 통증) 및 운동 내성에 대한 베타-차단제의 유익한 효과는 주로 이완기의 결과적 연장 및 증가된 수동 심실 충만과 함께 심박수의 감소에 기인한다 (Thompson et al., Br. Heart J., 44: 488-98 (1980); Harrison et al., Circulation., 29: 84-98 (1964)). 베라파밀은 심실 충만을 향상시키고, 심근 허혈을 감소시킬 가능성이 있는 것으로 기재된 바 있다 (Bonow et al., Circulation, 72: 853-64 (1985)).
니페디핀 및 딜티아젬도 비대성 심근병증의 치료에 종종 사용된 바 있다 (Lorell et al., Circulation, 65: 499-507 (1982); Betocchi et al., Am. J. Cardio., 78: 451-457 (1996)). 그러나, 니페디핀은 그의 강력한 혈관확장성 때문에 특히 배출 장애가 있는 환자에게 해로울 수 있다. 디이소피라미드는 그의 수축력 감소성 때문에 증상을 완화시키는 데 사용된 바 있다 (Pollick, N. Engl. J. Med., 307: 997-999 (1982)). 그러나, 많은 환자에서 초기 잇점이 시간에 따라 감소한다 (Wigle et al., Circulation. 92: 1680-1692 (1995)). 항고혈압 약물 치료법은 상승된 혈압과 관련된 심비대증에 유익한 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다. 단독으로, 또는 조합으로 항고혈압 치료법에 사용된 약물의 예로는 칼슘 길항제, 예를 들어 니트렌디핀; 아드레날린성 수용체 차단제, 예를 들어 상기 기재된 것들; 퀴나프릴, 캡토프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 벤아제프릴, 포시노프릴 및 리시노프릴과 같은 안지오텐신 전환 효소 (ACE); 이뇨제, 예를 들어 클로로티아지드, 히드로클로로티아지드, 히드로플루메타지드, 메틸클로로티아지드, 벤즈티아지드, 디클로로펜아미드, 아세트아졸아미드 및 인다파미드; 및 칼슘 채널 차단제, 예를 들어 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀 및 니카르디핀이 있다.
예를 들어, 딜티아젬 및 캡토프릴을 사용한 고혈압의 치료는 좌심실근 질량의 감소를 보였지만, 이완 기능의 도플러 지수는 정상화되지 않았다 (Szlachcic et al., Am. J. Cardiol., 63: 198-201 (1998); Shahi et al., Lancet, 336: 458-461 (1990)). 이들 발견은 과량의 간질 콜라겐이 좌심실 비대증의 퇴행 후에 남아 있을 수 있는 것을 나타내는 것으로 해석되었다 (Rossi et al., Am. Heart. J., 124: 700-709 (1992)). 상기 Rossi 등은 실험 래트의 압력 부하 심비대증에서 심근세포비대증 및 간질 섬유증의 예방 및 퇴행에 대한 캡토프릴의 효과를 조사하였다.
심수축성을 직접 증가시키는 물질은 단기간에 심박출량을 향상시키기 때문에 심부전을 앓는 환자에 유익할 것으로 처음에는 생각되었다. 그러나, 디고시제닌을 제외한 모든 수축력 증가제는 심장작업 수행능력의 단기간 향상에도 불구하고 증가된 장기간 사망률을 초래하는 것으로 확인된 바 있다 (Massie, Curr. Op. in Cardiology, 12: 209-217 (1997); Reddy et al., Curr. Opin. Cardiol., 12: 233-241 (1997)). 최근에 베타-아드레날린성 수용체 차단제는 심부전에 사용하도록 추천된 바 있다. 임상 시험으로부터 얻은 결과는 기록된 개선 환자 생존이 아직 증명되지 않았지만 사망률을 증가시키지 않고 심장기능의 향상을 달성할 수 있음을 제시하고 있다. 또한, CHF의 치료에 있어서 카디오트로핀-1 또는 그의 길항제, 또는 성장 호르몬 및(또는) 인슐린-유사 성장 인자-I의 용도에 관해서는 미국 특허 제5,935,924호, 제5,624,806호, 제5,610,134호 및 WO 95/28173를 참조한다. 또다른 치료 방법은 심장이식이지만, 이것은 공여자 심장의 이용가능성에 의해 제한된다.
엔도텔린은 돼지 동맥의 내피세포 배양 상등액으로부터 단리되어 구조학적으로 결정된, 21개의 아미노산을 포함하는 혈관수축 펩티드이다 (Yanagisawa et al., Nature, 332: 411-415 (1998)). 엔도텔린은 나중에 다양한 작용을 나타내는 것으로 밝혀졌고, 엔도텔린 길항제로서의 엔도텔린 항체는 심근경색증, 신부전 및 기타 질환의 치료에 효과적인 것으로 입증되었다. 엔도텔린은 생체내에 존재하고 혈관수축 작용을 나타내기 때문에, 순환계의 조절에 관여하는 내생 인자로 기대되고 있고 고혈압, 심근경색증과 같은 심혈관 질환, 및 급성 신부전과 같은 신장 질환과 관련되어 있을 수 있다. 엔도텔린 길항제는 예를 들어, 미국 특허 제5,773,414호; 일본 특허 공개 제3130299/1991호, 유럽 특허 제460,679호; 및 유럽 특허 제552,489호에 기재되어 있다. 엔도텔린 수용체 길항제를 확인하기 위한 신규 엔도텔린 B 수용체는 미국 특허 제5,773,223호에 기재되어 있다.
심부전에 대한 현재 치료법은 주로 캡토프릴 및 이뇨제와 같은 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제를 이용하는 것에 관한 것이다. 이들 약물은 혈액동력학적 프로필 및 운동 내성을 향상시키고 CHF를 앓는 환자의 이환률 및 사망률을 감소시킨다 (Kramer et al., Circulation, 67(4): 807-816 (1983); Captopril Multicenter Research Group, J.A.C.C., 2(4): 755-763 (1983): The CONSENSUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med., 316(23): 1429-1435 (1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med., 325(5): 293-302 (1991)). 또한, 상기 약물은 고혈압, 좌심실 기능저하, 죽상경화성 혈관질환 및 당뇨병성 신병증을 치료하는 데 유용하다 (상기 Brown 및 Vaughan). 그러나, 입증된 효능에도 불구하고 ACE 억제제에 대한 반응은 제한되고 있다. 예를 들어, ACE 억제제는 심부전의 치료에 있어서 생존을 연장시키면서 말기 심부전을 향한 진행을 늦추는 듯하고, ACE 억제제에 대한 상당수의 환자가 기능성 클래스 III 심부전을 갖는다.
게다가, 기능성 및 운동 시간의 향상은 적을 뿐이고 사망률은 비록 감소되기는 하였지만 계속 높다 (CONSENSUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med., 316(23): 1429-1453 (1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med., 325(5): 293-302 (1991); Cohn et al., N. Engl. J. Med., 325(5): 303-310 (1991); The Captopril-Digoxin Multicenter Research Group, JAMA, 259(4): 539-544 (1988)). 그러므로, ACE 억제제는 일관성 있게 60% 이상의 심부전 환자에서 증상을 완화시킬 수 없는 듯하고 약 15-20%까지만 심부전의 사망률을 감소시키는 듯하다. 추가적인 해로운 결과는 상기 Brown 및 Vaughan을 참조한다.
ACE 억제제에 대한 대안은 특정한 AT1 수용체 길항제에 의해 나타난다. 심혈관 질환 및 신장 질환의 치료에 있어서 이들 두 가지 방법의 효능을 비교하기 위해 임상 연구를 계획한다. 그러나, 동물 모델 데이타는 ACE/Ang II 경로가 심비대증에 분명히 관여하지만 이 역할에 작용하는 유일한 경로 또는 심지어 주요 경로도 아니라는 것을 제시한다. 마우스 유전 "넉아웃" 모델은 상기 경로의 개별 성분을 시험하기 위해 만들어졌다. Ang II에 대한 주요한 심장 수용체인 AT sub 1A가 유전적으로 결실된 상기 한 모델에서, 이들 마우스는 AngII가 실험적으로 주어지는 경우 비대증을 발전시키지 않는다 (Ang II에 의해 파생되는 비대증을 없애는 데 있어서 기초적인 성공 모델임을 확신시켜줌). 그러나, 대동맥이 이들 동물 (고혈압성 심장압축 모델)에서 수축되는 경우, 심장은 여전히 비대하게 된다. 이것은 이 수용체 (AT sub 1A)에 의존하지 않는 별도의 신호 경로가 고혈압에서 활성화된다는 것을 제시한다. ACE 억제제는 이들 경로를 억제할 수 없는 것으로 추측된다 (Harada et al., Circulation, 97: 1952-1959 (1998) 참조). 또한, 심비대증의 과정 및 기작과 관련된 수수께끼에 관해서는 문헌 (Homcy, Circulation, 97: 1890-1892 (1998))을 참조한다.
약 750,000명의 환자가 해마다 급성 심근경색증 (AMI)를 앓고, 대략 미국인의 모든 사망의 4분의 1이 AMI에 기인한 것이다. 최근에, 혈전용해제, 예를 들어 스트렙토키나제, 유로키나제 및 특히 플라스미노겐 활성화제 (t-PA)는 심근경색증을 앓는 환자의 생존을 상당히 증가시켰다. t-PA가 1.5시간 내지 4시간에 걸친 연속적인 정맥내 주입으로 투여된 경우, t-PA는 치료받은 환자의 69% 내지 90%에서 90분에 관을 개방시킨다 (Topol et al., Am. J. Cardiol., 61, 723-728 (1988);Neuhaus et al., J. Am. Coll. Cardiol., 12: 581-587 (1988); Neuhaus et al., J. Am. Coll. Cardiol., 14: 1566-1569 (1989)). 가장 큰 개방은 고용량 또는 가속화된 투약 처방에서 보고된 바 있다 (Topol et al., Am. J. Cardiol., 15: 922-924 (1990)). 또한, t-PA는 단회 볼루스로 투여될 수 있지만, 상대적으로 짧은 그의 반감기로 인해 주입 치료법이 보다 더 알맞다 (Tebbe et al., Am. J. Cardiol., 64: 448-453 (1989)). t-PA, 구체적으로는 보다 긴 반감기와 보다 높은 피브린 특이성을 갖도록 디자인된 TNK t-PA (T103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAA t-PA 변이체, Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3670-3674 (1994))는 볼루스 투여에 특히 적당하다. 그러나, 이들 모든 진보에도 불구하고 환자 생존의 장기간 예후는 심비대의 관찰 및 치료를 포함하는, 환자의 경색 후 관찰 및 치료에 크게 달려 있다.
B. 성장 인자
보고된 바에 의하면 다양한 천연 발생 폴리펩티드는 내피세포의 증식을 유도한다. 이들 폴리펩티드 중에는 염기성 및 산성 섬유아세포 인자 (FGF) (Burgess and Maciag, Annual Rev. Biochem., 58: 575 (1989)), 혈소판-유도 내피세포 성장 인자 (PD-ECGF) (Ishikawa et al., Nature, 338: 557 (1989)) 및 혈관 내피세포 성장 인자 (Leung et al., Science, 246: 1306 (1989); Ferrara and Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun. 161: 851 (1989); Tischer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 165: 1198 (1989); EP 471, 754B (1996년 7월 31일 사정)가 있다.
인간 VEGF (hVEGF) cDNA로 형질감염된 세포를 포함하는 배지는 모세혈관 내피세포의 증식을 촉진한 반면, 대조군 세포는 촉진하지 못하였다 (Leung et al., Science, 246: 1306 (1989)). 여러 가지 추가 cDNA가 hVEGF의 121-, 189- 및 206-아미노산 동종체 (집합적으로 hVEGF-관련 단백질로도 불림)를 코딩하는 cDNA 라이브러리에서 확인되었다. 121-아미노산 단백질은 hVEGF에서 잔기 116과 159사이의 44개 아미노산의 결실에 의해 hVEGF와 상이하다. 189-아미노산 단백질은 hVEGF의 잔기 116에서 24개 아미노산이 삽입됨으로써 hVEGF와 상이하며, 인간 혈관 투과성 인자 (hVPF)와 명백히 동일하다. 206-아미노산은 hVEGF의 잔기 116에서 41개 아미노산이 삽입됨으로써 hVEGF와 상이하다 (Houck et al., Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991); Ferrara et al., J. Cell Biochem., 47: 211(1991); Ferrara et al., Endocrine Reviews, 13: 18(1992); Keck et al., Science, 146: 1309 (1989); Connolly et al., J. Biol. Chem., 264: 20017 (1989); EP 370,989 (1990년 5월 30일 공개)).
선재하는 내피로부터 새로운 혈관의 형성을 수반하는 혈관신생은 다양한 질환의 발병기전에 관여하는 것으로 현재 잘 확립되어 있다. 이들은 고형 종양 및 전이, 죽상경화증, 수정체후부 섬유증식증, 혈관종, 만성 염증, 증식성 망막병증 예컨대, 당뇨성 망막병증과 같은 안내 신생혈관 증후군, 연령 관련 황반 퇴화증 (AMD), 신생혈관 녹내장, 이식된 각막 조직 및 기타 조직의 면역 거부, 류마티스성 관절염 및 건선을 포함한다 (Folkman et al., J. Biol. Chem., 267: 10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol., 53: 217-239 (1991); and GarnerA., "Vascular Diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease, A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 제2판 (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710).
종양 성장의 경우, 혈관신생은 증식에서 종양으로 전이하는 데, 그리고 영양분을 성장하는 고형 종양에 공급하는 데 결정적인 것인 듯하다 (Folkman et al., Nature, 339: 58(1998)). 혈관신생은 정상 세포에 비해 종양 세포가 성장 잇점 및 증식 자율성을 획득하게 한다. 따라서, 종양 절편의 미세혈관 밀도와 유방암 뿐만 아니라 여러 가지 다른 암에 있어서의 환자 생존 사이에 관련성이 관찰된 바 있다 (Weidner et al., N. Engl. J. Med., 324: 1-6 (1991); Horak et al., Lancet, 340: 1120-1124 (1992); Macciarini et al., Lancet, 340: 145-146 (1992)).
혈관신생의 양성 조절자의 검색 결과, aFGF, bFGF, TGF-α, TGF-β, HGF, TNF-α, 안지오제닌, IL-8 등을 포함한 많은 후보가 확인되었다 (상기 Folkman et al., J.B.C., 및 상기 Klagsbrun et al.,). 지금까지 확인된 음성 조절자에는 트롬보스판딘 (Good et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87: 6624-6628 (1990)), 프로락틴의 N-말단 단편 (16-킬로달톤) (Clapp et al., Endocrinology, 133: 1292-1299 (1993)), 안지오스타틴 (O'Reily et al., Cell, 79: 315-328 (1994)) 및 엔도스타틴 (O'Reily et al., Cell, 88: 277-285 (1996))이 포함된다.
최근 몇 년간의 연구 결과, 혈관 내피세포 증식을 자극시키는 데 뿐만 아니라 혈관 투과성 및 혈관신생을 유도하는 데 있어서 VEGF의 핵심 역할이 확립되었다 (Ferrara et al., Endocr. Rev., 18: 4-25 (1997)). 심지어 단일 VEGF 대립유전자의 손실이 배아에 치명적이라는 발견은 혈관계의 발달 및 분화에 있어서 이 인자가 하는 대체불가능한 역할을 암시한다. 게다가, VEGF는 종양 및 안내 질환과 관련된 혈관신생의 핵심 매개자로 보인다 (상기 Ferrara et al., Endocr. Rev.). VEGF의 mRNA는 조사한 인간 종양의 대다수에 의해 과발현된다 (Berkman et al., J. Clin. Invest., 91: 153-159 (1993); Brown et al., Human Pathol., 26: 86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res., 53: 4727-4735 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer, 73: 931-934 (1996); Dvorak et al., Am. J. Pathol., 146: 1029-1039 (1995)).
또한, 눈액의 VEGF의 농도 수준은 당뇨성 망막병증 및 기타 허혈-관련 망막병증을 앓는 환자 혈관의 활발한 증식의 존재와 밀접하게 관련되어 있다 (Aiello et al., N. Engl. J. Med., 331: 1480-1487 (1994)). 게다가, 최근 연구는 AMD에 걸린 환자의 맥락막의 신생혈관막에서 VEGF의 국소화를 입증하였다 (Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 37: 855-868 (1996)).
항-VEGF 중성화 황체는 누드 마우스에서 다양한 인간 종양세포주의 성장을 억제하고 (Kim et al., Nature, 362: 841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest., 95: 1789-1797 (1995); Borgstrom et al., Cancer Res., 56: 4032-4039 (1996); Melnyk et al., Cancer Res., 56: 921-924 (1996)), 허혈성 망막 질환의 모델에서 안내 혈관신생을 억제하기도 한다 (Adamis et al., Arch. Ophthalmol., 114: 66-71 (1996)). 그러므로, 항-VEGF 모노클로날 항체 또는 VEGF 활성의 다른 억제제는 고형 종양 및 다양한 안내 혈관신생성 질환의 치료용 물질일 가능성이 있다. 이러한 항체는 예를 들어, 1998년 1월 14에 공개된 EP 817,648 및 1998년 4월 3일에 출원된 PCT/US 98/06724에 기재되어 있다.
일부 세포에 의해 발현되는 복합적인 유전자 세트를 신속히 유도할 수 있는, 형질전이 종양유전자를 비롯한 여러 가지 다른 성장 인자 및 미토겐 (mitogen)이 존재한다 (Lau and Nathans, Molecular Aspects of Cellular Regulation, 6: 152-202 (1991)). 즉시 조기-반응 유전자 또는 조기-반응 유전자라고 불리는 이들 유전자는 새로운 단백질 합성과는 별개로 성장 인자 및 미토겐과 접촉한 후 수분 내에 전사 활성화된다. 이들 즉시 조기-반응 유전자 군은 분화 및 증식, 재생, 및 창상 치유와 같은 복합적인 생물학적 과정의 조정에 필요한 세포외 분비 단백질을 코딩한다 (Ryseck et al., Cell Growth Differ., 2: 235-233 (1991)).
이 군에 속하는 매우 관련된 단백질에는cef10 (Simmons et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1178-1182 (1989)), 혈청 또는 혈소판-유도 성장 인자 (PDGF)에 의해 신속히 활성화되는cyr61 (O'Brien et al., Mol. Cell Biol., 10: 3569-3577 (1990)), 형질전이 성장 인자 베타 (TGF-β)에 의해 활성화된 후 인간 혈관 내피세포에 의해 고농도로 분비되어 PDGF-유사 생물학적 및 면역학적 활성을 나타내고 특정한 세포 표면 수용체에 대해 PDGF와 경쟁하는 인간 결합 조직 성장 인자 (CTGF) (Bradham et al., J. Cell. Biol., 114: 1285-1294 (1991)),fisp-12 (Ryseck et al., Cell Growth Differ., 2: 235-233 (1991)), 인간 혈관 IBP-유사 성장 인자 (VIGF) (WO 96/17931), 및 골수아세포증-관련-바이러스-타입-1-유도 신모세포종에서 과발현되는 것으로 확인된, 성숙 신장 세포에서 정상적으로 억류되는nov가 포함된다 (Joloit et al., Mol. Cell Biol., 12: 10-21 (1992)).
이들 즉시 조기 유전자의 발현은 성장 인자에 의해 일어나는 사건의 케스케이드에서 '제3 메신저"로 작용한다. 또한, 상기 유전자는 세포 증식이 공통 사건인 분화 및 창상 치유와 같은 복합적인 생물학적 과정을 통합하고 조정하는 데 필요한 것으로 생각된다.
추가적인 미토겐으로서 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP)은 인슐린-유사 성장 인자 (IGF)와의 결합체로 섬유아세포 및 평활근 세포 표면 수용체와 IGF의 결합 증가를 자극시키는 것으로 확인되었다 (Clmmons et al., J. Clin. Invest., 77: 1548 (1986)). 시험관내에서 다양한 IGF 작용에 대한 IGFBP의 억제 효과는 지방세포에 의한 글루코스 수송의 자극, 연골세포에 의한 술페이트 혼입, 및 섬유아세포의 티미드 혼입을 포함한다 (Zapf et al., J. Clin. Invest., 63: 1077 (1979)). 또한, 정상 세포에서 성장 인자-매개 미토겐 활성에 대한 IGFBP의 억제 효과가 나타났다.
C. 추가 치료에 대한 필요성
많은 질환 및 장애에서 혈관 내피세포 성장 및 혈관신생의 역할 면에서, 이들 과정을 야기하는 한 가지 이상의 생물학적효과를 감소 또는 억제시키는 방법이 있는 것이 바람직하다. 또한, 정상 및 질환 상태, 및 특히 암에서 병원성 폴리펩티드의 존재를 검정하는 방법이 있는 것이 바람직하다. 추가로, 특정한 측면에서, 심장 비대증의 치료를 위한 일반적으로 허용가능한 치료법이 없기 때문에, 심근세포 비대증을 예방 또는 감소시킬 수 있는 인자의 확인은 병리생리학적 심장 성장을억제하는 신규 치료법의 개발에 1차적으로 중요하다. 다양한 심혈관 질환 및 종양 질환을 위한 여러 가지 치료법이 있지만 추가적인 치료법이 필요하다.
<발명의 요약>
A. 실시양태
따라서, 본 발명은 포유동물의 혈관신생 및(또는) 심혈관형성을 촉진 또는 억제하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 일부 생물학적 활성의 촉진 및 억제를 시험하는 다양한 심혈관 검정에서 양성으로 시험된 단백질의 확인을 기초로 한다. 따라서, 본 단백질은 혈관신생의 촉진 또는 억제, 혈관 내피세포 성장의 억제 또는 자극, 혈관 내피세포의 성장 또는 증식의 자극, 종양 성장의 억제, 혈관신생-의존성 조직 성장의 억제, 혈관신생-의존성 조직 성장의 자극, 심장 비대증의 억제 및 심장 비대증의 자극과 같은 효과가 필요한 질환의 치료 (예방을 포함함) 및 진단, 예를 들어 울혈성 심부전의 치료에 유용한 약물인 것으로 생각된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 PRO 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 측면에서, 상기 조성물은 치료 유효량의 상기 폴리펩티드를 포함한다. 또다른 측면에서, 상기 조성물은 추가 활성 성분, 즉 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제, 바람직하게는 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 멸균 상태이다. 상기 PRO 폴리펩티드는 저장 안정성을 연장시키기 위해 보존가능한 액상 제약 제제의 형태로 투여될 수 있다. 보존된 액상 제약 제제는 PRO 폴리펩티드의 다회 용량을 함유할 수 있으므로 반복 사용하기에 적당할것이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체와 치료 유효량의 PRO 폴리펩티드를 혼합하는 것을 포함하는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 치료에 유용한 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 측면에서, 상기 조성물은 치료 유효량의 아고니스트 또는 길항제를 포함한다. 또다른 측면에서, 상기 조성물은 추가 활성 성분, 즉 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관형성제, 또는 혈관신생 억제제, 바람직하게는 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 멸균 상태이다. 상기 PRO 폴리펩티드 아고니스트 또는 길항제는 저장 안정성을 연장시키기 위해 보존가능한 액상 제약 제제의 형태로 투여될 수 있다. 보존된 액상 제약 제제는 PRO 폴리펩티드 아고니스트 또는 길항제의 다회 용량을 함유할 수 있으므로 반복 사용하기에 적당할 것이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체와 치료 유효량의 PRO 폴리펩티드 아고니스트 또는 길항제를 혼합하는 것을 포함하는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 치료에 유용한 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 항-PRO 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 조성물은치료 유효량의 상기 항체를 포함한다. 또다른 측면에서, 상기 조성물은 추가 활성 성분, 즉 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관형성제, 또는 혈관신생 억제제, 바람직하게는 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 멸균 상태이다. 상기 조성물은 저장 안정성을 연장시키기 위해 보존가능한 액상 제약 제제의 형태로 투여될 수 있다. 보존된 액상 제약 제제는 항-PRO 항체의 다회 용량을 함유할 수 있으므로 반복 사용하기에 적당할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 모노클로날 항체, 항체 단편, 인간화된 항체 또는 단일쇄 항체이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체와 치료 유효량의 항-PRO 항체를 혼합하는 것을 포함하는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 치료에 유용한 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은
(a) PRO 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트 또는 길항제를 포함하는 물질 조성물;
(b) 상기 조성물을 함유하는 용기; 및
(c) 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 치료에 있어서 상기 PRO 폴리펩티드, 또는 상기 PRO 폴리펩티드에 결합하는 항체일 수 있는 그의 아고니스트 또는 길항제의 용도를 언급하는, 상기 용기에 부착된 표지 또는 상기 용기에 포함된 포장 삽입물
을 포함하는 제품을 제공한다. 상기 조성물은 치료 유효량의 상기 PRO 폴리펩티드또는 그의 아고니스트 또는 길항제를 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은
(a) PRO 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도된 세포 반응을 유도하기에 적합한 조건 하에서 세포와 스크리닝할 시험 화합물을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시험 화합물이 효과적인 아고니스트인지를 결정하기 위해 상기 세포 반응의 유도를 확인하는 단계 (여기서, 상기 세포 반응의 유도는 상기 시험 화합물이 효과적인 아고니스트라는 표시임)
를 포함하는, PRO 폴리펩티드의 아고니스트를 확인하는 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은
(a) PRO 폴리펩티드에 의한 세포 증식의 자극에 적당한 조건 하에서 세포와 스크리닝할 시험 화합물을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시험 화합물이 효과적인 길항제인지를 결정하기 위해 상기 세포의 증식을 측정하는 단계 (여기서, 세포 증식의 자극은 상기 시험 화합물이 효과적인 길항제라는 표시임)
를 포함하는, PRO 폴리펩티드의 길항제를 확인하는 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 시험 화합물과 폴리펩티드가 상호작용하기에 충분한 조건 하에서, 충분한 시간동안 시험 화합물을 PRO 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, 및 상기 PRO 폴리펩티드의 활성이 억제되지를 확인하는 단계를 포함하는, PRO 폴리펩티드의 활성을 억제하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 바람직한 특정 측면에서, 상기 시험 화합물 또는 PRO 폴리펩티드는 고형 지지체 상에부착되어 있다. 또다른 바람직한 측면에서, 부착되지 않은 성분은 탐지가능한 표지를 수반한다. 바람직한 측면에서, 본 방법은
(a) PRO 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도된 세포 반응을 유도하기에 적합한 조건 하에, PRO 폴리펩티드의 존재 하에서 세포와 스크리닝할 시험 화합물을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시험 화합물이 효과적인 아고니스트인지를 결정하기 위해 상기 세포 반응의 유도를 확인하는 단계
를 포함한다.
또다른 바람직한 측면에서, 본 방법은
a) PRO 폴리펩티드에 의한 세포 증식의 자극에 적당한 조건 하에, PRO 폴리펩티드의 존재 하에서 세포와 스크리닝할 시험 화합물을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시험 화합물이 효과적인 길항제인지를 결정하기 위해 상기 세포의 증식을 측정하는 단계
를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 정상적으로 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 PRO 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물을 확인하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 방법은 시험 화합물과 세포를 접촉시키고, 상기 PRO 폴리펩티드의 발현이 억제되는지를 확인하는 것을 포함한다. 바람직한 측면에서, 이 방법은
(a) 상기 PRO 폴리펩티드의 발현을 허용하기에 적합한 조건 하에서 세포와 스크리닝할 시험 화합물을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 폴리펩티드의 발현 억제를 확인하는 단계
를 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 상기 방법에 의해 확인된 화합물과 같은, PRO 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물을 제공한다.
본 발명의 또다른 측면은 임의로 상기 기재한 방법에 의해 확인될 수 있는 PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제에 관한 것이다.
상기 PRO 폴리펩티드의 한 가지 이상의 기능 또는 활성을 억제하는 PRO 폴리펩티드의 한 가지 유형의 길항제는 항체이다. 따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 바람직한 측면에서, 상기 항체는 바람직하게는 비인간 상보성-결정-영역 (CDR) 잔기 및 인간 골격-영역 (FR) 잔기를 갖는 모노클로날 항체이다. 상기 항체는 표지할 수 있고 고상 지지체 상에 부착시킬 수 있다. 추가 측면에서, 상기 항체는 항체 단편, 단일쇄 항체 또는 인간화된 항체이다. 바람직하게는, 상기 항체는 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.
추가 측면에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드 핵산 서열에서 상기 돌연변이의 존재 또는 부재를 확인하는 것을 포함하는, PRO 폴리펩티드-코딩 핵산 서열에 있는 돌연변이와 관련된 질병 또는 이 질병에 대한 민감성을 진단하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 돌연변이의 존재 또는 부재는 상기 질병의 존재 또는 상기 질병에 대한 민감성의 표시이다.
추가 측면에서, (a) 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플 및 (b) 동일한 세포형의 공지된 정상 조직 세포의 대조군 샘플에서 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현도를 분석하는 것을 포함하는, 상기 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 진단하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 대조군 샘플과 비교할 때 시험 샘플의 보다 높은, 또는 보다 낮은 발현도는 상기 포유동물에서 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 존재를 표시한다. PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현은 대조군 샘플과 비교할 때 시험 샘플에서 mRNA 또는 상기 폴리펩티드의 농도를 측정함으로써 임의로 달성될 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플에서 PRO 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는, 상기 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 진단하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 시험 샘플에서 상기 PRO 폴리펩티드의 존재 또는 부재는 상기 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 존재를 표시한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 (a) 항-PRO 항체를 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플과 접촉시키는 단계, 및 (b) 시험 샘플에서 상기 항체와 상기 PRO 폴리펩티드 사이의 결합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 진단하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 결합체의 형성은 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 존재를 표시한다. 상기 검출은 정성적 또는 정량적일 수 있고, 동일한 세포형의 공지된 정상 조직 세포의 대조군 샘플의 결합체 형성을 관찰하면서 비교하여 수행한다. 상기 시험 샘플에서 형성된 많은 또는 적은 양의 결합체는 시험 조직 세포를 얻은 포유동물에서 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 존재를 표시한다. 바람직하게는, 상기 항체는 탐지가능한 표지를 수반한다. 결합체 형성은 예를 들어, 당분야에 공지된 광학 현미경, 유량 세포측정기 (flow cytometry), 플루오리메트리 (fluorimetry) 또는 다른 기술로 관찰할 수 있다. 상기 시험 샘플은 대개 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환에 걸린 것으로 의심되는 개체로부터 수득한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 PRO 폴리펩티드를 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 항-PRO 항체에 노출시키고 상기 항체가 상기 샘플의 성분에 결합하는 것을 확인하는 단계를 포함하는, 샘플에서 PRO 폴리펩티드의 존재를 확인하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 상기 샘플은 PRO 폴리펩티드를 함유하는 것으로 의심되는 세포를 포함하고, 상기 항체는 상기 세포에 결합한다. 바람직하게는, 상기 항체는 탐지가능하게 표지되어 있고(있거나) 고형 지지체에 결합되어 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 적당한 포장안에 항-PRO 항체 및 담체를 포함하는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환용 진단 키트를 제공한다. 바람직하게는, 이러한 키트는 PRO 폴리펩티드의 존재를 검출하기 위해 상기 항체를 사용하기 위한 지시물을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 담체는 예를 들어, 완충용액이다. 바람직하게는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 암이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 PRO 폴리펩티드를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생질환을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 질환은 심비대증, 창상 또는 화상과 같은 외상, 또는 암 유형이다. 추가 측면에서, 상기 포유동물은 혈관성형술, 또는 ACE 억제제 또는 화학요법제 (상기 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환이 암 유형인 경우)와 같은 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 치료하는 약물에 노출된다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간, 바람직하게는 심비대증으로 발전할 위험이 있는 인간, 보다 바람직하게는 심근경색증을 앓는 인간이다.
또다른 바람직한 측면에서, 심비대증은 고농도 PGF2α의 존재에 의해 특징지워진다. 별법으로, 심비대증은 심근경색증에 의해 유도될 수 있는데, 여기서 바람직하게는 상기 PRO 폴리펩티드의 투여는 심근경색 후 48시간 내, 보다 바람직하게는 24시간 내에 개시된다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 심비대증이고, 상기 PRO 폴리펩티드는 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관형성제과 함께 투여한다. 이러한 목적을 위한 바람직한 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관형성제는 항고혈압 약물, ACE 억제제, 엔토텔린 수용체 길항제 및 혈전용해제로 구성된 군에서 선택된다. 혈전용해제를 투여하면, 바람직하게는 PRO 폴리펩티드는 상기 투여 후 투여한다. 보다 바람직하게는, 혈전용해제는 재조합 인간 조직 플라스미노겐 활성화제이다.
또다른 바람직한 측면에서, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 심비대증이고 급성 심근경색증의 치료를 위해 1차 혈관성형술 후 PRO 폴리펩티드를 투여하는데, 여기서 바람직하게는 상기 포유동물은 혈관성형술, 또는 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관형성제에 추가로 노출한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 암이고, 상기 PRO 폴리펩티드는 화학요법제, 성장 억제제 또는 세포독성제와 함께 투여한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 PRO 폴리펩티드 아고니스트를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 심비대증, 외상, 암 또는 연령-관련 황반퇴화증이다. 또한, 포유동물은 인간이고 유효량의 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 아고니스트와 함께 투여하는 것이 바람직하다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 PRO 폴리펩티드 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 심비대증, 외상, 암 또는 연령-관련 황반퇴화증이다. 또한, 포유동물은 인간이고 유효량의 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 길항제와 함께 투여하는 것이 바람직하다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 항-PRO 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 심비대증, 외상, 암 또는 연령-관련 황반퇴화증이다. 또한, 포유동물은 인간이고 유효량의 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 상기 항체와 함께 투여하는 것이 바람직하다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 코딩하는 핵산 분자를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 앓는 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 유전자는 생체외 유전자 치료법을 통해 투여한다. 바람직한 추가 실시양태에서, 상기 유전자는 벡터 내, 보다 바람직하게는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터 내에 포함되어 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본질적으로 프로모터, (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 폴리펩티드 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 코딩하는 핵산, 및 상기 폴리펩티드의 세포 분비용 신호 서열로 이루어진 레트로바이러스 벡터를 포함하는 재조합 레트로바이러스 입자를 제공하는 것으로, 여기서 상기 레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스 구조 단백질과 결합되어 있다. 바람직하게는, 상기 신호 서열은 천연 PRO 폴리펩티드와 같은 포유동물로부터 유래한 것이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 레트로바이러스 구조 단백질을 발현하고, 본질적으로 프로모터, (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 폴리펩티드 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 코딩하는 핵산, 및 상기 폴리펩티드의 세포 분비용 신호 서열로 이루어진 레트로바이러스 벡터도 포함하는 핵산 구조물을 포함하는 생체외 생산 세포를 제공하는 것으로, 여기서 상기 생산 세포는 재조합 레트로바이러스 입자를 생산하기 위해 상기 구조 단백질과 결합되어 있는 레트로바이러스 벡터를 패키징한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 폴리펩티드 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 내피세포 성장을 억제하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 내피세포 성장은 억제되고 상기 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이고 상기 내피세포 성장은 종양 또는 망막질환과 관련되어 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 폴리펩티드 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 내피세포 성장을 자극하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 내피세포 성장은 자극되고 상기 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 폴리펩티드 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심비대증을 억제하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 심비대증은 억제되고 상기 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이고 상기 심비대증은 심근경색증에 의해 유도된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 폴리펩티드 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심비대증을 자극하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 심비대증은 자극되고 상기 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 울혈성 심부전을 앓는 인간이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 항-PRO 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 PRO 폴리펩티드에 의해 유도된 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이고, 보다 바람직하게는 상기 포유동물은 종양 또는 망막질환을 앓는다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 PRO 폴리펩티드를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 PRO 폴리펩티드에 의해 유도된 혈관신생을 자극하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이고, 보다 바람직하게는 혈관신생은 조직 재생 또는 창상 치유를 촉진할 것이다.
B. 추가 실시양태
본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
한 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 개시된 전장 아미노산 서열, 신호 펩티드가 없는 본원에 개시된 아미노산 서열, 신호 펩티드가 있거나 없는 본원에 개시된 막횡단 단백질의 세포외 도메인 또는 본원에 개시된 전장 아미노산 서열의 구체적으로 정의된 임의의 다른 단편을 갖는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 (a) DNA 분자의 상보체와 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 개시된 전장 PRO 폴리펩티드 cDNA의 코딩 서열, 신호 펩티드가 없는 본원에 개시된 PRO 폴리펩티드의 코딩 서열, 신호 펩티드가 있거나 없는 본원에 개시된 막횡단 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인의 코딩 서열 또는 본원에 개시된 전장 아미노산 서열의 구체적으로 정의된 임의의 다른 코딩 서열을 포함하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 (a) DNA 분자의 상보체와 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 (a) 본원에 개시된 ATCC에 기탁된 임의의 인간 단백질 cDNA에 의해 코딩되는 것과 동일한 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자 또는 (b) 상기 (a) DNA 분자의 상보체와 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 서열동일성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 막횡단 도메인이 결실되거나 막횡단 도메인이 불활성화된 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이러한 코딩 뉴클레오티드 서열에 상보적인 단리된 핵산 분자를 제공하는 것으로, 여기서 이러한 폴리펩티드의 막횡단 도메인(들)은 본원에 개시되어 있다. 그러므로, 본원에 기재된 PRO 폴리펩티드의 가용성 세포외 도메인도 포함된다.
또다른 실시양태는 임의로 항-PRO 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 PRO 폴리펩티드의 단편을 코딩하는 PRO 폴리펩티드 코딩 서열의 단편 또는 그의 상보체에 관한 것으로, 상기 단편 또는 그의 상보체는 혼성화 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브로서 그 용도를 찾을 수 있다. 이러한 핵산 단편의 길이는 일반적으로 약 20개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약30개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 40개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 50개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 60개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 70개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 80개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 90개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 100개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 110개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 120개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 130개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 140개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 150개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 160개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 170개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 180개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 190개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 200개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 250개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 300개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 350개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 400개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 450개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 500개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 600개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 700개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 800개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 900개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 1000개 이상의 뉴클레오티드이고, 이 내용에서 용어 "약"은 상기 언급한 길이의 플러스 또는 마이너스 10%의 뉴클레오티드 서열 길이를 의미한다. 다수의 잘 공지된 임의의 서열 정렬 프로그램을 이용하여 다른 공지된 뉴클레오티드 서열과 PRO 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열을 정렬하고 어떤 PRO 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열 단편(들)이 신규한지를 결정하는 통상적인 방식으로 PRO 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열의 신규 단편을 결정할 수 있다는 것을 알아야 한다. 본원에서는 이러한 PRO 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열 모두를 고려한다. 또한, 이들 뉴클레오티드 분자 단편에 의해 코딩되는 PRO 폴리펩티드 단편, 바람직하게는 항-PRO 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 PRO 폴리펩티드 단편도 고려한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기에서 확인한 임의의 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 단리된 PRO 폴리펩티드를 제공한다.
일부 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 전장 아미노산 서열, 신호 펩티드가 없는 본원에 개시된 아미노산 서열, 신호 펩티드가 없는 본원에 개시된 막횡단 단백질의 세포외 도메인 또는 본원에 개시된 전장 아미노산 서열의 구체적으로 정의된 임의의 단편을 갖는 PRO 폴리펩티드와 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO 폴리펩티드에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 ATCC에 기탁된 임의의 인간 단백질 cDNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO 폴리펩티드에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 전장 아미노산 서열, 신호 펩티드가 없는 본원에 개시된 아미노산 서열, 신호 펩티드가 없는 본원에 개시된 막횡단 단백질의 세포외 도메인 또는 본원에 개시된 전장 아미노산 서열의 구체적으로 정의된 임의의 단편을 갖는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교할 때 약 80% 이상의 양성, 바람직하게는 약 81% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 양성을 기록하는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO 폴리펩티드에 관한 것이다.
특정 측면에서, 본 발명은 N-말단 신호 서열 및(또는) 개시 메티오닌이 없으며 상기와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단리된 PRO 폴리펩티드를 제공한다. 동일한 것을 생산하는 방법은 본원에도 기재되어 있는데, 여기서 상기 방법은 PRO 폴리펩티드의 발현에 적당한 조건 하에서 적당한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 세포 배양물로부터 상기 PRO 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 천연 PRO 폴리펩티드의 아고니스트 및 길항제에 관한 것이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체 또는 소분자이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드를 후보 분자와 접촉시키고 상기 PRO 폴리펩티드에 의해 매개되는 생물학적 활성을 관찰하는 것을 포함하는, PRO 폴리펩티드에 대한 아고니스트 또는 길항제를 확인하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, PRO 폴리펩티드는 천연 PRO 폴리펩티드이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 담체와 함께 본원에 기재된 PRO 폴리펩티드, 또는 PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PRO 항체를 포함하는 물질 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PRO 항체에 반응하는 질환의 치료에 유용한 약제를 제조하기 위한, 상기 기재한 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PRO 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재한 임의의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공한다. 예를 들어, 상기 숙주 세포는 CHO 세포, 대장균, 효모 또는 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포일 수 있다. 본원에 기재한 임의의 폴리펩티드를 제조하는 방법도 추가로 제공하고, 상기 방법은 원하는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고 이 세포 배양물로부터 원하는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 이종 폴리펩티드 또는 아미노산에 결합된 본원에 기재한 임의의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 제공한다. 이러한 키메라 분자의 예로는 이뮤노글로불린의 에피토프 태그 서열 또는 Fc 영역에 결합된 본원에 기재한 임의의 폴리펩티드를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 또는 하기 기재된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의로는, 상기 항체는 모노클로날 항체, 인간화된 항체, 항체 단편 또는 단일쇄 항체이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 안티센스 프로브로서 게놈 서열 및 cDNA 뉴클레오티드 서열을 단리하기에 유용한 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하는 것으로, 여기서 상기 프로브는 상기 또는 하기 기재된 임의의 뉴클레오티드 서열로부터 유도할 수 있다.
본 발명은 혈관신생 및(또는) 심혈관형성의 촉진 또는 억제 효과가 필요한 포유동물에서 이러한 혈관신생 및(또는) 심혈관형성을 촉진하거나 억제하기에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 이것은 종양 질환 뿐만 아니라 심혈관 질환의 진단 및 치료를 포함한다.
도 1은 천연 서열 PRO172 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 3)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 3은 본원에서 "DNA35916-1161"로 지칭하는 클론이다.
도 2는 도 1에 나타낸 서열 3의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 4)를 나타낸다.
도 3은 천연 서열 PRO178 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 8)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 8은 본원에서 "DNA23339-1130"으로 지칭하는 클론이다.
도 4는 도 3에 나타낸 서열 8의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 9)를 나타낸다.
도 5는 천연 서열 PRO179 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 13)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 13은 본원에서 "DNA16451-1388"로 지칭하는 클론이다.
도 6은 도 5에 나타낸 서열 13의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 14)를 나타낸다.
도 7은 천연 서열 PRO182 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 15)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 15는 본원에서 "DNA27865-1091"로 지칭하는 클론이다.
도 8은 도 7에 나타낸 서열 15의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 16)를 나타낸다.
도 9는 천연 서열 PRO187 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 20)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 20은 본원에서 "DNA27864-1155"로 지칭하는 클론이다.
도 10은 도 9에 나타낸 서열 20의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 21)를 나타낸다.
도 11은 천연 서열 PRO188 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 25)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 25는 본원에서 "DNA28497-1130"으로 지칭하는 클론이다.
도 12는 도 11에 나타낸 서열 25의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 26)를 나타낸다.
도 13은 천연 서열 PRO195 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 30)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 30는 본원에서 "DNA26847-1395"로 지칭하는 클론이다.
도 14는 도 13에 나타낸 서열 30의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 31)를 나타낸다.
도 15는 천연 서열 PRO212 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 35)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 35는 본원에서 "DNA30942-1134"로 지칭하는 클론이다.
도 16은 도 15에 나타낸 서열 35의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 36)를 나타낸다.
도 17은 천연 서열 PRO214 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 40)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 40은 본원에서 "DNA32286-1191"로 지칭하는 클론이다.
도 18은 도 17에 나타낸 서열 40의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 41)를 나타낸다.
도 19는 천연 서열 PRO217 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 45)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 45는 본원에서 "DNA33094-1131"로 지칭하는 클론이다.
도 20은 도 19에 나타낸 서열 45의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 46)를 나타낸다.
도 21은 천연 서열 PRO224 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 50)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 50은 본원에서 "DNA33221-1133"으로 지칭하는 클론이다.
도 22는 도 21에 나타낸 서열 50의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 51)를 나타낸다.
도 23은 천연 서열 PRO231 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 55)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 55는 본원에서 "DNA34434-1139"로 지칭하는 클론이다.
도 24는 도 23에 나타낸 서열 55의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 56)를 나타낸다.
도 25는 천연 서열 PRO235 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 61)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 61은 본원에서 "DNA35558-1167"로 지칭하는 클론이다.
도 26은 도 25에 나타낸 서열 61의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 62)를 나타낸다.
도 27은 천연 서열 PRO245 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 66)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 66은 본원에서 "DNA35638-1141"로 지칭하는 클론이다.
도 28은 도 27에 나타낸 서열 66의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 67)를 나타낸다.
도 29는 천연 서열 PRO261 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 71)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 71은 본원에서 "DNA33473-1176"으로 지칭하는 클론이다.
도 30은 도 29에 나타낸 서열 71의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 72)를 나타낸다.
도 31은 천연 서열 PRO269 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 76)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 76은 본원에서 "DNA38260-1180"으로 지칭하는 클론이다.
도 32는 도 31에 나타낸 서열 76의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 77)를 나타낸다.
도 33은 천연 서열 PRO287 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 84)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 84는 본원에서 "DNA39969-1185"로 지칭하는 클론이다.
도 34는 도 33에 나타낸 서열 84의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 85)를 나타낸다.
도 35는 천연 서열 PRO301 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 89)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 89는 본원에서 "DNA240628-1216"으로 지칭하는 클론이다.
도 36은 도 35에 나타낸 서열 89의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 90)를 나타낸다.
도 37은 천연 서열 PRO323 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 97)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 97은 본원에서 "DNA35595-1228"로 지칭하는 클론이다.
도 38은 도 37에 나타낸 서열 97의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 98)를 나타낸다.
도 39는 천연 서열 PRO331 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 106)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 106은 본원에서 "DNA40981-1234"로 지칭하는 클론이다.
도 40은 도 39에 나타낸 서열 106의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 107)를 나타낸다.
도 41은 천연 서열 PRO356 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 111)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 111은 본원에서 "DNA47470-1130-P1"로 지칭하는 클론이다.
도 42는 도 41에 나타낸 서열 111의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 112)를 나타낸다.
도 43은 천연 서열 PRO364 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 116)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 116은 본원에서 "DNA47365-1206"으로 지칭하는 클론이다.
도 44는 도 43에 나타낸 서열 116의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열(서열 117)를 나타낸다.
도 45는 천연 서열 PRO526 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 126)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 126은 본원에서 "DNA44184-1319"로 지칭하는 클론이다.
도 46은 도 45에 나타낸 서열 126의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 127)를 나타낸다.
도 47은 천연 서열 PRO538 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 131)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 131은 본원에서 "DNA48613-1268"로 지칭하는 클론이다.
도 48은 도 47에 나타낸 서열 131의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 132)를 나타낸다.
도 49는 천연 서열 PRO713 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 136)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 136은 본원에서 "DNA29101-1122"로 지칭하는 클론이다.
도 50은 도 49에 나타낸 서열 136의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 137)를 나타낸다.
도 51은 천연 서열 PRO719 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 142)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 142는 본원에서 "DNA49646-1327"로 지칭하는 클론이다.
도 52는 도 51에 나타낸 서열 142의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 143)를 나타낸다.
도 53은 천연 서열 PRO771 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 147)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 147은 본원에서 "DNA49829-1346"으로 지칭하는 클론이다.
도 54는 도 53에 나타낸 서열 147의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열(서열 148)를 나타낸다.
도 55는 천연 서열 PRO788 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 152)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 152는 본원에서 "DNA56405-1357"로 지칭하는 클론이다.
도 56은 도 55에 나타낸 서열 152의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 153)를 나타낸다.
도 57은 천연 서열 PRO792 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 154)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 154는 본원에서 "DNA56352-1358"로 지칭하는 클론이다.
도 58은 도 57에 나타낸 서열 154의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 155)를 나타낸다.
도 59는 천연 서열 PRO812 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 159)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 159는 본원에서 "DNA59205-1421"으로 지칭하는 클론이다.
도 60은 도 59에 나타낸 서열 159의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 160)를 나타낸다.
도 61은 천연 서열 PRO865 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 161)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 161은 본원에서 "DNA53974-1401"로 지칭하는 클론이다.
도 62는 도 61에 나타낸 서열 161의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 162)를 나타낸다.
도 63은 천연 서열 PRO1075 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 169)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 169는 본원에서 "DNA57689-1385"로 지칭하는 클론이다.
도 64는 도 63에 나타낸 서열 169의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열(서열 170)를 나타낸다.
도 65는 천연 서열 PRO1126 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 180)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 180은 본원에서 "DNA60615-1483"으로 지칭하는 클론이다.
도 66은 도 65에 나타낸 서열 180의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 181)를 나타낸다.
도 67은 천연 서열 PRO1130 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 182)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 182는 본원에서 "DNA59814-1486"으로 지칭하는 클론이다.
도 68은 도 67에 나타낸 서열 182의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 183)를 나타낸다.
도 69는 천연 서열 PRO1154 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 190)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 190은 본원에서 "DNA59846-1503"으로 지칭하는 클론이다.
도 70은 도 69에 나타낸 서열 190의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 191)를 나타낸다.
도 71은 천연 서열 PRO1244 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 192)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 192는 본원에서 "DNA64883-1526"으로 지칭하는 클론이다.
도 72는 도 71에 나타낸 서열 192의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 193)를 나타낸다.
도 73은 천연 서열 PRO1246 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 194)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 194는 본원에서 "DNA64885-1529"으로 지칭하는 클론이다.
도 74는 도 73에 나타낸 서열 194의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열(서열 195)를 나타낸다.
도 75는 천연 서열 PRO1274 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 196)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 196은 본원에서 "DNA64889-1541"로 지칭하는 클론이다.
도 76은 도 75에 나타낸 서열 196의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 197)를 나타낸다.
도 77은 천연 서열 PRO1286 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 198)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 198은 본원에서 "DNA64903-1553"으로 지칭하는 클론이다.
도 78은 도 77에 나타낸 서열 198의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 199)를 나타낸다.
도 79는 천연 서열 PRO1294 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 200)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 200은 본원에서 "DNA64905-1558"으로 지칭하는 클론이다.
도 80은 도 79에 나타낸 서열 200의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 201)를 나타낸다.
도 81은 천연 서열 PRO1303 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 202)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 202는 본원에서 "DNA65409-1566"으로 지칭하는 클론이다.
도 82는 도 81에 나타낸 서열 202의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 206)를 나타낸다.
도 83은 천연 서열 PRO1304 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 204)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 204는 본원에서 "DNA65406-1567"로 지칭하는 클론이다.
도 84는 도 83에 나타낸 서열 204의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열(서열 205)를 나타낸다.
도 85는 천연 서열 PRO1312 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 213)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 213은 본원에서 "DNA61873-1574"로 지칭하는 클론이다.
도 86은 도 85에 나타낸 서열 213의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 214)를 나타낸다.
도 87은 천연 서열 PRO1313 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 215)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 215는 본원에서 "DNA64966-1575"로 지칭하는 클론이다.
도 88은 도 87에 나타낸 서열 215의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 216)를 나타낸다.
도 89는 천연 서열 PRO1376 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 217)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 217은 본원에서 "DNA67300-1605"로 지칭하는 클론이다.
도 90은 도 89에 나타낸 서열 217의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 218)를 나타낸다.
도 91은 천연 서열 PRO1387 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 219)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 219는 본원에서 "DNA68872-1620"으로 지칭하는 클론이다.
도 92는 도 91에 나타낸 서열 219의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 220)를 나타낸다.
도 93은 천연 서열 PRO1561 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 221)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 221은 본원에서 "DNA76538-1670"으로 지칭하는 클론이다.
도 94는 도 93에 나타낸 서열 221의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열(서열 222)를 나타낸다.
도 95는 천연 서열 PRO216 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 226)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 226은 본원에서 "DNA33087"로 지칭하는 클론이다.
도 96은 도 95에 나타낸 서열 226의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 227)를 나타낸다.
1. 정의
어구 "심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환", "심혈관 장애, 내피세포 장애 및 혈관신생 장애", "심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환" 및 "심혈관 장애, 내피세포 장애 또는 혈관신생 장애"는 교환가능하게 사용되고 동맥, 모세혈관, 정맥 및(또는) 림프관과 같은 혈관 자체의 질병 뿐만 아니라 부분적으로는 당뇨병과 같은, 혈관에 영향을 미치는 전신 질환을 말한다. 이는 혈관신생 및(또는) 심혈관형성을 자극하는 징후, 및 혈관신생 및(또는) 심혈관형성을 억제하는 징후를 포함한다. 이러한 질병에는 예를 들어, 죽상경화증, 고혈압, 염증성 혈관염, 레이나우드병 및 레이나우드 증후군, 동맥류 및 동맥성 재발협착증과 같은 동맥 질환; 혈전성정맥염, 림프관염 및 림프부종과 같은 정맥 및 림프관 질환; 말초 혈관 질환, 혈관 종양 (예컨대, 혈관종 (모세혈관 및 해면), 사구 종양, 모세혈관확장증, 세균성 혈관종증, 혈관내피종, 혈관육종, 혈관외피세포종, 카포시 육종, 림프관종 및 림프관육종)과 같은 암, 종양 혈관신생, 창상, 화상, 기타 손상 조직과 같은 외상, 이식물 고착, 흉터형성, 허혈성 재관류 손상, 류마티스성 관절염,뇌혈관 질환, 급성 신부전과 같은 신장 질환 및 골다공증과 같은 기타 혈관 질환이 포함된다. 상기 질병에는 협심증, 급성 심근경색증과 같은 심근경색증, 심비대증, 및 CHF와 같은 심부전도 포함된다.
본원에 사용된 "비대증"은 종양 형성을 수반하지 않는 자연적인 성장과는 독립적으로 기관 또는 구조 질량의 증가로 정의한다. 기관 또는 조직의 비대증은 개별 세포의 질량 증가 (진정한 의미의 비대증) 또는 상기 조직을 구성하는 세포 수의 증가, 또는 둘다에 기인한다. 심장과 같은 일부 기관은 생후 즉시 분열하는 능력을 상실한다. 따라서, "심비대증"은 세포 분열을 수반하지 않는, 근세포 크기 및 수축 단백질 함량의 증가에 의해 특징지워지는, 성인의 심장 질량의 증가로 정의된다. 비대증을 자극시키는 스트레스 (예컨대, 심근경색증에서와 같이 증가된 전(前)하중, 증가된 후(後)하중, 근세포의 손실 또는 수축성 일차 우울증)의 특징은 반응성을 결정하는 데 결정적인 역할을 하는 듯하다. 심비대증의 초기 단계는 일반적으로 미토콘드리아 및 핵의 팽창 뿐만 아니라 근섬유 및 미토콘드리아의 크기 증가에 의해 형태학적으로 특징지워진다. 이 단계에서, 근세포는 정상세포보다 크지만 세포 조직화는 대부분 보존된다. 심비대증의 진행 단계에서, 미토콘드리아와 같은 특정 소기관의 크기 또는 수가 월등히 증가되어 있고, 새로운 수축 요소가 불규칙적인 방식으로 세포의 국소 구역에 첨가된다. 오랜동안 비대화된 세포는 인접한 근섬유를 대체하고 정상적인 Z-밴드 표시의 분해를 야기하는 고도의 소엽막이 있는 현저히 팽창된 핵을 비롯하여 세포 조직화에서 보다 분명한 붕괴를 보인다. 어구 "심비대증"은 근원적인 심질환과는 관계없이 심근의 다양한 구조적 손상도에의해 특징지워지는, 이 질환의 모든 발전 단계를 포함하는 것으로 사용한다. 그러므로, 상기 용어는 고혈압, 대동맥 협착증, 또는 심근경색증의 발달에 수단이 되는 생리적인 상태도 포함한다.
"심부전"은 심장이 조직 대사의 요구에 필요한 속도로 혈액을 펌프하지 않는 심장 기능의 비정상성을 말한다. 심부전은 허혈성, 울혈성, 류마티스성 또는 특발성 형태를 포함한 다수의 인자에 의해 야기될 수 있다.
"울혈성 심부전" (CHF)은 심장이 산소를 포함한 혈액을 말초 조직에 전달하기에 적당한 심박 출량 (일정 시간에 걸쳐 심장에 의해 펌프되는 혈액 부피)을 점차적으로 공급할 수 없는 진행성 병적 상태이다. CHF가 진행됨에 따라, 구조적 및 혈액동력학적 손상이 일어난다. 이들 손상은 다양한 증상을 나타내지만 한 가지 특징적인 증상은 심실 비대증이다. CHF는 많은 다양한 심장 질환의 공통적인 결과이다.
"심근경색증"은 종종 중복성 관상 혈전증이 있는 관상 동맥의 죽상경화증으로부터 일반적으로 발생한다. 심근경색증은 두 가지 주요 유형, 즉 심근괴사가 전체층의 심실벽을 수반하는 전층경색증, 및 괴사가 심실벽을 통해 심장외막까지 내내 뻗어 있지 않고 심내막하층, 벽내심근층 또는 둘다를 수반하는 심내막하(비전층)경색증으로 나눌 수 있다. 심근경색증은 손상된 심장 구역 및 건강한 심장 구역에서 혈액동력학적 효과의 변화 및 구조의 변이 둘다를 초래하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 예를 들어 심근경색증은 심장의 최대 심박 출량 및 졸중을 감소시킨다. 또한, 영향받지 않은 심장 구역에서 콜라겐 합성의 증가 뿐만 아니라 틈에서 일어나는 DNA 합성의 자극은 심근경색증과 관련되어 있다.
예를 들어, 증가된 총 말초저항으로 인한 지속성 고혈압에서 심장에 가해지는 증가된 스트레스 또는 피로의 결과로서 심비대증은 "고혈압"과 관련된지 오래되었다. 만성 압력 과부하의 결과로 비대하게 된 심실의 특징은 손상된 확장 수행능력이다 (Fouad et al., J. Am. Coll. Cardiol., 4: 1500-1506 (1984); Smith et al., J. Am. Coll. Cardiol., 5: 869-874 (1985)). 지속성 좌심실 이완은 정상 또는 최정상 수축 기능에도 불구하고 초기 필수 고혈압에서 관찰된 바 있다 (Hartford et al., Hypertension, 6: 329-338 (1984)). 그러나, 혈압 수준과 심비대증 사이에 밀접한 대응관계는 없다. 항고혈압 치료법에 대해 반응하는 좌심실 기능의 개선이 인간에서 보고되었더라도, 이뇨제 (히드로클로로티아지드), β-차단제 (프로프라놀올) 또는 칼슘 채널 차단제 (딜티아젬)로 다양하게 치료받은 환자는 이뇨 기능의 향상 없이 좌심실 비대증의 역전을 나타낸 바 있다 (Inouye et al., Am. J. Cardiol., 53: 1583-7 (1984)).
심비대증과 관련된 또다른 복합성 심장 질환은 "비대증성 심근병증"이다. 이 질환은 형태적, 기능적 및 임상적 특징의 높은 다양성 (Maron et al., N. Engl. J. Med., 316: 780-789 (1987); Spirito et al., N. Engl. J. Med., 320: 749-755 (1989); Louie and Edwards, Prog. Cardiovasc. Dis., 36: 275-308 (1994); Wigle et al., Circulation, 92: 1680-1692 (1995)), 및 상기 질환이 모든 연령의 환자를 고생시킨다는 사실에 의해 강조되는 이질성 (Spirito et al., N. Engl. J. Med., 336: 775-785 (1997))에 의해 특징지워진다. 비대증성 심근병증의 원인 인자도 다양하고 거의 알려져 있지 않다. 일반적으로, 근절 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이는 비대증성 심근병증과 관련되어 있다. 최근 데이타는 β-미요신 중쇄 돌연변이가 가족성 비대증성 심근병증 경우의 약 30 내지 40%의 원인일 수 있다고 제시한다 (Warkins et al., N. Engl. J. Med., 326: 1108-1114 (1992); Schwartz et al., Circulation, 91: 532-540 (1995); Marian and Roberts, Circulation, 92: 1336-1347 (1995); Thierfelder et al., Cell, 77: 701-712 (1994); Watkins et al., Nat. Gen., 11: 434-437 (1995)). β-미요신 중쇄 이외에 다른 위치의 유전자 돌연변이에는 심장 트로포닌 T. 알파 토포미요신, 심장 미요신 결합 단백질 C, 필수 미요신 경쇄 및 조절 미요신 경쇄가 포함된다 (Malik and Watkins. Curr. Opin. Cardiol., 12: 295-302 (1997) 참조).
판상부 "대동맥 협착증"은 오름대동맥의 협착에 의해 특징지워지는 유전성 혈관 질환이지만, 폐동맥을 포함한 다른 동맥도 영향받을 수 있다. 치료받지 않은 대동맥 협착증은 심장내 혈압을 상승시키고, 이 심장내 혈압 상승은 심근비대증을 초래해서 결국 심부전 및 사망에 이르게 한다. 이 질환의 발병기작은 완전히 이해되지 않았지만, 내측평활근의 비대증과 아마도 증식증이 이 질환의 두드러진 특징이다. 엘라스틴 유전자의 분자 변이체가 대동맥 협착증의 발달 및 발병기작에 관여하는 것으로 보고된 바 있다 (1997년 7월 22일 발행된 미국 특허 제5,650,282호).
"판역류량"은 심장 판막 질환을 초래하는 심장 질환의 결과로 일어난다. 류마티스열과 같은 다양한 질환은 판막구와는 관계없는 수축 또는 당기기를 초래할수 있지만, 다른 질병은 심내막염, 심내막 또는 방실구 내막의 염증 및 심장 수술을 초래할 수 있다. 판막 협착증의 협착 또는 판막의 결손 폐쇄와 같은 결함은 심강의 혈액 축적 또는 판막을 지나는 혈액의 역류를 초래한다. 지속성 판막 협착증 또는 지속성 판막 부전은 치료하지 않으면 심비대증 및 심근에 관련된 손상을 초래할 수 있는데, 이러한 손상은 결국 판막 교체를 필요로 한다.
본 발명은 심비대증이 동반될 수 있거나 동반될 수 없는 이들 모든 질환, 및 기타 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 치료를 포함한다.
용어 "암", "암의" 및 "악성의"는 조절받지 않는 세포 성장이 전형적인 특징인 포유동물의 생리학적 상태를 말하거나 기술한다. 암의 예로는 선암종, 림프종, 모세포종, 흑색종, 육종 및 백혈병을 비롯한 암이 있으나, 여기에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예로는 편평 세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 위장암, 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종, 췌장암, 교모세포종, 자궁암, 난소암, 간암 (예컨대, 간암종 및 간세포암), 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 침샘암, 신장암 (예컨대, 신세포암 및 윌름스 종양), 기저세포암, 흑색종, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 고환암, 식도암 및 다양한 유형의 머리와 목 암이 있다. 본원에서 치료하기에 바람직한 암은 유방암, 결장암, 폐암, 흑색종, 난소암 및 상기에 기재한 혈관종양을 수반하는 다른 암이다.
본원에서 사용한 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 방해하여 세포를 파괴시키는 물질을 말한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어,131I,125I,90Y 및186Re), 화학요법제, 및 세균, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소 활성 독소와 같은 독소 또는 그의 단편을 포함하는 것으로 한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화합물이다. 화학요법제의 예로는 알킬화제, 폴산 길항제, 핵산 대사의 항-대사물질, 항생제, 피리미딘 동족체, 5-플루오로우라실, 시스플라틴, 퓨린 뉴클레오시드, 아민, 아미노산, 트리아졸 뉴클레오시드 또는 코르티코스테로이드가 있다. 구체적인 예로는 아드리아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 시톡신, 탁솔, 톡소테레, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포사이드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크레이스틴, 빈오렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신 (미국 특허 제4,675,187호), 멜팔란 및 다른 관련 질소 겨자가 있다. 이 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 호르몬제, 예컨대 타모시펜 및 오나프리스톤도 포함된다.
본원에 사용된 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포, 예컨대 Wnt-과다발현 암세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 말한다. 따라서, 성장 억제제는 S기에서 종양세포의 비율을 상당히 감소시킨다. 성장 억제제의 예로는 세포 주기 진행 (S기 이외의 상태에서)을 차단하는 물질, 예컨대 G1-기 정체 및 M-기 정체를 유도하는 물질이 있다. 전형적인 M-기 차단제로는 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔 및 토포 II 억제제 (예컨대, 독소루비신, 다우노루비신, 에토포사이드 및 블레오마이신)가 있다. G1을 정제하는 물질, 예컨대 타모시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로로에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C와 같은 DNA 알킬화제는 S-기로도 누출된다. 자세한 정보는 문헌 (The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders; Philadelphia, 1995), especially p.13)에서 찾을 수 있다. 추가적인 예로는 종양 괴사 인자 (TNF), 산성 또는 염기성 FGF 또는 간세포암 성장 인자 (FGF)의 혈관신생 활성을 억제 또는 중화할 수 있는 항체, 조직 인자, 단백질 C 또는 단백질 S (WO 91/01753, 1991년 2월 21일 공개)의 응고 활성을 억제하거나 중화할 수 있는 항체, 및 4D5 항체 (및 그의 기능적 등가물) (예를 들어, WO 92/22653)와 같이 HER2 수용체 (WO 89/06692)에 결합할 수 있는 항체가 있다.
"치료"는 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 발달을 예방하거나 상기 질환의 병리학을 바꾸기 위한 의도로 수행된 조정이다. 치료의 개념은 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 임의의 단계의 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 방지 (예방), 완화, 경감 및 치유를 포함한다. 따라서, "치료"는 치료적인 치료 및 예방 또는 방지 처치 둘다를 말하는 것으로, 이 때 목적은 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 비대증과 같은 혈관신생 질환을 예방하거나 늦추는 것이다. 치료가 필요한 대상은 상기 질환에 걸리기 쉬운 대상 또는 상기질환을 예방한 대상 뿐만 아니라 이미 상기 질환을 앓는 대상을 포함한다. 상기 질환은 특발성, 심장친화성 또는 근육친화성 원인을 비롯한 임의의 원인, 또는 심근경색증과 같은 허혈 또는 허혈성 발작으로부터 발생할 수 있다.
"만성" 투여는 항-비대증성 효과와 같은 초기 효과를 연장된 기간동안 유지하기 위해 급성 방식과는 반대인 연속 방식으로 약제(들)을 투여하는 것을 말한다.
치료 목적을 위한 "포유동물"은 인간, 가축 및 사육 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물 및 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소, 양, 돼지 등을 포함한 포유동물로 분류된 임의의 동물을 말한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
투여에 있어서 1종 이상의 추가 치료제와의 "조합으로"는 동시적인 투여 및 임의의 순서의 연속적인 투여를 포함한다.
어구 "심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관신생 약제"는 일반적으로 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환을 치료하는 데 작용하는 임의의 약물을 말한다. 심혈관계 약제의 예로는 혈관 질환에 작용하는 혈압, 심박동수, 심수축성, 및 내피성 근육과 평활근을 조절하여 혈관 항상성을 촉진하는 것이 있다. 이들의 구체적인 예로는 안지오텐신-III, 수용체 길항제; 엔도텔린 수용체 길항제, 예컨대 BOSENTANTM및 MOXONODINTM, 인터페론-감마 (INF-γ); 데스-아스파르테이트-안지오텐신 I; 혈전용해제, 예컨대 스트렙토키나제, 유로키나제, t-PA, 및 보다 긴 반감기 및 매우 높은 피브린 특이성을 갖도록 특이적으로 디자인된 t-PA, TNK t-PA (a T103N, N117Q, KHRR (296-299)AAAA t-PA 변이체, Keyt et al., Proc. Natl.Acad. Sci., USA 91, 3670-3674 (1994)); 디고시제닌 및 β-아드레날린성 수용체 차단제와 같은 수축촉진제 또는 고혈압제, 예컨대 프로프라놀올, 티몰올, 테르타롤올, 카르네올올, 나돌올, 베타솔올, 펜부톨올, 아세토부톨올, 아테놀올, 메토프롤올 및 카르베딜올; 안지오텐신 전환 효소 (ACE), 예컨대 퀴나프릴, 캅토프릴, 에날아프릴, 라미프릴, 벤아제프릴, 포시노프릴 및 리시노프릴; 이뇨제, 예컨대 클로로티아지드, 히드로클로로티아지드, 히드로플루메타지드, 메틸클로로티아지드, 벤즈티아지드, 디클로로펜아미드, 아세타졸아미드 및 인다프아미드; 및 칼슘 채널 차단제, 예컨대 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀, 니카르디핀이 있다. 이 유형의 한 가지 바람직한 카테고리는 혈압 상승, 대동맥 협착증 또는 심근경색증과 같은 심비대증의 발달에 수단이 되는 심비대증 또는 생리학적인 상태의 치료에 이용되는 치료제이다.
"혈관형성제" 및 "내피세포계 약제"는 혈관신생 및(또는) 내피세포 성장 또는, 적용가능하다면 혈관생성을 촉진하는 활성제이다. 이것은 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-I), VEGF, VIGF, PDGF, 표피 성장 인자 (EGF), CTGF 및 그의 구성원, 및 TGF-α와 TGF-β와 같은 창상 치유를 가속화하는 인자를 포함한다.
"혈관신생 억제제"는 혈관신생 또는 혈관생성을 억제하거나 암세포의 성장을 억제 또는 방해하는 활성제이다. 예로는 VEGF에 대한 항체와 같은, 상기 정의한 혈관형성제에 대한 항체 또는 다른 길항제가 있다. 추가적으로 이들은 세포치료제, 예컨대 세포독성제, 화학요법제, 성장 억제제, 아폽토시스제, 및 암으로 치료하는 다른 약제 (예컨대, 항-HER-2, 항-CD20, 다른 생물활성제 및 유기 화학제)를 포함한다.
제약학적 의미에서, 본 발명의 내용에서 PRO 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PRO 항체의 "치료 유효량"은 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 치료에 유효한 양이고 실험적으로 결정할 수 있다.
본원에 사용된 PRO 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PRO 항체의 "유효량"은 상기 목적을 수행하기에 유효한 양을 말하는데, 여기서 원하는 효과를 나타내는 양은 실험적으로 결정할 수 있다.
"PRO 폴리펩티드" 및 "PRO"란 본 명세서에 사용된 바와 같이 바로 뒤에 숫자가 붙어서 다양한 폴리펩티드를 의미하는데, 완전한 명칭(즉, PRO/숫자)은 본 명세서에 기재된 특정 폴리펩티드를 의미하는 용어이다. 본 명세서에 사용된 "PRO/숫자 폴리펩티드" 및 "PRO/숫자" (여기서 숫자 부분은 실제 수로 나타냄)는 천연 서열 폴리펩티드 및 폴리펩티드 변이체 (본 명세서에 추가로 정의됨)를 포함하는 용어이다. 본 명세서에 기재된 PRO 폴리펩티드는 인간 조직 또는 다른 출처와 같은 다양한 출처로부터 단리될 수 있거나 재조합 또는 합성에 의해 제조될 수 있다.
"천연 서열 PRO 폴리펩티드"는 자연으로부터 유도된 대응하는 PRO 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 PRO 폴리펩티드는 자연으로부터 단리할 수 있거나 재조합 또는 합성 방법으로 제조할 수 있다. 용어 "천연 서열 PRO 폴리펩티드"는 구체적으로는 특정 PRO 폴리펩티드의 자연발생 말단 절단 (truncated) 또는 분비된 형태 (예를 들어 세포외 도메인 서열), 이러한 폴리펩티드의 자연발생 변이체 (달리 스프라이싱된 형태) 및 자연발생 대립 변이체를 포함한다. 본 발명의 여러 실시양태에서, 본 명세서에서 기재된 천연 서열 PRO 폴리펩티드는 수반하는 도면에 나타낸 전장 아미노산 서열을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열 폴리펩티드이다. 개시 및 중지 코돈은 도면에서 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된다. 그러나, 본원에서 수반하는 도면에 개시된 PRO 폴리펩티드는 도면에서 아미노산 위치 1로 지칭하는 메티오닌 잔기로 시작하는 것으로 나타나 있지만, 도면에서 아미노산 위치 1로부터 위쪽 또는 아래쪽 부분에 위치한 다른 메티오닌 잔기가 PRO 폴리펩티드에 대한 출발 아미노산 잔기로 이용될 수 있다.
PRO 폴리펩티드 "세포외 도메인" 또는 "ECD"란 본질적으로 막횡단 또는 세포질 도메인이 없는 PRO 폴리펩티드의 형태를 의미한다. PRO 폴리펩티드 ECD는 통상 막횡단 및(또는) 세포질 도메인을 1% 미만으로 포함하며, 바람직하게는 상기 도메인들을 0.5% 미만으로 포함한다. 본 발명의 PRO 폴리펩티드에서 확인된 모든 막횡단 도메인은 당업계에서 소수성 도메인 유형을 밝히는 데 통상적으로 사용되는 기준에 준거하여 확인된 것임을 이해해야 할 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계선은 다를 수 있지만, 대부분은 본원에서 처음 확인된 도메인의 말단에서 5개 아미노산 범위 내에 존재한다. 따라서, PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인은 경우에 따라 실시예 및 상세한 설명에서 확인된 막횡단 도메인/세포외 도메인의 각 경계면에서 약 5개 이하의 아미노산을 포함할 수 있고, 결합된 신호 펩티드가 있거나 없는이러한 폴리펩티드, 및 이들을 코딩하는 핵산은 본 발명에 포함된다.
본원에 개시된 다양한 PRO 폴리펩티드의 "신호 펩티드"의 대략적인 위치는 수반하는 도면에 나타나 있다. 그러나, 신호 펩티드의 C-말단 경계는 다양할 수 있지만, 대부분은 본원에서 처음 확인된 신호 펩티드 C-말단의 각 경계면에서 아미노산은 약 5개 이하일 것을 알아야 하는데, 여기서 신호 펩티드의 C-말단 경계는 당업계에서 아미노산 서열 요소의 타입을 확인하는 데 통상적으로 이용되는 기준에 따라 확인될 수 있다 (예를 들어, Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1-6 (1997) 및 von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)). 게다가, 일부 경우에는 분비 폴리펩티드의 신호 서열의 절단이 전체적으로 동일하지 않아 1종 이상의 분비 폴리펩티드를 생성시킨다는 것을 인지해야 한다. 본원에서 확인된 신호 펩티드의 C-말단의 각 경계면에 있는 약 5개 이하의 아미노산 범위 내에서 신호 펩티드가 절단된 이들 성숙 폴리펩티드, 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 포함된다.
"PRO 폴리펩티드 변이체"는 본원에 개시된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 있거나 없는 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 앞서 또는 뒤에 정의된 활성 PRO 폴리펩티드을 의미한다. 이러한 PRO 폴리펩티드 변이체로는 예를 들어 전장 천연 아미노산 서열의 N 말단 또는 C 말단에 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가되거나 결실된PRO 폴리펩티드 등이 있다. 통상, PRO 폴리펩티드 변이체는 본원에서 개시된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 있거나 없는 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 가장 바람직하게는 약 99 % 이상이다. 통상적으로, PRO 변이체 폴리펩티드는 그 길이가 약 10개 이상의 아미노산, 흔히 약 20개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 30개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 40개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 50개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 60개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 70 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 80 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 90 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 100 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 150 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 200 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 300 개 이상의 아미노산 또는 그 이상이다.
아래에 나타낸 바와 같이, 표 1은 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램의 완전한 원시 코드를 제공한다. 이 원시 코드는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 제공하는 UNIX 작동계 상에서 사용하기 위해 통상적으로 편집될 수 있다.
추가로, 표 2A-2D는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 % 아미노산 서열 동일성 (표 2A-2B) 및 % 핵산 서열 동일성 (표 2C-2D)를 결정하기 위한 하기 기재된 방법을 사용하는 가설적인 실시예를 도시하며, 여기서, "PRO"는 관심있는 가정의 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "비교 단백질"은 관심있는 "PRO" 폴리펩티드를 비교할 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내며, "PRO-DNA"는 관심있는 가정의 PRO-코딩 핵산 서열을 나타내며, "비교 DNA"는 관심있는 "PRO-DNA" 핵산 분자를 비교할 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, "X", "Y" 및 "Z"는 각각 상이한 가정의 아미노산 잔기를 나타내며, "N", "L" 및 "V"는 각각 상이한 가정의 뉴클레오티드를 나타낸다.
<표 1>
<표 2A>
<표 2B>
<표 2C>
<표 2D>
본원에서 밝혀진 PRO 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 (%)"은 특정 PRO 폴리펩티드 서열과 후보 서열을 정렬하고, 필요한 경우 서열 동일성 퍼센트의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 상태에서 특정 PRO 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 (%)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업계의 숙련가는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대로 정렬시키기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하기에 적합한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 아미노산 서열 동일성 값(%)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수도 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 도 248A-Q에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인크사가 개발하였으며, 도 248A-Q에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱톤 D.C.에 소재)의 사용자 문서로 보관되어 있는데, 상기 코드는 미국 저작권 등록 제TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨텍, 인크사 (캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 쉽게 구할 수 있거나, 표 1에 기재된 원시 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 편집되어 이용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램으로 설정하고 다양하지 않다.
본원의 목적상 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. 이 방법을 이용한 아미노산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 2A-2B는 "PRO"로 지칭하는 아미노산 서열에 대한 "비교 단백질"로 지칭하는 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성 (%)을 계산하는 방법을 나타낸다.
달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 본원에 이용된 모든 아미노산 서열 동일성 값 (%)은 상기 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻는다. 그러나, 아미노산 서열 동일성 값 (%)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997)을 이용하여 얻을 수도 있다. 상기 NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정된다.
NCBI-BLAST2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 NCBI-BLAST2 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
아미노산 서열 동일성 값(%)은 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996))를 이용하여 결정할 수도 있다. WU-BLAST-2 검색 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정된다. 디폴트값으로 설정하지 않은 것들 즉, 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정된다: 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62. 본원의 목적을 달성하기 위해 아미노산 서열 동일성 값(%)은, 천연 PRO 폴리펩티드로부터 유도된 서열을 갖는 원하는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교되는 원하는 아미노산 서열 (즉, 원하는 PRO 폴리펩티드와 비교되는 서열로서 PRO 변이체 폴리펩티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 아미노산 잔기의 수를 WU-BLAST-2로 결정하여 얻고, 이를 원하는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 총 잔기수로 나누어 결정한다. 예를 들어, 아미노산 서열 B와 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 A를 포함하는 폴리펩티드"라는 말에서, 아미노산 서열 A는 비교하는 원하는 아미노산 서열이고 아미노산 서열 B는 원하는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
"PRO 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO 변이체 핵산 서열"은 아래 정의된 바와 같은 활성 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, 본원에 개시된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 PRO 폴리핍티드 서열, 본원에 개시된 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 여타의 다른 단편 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상인 핵산 분자이다. 보통 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 PRO 폴리핍티드 서열, 본원에 개시된 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 여타의 다른 단편 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90 % 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 약 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95 % 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 가장 바람직하게는 약 99 % 이상일 것이다. 변이체들은 천연 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.
보통 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 약 30개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 60 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 90 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 120 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 150 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 180 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 210 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 240 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 270 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 300 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 450 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 600 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 900 개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 이상이다.
본원에서 확인된 PRO 코딩 핵산 서열과 관련하여 "핵산 서열 동일성 (%)"은 특정 PRO 핵산 서열과 후보 서열을 정렬시키고, 필요한 경우 서열 동일성의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 특정 PRO 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열의 뉴클레오티드의 비율로서 정의된다. 핵산 서열 동일성 (%)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당분야에 숙련된 자들은 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하기 위한 적당한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 핵산 서열 동일성 값 (%)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수도 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 하기 표 1에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인크사가 개발하였으며, 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱톤 D.C.에 소재)의 사용자 문서로 보관되어있는데, 상기 코드는 미국 저작권 등록 제TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨텍, 인크사 (캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 쉽게 구할 수 있거나, 표 1에 기재된 원시 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 편집되어 이용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램으로 설정하고 다양하지 않다.
본원의 목적상, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (%)(주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
W/Z ×100
여기서, W는 C와 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (%)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. 핵산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 2C-2D는 "PRO-DNA"로 지칭하는 핵산 서열에 대한 "비교 DNA"로 지칭하는 핵산 서열의 핵산 서열 동일성 (%)을 계산하는 방법을 나타낸다.
달리 구체적으로 명시하지 않는 한, 핵산 서열 동일성 (%)은 하기 기재된 서열 비교 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있다. 그러나, 핵산 서열 동일성(%)은 하기 기재된 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2를 이용하여 계산할 수도 있다 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). 상기 NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정된다.
NCBI-BLAST2가 핵산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (%)(주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
W/Z ×100
여기서, W는 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (%)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
추가로, 핵산 서열 동일성 값(%)은 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996))를 이용하여 결정할 수도 있다. WU-BLAST-2 검색 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정된다. 디폴트값으로 설정하지 않은 것들 즉, 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정된다: 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62. 본원의 목적을 달성하기 위해 핵산 서열 동일성 값(%)은, 천연 PRO 폴리펩티드로부터 유도된 서열을 갖는 원하는 PRO 폴리펩티드의 핵산 서열과 비교되는 원하는 핵산 서열 (즉, 원하는 PRO 폴리펩티드와 비교되는 서열로서 PRO 변이체 폴리펩티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 뉴클레오티드 수를 WU-BLAST-2로 결정하여 얻고, 이를 원하는 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자의 총 뉴클레오티드 수로 나누어 결정한다. 예를 들어, 핵산 서열 B와 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 A를 포함하는 폴리펩티드"라는 말에서, 핵산 서열 A는 비교하는 원하는 핵산 서열이고 핵산 서열 B는 원하는 PRO 폴리펩티드의 핵산 서열이다.
다른 실시양태에서 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세척 조건 하에서 도 2 (서열 4), 도 4 (서열 9), 도 6 (서열 14), 도 8 (서열 16), 도 10 (서열 21), 도 12 (서열 26), 도 14 (서열 31), 도 16 (서열 36), 도 18 (서열 41), 도 20 (서열 46), 도 22 (서열 51), 도 24 (서열 56), 도 26 (서열 62), 도 28 (서열 67), 도 30 (서열 72), 도 32 (서열 77), 도 34 (서열 85), 도 36 (서열 90), 도 38 (서열 98), 도 40 (서열 107), 도 42 (서열 112), 도 44 (서열 117), 도 46 (서열 127), 도 48 (서열 132), 도 50 (서열 137), 도 52 (서열 143), 도 54 (서열 148), 도 56 (서열 153), 도 58 (서열 155), 도 60 (서열 160), 도 62 (서열 162), 도 64 (서열 170), 도 66 (서열 181), 도 68 (서열 183), 도 70(서열 191), 도 72 (서열 193), 도 74 (서열 195), 도 76 (서열 197), 도 78 (서열 199), 도 80 (서열 201), 도 82 (서열 203), 도 84 (서열 205), 도 86 (서열 214), 도 88 (서열 216), 도 90 (서열 218), 도 92 (서열 220), 도 94 (서열 222), 도 96 (서열 227) 각각에 나타낸 전장 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 활성 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자이다. PRO 변이체 폴리펩티드는 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
상기한 바와 같이 수행되는 서열 비교의 내용에서 "양성"이란 용어는 동일하지는 않으나 성질이 유사한 비교되는 서열의 아미노산 잔기를 의미한다. 원하는 아미노산 잔기에 대해 양성값을 기록하는 아미노산 잔기는 원하는 아미노산 잔기와 동일한 것이거나 원하는 아미노산 잔기의 바람직한 치환체 (하기 표 3에 정의된 바와 같음)이다.
본원의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 양성값 (%)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 양성값 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 상기에서 정의된 양성값을 기록하는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 양성값 (%)은 A에 대한 B의 양성값 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용된 "단리된"은 폴리펩티드가 확인되고, 그 자연 환경 요소로부터 분리 및(또는) 회수되었음을 의미한다. 폴리펩티드의 자연 환경의 오염 요소는 이 폴리펩티드의 진단 또는 치료적 사용을 일반적으로 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질 등이 있을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝컵 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제될 수 있다. PRO 폴리펩티드 자연 환경의 요소가 하나 이상 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 내에 존재하는 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 얻어질 것이다.
PRO 폴리펩티드를 코딩하는 "단리된" 핵산 또는 항-PRO 항체를 코딩하는 "단리된" 핵산 분자란 PRO-코딩 핵산의 천연 출처 또는 항-PRO-코딩 핵산의 천연 출처에서 통상적으로 관련되는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자라는 의미이다. 바람직하게는, 단리된 핵산은 천연적으로 관련되어 있는 모든 성분과의 결합으로부터 자유로운 상태이다. 단리된 PRO-코딩 핵산 분자 또는 단리된 항-PRO-코딩 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와는 다른 상태이다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 PRO-코딩 핵산 분자 또는항-PRO-코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 예를 들어, 상기 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하는 경우, PRO 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 항-PRO 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자에는 통상적으로 PRO 폴리펩티드 또는 항-PRO 항체를 발현하는 세포에 함유된 PRO-핵산 분자 또는 항-PRO핵산 분자가 포함된다.
용어 "조절 서열"이란 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열이다. 원핵생물에 적절한 조절 서열로는 예컨데 프로모터, 경우에 따라 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 들 수 있다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더 (leader)의 DNA는 해당 폴리펩티드가 분비되기 전의 형태인 전단백질로서 발현되는 경우 그 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩티드 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 위치할 뿐만 아니라 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.
혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자가 용이하게 결정할 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도, 염 농도에 따라 달라지는 실험적 계산값이다. 일반적으로 보다 긴 프로브일수록 적절한 어닐링에 보다 높은 온도를 필요로하며, 보다 짧은 프로브일수록 보다 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보적 가닥이 자신들의 용융 온도보다 낮은 환경에 존재할 때 재어닐링되는 변성된 DNA의 능력에 따라 달라진다. 프로브와 혼성화가능한 서열 사이의 원하는 상동성의 정도가 높을수록, 사용할 수 있는 상대적인 온도가 높아진다. 따라서, 상대적 온도보다 높아질수록 반응 조건은 더욱 엄격해지는 반면, 상대적 온도가 낮을수록 반응조건은 덜 엄격해진다. 혼성화 반응의 엄격도와 관련한 더 자세한 정보 및 설명은 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995))을 참조한다.
본원에서 정의되는 "엄격 조건" 또는 "엄격도가 높은 조건"이란 (1) 세척시 이온 세기가 낮고 온도가 높은 조건, 예를 들면 50 ℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1 % 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 조건, 또는 (2) 혼성화시에 포름아미드, 예를 들어 42 ℃, 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)/0.1 % 소혈청 알부민/0.1 % 피콜/0.1 % 폴리비닐피롤리돈으로 제조한 50 % (부피/부피) 포름아미드와 같은 변성제를 사용하는 조건, (3) 50 % 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1 % 피로인산 나트륨, 5 x Denhardt's 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1 % SDS, 및 10 %덱스트란 술페이트를 42 ℃에서 사용하고, 42 ℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨), 그리고 55 ℃에서 50 % 포름아미드로 세척하며, 55 ℃에서 EDTA가 함유된 0.1 x SSC를 이용한 고엄격 세척을 수행하는 것이다.
"중간정도의 엄격 조건"이란 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press 1989)에 기재된 바와 같고, 상기한 것보다 엄격성이 낮은 혼성화 조건 (예를 들어 온도, 이온 세기 및 %SDS)의 이용을 말한다. 중간정도의 엄격 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x Denhardt 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 잘린 연어 정액 변성 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃로 밤새 인큐베이션한 후 필터를 약 37 내지 50℃에서 1 x SSC로 세척하는 조건이다. 당업계의 숙련가는 프로브 길이 등과 같은 인자에 맞추기 위해 필요한 온도, 이온 세기 등을 조절하는 방법을 잘 알 것이다.
본원에 사용된 "에피토프 태그를 붙인"란 용어는 "태그 폴리펩티드"에 결합된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. "태그 폴리펩티드"가 만들어질 수 있을 정도의 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만 결합되는 PRO 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 태그 폴리펩티드는 아주 독특해서 자신에 대한 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 가교반응하지 않는 것이 바람직하다. 적절한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 통상 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기를 갖는다 (바람직하게는 약 10 내지 20개의 잔기).
PRO 변이체의 내용에서 "활성의" 또는 "활성"은 천연 또는 자연발생 PRO 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 보유하는 PRO 단백질의 형태(들)을 말한다.
본원에 개시된 스크리닝 검정법으로 확인할 수 있는 PRO 폴리펩티드에 대한 길항작용을 할 수 있는 분자 (예컨대, 유기 또는 무기 소분자, 펩티드 등)의 내용에서 "생물학적 활성"이란 본원에서 확인한 PRO 폴리펩티드와 결합하거나 결합체를 형성할 수 있거나, 혹은 달리 말하면 다른 세포 단백질과 PRO 폴리펩티드의 상호작용을 방해하거나 아니면 PRO 폴리펩티드의 전사 또는 번역을 억제하는 분자의 능력을 말하는 데 사용된다. 특히, 바람직한 생물학적 활성은 동맥, 모세혈관, 정맥 및 (또는) 림프관의 질병 및 암 뿐만 아니라 당뇨병과 같은, 혈관에 영향을 미치는 전신 질환에 작용하는 심비대증성 활성을 포함한다.
용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 PRO 폴리펩티드의 생물학적 활성, 예를 들어 적용가능하다면 분열촉진 활성 또는 혈관신생 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 통칭한다. PRO 폴리펩티드의 길항제는 세포 수용체와 PRO 폴리펩티드의 결합을 방해함으로써, PRO 폴리펩티드에 의해 활성화되는 세포를 무능력화시키거나 살해함으로써, 또는 세포 수용체와 PRO 폴리펩티드의 결합 후 혈관 내피세포 활성화를 방해함으로써 작용할 수 있다. PRO 폴리펩티드 길항제에 의한 조정의 이러한 모든 요점은 본 발명의 목적상 동일한 것으로 간주될 것이다. 상기 길항제는 PRO 폴리펩티드의 분열촉진 활성, 혈관신생 활성 또는 기타 생물학적 활성을 억제하므로, 예를 들어 종양 및 특히 고형 악성 종양, 류마티스성 관절염, 건선, 죽상경화증, 당뇨성 망막병증 및 기타 망막병증, 수정체후 섬유증식증, 연령-관련 황반 퇴화, 신생혈관 녹내장, 혈관종, 갑상선 과다증식증 (그레이브스병을 포함함), 각막 및 기타 조직 이식, 및 만성 염증을 포함하여 원하지 않는 과도한 혈관신생이 특징인 질병 또는 질환의 치료에 유용하다. 또한, 길항제는 원하지 않는 과도한 혈관 투과성이 특징인 질병 또는 질환, 예컨대 뇌종양과 관련된 부종, 악성과 관련된 복수, 메이그스 증후군, 폐 염증, 신증후군, 심낭유출 (예를 들어, 심낭염과 관련된 것) 및 흉막유출의 치료에 유용하다. 이와 비슷하게 용어 "아고니스트"도 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 PRO 폴리펩티드의 생물학적 활성을 흉내내는 모든 분자를 통칭한다. 적절한 아고니스트 또는 길항제 분자로는 구체적으로 아고니스트 또는 길항제의 항체 또는 항체의 단편, 천연 PRO 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 유기분자 등을 들 수 있다.
"소분자"는 약 500 달톤 미만의 분자량을 갖는 것으로 본원에서 정의한다.
본원에 사용된 용어 "PRO 폴리펩티드 수용체"란 PRO 폴리펩티드에 대한 세포 수용체, 통상적으로 혈관 내피세포 상에서 발견되는 세포-표면 수용체 뿐만 아니라 PRO 폴리펩티드에 결합하는 능력을 보유하는 그의 변이체를 말한다.
"항체" (Ab) 및 "이뮤노글로불린" (Ig)은 동일한 구조적 특징을 갖는 당단백질이다. 항체는 특정 항체에 대한 결합 특이성을 나타내지만, 이뮤노글로불린은 항체, 및 항원 특이성이 없는 기타 항체-유사 분자 둘다를 포함한다. 예를 들어,후자 종류의 폴리펩티드는 림프계에 의해 낮은 농도로 생산되고 골수종에 의해 증가된 농도로 생산된다. 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적ㅇ로는 온전한 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 2종 이상의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예컨대, 이중특이적 항체), 및 항체 단편 (원하는 생물학적 활성을 나타내는 경우)을 포괄하지만, 여기에 제한되지 않는다.
"천연 항체" 및 "천연 이뮤노글로불린"은 대개 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질이다. 각 경쇄는 1개의 공유결합성 이황화 결합에 의해 중쇄에 결합되어 있지만, 이황화 결합의 수는 다양한 이뮤노글로불린 동종형의 중쇄 사이에 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 공간을 두고 떨어져 있는 쇄내 이황화 가교도 갖는다. 각 중쇄는 많은 불변 도메인 다음에 한 쪽 말단에 가변 도메인 (VH)을 갖는다. 각 경쇄는 한 쪽 말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고 다른 쪽 말단에 불변 도메인을 갖는데, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에 접점을 형성하는 것으로 생각된다.
용어 "가변"이란 가변 도메인의 일부가 항체들 사이에 서열상 광범위하게 상이하여 특정 항원과 각 특정 항체의 결합, 및 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 특이성에 사용된다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체를 통해 골고루 분포되어 있지는 않다. 가변은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘다에서 상보성-결정 영역(CDR) 또는 과가변 영역이라고 불리는 세 개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 높은 보존부는 골격 영역 (FR)이라고 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성하고, 몇몇 경우에는 β-시크 구조의 일부를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된, β-시트 구조를 주로 취하는 4개의 FR 영역을 포함한다. 각 쇄의 CDR은 FR 영역에 의해 아주 근접하여 뭉쳐 있고, 다른 쇄의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat et al., NIH Publ. No. 91:3242, Vol. 1, pages 647-669 (1991) 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는 데 직접 관여하지 않지만, 항체-의존성 세포 독성에서 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10):1057-1062 (1995); 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 있다.
항체를 파파인 (Papain) 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 "Fab" 단편, 및 쉽게 결정화되는 능력을 반영하여 이름 붙여진 나머지 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')2단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비공유결합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 이량체로 구성된다. 이 구조에서는 각 가변 도메인의 CDR 3개가 상호작용하여 VH-VL이량체의 표면에 항원 결합 부위를 형성한다. 결론적으로 보면, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만 항원을 인식하여 항원에 결합하는 능력을 갖는다.
또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 (Hinge) 영역으로부터 유래한 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 첨가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 지칭한다. F(ab')2항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인이 있는 몇쌍의 Fab' 단편으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
임의의 척추동물종으로부터 유래한 항체(이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 명백하게 상이한 타입 중의 하나로 분류될 수 있다.
이뮤노글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 이뮤노글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개주요 클래스가 있고, 이들 중 몇 개는 서브클래스(이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 다양한 이뮤노글로불린류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ이라 불린다. 다양한 이뮤노글로불린류의 서브유닛 구조 및 3차원적 구조는 잘 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체를 말하는데, 다시 말해 한 집단을 이루는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대해 매우 특이적이다. 게다가, 전형적으로 다양한 결정인자 (에피토프)에 대한 다양한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 집단과는 반대로 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대한 것이다. 이들의 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리하다. 변형자 "모노클로날"은 실질적으로 동종 집단으로부터 수득한 항체의 특성을 나타내지만, 임의의 구체적 방법에 의한 항체의 생산을 요구하지는 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 (Kohler et al., Nature, 256: 459 (1975))에 처음 기재된 하이브리도마 방법으로 만들 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)으로 만들 수 있다. "모노클로날 항체"는 예를 들어, 문헌 (Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991))에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래한 항체 또는 특정 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일 또는 상동성이 있지만, 상기 쇄의 나머지는 또다른 종으로부터 유래한 항체 또는 또다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편 (이들이 원하는 생물학적 활성을 나타냄)의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있는 "키메라" 항체 (이뮤노글로불린)를 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)).
비인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 이뮤노글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린쇄, 또는 그의 단편 (예컨대, 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 다른 항원-결합 하위서열)이다. 보통 인간화된 항체는 수령자의 CDR 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 수용력을 갖는 비인간종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR 잔기에 의해 대체되는 인간 이뮤노글로불린 (수령자 항체)이다. 몇몇 경우에서, 인간 이뮤노글로불린의 Fv FR 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 게다가, 인간화된 항체는 수령자 항체 및 이입된 CDR 또는 골격 잔기 서열 둘다에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 항체 수행능력을 개량하고 최대화하기 위해 이러한 변형을 한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 1종 이상, 및 전형적으로는 2종의 가변 도메인으로 구성되어 있을 것이고, 여기서 상기 가변 도메인 내의 CDR 영역 모두 또는 실질적으로 모두는 비인간 이뮤노글로불린의 CDR 영역에 상응하고, FR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR 여역이다. 또한, 인간화된 항체는 바람직하게는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 일부를 포함할 것이다. 더 상세한 것을 위해서는, 문헌 (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 322: 323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struc. Biol., 2: 593-596 (1992))을 참조한다. 인간화된 항체는 항체의 항원-결합 영역이 원하는 항원으로 마카크 원숭이를 면역화시켜 제조한 항체로부터 유도된 PRIMATIZED (상표명) 항체를 포함한다.
"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH및 VL도메인을 포함하는데, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드쇄에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 VH와 VL도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하는데, 이 링커는 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성하게 한다. sFv를 조사하기 위해서는, 문헌 (Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenbug and Moore, eds. (Springer-Verlag: New York, 1994), pp. 269-315)을 참조한다.
용어 "디아바디 (diabody)"는 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내에 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위가 있는 작은 항체 단편을 말한다. 동일한 사슬에 있는 2개의 도메인을 페어링시키기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인을 다른 사슬의 상보성 도메인과강제로 페어링시켜 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097, WO93/11611 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 보다 상세하게 기재되어 있다.
"단리된" 항체란 자신의 천연 환경의 요소로부터 확인 및 분리 및(또는) 회수된 항체이다. 그의 천연 환경의 오염 요소는 항체의 진단 또는 치료적 사용을 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백성 또는 비단백성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정시 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과의 항체로, 또는 (2) 스피닝 컵(spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산의 잔기 15개 이상을 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드로 정제될 것이다. 단리된 항체는 그 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내의 원위치에서의 항체를 포함한다. 그러나, 단리된 항체는 일반적으로 하나 이상의 정제 단계에 의해 정제될 것이다.
"표지 (label)"는 이 명세서에 사용될 때, 항체에 직간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 생성시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 그 자체로 (방사성동위원소 표지 또는 형광 표지) 검출될 수 있거나, 효소 표지인 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다. 탐지가능한 표지로 작용할 수 있는 레디오뉴클리드는 예를 들어, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, At-211, Cu-67, Bi-212 및 Pd-109를 포함한다. 표지는 독소와같은 탐지불가능한 것일 수도 있다.
"고상 (solid phase)"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 고상의 예는 부분적으로 또는 완전하게 형성된 유리 (예를 들어 세공 조절된 유리), 폴리사카라이드 (예를 들어 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘 등이 있다. 특정 실시양태에서, 내용에 따라 고상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있으며, 다른 실시양태에서 고상은 정제 컬럼 (예를 들어 친화 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 별개 입자의 비연속적 고상도 포함한다.
"리포좀"은 약물 (예를 들어 PRO 폴리펩티드 또는 이에 대한 항체)을 포유동물에게 전달하는 데 유용한 여러 형태의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 작은 베지클 (vesicle)이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생체막의 지질 정렬과 유사하게 이중층 형태로 정렬된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이뮤노어드헤신"은 이뮤노글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 이종 단백질 (어드헤신)의 결합 특이성을 겸비한 항체 유사 분자를 지칭한다. 구조적으로 보면 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌, 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 결합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 이뮤노어드헤신 중 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM과 같은 임의의 이뮤노글로불린으로부터 얻을 수 있다.
II. 본 발명의 조성물 및 방법
A. PRO 변이체
본원에서 설명되는 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 외에, PRO 변이체를 제조할 수 있는 것으로 생각된다. PRO 변이체는 적합한 뉴클레오티드 변화를 PRO DNA에 도입하고(하거나) 목적 PRO 폴리펩티드를 합성하여 제조할 수 있다. 당업자라면 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변경 또는 멤브레인 앵커링 특성의 변화와 같은 아미노산 변화가 RPO의 번역후 프로세싱을 변경시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 설명되는 전장 천연 서열 PRO 또는 PRO의 여러 도메인에서의 변이는 예를 들어 미국 특허 제5,364,934호에 개시된 보존적 및 비보존적 돌연변이 기술 및 지침을 사용하여 제조할 수 있다. 변이는 천연 서열 PRO와 비교되는 것으로 PRO의 아미노산 서열이 변화된 PRO를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 변이는 하나 이상의 PRO 도메인에서 하나 이상의 아미노산을 임의 다른 아미노산으로 치환함으로써 생성된다. 목적 활성에 유해한 효과를 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 아미노산 잔기는 PRO의 서열을 공지의 상동 단백질 분자의 서열과 비교하고 상동성이 높은 영역에서 생성된 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 결정할 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환, 예를 들어 루이신의 세린으로의 치환, 즉 아미노산의 보존적 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개의 아미노산에서 발생할 수 있다. 허용되는 변이는 서열 내에 아미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환시키고, 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해 나타나는 생성된 변이체의 활성을 시험함으로써 정할 수 있다.
구체적인 실시태양에서, 목적물의 보존적 치환은 바람직한 치환이라는 표제로 표 3에 나타내었다. 이러한 치환에 의해 생물학적 활성이 변화하는 경우, 하기 표 3에서 치환예로서 명명되거나 아미노산 종류에 대해서 하기에서 보다 상세하게 설명된 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝하였다.
<표 3>
PRO 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 백본의 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 유지하거나, (b) 표적 부위에서의 분자의 하전 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 그의 효과를 상당히 변경시키는 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 구분된다:
(1) 소수성: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족; trp, tyr, phe.
비보존적 치환은 상기 한 종류의 구성 성분을 다른 종류의 것으로 교환시킬 것이다. 또한, 이렇게 치환되는 잔기는 보존적 치환 부위에 도입될 수 있거나 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비보존) 부위에 도입될 수 있다.
변이는 올리고뉴클레오티드 매개 (위치 지정) 돌연변이 유발법, 알라닌 스캐닝법 및 PCR 돌연변이 유발법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수있다. 위치 지정 돌연변이 유발법 [Carter et al.,Nucl. Acids Res.,13:4331 (1986); Zoller et al.,Nucl. Acids Res.,10:6487 (1987)], 카세트 돌연변이 유발법 [Wells et al.,Gene,34:315 (1985)], 제한 선택 돌연변이 유발법 [Wells et al.,Philos. Trans. R. Soc. London SerA,317:415 (1986)] 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA에 실시하여 본 발명의 PRO 폴리펩티드 변이체 DNA를 제조할 수 있다.
또한, 스캐닝 아미노산 분석법을 사용하여 인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 통상적으로, 알라닌은 베타-탄소 밖의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 배열을 변경시킬 가능성이 적기 때문에 바람직한 스캐닝 아미노산이다[Cunningham and Wells,Science,244: 1081-1085 (1989)]. 또한, 알라닌은 통상적으로 가장 흔한 아미노산이기 때문에 바람직하다. 또한, 알라닌은 파묻힌 위치 및 노출된 위치 모두에서 빈번하게 발견된다 [Creighton,The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia,J. Mol. Biol.,150:1 (1976)]. 알라닌 치환이 적당한 양의 변이체를 생성시키지 않으면, 동배체(isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.
B. PRO의 변형
PRO의 공유결합 변형은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유결합 변형의 한 형태는 PRO의 선택된 측쇄 또는 N 말단 또는 C 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 PRO 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제를 사용한 유도체화는 예를 들어 항-PRO 폴리펩티드 항체 정제 방법에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 PRO를 가교결합시키거나 그 반대로 가교결합시키는데 유용하다. 통상 사용되는 가교결합제는 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 물질을 포함한다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노기의 메틸화[T.E. Creighton,Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)], N-말단 아민의 아세틸화 및 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범위 내에 포함되는 PRO 폴리펩티드의 공유결합 변형의 다른 유형은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. 본원에서 "천연 글리코실화 패턴의 변화"는 천연 서열 PRO에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실(잠재적인 글리코실화 부위를 제거하거나 화학적 및(또는) 효소적 방법에 의해 글리코실화를 결실시킴으로써) 및(또는) 천연 서열 PRO에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다. 또한, 이 용어는 존재하는 다양한 탄수화물 잔기의 특성 및 비율의 변화를 비롯한 천연 단백질의 글리코실화에 있어 질적 변화를 포함한다.
PRO 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열의 변화에 의해 달성될 수 있다. 변화는 예를 들어 천연 서열 PRO에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우). PRO 아미노산 서열은 특히 목적 아미노산으로 번역되는 코돈을 생성시키도록 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선택된 염기에서 돌연변이시킴으로써 DNA 수준에서의 변화를 통하여 임의로 변화시킬 수 있다.
PRO 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin and Wriston,CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
PRO 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해 또는 글리코실화 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Hakimuddin, et al.,Arch. Biochem. Biophys.,259:52(1987) 및 Edge et al.,Anal. Biochem.,118:131(1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 효소에 의한 절단은 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다 [Thotakura et al.,Meth. Enzymol.,138:350(1987)].
PRO의 공유결합 변형의 다른 종류는 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 또는 동 제4,179,337호에 기재된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 PRO 폴리펩티드를 연결시키는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 PRO는 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 결합된PRO를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 PRO의 결합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 PRO의 아미노 또는 카르복실 말단에 위치한다. 상기 에피토프 태그를 갖는 형태의 PRO의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 도입하면 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 종류의 친화성 매트릭스를 사용한 친화성 정제에 의해 PRO를 용이하게 정제할 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리-히스티딘(poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-his-gly) 태그, flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 [Field et al.,Mol. Cell. Biol.,8:2159-2165 (1988)], c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evan et al.,Molecular and Cellular Biology,5:3610-3636 (1985)], 및 단순포진 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 [Paborsky et al.,Protein Engineering,3(6):547-553 (1990)]를 들 수 있다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드 [Hopp et al.,BioTechnology,6:1204-1210 (1988)], KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al.,Science,255:192-194 (1992)], 알파-튜불린 에피토프 펩티드 [Skinner et al.,J. Biol. Chem.,266:15163-15166 (1991)] 및 T7 유전자 10 단백질 태그 [Lutz-Freyermuth et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87:6393-6397 (1990)]를 포함한다.
다른 한 실시태양에서, 키메라 분자는 PRO와 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린의 특정 영역의 결합체를 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가 형태("면역어드헤신"으로 언급하기도 함)의 경우, 결합체는 IgG 분자의 Fc 영역일 수 있다. 이 Ig 결합체는 바람직하게는 Ig 분자내 1개 이상의 가변성 영역의 부위를 PRO 폴리펩티드의 가용성(결실 또는 실활화된 막횡단 도메인) 형태로 치환한 것을 포함한다. 특히 바람직한 한 실시태양에서, 이뮤노글로불린 결합체는 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 이뮤노글로불린 결합체를 생산하는 방법으로는, 1995년 6월 27일 간행된 미국 특허 제5,428,130호를 참조한다.
C. PRO 폴리펩티드의 제조
본 발명은 본원에서 PRO 폴리펩티드로 언급된 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 특히, 하기 실시예에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 각종 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. 별도의 발현 라운드에서 생산된 단백질의 PRO 숫자는 다를 수 있지만 UNQ 수는 임의 주어진 DNA 및 코딩된 단백질 특유의 것이며, 변하지 않을 것이다. 그러나, 본원에서는 간단하게, DNA35916-1161, DNA23339-1130, DNA16451-1388, DNA27865-1091, DNA27864-1155, DNA28497-1130, DNA26847-1395, DNA30942-1134, DNA32286-1191, DNA33094-1131, DNA33221-1133, DNA34434-1139, DNA35558-1167, DNA35638-1141, DNA33473-1176, DNA38260-1180, DNA39969-1185, DNA40628-1216, DNA35595-1228, DNA40981-1234, DNA47470-1130-P1, DNA47365-1206, DNA44184-1319, DNA48613-1268, DNA29101-1122, DNA49646-1327, DNA49829-1346, DNA56405-1357,DNA56352-1358, DNA59205-1421, DNA53974-1401, DNA57689-1385, DNA60615-1483, DNA59814-1486, DNA59846-1503, DNA64883-1526, DNA64885-1529, DNA64889-1541, DNA64903-1553, DNA64905-1558, DNA65409-1566, DNA65406-1567, DNA61873-1574, DNA64966-1575, DNA67300-1605, DNA68872-1620에 의해 코딩된 단백질, 및 상기 정의에 포함된 PRO의 다른 천연 상동체 및 변이체를 이들의 출처 및 제조 방식과 상관없이 각각 "PRO"로 언급할 것이다.
이하에 설명되는 내용은 주로 PRO 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 PRO를 제조하는 방법에 관한 것이다. 물론, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 PRO를 제조할 수 있다. 예를 들어, PRO 서열 또는 그의 단편은 고상 기술을 사용하는 직접 펩티드 합성법에 의해 제조할 수 있다 [문헌 (Stewart et al.,Solid -Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield,J. Am. Chem. Soc.,85:2149-2154 (1963))을 참조한다]. 시험관내 단백질 합성은 수동 방법 또는 자동 방법에 의해 수행될 수 있다. 자동 합성법은 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 펩티드 합성기( Applied Biosystems Peptide Synthesizer)(미국 캘리포니아주 포스터시티 소재)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. PRO의 상이한 단편을 별도로 화학적으로 합성하고 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합함으로써 전장 PRO 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
i. PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 단리
PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA를 보유하여 그를 검출가능한 수준으로 발현할 것으로 생각되는 조직으로부터 제조한 cDNA 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 따라서, 인간 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 실시예에서 설명되는 바와 같이 인체 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득할 수 있다. 또한, PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 게놈 라이브러리로부터 수득하거나 또는 올리고뉴클레오티드 합성으로 수득할 수 있다.
라이브러리는 원하는 유전자 또는 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 확인하기 위해 디자인된 프로브 (예를 들어, 목적하는 PRO 폴리펩티드에 대한 항체 또는 약 20 내지 80개 이상의 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 예를 들어 문헌 [Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Haror Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다. PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 단리하는 다른 수단은 PCR 방법을 사용하는 것이다 [Sambrook et al.,상기 문헌; Dieffenbach et al.,PCR Primer: A Laboratory Manual(Cold Spring Haror Laboratory Press, 1995)].
하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 설명한다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 가양성 결과를 최소화하기 위해서 충분한 길이를 갖고 충분히 분명한 서열이어야 한다. 올리고뉴클레오티드는 스크리닝되는 라이브러리에서 DNA에 혼성화시에 검출될 수 있도록 표지되는 것이 바람직하다.표지 방법은 당업계에 공지되어 있고,32P-표지된 ATP와 같은 방사성 표지, 비오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중간정도 엄격성 및 높은 엄격성을 포함하는 혼성화 조건은 문헌 (Sambrook et al.,상기 문헌)에서 제공된다.
상기 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 GenBank와 같은 공용 데이타베이스 또는 다른 독점 서열 데이타베이스에 기탁되고 입수될 수 있는 다른 공지의 서열과 비교하여 정렬시킬 수 있다. 분자의 한정된 영역 내 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서)은 상동성을 측정하기 위해 다양한 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램, 예컨대 ALIGN, DNAstar 및 INHERIT를 사용하여 서열 정렬을 통해 결정할 수 있다.
단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 먼저 본원에서 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하고 필요하다면 전구체를 검출하기 위해 문헌 (Sambrook et al.,상기 문헌)에 기재된 통상의 프라이머 신장 방법을 사용하여, 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, cDNA로 역전사되지 않은 mRNA의 중간체를 프로세싱함으로써 수득할 수 있다.
ii. 숙주 세포의 선별 및 형질전환
숙주 세포는 PRO 폴리펩티드 생산을 위해 본원에서 설명한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환되고 프로모터 유도, 형질전환체 선택 또는 목적 서열을 코딩하는 유전자 증폭에 적합하게끔 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양된다. 당업자라면 불필요한 실험을 수행하지 않고서도 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건을 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실시되는 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al.,상기 문헌]에서 찾을 수 있다.
진핵세포 형질감염 방법 및 원핵세포 형질전환 방법, 예를 들어 CaCl2, CaPO4, 리포솜-매개 방법 및 일렉트로포레이션은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 문헌 (Sambrook et al.,상기 문헌)에 기재된 염화칼슘법을 이용하는 칼슘 처리, 또는 일렉트로포레이션은 일반적으로 원핵세포에 대해 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은 문헌 [Shaw et al.,Gene,23:315(1983) 및 1989년 6월 29일 공개된 WO 89/05859]에 기재된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 상기 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 문헌 [Graham and van der Eb,Virology,52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 특징은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 문헌 [Van Solingen et al.,J. Bact.,130:949(1977) 및 Hsiao et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.(USA),76:3829(1979)]의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 세포 내로 DNA를 도입하는 다른 방법, 예를 들어 핵내 미세주입, 일렉트로포레이션, 원형 세포와 세균 원형질체 결합, 또는다원양이온(polycation), 예를 들어 폴리브렌, 폴리오르니틴도 사용할 수 있다. 포유동물 세포의 형질전환을 위한 여러 기술에 대해서는 문헌 [Keown et al.,Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) 및 Mansour et al.,Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조한다.
본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포에는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포가 포함된다. 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들어 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae), 예를 들어 이. 콜라이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예를 들어 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)는 용이하게 입수할 수 있다. 다른 적합한 원핵생물 숙주 세포는 에셔리키아(Eshcerichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움 (typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스 (marcescans) 및 시겔라 (Shigella)와 같은 장내세균과(Enterobacteriaceae), 및 바실러스 (Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (subtilis) 및 비. 리체니포르미스 (licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공고된 DD 266,710호에 기재된 비. 리체니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사 (aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이러한 예는단지 예시적인 것으로서 이에 제한되는 것은 아니다. 균주 W3110은 재조합 DNA 산물 발효에 공통적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주의 내생 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 초래하도록 변형될 수 있고, 이러한 숙주의 예는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2, 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4, 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanr를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244), 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6, 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4 및 1990년 8월 7일 공포된 미국 특허 제4,946,783호에 개시된 페리플라즘 프로테아제 변이체를 갖는 이. 콜라이 균주를 포함한다. 별법으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 폴리머라제 반응이 적합하다.
원핵세포 외에, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 벡터의 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 일반적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 미생물에는 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (Beach and Nurse,Nature, 290: 140 [1981]; 1985년 5월 2일 공고된 EP 139,383); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 제4,943,529호; Fleer etal.,Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), 예를 들어 케이. 락티스 (lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al.,J. Bacteriol., 737 [1983]), 케이. 프라길리스 (fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미 (wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (drosophilarum) (ATCC 36,906; Van den Berg et al.,Bio/Technology, 8:135(1990)), 케이. 테르모톨레란스 (thermotolerans) 및 케이. 막시아누스 (marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070; Sreekrishna et al.,J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa; Case et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 시와니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidentalis) (1990년 10월 31일 공고된 EP 394,538); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) (1991년 1월 10일 공고된 WO 91/00357) 및 아스퍼길러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (nidulans) (Ballance et al,,Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al.,Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) 및 에이. 니게르 (niger) (Kelly and Hynes,EMBO J., 4: 475-479 [1985])가 포함된다. 메틸 영양 요구성 효모가 적합하고, 한세눌라 (Hansenula), 칸디다 (Candida), 클로엑케라(Kloeckera), 피치아, 사카로마이세스, 토룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 이루어지는 속으로부터 선택된, 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이들 종류의 효모의 예인 구체적인 종의 목록은 문헌 [C. Anthony,The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에 기재되어 있다.
글리코실화된 PRO 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예에는 드로소필라 S2 및 스포도프테라 Sf9와 같은 곤충 세포 및 식물 세포가 포함된다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예에는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 COS 세포가 포함된다. 보다 구체적인 예에는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 라인 (293 세포 또는 현탁 배양액 중의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al.,J. Gen Virol., 36:59(1997)), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather,Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)), 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065) 및 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)이 포함된다. 당업계의 숙련가라면 적합한 숙주 세포를 선택할 수 있다.
iii. 복제가능 벡터의 선별 및 사용
PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능 벡터에 삽입할 수 있다. 다양한 벡터를용이하게 구할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 방법에 의해 벡터 내에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 DNA를 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내에 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 성분을 하나 이상 포함하는 적합한 벡터의 제조는 당업계의 숙련가에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 사용한다.
PRO 폴리펩티드는 직접 재조합 방법에 의해 생산될 수 있을 뿐만 아니라 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드 또는 신호 서열일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 결합 폴리펩티드로서 생산될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 또는 벡터 내로 삽입된 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 (미국 특허 제5,010,182호)를 포함함) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일 공고된 EP 362,179) 또는 1990년 11월 15일 공개된 WO 90/13646에 기재된 신호 서열일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열, 예를 들어 동일하거나 관련된 종의 분비 폴리펩티드로부터의 신호 서열 및 바이러스 분비 리더를 사용하여 단백질의 분비를지시할 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터 모두는 벡터가 선택된 1종 이상의 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 만드는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 선택가능한 마커로도 불리우는 선택 유전자를 함유할 것이다. 대표적인 선택 유전자, 예를 들어 바실러스 (Bacillus)의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라싸이클린에 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결함을 보완하는 단백질 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩한다.
포유동물 세포에 적합한 선택가능한 마커의 예는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 수용할 수 있는 세포의 동정을 가능하게 하는 것, 예를 들어 DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR이 이용될 경우, 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 CHO 세포주이고, 문헌 [Urlaub et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조 및 증식된다. 효모에 사용하는데 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al.,Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al.,Gene, 7:141 (1979); Tschemperet al.,Gene, 10:157 (1980)]. trp1 유전자는 트립토판으로의 성장능이 결여된 효모의 변이주 (예를 들어, ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선택 마커를 제공한다 [Jones,Genetics, 85: 12 (1977)].
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 mRNA 합성을 지시하는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터에는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 [Chang et al.,Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al.,Nature, 281:544 (1979)], 알칼리 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [Goeddel,Nucleic acid Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터 [deBoer et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]를 포함한다. 또한, 세균계에서 사용되는 프로모터는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 [Hitzeman et al.,J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] 또는 다른 당분해 효소 [Hess et al.,J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland,Biochemistry, 17:4900 (1978)], 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 디히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 EP 제73,657호에 기재되어 있다.
포유동물 숙주 세포내의 벡터로부터의 PRO 핵산 전사는 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스 (1989년 7월 5일 공고된 UK 2,211,504호), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 얻어진 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터 및 열-충격 프로모터로부터 얻어진, 숙주 세포계에 적합성인 프로모터에 의해 조절된다.
고등 진핵세포에 의한 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 일반적으로 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 대해 작용하는, 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-액팅 성분이다. 많은 인핸서 서열은 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 유래하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 통상적으로 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 뒷부분 상의SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 뒷부분 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 인핸서는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 서열에 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.
또한, 진핵생물 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터 유래한 다핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 수 있을 것이다. 그러한 서열은 통상적으로 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비번역 영역으로부터 확보된다. 이들 영역은 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 단편을 포함한다.
재조합 척추동물 세포 배양에서 PRO 폴리펩티드의 합성에 적용하는 데 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 [Gething et al.,Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al.,Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060 및 EP 117,058]에 기재되어 있다.
iv. 유전자 증폭/발현의 검출
유전자 증폭 및(또는) 발현은 예를 들어 통상의 서던 블로팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블로팅 [Thomas,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], 도트 블로팅 (DNA 분석) 또는 본원에서 제공된 서열을 기초로 하여 적절하게 표지된 프로브를 사용한in situ혼성화에 의해 시료에서 직접 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중쇄, RNA 이중쇄 및 DNA-RNA 혼성 이중쇄 또는 DNA-단백질이중쇄를 비롯한 특정 이중쇄를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 바꾸어 말하면, 항체를 표지하고, 상기 이중쇄를 표면에 결합시켜, 표면 상에 이중쇄가 형성될 때 이중쇄에 결합한 항체의 존재를 검출할 수 있는 분석을 수행할 수 있다.
별법으로, 유전자 발현은 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 산물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양액 또는 체액의 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 시료 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 임의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 천연 PRO 폴리펩티드 또는 본원에서 제공되는 DNA 서열을 기초로 한 합성 펩티드, 또는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 결합되고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다.
v. 폴리펩티드의 정제
PRO 폴리펩티드의 형태는 배양 배지 또는 숙주 세포 용균액으로부터 회수될 수 있다. 멤브레인에 결합하는 경우, 적합한 세제 용액 (예를 들어 Triton-X 100)을 사용하거나 효소의 절단에 의해 멤브레인으로부터 방출될 수 있다. PRO 폴리펩티드의 발현에 사용된 세포는 동결-해동 싸이클, 초음파 처리, 기계적 분쇄 또는 세포 용균제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해 분쇄시킬 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 PRO 폴리펩티드를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 정제 방법의 예는 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온 교환 수지, 예를 들어 DEAE 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 예를 들어 SephadexG-75를 사용한 겔 여과, IgG와 같은 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼 및 PRO 폴리펩티드의 에피토프 태그 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이팅 컬럼이다. 다양한 단백질 정제 방법을 사용할 수 있으며, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Deutscher,Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes,Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)은 예를 들어 사용되는 생산 방법 및 생산되는 특정 PRO 폴리펩티드의 특성에 따라 결정될 것이다.
D. PRO 폴리펩티드의 용도
i. 심혈관 활성, 내피 활성 및 혈관신생 활성에 대한 검정
다양한 검정법을 이용하여 심혈관 활성, 내피 활성 및 혈관신생 활성에 대해 본원의 폴리펩티드를 시험할 수 있다. 이러한 검정법은 하기 실시예에 기재된 것을 포함한다.
미국 특허 제5,773,414호에 개시된, 엔도텔린 길항제 활성에 대한 시험용 검정법은 상기 폴리펩티드가 수용체 검정법에서 요오드화된 엔도텔린-1 결합을 억제하는 그의 능력에 대해 시험하는 래트 심장 심실 결합 검정법, 토끼 동맥 혈관 평활근 세포를 사용하여 방사선표지된 엔도텔린-1의 온전한 세포 결합에 대해 시험하는 엔도텔린 수용체 결합 검정법, 제2 메신저의 세포 내 농도를 측정하여 Rat-1 세포에서 기능 활성을 측정하는 이노시톨 포스페이트 축적 검정법, 수컷 뉴질랜드 토끼의 내피세포를 사용하는 시험관내 (단리된 혈관) 연구에서 배양된 혈관 평활근의엔도텔린-자극된 아라키돈산 방출을 감소시키는 첨가 화합물의 능력을 측정하는 아라키돈산 방출 검정법, 및 스프라그-다우레이 래트를 사용한 생체내 연구를 포함한다.
조직 재생 활성 검정법은 WO 95/16035 (뼈 연골, 힘줄); WO 95/05846 (신경, 신경세포); 및 WO 91/07491 (피부, 내피세포)에 기재된 것을 포함하나 여기에 제한되지 않는다.
창상-치유 활성 검정법은 예를 들어, 문헌 (Eaglstein and Mertz, J. Invest. Dermatol., 71: 382-384 (1978))에 의해 변형된, 문헌 (Winter, Epidermal Wound Healing, Maibach, HI and Rovee, DT, eds (Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago), pp. 71-112)에 기재된 검정법을 포함한다.
엔도텔린 B1(ETB1) 수용체 폴리펩티드에 결합하고 신호 전달 활성을 조절하는 PRO 폴리펩티드와 관련된 시험 화합물을 스크리닝하는 검정법은 엔도텔린 B1수용체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 단계, 이 세포를 시험 후보물질에 노출시키는 단계, 및 예컨대 미국 특허 제5,773,223호에 기재된 바와 같이 엔도텔린 B1수용체 신호 전달 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
여러 가지 심비대증 검정법이 있다. 시험관내 검정법은 성숙 래트 심근세포의 퍼짐을 유도하는 것을 포함한다. 이 검정법에서, 본질적으로 문헌 (Piper et al., "Adult ventricular rat heart muscle cells" in Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research, H.M. Piper, ed. (Berlin:Springer-Verlag, 1990),pp. 36-60)에 상세히 기재된 방법의 변형에 따라 단일 (수컷 스프라그-다우레이) 래트로부터 심실 근세포를 단리한다. 이 방법은 성숙 심실 근세포의 단리를 허용하고 막대 모양의 표현형으로 이들 세포를 장기간 배양하는 것을 허용한다. 페닐레프린 및 프로스타글란딘 F2α(PGF2α)는 이들 성숙 세포에서 퍼짐 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 그 다음으로, 심비대증의 다양한 잠재적 억제제로 PGF2α또는 PGF2α동족체에 의해 유도된 근세포 퍼짐의 억제를 시험한다.
생체내 검정법의 한 예는 생체내에서 플루프로스테놀에 의해 유도된 심비대증을 억제에 대한 시험이다. 이 제약학적 모델은 플루프로스테놀 (PGF2α의 아고니스트 동족체)의 피하 주사에 의해 래트에서 유도된 심비대증을 억재하는 PRO 폴리펩티드의 능력을 시험한다. 심근경색증에 의해 유도된 병적 심비대증을 앓는 래트는 그들의 심근에서 임상적으로 추출가능한 고농도의 PGF2α를 갖는 것이 공지되어 있다 (Lai et al., Am. J. Physiol. (Heart Circ. Physiol.), 271:H2197-H2208 (1996)). 따라서, 생체내에서 심근 성장에 대한 플루프로스테놀의 효과를 억제할 수 있는 인자는 잠재적으로 심비대증의 치료에 유용하다. 심비대증에 대한 PRO 폴리펩티드의 효과는 PRO 폴리펩티드를 수용하지 않는 플루프로스테놀-처리 래트에 비례한 심장, 심실 및 좌심실의 중량 (체중에 의해 표준화됨)을 측정하여 결정한다.
생체내 검정법의 또다른 예는 압력-과부하 심비대증 검정법이다. 생체내 시험을 위해, 시험 동물의 복부 대동맥의 수축으로 압력-과부하 심비대증을 유도하는 것이 보통이다. 전형적인 프로토콜에서, 래트 (예컨대, 수컷 위스타 또는 스프라그-다우레이)를 마취 하에 처리하고, 각 래트의 복부 대동맥을 횡경막 바로 아래에서 좁힌다 (Beznak M., Can. J. Biochem. Physiol., 33: 985-94 (1995)). 대동맥을 절개 수술하여 노출시키고, 돗바늘을 혈관 옆에 배치한다. 바늘 주위의 견사로 봉합하여 대동맥을 수축시키는데, 상기 견사는 즉시 제거되고 바늘의 직경까지 대동맥의 루멘 (lumen)을 줄인다. 이 방법은 예를 들어, 문헌 (Rossi et al., Am. Heart J., 124: 700-709 (1992) and O' Rourke and Reibel, P.S.E.M.B., 200: 95-100 (1992))에 기재되어 있다.
또다른 생체내 검정법에서, 실험적으로 유도된 심근경색증 (MI) 다음의 심비대증에 대한 효과를 측정한다. 급성 MI는 래트에서 좌심장동맥 결찰로 유도하고 심전도 검사로 확인한다. 겉보기 수술한 동물군도 대조 동물로서 준비한다. 초기 데이타는 심장 중량 대 체중 비율의 18% 증가로 입증된 MI를 앓는 동물군에 심비대증이 존재함을 나타낸다 (상기 Lai et al.). 심비대증의 후보 차단제, 예컨대 PRO 폴리펩티드를 이용한 이들 동물의 치료는 시험된 후보물질의 치료 잠재력에 대한 가치 있는 정보를 제공한다. 스프라그-다우레이 래트를 이용한 심비대증 유도에 대한 이러한 검정 시험이 추가로 미국 특허 제5,773,415호에 개시되어 있다.
암에 대해서는, 잘 공지된 다양한 동물 모델을 사용하여 암의 발달 및 병리과정에 있어서 본원에서 확인한 유전자의 역할을 더 이해하고, 소분자 길항제와 같은 천연 PRO 폴리펩티드의 항체 및 다른 길항제를 비롯한 후보 치료제의 효능을 시험할 수 있다. 이러한 모델의 생체내 성질은 인간 환자에서 구체적인 반응을 예측할 수 있게 한다. 종양 및 암 (예를 들어, 유방암, 결장암, 전립선암, 폐암 등)의 동물 모델에는 비재조합 동물 및 재조합 (형질전환) 동물이 포함된다. 비재조합 동물에는 예를 들어, 설치류 (예컨대, 뮤린 동물)가 포함된다. 이러한 모델은 표준 기술, 예를 들어 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 신장 캡슐 하의 이식, 또는 오르토핀 이식 (예컨대, 결장 조직에 이식된 결장 암세포)을 이용하여 종양 세포를 유전적 동계의 마우스 내로 도입하여 만들 수 있다 (예컨대, 1997년 9월 18일 공개된 PCT 공개 제WO97/33551호 참조). 종양학 연구에 가장 흔히 사용된 동물종은 아마도 면역결핍 마우스, 구체적으로는 누드 마우스이다. 흉선 저형성증 또는 무형성증을 앓는 누드 마우스가 인간 종양 이종이식을 위한 숙주로서 성공적으로 작용할 수 있었다는 관찰 때문에 누드 마우스가 이 목적에 많이 사용된다. 상염색체 열성nu유전자가 예를 들어, ASW, A/He, AKR, BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII 및 SJL을 포함한 누드 마우스의 많은 별개의 유사유전자형 (congenic) 종 내로 도입하였다. 추가로, 누드 마우스 이외에 유전적 면역 결핍을 앓는 다양한 기타 동물을 육종하여 왔고 종양 이종이식의 수령자로서 이용하여 왔다. 보다 자세한 것을 위해서는 예를 들어, 문헌 (The Nude Mouse in Ocology Research, E. Boven and B. Winograd, eds. (CRC Press, Inc., 1991))을 참조한다.
이러한 동물 내로 도입된 세포는 예컨대 상기 기재한 종양세포주, 예를 들어 B104-1-I 세포주 (neu원종양유전자로 형질감염된 안정한 NIH-3T3 세포주); ras-형질감염된 NIH-3T3 세포; Caco-2 (ATCC HTB-37); 또는 적당하게 잘 분화된 등급 II 인간 결장 아데노암세포주인 HT-29 (ATCCHTB-38)와 같은 공지된 종양(암) 세포주 또는 종양 및 암세포로부터 유래할 수 있다. 종양세포 또는 암세포 샘플은 액체 질소 중의 동결 및 저장을 수반하는 표준 조건을 이용하여 외과수술을 한 환자로부터 수득할 수 있다 (Karmali et al., Br. J. Cancer, 48: 689-696 (1983).
종양세포는 다양한 방법으로 누드 마우스와 같은 동물 내로 도입할 수 있다. 마우스의 피하 (s.c.) 공간은 종양 이식에 매우 적합하다. 종양은 고형 덩어리, 투관침의 사용에 의한 침생검 또는 세포 현탁액으로서 피하 이식할 수 있다. 고형 덩어리 또는 투관침 이식을 위해, 적당한 크기의 종양 조직 단편을 피하 공간 내로 도입한다. 세포 현탁액은 원발성 종양세포주 또는 안정한 종양세포주로부터 새로 준비하고 피하 주사한다. 또한, 종양세포는 진피하 이식으로 주사할 수 있다. 이 위치에서, 접종물 (inoculum)은 진피 결합 조직의 하부와 피하 조직 사이에 놓는다.
유방암의 동물 모델은 본질적으로 문헌 (Drebin et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 83: 9129-9133 (1986))에 기재된 바와 같이 예를 들어, 래트 신경모세포종 (이 세포로부터neu종양유전자를 처음 단리함) 또는neu-형질전환된 NIH-3T3 세포를 누드 마우스에 이식하여 만들 수 있다.
유사하게, 결장암의 동물 모델은 결장암 세포를 동물, 예컨대 누드 마우스에서 계대(passage)하여 이들 동물 모델에서 종양이 나타나게하여 만들 수 있다. 누드 마우스에서 인간 결장암의 동소이식 모델은 예컨대 문헌 (Wang et al., CancerResearch. 54: 4726-4728 (1994) and Too et al., Cancer Research, 55: 681-684 (1995))에 기재되어 있다. 이 모델은 안티캔서사 (AntiCancer, Inc., San Diego, California)에 의해 판매되는 소위 "METAMOUSE" (상표명)를 기초로 한 것이다.
동물에서 발생하는 종양은 적출하여 시험관내에서 배양한다. 이어서, 시험관내 배양으로부터 수득한 세포를 동물에 계대할 수 있다. 이러한 종양은 다른 시험 또는 약물 스크리닝을 위한 표적으로 작용할 수 있다. 별법으로, 계대로부터 생성된 종양은 단리할 수 있고, 예비-계대 세포, 및 1회 이상의 계대 후 단리한 세포로부터 수득한 RNA는 원하는 유전자의 분별 발현에 대해 분석할 수 있다. 이러한 계대 기술은 임의의 공지된 종양세포주 또는 암세포주로 수행할 수 있다.
예를 들면, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 및 WEHI-164는 다양한 물질의 항-종양 활성을 연구하기 위한 매우 조절가능한 모델계를 제공하는 BALB/c 수컷 마우스 (DeLeo et al., J. Exp. Med., 146: 720 (1997))의 화학적으로 유도된 섬유육종이다 (Palladino et al., J. Immunol., 138: 4023-4032 (1987). 간단하게, 종양세포는 시험관내에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있다. 동물 내로 주사하기 전, 세포주를 세척하고 약 10x106내지 10x107세포/ml의 세포 농도로 완충용액에 현탁시킨다. 그 다음으로, 동물은 10 내지 100 ㎕의 세포 현탁액으로 피하 감염시켜 1 내지 3주 후에 종양이 나타나게 한다.
추가로, 가장 철저히 연구된 실험 종양 중 하나인 마우스의 루이스 폐 (3LL) 암세포를 연구 종양 모델로서 사용할 수 있다. 이 종양 모델의 효능은 소세포성폐암으로 진단받은 인간 환자의 치료에 있어서 유리한 효과와 관련되어 있다. 이 종양은 병에 걸린 마우스로부터 수득한 종양 단편 또는 배양 중인 세포의 주사시 정상 마우스 내로 도입할 수 있다 (Zupi et al., Br. J. Cancer. 41: suppl. 4, 30 (1998)). 종양이 심지어 단일 세포의 주사로부터 시작될 수 있으며 매우 높은 비율의 감염된 종양세포가 생존한다는 것을 나타내는 증거가 있다. 이 종양 모델에 대한 추가 정보를 위해서는 문헌 (Zacharski, Haemostasis, 16: 300-320 (1986))을 참조한다.
이식된 종양이 있는 동물 모델에서 시험 화합물의 효능을 측정하는 한 방법은 치료 전 및 후의 종양 크기를 측정하는 것이다. 통상적으로, 이식된 종양 크기는 2차원 또는 3차원의 슬라이드 칼리퍼 (caliper)로 측정한다. 2차원에 제한된 측정은 종양의 크기를 정확하게 반영하지 못하므로 대개 수학식을 사용하여 상응하는 부피로 전환한다. 그러나, 종양 크기의 측정은 매우 부정확하다. 약물 후보의 치료 효과는 치료-유도 성장 지연 및 특정 성장 지연으로 더 잘 표현할 수 있다. 종양 성장의 표현에 있어서 또다른 중요 변수는 종양 부피를 두배가 되게 하는 시간이다. 종양 성장의 계산 및 표현을 위한 컴퓨터 프로그램, 예컨대 문헌 (Rygaard and Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Sheng eds. (Basel, 1989), p.301)에 의해 보고된 프로그램도 이용가능하다. 그러나, 치료 후 세포괴사 및 면역 반응은 실재로 적어도 초기에 종양 크기를 증가시킨다. 그러므로, 이들 변화는 형태 계측 방법 및 유량 세포측정 분석의 조합으로 조심스럽게 관찰할 필요가 있다. 또한, 재조합 (형질전환) 동물모델은 형질전환 동물을 제조하는 표준 기술을 이용하여 본원에서 확인한 PRO 유전자의 코딩 일부를 원하는 동물의 게놈 내로 도입시켜 만들 수 있다. 형질전환 조작용 표적으로 작용할 수 있는 동물은 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지 및 기타 비인간 영장류, 예컨대 개코원숭이, 침팬지 및 원숭이를 포함하나, 여기에 제한되지 않는다. 형질전이유전자를 이러한 동물 내로 도입하는, 당업계에 공지된 기술에는 전핵 미세주입 (미국 특허 제4,873,191호); 생식세포주 내로의 레트로바이러스-매개 유전자 전달 (예컨대, Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6148-615 (1985)); 배아 줄기 세포에 있어서 유전자 표적화 (gene targeting) (Thompson et al., Cell, 56: 313-321 (1989)); 배아의 일렉트로포레이션 (Lo, Mol. Cell. Biol., 3: 1803-1814 (1983)); 및 정자-매개 유전자 전달 (Lavitrano et al., Cell, 57: 717-73 (1989))이 포함된다. 보다 자세한 것은 예를 들어, 미국 특허 제4,736,866호를 참조한다.
본 발명의 목적상, 형질전환 동물에는 일부 세포에만 형질전이유전자를 가지고 있는 동물 ("모자이크 동물")이 포함된다. 형질전이유전자는 단일 형질전이유전자 또는 콘카타머 (concatamer), 예컨대 머리-대-머리 또는 머리-대-꼬리 텐덤으로서 삽입할 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6232-636 (1992))의 기술에 따라 형질전이유전자를 특정 세포형 내로 선별적으로 도입하는 것도 가능하다. 형질전환 동물의 형질전이유전자 발현은 표준 기술로 관찰할 수 있다. 예를 들어, 형질전이유전자 삽입을 확인하는 데 서던 블롯 분석 또는 PCR 증폭을 사용할 수 있다. 이어서, 제자리 혼성화 (in situhybridization), 노던 블롯 분석, PCR 또는 면역세포화학을 이용하여 mRNA 발현도를 조사할 수 있다. 추가로 동물을 종양 또는 암 발달의 징후에 대해 조사한다.
별법으로, PRO 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자와 동물의 배아세포 내로 도입된 것과 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 변이 게놈 DNA 사이의 상동 재조합 결과로서 본원에서 확인한 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 결손 또는 변이 유전자를 갖는 "넉아웃" 동물을 구축할 수 있다. 예를 들면, 확립된 기술에 따라 특정 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝하는 데 상기 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 사용할 수 있다. 특정 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부는 결실할 수 있거나, 삽입을 관찰하는 데 사용할 수 있는 선별가능한 마커를 코딩하는 유전자와 같은 또다른 유전자로 대체할 수 있다. 전형적으로, 벡터는 (5' 및 3' 말단 둘다에서) 변이되지 않은 수백 킬로베이스의 플랭킹 DNA를 포함한다. 상동한 재조합 벡터의 설명에 대해서는 예컨대, 문헌 (Thomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987))을 참조한다. 벡터를 (예를 들어, 일렉트로포레이션으로) 배아 줄기 세포주 내로 도입하고, 도입된 DNA가 내인성 DNA와 상동 재조합된 세포를 선별한다 (예를 들어, Li et al., Cell. 69: 915 (1992) 참조). 그 다음으로, 선별 세포를 동물 (예컨대, 마우스 또는 래트)의 포배 내에 주입하여 침전 키메라를 형성한다 (예컨대, Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E. J. Robertson, ed. (IRL: Oxford, 1987), pp. 113-152 참조). 그 다음, 키메라 배아를 적당한 가임신 암컷 양육 동물 내에 이식할 수 있고 이 배아로 인해 "넉아웃" 동물이라는 용어가 생겨났다. 표준 기술로 생식세포 내에 상동 재조합 DNA가 있는 새끼를 확인할 수 있고, 이 새끼를 사용하여 모든 세포가 상동 재조합 DNA를 함유하는 동물을 육종할 수 있다. 예를 들어, 넉아웃 동물의 특징은 일부 병적 상태에 대한 방어 능력 및 PRO 폴리펩티드의 부재로 인한 병적 상태의 발달일 수 있다.
자연발생 동물 종양의 치료에 있어서 본원에서 확인한 PRO 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 및 기타 약물 후보물질의 효능도 시험할 수 있다. 이러한 연구에 적당한 표적은 고양이 구강 편평 세포암 (SCC)이다. 고양이 구강 SCC는 이 종에서 보고된 구강암의 60% 이상을 차지하는 가장 흔한 고양이 구강 악성종양인 고침습 악성 종양이다. 이러한 저발생 전이가 단지 이 종양이 있는 고양이에 대한 짧은 생존 시간의 반영일 수 있다하더라도 상기 종양은 거의 다른 부위로 전이하지 않는다. 이들 종양은 주로 고양이 구강의 해부구조 때문에 통상적으로 외과수술로 치료되지 않는다. 현재, 이 종양에 대한 효과적인 치료법은 없다. 연구로 들어가기 전에, 각 고양이는 완전한 임상 조사 및 생검을 하고, 전산화 단층촬영술 (CT)로 스캐닝한다. 설하 구강 편평 세포 종양으로 진단받은 고양이는 연구에서 제외한다. 혀는 이러한 종양의 결과로 마비될 수 있고, 치료로 종양을 없앨 수 있다하더라도 동물은 스스로 먹을 수 없을 것이다. 각 고양이를 보다 장시간 동안 반복해서 치료한다. 종양의 사진을 치료 기간동안 매일 촬영한 후 각각을 재검토한다. 치료 후, 각 고양이를 또다른 CT 스캔한다. 그 후, CT 스캔 및 흉부 방사선상은 8주마다 평가한다. 비교군과 비교할 때 생존, 반응 및 독성의 차이점에 대해 데이타를 평가한다. 양성 반응은 종양 퇴행, 바람직하게는 삶의 질 향상 및(또는) 늘어난 수명의 증거를 요구할 수 있다.
추가로, 섬유육종, 선암종, 림프종, 연골종, 또는 개, 고양이 및 개코원숭이의 평활근육종과 같은 기타 자연발생적 동물 종양도 시험할 수 있다. 이들 중, 개 및 고양이의 유방 선암종은 그의 외관 및 행동이 사람의 유방 선암종과 매우 유사하기 때문에 바람직한 모델이다. 그러나, 이 모델의 용도는 동물에서 이러한 형태의 종양 발생이 드물기 때문에 제한된다.
당업계에 공지된 다른 시험관내 및 생체내 심혈관, 내피 및 혈관신생 시험도 본원에 적합하다.
ii. 조직 분포
본원에서 심혈관, 내피 및 혈관신생 검정법의 결과는 다른 연구, 예컨대 다양한 인간 조직에서 mRNA 발현을 측정하는 것으로 입증할 수 있다.
전술한 바와 같이, 다양한 조직에 있어서 유전자 증폭 및(또는) 유전자 발현은 본원에 제공된 서열을 기초로 한 적당한 표지 프로브를 사용하여 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블롯팅 (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)), 돗 블롯팅 (DNA 분석) 또는 제자리 혼성화로 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 듀플렉스, RNA 듀플렉스 및 DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스를 포함한 특정 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다.
별법으로, 다양한 조직의 유전자 발현은 면역학적 방법, 예컨대 조직 절편의 면역조직학적 염색 및 세포 배양 또는 체액의 검정으로 측정하여 유전자 생성물의발현을 직접 정량할 수 있다. 면역조직학적 염색 및(또는) 샘플액의 검정에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 천연-서열 PRO 폴리펩티드 또는 본원에 제공된 DNA 서열을 기초로 한 합성 펩티드, 또는 특정 항체 에피토프를 코딩하며 PRO DNA에 결합된 외인성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다. 제자리 혼성화를 위한 항체 및 특별한 프로토콜을 만드는 일반 기술은 아래 본원에 제공된다.
iii. 항체 결합 연구
심혈관, 내피세포 및 혈관신생 연구의 결과는 항체 결합 연구로 더 입증할 수 있는데, 상기 항체 결합 연구에서 심혈관, 내피세포 및 혈관신생 검정법에서 사용된 내피세포 또는 다른 세포에 대한 PRO 폴리펩티드의 효과를 억제하는 항-PRO 항체의 능력을 시험한다. 예시적 항체에는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화된 항체, 이중특이적 항체 및 헤테로컨쥬게이트 항체가 포함되고, 이 항체들의 제조는 하기에 기재할 것이다.
항체 결합 연구는 임의의 공지된 검정 방법, 예컨대 경쟁적 결합 검정법, 직간접 샌드위치 검정법 및 면역침전 검정법에서 수행할 수 있다 (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (CRC Press, Inc., 1987), pp. 147-158).
경쟁적 결합 검정법은 제한된 양의 항체와 결합하는 시험 샘플 분석물과 경쟁하는 표지된 표준물의 능력에 의존한다. 상기 시험 샘플에 있는 표적 단백질의 양은 항체에 결합하게 되는 표준물의 양과 반비례한다. 결합하게 되는 표준물의 양을 측정하기 쉽게 하기 위해, 바람직하게는 경쟁 전 또는 후에 항체를 불용화시켜서 상기 항체에 결합하는 표준물 및 분석물이 비결합 상태로 남은 표준물 및 분석물로부터 편리하게 분리할 수 있다.
샌드위치 검정법은 검출할 단백질의 상이한 면역성 일부 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있는 두 항체의 용도를 포함한다. 샌드위치 검정법에서, 시험 샘플 분석물은 고형 지지체에 부착된 제1항체와 결합한 후, 제2 항체가 상기 분석물에 결합하여 불용성 3부 결합체를 형성한다 (예를 들면, 미국 특허 제4,376,110호 참조). 제2 항체는 그 자체가 검출가능한 잔기로 표지되거나 (직접 샌드위치 검정법), 검출가능한 잔기로 표지된 항-이뮤노글로불린 항체를 사용하여 측정할 수 있다 (간접 샌드위치 검정법). 예를 들면, 샌드위치 검정법의 한 유형은 검출가능한 잔기가 효소인 ELISA 검정법이다.
면역조직학을 위해, 조직 샘플은 신선한 것이거나 동결된 것일 수 있고, 혹은 파라핀에 함몰시켜 예를 들어, 포르말린과 같은 방부제로 고정시킬 수 있다.
iv. 세포-기재 종양 검정법
종양과 같은 심혈관, 내피세포 및 혈관신생 질환의 세포-기재 검정법 및 동물 모델은 본원의 심혈관, 내피성 및 혈관신생 검정법의 발견을 입증하는 데, 그리고 추가로 본원에서 확인한 유전자와 원하지 않는 심혈관계 세포, 내피세포 및 혈관신생 세포 성장의 발달 및 병리과정 사이의 관계를 이해하는 데 이용할 수 있다. 원하지 않은 심혈관계 세포, 내피세포 및 혈관신생 세포 성장, 예컨대 종양 세포의 발달 및 병리과정에 있어서 본원에서 확인한 유전자 생성물의 역할은 본원의 PRO 폴리펩티드에 의해 자극되거나 억제되는 것으로 확인된 세포 또는 세포주를 사용하여 시험할 수 있다. 이러한 세포에는 예를 들어, 하기 실시예에 기재한 것들이 포함된다.
다른 접근에서, 특정한 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환과 연관되는 것으로 공지된 세포 유형의 세포를 본원의 cDNA로 형질감염시키고, 과도한 성장을 유도하거나 성장을 억제하는 이들 cDNA의 능력을 분석한다. 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환이 암인 경우, 적당한 종양세포에는 예를 들어, B104-I-1 세포주 (neu원종양유전자로 형질감염된 안정한 NIH-3T3 세포주) 및ras-형질감염된 NIH-3T3 세포와 같은 안정한 종양 세포주가 포함되는데, 이 종양 세포주를 원하는 유전자로 형질감염시켜 종양 성장에 대해 관찰할 수 있다. 그다음으로, 이러한 형질감염된 세포주는 형질전환된 세포의 성장에 대한 세포활동 억제 활성 또는 세포독성 활성을 발휘하거나, 항체-의존성 세포의 세포독성 (ADCC)을 매개하여 종양세포 성장을 억제하는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항체 조성물의 능력을 시험할 수 있다. 본원에서 확인한 유전자의 코딩 서열로 형질감염된 세포는 암과 같은 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 치료용 약물 후보물질을 확인하는 데 사용할 수도 있다.
또한, 형질전환 동물 (상기 기재됨)의 종양으로부터 유래한 1차 배양물은 안정한 세포주가 바람직하더라도 본원의 세포-기재 검정법에 사용할 수 있다. 형질전환 동물로부터 연속 세포주를 유도하는 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, Small et al., Mol. Cell. Biol., 5: 642-648 (1985) 참조).
v. 유전자 치료법
본원의 PRO 폴리펩티드, 폴리펩티딜 아고니스트 및 폴리펩티딜 길항제는 본 발명에 따라 상기 폴리펩티드를 발현시켜 사용할 수 있는데, 이것은 흔히 유전자 치료법이라 불린다.
환자 세포 내로 핵산 (임의로는 벡터에 포함되어 있음)을 도입하는 두 가지 방법, 즉 생체내 및 생체외 방법이 있다. 생체내 전달을 위해서는, 핵산은 대개 PRO 폴리펩티드가 필요한 부위, 즉 PRO 폴리펩티드의 합성 부위, 및 알려져 있다면 PRO 폴리펩티드의 생물학적 활성이 필요한 부위 (예, 창상)에서 환자 내로 직접 주사한다. 생체외 치료를 위해서는, 환자의 세포를 적출하고, 핵산을 이들 단리된 세포 내로 도입한 다음, 형질전환된 세포를 환자에게 직접 투여하거나, 예를 들어 환자 내로 이식되는 다공성 막 내에 캡슐화시켜 환자에게 투여한다 (예컨대, 미국 특허 제4,892,538호 및 제5,283,187호 참조). 핵산을 생존가능한 세포 내로 도입하는 데 이용가능한 다양한 기술이 있다. 이 기술은 시험관내에서 핵산을 배양된 세포 내로 전달하는지 생체내에서 의도한 숙주의 세포 내로 전달하는지에 따라 다양하다. 시험관내에서 포유동물 세포 내로 핵산을 전달하기에 적당한 기술에는 리포좀의 사용, 일렉트로포레이션, 미세주입, 형질도입 (transduction), 세포 결합, DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전 방법 등이 포함된다. 형질도입은 세포 수용체와 복제-결합성 재조합 바이러스 (바람직하게는 레트로바이러스) 입자의 결합 후, 입자에 함유된 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 유전자의 생체외 전달을 위해 통상적으로 사용되는 백터는 레트로바이러스이다.
현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술에는 바이러스 벡터 또는 바이러스가아닌 벡터 (예컨대, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 I 바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV)) 및 지질-기재 계 (유전자의 지질-매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어, DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임, 예컨대 Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14 (1): 54-65 (1996) 참조)가 포함된다. 유전자 치료법에 사용하기에 가장 바람직한 벡터는 바이러스, 가장 바람직하게는 아데노바이러스, AAV, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스이다. 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터에는 1종 이상의 전사 프로모터(인핸서) 또는 좌위-정의 요소(들), 또는 교대 스플리싱 (alternative splicing), 핵 RNA 유출 또는 메신저의 번역 후 수식과 같은 다른 방법으로 유전자 발현을 조절하는 기타 요소가 포함된다. 또한, PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 존재 하에 전사되는 경우, 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터에는 상기 유전자에 작동가능하게 결합되어 번역 개시 서열로 작용하는 핵산 분자가 포함된다. 또한, 이러한 벡터 구축물에는 패키징 신호, 장말단 반복부 (LTR) 또는 그의 일부, 사용되는 바이러스에 적당한 음성 가닥 프라이머 결합 부위 (이것이 바이러스 벡터에 이미 존재하지 않는 경우)가 포함된다. 또한, 이러한 벡터에는 전형적으로 PRO 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포로부터의 상기 PRO 폴리펩티드 분비를 위한 신호 서열이 포함된다. 바람직하게는, 이 목적을 위한 신호 서열은 포유동물의 PRO 폴리펩티드용 신호 서열, 가장 바람직하게는 PRO 폴리펩티드용 천연 신호 서열이다. 임의로는, 상기 벡터 구축물에는 한 개 이상의 제한효소 부위 및 번역 종결 서열 뿐만 아니라 폴리아데닐화를 지시하는 신호도 포함될 수 있다. 예를 들면, 이러한 벡터에는 전형적으로 5'LTR, tRNA 결합 부위,패키징 신호, 제2 가닥 DNA 합성 기점, 및 3'LTR 또는 그의 일부가 포함될 것이다. 양이온성 지질, 폴리라이신 및 덴드리머와 같은 바이러스가 아닌 기타 벡터를 사용할 수 있다.
몇몇 경우에서, 표적 세포를 목표로 삼는 물질, 예컨대 세포 표면막 단백질 또는 표적 세포에 대해 특이적인 항체, 표적 세포 위의 수용체에 대한 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용되는 경우, 세포내이입 (endocytosis)과 관련된 세포 표면막 단백질에 결합하는 단백질은 예컨대, 켑시드 단백질 또는 특정한 세포 유형에 친화적인 그의 단편, 시클링시 내재화를 겪는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 위치결정을 목표로 삼고 세포내 반감기를 증가시키는 단백질을 표적화하고(거나) 용이하게 받아들이게 하는 데 사용할 수 있다. 수용체-매개 세포내이입의 기술은 예를 들어, 문헌 (Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987); and Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990))에 기재되어 있다. 현재 공지된 유전자 표시 (marking) 및 유전자 치료법 프로토콜의 검토를 위해서는 문헌 (Anderson et al., Science, 256: 808-813 (1992))을 참조한다. 또한, WO93/25673 및 본원에서 언급한 문헌들을 참조한다.
레트로바이러스 입자 및 구조 단백질을 만드는 데 적당한 유전자 치료법 및 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,681,746호에서 찾을 수 있다.
vi. 진단수단으로서의 유전자 용도
본 발명은 진단수단으로서 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 용도에 관한것이기도 하다. PRO 폴리펩티드의 돌연변이 형태 검출은 PRO 폴리펩티드가 종양을 일으킬 수 있기 때문에 종양과 같은 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환, 또는 이들 질환에 대한 감수성을 진달할 수 있게 할 것이다.
인간 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 돌연변이를 수반하는 개체는 다양한 기술로 DNA 수준에서 검출할 수 있다. 진단을 위한 핵산은 혈액, 소변, 침, 조직 생검 및 생검 물질과 같은 환자의 세포로부터 수득할 수 있다. 게놈 DNA는 검출에 직접 사용할 수 있고, 또는 분석 전에 PCR (Saiki et al., Nature, 324: 163-166 (1986))을 이용하여 효소적으로 증폭시킬 수 있다. 상기와 동일한 목적에 RNA 또는 cDNA를 사용할 수도 있다. 예로서, PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 PRO 폴리펩티드 돌연변이를 확인 및 분석할 수 있다. 예컨대, 결실 및 삽입은 정상 유전형과 비교할 때 증폭된 생성물의 크기 변화로 검출할 수 있다. 점돌연변이는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 방사선표지된 RNA, 또는 별법으로 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 방사선표지된 안티센스 DNA 서열에 증폭된 DNA를 혼성화시켜 확인할 수 있다. 완전히 일치하는 서열은 RNase A 절단 또는 융점의 차이에 의해 일치하지 않는 듀플렉스와 구별할 수 있다.
DNA 서열 차이를 기초로 한 유전자 시험은 변성제가 있거나 없이 겔에서 DNA 단편의 전기영동 이동의 변화를 검출하여 달성할 수 있다. 소규모 서열 결실 및 삽입은 고해상 전기영동으로 관찰할 수 있다. 다른 서열의 DNA 단편은 변성 포름아미딘 농도구배 겔 상에서 구별할 수 있는데, 여기서 다른 DNA 단편의 이동성은 이들의 특정 융점 또는 부분 융점에 따라 겔의 다른 위치에서 지연된다 (예컨대,Myers et al., Science, 230: 1242 (1985) 참조).
특정 위치에서 서열 변화는 예를 들어, RNase 및 S1 보호 방법 또는 화학적 절단 방법과 같은 뉴클리아제 보호 검정법에 의해 나타날 수도 있다 (Cotten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4397-4401 (1985)).
따라서, 혼성화, RNase 보호, 화학적 절단, 직접 DNA 시퀀싱, 또는 제한효소의 사용, 예컨대 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 및 게놈 DNA의 서던 블롯팅과 같은 방법으로 특정 DNA 서열을 검출할 수 있다.
vii. PRO 폴리펩티드 농도를 검출하는 용도
통상적인 겔 전기영동 및 DNA 시퀀싱 이외에도 제자리 분석 (in situanalysis)으로 돌연변이를 검출할 수도 있다.
PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현은 종양 형성과 관련된 혈관 질환 또는 혈관형성과 연결될 수 있다. PRO 폴리펩티드가 신호 서열을 갖고 mRNA가 내피세포에서 많이 발현되고 평활근세포에서 보다 적은 정도로 발현되는 경우, 이것은 PRO 폴리펩티드가 혈청에 존재함을 나타낸다. 따라서, 이 PRO 폴리펩티드의 바뀐 농도가 이러한 질병의 표시일 수 있기 때문에 항-PRO 폴리펩티드 항체는 종양 형성과 관련된 혈관 질환 또는 혈관형성을 진단하는 데 사용할 수 있다. PRO 폴리펩티드에 특이적인 항체를 고형 지지체에 부착시키고 표지된 PRO 폴리펩티드 및 숙주로부터 유래한 샘플을 상기 고형 지지체 상을 통과시킬 때, 상기 고형 지지체에 부착된 표지의 검출량이 샘플 중의 PRO 폴리펩티드의 양과 상관관계가 있는 경쟁적 검정법을 사용할 수 있다.
viii. 염색체 맵핑(Chromosome mapping)
본 발명의 서열은 염색체 확인에도 가치가 있다. 본 서열은 개별 인간 염색체 상의 특정 위치에 특이적으로 표적화되어 상기 특정 위치와 혼성화할 수 있다. 게다가, 현재 염색체 상의 특정 부위를 확인할 필요가 있다. 현재, 염색체상 위치를 표시하는 데 실제 서열 데이타 (반복부 다형성)를 기초로 한 소수의 염색체 표시 시약을 이용할 수 있다. 본 발명에 따라 DNA를 염색체에 맴핑하는 것은 상기 DNA 서열과 질병과 관련된 유전자를 서로 관련시키는 데 있어서 중요한 첫 단계이다.
간단하게, cDNA로부터 PCR 프라이머 (바람직하게는 15-25 bp)를 제조함으로써 염색체에 서열을 맴핑할 수 있다. 게놈 DNA에서 한 개 이상의 엑손에 걸쳐 있지 않은 프라이머를 신속히 선별하는 데 3'-비번역 영역에 대한 컴퓨터 분석을 이용해서 증폭 과정을 복잡하게 한다. 그 다음으로, 이들 프라이머는 개별 인간 염색체를 함유하는 체세포 하이브리드의 PCR 스크리닝에 사용한다. 상기 프라이머에 상응하는 인간 유전자를 함유하는 하이브리드만이 증폭된 단편을 제공할 것이다.
체세포 하이브리드의 PCR 맴핑은 특정 DNA를 특정 염색체에 할당하는 신속한 방법이다. 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 쓰는 본 발명을 이용하여, 유사한 방식으로 특정 염색체 또는 큰 게놈 클론 집단으로부터 수득한 단편 판넬로 서브로칼리제이션 (sublocalization)할 수 있다. 염색체에 맴핑하는 데 유사하게 사용할 수 있는 다른 맴핑 방법에는 제자리 혼성화, 표지된 유량-분류 염색체를 사용한 예비스크리닝, 및 염색체-특정 cDNA 라이브러리를 구축하는 혼성화에 의한 예비선별이 포함된다.
중기 염색체 스프레드로를 이용한 cDNA 클론의 형광 제자리 혼성화 (FISH)는 한 단계로 정확한 염색체 위치를 제공하는 데 이용할 수 있다. 이 기술은 500 또는 600 개의 염기 만큼 짧은 cDNA로 이용할 수 있지만, 2,000 bp보다 큰 클론은 단순 검출에 충분한 신호 강도로 유일한 염색체 위치에 결합할 가능성이 보다 높다. FISH는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 유래한 클론의 사용을 필요로 하고,이 클론은 길수록 더 좋다. 예를 들어, 2,000 bp는 좋고, 4,000 bp는 더 좋지만, 4,000 bp 이상은 시간과 좋은 결과의 적당한 비율을 얻는 데 필요한 것은 아닌 것 같다. 이 기술의 검토를 위해서는 문헌 (Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques (Pergamin Press, New York, 1988)을 참조한다.
일단 서열이 정확한 염색체 위치에 맴핑되면, 염색체 상에서 서열의 물리적 위치는 유전적 맴 데이타와 서로 관계되어 있을 수 있다. 이러한 데이타는 예를 들어, 문헌 (V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (존 홉킨스 유니버시티 웰치 메디칼 라이브러리로부터 온라인으로 이용가능함))에서 찾을 수 있다. 그 다음으로, 동일한 염색체 영역에 맴핑된 유전자와 질병 사이의 관계를 링키지 분석 (linkage analysis) (물리적으로 인접한 유전자의 공유전)을 통해 확인한다.
그 다음, 병에 걸린 개체와 병에 걸리지 않은 개체 사이의 cDNA 또는 게놈 서열의 차이점을 결정할 필요가 있다. 만약 돌연변이가 일부 또는 모든 병에 걸린 개체에서는 관찰되지만, 임의의 정상 개체에서는 관찰되지 않으면, 이 돌연변이는 질병의 원인일 수 있다.
물리적 맴핑 및 유전적 맴핑 기술의 현재 해상력으로 볼 때, 질병과 관련된 염색체 영역에 정확히 위치한 cDNA는 50 내지 500개 (이것은 맴핑 해상력이 1 메가 염기이고 20 kb 당 한 개의 유전자가 있다고 가정할 경우임)의 잠재적인 원인 유전자들 중 하나일 수 있다.
ix. 약물 후보물질에 대한 스크리닝 검정법
본 발명은 PRO 폴리펩티드를 흉내내거나 (아고니스트) PRO 폴리펩티드의 효과를 방해하는 (길항제) 폴리펩티드를 확인하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법을 포함한다. 길항제 약물 후보물질에 대한 스크리닝 검정법은 본원에서 확인한 유전자에 의해 코딩되는 PRO 폴리펩티드와 결합하거나 아니면 결합체를 형성하는 화합물, 또는 다른 세포 단백질과 코딩된 폴리펩티드의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하기 위해 디자인한다. 이러한 스크리닝 검정법은 소분자 약물 후보물질을 확인하기에 특히 적합하게 하는 화학적 라이브러리의 고처리량 스크리닝에 따른 검정법을 포함할 것이다.
상기 검정법은 단백질-단백질 결합 검정법, 생화학적 스크리닝 검정법, 면역검정법 및 세포-기재 검정법을 비롯하여 다양한 형식으로 수행할 수 있고, 이들의 특징은 당업계에 잘 규명되어 있다.
길항제에 대한 모든 검정법은 약물 후보물질이 본원에서 확인한 핵산에 의해 코딩된 PRO 폴리펩티드와 상호작용하기에 충분한 조건 하에서 충분한 시간 동안 이들 두 성분이 접촉하는 것을 요구한다는 점에서 공통된다.
결합 검정법에서, 상호작용은 결합이고, 형성된 결합체는 반응 혼합물에서단리 또는 검출할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 본원에서 확인한 유전자에 의해 코딩되는 PRO 폴리펩티드 또는 약물 후보물질은 공유결합 또는 비공유결합 부착에 의해 고상, 예컨대 마이크로타이터 플레이트 상에 부착되어 있다. 비공유결합 부착은 일반적으로 고체 표면을 PRO 폴리펩티드 용액으로 코팅하고 건조하여 달성한다. 별법으로, 부착된 항체, 예를 들어 부착되어야 하는 PRO 폴리펩티드에 대해 특이적인 모노클로날 항체는 PRO 폴리펩티드를 고체 표면에 부착시키는 데 사용할 수 있다. 상기 검정은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 비부착된 성분을 부착된 성분, 예컨대 부착된 성분을 함유하는 코팅 표면에 첨가함으로써 수행한다. 반응이 완결될 때, 반응하지 않은 성분은 예를 들어 세척하여 제거하고, 고체 표면 상에 부착된 결합체를 검출한다. 본래 부착되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 수반하는 경우, 표면 상에 부착된 표지의 검출은 결합체 형성이 일어났음을 나타낸다. 본래 부착되지 않은 성분이 표지를 수반하지 않는 경우, 결합체 형성은 예컨대, 부착된 결합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출할 수 있다.
후보 화합물이 본원에서 확인한 유전자에 의해 코딩되는 특정 PRO 폴리펩티드와 상호작용하지만 결합하지 않는 경우, 상기 폴리펩티드와 후보 화합물의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 데 잘 공지된 방법으로 검정할 수 있다. 이러한 검정법에는 예를 들어, 교차-결합, 동시-면역침전, 및 농도구배 또는 크로마토그래픽 컬럼을 통한 동시-정제와 같은 전통적인 방법이 포함된다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 (Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 89: 5789-5793 (1991))에 개시된 바와 같이 필드와 공동-연구자들의 문헌 (Fields and Song, Nature (London), 340: 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582 (1991))에 기재된 효모-기재 유전계로 관찰할 수 있다. 효모 GAL4와 같은 많은 전사 활성자는 두 개의 물리적으로 구별되는 조절 도메인으로 구성되어 있는데, 하나는 DNA-결합 도메인으로 작용하고 다른 하나는 전사-활성화 도메인으로 작용한다.
상기 문헌에 기재된 효모 발현계 (일반적으로 "투-하이브리드 시스템"으로 불림)는 이 특성을 이용하여 두 가지 하이브리드 단백질을 사용하는데, 한 개의 하이브리드 단백질에는 표적 단백질이 GAL-4의 DNA-결합 도메인에 결합되어 있고, 또다른 하이브리드 단백질에는 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인에 결합되어 있다. GAL4-활성화 프로모터의 조절 하의 GAL1-lacZ 레포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 달려 있다. 상호작용하는 폴리펩티드를 함유하는 클론은 β-갈락토시다제에 대한 정색 기질로 검출한다. 투-하이브리드 기술을 사용하여 특정 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위한 완전한 키트 (MATCHMAKER(상표명))가 클론텍으로부터 시판된다. 이 계는 이들 상호작용에 중요한 핀포인트 아미노산 잔기 뿐만 아니라 특정한 단백질 상호작용에 관여하는 단백질 도메인을 맴핑하는 데에도 사용할 수 있다.
본원에서 확인한 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 다른 세포내 또는 세포외 성분의 상호작용을 방해하는 화합물은 하기와 같이 시험할 수 있다. 통상적으로, 상기 유전자 생성물과 세포내 또는 세포외 성분을 함유한 반응 혼합물은 이들 두 생성물을 상호작용시키고 결합시키는 조건 하에서 충분한 시간 동안 제조한다. 결합을 억제하는 후보 화합물의 능력을 시험하기 위해, 반응은 시험 화합물의 존재 및 부재 하에 수행한다. 또한, 위약을 제3 반응 혼합물에 첨가하여 양성 대조군으로 사용할 수 있다. 상기 혼합물에 존재하는 시험 화합물과 세포내 또는 세포외 성분 사이의 결합 (결합체 형성)은 상기에 기재한 바와 같이 관찰한다. 대조 반응물(들)에는 결합체가 형성되지만 시험 화합물을 함유하는 반응 혼합물에는 결합체가 형성되지 않는 것은 시험 화합물이 후보 화합물과 그의 반응 파트너의 상호작용을 방해한다는 것을 나타낸다.
만약 PRO 폴리펩티드가 코-마이토겐 ConA의 존재 하에 내피세포의 증식을 자극하는 능력을 갖는다면, 이 능력을 이용하는 스크리닝 방법의 한 예가 있다. 구체적으로는, 증식 검정법에서 인간 배꼽정맥 내피세포를 수득하여 96-웰 평편-바닥 배양 플레이트에서 배양하고 (Costar, Cambridge, MA), 세포 증식을 촉진하기에 적당한 반응 혼합물, 즉 Con-A를 함유한 혼합물 (Calbiochem, La Jolla, CA)로 보충한다. Con-A 및 스크리닝할 화합물을 첨가하고, 37℃에서 배양한 후 배양물을 통해3H-티미딘을 펄스로 넣고 유리 섬유 필터 (phD:; Cambridge Technology, Watertown, MA) 위에서 세포를 모았다. 액체 신틸레이션 카운터 (Beckman Instrument, Irvine, CA)를 사용하여 삼중 배양물의 평균3H-티미딘 삽입양 (cpm)을 계산한다. 상당한3H-티미딘 삽입은 내피세포 증식의 자극을 나타낸다.
길항제를 검정하기 위해, 상기 검정법을 수행하나, 이 검정법에서 PRO 폴리펩티드를 스크리닝할 화합물과 함께 첨가하고, PRO 폴리펩티드의 존재 하에서3(H)-티미딘 삽입을 억제하는 화합물의 능력은 상기 화합물이 PRO 폴리펩티드에 대한 길항제임을 나타낸다. 별법으로, 길항제는 경쟁적인 억제 검정법에 적당한 조건 하에서 PRO 폴리펩티드 및 잠재적인 길항제를 막결합 PRO 폴리펩티드 수용체 또는 재조합 수용체와 결합시켜 검출할 수 있다. 상기 PRO 폴리펩티드는 방사능과 같은 것으로 표지할 수 있어서 잠재적인 길항제의 효능을 측정하는 데 수용체에 결합된 PRO 폴리펩티드의 수를 사용할 수 있다. 수용체를 코딩하는 유전자는 당업계에 공지된 다수의 방법, 예컨대 리간드 패닝 및 FACS 분류로 확인할 수 있다 (Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)). 바람직하게는, 발현 클로닝을 사용하여 폴리아데닐화된 RNA를 PRO 폴리펩티드에 반응하는 세포로부터 제조하고, RNA로부터 만들어진 cDNA 라이브러리를 집단으로 나누어 PRO 폴리펩티드에 반응하지 않는 COS 세포 또는 기타 세포를 형질감염시키는 데 사용한다. 유리 슬라이드 위에 자란 형질감염된 세포를 표지된 PRO 폴리펩티드에 노출시켰다. 부위-특이적 단백질 키나제에 대한 인식 부위의 요오드화 또는 포섭 (inclusion)을 비룻한 다양한 방법으로 표지할 수 있다. 고정 및 인큐베이션 후, 상기 슬라이드를 방사능 사진으로 분석한다. 양성 집단을 확인하고 하위집단을 준비한 후, 상호작용성 하위-집단화 (pooling) 및 재스크리닝 방법을 사용하여 다시 형질감염시켜서 결과적으로 잠정적인 수용체를 코딩하는 단일 클론을 얻는다.
수용체 확인을 위한 대안으로서, 표지된 PRO 폴리펩티드를 수용체 분자를 발현하는 세포막 또는 추출물과 광친화-결합시킬 수 있다. 가교된 물질을 PAGE로 해상하고 X-선 막에 노출시킨다. 수용체를 함유하는 표지된 결합체를 잘라내어 펩티드 단편으로 해상하고 단백질 미세-시퀀싱할 수 있다. 미세-시퀀싱으로부터 얻은 아미노산 서열은 잠정적인 수용체를 코딩하는 유전자를 확인하기 위해 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 데 쓰이는 축퇴 (degenerate) 올리고뉴클레오티드 프로브의 세트를 디자인하는 데 사용할 것이다.
길항제에 대한 또다른 검정법에서, 수용체를 발현하는 포유동물 세포 또는 막 준비물은 후보 화합물의 존재 하에서 표지된 PRO 폴리펩티드와 함께 인큐베이션할 것이다. 그 다음으로, 이 상호작용을 상승시키거나 차단하는 화합물의 능력을 측정할 것이다.
심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 치료에 유용한 조성물에는 표적 유전자 생성물의 발현 및(또는) 활성을 억제하는 항체, 작은 유기 및 무기 분자, 펩티드, 포스포펩티드, 안티센스 및 리보자임 분자, 3중-헬릭스 분자 등이 포함되나, 여기에 제한되지 않는다.
잠재적인 길항제의 보다 구체적인 예로는 PRO 폴리펩티드와 이뮤노글로불린 항체의 결합에 결합하는 올리고뉴클레오티드, 및 구체적으로는 인간 항체 및 항체 단편 뿐만 아니라, 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체, 및 항체 단편, 단쇄 항체, 항-이디오타입 항체, 및 이러한 항체 또는 단편의 키메라 또는 인간화된 항체를 포함한 항체가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 별법으로, 잠재적인 길항제는 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들어 수용체를 인식하나 효과를 나타내지 않아 PRO폴리펩티드의 작용을 경쟁적으로 억제하는 PRO 폴리펩티드의 돌연변이 형태일 수 있다.
또다른 잠재적인 PRO 폴리펩티드 길항제 또는 아고니스트는 안티센스 기술을 이용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 구축물인데, 여기서 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 예컨대, 표적 mRNA와 혼성화하여 단백질 번역을 방해함으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하는 작용을 한다. 안티센스 기술은 3중-헬릭스 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 유전자 발현을 조절하는 데 사용할 수 있으며, 이들 방법 둘다는 DNA 또는 RNA와 폴리뉴클레오티드의 결합을 기초로 한다. 예를 들면, 본원에서 성숙 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 코딩부는 길이가 약 10 내지 40 bp인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 디자인하는 데 사용한다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사 (triple helix - Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991) 참조)에 관여하는 유전자의 영역에 상보적이어서 PRO 폴리펩티드의 전사 및 생성을 방해하도록 디자인한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 mRNA와 혼성화하여 PRO 폴리펩티드로의 mRNA 분자 번역을 차단한다 (안티센스-Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)). 상기 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체내에서 발현되어 PRO 폴리펩티드의 합성을 억제하도록 세포로 전달될 수도 있다. 안티센스 DNA를 사용하는 경우, 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 번역-개시 부위,예컨대 약 -10과 +10 위치 사이의 표적 유전자 뉴클레오티드 서열로부터 유도한 올리고디옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.
안티센스 RNA 또는 DNA 분자의 길이는 일반적으로 약 5개 염기 이상, 약 10개 염기 이상, 약 15개 염기 이상, 약 20개 염기 이상, 약 25개 염기 이상, 약 30개 염기 이상, 약 35개 염기 이상, 약 40개 염기 이상, 약 45개 염기 이상, 약 50개 염기 이상, 약 55개 염기 이상, 약 60개 염기 이상, 약 65개 염기 이상, 약 70개 염기 이상, 약 75개 염기 이상, 약 80개 염기 이상, 약 85개 염기 이상, 약 90개 염기 이상, 약 95개 염기 이상, 약 100개 염기 이상, 또는 그 이상이다.
잠재적인 길항제에는 활성 부위, 수용체 결합 부위, 또는 PRO 폴리펩티드의성장 인자나 다른 관련 결합 부위에 결합하는 소분자가 포함된다. 소분자의 예로는 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드, 및 합성 비펩티딜 유기 또는 무기 화합물이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 상보적인 표적 RNA와의 서열 특이적 혼성화에 이은 핵산내부절단성 절단 (endonucleolytic cleavage)을 통해 작용한다.
잠재적인 RNA 표적 내의 특이적인 리보자임 절단 부위는 공지된 기술로 확인할 수 있다. 더 자세한 내용은 문헌 (Rossi, Current Biology, 4: 469-471 (1994), and PCT 공개 번호 제WO 97/33551 (1997년 9월 18일 공개됨))을 참조한다.
전사를 억제하는 데 사용되는 3중-헬릭스 형성의 핵산 분자는 단일 가닥이고 디옥시뉴클레오티드로 구성될 것이다. 이들 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 일반적으로 듀플렉스의 한 가닥 상에 퓨린 또는 피리미딘의 꽤 큰 스트레취를 필요로하는 Hoogsteen 염기-짝짓기 규칙을 통해 3중-헬릭스 형성을 촉진하도록 디자인한다. 보다 자세한 내용은 문헌 (상기 PCT 공개 번호 제WO 97/33551)을 참조한다.
이들 소분자는 본원에서 상기에 논의한 1종 이상의 임의의 스크리닝 검정법및(또는) 당업자에 잘 공지된 임의의 다른 스크리닝 기술로 확인할 수 있다.
x. 치료받아야 하는 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 형태
본원에서 기재한 심혈관, 내피성 및 혈관신생 검정법에서 활성을 나타내는 PRO 폴리펩티드, 그에 대한 아고니스트 또는 길항제, 및(또는) 심혈관계에 위치한 것으로 확인된 그의 유전자 생성물은 당뇨병과 같이 혈관에 영향을 주는 전신질환을 포함하여 다양한 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 치료 용도를 갖을 가능성이 있다. 이들의 치료 용도에는 동맥, 모세혈관, 정맥, 및 (또는) 림프관의 질병이 포함된다. 치료의 예로는 근육 소모병의 치료, 골다공증의 치료, 이식물 주위의 세포 성장을 자극하여 의도한 부위에 대한 이식물의 부착을 용이하게 하는 이식물 고정의 보조, 조직 또는 혈청의 IGF 안정성 증가, 및 적용가능하다면 IGF 수용체에 대한 결합 증가 (IGF가 시험관내에서 인간 골수 적혈구 및 과립성 전구세포 성장을 촉진하는 것으로 나타나기 때문임)가 있다.
PRO 폴리펩티드, 그에 대한 아고니스트 또는 길항제는 적혈구조혈 또는 과립구조혈을 자극하는 데; 조직, 예컨대 결합조직, 피부, 골, 연골, 근육, 폐 또는 신장의 재성장과 관계된 치료법과 관련된 창상 또는 조직 재생을 자극하는 데; 및 혈관신생을 촉진하는 데; 내피세포의 이동을 자극하거나 억제하는 데; 및 혈관 평활근의 성장 및 내피세포 생성을 상승시키는 데 사용할 수도 있다. PRO 폴리펩티드 또는 길항제에 의해 매개되는 혈관신생의 증가는 허혈 조직, 및 관상 협착증을 수반하는 심장의 측부 관상 발달에 이롭다. 길항제는 이러한 폴리펩티드의 작용을 억제하는 데 사용하는데, 예를 들어 PRO 폴리펩티드가 창상 치유 또는 폐섬유증 과정동안 과도한 결합 조직의 생성을 촉진한다면 이러한 생성을 제한하는 데 사용한다. 이것은 급성 심근경색증 및 심부전의 치료를 포함할 것이다.
게다가, 본 발명은 치료 유효량의 PRO 폴리펩티드, 그에 대한 아고니스트 또는 길항제를 투여하여 근원적인 원인과 관계없이 심비대증을 치료하는 것에 관한 것이다. 목적이 인간 환자의 치료라면, PRO 폴리펩티드는 재조합 인간 PRO 폴리펩티드 (rhPRO 폴리펩티드)가 바람직하다. 심비대증의 치료는 임의의 다양한 단계에서 수행할 수 있는데, 상기 심비대증은 심근경색증, 고혈압, 비대증성 심근병증 및 판역류를 비롯한 다양한 병리적 상태로부터 발생할 수 있다. 치료는 근원적인 심장 질환과 관계 없이 심근의 구조적인 손상이 있거나 없는 심비대증의 모든 진행 단계까지 확장된다.
분자 자체, 또는 이 분자에 대한 항체와 반대로 작용하는, 임의의 특정 징후에 대한 그의 아고니스트를 사용할지 사용안할지를 결정하는 것은 본원의 분자가 심혈관형성, 내피세포 생성 또는 혈관신생을 촉진하는지, 아니면 이들 상태를 억제하는지에 주로 달려 있다. 예를 들어, 분자가 혈관신생을 촉진한다면, 그의 길항제는 혈관신생을 제한하거나 방해하는 것이 필요한 질환의 치료에 유용할 것이다. 이러한 질환의 예로는 혈관종과 같은 혈관 종양; 종양 혈관신생; 당뇨성 망막병증또는 미성숙 소아 망막병증, 또는 황반퇴행성 및 증식성 유리체망막병증과 관련된 망막, 맥락막, 각막의 혈관신생; 류마티스성 관절염; 크론병, 죽상경화증, 난소 과자극증후군, 건선, 혈관신생과 관련된 자궁내막증, 풍선 혈관성형술 후의 재발협착증, 예컨대 수술 후 형성된 켈로이드에서 나타난 반흔 조직의 과다형성, 심근경색증 후의 섬유증, 또는 폐섬유증과 관련된 섬유 손상이 있다.
그러나, 만약 상기 분자가 혈관신생을 억제한다면, 이 분자를 상기 질환의 치료용으로 직접 사용할 수 있을 것이다.
한편, 상기 분자가 혈관신생을 자극한다면, 말초 혈관 질환, 고혈압, 염증성 혈관염, 레이나우드병 및 레이나우드 증후군, 동맥류, 대동맥 재발협착증, 혈전성정맥염, 림프관염, 림프부종, 창상 치유 및 조직 회복, 허혈, 재관류 손상, 협심증, 급성 심근경색증과 같은 심근경색증, 만성 심장 질환, 울혈성 심부전과 같은 심부전 및 골다공증과 같이 혈관신생이 바람직한 질환을 위해 그 자체 (또는 그의 아고니스트)를 사용할 것이다.
그러나, 만약 상기 분자가 혈관신생을 억제한다면, 혈관신생이 바람직한 상기 질환의 치료용으로 상기 분자의 길항제를 사용할 것이다.
특정한 형태의 질환이 하기에 기재되어 있는데, 여기서 본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 혈관-관련 약물 표적화에 유용한 것으로서, 또는 하기 질환의 치료 또는 예방용 치료 표적으로서 작용가능하다. 죽상경화증은 동맥벽 내의 지질 축적, 평활근 세포의 증식 및 섬유 조직의 형성으로 인한 동맥의 내막 비후화 플라크의 축적에 의해 특징지워지는 질환이다. 상기 질환은 임의의 기관에 있는대동맥, 중동맥 및 소동맥에 영향을 줄 수 있다. 내피세포 및 혈관 평활근 세포 기능의 변화는 이들 플라크의 축적 및 퇴행을 조절하는 데 중요한 역활을 하는 것으로 알려져 있다.
고혈압은 전신 동맥, 폐동맥 또는 문맥계의 상승된 혈압에 의해 특징지워진다. 상승된 혈압은 손상된 내피세포 기능 및(또는) 혈관 질환으로부터 초래되거나, 손상된 내피세포 기능 및(또는) 혈관 질환을 초래할 수 있다.
염증성 혈관염에는 거대 세포 동맥염, 타카야수 동맥염, 결절성 다발동맥염 (미세혈관병증 형태를 포함함), 가와사키병, 현미경 다발염, 베게너 육아종증, 및 다양한 감염-관련 혈관 질환 (헤노호-쉐라인 자반증을 포함함)이 포함된다. 바뀐 내피세포 기능은 이들 질환에서 중요한 것으로 나타났다.
레이나우드병 및 레이나우드 증후군은 추위에 노출시 사지를 통해 순환의 비정상적인 간헐적 손상에 의해 특징지워진다. 바뀐 내피세포 기능은 이 질환에서 중요한 것으로 나타났다.
동맥류는 바뀐 내피세포 및(또는) 혈관 평활근 세포와 관련된 동맥계 또는 정맥계의 낭상형 또는 방추형 확장이다.
동맥 재발협착증 (동맥벽의 재발협착증)은 내피세포 및 혈관 평활근세포의 기능 및 증식에 있어서 변화의 결과로서 혈관성형술 후에 발생할 수 있다.
혈전성정맥염, 림프관염은 바뀐 내피세포 기능으로부터 초래할 수 있고(거나), 바뀐 내피세포 기능을 초래할 수 있는 정맥 및 림프관 각각의 염증성 질환이다. 유사하게, 림프부종은 내피세포 기능으로부터 발생되는 손상된 림프 혈관을수반하는 질병이다.
양성 및 악성 혈관 종양 족은 혈관계 세포 요소의 비정상적인 증식 및 성장에 의해 특징지워진다. 예컨대, 림프관종은 신생아에서 흔히 발생하는 종종 낭성의 선청성 림프관 기형인 림프계의 양성 종양이다. 낭성 종양은 인접한 조직 내까지 성장하는 경향이 있다. 낭성 종양은 대개 자궁 및 겨드랑 부위에서 발생한다. 이들은 사지의 연조직에서 발생할 수도 있다. 주요 증상은 부풀고 종종 그물모양 구조의 림프관, 및 결합조직에 의해 둘러쌓인 림프구이다. 림프관종은 부적절하게 결합된 배아 림프관 또는 이들의 결핍에 의해 발생되는 것으로 생각된다. 손상된 국소 림프 배출이 그 결과이다 (Griener et al., Lymphology, 4: 140-144 (1971)).
본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그에 대한 길항제의 또다른 용도는 종양이 성장하고(거나) 전이할 수 있게 하는 종양의 혈관형성을 수반하는 종양 혈관신생의 예방에 있다. 이 과정은 새로운 혈관의 성장에 달려 있다. 종양 혈관신생을 수반하는 신생물 및 관련 질환의 예로는 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 결장직장암, 간암, 난소암, 난포막종, 남성배세포종, 자궁암, 자궁내막암, 자궁내막 증식증, 자궁내막증, 섬유육종, 융모막암종, 머리 및 목 암, 비강인두암, 후두암, 간모세포종, 카포시 육종, 흑색종, 피부암, 혈관종, 해면혈관종, 혈관모세포종, 췌장암, 망막모세포종, 성상세포종, 교모세포종, 슈반종, 핍지교종, 수모세포종, 신경모세포종, 횡문근육종, 골육종, 평활근육종, 요도육종, 갑상선암, 윌름스종양, 신장세포암, 전립선암, 모반증과 관련된 비정상적 혈관 증식, 부종 (뇌종양과 관련된 것과 같은 것)및 메이그스 증후군이 있다.
연령-관련 황반퇴화증 (AMD)은 나이가 든 집단에서 심각한 시각 손실의 주요 원인이다. AMD 삼출 형태의 특징은 맥락 혈관신생 및 망막 색소 상피세포 탈착이다. 맥락 혈관신생이 예후에 있어서 급격한 악화와 관련되어 있기 때문에, PRO 폴리펩티드 또는 그에 대한 길항제는 AMD의 심각도를 완화시키는 데 유용한 것으로 기대된다.
창상 치유 및 조직 회복과 같은 외상의 치유 역시 본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그들의 길항제의 용도이다. 새로운 혈관의 형성 및 퇴행은 조직 치유 및 회복에 필수적이다. 이 카테고리에는 화상, 절개 및 궤양의 치료에 있어서 창상 치유 및 조직 회복 및 교체 뿐만 아니라 골, 연골, 힘줄, 인대 및(또는) 신경 조직 성장 또는 재생이 포함된다. 골이 정상적으로 형성되지 않는 환경 하에서 연골 및(또는) 골 성장을 유도하는 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 인간 및 다른 동물에서 골 골절, 및 연골 손상 또는 결함의 치료에 적용된다. PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제를 사용하는 조제는 개방성 골절 뿐만 아니라 폐쇄성 골절 완화에 있어서 예방 용도를 갖고 인골 관절의 개선된 고정에 있어서도 용도를 갖는다. 골생성제에 의해 유도된 새로운 골 형성은 선천성 두개안면 결함, 외상에 의해 유도된 두개안면 결함, 또는 종양성 두개안면 결함 또는 절개에 의해 유도된 두개안면 결함의 회복에 기여하고, 미용 성형 수술에도 유용하다.
PRO 폴리펩티드 또는 그에 대한 길항제는 압력 궤양, 혈관 부족과 관련된 궤양, 수술 및 외상적 창상 등을 포함하나 여기에 제한되지 않는 비-치유 창상의 보다 향상된 또는 보다 빠른 폐쇄를 촉진하는 데 유용할 수도 있다.
PRO 폴리펩티드 또는 그에 대한 길항제는 기관 (예컨대, 췌장, 간, 장, 신장, 피부 또는 내피), 근육 (평활근, 골격근 또는 심근), 및 혈관 (혈관 내피 포함함) 조직과 같은 다른 조직의 생성 또는 재생, 또는 이러한 조직을 포함한 세포의 성장 촉진에 대한 활성을 나타낼 수도 있다. 원하는 효과의 일부는 섬유성 반흔형성의 억제 또는 조절에 의해 정상 조직이 재생하게 할 수 있는 것이다.
본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그에 대한 길항제는 소화관 보호 또는 재생, 및 폐 또는 간 섬유증, 다양한 조직의 재관류 손상 및 전신적인 사이토카인 손상으로부터 발생하는 질병의 치료에 유용할 수도 있다. 또한, PRO 폴리펩티드 또는 그에 대한 길항제는 전구 조직 또는 전구 세포로부터 상기 조직의 분화를 촉진 또는 억제하는 데 유용할 수 있거나, 상기 조직의 성장을 억제하는 데 유용할 수 있다.
PRO 폴리펩티드 또는 그에 대한 길항제는 치주질환의 치료 및 다른 치아-회복 과정에 사용할 수도 있다. 이러한 약제는 골-형성 세포를 끌어당기거나, 골-형성 세포의 성장을 자극하거나, 골-형성 세포 전구체의 분화를 유도하는 환경을 제공할 수 있다. 본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그에 대한 길항제는 골 및(또는) 연골 회복의 자극을 통해서, 또는 염증 과정에 의해 매개되는 조직 파괴 (콜라게나제 활성, 파골세포 활성 등)의 염증 또는 과정을 차단함으로써 골다공증 또는 골관절염의 치료에 유용할 수도 있는데, 이는 혈관이 골 교체 및 성장의 조절에 중요한 역할을 하기 때문이다. 본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그에 대한 길항제에 기인할 수 있는 조직 재생 활성의 또다른 카테고리는 힘줄(인대) 형성이다. 이러한 조직이정상적으로 형성되지 않은 환경에서 힘줄(인대)-유사 조직 또는 다른 조직 형성을 유도하는 단백질은 인간 및 다른 동물에서 힘줄 또는 인대 누액, 변형, 및 다른 힘줄 또는 인대 결함의 치유에 적용가능하다. 이러한 조제는 골 또는 다른 조직에 힘줄 또는 인대를 고정하는 것을 개선하고 힘줄 또는 인대 조직의 결함을 회복하는 데 있어서 용도를 갖을 수 있을 뿐만 아니라 힘줄 또는 인대 조직의 손상을 예방하는 데 있어서 예방 용도를 갖을 수 있다. 본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그에 대한 길항제의 조성물에 의해 유도된 새로운 힘줄(인대)-유사 조직 형성은 선천성 힘줄 또는 인대 결함, 외상에 의해 유도된 힘줄 또는 인대 결함, 또는 다른 유래의 기타 힘줄 또는 인대 결함에 기여하고, 힘줄 또는 인대의 부착 또는 회복을 위한 미용 성형 수술에도 유용하다. 본원의 조성물은 힘줄 또는 인대 형성 세포를 끌어당기거나, 힘줄 또는 인대 형성 세포의 성장을 자극하거나, 힘줄 또는 인대 형성 세포의 전구체의 분화를 유도하거나, 조직 회복에 영향을 주기 위한 생체내 복구를 위해 생체외에서 힘줄(인대) 세포 또는 전구체의 성장을 유도하는 환경을 제공한다. 본원의 조성물은 건염, 수근관증후군 및 기타 힘줄 또는 인대 결함의 치료에 유용할 수도 있다. 상기 조성물은 당업계에 잘 공지된 담체로서 적당한 매트릭스 및(또는) 분포획제를 포함할 수도 있다.
PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 신경세포의 증식 및 신경조직과 뇌조직의 재생, 즉 기계적 및 외상적 질환 뿐만 아니라 신경세포 또는 신경조직의 퇴화, 사멸, 또는 외상을 수반하는 중추 및 말초 신경계 질환 및 신경병증의 치료에 유용할 수도 있다. 보다 구체적으로, PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 말초 신경손상, 말초 신경병증 및 국소 신경병증과 같은 말초 신경계 질환, 및 알쯔하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성측삭경화증 및 샤이-드래거 증후군과 같은 중추 신경계 질환의 치료에 유용할 수 있다. 본 발명에 따라 치료가능한 추가 질환에는 기계적 및 외상적 질환, 예컨대 척수 질환, 머리 외상, 및 졸중과 같은 뇌혈관 질환이 포함된다. 화학치료법 또는 다른 의학적 치료법으로부터 발생한 말초 신경병증은 본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그에 대한 길항제를 사용하여 치료할 수도 있다.
허혈-재관류 손상은 또다른 질환이다. 내피세포 기능저하는 허혈-재관류 손상 후에 일어나는 후유증의 개시 및 조절 둘다에 중요할 수 있다.
류마티스성 관절염은 또다른 질환이다. 맥관계를 통한 혈관 성장 및 염증세포의 표적화는 류마티스성 관절염 및 혈청반응-음성 형태의 관절염의 병리과정에 중요한 성분이다.
PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 질환의 진행을 예방하고, 무증상 환자의 사망을 비롯해 갑작스러운 사망을 피하기 위해 심비대증을 앓는 환자에게 예방 투여할 수도 있다. 광범성 좌심실 심비대증 (성인의 경우에는 35mm 이상의 최대 벽 두께, 또는 어린이의 경우에는 비교가능한 값)으로 진단받은 환자의 경우, 및 심장 상의 혈액동력학적 과부하가 상당히 강한 경우에는 이러한 예방 요법이 특히 확실하다.
PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 실질적으로 비대증성 심근병증으로 진단받은 일부 환자에서 발달하는 심방세동의 관리에 유용할 수도 있다.
추가 질환에는 협심증, 급성 심근경색증과 같은 심근경색증, 및 울혈성 심부전과 같은 심부전이 포함된다. 추가적인 비종양성 질환에는 건선, 당뇨성 증식 망막병증과 미숙아 망막병증을 포함한 기타 증식성 망막병증, 수정체후부 섬유증식증, 신생혈관 녹내장, 갑상선 과다증식증 (그레이브스병을 포함함), 각막 및 기타 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 신증후군, 전자간증, 복수증, 심낭삼출증 (심낭과 관련된 것과 같은 것) 및 흉막삼출증이 포함된다.
상기의 관점에서, 내피세포 기능, 증식 및(또는) 형태를 바꾸거나 손상을 주는 것으로 나타난, 본원에 기재된 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제는 상기 기재한 다수의 질병 또는 모든 질병의 병인 및 발병기전에 중요한 역할을 하는 것 같으므로, 이들 과정을 증대시키거나 억제하기 위한 치료 표적으로서, 또는 이들 질환에서 혈관-관련 약물 표적화를 위한 치료 표적으로서 작용할 수 있다.
xi. 투여 프로토콜, 스케줄, 투여량 및 제제
본원의 분자 및 그에 대한 아고니스트와 길항제는 상기에 기재한 다양한 질환 및 장애의 예방제 및 치료제로서 제약학적으로 유용하다.
PRO 폴리펩티드 또는 아고니스트 또는 길항제의 치료 조성물은 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 적당한 순도의 원하는 분자를 임의로 제약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Science, 16th edition, Osol, A. ed. (1980))와 혼합하여 저장용으로 제조한다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 양 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충용액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 옥타데실디메틸벤질 암노늄 클로라이드와 같은 방부제; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀 및 m-크레졸; 저분자량 (약 10개 잔기 이하)의 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 및 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 슈크로스, 만니톨, 트레하로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대 이온; 금속 착화물 (예컨대, Zn-단백질 착화물); 및(또는) TWEEN (상표명), PLURONICS (상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다.
이러한 담체의 추가 예로는 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 포스페이트와 같은 완충 물질, 글리신, 소르브산, 포타슘 소르베이트, 포화된 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질이 있고, 전해질의 예로는 프로타민 술페이트, 디소듐 히드로겐 포스페이트, 포타슘 히드로겐 포스페이트, 소듐 클로라이드, 아연염, 실리카 콜로이드, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기재 물질 및 폴리에틸렌 글리콜이 있다. 국소 형태 또는 겔-기재 형태의 길항제용 담체로는 카르복시메틸셀룰로스 또는 메틸셀룰로스와 같은 폴리사카라이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 나무 왁스 알콜이 있다. 모든 투여를 위해, 통상적인 데포 형태를 적당하게 사용한다. 이러한 형태로는 예를 들어, 마이크로캡슐, 나노-캡슐, 리포좀, 반창고, 흡입 형태, 비강 분무, 설하 정제 및 지속-방출 제제가 있다. PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제는 전형적으로 약 0.1 mg/ml 내지 100 mg/ml의 농도의 상기 비히클로 제제화될 것이다.
다른 제제는 형성된 제품에 PRO 폴리펩티드 또는 그에 대한 길항제의 혼입을 포함한다. 이러한 제품은 내피 세포의 생장 및 신생혈관 형성을 조절하는데 사용될 수 있다. 또한, 종양 침윤 및 전이도 상기 제품에 의해 조절될 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 PRO 폴리펩티드 또는 길항제는 멸균되어야 한다. 이는 동결 건조 및 재구성 이전 또는 이후에 멸균 여과막을 통해 여과시킴으로써 용이하게 수행될 수 있다. 전신 투여되는 경우, 상기 PRO 폴리펩티드는 통상 동결 건조 형태로 또는 용액 중에 보관된다. 동결 건조된 형태인 경우, PRO 폴리펩티드 또는 그에 대한 길항제는 통상 사용시 적합한 희석제와의 재구성을 위해 다른 성분과 배합하여 제제화한다. PRO 폴리펩티드 또는 길항제의 액형 제제의 예에는 피하 주사를 위해 단일 투여 바이알에 충전된 멸균, 투명, 무색의 무방부제 용액제가 있다. 반복 사용에 적합한 방부 처리 제약 조성물은 주로 처방전 및 폴리펩티드 유형에 따라,
a) PRO 폴리펩티드 또는 그에 대한 효능제 또는 길항제,
b) 폴리펩티드 또는 기타 분자가 용액 중에서 최대로 안정되도록 pH(바람직하게는 약 4 내지 8)를 유지할 수 있는 완충액,
c) 교반에 의해 유도되는 응집 현상에 대해 폴리펩티드 또는 분자를 일차적으로 안정화시키는 세정제 및 계면활성제,
d) 등장화제(isotonifier),
e) 페놀, 벤질 알콜 및 벤즈에토늄 할라이드(예를 들면, 클로라이드)의 군으로부터 선택되는 방부제, 및
f) 물을 함유할 수 있다.
사용되는 세정제가 비이온성인 경우, 세정제는 예를 들면, 폴리소르베이트(예를 들면, 폴리소르베이트(등록상표)(POLYSORBATE), 트윈(등록상표)(TWEEN) 20, 80 등) 또는 폴록사머(예를 들면, 폴록사머(등록상표)(POLOXAMER) 188)일 수 있다. 비이온성 계면활성제를 사용하면 폴리펩티드가 변성되지 않고 제제를 전단 표면 응력에 노출시킬 수 있다. 또한, 이러한 계면활성제 함유 제제는 폐 투여용 에어로졸 장치 및 바늘없는 제트 주사기(needleless jet injector gun; EP 제257,956호 참조)에 사용될 수 있다.
등장화제는 PRO 폴리펩티드 또는 그에 대한 길항제의 용액 조성물이 등장성을 유지하도록 하기 위해 존재할 수 있으며, 그 예에는 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨 등의 3이 또는 그 이상의 알콜과 같은 다가 당 알콜이 있다. 이들 당 알콜은 단독으로 또는 배합된 상태로 사용될 수 있다. 별법으로, 염화나트륨 또는 기타 적합한 무기염이 용액을 등장액으로 만들기 위해 사용될 수 있다.
완충액은 원하는 pH에 따라 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트 또는 포스페이트 완충액 등일 수 있다. 본 발명의 액형 제제 중 어떤 유형의 pH는 약 4 내지 8, 바람직하게는 대략 생리적 pH로 완충된다.
페놀, 벤질 알콜 및 벤즈에토늄 할라이드(예를 들면, 클로라이드) 등의 방부제는 사용가능한 공지된 항미생물제이다.
통상, 치료용 PRO 폴리펩티드 조성물은 정맥내 주사용 백이나 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개가 있는 바이알과 같이 멸균 투입구가 있는 용기 내에 존재한다. 바람직하게는 상기 제제가 정맥내(i.v.), 피하(s.c.) 또는 근육내(i.m.) 주사에 의해 반복 투여되거나, 또는 비강내 또는 폐 전달에 적합한 에어로졸 제제(EP 제257,956호 참조)로서 투여된다.
또한, PRO 폴리펩티드는 서방성 제제의 형태로 투여될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예에는 상기 단백질을 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 성형품의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예에는 문헌 (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) 및 Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982))에 기재된 바와 같은 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들면, 2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호 및 EP 제58,481호), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트(Langer et al., 상기 문헌), Lupron Depot(등록상표)(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 이루어진 주입가능한 마이크로스피어)와 같은 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(EP 제133,988호)이 포함된다.
에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출시키지만, 어떤 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 항체가 오래 동안 체내에 남아있는 경우, 이는 37 ℃에서 습기에 노출된 결과, 변성 또는 응집되어 생물학적 활성이 감소되고 면역원성이 변화될 수 있다. 단백질의 안정화를 위해 관련된 메카니즘에 따라 합리적인 전략을 설계할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자내 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진다면, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화시킬 수 있다.
또한, 서방성 PRO 폴리펩티드 조성물에는 리포좀에 의해 포획된 PRO 폴리펩티드가 포함될 수 있다. PRO 폴리펩티드를 함유하는 리포좀은 문헌 (DE 제3,218,121호; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); EP 제52,322호; EP 제36,676호; EP 제88,046호; EP 제143,949호; EP 제142,641호; 일본 특허 출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호; 미국 특허 제4,544,545호; 및 EP 제102,324호)에 그 자체로 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 통상, 리포좀은 지질로서 약 30 몰%의 콜레스테롤을 함유하며, 최적의 치료를 위해 선택된 비율이 조정될 수 있는 작은 크기의(약 200 내지 800Å) 단일 적층형이다.
PRO 폴리펩티드 또는 그에 대한 길항제의 치료 유효량은 치료(예방 포함)될 병리적 증상, 투여 방법, 치료에 사용되는 화합물의 유형, 관련된 임의의 보조 치료법, 환자의 연령, 환자의 체중, 일반적인 의학 조건, 의학적 병력 등과 같은 인자에 따라 달라질 것이며, 그 결정은 전문 내과의사가 능숙하게 할 것이다. 따라서, 치료자는 최대의 치료 효과를 얻기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 변화시켜야 한다. PRO 폴리펩티드의 숙주 범위가 좁은 경우에는, 인간 환자의 치료를 위해 인간 PRO 폴리펩티드를 포함하는 제제가 바람직하며, 천연 서열의 인간 PRO 폴리펩티드를 포함하는 제제가 더욱 바람직하다. 임상학자는 투여량이 해당 증상의 치료에 대한 효과가 성취될 때까지 PRO 폴리펩티드를 투여할 것이다. 예를 들어, 치료 목적이 CHF의 치료인 경우에는 진행성 심장 비대증과 관련된 증상을 억제하는 정도로 투여할 것이다. 이 치료법의 진행은 심장 초음파 검사에 의해 용이하게 모니터링된다. 이와 유사하게, 비후성 심근병증을 앓고 있는 환자의 경우, PRO 폴리펩티드는 경험을 바탕으로 투여될 수 있다.
상기 지침에 따라, 효과적인 투여량은 통상 약 0.001 내지 약 1.0mg/kg이며, 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 1.0mg/kg, 가장 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1mg/kg이다.
성인 고혈압 치료에 있어서 비경구적 사용을 위해, 체중 1kg당 주사용 PRO 폴리펩티드 약 0.01 내지 50mg, 바람직하게는 0.05 내지 20mg, 가장 바람직하게는 1 내지 20mg을 일일 1 내지 3회에 걸쳐 정맥내 주사로 투여하는 것이 유리하다. 경구 투여의 경우, 체중 1kg당 약 5mg 내지 1g, 바람직하게는 10 내지 100mg의 PRO 폴리펩티드 기재 분자가 일일 1 내지 3회 투여되는 것이 바람직하다. 내독소의 오염은, 예를 들면 단백질 1mg당 0.5ng 미만의 안전한 수준으로 최소화되어야 함을알아야 한다. 게다가, 인간에 투여하는 경우에는 제제에 대한 멸균성, 발열성, 총체적 안전성 및 순도가 FDA 및 생물학적 표준에서 요구하는 정도에 부합하는 것이 바람직하다.
조직의 재생에 사용되는 PRO 폴리펩티드를 함유하는 제약 조성물의 투여 방식은, 형성되어야 할 조직의 중량, 손상 부위, 손상된 조직의 상태, 상처의 크기, 손상된 조직의 유형(예를 들어, 뼈), 환자의 연령, 성별 및 식이 요법, 감염의 심각성, 투여 시간 및 기타 임상적 인자와 같이 폴리펩티드의 작용을 변화시키는 다양한 인자를 고려하여 주치의가 결정할 것이다. 투여량은 재구성에 사용된 매트릭스의 유형 및 제약 조성물 중 다른 단백질의 포함 여부에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, IGF-I과 같은 기타 공지된 생장 인자를 최종 조성물에 가하는 것도 투여량에 영향을 미칠 수 있다. 치료의 진행은 X-선, 조직형태학적 측정 및 테트라싸이클린 표지 등에 의해 조직과 뼈의 생장 및(또는) 회복을 주기적으로 측정함으로써 모니터링될 수 있다.
PRO 폴리펩티드 또는 효능제나 길항제의 투여는 정맥내, 근육내, 뇌내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 안내, 동맥내, 활액내, 수막강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의한 주사 또는 관주, 또는 하기 기재되는 바와 같은 서방성 시스템 등의 공지된 방법에 따라 투여된다. 또한, PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 국소 및 전신 치료 효과를 나타내기 위해 종양 내부, 종양 주변, 손상부 내부 또는 손상부 주변 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 난소암 치료시 복강내 투여가 특히 유용할 것으로 기대된다.
펩티드 또는 소분자가 길항제 또는 효능제로 사용되는 경우, 이는 액체 또는 고체의 형태로 포유동물에 경구 또는 비경구적으로 투여되는 것이 바람직하다.
염을 형성하고 본원의 하기에 유용한 분자의 약리학상 허용되는 염의 예는 알칼리 금속염(예를 들면, 나트륨염, 칼륨염), 알칼리 토금속염(예를 들면, 칼슘염, 마그네슘염), 암모늄염, 유기 염기염(예를 들면, 피리딘염, 트리에틸아민염), 무기산염(예를 들면, 염산염, 황산염, 질산염), 및 유기산의 염(예를 들면, 아세테이트, 옥살레이트, p-톨루엔술포네이트)이 포함된다.
뼈, 연골, 건 또는 인대 재생에 유용한 본원의 조성물의 경우, 치료 방법에는 조성물을 이식편 또는 장치로서 국소적, 전신적 또는 국부적으로 투여하는 것이 포함된다. 투여되었을 때, 사용되는 치료 조성물은 발열원이 없고 생리적으로 허용가능한 형태여야 한다. 또한, 조성물은 바람직하게는 캡슐화되거나, 뼈, 연골 또는 조직 손상부에 전달하기 위한 점액질 형태로 주사될 수 있다. 국소 투여가 상처 치료 및 조직 복구에 적합할 수 있다. 바람직하게는 뼈 및(또는) 연골 형성을 위해, 단백질 함유 조성물을 뼈 및(또는) 연골 손상부에 전달할 수 있고, 발생중인 뼈 및 연골을 위한 구조를 제공하며, 바람직하게는 신체에 재흡수될 수 있는 매트릭스가 상기 조성물에 포함될 것이다. 그러한 매트릭스는 기타 이식 의학 분야에 현재 사용되고 있는 매트릭스의 형태일 수 있다.
매트릭스 재료의 선택은 생체 상용성, 생분해성, 기계적 특성, 외양 및 공유성에 기초를 둔다. 상기 조성물의 특정한 적용법은 적합한 제제화 방법을 한정할 것이다. 상기 조성물에 대한 효능있는 매트릭스는 생분해성이며, 화학적으로 칼슘술페이트, 트리칼슘 포스페이트, 히드록시아파타이트, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 폴리안하이드라이드로 한정될 수 있다. 기타 효능있는 재료는 생분해성이며, 뼈 또는 콜라겐과 같이 생물학적으로 잘 한정된다. 추가의 매트릭스에는 순수한 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분이 포함된다. 다른 효능있는 매트릭스는 비분해성이며, 소결된 히드록시아파타이트, 바이오글래스, 알루미네이트 또는 기타 세라믹과 같이 화학적으로 한정된다. 매트릭스에는 폴리락트산과 히드록시아파타이트 또는 콜라겐과 트리칼슘 포스페이트와 같은 임의의 상기 재료의 배합물이 포함될 수 있다. 바이오세라믹은 칼슘-알루미네이트-포스페이트와 같은 조성물 중에서 변화될 수 있으며, 공극 크기, 입자 크기, 입자 모양 및 생분해성의 변화를 위해 가공될 수 있다.
구체적인 한 실시양태는 150 내지 800㎛의 직경을 갖는 다공성 입자의 형태로 락트산과 글리콜산이 50:50(몰 중량)으로 이루어진 공중합체이다. 어떤 분야에서는 카르복시메틸 셀룰로스 또는 자가이식 응혈과 같은 격리제를 이용하여 폴리펩티드 조성물이 매트릭스로부터 분리되는 현상을 방지하는 것이 유용할 것이다.
적합한 격리제의 족은 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스 및 카르복시메틸셀룰로스를 포함하는 알킬셀룰로스(히드록시알킬셀룰로스 포함)와 같은 셀룰로스성 물질이며, 카르복시메틸셀룰로스(CMC)의 양이온염이 바람직하다. 다른 바람직한 격리제에는 히알루론산, 알긴산나트륨, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리옥시에틸렌 옥시드, 카르복시비닐 중합체 및 폴리(비닐 알콜)이 포함된다. 본원에 유용한 격리제의 양은 제제의 총 중량을 기준으로 0.5 내지 20 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%이며, 이는 폴리펩티드(또는 그의 길항제)가 중합체 매트릭스에서 제거되는 현상을 방지하고 조성물을 적절히 취급할 수 있게 하는 양이지만, 부모세대의 세포가 매트릭스를 침윤하지 않게 하여 폴리펩티드(또는 그의 길항제)가 부모세대 세포의 뼈 생성 작용을 보조하지 않도록 하는 양이다.
xii. 병용 치료법
해당 질환을 예방 또는 치료함에 있어서 PRO 폴리펩티드 또는 그의 효능제나 길항제의 효과는, 활성 성분을 그러한 목적에 효과적인 다른 제제와 순차적으로 또는 병행하여, 동일한 조성물 중에서 또는 별개의 조성물로서 투여함으로써 개선될 수 있다.
예를 들어, 심장 비대증 치료의 경우, PRO 폴리펩티드 치료법은 공지된 심장 근세포 비대증 인자의 억제제(예를 들면, 페닐에프린과 같은 α-아드레날린 효능제의 억제제; 보센탄(등록상표)(BOSENTAN) 및 목소노딘(등록상표)(MOXONODIN)과 같은 엔도텔린-1 억제제; CT-1에 대한 억제제(미국 특허 제5,679,543호); LIF에 대한 억제제; ACE 억제제; 데스-아스파테이트-안지오텐신 Ⅰ 억제제(미국 특허 제5,773,415호) 및 안지오텐신 Ⅱ 억제제)의 투여와 병행될 수 있다.
고혈압과 관련된 심장 비대증의 치료를 위해, PRO 폴리펩티드는 프로판올롤, 티몰롤, 테르탈올롤, 카르테올롤, 나돌롤, 베탁솔롤, 펜부톨롤, 아세토부톨롤, 아테놀롤, 메토프롤롤 또는 카르베딜롤과 같은 β-아드레날린 수용체 차단제; 퀴나프릴, 카프토프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 베나제프릴, 포시노프릴 또는 리시노프릴과 같은 ACE 억제제; 클로로티아지드, 히드로클로로티아지드, 히드로플루메타지드, 메틸클로티아지드, 벤즈티아지드, 디클로르펜아미드, 아세타졸아미드 또는 인다파미드와 같은 이뇨제; 및(또는) 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀 또는 니카르디핀과 같은 칼슘 채널 차단제와 함께 배합된 상태로 투여될 수 있다. 본원에서 일반명에 의해 확인된 치료제를 포함하는 제약 조성물은 상업적으로 시판되는 것이며, 투여량, 투여, 부작용, 금기사항 등에 대한 제조자의 지시에 따라 투여될 것이다(Physicians' Desk Reference (Medical Economics Data Production Co.: Montvale, N. J., 1997), 51판 참조).
비후성 심근병증의 치료에 있어서 병용 치료법을 위한 바람직한 후보에는 β-아드레날린 차단 약물(예를 들면, 프로프란올롤, 티몰롤, 테르탈올롤, 카르테올롤, 나돌롤, 베탁솔롤, 펜부톨롤, 아세토부톨롤, 아테놀롤, 메토프롤롤 또는 카르베딜롤), 베라파밀, 디페디핀 또는 딜티아젬이 있다. 혈압과 관련된 비대증의 치료는 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀 또는 니카르디핀과 같은 칼슘 채널 차단제; β-아드레날린 차단제; 클로로티아지드, 히드로클로로티아지드, 히드로플루메타지드, 메틸클로티아지드, 벤즈티아지드, 디클로르펜아미드, 아세타졸아미드 또는 인다파미드와 같은 이뇨제; 및(또는) 퀴나프릴, 카프토프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 베나제프릴, 포시노프릴 또는 리시노프릴과 같은 ACE 억제제를 이용하는 고혈압 억제성 약물 치료법을 이용할 필요가 있다.
다른 징후의 경우, PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 뼈 및(또는) 연골 결함, 상처, 또는 해당 조직의 치료에 유익한 다른 제제와 배합될 수 있다. 이러한제제에는 EGF, PDGF, TGF-α 또는 TGF-β, IGF, FGF, 및 CTGF와 같은 다양한 생장 인자가 포함된다.
또한, 암의 치료에 사용되는 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 상기 기재된 바와 같은 세포 독성 제제, 화학치료제 또는 생장-억제제와 배합될 수 있다. 또한, 암 치료용 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 방사선 조사 또는 방사성 물질의 투여를 포함하는 방사선 치료와 병행하여 또는 순차적으로 투여되는 것이 적합하다.
PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제와 배합된 상태로 투여되는 치료제의 유효량은 내과의사 또는 수의사의 재량에 달려있다. 투여량 및 그 조정은 해당 증상이 최대로 치료되도록 정해진다. 예를 들면, 고혈압 치료의 경우, 유효량은 이뇨제 또는 강심제의 용도, 및 고혈압 또는 저혈압, 신장 손상 등과 같은 증상을 고려하는 것이 이상적이다. 부가적으로, 투여량은 사용될 치료제의 유형 및 치료되는 환자와 같은 요인에 따라 달라질 것이다. 통상, 사용되는 양은 해당 치료제가 PRO 폴리펩티드 없이 투여되는 경우와 동일한 양일 것이다.
xiii. 제품
상기 기재된 질환의 진단 또는 치료에 유용한 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제를 함유하는 키트와 같은 제품은 최소한 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 시험관이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 이 용기에는 증상의 진단 또는 치료에 효과적인 조성물이 들어 있으며, 멸균 채취구(access port) (예를 들어, 이용기는 정맥 주사용액 백(bag)이거나, 피하 주사기 바늘이 뚫을 수 있는 마개가 달린 바이알일 수 있음)가 있을 수 있다. 상기 조성물의 활성 성분은 PRO 폴리펩티드 또는 그에 대한 길항제이다. 용기 위에 있거나 용기에 부착되어 있는 라벨은 조성물이 선택된 증상의 진단 또는 치료에 사용된다는 것을 알려준다. 이 제품은 또한 인산염-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용가능한 완충액을 포함하는 제2의 용기를 더 포함할 수 있다. 이 제품은 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 지침이 들어있는 패키지 삽입물을 포함하는, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 재료를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 이 제품은 상기 기재된 바와 같은 다른 활성 약제를 함유하는 제2 또는 제3의 용기를 포함할 수 있다.
E. 항체
본 발명에 따른 가장 장래성있는 약물 후보 중 일부는 본원에서 확인된 유전자 산물의 생성을 억제하고(하거나) 유전사 산물의 활성을 감소시킬 수 있는 항체 및 항체 단편이다.
i. 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 예를 들어 면역화제 및 필요한 경우 보조제를 1회 이상 주사함으로써 포유동물에서 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 면역화제 및(또는) 보조제는 피하 또는 복강내 수회 주사에 의해 포유동물에 주사될 것이다. 면역화제는 PRO 폴리펩티드 또는 그의 결합 단편을 포함할 수 있다. 면역처리되는 포유동물에서 면역원성인 것으로 공지된 단백질에 면역화제를 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예로는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 저해제를 들 수 있다. 사용될 수 있는 보조제의 예는 프로이드 완전 보조제 및 MPL-TDM 보조제 (모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)를 포함한다. 면역처리 방법은 불필요한 실험 없이도 당업계의 숙련가에 의해 선택될 수 있다.
ii. 모노클로날 항체
항-PRO 폴리펩티드 항체는 별법으로 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌 (Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975))에 기재된 바와 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 생쥐, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 통상적으로 면역화제로 면역처리되어 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 별법으로, 림프구는 시험관내에서 면역처리될 수 있다.
면역화제는 일반적으로 PRO 폴리펩티드 또는 그의 결합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인체 기원의 세포를 원하는 경우 말초 혈액 림프구 ("PBL")가 사용되나, 비인간 포유동물 공급원을 원하는 경우에는 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 결합제를 사용하여 림프구와 무한증식 세포주를 결합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). 무한증식 세포주는 대체로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및인체 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 쥐 또는 생쥐 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비결합된 무한증식 세포의 생장 또는 생존을 억제시키는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양시킬 수 있다. 예를 들면, 모세포가 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 생장을 억제시킨다.
바람직한 무한증식 세포주는 효율적으로 결합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 높은 수준의 안정한 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 바람직한 무한증식 세포주는 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고) 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 마나사스)으로부터 입수가능한 쥐과 골수종 세포주이다. 또한, 인간 골수종 세포주 및 생쥐-사람 헤테로골수종 세포주가 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기술되었다 (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63).
하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지를 PRO에 대해 지시된 모노클로날 항체의 존재에 대해 분석하였다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침강법에 의해, 또는 방사성면역분석법(RIA) 또는 효소 결합 면역 흡수 분석법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석에 의해 측정하였다. 이러한 기술 및 분석은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 스캐쳐드 (Scatchard) 분석 (Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980))에 의해 결정할 수 있다.
원하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 제한 희석 절차에 의해 클론을 서브클로닝시키고 표준 방법 (Goding, 상기문헌)으로 배양시켰다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들면, 둘벨코스 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수종양으로서 생체내 배양시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들면, 단백질 A-세파로스 (Sepharose), 히드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 통상의 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 및 정제시킬 수 있다.
또한, 모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차 (예를 들면, 쥐과 동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)를 이용하여 쉽게 단리하고 서열 분석할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 기원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 이어서, 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 원숭이 COS세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성시킬 수 있다. 또한, DNA는 예를 들어 상동성 쥐과 동물 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 (미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., 상기 문헌), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형시킬 수 있다. 그러한 비면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인에 대해 치환되거나, 본 발명의 항체의 한 항체-결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환되어 키메라 2가 항체를 생성시킬 수 있다.
항체는 1이 항체일 수 있다. 1이 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄 가교결합을 방지하기 위해서 중쇄는 일반적으로 Fc 영역의 임의의 지점에서 말단이 절단된다. 별법으로, 관련 시스테인 잔기는 가교결합을 방지하기 위해서 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실된다.
또한, 시험관내 방법도 1이 항체의 제조에 적합하다. 항체 단편, 특히 Fab 단편을 제조하기 위한 항체의 분해는 당업계에 통상적으로 알려진 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
iii. 인간 항체 및 인간화된 항체
본 발명의 항-PRO 항체는 추가로 인간화된 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 비인간(예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 인간화 형태는 키메라 면역글로불린,비인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 포함하는 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2또는 항체의 다른 항원 결합 서열)이다. 인간화된 항체는, 수용체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 비인간 종 (공여 항체)의 CDR의 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린 (수용 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화된 항체는 수용 항체 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비인간 면역글로불린의 영역에 대응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 영역에 대응한다. 또한, 인간화된 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)).
비인간 항체의 인간화 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비인체 기원으로부터의 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트(import)" 잔기로 부르며, 통상적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 인간 항체의 상응하는서열 대신 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988))에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화" 항체는 실질적으로 보다 적은 무손상 인간 가변 도메인이 비인간 종 유래의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제, 인간화된 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기로 치환시킨 인간 항체이다.
인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 당업계에 공지된 여러 기술을 사용하여 제조할 수도 있다 (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Bio., 222: 581-597 (1991)). 또한, 코울 등 및 보에르너 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 사용할 수 있다 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. 마찬가지로, 유전자도입 동물, 예를 들어 생쥐에 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입함으로써 인간 항체를 제조할 수 있는데, 여기서 내부 면역글로불린 유전자는 부분 또는 전체가 실활화된다. 항원투여 후에, 인간 항체 생산이 관찰되었는데, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 목록을 비롯한 모든 점에서 인간에서 관찰되는 항체와 매우 유사하였다. 상기 사항은 예를 들어 문헌 (미국 특허 제5,545,807호, 동 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 5,661,016호) 및 과학간행물 (Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856-859 (1994), Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))에 기재되어 있다.
iv. 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체이다. 이 경우에, 결합 특이성 중의 하나는 PRO 폴리펩티드에 대한 것이고, 다른 하나는 임의 다른 항원, 바람직하게는 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중 특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄/경쇄-중쇄 쌍의 동시발현에 기초하며, 여기에서, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생산하며, 이중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 일반적으로 친화도 크로마토그래피 단계로 수행된다. 유사한 절차가 WO 제93/08829호(1993년 5월 13일에 공개됨) 및 문헌(Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991))에 기재되어 있다.
원하는 결합 특이성을 갖는 항체의 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 결합시킨다. 이 결합은 바람직하게는 힌지, 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 결합이다. 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 결합체의 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 결합체, 및 원한다면 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주 유기체로 공동 형질감염시킨다. 이중특이적 항체를 생산하기 위한 보다 상세한 내용은 예를 들면, 문헌(Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121: 210(1986))을 참조한다.
v. 이종 접합 항체
이종접합 항체는 2개의 공유결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 제91/00360호, 동 제92/200373호, 및 EP 제03089호) 제안되었다. 이종접합 항체는 가교결합제를 사용하는 방법을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 제조할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약은 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트 및 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 시약을 포함한다.
vi. 효과기 기능 조작
효과기 기능에 대해 본 발명의 항체를 변형하여 예를 들어 암치료에 있어 항체의 효과를 증대하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 Fc 영역에 도입하여 이 영역내 쇄간 디술피드 결합을 형성시킬 수 있다. 이와 같이 생성된 호모다이머 항체는 내부화 능력을 향상시키고(시키거나) 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포내 세포독성(ADCC)을 증대시킨다(문헌 (Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992))을 참조한다). 또한, 문헌 (Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993))에 기재된 헤테로이관능성 가교를 사용하여 증대된 항-종양 활성을 지닌 호모다이머 항체를 제조할 수 있다. 또는, 이중의 Fc 영역을 갖는 항체를 조작하여 보체 용균성 및 ADCC 능력을 증대시킬 수 있다(문헌 (Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989))을 참조한다).
vii. 면역복합체
또한, 본 발명은 세포독성 물질, 예를 들어 화학치료제, 독소(예를 들어, 효소적으로 활성인 박테리아, 진균, 식물 또는 동물성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사활성 동위원소(즉, 방사성복합체)와 결합된 항체를 포함하는 면역복합체에 관한 것이다.
상기 면역복합체의 생성에 유용한 화학치료제는 상기에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 쓴멜론(momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테세네스가 포함된다. 여러 방사성핵종을 방사복합체 항체의 제조에 이용할 수 있다. 예에는212Bi,131I,131In,90Y 및186Re가 포함된다.
다양한 이관능성 단백질-연결 물질, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체(예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물(예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성 물질의 복합체를 만들 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987))에 기재된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성뉴클레오디드와 항체를 연결하는 전형적인 킬레이트제이다(WO 94/11026을 참조한다).
또다른 실시태양으로, 항체와 종양 예비표적화에 이용되는 "수용체"(예를 들어, 스트렙타비딘)를 연결할 수 있는데, 여기서 항체-수용체 복합체를 투여 대상에게 투여한 다음, 킬레이트제를 사용하여 순환으로부터 결합하지 않은 복합체를 제거하고 세포독성 물질(예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 연결된 "리간드"(예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
viii. 면역리포좀
본원에서 개시된 항체를 면역리포좀으로 제제화할 수도 있다. 이 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 (Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호)에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 순환 시간이 증대된 리포좀은 문헌 (미국 특허 제5,013,556호)에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 함유하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발법에 의해 생성할 수 있다. 정해진 공극 크기의 필터를 통해 리포좀을 밀어내어 소정의 직경을 갖는 리포좀을 수득하였다. 문헌 (Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982))에 기재된 바와 같이 디술피드-상호교환 반응을 통해 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 리포좀에 연결할 수 있다. 화학요법제(예를 들어, 독소루비신(Doxorubicin))은 임의로 리포좀내에 포함된다(문헌 (Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989))을 참조한다).
ix. 항체 제약 조성물
각종 질환을 치료하기 위해, 본원에서 확인된 PRO 폴리펩티드와 특이적으로결합하는 항체 및 상기 기재된 스크리닝 분석에 의해 확인된 다른 분자를 상기 및 하기에 기재된 다양한 질환의 치료를 위해 제약 조성물 형태로 투여할 수 있다.
PRO 폴리펩티드가 세포내에 있고 항체 전부가 저해제로 사용되는 경우, 내부화 항체가 바람직하다. 그러나, 또한 리포펙션 또는 리포좀을 사용하여 항체 또는 항체 단편을 세포내에 전달할 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 저해성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열을 토대로, 표적 단백질 서열과 결합하는 능력을 지닌 펩티드 분자를 설계할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성하고(하거나) 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다(예를 들어, 문헌 (Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993))을 참조한다).
또한, 본원의 제형은 치료할 특정 증상에 있어 필요에 따라 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 상보적인 활성을 지닌 화합물을 포함할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 이 조성물은 그의 기능을 증대시키는 물질, 예를 들어 세포독성 물질, 시토킨, 화학요법제, 또는 증식-억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 배합된다.
활성 성분은 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에서 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐에 봉입될 수 있다. 상기 기술은문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 문헌)에 개시되어 있다.
체내 투여에 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.
서방성 제제도 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT(등록상표)(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주입가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 있다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출시키지만, 어떤 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 항체가 오랫 동안 체내에 남아있는 경우, 그는 37 ℃에서 습기에 노출된 결과, 변성 또는 응집되어 생물 활성을 감소시키고 면역원성을 변화시킬 수 있다. 안정화를 위해 관련된 메카니즘에 따라 합리적인 전략을 설계할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분재내 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진 다면, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화를 달성할 수 있다.
x. 항체를 이용한 치료 방법
PRO 폴리펩티드에 대한 항체는 상기 언급한 바와 같은 다양한 심혈관계, 내피 및 신생혈관성 증상을 치료하는데 사용될 수 있다고 생각된다.
상기 항체는 볼루스로서의 정맥내 투여 또는 장기간의 연속 관주, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하내, 관절내, 활액내, 수막강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의해 공지된 방법으로 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 항체의 정맥내 투여가 바람직하다.
다른 치료법이 본 발명의 항체 투여와 병행될 수 있다. 예를 들어, 항체가 암을 치료하는 경우에 상기 항체로 치료되는 환자는 방사선 치료를 병행하여 받을 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 환자에게 화학 요법 치료제를 투여할 수 있다. 이러한 화학 요법 치료제의 제조 및 투여 일정은 제조자의 지시를 따르거나 당업계 전문 숙련인에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 또한, 이러한 화학 요법 치료제의 제조 및 투여 일정은 문헌 (Chemotherapy Service Ed., M.C.Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1992)에 기재되어 있다. 화학 요법 치료제는 항체의 투여 전 또는 후에 투여되거나, 동시에 투여될 수 있다. 타목시펜 또는 에비스타(등록상표)(EVISTA)와 같은 항-에스트로겐 화합물 또는 오나프리스톤과 같은 항-프로게스테론 화합물(EP 제616812호 참조)에 대해 공지된 투여량의 상기 분자와 항체를 배합하여 투여할 수 있다.
또한, 항체가 암의 치료에 사용되는 경우, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 또는 VEGF 수용체 중 하나 이상과 결합하는 항체와 같이 기타 종양 관련 항원에 대한 항체를 투여하는 것도 바람직하다. 또한, 이들은 상기 기재된 제제를 포함한다. 또한, 항체는 방사선 조사 또는 방사성 물질의 투여를 포함하는 방사의학 치료와 병행하여 또는 순차적으로 투여되는 것이 적합하다. 별법으로, 또는 추가로, 본원에 개시된 동일하거나 2종 이상의 상이한 항원에 결합하는 2종 이상의 항체를 환자에 동시 투여할 수 있다. 때로는, 환자에 1종 이상의 싸이토카인을 투여하는 것도 유익할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원의 항체를 생장 억제제와 동시에 투여할 수 있다. 예를 들어, 우선 생장 억제제를 투여한 후에 본 발명의 항체를 투여할 수 있다. 그러나, 동시 투여나 본 발명의 항체를 먼저 투여하는 것도 고려할 수 있다. 생장 억제제의 적합한 투여량은 현재 사용되는 투여량이며, 생장 억제제와 본원 항체의 복합 작용(상승)으로 인하여 투여량을 저하시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 종양의 혈관 신생은 병용 치료시 공격받는다. 항-PRO 폴리펩티드 항체 및 기타 항체(예를 들면, 항-VEGF)는 종양의 괴사 또는 그의 전이 병소를 관찰하여 결정된 치료 유효량으로 종양을 앓고 있는 환자에 투여된다. 이 치료법은 추가로 유익한 효과가 관찰되지 않거나 임상 시험이 종양 또는 임의의 전이 병소를 나타내지 않을 때까지 지속된다. 이후에, TNF를 단독으로, 또는 알파-, 베타- 또는 감마-인터페론, 항-HER2 항체, 헤레굴린(heregulin), 항-헤레굴린 항체, D-인자, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 또는 종양에서 미세혈관 응고를 촉진하는 제제(예를 들면, 항-단백질 C 항체, 항-단백질 S 항체 또는 C4b 결합 단백질; 1991년 2월 21일에 공개된 WO 제91/01753호 참조), 또는 열 또는 방사선과 병행하여 투여한다.
보조제는 그 효과가 다양하기 때문에, 종래의 방법으로 매트릭스 스크리닝에 의해 종양에서의 효과를 비교하는 것이 바람직하다. 항-PRO 폴리펩티드 항체 및 TNF의 투여는 원하는 임상 효과가 성취될 때까지 반복한다. 별법으로, 항-PRO 폴리펩티드 항체는 TNF 및 임의로 보조제와 함께 투여된다. 사지, 또는 대순환으로부터 분리될 수 있는 다른 위치에서 충실성 종양이 발견되는 경우, 분리된 종양 또는 기관에 본원의 치료제를 투여한다. 다른 실시양태에서, 항-FGF 또는 항-PDGF 중화 항체와 같은 FGF 또는 PDGF 길항제를 항-PRO 폴리펩티드 항체와 함께 투여한다. 항-PRO 폴리펩티드 항체를 이용한 치료는 상처 치료 또는 원하는 신생혈관 형성시 중지할 수 있다.
심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 예방 또는 치료에 있어서, 본원 항체의 적합한 투여량은 상기 정의한 바와 같이 치료되는 질환의 유형, 심각성 및 질환의 진행 과정, 투여되는 항암제가 예방 목적인지 치료 목적인지, 이전의 치료법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 재량 및 주치의에 따라 달라질 것이다. 이 항체는 일시에 또는 일련의 치료를 통해 환자에 적합하게 투여된다.
예를 들어, 질환의 유형 및 심각성에 따라, 약 1㎍/kg 내지 15mg/kg(예를 들어, 0.1 내지 20mg/kg)의 항체가 1회 이상의 분리된 투여 또는 연속 관주에 의한 환자에의 투여에 대한 초기 후보 투여량이다. 통상적인 일일 투여량 또는 주간 투여량은 상기 언급한 인자에 따라 약 1㎍/kg 내지 100mg/kg 또는 그 이상이다. 증상에 따라 며칠 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 원하는 질환 징후가 억제될 때까지 반복 또는 지속된다. 그러나, 다른 투여량이 효과적일 수도 있다. 이 치료법의 진행은 종래의 기술 및 분석(예를 들면, 방사성 종양 영상화)에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다.
xi. 항체로 제조된 제품
용기에 항체 및 라벨을 포함하는 제품이 제공된다. 이러한 제품은 상기 기재된 바와 같으며, 그 활성 성분은 항-PRO 항체이다.
xii. 항체를 이용한 종양의 진단 및 예후
특정 종양에서 과다 발현되는 생장 수용체와 같은 세포-표면 단백질은 약물 후보 또는 종양(예를 들어, 암) 치료에 대한 훌륭한 표적이지만, 항체가 사용되는 징후가 암인 경우에는 동일한 단백질을 PRO 폴리펩티드와 함께 사용하면 종양의 진단 및 예후에 있어서 부가적인 유용성이 있다. 예를 들면, PRO 폴리펩티드에 대해 유도된 항체는 종양의 진단 또는 예후에 사용될 수 있다.
예를 들어, 항체 단편을 포함하는 항체는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자의 발현을 정성 또는 정량 검출하는데 사용할 수 있다. 항체는 형광 표지와 같이 검출 가능한 표지물이 부착되어 있는 것이 바람직하며, 항체의 결합은 광학현미경법, 유세포 분석법, 또는 당업계에 공지된 다른 기술에 의해 모니터링될 수 있다. 이러한 결합 분석법은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된다.
원래 위치에서(in situ) 마커 유전자 생성물에 대한 항체 결합의 검출은, 예를 들어 면역형광현미경법 또는 면역전자현미경법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 환자로부터 조직학적 시료를 분리하여, 바람직하게는 상기 생물학적샘플에 항체를 올려놓음으로써 표지된 항체를 반응시킨다. 또한, 이 절차는 조사된 조직에서 마커 유전자 생성물이 어떻게 분포하는지 결정하게 해준다. 원래 위치에서의 검출에 다양한 조직학적 방법을 쉽게 이용할 수 있음이 당업계 숙련자들에게 명백할 것이다.
하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌의 개시 내용은 그 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된다.
실시예에서 언급한 시판 시약들은 달리 지시하지 않는 한 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예와 명세서 전반에서 ATCC 기탁 번호로 확인되는 세포들의 입수원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, Manassas, VA)이다. 달리 언급되지 않는 한, 본 발명은 상기 기재된 문헌 및 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Academic Press, Inc.: N.Y., 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis(IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991)에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 기술의 표준 방법을 이용하였다.
실시예 1: 신규 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 cDNA를 확인하기 위한 세포외 도메인 상동성 스크리닝
스위스-프롯(Swiss-Prot) 공개 데이타베이스로부터 약 950개의 공지된 분비형 단백질로부터의 세포외 도메인 (ECD) 서열 (존재하는 경우 분비 신호 서열 포함)을 사용하여 EST 데이타베이스를 검색하였다. EST 데이타베이스는 공개 데이타베이스 (예를 들면, 데이호프(Dayhoff), 진뱅크(GenBank))와 비공개 데이타베이스 (예를 들면, LIFESEQ™ (인사이트 파마슈티칼스(Incyte Pharmaceuticals, 캘리포니아주 팔로 알토))를 포함한다. 검색은 EST 서열의 6개 프레임 번역에 대한 ECD 단백질 서열의 비교로서 컴퓨터 프로그램 WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "프랩(phrap)" (Phil Green, University of Washington, 워싱턴주 시애틀)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다.
본 세포외 도메인 상동성 스크린을 이용하여, 컨센서스 DNA 서열을 프랩을 사용하여 확인된 다른 EST 서열에 대해 어셈블리하였다. 또한, 수득한 컨센서스 DNA 서열을 종종 (항상은 아니지만) 가능한 한 상기 논의한 EST 서열원을 사용하여 컨센서스 서열을 가능한 길게 신장시키기 위해 BLAST 또는 BLAST-2와 프랩의 반복 사이클을 이용하였다.
이어서, 상기한 바와 같이 수득한 컨센서스 서열에 기준하여 올리고뉴클레오티드를 합성하여, PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하기 위해 사용하고 PRO 폴리펩티드에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리시키기 위한 프로브로서 사용하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30개 뉴클레오티드 범위이고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 제공하기 위해 고안된다. 프로브 서열은 대개 40 내지 55 bp 길이이다. 몇몇 경우, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp보다 큰 경우 추가의 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 전장 클론을 위한 몇몇 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 따라 PCR 증폭에 의해 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리시켰다.
cDNA 클론을 단리시키기 위해 사용되는 cDNA 라이브러리는 인비트로젠(Invitrogen, 캘리포니아주 샌디에고)으로부터의 시약들과 같은 시판 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작하였다. cDNA를 NotI 부위를 갖는 올리고 dT로 프라이밍시키고, SalI 헤미키나제화 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 적절한 크기로 분류하고, 적당한 클로닝 벡터 (예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991))을 참조한다)내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
실시예 2: 아밀라제 스크리닝에 의한 cDNA 클론의 단리
1. 올리고 dT 프라이밍된 cDNA 라이브러리의 제조
인비트로젠 (캘리포니아주, 샌디에고)사의 시약 및 프로토콜 (Fast Track 2)을 사용하여 인간 조직으로부터 mRNA를 단리하였다. 미국 메릴랜드주 게터스버그 소재의 Life Technologies사의 시약 및 프로토콜 (Super Script Plasmid System)을 이용하여, 상기 RNA를 사용하여 벡터 pRK5D에 올리고 dT 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. 이 과정에서, 이중 가닥 cDNA의 크기를 1000 bp보다 크도록 선택하고, SalI/NotI 링커 부착 cDNA를 XhoI/NotI 절단 벡터에 클로닝하였다. pRK5D는 sp6 전사 개시 부위, SfiI 제한 효소 부위, XhoI/NotI cDNA 클로닝 부위를 순서대로 포함하는 클로닝 벡터이다.
2. 랜덤 프라이밍된 cDNA 라이브러리의 제조
1차 cDNA 클론의 5' 말단을 우선적으로 제공하기 위해 2차 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. 1차 라이브러리 (상기한 바와 같음)로부터 Sp6 RNA를 생성시키고, 라이프 테크놀로지(Life Technologies)사의 시약 및 프로토콜 (Super Script Plasmid System, 상기한 바와 같음)을 이용하여 상기 RNA를 사용하여 랜덤 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. 이 과정에서, 이중가닥 cDNA를 500 내지 1000 bp의 크기로 만들고, NotI 어댑터에 평활한 상태로 연결시키고, SfiI로 절단하여 SfiI/NotI 절단 벡터에 클로닝하였다. pSST-AMY.0은 cDNA 클로닝 부위 및 생쥐 아밀라제 서열 (성숙 서열, 분비 신호 없음) 앞에 효모 알콜 탈수소효소 프로모터를 갖고 클로닝 부위 뒤에 효모 알콜 디히드로게나제 터미네이터를 갖는 클로닝 벡터이다. 따라서, 프레임내에 아밀라제 서열과 결합된, 상기 벡터 내에 클로닝된cDNA는 적절하게 형질감염된 효모 콜로니로부터 아밀라제를 분비시킬 수 있다.
3. 형질전환 및 검출
상기 단락 2에 기재된 라이브러리로부터의 DNA를 빙상에서 냉각시켜 전기수용성(electorcompetent) DH10B 세균 (Life Technologies) 20 ml을 첨가하였다. 세균 및 벡터 혼합물을 이어서 제조자의 권고대로 일렉트로포레이션시켰다. 이어서, SOC 배지 (Life Technologies) 1 ml을 첨가하고 혼합물을 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후에, 형질전환체를 암피실린 함유 표준 150 mm LB 플레이트 20개에 플레이팅하고 16시간 동안 (37℃)에서 인큐베이션하였다. 양성 콜로니를 플레이트로부터 분리하여 표준 프로토콜, 예를 들어 CsCl-구배법을 사용하여 DNA를 세균 펠렛으로부터 단리하였다. 정제된 DNA를 사용하여 다음과 같은 효모 프로토콜을 수행하였다.
효모 방법은 다음 세개의 카테고리로 분류된다: 1) 플라스미드/cDNA 조합 벡터를 사용한 효모의 형질전환, 2) 아밀라제를 분비하는 효모 클론의 검출 및 단리 및 3) 효모 콜로니로부터 삽입체의 직접 PCR 증폭 및 서열분석 및 추가의 분석을 위한 DNA의 정제.
사용된 효모는 HD56-5A (ATCC-90785)이었다. 이 균주는 MAT 알파, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, MAL+, SUC+, GAL+의 인자형을 갖는다. 바람직하게는, 번역 후 경로가 결여된 효모 변이체를 사용할 수 있다. 이러한 변이체는 sec71, sec72, sec62, 바람직하게는 말단이 잘린 sec71에서 전좌(translocation)로인한 결핍 대립유전자를 가질 수 있다. 별법으로, 상기 유전자의 정상적인 작동을 방해하거나 상기 번역 후 경로에 관련된 다른 단백질 (예를 들어 SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p 또는 SSA1p-4p) 또는 이들 단백질의 복합체 형성을 방해하는 길항제 (안티센스 뉴클레오티드 및(또는) 리간드 포함)를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
형질전환은 문헌 (Gietz et al., Nucl. Acid. Res., 20:1425 (1992))에 개관된 프로토콜에 기초하여 수행하였다. 이어서, 형질전환된 세포를 아가로부터 YEPD 복합 배지 브로쓰 100 ml에 접종하고 30℃에서 밤새 배양하였다. YEPD 브로쓰를 문헌 [Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994)]에 기재된 바와 같이 제조하였다. 밤새 배양한 배양액을 신선한 YEPD 브로쓰 500 ml로 약 2 x 106세포/ml (약 OD600= 0.1)로 희석하여 약 1 x 107세포/ml (약 OD600= 0.4 - 0.5)로 재배양하였다.
세포를 회수한 다음, 형질전환을 준비하였는데, Sorval GS3 로터의 GS3 로터 바틀로 옮겨서 5,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 버리고, 멸균수로 재현탁시켜 Beckman GS-6KR 원심분리기에서 3,500 rpm으로 50 ml 팔콘 튜브에서 다시 원심분리하여였다. 상등액을 버리고, 세포를 LiAc/TE (10 ml, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH7.5, 100 mM Li2OOCCH3)로 세척하여 LiAc/TE (2.5 ml)에 재현탁시켰다.
마이크로 원심분리 튜브에서, 준비한 세포 100 ㎕를 신선한 변성 단일 가닥연어 고환 DNA (미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재 Lofstrand Lab)와 형질전환 DNA 1 ㎍ (부피 < 10 ㎕)와 혼합하여 형질전환을 수행하였다. 혼합물을 볼텍싱에 의해 잠깐 혼합한 후, 40% PEG/TE 600 ㎕ (40% 폴리에틸렌 글리콜-4000, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Li2OOCCH3, pH 7.5)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 부드럽게 혼합하고 30분 동안 교반하면서 30℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 이어서 42℃에서 15분 동안 열 쇼크를 가하고, 반응 용기를 마이크로원심분리기에서 12,000 rpm에서 5 내지 10초 동안 원심분리하여 상등액을 버리고 TE 500 ㎕ (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH7.5)에 재현탁시킨 후 재원심분리하였다. 세포를 TE 1 ml로 희석하고 분취액 200 ㎕를 150 mm 생장 플레이트 (VWR)에서 미리 제조한 선택 배지 상에 도말하였다.
별법으로, 작은 다수회의 반응 대신에, 시약량을 증가시키면서 1회의 대규모의 반응을 이용하여 형질전환을 수행하였다.
사용된 선택 배지는 문헌 (Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994))에 기재된 바와 같이 제조된 우라실 결여된 합성 완전 덱스트로스 아가 (SCD-Ura)이었다. 형질전환체를 30℃에서 2 내지 3일 동안 배양하였다.
아밀라제를 분비하는 콜로니의 검출은 선택 생장 배지 중에 적색 전분을 포함시켜 수행하였다. 문헌 (Biely et al., Anal. Biochem., 172:176-179 (1988))에 기재된 바와 같은 방법에 따라 전분을 적색 염료 (반응성 Red-120, Sigma)와 결합시켰다. 결합된 전분을 최종 농도 0.15% (w/v)로 SCD-Ura 아가 플레이트에 첨가하고, 인산칼륨을 사용하여 pH 7.0으로 완충시켰다 (최종 농도 50 내지 100 mM).
양성 콜로니를 선택하여 새로운 선택 배지 (150 mm 플레이트 상의)에 스트리킹하여 잘 단리되며 동정가능한 단일 콜로리를 수득하였다. 적색 전분을 완충된 SCD-Ura 아가에 직접 첨가하여 아밀라제 분비에 대해 양성인 잘 단리된 단일 콜로니를 검출하였다. 전분을 분해하여 직접 시각으로 확인할 수 있는 양성 콜로니 주위에 투명 원광(halo)을 생성시키는 능력에 의해 양성 콜로니를 결정하였다.
4. PCR 증폭에 의한 DNA의 단리
양성 콜로니를 단리할 때, 그 일부를 이쑤시개로 떠내어 96웰 플레이트 내의 멸균수 30 ㎕ 중에 희석하였다. 이때, 양성 콜로니를 동결시켜 후속 분석을 위해 보관하거나 즉시 증폭하였다. 0.5 ㎕ Klentaq (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 Clontech), 10 mM dNTP 4.0 ㎕ (Perkin Elmer-Cetus), Kentaq 완충액 (Clontech) 2.5 ㎕, 전방향 올리고뉴클레오티드 1 0.25 ㎕, 역방향 올리고뉴클레오티드 2 0.25 ㎕, 증류수 12.5 ㎕를 포함하는 25 ㎕ 부피의 PCR 반응의 주형으로서 세포의 분취액 5 ㎕를 사용하였다. 전방향 올리고뉴클레오티드 1의 서열은 다음과 같다:
5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3' (서열 1)
역방향 올리고뉴클레오티드 2의 서열은 다음과 같다:
5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3' (서열 2)
이어서, PCR을 다음과 같이 수행하였다.
a. 92℃에서 5분 동안 변성시킴,
b. 92℃에서 30초 동안 변성, 59℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초간 신장시키는 과정을 3회 실시,
c. 92℃에서 30초 동안 변성, 57℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초간 신장시키는 과정을 3회 실시,
d. 92℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초간 신장시키는 과정을 25회 실시,
e. 4℃에서 유지시킴.
올리고뉴클레오티드의 밑줄친 영역은 ADH 프로모터 영역 및 아밀라제 영역에 각각 어닐링되고, 삽입체가 존재하지 않을 경우 벡터 pSST-AMY.O으로부터 307 bp 영역을 증폭하였다. 통상적으로, 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 처음 18개의 뉴클레오티드는 서열 분석 프라이머의 어닐링 부위를 포함하였다. 따라서, 공(empty) 벡터로부터 PCR 반응의 총 생성물은 343 bp이었다. 그러나, 신호 서열이 결합된 cDNA는 상당히 긴 뉴클레오티드 서열을 생성시켰다.
PCR 후에, 반응액의 분취액 5 ㎕를 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 Tris-Borate-EDTA (TBE) 완충 시스템을 사용하여 1% 아가로스 겔에서의 아가로스 겔 전기영동에 의해 조사하였다. 400 bp보다 큰 강력한 하나의 PCR 생성물을 생성시키는 클론을 96 Qiaquick PCR clean-up 컬럼 (미국 캘리포니아주 채스워쓰 소재의 Qiagen Inc.)로 정제한 후 DNA 서열 분석에 의해 추가로 분석하였다.
실시예 3: 신호 연산법 분석을 이용한 cDNA 클론의 단리
제넨테크, 인크(Genentech, Inc., South San Franscisco, CA)사에서 개발한 비공개 신호 서열 검색 연산법을 사용하여, 공개(예를 들어, Genbank) 및(또는) 비공개(LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA) 데이타베이스로부터의 EST 및 밀집되고 조립된 EST 단편에서 다양한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 확인하였다. 신호 서열 연산법은 목적 서열 또는 서열 단편의 5'-말단에서 첫번째 및 임의로 두번째 메티오닌 코돈(ATG) 주변의 DNA 뉴클레오티드의 특성을 토대로 분비 신호 점수를 계산하였다. 첫번째 ATG 다음의 뉴클레오티드는 임의의 정지 코돈 없이 35개 이상의 분명한 아미노산을 코딩해야 한다. 첫번째 ATG는 소정의 아미노산을 갖는 경우, 두번째 ATG는 조사하지 않았다. 이 요건을 충족시키지 못하는 경우, 후보 서열의 점수는 계산하지 않았다. EST 서열이 분명한 신호 서열을 포함하는지를 결정하기 위해, 분비 신호와 관련된 것으로 알려진 7개의 센서(평가 파라메타) 한 세트를 사용하여 이 DNA 및 ATG 코돈 주변의 아미노산 서열의 점수를 매겼다. 이 연산법을 사용하여 많은 폴리펩티드-코딩 핵산 서열을 확인하였다.
실시예 4: 인간 PRO172를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 프랩을 이용하여 델타-유사 동족체를 코딩하는 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 어셈블리하였다. 이 컨센서스 서열은 본원에서 DNA28765라 지칭된다. DNA28765 서열을 기초로 하여, 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO172 코딩 서열의 전장 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
PCR 프라이머 1쌍(전방향 및 역방향)을 합성하였다.
28765.f(OLI644) 5'-GGATCTCGAGAACAGCTACTCC-3' (서열 5)
28765.r(OLI645) 5'-TCGTCCACGTTGTCGTCACATG-3' (서열 6)
추가로, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA28765 서열로부터 제조하였다.
28765.p(OLI643)혼성화 프로브:
5'-AAATCTGTGAATTGAGTGCCATGGACCTGTTGCGGACGGCCCTTGCTT-3' (서열 7)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO172 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 신장 조직으로부터 단리하였다.
상기한 바와 같이 단리한 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 DNA35916-1161의 전장 DNA 서열[도 1, 서열 3] 및 이로부터 유도된 PRO172의 단백질 서열을 수득하였다.
DNA35916-1161의 전체 코딩 서열은 도 1 (서열 3)에 포함되어 있다. 클론 DNA35916-1161은 뉴클레오티드 위치 38 내지 40의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 2207 내지 2209의 분명한 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 723개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다. 도 2 (서열 4)에 나타낸 전장 PRO172 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기기재된 바와 같은, 도 2에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 2에 나타낸 전장 PRO172 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 21의 신호 펩티드; 약 아미노산 546 내지 약 아미노산 566의 막횡당 도메인; 약 아미노산 477 내지 약 아미노산 481의 N-글리코실화 부위 ; 약 아미노산 660 내지 약 아미노산 664의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 176 내지 약 아미노산 185 및 약 아미노산 252 내지 약 아미노산 261의 티로신 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 2 내지 약 아미노산 8, 약 아미노산 37 내지 약 아미노산 43, 약 아미노산 40 내지 약 아미노산 46, 약 아미노산 98 내지 약 아미노산 104, 약 아미노산 99 내지 약 아미노산 105, 약 아미노산 262 내지 약 아미노산 268, 약 아미노산 281 내지 약 아미노산 287, 약 아미노산 282 내지 약 아미노산 288, 약 아미노산 301 내지 약 아미노산 307, 약 아미노산 310 내지 약 아미노산 316, 약 아미노산 328 내지 약 아미노산 334, 약 아미노산 340 내지 약 아미노산 344, 약 아미노산 378 내지 약 아미노산 384, 약 아미노산 387 내지 약 아미노산 393, 약 아미노산 512 내지 약 아미노산 518, 약 아미노산 676 내지 약 아미노산 682, 약 아미노산 683 내지 약 아미노산 689 및 약 아미노산 695 내지 약 아미노산 701의 N-미리스토일화 부위; 약 아미노산 343 내지 약 아미노산 355, 약 아미노산 420 내지 약 아미노산 432 및 약 아미노산 458 내지 약 아미노산 470의 아스파라긴산 및 아스파라긴 히드록실화 부위; 약 아미노산 552 내지 약 아미노산 563의 원핵 세포막 지질단백질 지질 부착 부위; 및 약 아미노산 243 내지 약 아미노산 255, 약 아미노산 274 내지 약 아미노산 286, 약 아미노산 314 내지 약 아미노산326, 약 아미노산 352 내지 약 아미노산 364, 약 아미노산 391 내지 약 아미노산 403, 약 아미노산 429 내지 약 아미노산 441, 약 아미노산 467 내지 약 아미노산 479 및 약 아미노산 505 내지 약 아미노산 517의 EGF-유사 도메인 시스테인 패턴 시그너쳐가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA35916-1161을 1997년 10월 28일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209419 호를 배정받았다.
도 2 (서열 4)에 나타낸 전장 서열의 BLAST 및 FastA 서열 정렬 분석을 기초로, PRO172는 델타-1 생쥐 단백질과 89%의 서열 동일성을 나타내었다.
실시예 5: 인간 PRO178을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
발현 서열 태그(EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 검색하여, 인간 TIE 리간드 족에 상동성을 나타내는 EST를 찾아내었다.
이후에, cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 폐 조직으로부터 단리하였다. 인간 PRO178을 코딩하는 cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는, 인비트로젠(Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 상업적으로 시판하는 시약을 이용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터에 평활 말단으로 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 대략의 크기를 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO178에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 상기 기재된 EST 서열 기재의 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 통상 뉴클레오티드 20 내지 30개 범위이며, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 산출하도록 설계한다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 전장 클론의 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 그 후에, 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 목적 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 양성 라이브러리를 이용하였다.
사용된 올리고뉴클레오티드 프로브는 하기와 같다:
NL8.5-1:
5'-ACGTAGTTCCAGTATGGTGTGAGCAGCAACTGGA-3' (서열 10)
NL8.3-1:
5'-AGTCCAGCCTCCACCCTCCAGTTGCT-3' (서열 11)
NL8.3-2:
5'-CCCCAGTCCTCCAGGAGAACCAGCA-3' (서열 12)
전장의 클론[DNA23339-1130]은 뉴클레오티드 위치 118 내지 120의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1528 내지 1530의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함함을 확인하였다(도 3, 서열 8). 예상된 폴리펩티드 전구체는470개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 계산된 분자량은 51,694 달톤이며, 추정 pI는 약 8.86이다. 도 4(서열 9)에 나타낸 전장 PRO178 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 4에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 4에 나타낸 전장 PRO178 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 20의 신호 펩티드; 약 아미노산 58 내지 약 아미노산 62 및 약 아미노산 145 내지 약 아미노산 149의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 97 내지 약 아미노산 101의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 441 내지 약 아미노산 448의 티로신 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 16 내지 약 아미노산 22, 약 아미노산 23 내지 약 아미노산 29, 약 아미노산 87 내지 약 아미노산 93, 약 아미노산 108 내지 약 아미노산 114, 약 아미노산 121 내지 약 아미노산 127, 약 아미노산 125 내지 약 아미노산 131, 약 아미노산 129 내지 약 아미노산 135, 약 아미노산 187 내지 약 아미노산 93, 약 아미노산 293 내지 약 아미노산 299, 약 아미노산 353 내지 약 아미노산 359, 약 아미노산 378 내지 약 아미노산 384, 약 아미노산 445 내지 약 아미노산 451 및 약 아미노산 453 내지 약 아미노산 459의 N-미리스토일화 부위; 약 아미노산 340 내지 약 아미노산 343의 세포 부착 부위; 및 약 아미노산 418 내지 약 아미노산 431의 피브리노겐 베타 및 감마 사슬 C-말단 도메인 시그너쳐가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA23339-1130을 1997년 9월 18일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209282 호를 배정받았다.
도 4 (서열 9)에 나타낸 전장 서열의 BLAST 및 FastA 서열 정렬 분석을 기초로, PRO178(본원에서 NL8이라 지칭됨)은 TIE-2 수용체의 리간드 1 및 리간드 2와23%의 서열 동일성을 나타내었다. TIE-2 수용체의 리간드 1 및 리간드 2는 PRO178에 각각 64% 및 40-43% 동일하였다. "TIE"라는 약어는 "티로신 키나아제 함유 Ig 및 EGF 상동성 도메인(tyrosine kinase containingIg andEGF homology domain)"을 나타내는 머리 글자이며, 수용체 티로신 키나아제의 새로운 족을 지칭하기 위해 만들어졌다.
실시예 6: 인간 PRO179를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
BLAST 및 FastA 서열 정렬에 의해, 상기 실시예 2에 기재된 아밀라제 스크린에서 단리된 cDNA 서열이 다양한 안지오포이에틴(angiopoietin) 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 상동성이 있음을 확인하였다. 이 cDNA 서열을 본원에서 DNA10028 및(또는) DNA25250이라 지칭하였다. 서열 상동성을 기초로 하여 DNA10028 분자의 서열로부터 프로브를 제조하여, 상기 실시예 2의 첫번째 단락에 기재된 바와 같이 제조된 인간 태아 간 라이브러리(LIB6)를 스크린하기 위해 사용하였다. 클로닝 벡터는 pRK5B (pRK5B는 SfiⅠ 부위를 함유하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al., Science, 253:1278-1280 (1991)) 참조)였으며, 절단된 cDNA의 크기는 2800bp 미만이었다.
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO179 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다.
전장의 클론[DNA16451-1388]은 뉴클레오티드 위치 37 내지 39의 분명한 번역개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1417 내지 1419의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함함을 확인하였다(도 5, 서열 13). 예상된 폴리펩티드 전구체는 460개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 계산된 분자량은 53,637 달톤이며, 추정 pI는 약 6.61이다. 도 6 (서열 14)에 나타낸 전장 PRO179 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 6에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 6에 나타낸 전장 PRO179 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 16의 신호 펩티드; 약 아미노산 23 내지 약 아미노산 27, 약 아미노산 115 내지 약 아미노산 119, 약 아미노산 296 내지 약 아미노산 300 및 약 아미노산 357 내지 약 아미노산 361의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 100 내지 약 아미노산 104 및 약 아미노산 204 내지 약 아미노산 208의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 342 내지 약 아미노산 351의 티로신 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 279 내지 약 아미노산 285, 약 아미노산 352 내지 약 아미노산 358 및 약 아미노산 367 내지 약 아미노산 373의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 120 내지 약 아미노산 142 및 약 아미노산 127 내지 약 아미노산 149의 루이신 지퍼 패턴이 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA16451-1388을 1998년 4월 14일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209776 호를 배정받았다.
도 6 (서열 14)에 나타낸 전장의 PRO179 폴리펩티드의 분석은 상기 폴리펩티드가 안지오포이에틴 족의 단백질과 상당히 유사함을 제시하고, 따라서 PRO179는 안지오포이에틴 족의 신규한 단백질일 수 있다. 더욱 구체적으로, 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO179 아미노산 서열과 데이호프서열 AF004326_1, P_R94605, HSU83508_1, P_R94603, P_R94317, AF025818_1, HSY16132_1, P_R65760, 137391 및 HUMRSC192_1 사이의 상당한 상동성을 보여주었다.
실시예 7: 인간 PRO182를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
인슐린 족의 단백질인 릴렉신(relaxin)의 핵산 서열을 이용하여 인사이트 인크(Incyte, Inc.)에서 입수가능한 발현 서열 태그(EST)의 인간 직장 cDNA 라이브러리(LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)에서 상동성 서열을 검색하였다. Incyte EST 제 INC2328985호 및 제INC778319호의 EST 2개를 수득하였는데, 각각은 릴렉신 핵산 서열 영역에 약 40%의 상동성이 있었으며, 인슐린-유사 폴리펩티드(ILP) 유전자 내의 서열을 대표한다.
cDNA 라이브러리는 클론테크(Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA, 카탈로그 번호 6537-1)에서 입수한 인간 자궁 mRNA로부터 제조하였다. 인사이트 인크로부터의 EST 서열(Incyte EST INC2328985 및 Incyte EST INC778319) 기재의 올리고뉴클레오티드를 이용하는 콜리니 혼성화에 의해, 상기 기재된 플라스미드 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 PRO182의 전장 핵산 서열을 수득하였다. 인간 PRO178을 코딩하는 cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는, 인비트로젠(Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 상업적으로 시판하는 시약을 이용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터에 평활 말단으로 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 대략의 크기를 분류한 다음, 적합한 클로닝벡터(예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO182에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 상기 기재된 EST 서열 기재의 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 통상 뉴클레오티드 20 내지 30개 범위이며, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 산출하도록 설계한다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 전장 클론의 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 그 후에, 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 목적 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 양성 라이브러리를 이용하였다.
사용된 올리고뉴클레오티드 프로브는 하기와 같다:
5'-CACATTCAGTCCTCAGCAAAATGAA-3' (서열 17)
5'-GAGAATAAAAACAGAGTGAAAATGGAGCCCTTCATTTTGC-3' (서열 18)
5'-CTCAGCTTGCTGAGCTTGAGGGA-3'(서열 19)
전장의 클론[DNA27865-1091]은 뉴클레오티드 위치 39 내지 41의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 444 내지 446의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함함을 확인하였다(도 7, 서열 15). 예상된 폴리펩티드 전구체는 135개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 계산된 분자량은 15,319 달톤이며, 추정 pI는 약 7.39가다. 도 8 (서열 16)에 나타낸 전장 PRO182 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 8에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 8에 나타낸 전장 PRO182 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 18의 신호 펩티드; 약 아미노산 107 내지 약 아미노산 111의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 3 내지 약 아미노산 9, 약 아미노산 52 내지 약 아미노산 58, 약 아미노산 96 내지 약 아미노산 102 및 약 아미노산 125 내지 약 아미노산 131의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 121 내지 약 아미노산 136의 인슐린 족 시그너쳐가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA27865-1091을 1997년 9월 23일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209296 호를 배정받았다.
도 8 (서열 16)에 나타낸 전장 서열의 BLAST 및 FastA 서열 정렬 분석(ALIGN 컴퓨터 프로그램 이용)에 기초하여, PRO182 폴리펩티드는 상동성이 있었지만 임의의 다른 공지 폴리펩티드 분자와 상이했으며, 따라서 PRO182 폴리펩티드는 인슐린 족의 신규한 단백질일 수 있다.
실시예 8: 인간 PRO187을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
발현 서열 태그(EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 검색하여, 섬유아세포 생장인자(FGF-8)에 상동성을 나타내며 안드로겐-유도 생장인자로도 알려진 EST를 찾아내었다.
cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 폐 조직으로부터 단리하였다. 인간 PRO187을 코딩하는 cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는, 인비트로젠(Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 상업적으로 시판하는 시약을 이용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터에 평활 말단으로 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 대략의 크기를 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO187에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 상기 기재된 EST 서열 기재의 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 통상 뉴클레오티드 20 내지 30개 범위이며, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 산출하도록 설계한다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 전장 클론의 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 그 후에, 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 목적 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 양성 라이브러리를 이용하였다.
다양한 조직으로부터의 여러 라이브러리를 하기 올리고뉴클레오티드 프로브로 PCR 증폭하여 스크리닝하였다:
IN843193.f(OLI315)
5'-CAGTACGTGAGGGACCAGGGCGCCATGA-3' (서열 22)
IN843193.r(OLI317)
5'-CCGGTGACCTGCACGTGCTTGCCA-3' (서열 23)
이후에, 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나와 하기 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 FGF-8 상동성 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 양성 라이브러리를 이용하였다.
IN843193.p(OLI316)
5'-GCGGATCTGCCGCCTGCTCANCTGGTCGGTCATGGCGCCCT-3' (서열 24)
전장의 클론[DNA27864-1155]은 뉴클레오티드 위치 26 내지 28의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 641 내지 643의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함함을 확인하였다(도 9, 서열 20). 예상된 폴리펩티드 전구체는 205개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 계산된 분자량은 23,669 달톤이며, 추정 pI는 약 10.75가다. 도 10 (서열 21)에 나타낸 전장 PRO187 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 10에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 10에 나타낸 전장 PRO187 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 22의 신호 펩티드; 약 아미노산 9 내지 약 아미노산 13 및 약 아미노산 126 내지 약 아미노산 130의 N-글리코실화 부위;약 아미노산 60 내지 약 아미노산 64의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 39 내지 약 아미노산 48 및 약 아미노산 89 내지 약 아미노산 97의 티로신 키나아제인산화 부위; 약 아미노산 69 내지 약 아미노산 75 및 약 아미노산 188 내지 약 아미노산 194의 N-미리스토일화 부위; 약 아미노산 58 내지 약 아미노산 62의 아미드화 부위; 및 약 아미노산 103 내지 약 아미노산 128의 HBGF/FGF 족 시그너쳐가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA27864-1155를 1997년 10월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209375 호를 배정받았다.
도 10 (서열 21)에 나타낸 전장 서열의 BLAST 및 FastA 서열 정렬 분석(ALIGN 컴퓨터 프로그램 이용)에 기초하여, PRO187 폴리펩티드는 인간 섬유아세포 생장인자-8(안드로겐-유도 생장인자)와 74%의 서열 동일성을 나타내었다.
실시예 9: 인간 PRO188을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
발현 서열 태그(EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 검색하여, 인간 TIE 리간드 족에 상동성을 나타내는 EST를 찾아내었다.
cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 폐 조직으로부터 단리하였다. 인간 PRO188을 코딩하는 cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는, 인비트로젠(Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 상업적으로 시판하는 시약을 이용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터에 평활 말단으로 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 대략의 크기를 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO188에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 상기 기재된 EST 서열 기재의 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 통상 뉴클레오티드 20 내지 30개 범위이며, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 산출하도록 설계한다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 전장 클론의 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 그 후에, 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 목적 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 양성 라이브러리를 이용하였다.
사용된 올리고뉴틀레오티드 프로브는 하기와 같다:
NL5.5-1
5'-CAGGTTATCCCAGAGATTTAATGCCACCA-3' (서열 27)
NL5.3-1
5'-TTGGTGGGAGAAGTTGCCAGATCAGGTGGTGGCA-3' (서열 28)
NL5.3-2
5'-TTCACACCATAACTGCATTGGTCCA-3' (서열 29)
전장의 클론[DNA28497-1130]은 뉴클레오티드 위치 449 내지 451의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1922 내지 1924의 정지 신호를 갖는 단일 오픈리딩 프레임을 포함함을 확인하였다(도 11, 서열 25). 예상된 폴리펩티드 전구체는 491개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 계산된 분자량은 56,720 달톤이며, 추정 pI는 약 8.56이다. 도 12 (서열 26)에 나타낸 전장 PRO188 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 12에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 12에 나타낸 전장 PRO188 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 23의 신호 펩티드; 약 아미노산 160 내지 약 아미노산 164 및 약 아미노산 188 내지 약 아미노산 192의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 120 내지 약 아미노산 124의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 173 내지 약 아미노산 180 및 약 아미노산 387 내지 약 아미노산 396의 티로신 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 70 내지 약 아미노산 76, 약 아미노산 110 내지 약 아미노산 116, 약 아미노산 232 내지 약 아미노산 238, 약 아미노산 343 내지 약 아미노산 349, 약 아미노산 400 내지 약 아미노산 406, 약 아미노산 467 내지 약 아미노산 473 및 약 아미노산 475 내지 약 아미노산 487의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 440 내지 약 아미노산 453의 피브리노겐 베타 및 감마 사슬 C-말단 도메인 시그너쳐가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA28497-1130을 1997년 9월 18일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209279 호를 배정받았다.
도 12 (서열 26)에 나타낸 전장 서열의 BLAST 및 FastA 서열 정렬 분석(ALIGN 컴퓨터 프로그램 이용)에 기초하여, PRO188(본원에서 NL5라 지칭됨)은 TIE-2 수용체의 리간드 1 및 리간드 2와 24%의 서열 동일성을 나타내었다. TIE-2수용체의 리간드 1 및 리간드 2는 PRO188에 각각 64% 및 40-43% 동일하였다. "TIE"라는 약어는 "티로신 키나아제 함유 Ig 및 EGF 상동성 도메인(tyrosine kinase containingIg andEGF homology domain)"을 나타내는 머리 글자이며, 수용체 티로신 키나아제의 새로운 족을 지칭하기 위해 만들어졌다.
실시예 10: 인간 PRO195를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 2에 기재된 아밀라제 스크린에서 단리된 cDNA 서열을 본원에서 DNA13199_ABI2라 지칭하였다. DNA13199_ABI2 서열을 공개 EST 데이타베이스(예를 들면, 진뱅크)를 포함하는 다양한 발현 서열 태그(EST)와 비교하여 상동성의 존재를 확인하였다. 검색은 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2 (Altschul et al.,Methods in Enzymology,266:460-480 (1996))을 사용하여 수행하였다. 공지의 단백질을 코딩하지 않는, BLAST 스코어가 70 이상 (일부 경우에 90)인 비교물을 수집하여 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)으로 정리하여 컨센서스 서열을 수득하였다. 본원에서는 이 컨센서스 서열을 DNA22778로 명명하였다.
DNA13199_ABI2 서열과 DNA22778 서열의 상동성을 기초로 하여 올리고뉴클레오티드 프로브를 제조하여, 상기 실시예 2의 첫번째 단락에 기재된 바와 같이 제조된 인간 태아 간 라이브러리(LIB6)를 스크린하기 위해 사용하였다. 클로닝 벡터는 pRK5B (pRK5B는 SfiⅠ 부위를 함유하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al., Science, 253:1278-1280 (1991)) 참조)였으며, 절단된 cDNA의 크기는 2800bp 미만이었다.
PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머(22778.f):
5'-ACAAGCTGAGCTGCTGTGACAG-3' (서열 32)
역방향 PCR 프라이머(22778.r):
5'-TGATTCTGGCAACCAAGATGGC-3' (서열 33)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA22778 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브(22778.p):
5'-ATGGCCTTGGCCGGAGGTTCGGGGACCGCTTCGGCTGAAG-3' (서열 34)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO195 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다.
전장의 클론[DNA26847-1395]은 뉴클레오티드 위치 70 내지 72의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1039 내지 1041의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함함을 확인하였다(도 13, 서열 30). 예상된 폴리펩티드 전구체는 323개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 계산된 분자량은 36,223 달톤이며, 추정 pI는 약 5.06이다. 도 14 (서열 31)에 나타낸 전장 PRO195 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 14에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 14에 나타낸 전장 PRO195 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산1 내지 약 아미노산 31의 신호 펩티드, 약 아미노산 242 내지 약 아미노산 262의 막횡단 도메인, 약 아미노산 90 내지 약 아미노산 94의 N-글리코실화 부위, 및 약 아미노산 28 내지 약 아미노산 34, 약 아미노산 29 내지 약 아미노산 35, 약 아미노산 31 내지 약 아미노산 37 및 약 아미노산 86 내지 약 아미노산 92의 N-미리스토일화 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA26847-1395를 1998년 4월 14일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209772 호를 배정받았다.
전장 PRO195 폴리펩티드(도 14, 서열 31)의 아미노산 서열 분석은 상기 폴리펩티드가 어떤 공지된 단백질과도 상당한 유사성을 나타내지 않음을 제시한다. 그러나, 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO195 아미노산 서열과 데이호프 서열 P_P91380, AF035118_1, HUMTROPCS_1, NUOD_SALTY 및 E70002 사이에 어느 정도의 상동성을 보여주었다.
실시예 11: 인간 PRO212를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열(Genentech의 EST 비공개 서열 포함)에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 어셈블리된 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO212에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
1쌍의 PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머:
5'-CACGCTGGTTTCTGCTTGGAG-3' (서열 37)
역방향 PCR 프라이머:
5'-AGCTGGTGCACAGGGTGTCATG-3' (서열 38)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-CCCAGGCACCTTCTCAGCCAGCCAGCAGCTCCAGCTCAGAGCAGTGCCAGCCC-3' (서열 39)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO212 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 폐 조직으로부터 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA30942-1134[도 15, 서열 35]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO212 단백질 서열을 수득하였다.
DNA30942-1134의 전장 클론은 도 15(서열 35)에 포함되어 있다. 클론 DNA30942-1134는 뉴클레오티드 위치 101 내지 103의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1001 내지 1003의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 300개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다. 도 16 (서열 36)에 나타낸 전장 PRO212 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 16에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다.도 16에 나타낸 전장 PRO212 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 23의 신호 펩티드; 약 아미노산 173 내지 약 아미노산 177의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 63 내지 약 아미노산 67, 약 아미노산 259 내지 약 아미노산 263의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 28 내지 약 아미노산 37의 티로신 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 156 내지 약 아미노산 162, 약 아미노산 178 내지 약 아미노산 184, 약 아미노산 207 내지 약 아미노산 213, 약 아미노산 266 내지 약 아미노산 272 및 약 아미노산 287 내지 약 아미노산 293의 N-미리스토일화 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA30942-1134를 1997년 9월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209254 호를 배정받았다.
도 16(서열 36)에 나타낸 전장 서열의 BLAST 및 FastA 서열 정렬 분석에 기초하여, PRO212는 TNFR2에 약간의 아미노산 서열 동일성을 나타내었다(28.7%).
실시예 12: 인간 PRO214를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 EGF-유사 동족체를 코딩하는 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA28744라 명명하였다. 어셈블리된 DNA28744 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO214에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
1쌍의 PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머(OLI556):
5'-ATTCTGCGTGAACACTGAGGGC-3' (서열 42)
역방향 PCR 프라이머(OLI557):
5'-ATCTGCTTGTAGCCCTCGGCAC-3' (서열 43)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA28744 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브(OLI555):
5'-CCTGGCTATCAGCAGGTGGGCTCCAAGTGTCTCGATGTGGATGAGTGTGA-3' (서열 44)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO214 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 폐 조직으로부터 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA32286-1191[도 17, 서열 40]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO214 단백질 서열을 수득하였다.
DNA32286-1191의 전장 클론은 도 17(서열 40)에 포함되어 있다. 클론 DNA32286-1191는 뉴클레오티드 위치 103 내지 105의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1363 내지 1365의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 420개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다. 도 18 (서열 41)에 나타낸 전장 PRO214 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기기재된 바와 같은, 도 18에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 18에 나타낸 전장 PRO214 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 29의 신호 펩티드; 약 아미노산 342 내지 약 아미노산 392의 막횡단 도메인; 약 아미노산 79 내지 약 아미노산 83 및 약 아미노산 205 내지 약 아미노산 209의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 290 내지 약 아미노산 294의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 321 내지 약 아미노산 333의 아스파라긴산 및 아스파라긴 히드록실화 부위; 및 약 아미노산 181 내지 약 아미노산 193의 EGF-유사 도메인 시스테인 페턴 시그너쳐가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA32286-1191을 1997년 10월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209385 호를 배정받았다.
도 18(서열 41)에 나타낸 전장 서열의 BLAST 및 FastA 서열 정렬 분석에 기초하여, PRO214는 HT 단백질 및(또는) 피불린에 대해 아미노산 서열 동일성을 나타내었다(각각 49% 및 38%).
실시예 13: 인간 PRO217을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA28760이라 명명하였다. 어셈블리된 DNA28760 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO217에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
1쌍의 PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머:
5'-AAAGACGCATCTGCGAGTGTCC-3' (서열 47)
역방향 PCR 프라이머:
5'-TGCTGATTTCACACTGCTCTCCC-3' (서열 48)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA28760 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-CCCACGATGTATGAATGGTGGACTTTGTGTGACTCCTGGTTTCTGCATC-3' (서열 49)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO217 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 폐 조직으로부터 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA33094-1131[도 19, 서열 45]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO217 단백질 서열을 수득하였다.
DNA33094-1131의 전장 클론은 도 19(서열 45)에 포함되어 있다. 클론 DNA33094-1131는 뉴클레오티드 위치 146 내지 148의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1283 내지 1285의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 379개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 분자량은 대략 41,528 달톤이며, 추정된 pI는 약 7.97이다. 도 20 (서열 46)에 나타낸 전장 PRO217 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 20에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 20에 나타낸 전장 PRO217 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 28의 신호 펩티드; 약 아미노산 88 내지 약 아미노산 92 및 약 아미노산 245 내지 약 아미노산 249의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 370 내지 약 아미노산 378의 티로신 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 184 내지 약 아미노산 190, 약 아미노산 185 내지 약 아미노산 191, 약 아미노산 189 내지 약 아미노산 195 및 약 아미노산 315 내지 약 아미노산 321의 N-미리스토일화 부위; 약 아미노산 285 내지 약 아미노산 293의 ATP/GTP-결합 부위 모티프 A (P-루프); 및 약 아미노산 198 내지 약 아미노산 210, 약 아미노산 230 내지 약 아미노산 242, 약 아미노산 262 내지 약 아미노산 274, 약 아미노산 294 내지 약 아미노산 306 및 약 아미노산 326 내지 약 아미노산 338의 EGF-유사 도메인 시스테인 패턴 시그너쳐가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA33094-1131을 1997년 9월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209256 호를 배정받았다.
도 20(서열 46)에 나타낸 전장 서열의 BLAST 및 FastA 서열 정렬 분석에 기초하여, PRO217는 신규 EGF-유사 동족체인 것 같다.
실시예 14: 인간 PRO224를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA30845라 명명하였다. 어셈블리된 DNA30845 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO224에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
1쌍의 PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머:
5'-AAGTTCCAGTGCCGCACCAGTGGC-3' (서열 52)
역방향 PCR 프라이머:
5'-TTGGTTCCACAGCCGAGCTCGTCG-3' (서열 53)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA30845 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-GAGGAGGAGTGCAGGATTGAGCCATGTACCCAGAAAGGGCAATGCCCACC-3' (서열 54)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO224 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 간 조직으로부터 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA33221-1133[도 21, 서열 50]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO224 단백질 서열을 수득하였다.
DNA33221-1133의 전장 클론은 도 21(서열 50)에 포함되어 있다. 클론 DNA33221-1133는 뉴클레오티드 위치 33 내지 35의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 879 내지 881의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 282개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 분자량은 대략 28,991 달톤이며, 추정된 pI는 약 4.62가다. 도 22 (서열 51)에 나타낸 전장 PRO224 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 22에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 22에 나타낸 전장 PRO224 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 30의 신호 펩티드; 약 아미노산 231 내지 약 아미노산 248의 막횡단 도메인; 약 아미노산 126 내지 약 아미노산 130, 약 아미노산 195 내지 약 아미노산 199 및 약 아미노산 213 내지 약 아미노산 217의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 3 내지 약 아미노산 9, 약 아미노산 10 내지 약 아미노산 16, 약 아미노산 26 내지 약 아미노산 32 및 약 아미노산 30 내지 약 아미노산 36, 약 아미노산 112 내지 약 아미노산 118, 약 아미노산 166 내지 약 아미노산 172, 약 아미노산 212 내지 약 아미노산 218, 약 아미노산 224 내지 약 아미노산 230, 약 아미노산 230 내지 약 아미노산 236 및 약 아미노산 263 내지 약 아미노산 269의 N-미리스토일화 부위; 약 아미노산 44 내지 약 아미노산 55의 원핵 세포막 지질단백질 지질 부착 부위; 및 약 아미노산 17 내지 약 아미노산 39의 루이신 지퍼 패턴이 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA33221-1133을 1997년 9월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209263 호를 배정받았다.
전장 PRO224 서열의 아미노산 서열 분석은 상기 폴리펩티드가 초저밀도 지질단백질 수용체, 아포지질단백질 E 수용체 및 닭 난모세포 수용체 P95와 상동성이 있음을 제시한다. 도 22(서열 51)에 나타낸 전장 서열의 BLAST 및 FastA 서열 정렬 분석에 기초하여, PRO224는 상기 단백질들의 일부분에 대해 28% 내지 45%의 아미노산 동일성을 나타냈으며, 상기 단백질들과의 전체 동일성은 약 33%였다.
실시예 15: 인간 PRO231을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA30933이라 명명하였다. 어셈블리된 DNA30933 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO231에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
1쌍의 PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머1:
5'-CCAACTACCAAAGCTGCTGGAGCC-3' (서열 57)
전방향 PCR 프라이머2:
5'-GCAGCTCTATTACCACGGGAAGGA-3' (서열 58)
역방향 PCR 프라이머:
5'-TCCTTCCCGTGGTAATAGAGCTGC-3' (서열 59)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA30933 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-GGCAGAGAACCAGAGGCCGGAGGAGACTGCCTCTTTACAGCCAGG-3' (서열 60)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO231 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 간 조직으로부터 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA34434-1139[도 23, 서열 55]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO231 단백질 서열을 수득하였다.
DNA34434-1139의 전장 클론은 도 23(서열 55)에 포함되어 있다. 클론 DNA34434-1139는 뉴클레오티드 위치 173 내지 175의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1457 내지 1459의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 428개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 분자량은 대략 48,886 달톤이며, 추정된 pI는 약 6.39가다. 도 24 (서열 56)에 나타낸 전장 PRO231 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 24에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 24에 나타낸 전장 PRO231 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 23의 신호 펩티드; 약 아미노산 218 내지 약 아미노산 222의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 280 내지 약 아미노산 288의 티로신 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 15 내지 약 아미노산 21, 약 아미노산 117 내지 약 아미노산 123,약 아미노산 118 내지 약 아미노산 124, 약 아미노산 179 내지 약 아미노산 185, 약 아미노산 240 내지 약 아미노산 246 및 약 아미노산 387 내지 약 아미노산 393의 N-미리스토일화 부위; 약 아미노산 216 내지 약 아미노산 220의 아미드화 부위; 약 아미노산 10 내지 약 아미노산 32의 루이신 지퍼 패턴; 및 약 아미노산 50 내지 약 아미노산 65의 히스티딘 산 포스파타제 포스포히스티딘 시그너쳐가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA34434-1139를 1997년 9월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209252 호를 배정받았다.
전장 PRO231 서열의 아미노산 서열 분석은 상기 폴리펩티드가 인간 및 쥐의 프로스타트산 포스파타제 전구체 단백질과 각각 30% 및 31%의 아미노산 동일성이 있음을 제시한다.
실시예 16: 인간 PRO235를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA30927이라 명명하였다. 어셈블리된 DNA30927 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO235에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
1쌍의 PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머1:
5'-TGGAATACCGCCTCCTGCAG-3' (서열 63)
역방향 PCR 프라이머:
5'-CTTCTGCCCTTTGGAGAAGATGGC-3' (서열 64)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA30927 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-GGACTCACTGGCCCAGGCCTTCAATATCACCAGCCAGGACGAT-3' (서열 65)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO235 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 간 조직으로부터 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA35558-1167[도 25, 서열 61]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO235 단백질 서열을 수득하였다.
DNA35558-1167의 전장 클론은 도 25(서열 61)에 포함되어 있다. 클론 DNA35558-1167는 뉴클레오티드 위치 667 내지 669의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 2323 내지 2325의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 552개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 분자량은 대략 61,674 달톤이며, 추정된 pI는 약 6.95가다. 도 26 (서열 62)에 나타낸 전장 PRO235 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 26에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 26에 나타낸 전장PRO235 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 32의 신호 펩티드; 약 아미노산 71 내지 약 아미노산 86의 막횡단 도메인; 약 아미노산 130 내지 약 아미노산 134, 약 아미노산 145 내지 약 아미노산 149, 약 아미노산 217 내지 약 아미노산 221 및 약 아미노산 380 내지 약 아미노산 385의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 220 내지 약 아미노산 226, 약 아미노산 319 내지 약 아미노산 325, 약 아미노산 353 내지 약 아미노산 359, 약 아미노산 460 내지 약 아미노산 466 및 약 아미노산 503 내지 약 아미노산 509의 N-미리스토일화 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA35558-1167을 1997년 10월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209374 호를 배정받았다.
도 26(서열 62)에 나타낸 전장 PRO235 서열의 아미노산 서열 분석은 상기 폴리펩티드의 일부분이 인간, 생쥐 및 제노푸스(Xenopus)의 플렉신 단백질과 상당한 상동성을 가짐을 제시하고, 따라서 PRO235는 신규 플렉신 단백질 일 것이다.
실시예 17: 인간 PRO245를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA30954라 명명하였다. 어셈블리된 DNA30954 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO245에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
1쌍의 PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머1:
5'-ATCGTTGTGAAGTTAGTGCCCC-3' (서열 68)
역방향 PCR 프라이머:
5'-ACCTGCGATATCCAACAGAATTG-3' (서열 69)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA30954 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-GGAAGAGGATACAGTCACTCTGGAAGTATTAGTGGCTCCAGCAGTTCC-3' (서열 70)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO245 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 간 조직으로부터 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA35638-1141[도 27, 서열 66]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO245 단백질 서열을 수득하였다.
DNA35638-1141의 전장 클론은 도 27(서열 66)에 포함되어 있다. 클론 DNA35638-1141는 뉴클레오티드 위치 89 내지 91의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1025 내지 1027의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 312개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 분자량은 대략 34,554 달톤이며, 추정된 pI는 약 9.39가다. 도 28 (서열 67)에 나타낸 전장 PRO245 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 28에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 28에 나타낸 전장 PRO245 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 20의 신호 펩티드; 약 아미노산 237 내지 약 아미노산 258의 막횡단 도메인; 약 아미노산 98 내지 약 아미노산 102, 약 아미노산 187 내지 약 아미노산 191, 약 아미노산 236 내지 약 아미노산 240 및 약 아미노산 277 내지 약 아미노산 281의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 182 내지 약 아미노산 188, 약 아미노산 239 내지 약 아미노산 245, 약 아미노산 255 내지 약 아미노산 261, 약 아미노산 257 내지 약 아미노산 263 및 약 아미노산 305 내지 약 아미노산 311의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 226 내지 약 아미노산 230의 아미드화 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA35638-1141을 1997년 9월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209265 호를 배정받았다.
도 28(서열 67)에 나타낸 전장 PRO245 서열의 아미노산 서열 분석은 상기 폴리펩티드의 일부분이 인간 c-myb 단백질과 60%의 아미노산 동일성을 가짐을 제시하고, 따라서 이는 막횡단 단백질 수용체 티로신 키나아제 족의 신규 구성원일 수 있다.
실시예 18: 인간 PRO261을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA30843이라 명명하였다. 어셈블리된 DNA30843 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO261에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
1쌍의 PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머1:
5'-AAAGGTGCGTACCCAGCTGTGCC-3' (서열 73)
역방향 PCR 프라이머:
5'-TCCAGTCGGCAGAAGCGGTTCTGG-3' (서열 74)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA30843 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-CCTGGTGCTGGATGGCTGTGGCTGCTGCCGGGTATGTGCACGGCGGCTGGG-3' (서열 75)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO261 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 간 조직으로부터 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA33473-1176[도 29, 서열 71]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO261 단백질 서열을 수득하였다.
DNA33473-1176의 전장 클론은 도 29(서열 71)에 포함되어 있다. 클론DNA33473-1176는 뉴클레오티드 위치 10 내지 12의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 760 내지 762의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 250개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 분자량은 대략 26,825 달톤이며, 추정된 pI는 약 8.36이다. 도 30 (서열 72)에 나타낸 전장 PRO261 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 30에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 30에 나타낸 전장 PRO261 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 23의 신호 펩티드; 약 아미노산 3 내지 약 아미노산 9, 약 아미노산 49 내지 약 아미노산 55, 약 아미노산 81 내지 약 아미노산 87, 약 아미노산 85 내지 약 아미노산 91, 약 아미노산 126 내지 약 아미노산 132, 약 아미노산 164 내지 약 아미노산 170, 약 아미노산 166 내지 약 아미노산 172, 약 아미노산 167 내지 약 아미노산 173, 약 아미노산 183 내지 약 아미노산 189 및 약 아미노산 209 내지 약 아미노산 215의 N-미리스토일화 부위; 약 아미노산 49 내지 약 아미노산 65의 인슐린-유사 생장 인자 결합 단백질 시그너쳐; 약 아미노산 107 내지 약 아미노산 124의 폰 빌레브란트(von Willebrand) C1 도메인; 약 아미노산 201 내지 약 아미노산 216의 트롬보스폰딘 1 상동성 블록; 및 약 아미노산 49 내지 약 아미노산 58의 IGF 결합 단백질 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA33473-1176을 1997년 10월 17일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209391 호를 배정받았다.
도 30(서열 72)에 나타낸 전장 PRO261 서열의 아미노산 서열 분석은 상기 폴리펩티드의 일부분이 CTGF와 상동성이 있음을 제시하고, 따라서 PRO261은 신규 생장 인자일 수 있다.
실시예 19: 인간 PRO269를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA35705라 명명하였다. 어셈블리된 DNA35705 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO269에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
PCR 프라이머(3개의 전방향 및 2개의 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머 1:
5'-TGGAAGGAGATGCGATGCCACCTG-3' (서열 78)
전방향 PCR 프라이머 2:
5'-TGACCAGTGGGGAAGGACAG-3' (서열 79)
전방향 PCR 프라이머 3:
5'-ACAGAGCAGAGGGTGCCTTG-3' (서열 80)
역방향 PCR 프라이머 1:
5'-TCAGGGACAAGTGGTGTCTCTCCC-3' (서열 81)
역방향 PCR 프라이머 2:
5'-TCAGGGAAGGAGTGTGCAGTTCTG-3' (서열 82)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA35705 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-ACAGCTCCCGATCTCAGTTACTTGCATCGCGGACGAAATCGGCGCTCGCT-3' (서열 83)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO269 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 신장 조직으로부터 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA38260-1180[도 31, 서열 76]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO269 단백질 서열을 수득하였다.
DNA38260-1180의 전장 클론은 도 31(서열 76)에 포함되어 있다. 클론 DNA38260-1180는 뉴클레오티드 위치 314 내지 316의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1784 내지 1786의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 490개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 분자량은 대략 51,636 달톤이며, 추정된 pI는 약 6.29가다. 도 32 (서열 77)에 나타낸 전장 PRO269 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 32에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 32에 나타낸 전장 PRO269 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 16의 신호 펩티드; 약 아미노산 397 내지 약 아미노산 418의 막횡단 도메인; 약 아미노산 189 내지 약 아미노산 193 및 약 아미노산 381 내지 약 아미노산 385의 N-글리코실화 부위; 약아미노산 289 내지 약 아미노산 293의 글리코사미노글리칸 부착 부위; 약 아미노산 98 내지 약 아미노산 102 및 약 아미노산 434 내지 약 아미노산 438의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 30 내지 약 아미노산 36, 약 아미노산 35 내지 약 아미노산 41, 약 아미노산 58 내지 약 아미노산 66, 약 아미노산 59 내지 약 아미노산 65, 약 아미노산 121 내지 약 아미노산 127, 약 아미노산 151 내지 약 아미노산 157, 약 아미노산 185 내지 약 아미노산 191, 약 아미노산 209 내지 약 아미노산 215, 약 아미노산 267 내지 약 아미노산 273, 약 아미노산 350 내지 약 아미노산 356, 약 아미노산 374 내지 약 아미노산 380, 약 아미노산 453 내지 약 아민노산 459, 약 아미노산 463 내지 약 아미노산 469 및 약 아미노산 477 내지 약 아미노산 483의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 262 내지 약 아미노산 274의 아스파라긴산 및 아스파라긴 히드록실화 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA38260-1180을 1997년 10월 17일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209397 호를 배정받았다.
도 32(서열 77)에 나타낸 전장 PRO269 서열의 아미노산 서열 분석은 상기 폴리펩티드의 일부분이 인간 트로보모둘린 단백질과 상당한 상동성이 있음을 제시하고, 따라서 PRO269은 1개 이상의 트로보모둘린-유사 도메인을 가질 수 있다.
실시예 20: 인간 PRO287을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA28728이라 명명하였다. PRO287을 코딩하는 확장된 컨센서스 서열을 어셈블리하였고, 이는 1형 프로콜라겐 C-단백질 분해효소 인핸서 단백질 및 1형 프로콜라겐 C-단백질 분해효소 인핸서 단백질 전구체와 유사성을 나타내었다. 어셈블리된 DNA28728 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO287에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
1쌍의 PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머:
5'-CCGATTCATAGACCTCGAGAGT-3' (서열 86)
역방향 PCR 프라이머:
5'-GTCAAGGAGTCCTCCACAATAC-3' (서열87)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA28728 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-GTGTACAATGGCCATGCCAATGGCCAGCGCATTGGCCGCTTCTGT-3' (서열 88)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO287 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 신장 조직으로부터 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA39969-1185[도33, 서열 84]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO287 단백질 서열을 수득하였다.
DNA39969-1185의 전장 클론은 도 33(서열 84)에 포함되어 있다. 클론 DNA39969-1185는 뉴클레오티드 위치 307 내지 309의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1552 내지 1554의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 415개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 분자량은 대략 45,716 달톤이며, 추정된 pI는 약 8.89가다. 도 34 (서열 85)에 나타낸 전장 PRO287 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 34에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 34에 나타낸 전장 PRO287 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 23의 신호 펩티드; 약 아미노산 355 내지 약 아미노산 359의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 199 내지 약 아미노산 208의 티로신 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 34 내지 약 아미노산 40, 약 아미노산 35 내지 약 아미노산 41, 약 아미노산 100 내지 약 아미노산 106, 약 아미노산 113 내지 약 아미노산 119, 약 아미노산 218 내지 약 아미노산 224, 약 아미노산 289 내지 약 아미노산 295, 약 아미노산 305 내지 약 아미노산 311, 약 아미노산 309 내지 약 아미노산 315, 약 아미노산 320 내지 약 아미노산 326 및 약 아미노산 330 내지 약 아미노산 336의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 149 내지 약 아미노산 152의 세포 부착 서열이 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA39969-1185를 1997년 10월 17일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209400 호를 배정받았다.
도 34(서열 85)에 나타낸 전장 PRO287 서열의 아미노산 서열 분석은 상기 폴리펩티드의 일부분이 1개 이상의 프로콜라겐 C-단백질 분해효소 인핸서 단백질 전구체 또는 프로콜라겐 C-단백질 분해효소 인핸서 단백질-유사 도메인을 가짐을 제시한다. 전장 서열의 BLAST 및 FastA 서열 정렬 분석에 기초하여, PRO287은 프로콜라겐 C-단백질 분해효소 인핸서 단백질 전구체 또는 프로콜라겐 C-단백질 분해효소 인핸서 단백질과 아미노산 서열 동일성을 나타내었다(각각 47% 및 54%).
실시예 21: 인간 PRO301을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA35936이라 명명하였다. 어셈블리된 DNA35936 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO301에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
PCR 프라이머(3개의 전방향 및 2개의 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머 1:
5'-TCGCGGAGCTGTGTTCTGTTTCCC-3' (서열 91)
전방향 PCR 프라이머 2:
5'-ACACCTGGTTCAAAGATGGG-3' (서열 92)
전방향 PCR 프라이머 3:
5'-TTGCCTTACTCAGGTGCTAC-3' (서열 93)
역방향 PCR 프라이머 1:
5'-TAGGAAGAGTTGCTGAAGGCACGG-3' (서열 94)
역방향 PCR 프라이머 2:
5'-ACTCAGCAGTGGTAGGAAAG-3' (서열 95)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA35936 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-TGATCGCGATGGGGACAAAGGCGCAAGCTCGAGAGGAAACTGTTGTGCCT-3' (서열 96)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO301 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 신장 조직으로부터 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA40628-1216[도 35, 서열 89]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO301 단백질 서열을 수득하였다.
DNA40628-1216의 전장 클론은 도 35(서열 89)에 포함되어 있다. 클론 DNA40628-1216는 뉴클레오티드 위치 52 내지 54의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 949 내지 951의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 299개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 분자량은 대략 32,583 달톤이며, 추정된 pI는 약 8.29가다. 도 36 (서열 90)에 나타낸 전장 PRO301 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 36에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 36에 나타낸 전장 PRO301 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 27의 신호 펩티드; 약 아미노산 235 내지 약 아미노산 256의 막횡단 도메인; 약 아미노산 185 내지 약 아미노산 189의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 270 내지 약 아미노산 274의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 105 내지 약 아미노산 111, 약 아미노산 116 내지 약 아미노산 122, 약 아미노산 158 내지 약 아미노산 164, 약 아미노산 219 내지 약 아미노산 225, 약 아미노산 237 내지 약 아미노산 243 및 약 아미노산 256 내지 약 아미노산 262의 N-미리스토일화 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA40628-1216을 1997년 11월 7일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209432 호를 배정받았다.
도 36(서열 90)에 나타낸 전장 PRO301 서열의 BLAST 및 FastA 서열 정렬 분석에 기초하여, PRO301은 A33 항원 전구체(30%), 및 콕사키에 및 아데노바이러스 수용체 단백질(29%)과 아미노산 서열 동일성을 나타내었다.
실시예 22: 인간 PRO323을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA30875라 명명하였다. 어셈블리된 DNA30875 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO323에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
PCR 프라이머(2개의 전방향 및 1개의 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머 1:
5'-AGTTCTGGTCAGCCTATGTGCC-3' (서열 99)
전방향 PCR 프라이머 2:
5'-CGTGATGGTGTCTTTGTCCATGGG-3' (서열 100)
역방향 PCR 프라이머 1:
5'-CTCCACCAATCCCGATGAACTTGG-3' (서열 101)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA30875 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-GAGCAGATTGACCTCATACGCCGCATGTGTGCCTCCTATTCTGAGCTGGA-3' (서열 102)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO323 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 간 조직으로부터 단리하였다(LIB6).
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA35595-1228[도 37, 서열 97]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO323 단백질 서열을 수득하였다. DNA35595 서열의 특성화에 사용하고 다른 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위해, DNA35595 서열로부터 하기와 같은 부가의 프로브를 제조하였다.
전방향 PCR 프라이머:
5'-TGCTGCTGCTCCAGCCTGTAACC-3' (서열 103)
역방향 PCR 프라이머:
5'-CTGGCCGTAGCTGAAATTGCGC-3' (서열 104)
혼성화 프로브:
5'-ACTCAGTAGTCCCAGCACCCAGGGCCTGCAAGAGCAGGCACGG-3' (서열 105)
DNA35595-1228의 전장 클론은 도 37(서열 97)에 포함되어 있다. 클론 DNA35595-1228는 뉴클레오티드 위치 110 내지 112의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1409 내지 1411의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 433개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 분자량은 대략 47,787 달톤이며, 추정된 pI는 약 6.11이다. 도 38 (서열 98)에 나타낸 전장 PRO323 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 38에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 38에 나타낸 전장 PRO323 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 58 내지 약 아미노산 62, 약 아미노산 123 내지 약 아미노산 127, 약 아미노산 182 내지 약 아미노산 186 및 약 아미노산 273 내지 약 아미노산 277의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 72 내지 약 아미노산 78, 약 아미노산 133 내지 약 아미노산 139, 약 아미노산 234 내지 약 아미노산 240, 약 아미노산 264 내지 약 아미노산 270, 약 아미노산 334 내지 약 아미노산 340 및 약 아미노산 389 내지 약 아미노산 395의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 134 내지 약 아미노산 157의 신장 디펩티다제 활성 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA35595-1228을 1997년 12월 10일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209528 호를 배정받았다.
도 38(서열 98)에 나타낸 전장 PRO323 서열의 아미노산 서열 분석은 상기 폴리펩티드의 일부분이 다양한 디펩티다제 단백질과 상당한 상동성이 있음을 제시하고, 따라서 PRO323은 신규 디펩티다제 단백질일 수 있다.
실시예 23: 인간 PRO331을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA30875라 명명하였다. 어셈블리된 DNA30875 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO331에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
1쌍의 PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머:
5'-GCCTTTGACAACCTTCAGTCACTAGTGG-3'(서열108)
역방향 PCR 프라이머:
5'-CCCCATGTGTCCATGACTGTTCCC-3' (서열 109)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-TACTGCCTCATGACCTCTTCACTCCCTTGCATCATCTTAGAGCGG-3' (서열 110)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO331 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 뇌 조직으로부터 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA40981-1234[도 39, 서열 106]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO331 단백질 서열을 수득하였다.
DNA40981-1234의 전장 클론은 도 39(서열 106)에 포함되어 있다. 클론 DNA40981-1234는 뉴클레오티드 위치 812 내지 814의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 2732 내지 2734의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 640개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 분자량은 대략 71,950 달톤이며, 추정된 pI는 약 7.12가다. 도 40 (서열 107)에 나타낸 전장 PRO331 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 40에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 40에 나타낸 전장 PRO331 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 44의 신호 펩티드; 약 아미노산 528 내지 약 아미노산 543의 막횡단 도메인; 약 아미노산 278 내지 약 아미노산 282, 약 아미노산 364 내지 약 아미노산 368, 약 아미노산 390 내지 약 아미노산 394, 약 아미노산 412 내지 약 아미노산 416, 약 아미노산 415 내지 약 아미노산 419, 약 아미노산 434 내지 약 아미노산 438, 약 아미노산 442 내지 약아미노산 446, 약 아미노산 488 내지 약 아미노산 492 및 약 아미노산 606 내지 약 아미노산 610의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 183 내지 약 아미노산 187의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 40 내지 약 아미노산 46, 약 아미노산 73 내지 약 아미노산 79, 약 아미노산 118 내지 약 아미노산 124, 약 아미노산 191 내지 약 아미노산 197, 약 아미노산 228 내지 약 아미노산 234, 약 아미노산 237 내지 약 아미노산 243, 약 아미노산 391 내지 약 아미노산 397, 약 아미노산 422 내지 약 아미노산 428, 약 아미노산 433 내지 약 아미노산 439 및 약 아미노산 531 내지 약 아미노산 537의 N-미리스토일화 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA40981-1234를 1997년 11월 7일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209439 호를 배정받았다.
도 40(서열 107)에 나타낸 전장 PRO331 서열의 아미노산 서열 분석은 상기 폴리펩티드의 일부분이 LIG-1 단백질과 상당한 상동성이 있음을 제시하고, 따라서 PRO331은 신규 LIG-1 관련 단백질일 수 있다.
실시예 24: 인간 PRO356을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
발현 서열 태그(EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 검색하여, 인간 TIE 리간드 족에 상동성을 나타내는 EST(#2939340)를 찾아내었다. PRO356을 클로닝하기 위해, 클론테크, 인크(Clontech, Inc., Palo Alto, CA)에서 구입한 mRNA(카탈로그 번호 #6528-1)로부터 제조된 인간 태아 폐 라이브러리를 제조자의 지시에 따라 사용하였다.
인간 PRO356을 코딩하는 cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는, 인비트로젠(Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 상업적으로 시판하는 시약을 이용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터에 평활 말단으로 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 대략의 크기를 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO356에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 상기 기재된 EST 서열 기재의 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 통상 뉴클레오티드 20 내지 30개 범위이며, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 산출하도록 설계한다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 전장 클론의 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 그 후에, 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 목적 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 양성 라이브러리를 이용하였다.
사용된 올리고뉴클레오티드 프로브는 하기와 같다:
5'-TTCAGCACCAAGGACAAGGACAATGACAACT-3' (서열 113)
5'-TGTGCACACTTGTCCAAGCAGTTGTCATTGTC-3' (서열 114)
5'-GTAGTACACTCCATTGAGGTTGG-3'(서열115)
cDNA 클론을 확인하고 그 전체를 서열 분석하였다. DNA47470-1130-P1의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 41(서열 111)에 나타내었다. 클론 DNA47470-1130-P1은 뉴클레오티드 위치 215 내지 217의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1253 내지 1255의 정지 코돈 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 41, 서열 111). 예상된 폴리펩티드 전구체는 346개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다. 전장 PRO356 단백질은 도 42(서열 112)에 나타내었다.
도 42(서열 112)에 나타낸 전장 PRO356 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 42에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 보여준다. 도 42(서열 112)에 나타낸 전장 PRO356의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 26의 신호 펩티드; 약 아미노산 58 내지 약 아미노산 62, 약 아미노산 253 내지 약 아미노산 257 및 약 아미노산 267 내지 약 아미노산 271의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 167 내지 약 아미노산 171의 글리코사미노글리칸 부착 부위; 약 아미노산 176 내지 약 아미노산 180의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 168 내지 약 아미노산 174, 약 아미노산 196 내지 약 아미노산 202, 약 아미노산 241 내지 약 아미노산 247, 약 아미노산 252 내지 약 아미노산 258, 약 아미노산 256 내지 약 아미노산 262 및 약 아미노산 327 내지 약 아미노산 333의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 199 내지 약 아미노산 202의 세포 부착 서열이 존재하는 것을 입증한다.
클론 DNA47470-1130-P1을 1997년 10월 28일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209422 호를 배정받았다. 기탁된 클론이 본원에 설명된 것에 비해 실제로 올바른 서열을 갖는 것을 이해된다.
도 42(서열 112)에 나타낸 전장 서열의 ALIGN-2 서열 정렬 분석을 이용하는 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO356 아미노산 서열과 TIE-2L1(32%) 및 TIE-2L2(34%) 사이에 아미노산 서열 동일성을 보여주었다. "TIE"라는 약어는 "티로신 키나아제 함유 Ig 및 EGF 상동성 도메인(tyrosine kinase containingIg andEGF homology domain)"을 나타내는 머리 글자이며, 수용체 티로신 키나아제의 새로운 족을 지칭하기 위해 만들어졌다.
실시예 25: 인간 PRO364를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
발현 서열 태그(EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 검색하여, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 족 폴리펩티드의 구성원에 상동성을 나타내는 EST(Incyte EST 제3003460호)를 찾아내었다.
이후에, BLAST (Altshul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)) 및 "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)의 반복 주기를 이용하여, Incyte EST 제3003460호 및 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 이 컨센서스 서열은 본원에서 "<consen01>"이라 명명되었으며, 또한 DNA44825라 지칭되었다. DNA44825 및 "<consen01>" 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO364에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 통상 뉴클레오티드 20 내지 30개 범위이며, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 산출하도록 설계한다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 전장 클론의 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 그 후에, 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 목적 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 양성 라이브러리를 이용하였다.
사용된 올리고뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:
전방향 PCR 프라이머 (44825.fl):
5'-CACAGCACGGGGCGATGGG-3' (서열 118)
전방향 PCR 프라이머 (44825.f2):
5'-GCTCTGCGTTCTGCTCTG-3'(서열119)
전방향 PCR 프라이머 (44825.GITR.f):
5'-GGCACAGCACGGGGCGATGGGCGCGTTT-3' (서열 120)
역방향 PCR 프라이머 (44825.rl):
5'-CTGGTCACTGCCACCTTCCTGCAC-3' (서열 121)
역방향 PCR 프라이머 (44825.r2):
5'-CGCTGACCCAGGCTGAG-3' (서열 122)
역방향 PCR 프라이머 (44825.GITR.r):
5'-GAAGGTCCCCGAGGCACAGTCGATACA-3' (서열 123)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA44825 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브 (44825.p1):
5'-GAGGAGTGCTGTTCCGAGTGGGACTGCATGTGTGTCCAGC-3' (서열 124)
혼성화 프로브 (44825.GITR.p):
5'-AGCCTGGGTCAGCGCCCCACCGGGGGTCCCGGGTGCGGCC-3' (서열 125)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO364 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다.
cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 소장 조직으로부터 단리하였다(LIB231). cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는, 인비트로젠(Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 상업적으로 시판하는 시약을 이용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터에 평활 말단으로 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 대략의 크기를 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석으로 PRO364에 대한 전장 DNA 서열[본원에서 DNA47365-1206이라 치칭됨]을 수득하였다. DNA47365-1206의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 43(서열 116)에 나타내었다. 클론 DNA47365-1206은 뉴클레오티드 위치 121 내지 123의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 844 내지 846의 정지 코돈 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 43, 서열 116). 예상된 폴리펩티드 전구체는 241개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 예상 분자량은 약 26,000 달톤이며, pI는 약 6.34가다. 전장 PRO364 단백질은 도 44(서열 117)에 나타내었다.
도 44(서열 117)에 나타낸 전장 PRO364 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 44에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 보여준다. 도 44(서열 117)에 나타낸 전장 PRO364의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 25의 신호 펩티드; 약 아미노산 163 내지 약 아미노산 183의 막횡단 도메인; 약 아미노산 146 내지 약 아미노산 150의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 5 내지 약 아미노산 11, 약 아미노산 8 내지 약 아미노산 14, 약 아미노산 25 내지 약 아미노산 31, 약 아미노산 30 내지 약 아미노산 36, 약 아미노산 33 내지 약 아미노산 39, 약 아미노산 118 내지 약 아미노산 124, 약 아미노산 122 내지 약 아미노산 128 및 약 아미노산 156 내지 약 아미노산 162의 N-미리스토일화 부위; 약 아미노산 166 내지 약 아미노산 177의 원핵 세포막 지질단백질 지질 부착 부위; 및 약 아미노산 171 내지 약 아미노산 193의 루이신 지퍼 패턴이 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA47365-1206을 1997년 11월 7일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209436 호를 배정받았다.
도 44(서열 117)에 나타낸 전장 PRO364 서열의 분석은 상기 폴리펩티드의 일부분이 종양 괴사 인자 수용체 족의 구성원과 상당한 상동성이 있음을 제시하고, 따라서 PRO364는 종양 괴사 인자 수용체 족의 신규 구성원일 수 있다.
전장 PRO364 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 상세히 재검토하면, 문헌(Nocenti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 6216-6221 (1997))에 보고된 생쥐 GITR 단백질과 상동성이 있음을 입증할 수 있다. 따라서, PRO364는 상기 문헌에 보고된 생쥐 GITR 단백질에 대한 인간의 상응물일 수 있다.
실시예 26: 인간 PRO526을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 최초의 컨센서스 DNA 서열을 확인하여, 본원에서 DNA39626.init라 명명하였다. BLAST 및 phrap의 반복 주기를 이용하여, 상기 논의된 EST 서열의 공급원을 이용하여 최초의 컨센서스 DNA 서열을 가능한 길게 확장시켰다. 확장된 어셈블리 서열을 본원에서 <consen01>이라 지칭하였다. 어셈블리된 <consen01> DNA 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO526에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다.
1쌍의 PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머:
5'-TGGCTGCCCTGCAGTACCTCTACC-3'(서열 128)
역방향 PCR 프라이머:
5'-CCCTGCAGGTCATTGGCAGCTAGG-3' (서열 129)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 <consen01> DNA 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-AGGCACTGCCTGATGACACCTTCCGCGACCTGGGCAACCTCACAC-3' (서열 130)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO526 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 간 조직으로부터 단리하였다(LIB228).
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석을 통해 DNA44184-1319[도 45, 서열 126]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO526 단백질 서열을 수득하였다.
DNA44184-1319의 전장 클론은 도 45(서열 126)에 포함되어 있다. 클론 DNA44184-1319는 뉴클레오티드 위치 514 내지 516의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1933 내지 1935의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 473개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 분자량은 대략 50,708 달톤이며, 추정된 pI는 약 9.28이다. 도 46 (서열 127)에 나타낸 전장 PRO526 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 46에 나타낸 전장 PRO526 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 26의 신호 펩티드; 약 아미노산 135 내지 약 아미노산 157의 루이신 지퍼 패턴; 약 아미노산 436 내지 약 아미노산 440의 글리코사미노글리칸 부착 부위; 약 아미노산 82 내지 약 아미노산 86, 약 아미노산 179 내지 약 아미노산 183, 약 아미노산 237 내지 약 아미노산 241, 약 아미노산 372 내지 약 아미노산 376 및 약 아미노산 423 내지 약 아미노산 427의 N-글리코실화 부위; 및 약 아미노산 411 내지 약 아미노산 427의 폰 빌레브란트 인자 유형 C 도메인이 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA44184-1319를 1998년 3월 26일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209704 호를 배정받았다.
도 46(서열 127)에 나타낸 전장 PRO526 서열의 아미노산 서열 분석은 상기 폴리펩티드의 일부분이 ALS, SLIT, 카르복시펩티다제 및 혈소판 당단백질 Ⅴ를 포함하는 루이신 반복 풍부 단백질과 상당한 상동성이 있음을 제시하고, 따라서 PRO526은 단백질-단백질 상호작용과 관련된 신규 단백질일 수 있다.
실시예 27: 인간 PRO538을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
발현 서열 태그(EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 검색하여, 쥐과 GFRα3("신경교 세포주 유도 신경 영양 인자 족 수용체 알파")와 61%의 동일성이 있는 Incyte EST(INC3574209)를 찾아내었다. PRO538에 상응하는 전장의 cDNA를 클로닝하기 위해, cDNA 라이브러리의 패널을 하기 프라이머로 스크리닝하였다:
newa3.F:
5'-GCCTCTCGCAGCCGGAGACC-3' (서열 133)
newa3.R:
5'-CAGGTGGGATCAGCCTGGCAC-3' (서열 134)
문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995))에 따라 상기 PCR 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 강력한 신호의 PCR 생성물을 모든 라이브러리에서 확인하고 분석하였다(태아 폐, 태아 신장 및 태반).
이 단백질을 코딩하는 cDNA 클론을 단리하기 위해, 인간 태아 폐-pRK5 벡터 라이브러리를 선택하여 newa3.R 프라이머를 이용하여 dug-/bung- 숙주 중에서 배양된 플라스미드 라이브러리로부터 단일 가닥 DNA를 확장시켜 양성 cDNA 클론의 양을 많게 하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 폐 조직으로부터 단리하였다.
cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는, 인비트로젠(Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 상업적으로 시판하는 시약을 이용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터에 평활 말단으로 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 대략의 크기를 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다. 양성 cDNA 클론의 양을 많게 하기 위해, 10x PCR 완충액(Perkin Elmer) 10㎕, dNTP(20 mM) 1㎕, 라이브러리 DNA 1㎕(200 ng), 프라이머 1㎕, 물 86.5㎕ 및 Amplitaq(Perkin Elmer, USA) 1㎕를 함유하는 프라이머 확장 반응물을 고온 반응 시작후 가하였다. 반응물을 95℃에서 1분 동안 변성시키고, 60℃에서 1분 동안 어닐링시킨 후, 72℃에서 15분 동안 확장시켰다. DNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전시킨 후, 일렉트로포레이션에 의해 DH10B 숙주 세균에 형질전환시켰다. 전체 형질전환 혼합물을 10개의 플레이트에 플레이팅하여 콜로니가 형성되도록 하였다. 콜로니를 나일론 막에 옮겨 상기 Incyte EST로부터 유도된 올리고뉴클레오티드 프로브로 스크리닝하였다.
newa3.프로브:
5'-TCTCGCAGCCGGAGACCCCCTTCCCACAGAAAGCCGACTCA-3' (서열 135)
5개의 양성 콜로니를 찾아내었다. 콜로니 정제 및 2차 스크리닝을 통해 순수한 양성 콜로니를 수득하였다. 2개의 단리된 클론을 서열 분석하고, 본원에서 DNA48613 및 DNA48614(DNA48613이 달리 스프라이싱된 형태)라 지칭하였다.
DNA48613-1268의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 49(서열 131)에 나타내었다. 클론 DNA48613-1268은 뉴클레오티드 위치 38 내지 40의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1238 내지 1240의 정지 코돈 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 49, 서열 131). 예상된 폴리펩티드 전구체는 400개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 예상 분자량은 약 44,511 달톤이며, pI는 약 8.15가다. 전장 PRO538 단백질은 도 48(서열 132)에 나타내었다.
도 48 (서열 132)에 나타낸 전장 PRO538 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 48에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 전장 PRO538 폴리펩티드(도 48, 서열 132)의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 26의 신호 펩티드; 약 아미노산 95 내지 약 아미노산 99, 약 아미노산 148 내지 약 아미노산 152 및 약 아미노산 309 내지 약 아미노산 313의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 231 내지 약 아미노산 235의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 279 내지 약 아미노산 285 및 약 아미노산 294 내지 약 아미노산 300의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 306 내지 약 아미노산 317 및 약 아미노산 379 내지 약 아미노산 390의 원핵 세포막 지질단백질 지질 부착 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA48613-1268을 1998년 4월 7일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209752 호를 배정받았다.
상기 논의된 바와 같이, DNA48613에 의해 코딩되는 단백질과 GFRα1 및 GFRα2의 서열 비교는 인간 단백질 PRO538이 GFRα 수용체 족의 새로운 구성원이며, 쥐과 GFRα3에 대한 인간 동족체임을 제시한다. 따라서, DNA48613-1268은 인간 GFRα3으로 지칭되는 단백질을 코딩하며, DNA48614는 그의 스플라이스 변형체를 코딩한다.
전장 PRO538 폴리펩티드(도 48, 서열 132에 나타냄)의 BLAST-2 및 FastA 서열 정렬 분석에 기초한 GFRα 족 구성원들 사이의 아미노산 서열 비교를 하기에 기재한다.
GFRα 족 구성원들 사이의 서열 동일성
비교된 단백질 동일성 %
rGFRα1 대 hGFRα1 92%
rGFRα2 대 hGFRα2 94%
mGFRα3 대 hGFRα3 77%
hGFRα3 대 hGFRα1 34%
hGFRα3 대 hGFRα2 34%
hGFRα1 대 hGFRα2 48%
서열 비교로부터, 인간 GFRα3은 GFRα1 또는 GFRα2에 비해 그의 설치류 동족체와의 연관성이 적은 것 같다. 또한, GFRα1과 GFRα2가 서로 연관된 것 보다 GFRα1 및 GFRα2에 대한 GFRα3의 연관성이 적은 것 같다.
실시예 28: 인간 PRO713을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
발현 서열 태그(EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 검색하여, VEGF에 상동성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 EST(Incyte EST 제1302516호)를 찾아내었다. 상기 Incyte EST 제1302516호 기재의 프로브를 사용하여 인간 신경교종 세포주인 G61로부터 유도된 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 특히, Incyte 클론 INC1302516을 사용하여 하기 4개의 프로브를 제조하였다.
5'-ACTTCTCAGTGTCCATAAGGG-3' (서열 138)
5'-GAACTAAAGAGAACCGATACCATTTTCTGGCCAGGTTGTC-3' (서열 139)
5'-CACCACAGCGTTTAACCAGG (서열 140)
5'-ACAACAGGCACAGTTCCCAC-3' (서열 141)
9개의 양성 반응체를 찾아내어 특성화하였다. 3개의 클론은 전체 코딩 영역을 함유하였으며, 서열이 동일하였다. 또한, 부분 클론도 태아 폐 라이브러리로부터 확인되었고, 코딩되는 아미노산 서열을 변화시키지 않는 뉴클레오티드 변화를제외하고는 신경교종 세포주에서 유도된 것과 서열이 동일하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석으로 PRO713에 대한 전장 DNA 서열[본원에서 DNA29101-1122라 치칭됨]을 수득하였다. DNA29101-1122의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 49(서열 136)에 나타내었다. 클론 DNA29101-1122는 뉴클레오티드 위치 285 내지 287의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1320 내지 1322의 정지 코돈 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 49, 서열 136). 예상된 폴리펩티드 전구체는 345개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 예상 분자량은 약 39,029 달톤이며, pI는 약 6.06이다. 전장 PRO713 단백질은 도 50(서열 137)에 나타내었다.
도 50 (서열 137)에 나타낸 전장 PRO538 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 50에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 전장 PRO713 폴리펩티드(도 50, 서열 137)의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 14의 신호 펩티드; 약 아미노산 25 내지 약 아미노산 29, 약 아미노산 55 내지 약 아미노산 59 및 약 아미노산 254 내지 약 아미노산 258의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 15 내지 약 아미노산 21, 약 아미노산 117 내지 약 아미노산 123, 약 아미노산 127 내지 약 아미노산 133, 약 아미노산 281 내지 약 아미노산 287, 약 아미노산 282 내지 약 아미노산 288 및 약 아미노산 319 내지 약 아미노산 325의 N-미리스토일화 부위; 및약 아미노산 229 내지 약 아미노산 233의 아미드화 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA29101-1122를 1998년 3월 5일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209653 호를 배정받았다.
도 59(서열 137)에 나타낸 전장 PRO713 서열의 분석은 상기 폴리펩티드가 신규 VEGF-관련 단백질(VEGF-E)임을 제시한다.
실시예 29: 인간 PRO719를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA44851이라 명명하였으며, 이는 또한 Incyte EST 클론 제179903호와 정확히 일치한다. 어셈블리된 DNA44851 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO719에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
1쌍의 PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머(44851.f1):
5'-GTGAGCATGAGCGAGCCGTCCAC-3' (서열 144)
역방향 PCR 프라이머(44851.r1):
5'-GCTATTACAACGGTTCTTGCGGCAGC-3' (서열 145)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 제조하였다:
혼성화 프로브(44851.p1):
5'-TTGACTCTCTGGTGAATCAGGACAAGCCGAGTTTTGCCTTCCAG-3' (서열 146)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO719 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태반 조직으로부터 단리하였다(LIB90).
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA49646-1327[도 51, 서열 142]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO719 단백질 서열을 수득하였다.
DNA49646-1327의 전장 클론은 도 51(서열 142)에 포함되어 있다. 클론 DNA49646-1327는 뉴클레오티드 위치 223 내지 225의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1285 내지 1287의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 354개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 분자량은 대략 39,362 달톤이며, 추정된 pI는 약 8.35가다. 도 52 (서열 143)에 나타낸 전장 PRO719 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 52에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 52에 나타낸 전장 PRO719 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 16의 신호 펩티드; 약 아미노산 80 내지 약 아미노산 84 및 약 아미노산 136 내지 약 아미노산 140의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 206 내지 약 아미노산 210 및 약 아미노산 329 내지 약 아미노산 333의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 63 내지 약 아미노산 69, 약 아미노산 96 내지 약 아미노산 102, 약 아미노산 171 내지 약 아미노산 177, 약 아미노산 191 내지 약 아미노산 197, 약 아미노산 227 내지 약 아미노산 233, 약 아미노산 251 내지 약 아미노산 257, 약 아미노산 306 내지 약 아미노산 312 및 약 아미노산 346 내지 약 아미노산 352의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 163 내지 약 아미노산 173의 리파아제, 세린 활성 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA49646-1327을 1998년 3월 26일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209705 호를 배정받았다.
전장 PRO719 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석은 상기 폴리펩티드가 지질단백질 리파아제 H 단백질과 상당한 서열 유사성이 있음을 제시하며, 따라서 PRO719는 신규 지질단백질 리파아제 동족체일 수 있다. 더욱 구체적으로, 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO719 아미노산 서열과 데이호프 서열 LIPL_HUMAN, LIPH_HUMAN, D83548_1, A24059_1, P_R30740, D88666_1, A43357, A46696, B43357 및 A49488 사이에 상당한 상동성을 보여주었다.
실시예 30: 인간 PRO771을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 이 컨센서스 서열을 본원에서 <consen01>이라 지칭하였다. <consen01> DNA 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO771에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
1쌍의 PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머:
5'-CAGCAATATTCAGAAGCGGCAAGGG-3' (서열 149)
역방향 PCR 프라이머:
5'-CATCATGGTCATCACCACCATCATCATC-3' (서열 150)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 <consen01> DNA 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-GGTTACTACAAGCCAACACAATGTCATGGCAGTGTTGGACAGTGCTGG-3' (서열 151)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO771 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 신장 조직으로부터 단리하였다(LIB28).
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석을 통해 DNA49829-1346[도 53, 서열 147]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO771 단백질 서열을 수득하였다.
DNA49829-1346의 전장 클론은 도 53(서열 147)에 포함되어 있다. 클론 DNA49829-1346는 뉴클레오티드 위치 134 내지 136의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1442 내지 1444의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 436개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 분자량은 대략 49,429 달톤이며, 추정된 pI는 약 4.80이다. 도 54 (서열 148)에 나타낸 전장 PRO771 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 54에 나타낸 전장 PRO771 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 16의 신호 펩티드; 약 아미노산 115 내지 약 아미노산 119의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 62 내지 약 아미노산 70의 티로신 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 357 내지 약 아미노산 363, 약 아미노산 371 내지 약 아미노산 377 및 약 아미노산 376 내지 약 아미노산 382의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 246 내지 약 아미노산 268의 루이신 지퍼 패턴이 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA49829-1346을 1998년 4월 7일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209749 호를 배정받았다.
전장 PRO771 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석은 상기 폴리펩티드의 일부분이 테스티칸 단백질과 상당한 서열 상동성이 있음을 제시하며, 따라서 PRO771는 신규 테스티칸 동족체일 수 있다.
실시예 31: 인간 PRO788을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 이 컨센서스 서열을 본원에서 "<consen01>"이라 명명하였다. 본원에 제공된 데이타를 기초로, ARS 및 E48 항원에 상동성을 나타내는 Incyte EST 2777282를 찾아내었다. 어셈블리된 "<consen01>" 서열 및 본원에 제공된 다른 데이타를 기초로, Incyte EST2777282를 수득하여 그 전체를 서열 분석함으로써 본원에서 DNA56405-1357(도 55, 서열 152)이라 지칭되는 PRO788에 대한 전장 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO788에 대한 단백질 서열을 수득하였다.
DNA56405-1357의 전체 코딩 서열은 도 55(서열 152)에 포함되어 있다. 클론 DNA56405-1357는 뉴클레오티드 위치 84 내지 86의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 459 내지 461의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 125개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 분자량은 대략 13,115 달톤이며, 추정된 pI는 약 5.90이다. 도 56 (서열 153)에 나타낸 전장 PRO788 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 56에 나타낸 전장 PRO788 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 17의 신호 펩티드; 약 아미노산 46 내지 약 아미노산 50의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 3 내지 약 아미노산 9, 약 아미노산 33 내지 약 아미노산 39 및 약 아미노산 84 내지 약 아미노산 90의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 6 내지 약 아미노산 17의 원핵 세포막 지질단백질 지질 부착 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA56405-1357을 1998년 5월 6일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209849 호를 배정받았다.
실시예 32: 인간 PRO792를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA38106이라 명명하였으며, 이는 Incyte EST 클론 제1988930호와 정확히 일치한다. 어셈블리된 DNA38106 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO792에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
1쌍의 PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머(38016.f1):
5'-GCGAGAACTGTGTCATGATGCTGC-3' (서열 156)
역방향 PCR 프라이머(38016.r1):
5'-GTTTCTGAGACTCAGCAGCGGTGG-3' (서열 157)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA38016으로부터 제조하였다:
혼성화 프로브(38016.p1):
5'-CACCGTGTGACAGCGAGAAGGACGGCTGGATCTGTGAGAAAAGGCACAAC-3' (서열 158)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO792 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 골수 조직으로부터 단리하였다(LIB255).
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA56352-1358[도 57, 서열 154]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO792 단백질 서열을 수득하였다.
DNA56352-1358의 전체 코딩 서열은 도 57(서열 154)에 포함되어 있다. 클론 DNA56352-1358는 뉴클레오티드 위치 67 내지 69의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 946 내지 948의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 293개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 분자량은 대략 32,562 달톤이며, 추정된 pI는 약 6.53이다. 도 58 (서열 155)에나타낸 전장 PRO792 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 58에 나타낸 전장 PRO792 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 46의 신호 펩티드; 약 아미노산 31 내지 약 아미노산 54의 가능한 Ⅱ형 막횡단 도메인; 약 아미노산 73 내지 약 아미노산 77 및 약 아미노산 159 내지 약 아미노산 163의 N-글리코실화부위; 약 아미노산 18 내지 약 아미노산 24, 약 아미노산 133 내지 약 아미노산 139 및 약 아미노산 242 내지 약 아미노산 248의 N-미리스토일화 부위; 약 아미노산 264 내지 약 아미노산 288의 C-형 렉틴 도메인 시그너쳐; 및 약 아미노산 102 내지 약 아미노산 124의 루이신 지퍼 패턴이 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA56352-1358을 1998년 5월 6일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209846 호를 배정받았다.
전장 PRO792 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석은 상기 폴리펩티드가 CD23 단백질과 상당한 서열 유사성이 있음을 제시하고, 따라서 PRO792은 신규 CD23 동족체일 수 있다. 더욱 구체적으로, 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO792 아미노산 서열과 데이호프 서열 S34198, A07100-1, A05303_1, P_R41689, P_P82839, A10871_1, P_R12796, P_R47199, A46274 및 P_R32188 사이에 상당한 상동성을 보여주었다.
실시예 33: 인간 PRO812를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 3에 기재된 비공개 신호 서열 조사 연산법을 사용하여 DNA59205-1421을 찾아내었다. 상기 기재된 신호 서열 연산법을 이용하여 LIFESEQ(등록상표) 데이타베이스로부터 Incyte EST 클러스터 제170079호라 명명된 EST 클러스터 서열을 찾아내었다. 그 후에, 존재하는 상동성을 확인하기 위해, 이 EST 클러스터 서열을, 공개 EST 데이타베이스(예를 들어, 진뱅크) 및 비공개 EST 데이타베이스(LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 포함하는 다양한 발현 서열 태그(EST) 데이타베이스와 비교하여 상동성을 조사하였다. 상동성 검색은 컴퓨트 프로그램인 BLAST 또는 BLAST2(Altshul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996))를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 이로부터 수득된 컨센서스 서열을 본원에서 DNA55721이라 지칭하였다.
DNA55721 서열과 Incyte EST 제388964호 사이의 서열 상동성을 고려하여, Incyte EST 클론 제388964호를 구입하고, cDNA 삽입체를 수득하여 서열 분석하였다. 이 cDNA 삽입체의 서열은 도 59(서열 159)에 나타내었고 본원에서 DNA59205-1421이라 지칭하였다.
DNA59205-1421의 전체 코딩 서열은 도 59(서열 159)에 포함되어 있다. 클론 DNA59205-1421는 뉴클레오티드 위치 55 내지 57의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 304 내지 306의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 59). 예상된 폴리펩티드 전구체는 83개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다(도 60, 서열 160). 도 60에 나타낸 전장 PRO812 단백질의 예상 분자량은 약 9,201 달톤이며, pI는 약 9.30이다. 도 60 (서열 160)에 나타낸 전장 PRO812서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 60에 나타낸 전장 PRO812 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 15의 신호 펩티드; 약 아미노산 73 내지 약 아미노산 77의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA59205-1421을 1998년 6월 23일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 203009 호를 배정받았다.
도 60(서열 160)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용하는 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO812 아미노산 서열과 데이호프 서열 P_W35802, P_W35803, PSC1_RAT, S68231, GEN13917, PSC2_RAT, CC10_HUMAN, UTER_RABIT, AF008595_1 및 A56413 사이에 상당한 상동성을 보여주었다.
실시예 34: 인간 PRO865를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 2에 기재된 아밀라제 스크린에서 단리된 cDNA 서열을 본원에서 DNA37642 또는 DNA37642.init라 지칭하였다. 그 후에, 이들 사이에 존재하는 상동성을 확인하기 위해, 공개 EST 데이타베이스(예를 들어, 진뱅크) 및 비공개 EST 데이타베이스(LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 포함하는 다양한 발현 서열 태그(EST) 데이타베이스와 상기 DNA37642를 비교하였다. 상동성 검색은 컴퓨트 프로그램인 BLAST 또는 BLAST2(Altshul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996))를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 수득된 어셈블리 및 컨센서스 서열을 본원에서 DNA48615라 지칭하였다.
DNA48615 서열을 기초로 하여 올리고뉴클레오티드 프로브를 제조하고, 상기 실시예 2의 첫번째 단락에 기재된 바와 같이 제조된 인간 태아 신장(LIB227) 라이브러리를 스크린하기 위해 사용하였다. 클로닝 벡터는 pRK5B (pRK5B는 SfiⅠ 부위를 함유하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al., Science, 253:1278-1280 (1991)) 참조)였으며, 절단된 cDNA의 크기는 2800bp 미만이었다.
PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머 1(48615.f1):
5'-AAGCTGCCGGAGCTGCAATG-3' (서열 163)
전방향 PCR 프라이머 2(48615.f2):
5'TTGCTTCTTAATCCTGAGCGC-3' (서열 164)
전방향 PCR 프라이머 3(48615.f3):
5'-AAAGGAGGACTTTCGACTGC-3' (서열 165)
역방향 PCR 프라이머 1(48615.r1):
5'-AGAGATTCATCCACTGCTCCAAGTCG-3' (서열 166)
역방향 PCR 프라이머 2(48615.r2):
5'-TGTCCAGAAACAGGCACATATCAGC-3' (서열 167)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화프로브를 컨센서스 DNA48615로부터 제조하였다:
혼성화 프로브(48615.p1):
5'-AGACAGCGGCACAGAGGTGCTTCTGCCAGGTTAGTGGTTACTTGGATGAT-3' (서열 168)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO815 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다.
전장 클론[DNA53974-1401]은 뉴클레오티드 위치 173 내지 175의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1577 내지 1579의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 61, 서열 161). 예상된 폴리펩티드 전구체는 468개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 계산된 분자량은 약 54,393 달톤이며, 추정된 pI는 약 5.63이다. 도 62 (서열 162)에 나타낸 전장 PRO865 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은, 도 62에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 62에 나타낸 전장 PRO865 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 23의 신호 펩티드; 약 아미노산 280 내지 약 아미노산 284 및 약 아미노산 384 내지 약 아미노산 388의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 94 내지 약 아미노산 98의 아미드화 부위; 약 아미노산 20 내지 약 아미노산 24 및 약 아미노산 223 내지 약 아미노산 227의 글리코사미노글리칸 부착 부위; 약 아미노산 216 내지 약 아미노산 223의 아미노트랜스퍼라제 클래스-V 피리독실-포스페이트 부위; 및 약 아미노산 338 내지 약 아미노산 344의 인터루킨-7 단백질 부위가 존재하는것을 입증한다. 클론 DNA53974-1401을 1998년 4월 14일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209774 호를 배정받았다.
전장 PRO865(도 62, 서열 162) 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석은 상기 폴리펩티즈가 어떤 공지된 단백질과도 상당한 유사성이 없음을 제시하였다. 그러나, 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO865 아미노산 서열과 데이호프 서열 YMN0_YEAST, ATFCA4_43, S44168, P_W14549 및 RABTCRG4_1 사이에 어느정도의 상동성을 보여주었다.
실시예 35: 인간 PRO1075를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA34363이라 명명하였다. 컨센서스 어셈블리에 제넨테크의 비공개 EST를 사용하였다. 제넨테크의 EST는 본원에서 DNA13059 및 DNA19463이라 지칭된다. DNA34363 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO1075에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머(34363.f1):
5'-TGAGAGGCCTCTCTGGAAGTTG-3' (서열 171)
전방향 PCR 프라이머(34363.f2):
5'-GTCAGCGATCAGTGAAAGC-3' (서열 172)
전방향 PCR 프라이머(34363.f3):
5'-CCAGAATGAAGTAGCTCGGC-3' (서열 173)
전방향 PCR 프라이머(34363.f4):
5'-CCGACTCAAAATGCATTGTC-3' (서열 174)
전방향 PCR 프라이머(34363.f5):
5'-CATTTGGCAGGAATTGTCC-3' (서열 175)
전방향 PCR 프라이머(34363.f6):
5'-GGTGCTATAGGCCAAGGG-3' (서열 176)
역방향 PCR 프라이머(34363.r1):
5'-CTGTATCTCTGGGCTATGTCAGAG-3' (서열 177)
역방향 PCR 프라이머(34363.r2):
5'-CTACATATAATGGCACATGTCAGCC-3' (서열 178)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA34363으로부터 제조하였다:
혼성화 프로브(34363.p1):
5'-CGTCTTCCTATCCTTACCCGACCTCAGATGCTCCCTTCTGCTCCTG-3' (서열 179)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO1075 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 피부 종양 조직으로부터 단리하였다(LIB324).
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA57689-1385[도 63, 서열 169]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO1075 단백질 서열을 수득하였다.
DNA57689-1385의 전체 코딩 서열은 도 63(서열 169)에 포함되어 있다. 클론 DNA57689-1385는 뉴클레오티드 위치 137 내지 139의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1255 내지 1357의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 406개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 예상 분자량은 약 46,927 달톤이며, pI는 약 5.21이다. 도 64 (서열 170)에 나타낸 전장 PRO1075 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 64에 나타낸 전장 PRO1075 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 29의 신호 펩티드; 약 아미노산 203 내지 약 아미노산 212의 티로신 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 225 내지 약 아미노산 231의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 403 내지 약 아미노산 408의 소포체 표적 서열이 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA57689-1385를 1998년 5월 14일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209869 호를 배정받았다.
전장 PRO1075 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석은 상기 폴리펩티드가 단백질 디술피드 이소머라제와 상당한 서열 유사성이 있음을 제시하며, 따라서 PRO1075는 신규 단백질 디술피드 이소머라제일 수 있다. 더욱 구체적으로, 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1075 아미노산 서열과 데이호프 서열 CELC30H7_2, CELC06A6_3, CELF42G8_3, S57942, ER72_CAEEL, CELC07A12_3, CEH06O01_4 및 P_R51696 사이에 상당한 상동성을 보여주었다.
실시예 36: 인간 PRO1126을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 3에 기재된 비공개 신호 서열 조사 연산법을 사용하여 DNA60615-1483을 찾아내었다. 상기 기재된 신호 서열 연산법을 이용하여 LIFESEQ(등록상표) 데이타베이스로부터 Incyte EST 클러스터 제121249호라 명명된 EST 클러스터 서열을 찾아내었다. 그 후에, 존재하는 상동성을 확인하기 위해, 이 EST 클러스터 서열을, 공개 EST 데이타베이스(예를 들어, 진뱅크) 및 비공개 EST 데이타베이스(LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 포함하는 다양한 발현 서열 태그(EST) 데이타베이스와 비교하여 상동성을 조사하였다. 상동성 검색은 컴퓨트 프로그램인 BLAST 또는 BLAST2(Altshul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996))를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 이로부터 수득된 컨센서스 서열을 본원에서 DNA56250이라 지칭하였다.
DNA56250 서열과 Incyte EST 제1437250호 사이의 서열 상동성을 고려하여, Incyte EST 클론 제1437250호를 구입하고, cDNA 삽입체를 수득하여 서열 분석하였다. 이 cDNA 삽입체의 서열은 도 65(서열 180)에 나타내었고 본원에서 DNA60615-1483이라 지칭하였다.
DNA60615-1483의 전체 코딩 서열은 도 65(서열 180)에 포함되어 있다. 클론 DNA60615-1483는 뉴클레오티드 위치 110 내지 112의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1316 내지 1318의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 65). 예상된 폴리펩티드 전구체는 402개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다(도 66, 서열 181). 도 66에 나타낸 전장 PRO1126 단백질의 추정 분자량은 약 45,921 달톤이며, pI는 약 8.60이다. 도 66 (서열 181)에 나타낸 전장 PRO1126 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 66에 나타낸 전장 PRO1126 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 25의 신호 펩티드; 약 아미노산 66 내지 약 아미노산 70, 약 아미노산 138 내지 약 아미노산 142 및 약 아미노산 183 내지 약 아미노산 187의 N-글리코실화 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA60615-1483을 1998년 6월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209980 호를 배정받았다.
도 66(서열 181)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용하는 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1126 아미노산 서열과 데이호프 서열 173636, NOMR_HUMAN, MMUSMYOC3_1, HS454G6_1, P_R98225, RNU78105_1, RNU72487_1, AF035301_1, CEELC48E7_4 및 CEF11C3_3 사이에 상당한 상동성을 보여주었다.
실시예 37: 인간 PRO1130을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA34360이라 명명하였다. DNA34360 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO1130에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머(34360.f1):
5'-GCCATAGTCACGACATGGATG-3' (서열 184)
전방향 PCR 프라이머(34360.f2):
5'-GGATGGCCAGAGCTGCTG-3' (서열 185)
전방향 PCR 프라이머(34360.f3):
5'-AAAGTACAAGTGTGGCCTCATCAAGC-3' (서열 186)
역방향 PCR 프라이머(34360.r1):
5'-TCTGACTCCTAAGTCAGGCAGGAG-3' (서열 187)
역방향 PCR 프라이머(34360.r2):
5'-ATTCTCTCCACAGACAGCTGGTTC-3' (서열 188)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA34360으로부터 제조하였다:
혼성화 프로브(34360.p1):
5'-GTACAAGTGTGGCCTCATCAAGCCCTGCCCAGCCAACTACTTTGCG-3' (서열 189)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO1130 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 대동맥 내피 세포 조직으로부터 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA59814-1486[도 67, 서열 182]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO1130 단백질 서열을 수득하였다.
DNA59814-1486의 전체 코딩 서열은 도 67(서열 182)에 포함되어 있다. 클론 DNA59814-1486는 뉴클레오티드 위치 312 내지 314의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 984 내지 986의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 224개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 추정 분자량은 약 24,963 달톤이며, pI는 약 9.64가다. 도 68 (서열 183)에 나타낸 전장 PRO1130 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 68에 나타낸 전장 PRO1130 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 15의 신호 펩티드; 약 아미노산 184 내지 약 아미노산 192의 ATP/GTP-결합 부위 모티프 A(P-루프); 및 약 아미노산 107 내지 약 아미노산 111의 N-글리코실화 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA59814-1486을 1998년 10월 28일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 203359 호를 배정받았다.
도 68(서열 183)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용하는 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1130 아미노산서열과 데이호프 서열 P_W06547, 216_HUMAN, D87120_1, MMU72677_1, LAU04889_1 및 D69319 사이에 상당한 상동성을 보여주었다.
실시예 38: 인간 PRO1154를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 3에 기재된 비공개 신호 서열 조사 연산법을 사용하여 DNA59846-1503을 찾아내었다. 상기 기재된 신호 서열 연산법을 이용하여 LIFESEQ(등록상표) 데이타베이스로부터 Incyte EST 클러스터 제121249호라 명명된 EST 클러스터 서열을 찾아내었다. 그 후에, 존재하는 상동성을 확인하기 위해, 이 EST 클러스터 서열을, 공개 EST 데이타베이스(예를 들어, 진뱅크) 및 비공개 EST 데이타베이스(LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 포함하는 다양한 발현 서열 태그(EST) 데이타베이스와 비교하여 상동성을 조사하였다. 상동성 검색은 컴퓨트 프로그램인 BLAST 또는 BLAST2(Altshul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996))를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 이로부터 수득된 컨센서스 서열을 본원에서 DNA56250이라 지칭하였다.
본원에 제공된 발견을 고려하여, EST 2169375(미세혈관성 내피 세포 라이브러리로부터의 라이브러리 309-ENDCNOT03)를 포함하는 Incyte 클론을 구입하여 추가로 조사하고 서열 분석하였다. 이 cDNA 삽입체의 서열은 도 69(서열 190)에 나타내었고 본원에서 DNA59846-1503이라 지칭하였다.
DNA59846-1503의 전체 코딩 서열은 도 69(서열 190)에 포함되어 있다. 클론 DNA59846-1503는 뉴클레오티드 위치 86 내지 88의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 2909 내지 2911의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 69). 예상된 폴리펩티드 전구체는 941개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다(도 70, 서열 191). 도 70에 나타낸 전장 PRO1154 단백질의 추정 분자량은 약 107,144 달톤이며, pI는 약 6.26이다. 도 70 (서열 191)에 나타낸 전장 PRO1154 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 70에 나타낸 전장 PRO1154 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 34의 신호 펩티드; 약 아미노산 70 내지 약 아미노산 74, 약 아미노산 154 내지 약 아미노산 158, 약 아미노산 414 내지 약 아미노산 418, 약 아미노산 760 내지 약 아미노산 764 및 약 아미노산 901 내지 약 아미노산 905의 N-글리코실화 부위; 및 약 아미노산 350 내지 약 아미노산 360의 중성 아연 메탈로펩티타제, 아연-결합 영역 시그너쳐가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA59846-1503을 1998년 6월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209978 호를 배정받았다.
도 70(서열 191)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용하는 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1154 아미노산 서열과 데이호프 서열 ABOl1097_1, AMPN_HUMAN, RNU76997_1, 159331, GEN14047, HSU62768_1, P_R51281, CET07F10_1, SSU66371_1 및 AMPRE_HUMAN 사이에 상당한 상동성을 보여주었다.
실시예 39: 인간 PRO1244를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 3에 기재된 비공개 신호 서열 조사 연산법을 사용하여 DNA64883-1526을 찾아내었다. 상기 기재된 신호 서열 연산법을 이용하여 LIFESEQ(등록상표) 데이타베이스로부터 Incyte EST 클러스터 제7874호라 명명된 EST 클러스터 서열을 찾아내었다. 그 후에, 존재하는 상동성을 확인하기 위해, 이 EST 클러스터 서열을, 공개 EST 데이타베이스(예를 들어, 진뱅크) 및 비공개 EST 데이타베이스(LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 포함하는 다양한 발현 서열 태그(EST) 데이타베이스와 비교하여 상동성을 조사하였다. 상동성 검색은 컴퓨트 프로그램인 BLAST 또는 BLAST2(Altshul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996))를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 이 어셈블리에는 EST 서열 "DNA18313", "DNA22812" 및 EST 제3202349호 가 포함된다. 이로부터 수득된 컨센서스 서열을 본원에서 DNA56011이라 지칭하였다.
DNA56011 서열과 Incyte EST 제3202349호 사이의 서열 상동성을 고려하여, Incyte EST 클론 제3202349호를 구입하고, cDNA 삽입체를 수득하여 서열 분석하였다. 이 cDNA 삽입체의 서열은 도 71(서열 192)에 나타내었고 본원에서 DNA64883-1526이라 지칭하였다.
DNA64883-1526의 전체 코딩 서열은 도 71(서열 192)에 포함되어 있다. 클론DNA64883-1526는 뉴클레오티드 위치 9 내지 11의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1014 내지 1016의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 71). 예상된 폴리펩티드 전구체는 941개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다(도 72, 서열 193). 도 72에 나타낸 전장 PRO1244 단백질의 추정 분자량은 약 38,037 달톤이며, pI는 약 9.87이다. 도 72 (서열 193)에 나타낸 전장 PRO1244 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 72에 나타낸 전장 PRO1244 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 29의 신호 펩티드; 약 아미노산 183 내지 약 아미노산 205, 약 아미노산 217 내지 약 아미노산 237, 약 아미노산 217 내지 약 아미노산 287 및 약 아미노산 301 내지 약 아미노산 321의 막횡단 도메인; 약 아미노산 71 내지 약 아미노산 75 및 약 아미노산 215 내지 약 아미노산 219의 N-글리코실화 부위; 및 약 아미노산 150 내지 약 아미노산 153의 세포 부착 서열이 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA64883-1526을 1998년 9월 9일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 203253 호를 배정받았다.
도 72(서열 193)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용하는 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1244 아미노산 서열과 데이호프 서열 AF008554_1, P_485334, G02297, HUMN33S11_1, HUMN33S10_1, YO13_CAEEL, GEN13255, S49758, E70107 및 ERP5_MEDSA 사이에 상당한 상동성을 보여주었다.
실시예 40: 인간 PRO1246을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 3에 기재된 비공개 신호 서열 조사 연산법을 사용하여 DNA64885-1529를 찾아내었다. 상기 기재된 신호 서열 연산법을 이용하여 LIFESEQ(등록상표) 데이타베이스로부터 Incyte EST 클러스터 제56853호라 명명된 EST 클러스터 서열을 찾아내었다. 그 후에, 존재하는 상동성을 확인하기 위해, 이 EST 클러스터 서열을, 공개 EST 데이타베이스(예를 들어, 진뱅크) 및 비공개 EST 데이타베이스(LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 포함하는 다양한 발현 서열 태그(EST) 데이타베이스와 비교하여 상동성을 조사하였다. 상동성 검색은 컴퓨트 프로그램인 BLAST 또는 BLAST2(Altshul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996))를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 이로부터 수득된 컨센서스 서열을 본원에서 DNA56021이라 지칭하였다.
DNA56021 서열과 Incyte EST 제2481345호 사이의 서열 상동성을 고려하여, Incyte EST 클론 제2481345호를 구입하고, cDNA 삽입체를 수득하여 서열 분석하였다. 이 cDNA 삽입체의 서열은 도 73(서열 194)에 나타내었고 본원에서 DNA64885-1529라 지칭하였다.
DNA64885-1529의 전체 코딩 서열은 도 73(서열 194)에 포함되어 있다. 클론 DNA64885-1529는 뉴클레오티드 위치 119 내지 121의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1727 내지 1729의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 73). 예상된 폴리펩티드 전구체는 536개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다(도 74, 서열 195). 도 74에 나타낸 전장 PRO1246 단백질의 추정 분자량은 약 61,450 달톤이며, pI는 약 9.17이다. 도 74 (서열 195)에 나타낸 전장 PRO1246 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 74에 나타낸 전장 PRO1246 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 15의 신호 펩티드; 약 아미노산 108 내지 약 아미노산 112, 약 아미노산 166 내지 약 아미노산 170, 약 아미노산 193 내지 약 아미노산 197, 약 아미노산 262 내지 약 아미노산 266, 약 아미노산 375 내지 약 아미노산 379, 약 아미노산 413 내지 약 아미노산 417 및 약 아미노산 498 내지 약 아미노산 502의 N-글리코실화 부위; 및 약 아미노산 286 내지 약 아미노산 317, 약 아미노산 359 내지 약 아미노산 370 및 약 아미노산 78 내지 약 아미노산 98의 술파타제 단백질 상동성 블록이 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA64885-1529를 1998년 11월 3일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 203457 호를 배정받았다.
도 74(서열 195)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용하는 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1246 아미노산 서열과 데이호프 서열 P_R51355, CELK09C4-1, BCU44852_1, 1DS_HUMAN, G65169, E64903, ARSA_HUMAN, GL6S_HUMAN, HSARSF_l 및 GEN12648 사이에 상당한 상동성을 보여주었다.
실시예 41: 인간 PRO1274를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
Incyte(LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)의 비공개 데이타베이스 및 진뱅크의 공개 데이타베이스에 대해 BLAST 분석하기 위해 신규 분비 분자인 DNA57700을 사용하였다. 상동성 검색은 컴퓨트 프로그램인 BLAST 또는 BLAST2(Altshul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996))를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 이로부터 수득된 컨센서스 서열을 본원에서 DNA59573이라 지칭하였다.
DNA59573 컨센서스 서열, 및 어셈블리에서 확인된 서열과의 관계를 기초로 하여, 어셈블리의 서열 중 하나를 포함하는 클론 중 하나(Incyte EST 클론 제2623992호)를 구입하고, cDNA 삽입체를 수득하여 서열 분석하였다. Incyte 클론 2623992는 상피성 가슴 각질세포의 RNA로부터 제조된 라이브러리에서 유래한 것이다. 이 cDNA 삽입체의 서열은 도 75(서열 196)에 나타내었고 본원에서 DNA64889-1541이라 지칭하였다.
DNA64889-1541의 전체 코딩 서열은 도 75(서열 196)에 포함되어 있다. 클론 DNA64889-1541는 뉴클레오티드 위치 24 내지 26의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 354 내지 356의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 75). 예상된 폴리펩티드 전구체는 110개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다(도 76, 서열 197). 도 76에 나타낸 전장 PRO1274 단백질의 추정 분자량은 약 12,363 달톤이며, pI는 약 8.31이다. 도 76 (서열 197)에 나타낸 전장 PRO1274서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 76에 나타낸 전장 PRO1274 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 24의 신호 펩티드; 약 아미노산 71 내지 약 아미노산 75의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 76 내지 약 아미노산 96 및 약 아미노산 42 내지 약 아미노산 61의 인슐린 족 단백질 상동성 블록이 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA64889-1541을 1998년 9월 9일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 203250 호를 배정받았다.
도 76(서열 197)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용하는 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1274 아미노산 서열과 데이호프 서열 CEW05B2_9, AFO16922_1 (인슐린-유사 생장 인자 1), B48151, A53640, BTIGF2REC_1(인슐린-유사 생장 인자 2), HSNFIGEN12_1, TXA3RADMA(신경 독소 3), CXM1_CONGE, P_P61301, TXA4_RADMA(신경 독소 4) 사이에 서열 동일성을 보여주었다.
실시예 42: 인간 PRO1274를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 3에 기재된 비공개 신호 서열 조사 연산법을 사용하여 DNA64903-1553을 찾아내었다. 상기 기재된 신호 서열 연산법을 이용하여 LIFESEQ(등록상표) 데이타베이스로부터 Incyte EST 클러스터 제86809호라 명명된 EST 클러스터 서열을 찾아내었다. 그 후에, 존재하는 상동성을 확인하기 위해, 이 EST 클러스터 서열을, 공개 EST 데이타베이스(예를 들어, 진뱅크) 및 비공개 EST 데이타베이스(LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 포함하는다양한 발현 서열 태그(EST) 데이타베이스와 비교하여 상동성을 조사하였다. 상동성 검색은 컴퓨트 프로그램인 BLAST 또는 BLAST2(Altshul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996))를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 어셈블리시의 EST는 종양, 세포주 또는 질병 조직으로부터의 EST를 포함하였다. 질병에 걸린 결장 조직의 RNA로부터 제조된 cDNA 라이브러리에서 1개 이상의 EST를 수득하였다. 이로부터 수득된 컨센서스 서열을 본원에서 DNA58822라 지칭하였다.
DNA58822 서열과 Incyte EST 제1695434호 사이의 서열 상동성을 고려하여, Incyte EST 클론 제1695434호를 구입하고, cDNA 삽입체를 수득하여 서열 분석하였다. 이 cDNA 삽입체의 서열은 도 77(서열 198)에 나타내었고 본원에서 DNA64903-1553이라 지칭하였다.
DNA64903-1553의 전체 코딩 서열은 도 77(서열 198)에 포함되어 있다. 클론 DNA64903-1553는 뉴클레오티드 위치 93 내지 95의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 372 내지 374의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 77). 예상된 폴리펩티드 전구체는 93개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다(도 78, 서열 199). 도 78에 나타낸 전장 PRO1274 단백질의 추정 분자량은 약 10,111 달톤이며, pI는 약 9.70이다. 도 78 (서열 199)에 나타낸 전장 PRO1274 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의존재를 입증한다. 도 78에 나타낸 전장 PRO1274 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 18의 신호 펩티드; 및 약 아미노산 15 내지 약 아미노산 21, 약 아미노산 17 내지 약 아미노산 23, 약 아미노산 19 내지 약 아미노산 25, 약 아미노산 83 내지 약 아미노산 89 및 약 아미노산 86 내지 약 아미노산 92의 N-미리스토일화 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA64903-1553을 1998년 9월 15일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 203457 호를 배정받았다.
도 78(서열 199)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용하는 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1274 아미노산 서열과 데이호프 서열 SR5C_ARATH, CELC17H12_11, MCPD_ENTAE, JQ2283, INVO_LEMCA, P_R07309, ADEVBCAGN_4, AF020947_1, CELT23H2_1 및 MDH_STRAR 사이에 약간의 상동성을 보여주었다.
실시예 43: 인간 PRO1294를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 3에 기재된 비공개 신호 서열 조사 연산법을 사용하여 DNA64905-1558을 찾아내었다. 상기 기재된 신호 서열 연산법을 이용하여 LIFESEQ(등록상표) 데이타베이스로부터 Incyte EST 클러스터 제10559호라 명명된 EST 클러스터 서열을 찾아내었다. 그 후에, 존재하는 상동성을 확인하기 위해, 이 EST 클러스터 서열을, 공개 EST 데이타베이스(예를 들어, 진뱅크) 및 비공개 EST 데이타베이스(LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 포함하는 다양한 발현 서열 태그(EST) 데이타베이스와 비교하여 상동성을 조사하였다. 상동성 검색은 컴퓨트 프로그램인 BLAST 또는 BLAST2(Altshul et al., Methods inEnzymology, 266:460-480 (1996))를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 이로부터 수득된 컨센서스 서열을 본원에서 DNA57203이라 지칭하였다.
DNA57203 서열과 Incyte EST 제3037763호 사이의 서열 상동성을 고려하여, Incyte EST 클론 제3037763호를 구입하고, cDNA 삽입체를 수득하여 서열 분석하였다. 이 cDNA 삽입체의 서열은 도 79(서열 200)에 나타내었고 본원에서 DNA64905-1558이라 지칭하였다.
DNA64905-1558의 전체 코딩 서열은 도 79(서열 200)에 포함되어 있다. 클론 DNA64905-1558는 뉴클레오티드 위치 110 내지 112의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1328 내지 1330의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 79). 예상된 폴리펩티드 전구체는 406개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다(도 80, 서열 201). 도 80에 나타낸 전장 PRO1294 단백질의 추정 분자량은 약 46,038 달톤이며, pI는 약 6.50이다. 도 80 (서열 201)에 나타낸 전장 PRO1294 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 80에 나타낸 전장 PRO1294 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 21의 신호 펩티드; 약 아미노산 77 내지 약 아미노산 181 및 약 아미노산 248 내지 약 아미노산 252의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 196 내지 약 아미노산 200의 a cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 89 내지 약 아미노산 97의 티로신 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 115 내지 약 아미노산 121, 약 아미노산 152 내지 약 아미노산 158 및 약 아미노산 370 내지 약 아미노산 376의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 122 내지 약 아미노산 126의 아미드화 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA64905-1558을 1998년 9월 15일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 203233 호를 배정받았다.
도 80(서열 201)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용하는 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1294 아미노산 서열과 데이호프 서열 173636, AF028740_1, AB006686S3_1, P_R9822, RNU78105_l, CELC48E7_4, CEF11C3_3, SCP1_MESAU, TPM3_HUMAN 및 CELK05B2_3 사이에 상당한 상동성을 보여주었다.
실시예 44: 인간 PRO1303을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA47347이라 명명하였다. DNA47347 컨센서스 서열, 및 상기 DNA47347이 유도된 어셈블리 내의 Incyte EST에 대한 상동체를 기초로 하여, Incyte 클론 1430305를 구입하여 그 전체를 서열 분석하였다. 이로써 PRO1303을 코딩하는 서열을 확인하였다.
DNA65409-1566의 전체 코딩 서열은 도 81(서열 202)에 포함되어 있다. 클론 DNA65409-1566는 뉴클레오티드 위치 121 내지 123의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 865 내지 867의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 248개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 추정 분자량은 약 26,734 달톤이며, pI는 약 7.90이다. 도 82 (서열 203)에 나타낸 전장 PRO1303 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 82에 나타낸 전장 PRO1303 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 17의 신호 펩티드; 약 아미노산 24 내지 약 아미노산 28 및 약 아미노산 163 내지 약 아미노산 167의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 58 내지 약 아미노산 64의 세린 프로테아제, 트립신 족, 히스티딘 활성 부위; 약 아미노산 47 내지 약 아미노산 64, 약 아미노산 196 내지 약 아미노산 207 및 약 아미노산 218 내지 약 아미노산 242의 세린 프로테아제, 트립신 족, 히스티딘 활성 도메인; 약 아미노산 194 내지 약 아미노산 207 및 약 아미노산 47 내지 약 아미노산 65의 크링글(kringle) 도메인 단백질 상동성 블록; 및 약 아미노산 220 내지 약 아미노산 248의 애플 도메인이 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA65409-1566을 1998년 9월 15일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 203232 호를 배정받았다.
도 82(서열 203)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용하는 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1303 아미노산 서열과 데이호프 서열 AB009849_1, P_W08475, AF024605_1, A42048_1, TRY3_RAT, MMAE00066414, TRY1_RAT, MMAE000663_4, MMAE000665_2 및 MMAE00066412 사이에 서열 동일성을 보여주었다.
실시예 45: 인간 PRO1304를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA35745라 명명하였다. DNA35745 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO1304에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머(35745.f1):
5'-GTGTTCTGCTGGAGCCGATGCC-3' (서열 206)
전방향 PCR 프라이머(35745.f2):
5'-GACATGGACAATGACAGG-3' (서열 207)
전방향 PCR 프라이머(35745.f3):
5'-CCTTTCAGGATGTAGGAG-3' (서열 208)
전방향 PCR 프라이머(35745.f4):
5'-GATGTCTGCCACCCCAAG-3' (서열 209)
역방향 PCR 프라이머(35745.r1):
5'-GCATCCTGATATGACTTGTCACGTGGC-3' (서열 210)
역방향 PCR 프라이머(35745.r2):
5'-TACAAGAGGGAAGAGGAGTTGCAC-3' (서열 211)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA35745로부터 제조하였다:
혼성화 프로브(35745.p1):
5'-GCCCATTATGACGGCTACCTGGCTAAAGACGGCTCGAAATTCTACTGCAGCC-3' (서열 212)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO1304 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 난소 조직으로부터 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA65406-1567[도 83, 서열 204]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO1304 단백질 서열을 수득하였다.
DNA65406-1567의 전체 코딩 서열은 도 83(서열 204)에 포함되어 있다. 클론 DNA65406-1567는 뉴클레오티드 위치 23 내지 25의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 689 내지 691의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 222개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 추정 분자량은 약 25,794 달톤이며, pI는 약 6.24가다. 도 84 (서열 205)에 나타낸 전장 PRO1304 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 84에 나타낸 전장 PRO1304 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 219 내지 약 아미노산 224의 소포체 표적 서열; 약 아미노산 45 내지 약 아미노산 49의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 87 내지 약 아미노산 124 및 약 아미노산 129 내지 약 아미노산 143의 FKBP-형 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제 상동성 블록; 및 약 아미노산 202 내지 약 아미노산 215의 EF-핸드 칼슘-결합 도메인 단백질 상동성 블록이 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA65406-1567을 1998년 9월 15일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 203219 호를 배정받았다.
도 84(서열 205)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용하는 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1304 아미노산 서열과 데이호프 서열 AF040252_1, PR28980, S71238, CELC05C8_1, VFU52045_1, S75144, FKB3_BOVIN, CELC50F2_6, CELB0511_12 및 P_R41781 사이에 상당한 상동성을 보여주었다.
또한, Incyte EST 클론 제2813577호의 삽입체를 단리하여 서열 분석함으로써 DNA65406-1567 서열을 수득하였다.
실시예 46: 인간 PRO1312를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
효모 스크리닝을 이용하여 인간 태아 신장 cDNA 라이브러리로부터, 바람직하게는 1차 cDNA 클론의 5' 말단을 대표하는 DNA55773을 찾아내었다. DNA55773 서열을 기초로, PRO1312에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
전장 클론[DNA61873-1574]이 뉴클레오티드 위치 7 내지 9의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 643 내지 645의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함함을 확인하였다(도 85, 서열 213). 예상된 폴리펩티드 전구체는 212개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 계산된 분자량은 약 24,024 달톤이며, pI는 약 6.26이다. 도 86 (서열 214)에 나타낸 전장 PRO1312 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 86에 나타낸 전장 PRO1312 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 14의 신호 펩티드; 약 아미노산 141 내지 약 아미노산 160의 막횡단 도메인; 및 약 아미노산 76 내지 약 아미노산 80 및 약 아미노산 93 내지 약 아미노산 97의 N-글리코실화 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA61873-1574를 1998년 8월 18일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 203132 호를 배정받았다.
도 86(서열 214)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용하는 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1312 아미노산 서열과 데이호프 서열 GCINTALPH_1, GIBMUCIA_1, P_R96298, AF001406_1, PVU88874_1, P_R85151, AF041409_1, CELC50F2_7, C45875 및 AB009510_21 사이에 약간의 상동성을 보여주었다.
실시예 47: 인간 PRO1313을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA64876이라 명명하였다. DNA64876 컨센서스 서열, 및 DNA57711이라 명명된 제넨테크의 비공개 EST 서열과의 서열 상동성 검색을 기초로, 머크/워싱톤대(Merck/Washington University) EST 서열(R80613이라 지칭됨)이 DNA64876 및 DNA57711과 상당한 상동성이 있음을 알아내었다. 따라서, 머크/워싱톤대 EST 클론 제R80613호를 구입하여 그 삽입체를 서열 분석함으로써 도 87(서열 215)에 나타낸 DNA64966-1575 서열 및 그로부터 유도된 PRO1313에 대한 단백질 서열을 수득하였다.
DNA64966-1575의 전체 코딩 서열은 도 87(서열 215)에 포함되어 있다. 클론DNA64966-1575는 뉴클레오티드 위치 115 내지 117의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1036 내지 1038의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 87, 서열 215). 예상된 폴리펩티드 전구체는 307개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 추정 분자량은 약 35,098 달톤이며, pI는 약 8.11이다. 도 88 (서열 216)에 나타낸 전장 PRO1313 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 88에 나타낸 전장 PRO1313 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 106 내지 약 아미노산 121, 약 아미노산 136 내지 약 아미노산 152, 약 아미노산 172 내지 약 아미노산 188, 약 아미노산 230 내지 약 아미노산 245 및 약 아미노산 272 내지 약 아미노산 285의 막횡단 도메인; 약 아미노산 34 내지 약 아미노산 38, 약 아미노산 135 내지 약 아미노산 139 및 약 아미노산 203 내지 약 아미노산 207의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 59 내지 약 아미노산 67의 티로신 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 165 내지 약 아미노산 171, 약 아미노산 196 내지 약 아미노산 202, 약 아미노산 240 내지 약 아미노산 246 및 약 아미노산 247 내지 약 아미노산 253의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 53 내지 약 아미노산 61의 ATP/GTP-결합 부위 모티프 A (P-루프)가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA64966-1575를 1999년 1월 12일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 203575 호를 배정받았다.
도 88(서열 216)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용하는 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1313 아미노산 서열과 데이호프 서열 CELT27A1_3, CEF09C6_7, U93688_9, H64896, YDCX_ECOLI 및 RNU06101_1 사이에 상당한 상동성을 보여주었다.
실시예 48: 인간 PRO1376을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
머크/워싱톤대 데이타베이스를 검색하여 고유번호 W39620(소아레스(Soares)의 부갑상선 종양 단백질로 확인됨)으로서의 서열을 찾아내었다. 이 서열을 다른 서열과 비교될 수 있는 데이타베이스에 넣어 다른 서열들과 정렬하였다.
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA67221이라 명명하였다.
Merck W39620을 코딩하는 클론을 구입하여 그 전체를 서열 분석하였다. 상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석을 통해 DNA67300-1605[도 89, 서열 217]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO1376 단백질 서열을 수득하였다.
DNA67300-1605의 전체 코딩 서열은 도 89(서열 217)에 포함되어 있다. 클론DNA67300-1605는 뉴클레오티드 위치 107 내지 109의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 623 내지 625의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 172개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 추정 분자량은 약 19,206 달톤이며, pI는 약 5.36이다. 도 90 (서열 218)에 나타낸 전장 PRO1376 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 90에 나타낸 전장 PRO1376 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 23의 신호 펩티드; 및 약 아미노산 58 내지 약 아미노산 75의 티오레독신 족 단백질 동족체 블록이 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA67300-1605를 1998년 8월 25일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 203163 호를 배정받았다.
도 90(서열 218)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용하는 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1376 아미노산 서열과 데이호프 서열 XAG_XENLA, AF025474_1, NP77_XENLA, D69100, S75124, ER60_SCHMA, H69466, A57254, AB002234_1 및 TATHIORDH_1 사이에 서열 동일성을 보여주었다.
실시예 49: 인간 PRO1387을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 3에 기재된 비공개 신호 서열 조사 연산법을 사용하여 DNA68872-1620을 찾아내었다. 상기 기재된 신호 서열 연산법을 이용하여 LIFESEQ(등록상표) 데이타베이스로부터 Incyte EST 클러스터 제10298호라 명명된 EST 클러스터 서열을 찾아내었다. 그 후에, 존재하는 상동성을 확인하기 위해, 이 EST 클러스터 서열을, 공개 EST 데이타베이스(예를 들어, 진뱅크) 및 비공개 EST 데이타베이스(LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 포함하는 다양한 발현 서열 태그(EST) 데이타베이스와 비교하여 상동성을 조사하였다. 상동성 검색은 컴퓨트 프로그램인 BLAST 또는 BLAST2(Altshul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996))를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 이로부터 수득된 컨센서스 서열을 본원에서 DNA39516이라 지칭하였다.
DNA56259 서열과 Incyte EST 클론 제3507924호 사이의 서열 상동성을 고려하여, Incyte EST 클론 제3507924호를 구입하고, cDNA 삽입체를 수득하여 서열 분석하였다. 이 cDNA 삽입체의 서열은 도 91(서열 219)에 나타내었고 본원에서 DNA68872-1620이라 지칭하였다.
DNA68872-1620의 전체 코딩 서열은 도 91(서열 219)에 포함되어 있다. 클론 DNA68872-1620는 뉴클레오티드 위치 85 내지 87의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1267 내지 1269의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 91). 예상된 폴리펩티드 전구체는 394개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다(도 92, 서열 220). 도 92에 나타낸 전장 PRO1387 단백질의 추정 분자량은 약 44,339 달톤이며, pI는 약 7.10이다. 도 92 (서열 220)에 나타낸 전장 PRO1387 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 92에 나타낸 전장 PRO1387 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 19의 신호 펩티드; 약 아미노산 275 내지 약 아미노산 296의 막횡단 도메인; 약 아미노산 76 내지 약 아미노산 80, 약 아미노산 231 내지 약 아미노산 235, 약 아미노산 302 내지 약 아미노산 306, 약 아미노산 307 내지 약 아미노산 311 및 약 아미노산 376 내지 약 아미노산 380의 N-글리코실화부위; 및 약 아미노산 210 내지 약 아미노산 240 및 약 아미노산 92 내지 약 아미노산 122의 미엘린 P0 단백질 상동성 블록이 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA68872-1620을 1998년 8월 25일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 203160 호를 배정받았다.
도 92(서열 220)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용하는 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1387 아미노산 서열과 데이호프 서열 P_W36955, MYP0_HETFR, HS46KDA_1, AF049498_1, MY00_HUMAN, AF030454_1, A53268, SHPTCRA_1, P_W14146 및 GENl2838 사이에 상당한 상동성을 보여주었다.
실시예 50: 인간 PRO1516을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA40630이라 명명하였다. DNA40630 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO1516에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머(40630.f1):
5'-CTGCCTCCACTGCTCTGTGCTGGG-3' (서열 223)
역방향 PCR 프라이머(40630.r1):
5'-CAGAGCAGTGGATGTTCCCCTGGG-3' (서열 224)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA40630으로부터 제조하였다:
혼성화 프로브(40630.p1):
5'-CTGAACAAGATGGTCAAGCAAGTGACTGGGAAAATGCCCATCCTC-3' (서열 225)
전장 클론의 공급원에 대해 몇개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍으로의 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO1516 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 양성 라이브러리를 이용하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 유방 종양 조직으로부터 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA의 서열 분석을 통해 DNA76538-1670[도 93, 서열 221]에 대한 전장의 DNA 서열 및 그로부터 유도된 PRO1516 단백질 서열을 수득하였다.
DNA76538-1670의 전체 코딩 서열은 도 93(서열 221)에 포함되어 있다. 클론 DNA76538-1670는 뉴클레오티드 위치 29 내지 31의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 377 내지 379의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 116개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 추정 분자량은 약 12,910 달톤이며, pI는 약 6.41이다. 도 94 (서열 222)에 나타낸 전장 PRO1516 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 도 94에 나타낸 전장 PRO1516 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 17의 신호 펩티드; 약 아미노산 86 내지약 아미노산 90의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 20 내지 약 아미노산 26 및 약 아미노산 45 내지 약 아미노산 51의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 63 내지 약 아미노산 71의 포스포리파제 A2 히스티딘 활성 부위가 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA76538-1670을 1998년 10월 6일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 203313 호를 배정받았다.
도 94(서열 222)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용하는 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1516 아미노산 서열과 데이호프 서열 : P_R63053, P_R25416, P_R63055, P_P93363, P_R63046, PA2A_VIPAA, P_W58476, GEN 13747, PA2X_HUMAN 및 PA2A_CRODU 사이에 상당한 상동성을 보여주었다.
상기 이외에, 서열 상동성 검색은 DNA40630 컨센서스 서열과 Incyte EST 클론 제1921092호 사이에 상당한 상동성을 보여주었다. 따라서, Incyte EST 클론 제1921092호를 구입하고 삽입체를 수득하여 서열 분석함으로써, 도 93(서열 221)에 나타낸 DNA76538-1670 서열을 수득하였다.
실시예 51: 인간 PRO216을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
스위스-프롯(Swiss-Prot) 공개 데이타베이스로부터 약 950개의 공지된 분비형 단백질로부터의 세포외 도메인(ECD) 서열(존재하는 경우 분비 신호 서열 포함)을 사용하여 EST 데이타베이스를 검색하였다. EST 데이타베이스에는 공개 EST 데이타베이스(예를 들면, 진뱅크)와 비공개 데이타베이스 (예를 들면, LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 포함한다. 검색은 EST 서열의6개 프레임 번역에 대한 ECD 단백질 서열의 비교로서 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2[Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)]를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다.
DNA33087의 완전한 cDNA 서열은 고유번호 AB000114_1 및 AB009589_1(인간 오스테오모둘린(osteomodulin))로서 진뱅크에 개시되어 있다. 관련은 되어 있지만 아마도 상이한 단백질인 각막 케라틴 술페이트는 문헌(Funderburgh et al.. J. Biol. Chem., 271: 31431-31436 (1996))에 개시되어 있다.
상기 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA28754라 명명하였다. 어떤 경우에는 컨센서스 서열이, 상기 논의된 EST 서열의 공급원을 사용하여 가능한 길게 컨센서스 서열을 확장시키기 위해 BLAST 및 phrap의 반복 주기를 이용하여 확장된중간체 컨센서스 서열로부터 유도된다.
DNA28754 컨센서스 서열을 기초로 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO216에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 통상 뉴클레오티드 20 내지 30개 범위이며, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 산출하도록 설계한다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp길이이다. 전장 클론의 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 그 후에, 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 목적 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 양성 라이브러리를 이용하였다.
PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머:
5'-TCACGATGATCCTGACAATGC-3' (서열 228)
역방향 PCR 프라이머:
5'-AATAATGAAGGTCAAAGTGCCCTT-3' (서열 229)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA28754로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-TGCTCCTTCTTGTTCTGGGCTCTCATG-3' (서열 230)
cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아 신장 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는, 인비트로젠(Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 상업적으로 시판하는 시약을 이용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터에 평활 말단으로 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 대략의 크기를 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들면,pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석을 통해 전장 PRO216 폴리펩티드에 대한 전장 DNA 서열(본원에서 DNA33087이라 지칭됨[도 95, 서열 226]) 및 그로부터 유도된 PRO216 폴리펩티드에 대한 단백질 서열을 수득하였다.
상기 확인된 전장 클론은 뉴클레오티드 위치 268 내지 270의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1531 내지 1533의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 95, 서열 226). 예상된 폴리펩티드 전구체는 421개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖고, 계산된 분자량은 약 49,492 달톤이며, 추정된 pI는 약 5.51이다. 도 96 (서열 227)에 나타낸 전장 PRO216 서열의 분석은 그 위치가 대략 상기 기재된 바와 같은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 전장 PRO216 서열(도 96, 서열 227)의 분석은 약 아미노산 113 내지 약 아미노산 117, 약 아미노산 121 내지 약 아미노산 125, 약 아미노산 187 내지 약 아미노산 191, 약 아미노산 242 내지 약 아미노산 246 및 약 아미노산 316 내지 약 아미노산 320의 N-결합 글리코실화 부위; 약 아미노산 268 내지 약 아미노산 275 및 약 아미노산 300 내지 약 아미노산 307의 티로신 키나아제 인산화 부위; 약 아미노산 230 내지 약 아미노산 236의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 146 내지 약 아미노산 168 및 약 아미노산 217 내지 약 아미노산 239의 루이신 지퍼 패턴이 존재하는 것을 입증한다. 클론 DNA33087을 1997년 10월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 제 209381 호를 배정받았다.
이 클론은 아이. 오노(I. Ohno)가 1996년 12월 26일 진뱅크에 제출한 인간 오스테오모둘린(AB000114_1) 및 아이. 오노 등이 1997년 12월 5일 진뱅크에 제출한 인간 오스테오모둘린(AB009589_1)과 동일하다.
실시예 52: 신생 심장 비대증의 자극
이 분석법은 PRO 폴리펩티드가 신생 심장의 비대증을 자극하는 능력을 측정하기 위해 고안된 것이다. 1일된 할란 스프라그 돌리 쥐(Harlan Sprague Dawley rat)로부터 심근세포를 수득하였다. 1일째에 DMEM/F12+4% FCS로 미리 코팅된 96-웰 플레이트에 세포(7.5×104/ml에서 180㎕, 혈청<0.1%, 새로이 단리함)를 가하였다. 2일째, 웰에 시험용 PRO 폴리펩티드를 함유하는 시험 샘플 20㎕를 직접 가하였다. 추가로 2일이 지난 후에 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 다음날 가시적으로 스코어를 부여하였다. 배양 조건은 중요하며 5% CO2를 필요로 한다.
활성 기준: 페닐에프린 1 내지 100μM, PGF-2 알파 0.1 내지 1.0μM, 엔도텔린-1 1 내지 10nM, CT1(LIF) 1 내지 10nM. 이 분석 반응에 Ca 농도가 중요하기 때문에 PBS는 포함되어 있지 않다. 분석 매질에는 DMEM/F12(2.44g의 중탄산염 포함), 10㎍/ml 트렌스페린, 1㎍/ml 인슐린, 1㎍/ml 아프로티닌, 2mmol/L 글루타민, 100U/ml 페니실린 G, 100㎍/ml 스트렙토마이신이 포함되어 있다. 만니톨(4%)을 함유하는 단백질 완충액은 1/10(0.4%) 및 1/100(0.04%)에서 양성 신호(스코어 3.5)를 나타냈지만, 1/1000(0.004%)에서는 양성 신호를 나타내지 않았다. 따라서,만니톨을 함유하는 시험 샘플 완충액은 시험하지 않았다. 2차 분석은 조건화된 배지에서 ELISA에 의해 세포로부터 ANP 농도(ng/ml)를 측정하는 것으로 이루어진다. ANP 메시지가 증가되면, 몇 시간 후에 세포로부터 PCR에 의해 이를 측정할 수 있다.
가시적으로 세포 크기를 관찰함으로써 결과를 평가하였다: 스코어가 3.5 이상인 것을 조건화된 배지에 대한 양성 반응으로 생각하고, 스코어가 3.0 이하인 것을 정제된 댄백질에 대한 양성 반응으로 생각하였다.
정제된 PRO231, PRO526, PRO713, PRO792, PRO1246 및 PRO1312 폴리펩티드가 신생 심장 비대증을 자극하는지 관찰하고, 이 분석에서의 양성 스코어를 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 양성 대조구와 비교하였다.
<표 4>
신생 심장 비대증의 자극
PRO 샘플 농도 (또는 희석) 스코어
PRO231 12.0μM 3.375
PRO526 1% 3.50
PRO713 10.0nM 3.25
PRO713 10.0nM 3.25
PRO792 1% 4.50
PRO1246 1% 3.25
PRO1312 85.0nM 3.375
실시예 53: F2a에 의해 유도된 신생 비대증의 증대
이 분석법은 PRO 폴리펩티드가 신생 심장의 비대증을 자극하는 능력을 측정하기 위해 고안된 것이다. 1일된 할란 스프라그 돌리 쥐로부터 심근세포를 수득하였다. 1일째에 DMEM/F12+4% FCS로 미리 코팅된 96-웰 플레이트에 세포(7.5×104/ml에서 180㎕, 혈청<0.1%, 새로이 단리함)를 가하였다. 2일째에 시험용 PRO 폴리펩티드를 함유하는 시험 샘플(20㎕/웰)을 직접 가하였다. 2일째에 최종농도 10-6M로 PGF(20㎕/웰)를 가하였다. 4일째에 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 5일째에 가시적으로 스코어를 부여하였다. 가시적 스코어는 세포의 크기를 기준으로 한다. 즉, 세포의 크기가 음성 대조구에 비해 증가되지 않으면 0.0의 스코어가 되고, 음성 대조구에 비해 소량 내지 적당히 증가되면 1.0의 스코어가 되며, 세포의 크기가 음성 대조구에 비해 매우 커지면 2.0의 스코어가 된다. 1.0 이상의 스코어를 양성으로 간주한다.
이 분석 반응에 Ca 농도가 중요하기 때문에 PBS는 포함되어 있지 않다. 플레이트는 DMEM/F12 + 4% FCS(200㎕/웰)로 코팅되어 있다. 분석용 배지에는 DMEM/F12(2.44g의 중탄산염 포함), 10㎍/ml 트렌스페린, 1㎍/ml 인슐린, 1㎍/ml 아프로티닌, 2mmol/L 글루타민, 100U/ml 페니실린 G, 100㎍/ml 스트렙토마이신이 포함되어 있다. 만니톨(4%)을 함유하는 단백질 완충액은 1/10(0.4%) 및 1/100(0.04%)에서 양성 신호(스코어 3.5)를 나타냈지만, 1/1000(0.004%)에서는 양성 신호를 나타내지 않았다. 따라서, 만니톨을 함유하는 시험 샘플 완충액은 시험하지 않았다.
정제된 PRO179, PRO182, PRO195 및 PRO224 폴리펩티드는 상기 방법으로 분석했을 때, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 양성 결과를 나타내었다.
<표 5>
F2a에 의해 유도된 신생 비대증의 증대
PRO 농도 스코어
PRO179 0.01% 0.0
PRO179 0.10% 0.0
PRO179 1% 1.0
PRO182 0.01% 0.0
PRO182 0.10% 0.0
PRO182 1% 1.0
PRO195 0.01% 0.0
PRO195 0.1% 1.0
PRO195 1% 1.0
PRO224 0.01% 0.0
PRO224 0.10% 0.0
PRO224 1% 1.0
실시예 54: 성체 심장 비대증의 억제
이 분석법은 성체 심장 비대증을 억제하는 능력을 측정하기 위해 고안된 것이다. 심실의 근세포(250g)는 성체 할란 스프라그 돌리 쥐로부터 새로이 단리되어 2000/웰로 180㎕에 플레이팅되었다. 2일째, PRO 폴리펩티드를 함유하는 시험 샘플(20㎕)을 가하였다. 5일째, 세포를 고정시킨 후 염색하였다. 몇 시간 후에 세포로부터 PCR에 의해 ANP 메시지의 증가를 측정하였다. 결과를 세포 크기의 가시적 스코어로 나타내었다. 즉, 0은 억제되지 않은 것이고, -1은 조금 억제된 것이며, -2는 많이 억제된 것이다. 0 미만의 스코어를 양성으로 간주한다. 활성 기준은 양성 대조구로서 0.1mM에서의 페닐에프린(PE)에 상응하는 것이다. 2라는 스코어는 매우 반응성이 강한 것으로 간주된다. 분석용 배지에는 100nM의 인슐린, 0.2% BSA, 5mM 크레아틴, 2mM L-카르니틴, 5mM 타우린, 100U/ml 페니실린 G 및 100㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된, 글루타민이 없는 M199(변형), NaHCO3, 페놀 레드가 포함되어 있다. 96-웰 플레이트에서 내부의 60개 웰만을 사용하였다. 이들 중에서 6개의 웰은 음성 및 양성(PE) 대조구를 위해 사용되었다. 최초에, 평행한 방향으로 정량 PCR을 수행하여 가시적 스코어 부여 시스템의 상대적인 민감도를 측정하였다. PRO269 및 PRO356은 상기 기재된 성체 심장 비대증의 억제 시험에서 양성 결과를 나타내었다.
실시예 55: 내피 세포 증식의 자극
이 분석법은 PRO 폴리펩티드의 부신 피질 모세혈관 내피세포(ACE)의 생장 자극 능력을 측정하기 위해 고안된 것이다.
소과의 부신 피질 모세혈관 내피 세포(ACE; 1차 배양으로부터 최대 12-14회 패시지)를 100㎕에 500 세포/웰로 플레이팅하였다. 분석용 배지에는 포도당 농도가 낮은 DMEM, 10% 우태혈청, 2mM 글루타민 및 1X 페니실린/스트렙토마이신/펀지존이 포함되어 있다. 대조구 웰에는 (1)ACE 세포가 없는 것, (2) ACE 세포만 있는 것, (3) ACE 세포 + VEGF(5ng/ml) 및 (4) ACE 세포 + FGF(5ng/ml)가 포함된다. 이후에, 대조구 또는 시험 샘플(100㎕ 부피)를 웰에 가하였다(각각 1%, 0.1% 및 0.01%로 희석). 세포 배양액을 37℃ 및 5% CO2에서 6 내지 7일 동안 배양하였다. 배양 후, 웰에서 배지를 제거하고, 세포를 1X PBS로 세척하였다. 이어서, 산 포스파타제 반응 혼합물(100㎕: 0.1M 아세트산나트륨, pH 5.5, 0.1% 트리톤 X-100, 10mM p-니트로페닐 포스페이트)을 각 웰에 가하였다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 1N NaOH 10㎕를 가하여 반응을 멈추게 하였다. 405nm의 마이크로플레이트 판독기에서 광학 밀도(OD)를 측정하였다.
PRO 폴리펩티드의 활성은 (1)단지 세포만 있는 배경값, 및 (2) VEGF에 의한 최대 자극에 비해 증식이 몇 배 증가되었는지에 따라 계산하였다(산 포스파타제 활성에 의해 측정된 405nm에서의 OD). 최대 자극에 대한 활성 기준으로서 VEGF(3-10ng/ml) 및 FGF(1-5ng/ml)를 사용하였다. 관찰된 자극이 배경값에 비해 50% 이상인 경우에 분석의 결과를 "양성"으로 간주하였다. 1% 희석된 VEGF(5ng/ml) 대조구는 1.24배 자극하였으며, 1% 희석된 FGB(5ng/ml) 대조구는 1.46배 자극하였다.
하기 표 6에 나타난 바와 같이, PRO179, PRO212, PRO1075, PRO1154, PRO1244, PRO1286 및 PRO1303은 "양성"으로 분석되었다.
<표 6>
내피 세포 증식의 자극
PRO 농도 자극 증가 배수
PRO179PRO179PRO179 0.01%0.10%1.0% 1.161.571.38
PRO212PRO212PRO212 0.01%0.10%1.0% 4.084.734.75
PRO1075PRO1075PRO1075 0.01%0.10%1.0% 4.214.523.39
PRO1154PRO1154PRO1154 0.0017nM0.017nM0.17nM 4.635.155.53
PRO1244PRO1244PRO1244 0.67nM6.7nM67.0nM 4.604.785.24
PRO1286PRO1286 0.5nM5.0nM 4.614.55
PRO1303PRO1303PRO1303 0.38nM3.80nM38.0nM 4.294.283.74
실시예 56: 혈관 내피 생장 인자(VEGF) 자극된 내피 세포 생장 증식의 억제
VEGF 자극된 내피 세포의 증식을 억제하는 다양한 PRO 폴리펩티드의 능력을 시험하였다. 구체적으로, 소과의 부신 피질 모세혈관 내피 세포(ACE; 1차 배양으로부터 최대 12-14회 패시지)를 100㎕에 500 세포/웰로 플레이팅하였다. 분석용 배지에는 포도당 농도가 낮은 DMEM, 10% 우태혈청, 2mM 글루타민 및 1X 페니실린/스트렙토마이신/펀지존이 포함되어 있다. 대조구 웰에는 (1)ACE 세포가 없는 것, (2) ACE 세포만 있는 것, (3) ACE 세포 + 5ng/ml FGF, (4) ACE 세포 + 3ng/ml VEGF, (5) ACE 세포 + 3ng/ml VEGF + 1ng/ml TGF-베타, 및 (6) ACE 세포 + 3ng/ml VEGF가 포함된다. 폴리-His 표지된 PRO 폴리펩티드 시험 샘플(100㎕ 부피)를 웰에 가하였다(각각 1%, 0.1% 및 0.01%로 희석). 세포 배양액을 37℃ 및 5% CO2에서 6 내지 7일 동안 배양하였다. 배양 후, 웰에서 배지를 제거하고, 세포를 1X PBS로 세척하였다. 이어서, 산 포스파타제 반응 혼합물(100㎕: 0.1M 아세트산나트륨, pH 5.5, 0.1% 트리톤 X-100, 10mM p-니트로페닐 포스페이트)을 각 웰에 가하였다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 1N NaOH 10㎕를 가하여 반응을 멈추게 하였다. 405nm의 마이크로플레이트 판독기에서 광학 밀도(OD)를 측정하였다.
시험 PRO 폴리펩티드의 활성은 자극되지 않은 세포에 대해 VEGF(3ng/ml) 자극된 증식(산 포스파타제 활성에 의해 측정된 405nm에서의 OD)의 억제 비율로서 계산하였다. TGF-베타는 VEGF 자극된 ACE 세포 증식을 70 내지 90% 차단하기 때문에, 1ng/ml에서의 활성 기준으로서 TGF-베타를 사용하였다. 하기 표 7에 나타낸 바와 같은 결과는 암 치료시, 및 구체적으로는 종양의 신생혈관 형성 억제시 PRO폴리펩티드가 유용함을 알게 해준다. 표 7에 기재된 숫자(상대적 억제)는 자극받지 않은 세포에 대해 VEGF 자극된 증식의 억제 비율을 계산하고, 상기 비율을 VEGF 자극된 ACE 세포 증식을 70 내지 90% 차단하는 것으로 알려진 TGF-β 1ng/ml에 의해 얻은 억제율로 나누어 측정된 것이다. PRO 폴리펩티드가 VEGF 자극된 내피 세포 생장을 30% 이상 억제(상대 억제율 30% 이상)시키면, 결과는 양성으로 간주된다.
VEGF 자극된 내피 세포 생장의 억제
PRO 명칭 PRO 농도 상대 억제율(%)
PRO187PRO187PRO187 0.01%0.10%1.0% 918244
PRO214PRO214PRO214 0.01%0.10%1.0% 489194
PRO216PRO216PRO216 0.01%0.10%1.0% 968131
PRO216PRO216PRO216 0.01%0.10%1.0% 1049350
PRO323PRO323PRO323 0.01%0.10%1.0% 599391
PRO812PRO812PRO812 0.025nM0.25nM2.5nM 10110196
PRO1246PRO1246PRO1246 0.007nM0.07nM0.70nM 908760
PRO1246PRO1246PRO1246 0.007nM0.07nM0.70nM 999473
실시예 57: 내피 세포에서 c-fos의 유도
이 분석법은 PRO 폴리펩티드가 내피 세포에서 c-fos를 유도하는 능력이 있는지 측정하기 위해 고안된 것이다.
생장 배지(GHT가 없는 50% Ham's F12: 낮은 농도의 포도당, 및 글리신이 없는 50% DMEM: NaHCO3, 1% 글루타민, 10mM HEPES, 10% PBS, 10ng/ml bFGF 포함)가 들어있는 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 인간 정맥의 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC, Cell Systems)를 각 웰당 1×104의 세포 밀도로 플레이팅하였다. 플레이팅한 다음날, 생장 배재를 제거하여 세포를 굶기고, 세포를 각 웰당 100㎕의 시험 샘플 및 대조구(양성 대조구=생장 배지; 음성 대조구=단백질 32, 완충액=10mM HEPES, 140mM NaCl, 4%(w/v) 만니톨, pH 6.8)로 처리하였다. 5% CO2중의 37℃에서 30분 동안 세포를 배양하였다. 샘플을 제거하고, 하기 기재된 이용되는 시약/완충액을 입수할 수 있는 bDNA 키트의 프로토콜(Chiron Diagnostics, 카탈로그 번호 6005-037)의 1부에 기재된 방법을 수행하였다.
간략히 설명하면, 시험에 필요한 TM 용해 완충액 및 프로브를 제조자에 의해 제공되는 정보를 기초로 계산하였다. 해동된 프로브의 적합한 양을 TM 용해 완충액에 가하였다. 캡쳐 혼성화 완충액(Capture Hybridization Buffer)을 상온으로 가온하였다. bDNA 스트립을 금속 스트립 홀더에 설치하고, 100㎕의 캡쳐 혼성화 완충액을 필요한 각 b-DNA 웰에 가한 후 30분 이상 인큐베이션하였다. 세포가 있는 시험 플레이트를 인큐베이터에서 꺼낸 후, 진공 매니폴드를 이용하여 배지를 서서히 제거하였다. 프로브가 포함된 100㎕의 용해 혼성화 완충액을 피펫으로 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 빠르게 옮겼다. 이어서, 플레이트를 55℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 마이크로타이터 어댑터 헤드가 있는 볼텍스 혼합기에 놓고 #2로 설정하여 1분 동안 볼텍싱하였다. 80㎕의 용해물을 분리하여 캡쳐 혼성화 완충액을 함유하는 bDNA 웰에 가한 후, 피펫을 이용하여 위 아래로 혼합하였다. 플레이트를 53℃에서 16시간 이상 인큐베이션하였다.
그 다음날, bDNA 키트 프로토콜의 2부에 기재된 방법을 수행하였다. 구체적으로, 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 벤치에 놓고 10분 동안 냉각시켰다. 필요한 첨가물의 부피는 제조자에 의해 제공되는 정보를 기초로 계산하였다. 앰플리파이어 농축물을 AL 혼성화 완충액으로 1:100 희석하여 앰플리파이어 워킹 용액(Amplifier Working Solution)을 제조하였다. 혼성화 혼합물을 플레이트로부터 제거하고 워시(Wash) A로 2회 세척하였다. 50㎕의 앰플리파이어 워킹 용액을 각 웰에 가하고, 각 웰을 53℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 인큐베이터에서 꺼낸 후, 10분 동안 냉각시켰다. 표지 농축물(40pmole/마리)을 AL 혼성화 완충액으로 1:100 희석하여 표지 프로브 워킹 용액(Label Probe Working Solution)을 제조하였다. 10분간의 냉각기 이후에, 앰플리파이어 혼성화 혼합물을 제거하고, 플레이트를 워시 A로 2회 세척하였다. 50㎕의 표지 프로브 워킹 용액을 각 웰에 가하고, 각 웰을 53℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 10분 동안 냉각시킨 후, 기질(Substrate)을 상온으로 가온시켰다. 분석에 필요한 기질 각각의 ml에 3㎕의 기질 증진제(Substrate Enhancer)를 가하고, 플레이트를 10분 동안 냉각시킨 후, 표지 혼성화 혼합물을 제거하고, 플레이트를 워시 A로 2회 및 워시 D로 3회 세척하였다. 증진제가 포함된 50㎕의 기질 용액을 각 웰에 가하였다. 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 적합한 조도계에서 RLU를 판독하였다.
2회 측정하여 평균을 내었으며, 편차 상수를 측정하였다. 음성 대조구(상기 기재된 바와 같은 단백질 32/HEPES 완충액)의 값에 대해 증가된 배수의 활성 측정은 화학발광 단위(RLU)로 기입하였다. 그 결과는 하기 표 8에 기재되었으며, PRO 폴리펩티드가 음성 대조구에 비해 2배 이상의 값을 나타내는 경우 양성으로 간주한다. 음성 대조구는 1.00% 희석에서 1.00 RLU이고, 양성 대조구는 1.00% 희석에서 8.39 RLU이다.
<표 8a>
내피 세포에서 c-fos의 유도
PRO 명칭 PRO 농도 RLU 값
PRO287PRO287PRO287 0.018nM0.18nM1.8nM 2.061.891.73
PRO287PRO287 0.18nM1.8nM 1.642.14
PRO538PRO538PRO538 0.2149nM2.149nM21.49nM 1.952.151.46
PRO538PRO538PRO538 0.2149nM2.149nM21.49nM 2.382.422.84
PRO713PRO713PRO713 0.022nM0.22nM2.2nM 1.952.172.13
PRO713PRO713PRO713 0.022nM0.22nM2.2nM 2.662.522.69
PRO788PRO788PRO788 0.29nM2.9nM29.0nM 1.232.650.93
PRO865PRO865PRO865 0.027nM0.27nM2.7nM 1.983.092.90
PRO865PRO865PRO865 0.027nM0.27nM2.7nM 2.882.192.64
PRO1126PRO1126PRO1126 0.029nM0.29nM2.9nM 1.942.331.81
PRO1130PRO1130PRO1130 0.6nM6.0nM60.0nM 1.892.042.06
PRO1274PRO1274PRO1274 0.365nM3.65nM36.5nM 0.861.142.11
<표 8b>
내피 세포에서 c-fos의 유도
PRO 명칭 PRO 농도 RLU 값
PRO1274PRO1274PRO1274 0.365nM3.65nM36.5nM 2.041.862.41
PRO1294PRO1294PRO1294 0.13nM1.3nM13.0nM 2.382.231.39
PRO1294PRO1294PRO1294 0.13nM1.3nM13.0nM 2.782.531.39
PRO1304PRO1304PRO1304 0.074nM0.74nM7.4nM 1.722.081.41
PRO1304PRO1304PRO1304 0.074nM0.74nM7.4nM 2.661.751.45
PRO1376PRO1376PRO1376 0.86nM8.6nM86.0nM 1.412.205.59
PRO1376PRO1376PRO1376 0.86nM8.6nM86.0nM 1.432.281.49
PRO1387PRO1387PRO1387 0.1nM1.0nM10.0nM 2.191.812.45
실시예 58: 인간 정맥 내피 세포 Ca 흐름 분석
이 분석법은 PRO 폴리펩티드가 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC, Cell Systems)에서 칼슘 흐름을 자극하는 능력이 있는지 보여주기 위해 고안된 것이다. Ca 흐름은 특정 리간드가 그의 수용체에 결합시 잘 나타나는 반응이다. 본 Ca 흐름 분석에서 양성 반응을 나타내는 시험 화합물은 특정 수용체에 결합하여 인간 내피 세포에서 생물학적 신호전잘 경로를 활성화시킨다고 할 수 있다. 결국, 이는 세포 분열, 세포 증식의 억제, 내피 세포관 형성, 세포 이동 및 아팝토시스 등을 초래하게 된다.
생장 배지(글리신 없이 50:50%, 1% 글루타민, 10mM HEPES, 10% FBS, 10ng/mlbFGF)가 들어있는 96-웰 마이크로타이터 뷰 플레이트-96(Packard Instrument Company Part#6005182)에 인간 정맥의 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC, Cell Systems)를 각 웰당 2×104의 세포 밀도로 플레이팅하였다. 플레이팅한 다음날, 세포를 완충액(HBSS + 10mM HEPES)으로 3회 세척하고, 각 웰당 100㎕를 남겼다. 이어서, 각 웰당 100㎕의 8μM Fluo-3 (2X)를 가하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 1.5시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 완충액(상기 기재됨)으로 3회 세척하고, 각 웰당 100㎕를 남겼다. PRO 폴리펩티드의 시험 샘플을 5배 농도의 완충액이 들어있는 다른 96-웰 플레이트에 준비하였다. 양성 대조구는 50μM 이노마이신(5X)에 상응하며, 음성 대조구는 단백질 32에 상응한다. 세포 플레이트 및 샘플 플레이트를 FLIPR(Molecular Devices) 기계에서 구동시켰다. FLIPR 기계에 세포당 25㎕의 시험 샘플을 가하고, 1분 동안 매초 단위로 판독한 후, 이후의 3분 동안 매 3초 단위로 판독하였다.
곡선의 기준선으로부터 최대 증가치까지의 형광 변화(Δ 변화)를 계산하고, 2회 계산치를 평균내었다. 형광 증가 비율을 모니터링하여, 1000을 초과하며 60초 내에 증가되는 Δ 변화를 양성으로 간주하였다. 하기의 표 9에서, 결과는 양성 대조구에 대한 값으로 표현되었다.
<표 9>
인간 정맥 내피 세포 Ca 흐름 분석
PRO 명칭 PRO 농도 상대적 형광 Δ
PRO179PRO179PRO179 0.01%0.10%10.% 1.01.03.0
PRO179PRO179PRO179 0.01%0.10%10.% 1.01.03.0
PRO245PRO245PRO245 0.093nM0.93nM9.3nM 1.01.02.0
PRO771PRO771PRO771 0.075nM0.75nM7.5nM 1.01.02.0
PRO1313PRO1313PRO1313 0.611nM6.11nM61.1nM 1.01.04.0
PRO1313PRO1313PRO1313 0.611nM6.11nM61.1nM 1.01.03.0
PRO1376PRO1376PRO1376 0.86nM8.6nM86.0nM 1.01.02.0
PRO1376PRO1376PRO1376 0.86nM8.6nM86.0nM 1.01.02.0
PRO1561PRO1561PRO1561 0.023nM0.23nM23.0nM 1.01.02.0
실시예 59: 내피 세포 아팝토시스의 유도
인간 정맥의 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC, Cell Systems)에서 PRO 폴리펩티드가 내피 세포에서 아팝토시스를 유도하는 능력을 시험하였다.
상기 세포를 10% 혈청(CSG-배지, Cell Systems)이 포함된 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Amersham Life Science, 싸이토스타(cytostar)-T 섬광 마이크로플레이트, RPNQ160, 멸균, 조직 배양용 처리, 낱개로 포장됨)에 각 웰당 2×104의 세포 밀도로 총 100㎕에 플레이팅하였다. 2일째, PRO 폴리펩티드를 함유하는 시험 샘플을 3개의 희석액(1%, 0.33% 및 0.11%)으로 가하였다. 세포가 없는 웰을 블랭크로 사용하고, 세포만 있는 웰을 음성 대조구로 사용하였다. 양성 대조구로서 스타우로스포린 3X 원액 50㎕의 1:3 연속 희석액을 사용하였다. 안넥신(Annexin) V, 다수의 칼슘 및 지질 결합 단백질의 검출을 위해 96 웰 플레이트를 처리함으로써, PRO 폴리펩티드가 아팝토시스를 유도하는 능력을 측정하였다.
0.2ml의 안넥신 V-바이오틴 원액(100㎍/ml)을 4.6ml의 2X Ca2+결합 완충액 및 2.5% BSA 중에 희석하였다(1:25 희석). 50㎕의 희석된 안넥신 V-바이오틴 용액을 각 웰(대조구 제외)에 가하여 최종 농도가 1.0㎍/ml이 되게 하였다. 샘플을 안넥신-바이오틴과 함께 10 내지 15분 동안 인큐베이션한 후, 직접35S-스트렙타비딘을 가하였다.35S-스트렙타비딘을 2X Ca2+결합 완충액 및 2.5% BSA로 희석하고, 모든 웰에 최종 농도가 3×104cpm/웰이 되도록 가하였다. 이어서, 플레이트를 밀봉하고 1000rpm에서 15분 동안 원심분리한 후, 궤토 진탕기에 2시간 동안 놓아 두었다. 1450 마이크로베타 트리룩스(Micorbeta Trilux; Wallac)에서 분석을 수행하였다. 배경값을 초과하는 비율은 음성 대조구를 초과하는 분당 계수량의 비율을 나타낸다. 배경값보다 크거나 배경값의 30% 초과치와 동일한 비율을 양성으로 간주한다. PRO178, PRO179, PRO188, PRO217, PRO261, PRO301, PRO538 및 PRO719가 상기 기재된 분석에서 양성의 결과를 나타냈다(유도된 내피 세포 아팝토시스).
실시예 60: 내피 세포 아팝토시스의 유도 (ELISA)
96-웰 포맷을 이용하여, 100ng/ml의 VEGF, 0.1% BSA, 1X 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 0% 혈청 배지 중의 인간 정맥의 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC, Cell Systems)에서 PRO 폴리펩티드가 내피 세포에서 아팝토시스를 유도하는 능력을 시험하였다. 사용된 96-웰 플레이트는 팔콘(Falcon, No.3072)에서 제조하였다. 96-웰 플레이트의 코팅은 PBS 용액 중의 0.2% 젤라틴 100㎕로 30분이 넘게 젤라틴화가 일어나도록 하여 제조하였다. 젤라틴 혼합물을 흡입 제거한 후에 10% 혈청 함유 배지 중 최종 농도 2×104세포/ml의 HUVE 세포(웰당 100㎕ 부피)를 플레이팅하였다. 세포를 24시간 동안 배양한 후, 목적 PRO 폴리펩티드를 함유하는 시험 샘플을 가하였다.
100ng/ml의 VEGF, 0.1% BSA, 1X 페니실린/스트렙토마이신이 포충된 0% 혈청 배지(Cell Systems) 100㎕를 모든 웰에 가하였다. PRO 폴리펩티드를 함유하는 시험 샘플을 3개의 희석액(1%, 0.33% 및 0.11%)으로 가하였다. 세포가 없는 웰을 블랭크로 사용하고, 세포만 있는 웰을 음성 대조구로 사용하였다. 양성 대조구로서 스타우로스포린 3X 원액 50㎕의 1:3 연속 희석액을 사용하였다. 세포를 24 내지 35시간 동안 배양한 후 ELISA를 수행하였다.
베링거 매뉴얼[Boehringer, 세포 사멸 검출 ELISA 플러스, 카탈로그 번호 1 920 685]에 따라 용액을 제조하여 아팝토시스의 정도를 측정하기 위해 ELISA를 이용하였다. 샘플 제조: 96 웰 플레이트를 1000rpm으로 10분 동안 원심분리(200g)하고, 빠르게 거꾸로 뒤집어 상층액을 제거한 후, 종이 타올위에 플레이트를 거꾸로뒤집은 상태로 방치하여 남아있는 용액을 제가하였다. 각각의 웰에 200㎕의 1X 용해 완충액을 가하고, 진탕시키지 않으면서 상온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 1000rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 20㎕의 용해액(세포질 분획)을 스트렙타비딘 코팅된 MTP로 옮겼다. 80㎕의 면역시약 혼합물을 각 웰의 20㎕ 용해액에 가하였다. MTP를 접착성 호일로 덮은 후, 회전 진탕기(200rpm)에 놓고 상온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간 후, 흡입으로 상층액을 제거하고, 각 웰당 250㎕의 1X 인큐베이션 완충액을 사용하여 웰을 3회 세정(흡입에 의해 제거)하였다. 기질 용액(100㎕)을 각 웰에 가하고, 분광계를 통한 분석이 충분하도록 발색될 때까지(대략 10 내지 20분 후) 상온에서 250rpm의 회전 진탕기에서 인큐베이션하였다. 96 웰 판독기를 사용하여 492nm를 기준 파장으로 405nm에서 판독하였다. PIN32(대조구 완충액)에 대해 얻어진 값을 100%로 설정하였다. 130%를 초과하는 샘플을 아팝토시스 유도에 대한 양성 반응으로 간주하였다. PRO172 및 PRO235가 상기 기재된 ELISA 분석에 의해 측정된 바와 같이 양성으로 나타났다.
실시예 61: 내피 세포 아팝토시스의 검출 (FACS)
패시지가 10회를 넘지 않은 HUVE 세포를 이용하여 젤라틴화된 T175 플라스크 중 인간 정맥의 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC, Cell Systems)에서 PRO 폴리펩티드가 내피 세포에서 아팝토시스를 유도하는 능력을 시험하였다. 1일째, 세포를 분리[젤라틴화된 6cm 접시당 420,000개의 세포-(11×103세포/cm2팔콘, Pharmacia)]하고, 혈청을 함유하는 배지(CS-C, Cell Systems)에서 밤새 또는 16시간 내지 24시간 동안 배양하였다.
2일째, 세포를 5ml PBS로 1회 세척하고, 3ml의 0% 혈청 배지를 VEGF (100ng/ml)와 함께 가한 후, 30㎕의 PRO 시험 화합물(최종 희석 1%)을 가하였다. 세포, 배지 및 시험 PRO 화합물을 함유하는 혼합물을 48시간 동안 배양한 후 수획하였다.
이어서, 세포를 FACS로 분석하였다. 배지를 흡입 제거하고, 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 5ml의 1X 트립신을 T-175 플라스크 중의 세포에 가한 후, 세포가 플레이트로부터 떨어질 때까지(약 5 내지 10분) 놓아 두었다. 5ml의 생장 배지를 가하여 트립신 처리를 멈추었다. 세포를 4℃에서 1000rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 배지를 흡입 제거하고, 세포를 10ml의 10% 혈청 보충 배지(Cell Systems)에 재현탁한 후, 5㎕의 안넥신-FITC(BioVision)을 가하고, 냉각된 튜브로 FACS를 수행하였다.
PRO331 및 PRO364가 상기 기재된 분석에서 양성 결과를 나타냈다.
실시예 62: 원래 위치에서의 혼성화
원래 위치에서의 혼성화는 세포 및 조직 표본 내의 핵산 서열을 검출하고 위치를 파악하게 하는 강력한 다용도 기술이다. 예를 들어, 유전자 발현 부위의 확인, 전사되는 조직의 분포, 바이러스 감염 확인 및 그 위치 파악, 특정 mRNA 합성에 따른 변화, 및 염색체 지도화를 돕는데 유용할 수 있다.
PCR-생성33P-표지 리보프로브를 이용하여 문헌(Lu and Gillett, CellVision 1:169-176 (1994)]의 최적 버전 프로토콜로 원래 위치에서의 혼성화를 수행하였다. 요컨대, 포르말린으로 고정되어 파라핀에 묻힌 인간 조직을 절단하고, 탈파라핀화한 후, 37℃에서 15분 동안 단백질 분해효소 K(20g/ml)로 탈단백질화하고, 상기 문헌(Lu and Gillett)에 기재된 바와 같이 원래 위치에서의 혼성화로 추가 처리하였다. PCR 생성물로부터 [33P]-UTP로 표지된 안티센스 리보프로브를 생성하고 55℃에서 밤새 혼성화하였다. 상기 슬라이드를 코닥(Kodak) NTB2 핵 트랙 에멀젼(nuclear track emulsion) 중에 담그고 4주 동안 노출시켰다.
33P-리보프로브 합성
33P-UTP(Amersham BF 1002, SA < 2000Ci/mmol) 6.0㎕(125mCi)를 고속 진공기(speed vac)에서 건조시켰다. 건조된33P-UTP를 포함하는 각 튜브에 하기 성분을 가하였다.
2.0㎕ 5x 전사 완충액
1.0㎕ DTT (100mM)
2.0㎕ NTP 혼합물 (2.5mM: 각각 10mM인 GTP, CTP 및 ATP 10㎕ + 10㎕ H2O)
1.0㎕ UTP (50μM)
1.0㎕ RNAsin
1.0㎕ DNA 주형 (l㎍)
1.0㎕ H20
1.0㎕ RNA 중합효소 (PCR 생성물의 경우에 통상 T3 = AS, T7 = S)
37℃에서 1시간 동안 상기 튜브를 인큐베이션하였다. RQ1 DNase 1.0㎕를 가한 후에 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. TE(10mM Tris(pH 7.6) 및 lmM EDTA(pH 8.0)) 90㎕를 가하고, 피펫으로 상기 혼합물을 DE81 페이퍼에 가하였다. 마이크로콘(Microcon)-50 초미세여과 유닛에 잔류 용액을 로딩하고 프로그램 10을 이용하여 6분 동안 회전시켰다. 제2 튜브 위에 여과 유닛을 거꾸로 올려놓고 프로그램 2를 이용하여 3분 동안 회전시켰다. 최종 회수하기 전에, TE 100㎕를 가하였다. DE81 페이퍼 상에 최종 생성물 1㎕를 피펫으로 가하고 6ml의 바이오플라워(Bioflour) Ⅱ로 계수하였다.
TBE 및 요소 겔 상에 프로브를 전기영동하였다. 3㎕의 로딩 완충액에 1 내지 3㎕의 프로브 또는 5㎕의 RNA Mrk Ⅲ를 가하였다. 37℃ 가열 블록(heat block)에서 3분 동안 가열한 후에, 즉시 겔을 얼음에 놓았다. 겔의 웰을 세척한 후, 샘플을 로딩하고 180 내지 250볼트에서 45분 동안 전기영동하였다. 사란(saran) 랩으로 겔을 싸고, 이를 -70℃ 냉동고에서 1시간 내지 밤새의 시간 동안 신호 증강 스크린 상에서 XAR 필름에 노출시켰다.
33P-혼성화
A. 동결 단편의 예비처리
냉동고로부터 슬라이드를 꺼내 알루미늄 트레이에 놓고 상온에서 5분 동안 해동시켰다. 응축 감소를 위해, 트레이를 55℃ 배양기에 5분 동안 놓아 두었다.발연 후드(fume hood) 내의 얼음 상 4% 파라포름알데히드 중에서 10분 동안 슬라이드를 고정시키고, 상온에서 0.5x SSC(25ml 20x SSC + 975ml SQ H2O)로 5분 동안 세척하였다. 단백질 분해효소 K 0.5㎍/ml로 37℃에서 10분 동안 탈단백질화 후에(예열된, RNase가 없는 RNase 완충액 250ml 중의 10mg/ml 원액 12.5㎕), 상온에서 10분 동안 0.5x SSC로 단편을 세척하였다. 70%, 95%, 100% 에탄올 중에서 각각 2분 동안 단편을 탈수화하였다.
B. 파라핀에 묻힌 절편의 예비처리
슬라이드를 탈파라핀화하고 SQ H2O 중에 놓고 상온에서 2x SSC로 5분씩 2회 세척하였다. 인간 배(embryo)의 경우 단백질분해효소 K(RNase가 없는 RNase 완충액 250ml 중의 10mg/ml 용액 500㎕, 37℃, 15분) 20㎕/ml 중에서, 또는 포르말린 조직의 경우 8x 단백질분해효소 K(RNase 완충액 250ml 중의 100㎕, 37℃, 30분) 중에서 절편을 탈단백질화하였다. 그 후에, 상기 기재된 바와 같이 0.5x SSC로 세척하고 탈단백질화를 수행하였다.
C. 예비혼성화
박스(Box) 완충액(4x SSC, 50% 포름아미드)으로 포회된 여과지에 의해 구획이 나뉜 플라스틱 상자에 슬라이드를 놓았다. 50㎕ 혼성화 완충액(덱스트란 설페이트 3.75g + SQ H2O 6ml)을 조직 시료에 넣고 볼텍싱 후, 뚜껑을 느슨하게 한 상태로 2분 동안 극초단파로 가열하였다. 얼음에서 냉각한 후에, 포름아미드 18.75ml, 20x SSC 3.75ml 및 SQ H2O 9ml를 가하고 조직을 잘 볼텍싱한 후, 42℃에서 1내지 4시간 동안 인큐베이션하였다.
D. 혼성화
슬라이드 당 1.0 x 106cpm의 프로브 및 tRNA(50mg/ml 원액) 1.0㎕를 95℃에서 3분 동안 가열하였다. 얼음에서 상기 슬라이드를 냉각하고, 슬라이드 당 혼성화 완충액 48㎕를 가하였다. 볼텍싱한 후에, 슬라이드 상의 예비혼성화 시료 50㎕에33P 혼합물 50㎕를 가하였다. 55℃에서 밤새 이 슬라이드를 배양하였다.
E. 세척
상온에서 2x SSC, EDTA로 10분씩 2회 세척한 후에(20x SSC 400ml + 0.25M EDTA 16ml, 최종 부피=4L), 37℃에서 30분 동안 RNase A로 처리하였다(RNase 완충액 250ml 중 10mg/ml 농도의 RNase 500㎕ = 20㎍/ml). 상온에서 2x SSC, EDTA로 10분씩 2회 슬라이드를 세척하였다. 엄격한 세척 조건은 하기와 같다: 55℃, 0.1x SSC 및 EDTA에서 2시간(20x SSC 20ml + EDTA 16ml, 최종 부피 = 4L).
F. 올리고뉴클레오티드
본원에 개시된 12개의 DNA 서열에 대해 원래 위치에서의 분석을 수행하였다. 이러한 분석에 사용된 올리고뉴클레오티드는 하기와 같다:
(1) DNA23339-1130 (PRO178)
p1:5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CAC GGG CGC TGT GTG CTG GAG-3' (서열 231)
p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TGG TGG GGA CCG CAG GGT GAC-3' (서열 232)
p3: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CCG CCA CGA GGA GCT GTT ACG-3' (서열 233)
p4: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TGA CCT GCA GGC ATG GGA GAA-3' (서열 234)
p5: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGC CGC CAC GAG GAG CTG TTA-3' (서열 235)
p6: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GGG GCT CTG GGG CTG GGT C-3' (서열 236)
(2) DNA28497-1130 (PRO188)
p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CAA CAC CAA GGG GCA AGA TG-3' (서열 237)
p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GGG CTT TTG GTG GGA GAA GTT-3' (서열 238)
(3) DNA30942-1134 (PR0212)
p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC TCG CTG CTG TGC CTG GTG TTG-3' (서열 239)
p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CCG CTG CAG CCT CTT GAT GGA-3' (서열 240)
(4) DNA32286-1191 (PRO214)
p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CCC TCC TGC CTT CCC TGT CC-3' (서열 241)
p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GTG GTG GCC GCG ATT ATC TGC-3' (서열 242)
(5) DNA33094-1131 (PR0217)
p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC TCA GAA AAG CGC AAC AGA GAA-3' (서열 243)
p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TGT CTT CCA TGC CAA CCT TC-3' (서열 244)
(6) DNA33221-1133 (PR0224)
p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GCA GCG ATG GCA GCG ATG AGG-3' (서열 245)
p2 : 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CAG ACG GGG CAG CAG GGAGTG-3' (서열 246)
(7) DNA35638-1141 (PR0245)
p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGG AAG ATG GCG AGG AGG AG-3' (서열 247)
p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CCA AGG CCA CAA ACG GAA ATC-3' (서열 248)
(8) DNA33473-1176 (PR0261)
p1 : 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GCG AGG ACG GCG GCT TCA-3' (서열 249)
p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA AGA GTC GCG GCC GCC CTT TTT-3' (서열 250)
(9) DNA40628-1216 (PR0301)
p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GAG TCC TTC GGC GGC TGT T-3' (서열 251)
p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CGG GTG CTT TTG GGA TTC GTA-3' (서열 252)
(10) DNA47365-1206 (PR0364)
p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC AAC CCG AGC ATG GCA CAG CAC-3' (서열 253)
p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TCT CCC AGC CGC CCC TTC TC-3' (서열 254)
(11) DNA29101-1122 (PR0713)
p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGC GGA ATC CAA CCT GAG TAG-3' (서열 255)
p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GCG GCT ATC CTC CTG TGC TC-3' (서열 256)
(12) DNA33087 (PRO216)
p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CCC GAG TGT TTT CCA AGA-3' (서열 257)
p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CAA GTT TAC TAG CCC ATC CAT-3' (서열 258)
p3: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC TGG ATG GGC TAG TAA ACT TGA-3' (서열 259)
p4: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CCC TTC TGC TCC TTC TTG TT-3' (서열 260)
G. 결과
본원에 개시된 상기 12개의 DNA 서열에 대해 원래 위치에서의 분석을 수행하였다. 상기 분석으로부터의 결과는 하기와 같다:
(1) DNA23339-1130 (PRO178)
태아 하부 사지 중 골격근 및 뼈(원시성 골막) 사이의 연결 조직 경계면에서 독특한 발현 패턴이 관찰되었다. 또한, 발현은 혈관 조직 주변에서도 관찰되었으며, 따라서 신생혈관 형성과 연계될 가능성이 있다. 하부 사지의 발현과 유사한 발현 패턴이 체벽에서 관찰되었다. 도관의 평활근에서도 발현이 관찰되었다. 또한, 소장 및 위의 평활근/연결 조직의 고유판에서 발현이 관찰되었다. 인대 혈관 평활근도 양성이었다. 발생중인 사지, 장 및 체벽에서의 고도로 조직화된 발현 패턴은 이들 부위에 독특한 기능이 있음을 시사한다. 가능한 기능으로는 신생혈관 형성 및 분화가 포함될 수 있다.
태아 흉선의 골수 및 태아 뇌의 피질(피질 뉴런)에서 어느정도 증가된 발현이 나타난다. 하기의 태아 조직은 양성 결과가 나타나지 않았다: 척수, 갑상선, 부신, 간 및 태반.
조사된 모든 성인 조직에서는 음성이었다.
(2) DNA28497-1130 (PRO188)
태아 하부 사지 중, 골세포 및 발생중인 뼈의 골막/연골막의 내연골 형성 부위에서 높은 수준의 발현이 관찰되었다. 이 분포는 뼈 형성/분화에서의 기능을 시사한다. 갑상성 상피세포에서 약간 증가된 발현이 관찰되었다. 체벽에서는 골세포 및 발생중인 뼈의 골막/연골막에서 높은 수준의 발현이 관찰되었다. 이 분포는 뼈 형성/분화에서의 기능을 시사한다. 하기의 태아 조직은 양성 결과가 나타나지 않았다: 흉선, 기관, 뇌(대뇌 피질), 척수, 소장, 부신, 간, 위, 태반 및 인대.
성인 조직에서는 양성 유방 상피, 아포크린 화생 및 경화성 선종에서 발현이 관찰되었다. 또한, 침윤성 관상 유방암 세포에서 발현이 관찰되었다. 성인의 간, 심장 또는 간암에서는 발현이 관찰되지 않았다.
성인 피부의 편평 상피세포 및 성인 부신 피질에서 어느정도 발현이 나타난다. 태아 멀티블록(multiblock) 조직에는 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 척수, 체벽, 골반 및 하부 사지 조직이 포함된다. 성인 멀티블록 조직에는 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐 및 피부 조직이 포함된다.
(3) DNA30942-1134 (PR0212)
<폐암, 종양 블록 및 유방암에서의 발현>
정상 침팬치 흉선의 단핵 식세포 뿐만 아니라, 조사된 위암 하나, 결직장암 하나, 유방암 5개 중 2개 및 폐암 4개 중 하나에서 발현이 관찰되었다. 골육종 및 분화가 덜된 지방육종의 악성 세포에 의해 발현이 관찰되었다. 고환 기형종 및 조사된 유방암 5개 중 1개의 악성 세포에서 어느정도 신호가 나타났다. 상기 폐암 중 하나에서는 폐 림프 조직내의 위쪽 내피 세정맥에서 분산된 신호가 나타났다.
조사된 태아 조직(E12-E16 주)에는 태반, 탯줄 도관, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 체벽, 골반 및 하부 사지 조직이 포함된다. 조사된 성인 조직에는 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 폐, 피부, 연골육종, 눈, 위, 위암, 결장, 결장암, 신장 세포암, 전립선, 방광 점막 및 담낭, 및 아세트아미노펜 유도 간 손상 및 간경화 조직이 포함된다. 조사된 붉은털 원숭이 조직에는 대뇌 피질(rm) 및 해마상융기(rm) 조직이 포함된다. 조사된 침팬치 조직에는 갑상선, 부갑상선, 난소, 신경, 혀, 흉선, 부신 위 점막 및 침샘 조직이 포함된다.
<폐 선암종 및 편평세포 암종에서의 발현>
8개의 선암종 및 7개의 편평세포 폐암종을 조사하였다. 액틴은 모든 종양에서 강한 양성 신호를 나타냈으며, 이는 모두가 원래 위치에서의 혼성화 분석에 적합함을 의미한다. 하기와 같은 6개의 종양에서 발현이 관찰되었다:
6727-95 편평세포 암종 - 신생성 상피 전체에서 강하게 발현됨
9558-95 편평세포 암종 - 신생성 상피 전체에서 발현됨
12235-95 선암종 - 원래 위치에서 및 침윤성 종양 세포 전체에서 발현됨
6545-95 및 4187-97 편평세포 암종 - 종양 스트로마의 세포 전체에서 발현되고, 종양 세포 전체에서는 발현되지 않음
12954-94 편평세포 암종 - 스트로마 세포 전체에서 어느정도 약하게 발현됨.
(4) DNA32286-1191 (PRO214)
태아 조직 중, 중간엽 전체에서 낮은 수준의 발현이 관찰되었다. 막 조직의 태반 스트로마 세포 및 갑상선에서 적당한 수준의 발현이 관찰되었다. 또한, 피질성 뉴런에서도 낮은 수준의 발현이 관찰되었다. 성인 조직은 모두 음성이었다.
조사된 태아 조직(E12-E16 주)에는 태반, 탯줄 도관, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 체벽, 골반 및 하부 사지 조직이 포함된다. 조사된 성인 조직에는 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐 및 피부 조직이 포함된다.
(5) DNA33094-1131 (PR0217)
매우 독특한 발현 패턴이 하기와 같이 관찰되었다: 인간 배아에서는 GI관의 외부 평활근층, 호흡 연골, 기관지 상피, 조골세포, 건, 생식선, 시신경 헤드 및 발생중인 진피에서 발현이 관찰되었다. 성체에서는 침팬치 혀의 상피 정수리 (epidermal peg), 전립선의 기저 상피/근상피 세포 및 방광에서 발현이 관찰되었다. 또한, 성체 폐의 폐포 연결부(alveolar lining) 세포, 성기에서 발기성 조직과 병치된 중간엽 세포 및 대뇌 피질(아마도 신경교세포)에서 발현이 관찰되었다. 신장에서는 질병 조직의 갑상선화 신장 세관을 둘러싸는 세포에서만 발현이 관찰되었다.
조사된 태아 조직(E12-E16 주)에는 태반, 탯줄 도관, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 체벽, 골반 및 하부 사지 조직이 포함된다. 조사된 성인 조직에는 신장(정상 및 말기), 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 담낭, 췌장, 폐, 피부, 눈(망막 포함), 전립선, 방광 및 간(정상, 간경화, 급성 간부전) 조직이 포함된다.
조사된 비인간 영장류 조직에는 침팬치 조직(침샘, 위, 갑상선, 부갑상선, 피부, 흉선, 난소, 림프절), 붉은털 원숭이 조직(대뇌 피질, 해마상융기, 소뇌, 성기)이 포함된다.
(6) DNA33221-1133 (PR0224)
발현은 태아 비장, 성인 비장, 태아 간, 성인 갑상선 및 성체 림프절(침팬치)의 혈관 내피로 한정되었다. 발생중인 척수 신경절에서 부가적인 발현 부위가 나타났다. 모든 다른 조직은 음성이었다.
조사된 인간 태아 조직(E12-E16 주)에는 태반, 탯줄 도관, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 체벽, 골반 및 하부 사지 조직이 포함된다. 조사된 성인 조직에는 신장(정상 및 말기), 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐, 피부, 눈(망막 포함), 방광 및 간(정상, 간경화, 급성 간부전) 조직이 포함된다. 조사된 비인간 영장류 조직에는 침팬치 조직(침샘, 위, 갑상선, 부갑상선, 피부, 흉선, 난소, 림프절), 붉은털 원숭이 조직(대뇌 피질, 해마상융기, 소뇌, 성기)이 포함된다.
(7) DNA35638-1141 (PR0245)
<성인 및 태아 조직에서의 발현 패턴>
태아의 일부와 탯줄을 연결하는 내피에서 발현이 관찰되었다. 발현은 이들 조직 블록으로 한정되었다. 또한, 태반의 중간 영양막 세포에서 발현이 관찰되었다. 모든 다른 조직에서는 음성이었다.
조사된 태아 조직(E12-E16 주)에는 태반, 탯줄 도관, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 체벽, 골반 및 하부 사지 조직이 포함된다. 조사된 성인 조직에는 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐, 피부, 대뇌 피질(rm), 해마상융기(rm), 소뇌(rm), 성기, 눈, 방광, 위, 위암, 결장, 결장암, 갑상선(침팬치), 부갑상선(침팬치), 난소(침팬치) 및 연골육종, 아세트아미노펜 유도 간 손상 및 간경화 조직이 포함된다.
<염증 조직(건선, IBD, 염증 신장, 염증 폐, 간염(간 블록), 정상 편도선, 성인 및 침팬치 멀티블록)에서의 발현>
이 분자는 면역 자극성(MLR에서 T 림프구 증식 및 동시 자극을 향상시킴)으로 나타났고, 염증전 특성(생체내에서 호중구 침윤을 유도)이 있는 것으로 나타났다. 상기 기재된 바와 같이, 이 분자는 내아 혈관의 내피/혈관 내막 일부 및 태반에서 발현되지만, 다양한 성인의 정상 조직 또는 상기 조직의 혈관에서는 발현되지 않는 것으로 나타났다. 인간 염증 조직의 혈관에서 상기 분자의 발현을 비-염증 조직과 비교하여 평가하였다. 요약하면, 만성 염증을 앓고 있는 폐의 대혈관내피/혈관 내막, 건선 피부의 표면 피부 혈관, 만성 경화성 신장염 시료의 세동맥, 및 편도선의 여포 주변 공동을 포함하는 모세혈관에서 발현이 관찰되었다.
정상 피부(인간 포피 시료), 정상 폐, 염증성 장(8개의 IBD 시료), 정상 장, 만성 염증성 간 또는 경화성 간, 성인 정상 심장 조직, 또는 부신에서는 발현이 관찰되지 않았다.
(8) DNA33473-1176 (PR0261)
<성인 및 태아 조직의 발현 패턴>
성인 정상 피부의 섬유아세포에서 강한 발현이 관찰되었다. 또한, 2가지 경화성 간의 활성 간 섬유증 부위에서 강한 발현이 관찰되었다. 부가적으로, 부신 피질의 패시큘라타(fasiculata) 세포에서 적당한 수준 발현이 관찰되었다. 발현의 부위는 세포외 매트릭스 형성/전환에서 상기 분자의 기능을 뒷받침 해준다.
<인간 유방암 및 정상 유방 조직, 및 폐암 조직에서의 발현>
조사된 2가지 유방 종양에서 약한 확산 신호가 나타났다. 양성 및 악성 상피 세포에서는 발현이 관찰되지 않았지만, 중간엽 세포(특히, 이영양성 골화를 포함하는 조직 복구 영역)에서 특이적 혼성화 신호가 관찰되었다. 신호는 동일한 세포 집단에 국한되는 것 같지만, 일부 영역(유방 종양 02)에서는 신호가 매우 강하게 나타났다. 대부분의 양성 반응 세포는 섬유아세포의 형태를 갖지만, 평활근 세포는 음성인 것 같다. 폐 종양 조직에서 나타나는 신호는 유방 종양에서 나타나는 것보다 더 약하지만, 이 부분은 유방 종양 슬라이드에 비해 복구가 덜된 것이었다. 정상 폐 및 신장 조직은 본질적으로 음성이었다.
요약하면, 본 연구는 조직 복구 및(또는) 콜라겐 축적과 관련된 중간엽 세포에서의 발현을 보여준다. 양성 염증성 조건(탈장) 때문에, 신호는 침윤성 유방암 세포 또는 파괴된 조직에 인접한 양성 섬유아세포-유사 세포에서 특히 강했다. 중요한 것은 양성 유골의 축적이 RNA의 강한 발현과 관련된 것처럼 보인다는 것이다.
<정상 인간 결장 및 결장암 조직에서의 발현>
종양 세포에서 양성 혼성화 신호를 나타내는 조직 단면은 없었다. 다양한 강도의 양성 신호는 섬유아세포 또는 평활근 분화의 중간엽 세포에서 관찰되었다. 이 종양 세포가 소위 데모플라스틱(demoplastic) 반응(콜라겐성 섬유증이 수반되는 섬유아세포 증식)을 도출한다면, 양성 신호의 섬유아세포는 침입성 종양 부근에서 관찰된다. 또한, 양성 섬유아세포는 조직 복구(과립화 조직 또는 육아종성 반응) 영역에서 나타났다. 양성 평활근 세포는 대부분 중간 크기의 동맥에 나타났다.
(9) DNA40628-1216 (PR0301)
<인간 염증 조직(건선, IBD, 염증 신장, 염증 폐, 간염, 정상 편도선, 성인 및 침팬치 멀티블록)에서의 발현>
주로 염증에 걸리고 정상 조직이 거의 없는 인간 조직 및 비인간 영장류 조직에서 발현을 평가하였다. 결장의 점막성 상피, 기관지의 대기도 상피, 경구 점막(혀), 편도움 점막, 태반 점막, 전립선 점막, 위샘 점막, 흉선 해셀소체의 상피, 간세포, 담 상피, 및 태반 상피를 포함하는, 평가된 모든 상피성 구조에서 발현이 관찰되었다. 반응성 증식을 수반하는 편도선의 여포 배아 중심에서 상피성 구조 외부에서의 발현에 대한 흔적은 약하고 낮으며 모순된 발현이었다.
비인간 영장류(침팬치) 조직 중, 혀 상피의 표피에서 약하게 확산되는 발현이 관찰되었고, 해셀소체의 흉선 상피에서 약한 발현이 관찰되었으며, 위샘 점막의 상피에서 약간의 확산된 발현이 관찰되었다.
인간 조직 중에서,
(1) 간(만성 담관염, 소엽 증식, 아세트아미노펜 독성을 포함하는 멀티블록)에서는, 간세포 및 담 상피에서 낮은 수준 내지 적당한 수준의 확산된 발현이 관찰되었다. 발현은 대부분 소엽 주변/문맥 주변의 간세포에서 두드러지게 나타났다. 만성 경화성 담관염에 걸린 간 단면의 담 상피에서 두드러지게 발현되었다.
(2) 표피의 건선 샘플에서 약한 발현이 관찰되었다.
(3) 만성 간질성 폐렴 또는 만성 기관지염에 걸린 폐에서는 대기도의 점막 상피에서 낮은 수준의 확산된 발현이 관찰되었고, 폐포 상피에서도 약하게 확산된 발현이 관찰되었다. 기관지/세기관지의 점막밑 샘의 상피에서는 발현이 관찰되지 않았다.
(4) 태반 상피 및 방광의 점막 상피에서 적당한 수준의 확산된 발현이 관찰되었다.
(5) 전립선 상피에서는 낮은 수준의 확산된 발현이 관찰되었다.
(6) 편도선 점막 및 움의 상피에서 높은 수준의 확산된 발현이 관찰되었고, 편도선 움을 연결하는 점막 세포에서 가장 강한 신호가 나타났다. 피질 여포의 배아 중심(B 림프구 영역)에서는 약하고 모순되며 확산된 발현이 관찰되었지만, B 림프구에서 림프 구조 또는 림프구 염증으로 평가된 어떤 조직에서도 발현은 관찰되지 않았다.
(7) 염증성 장 질환에 걸리고 용종/선종성 변화를 겪는 결장에서는, 점막 상피에서 낮은 수준의 발현이 관찰되었고, 융모 끝에서 가장 높은 수준의 발현이 관찰되었다. 용종에 걸린 1가지 시료 중, 용종의 이형성 상피에서 주변의 점막에 비해 증가된 발현이 관찰되지 않았다. 많은 단면에 존재하는 반응성 점막 림프 조직에서 명백한 발현은 없었다.
발현되지 않은 조직에는 심장, 말초 신경 및 근육(심근, 평활근)이 포함된다.
(10) DNA47365-1206 (PR0364)
척추체의 전면을 연결하는 태아의 근막에서 발현이 관찰되었다. 또한 태아의 망막에서도 발현되었다. 태아의 뉴런 전체에서 낮은 수준의 발현이 나타났다. 모든 다른 조직에서는 음성이었다.
(11) DNA29101-1122 (PR0713)
태아 조직: 발생중인 하부 사지 뼈의 연골성 원기 가장자리(즉, 외부 가장자리 둘레)에서 발현이 관찰되었고, 발생중인 건에서는 혈관 평활근 및 발생중인 골격근 근세포 및 근관을 둘러싸는 세포에서 발현이 관찰되었다. 또한, 뼈끝 생장판에서도 발현이 관찰되었다. 태아 림프절에서, 발생중인 림프절의 가장자리 동(洞)에서 발현이 나타났다. 발현은 이 영역에서 발견되는 피막하 상피 세포 또는 증식중인 흉선 세포가 존재하는 흉선 피질의 피막하 영역에서도 관찰되었다. 부가적으로, 하기의 조직에서 발현이 나타났다. 즉, 기관의 평활근에서 발현되었고, 대뇌피질의 피질성 뉴런에서 집중적으로 발현되었으며, 소장의 평활근에서 발현되었고, 갑상선 상피 전체에서 발현되었으며, 간의 관상판 세포에서 발현되었고, 위벽의 평활근에서 발현되었으며, 태아 피부 편평세포 상피의 기저층에서 발현되었고, 태반에서 장 세포의 영양아세포성 융모에서 발현되었으며, 탯줄 도관의 동맥벽 및 정맥벽에서 발현되었다. 발현 패턴은 이 분자가 세포 분화/증식에 관련될 수 있음을 시사한다.
태아의 피장, 척수 또는 부신에서는 발현이 관찰되지 않았다.
하기 부위에서 높은 수준의 발현이 관찰되었다:
(1) 침팬치 난소 - 성숙한 여포의 과립막 세포, 포막 세포 전체에서는 약한 강도의 신호가 관찰됨;
(2) 침팬치 부갑상선 - 주세포 전체에서 높은 수준의 발현이 관찰됨;
(3) 인간 태아 고환 - 발생중인 관을 둘러싸는 스트로마 세포 전체에서 적당한 수준의 발현이 관찰됨;
(4) 인간 태아 폐 - 발생중인 기관세지에서 연골세포 전체에서 높은 수준의 발현이 관찰되고, 분지중인 기관지 상피 전체에서는 낮은 수준의 발현이 관찰됨.
신장 세포, 위암 조직 및 결장암 조직에서는 특이한 발현이 관찰되지 않았다.
조사된 태아 조직(E12-E16 주)에는 태반, 탯줄 도관, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 체벽, 골반 및 하부 사지 조직이 포함된다. 조사된 성인 조직에는 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐, 피부, 대뇌 피질(rm), 해마상융기(rm), 소뇌(rm), 성기, 눈, 방광, 위, 위암, 결장, 결장암 및 연골육종, 아세트아미노펜 유도 간 손상 및 간경화 조직이 포함된다.
(12) DNA33087 (PRO216)
모든 연골질 부위 및 새 뼈 형성 부위의 조골세포에서 강하고 특이적인 발현이 관찰되었다. 부가적인 발현 부위에는 발생중인 폐동맥 및 대동맥의 대혈관이 포함된다. 그외의 모든 태아 조직에서는 음성이었다. 조사된 조직에는 태반, 탯줄 도관, 뇌, 척수, 눈, 시신경, 기관, 폐, 심장, 흉선, 간, 비장, 식도, 소장, 췌장, 부신, 갑상선, 체벽 및 하부 사지 조직이 포함된다.
조사된 성인 조직은 모두 음성이었으며, 여기에는 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐 및 피부 조직이 포함된다. 멀티블록의 모든 성인 조직은 베타-액틴에 대해 양성이었다.
이 분자의 가능한 기능은 뼈 매트릭스 침착 및(또는) 조골세포 생장의 조절일 수 있다.
실시예 63: 혼성화 프로브로서 PRO 폴리펩티드의 용도
하기 방법은 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 혼성화 프로브로서의 용도를 기술한다.
전장 또는 성숙 PRO 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함하는 DNA(각각 도 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81,83, 85, 87, 89, 91, 93 및 95, 서열 3, 8, 13, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 61, 66, 71, 76, 84, 89, 97, 106, 111, 116, 126, 131, 136, 142, 147, 152, 154, 159, 161, 169, 180, 182, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 213, 215, 217, 219, 221 및 226에 나타냄) 또는 그의 단편을 인간 조직 cDNA 라이브러리 또는 인간 조직 게놈 라이브러리에서 상동성 DNA (예를 들어, PRO의 자연 발생 변이체를 코딩하는 것)를 스크리닝하는데 프로브로서 사용할 수 있다.
이들 라이브러리 DNA를 포함하는 필터의 혼성화 및 세척을 하기 고엄격 조건 하에 수행하였다. 방사선 표지된 PRO 폴리펩티드 유도 프로브를 50% 포름아미드, 5×SSC, 0.1% SDS, 0.1% 피로인산나트륨, 50 mM 인산나트륨, pH 6.8, 2×덴하르트(Denhardt's) 용액 및 10% 덱스트란 술페이트 용액 중의 42℃에서 20시간 동안 혼성화시켰다. 필터를 0.1×SSC 및 0.1% SDS의 수용액 중의 42℃에서 세척하였다.
이어서, 전장 천연 서열을 코딩하는 DNA와 원하는 서열 동일성을 갖는 DNA를 당업계에 공지된 표준 방법으로 찾아내었다.
실시예 64: 대장균(E. coli)에서 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산의 발현
본 실시예는 대장균(E. coli) 내의 재조합 발현에 의해 PRO 폴리펩티드의 비글리코실화된 형태를 제조하는 방법을 예시한다.
처음에 원하는 PRO187, PRO195, PRO224, PRO301, PRO364, PRO713, PRO788, PRO1274, PRO1286, PRO1303, PRO1319, PRO1313 및 PRO1376 (각각 서열 20, 30, 50, 89, 116, 136, 152, 196, 198, 202, 213, 215 및 217)를 코딩하는 DNA 서열을 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위를 포함해야만 한다. 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예에는 앰피실린 및 테트라싸이클린 내성 유전자를 포함하는 pBR322 (대장균(E. coli)에서 유래; Bolivar et al., Gene 2:95(1977) 참조)가 있다. 벡터를 제한 효소로 절단하고 탈인산화시켰다. 이어서, PCR 증폭된 서열을 벡터에 라이게이션하였다. 벡터는 바람직하게는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리-His 리더(처음 6개의 STII 코돈, 폴리-His 서열 및 엔테로키나제 절단 부위를 포함), PRO187, PRO195, PRO224, PRO301, PRO364, PRO713, PRO788, PRO1274, PRO1286, PRO1303, PRO1319, PRO1313 및 PRO1376 코딩 부위, 람다 전사 종결부 및 argU 유전자를 서열을 포함할 것이다.
이어서, 상기 문헌(Sambrook et al.)에 기재된 방법을 이용하여 선택된 대장균(E. coli) 균주를 형질전환시키는데 라이게이션 혼합물을 사용하였다. LB 평판 배지에서 생장할 수 있는 형질전환체를 확인하고 항생제 내성을 갖는 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA를 단리하여, 제한 분석법 및 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다.
항생제가 포함된 LB 브로쓰와 같은 액체 배양 배지에서 선택된 클론을 밤새 배양하였다. 이 배양액을 더 큰 규모의 배양 접종에 사용하였다. 이어서, 세포를 원하는 광학 밀도까지 배양한 후, 발현 프로모터를 작동시켰다.
수시간 이상 동안 세포를 더 배양한 후에 원심분리로 세포를 회수하였다. 원심분리로 얻어진 세포 펠릿을 당업계에 공지된 여러가지 시약을 이용하여 용해시키고, 단백질이 강하게 결합하는 조건 하에서 금속 킬레이팅 컬럼을 이용하여 용해된 PRO187, PRO195, PRO224, PRO301, PRO364, PRO713, PRO788, PRO1274, PRO1286, PRO1303, PRO1319, PRO1313 및 PRO1376 폴리펩티드를 정제하였다.
실시예 65: 포유동물 세포에서 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산의 발현
본 실시예는 포유동물 세포에서 재조합 발현에 의해 PRO 폴리펩티드의 가능한 글리코실화된 형태를 제조하는 방법을 예시한다.
pRK5 벡터(1989년 3월 15일 공개된 EP 제307,247호 참조)를 발현 벡터로 사용하였다. 임의로, 상기 문헌(Sambrook et al.)에 기재된 라이게이션 방법을 이용하여 PRO DNA를 선택된 제한 효소로 pRK5에 라이게이션시켜, PRO 폴리펩티드 코딩 DNA를 삽입하였다. 결과의 벡터를 pRK5-(PRO 코딩 DNA)라 명명하였다.
한 실시양태에서, 숙주 세포로서 293 세포를 선택할 수 있다. 인간 293 세포(ATCC CCL 1573)를 우태 혈청 및 임의로 영양소 및(또는) 항생제가 포함된 DMEM와 같은 배지에서 조직 배양 플레이트에 가득 차도록(confluent) 배양하였다. pRK5-(PRO 코딩 DNA) 약 10 ㎍을 VA RNA 유전자를 코딩하는 DNA(Thimmappaya et al., Cell, 31: 543(1982)) 약 1 ㎍과 혼합하여, 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA 및 0.227 M CaCl2500 ㎕에 용해시켰다. 이 혼합물에 50 mM HEPES(pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO4500 ㎕를 적가하여 25℃에서 10분간 침전물을 형성시켰다. 침전물을 현탁시키고 293 세포에 가하여 37℃에서 4시간 가량을 정치시켰다. 배지를 흡입 제거하고 PBS 중의 20% 글리세롤 2 ㎖를 30초 동안 가하였다. 이어서, 293세포를 무혈청 배지로 세척하고 새로운 배지를 가하여 5일간 세포를 배양하였다.
형질감염 약 24시간 후에 배지를 제거하고 배지(만으로) 또는 200 μCi/㎖35S-시스테인 및 200 μCi/㎖35S-메티오닌을 포함하는 배지로 교체하였다. 12시간 배양 후, 조건화된 배지를 수집하고 회전 필터에서 농축시켜 15% SDS 겔에 로딩하였다. 처리된 겔을 건조시키고 일정 기간동안 필름에 노출시켜 PRO 폴리펩티드의 존재를 확인하였다. 형질감염된 세포를 포함하는 배양액을 추가로 배양시키고(무혈청 배지에서), 이를 선택된 생물분석법으로 시험하였다.
별법으로, 문헌(Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575(1981))에 기재된 덱스트란 술페이트 방법을 이용하여 PRO 폴리펩티드 코딩 DNA를 293 세포에 일시적으로 도입시킬 수 있었다. 293 세포를 회전 플라스크에서 최대 밀도가 되도록 배양하고 pRK5-(PRO 코딩 DNA) 700 ㎍을 가하였다. 세포를 우선 원심분리하여 회전 플라스크로부터 농축하고 PBS로 세척하였다. DNA-덱스트란 침전물을 세포 펠릿 상에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 20% 글리세롤로 90초간 처리하고 조직 배양 배지로 세척한 후, 조직 배양 배지, 5 ㎍/㎖ 소의 인슐린 및 0.1 ㎍/㎖ 소의 트랜스페린을 포함하는 회전 플라스크에 다시 넣었다. 약 4일 후에 조건화된 배지를 원심분리하고 여과시켜 세포와 파쇄물을 제거하였다. 발현된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 농축시키고, 투석 및(또는) 컬럼 크로마토그래피와 같은 선택된 방법으로 정제하였다.
다른 실시양태로, PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 CHO 세포에 발현시킬수 있다. pRK5-(PRO 코딩 DNA) 핵산은 공지된 시약, 예를 들어 CaPO4또는 DEAE 덱스트란을 이용하여 CHO 세포에 형질감염시킬 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 세포를 배양하고 배지(만으로) 또는35S-메티오닌과 같은 방사선 표지를 포함하는 배지로 배양액을 교체하였다. PRO 폴리펩티드의 존재를 확인한 후, 배양 배지를 무혈청 배지로 교체하였다. 바람직하게는 6일 가량 배양물을 배양한 후에 조건화된 배지를 회수한다. 발현된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 배지를 농축시켜 선택된 방법으로 정제하였다.
또한, 에피토프 태그가 부착된 PRO 폴리펩티드를 CHO 숙주세포에서 발현시킬 수 있다. PRO 폴리펩티드 코딩 유전자는 pRK5 벡터로부터 서브클로닝될 수 있다. 서브클론의 삽입체는 PCR을 통해 폴리-His 태그와 같은 선택된 에피토프 태그를 갖는 형태로 번역 프레임에 맞게 배큘로바이러스 발현 벡터에 결합될 수 있다. 폴리-His 태그가 부착된 PRO 폴리펩티드 코딩 유전자의 삽입체는 안정한 클론의 선별을 위한 DHFR과 같은 선택 마커를 포함하는 SV40 유도 벡터로 서브클로닝될 수 있다. 최종적으로, CHO 세포는 (상기에서와 같이) SV40 유도 벡터로 형질감염될 수 있다. 발현을 확인하기 위해서 상기와 같은 방법으로 표지시킬 수 있다. 이어서, 폴리-His 태그가 부착되어 발현된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 배양 배지를 농축시켜 Ni2+-킬레이트 친화 크로마토그래피와 같이 선택된 방법으로 정제할 수 있다.
PR0172, PR0178, PR0179, PR0182, PR0188, PR0212, PR0214, PR0216, PR0217,PR0224, PR0245, PR0261, PR0301, PR0356, PR0364, PR0713, PR0788, PR0792, PR0865, PRO1126, PRO1130, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1376 및 PRO 1387은 상기 기재된 방법에 의해 CHO 세포에서 안정하게 발현되었다. 또한, PRO172, PRO178, PRO182, PRO231, PRO245, PR0301, PR0356 및 PR0364는 일시적 절차에 의해 CHO 세포에서 발현되었다.
실시예 66: 효모에서 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산의 발현
하기 방법은 효모에서 PRO 폴리펩티드 코딩 유전자의 재조합 발현을 기재하고 있다.
우선, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 PRO 폴리펩티드의 세포내 생산 또는 분비를 위한 효모 발현 벡터를 제조하였다. PRO 폴리펩티드 코딩 DNA 및 프로모터를 PRO 폴리펩티드의 세포내 발현을 위해 선택된 플라스미드의 적합한 제한 효소 부위에 삽입하였다. 분비의 경우에는 PRO 폴리펩티드 코딩 DNA의 발현을 위해, ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 PRO 폴리펩티드 신호 펩티드 및 다른 포유동물의 신호 펩티드(예를 들어, 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비 신호/리더 서열), 및 링커 서열(필요한 경우)을 코딩하는 DNA와 함께 PRO 폴리펩티드 코딩 DNA를 선택된 플라스미드에 클로닝할 수 있다.
이어서, 효모 세포, 예를 들어 효모 균주 AB110을 상기 기재된 발현 플라스미드로 형질전환시키고 선택된 발효 배지에서 배양할 수 있다. 형질전환된 효모 상층액을 10% 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분리한 후 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 분석할 수 있다.
이후에, 원심분리에 의해 발효 배지로부터 효모 세포를 회수하고 선택된 카트리지 필터를 이용하여 배지를 농축시켜 재조합 PRO 폴리펩티드를 단리하고 정제할 수 있다. PRO 폴리펩티드를 함유하는 농축액을 선택된 컬럼 크로마토그래피 수지를 이용하여 추가로 정제할 수 있다.
실시예 67: 배큘로바이러스 감염 곤충 세포에서 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산의 발현
다음 방법은 배큘로바이러스로 감염된 곤충 세포 내에서의 재조합 발현에 대하여 기재하고 있다.
PRO 폴리펩티드의 코딩 서열을 배큘로바이러스 발현 벡터에 포함된 에피토프 태그의 상류에 결합시켰다. 이러한 에피토프 태그에는 폴리-His 태그 및 면역글로블린 태그(IgG의 Fc 영역과 같이)가 포함된다. 시판되는 플라스미드, 예를 들어 pVL1393(Novagen)에서 유도된 플라스미드를 포함하는 다양한 플라스미드를 사용할 수 있다. 간략하게, PRO 폴리펩티드를 코딩하는 서열이나 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 원하는 부분(예를 들어, 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 세포외 단백질의 경우에 성숙 단백질 코딩하는 서열)을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 5' 프라이머는 인접한 (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 이어서, 생성물을 선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝하였다.
리포펙틴(GIBCO-BRL로부터 구입)을 이용하여, 상기 플라스미드 및 배큘로골드 (상표명) (BaculoGold™) 바이러스 DNA (Phamingen)를 스포도프테라 프루기페르다 ("Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711)에 동시 형질감염시켜 재조합 배큘로바이러스를 생성하였다. 28℃에서 4 내지 5일 배양 후에, 방출된 바이러스를 회수하여 이후의 증폭에 사용한다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 문헌(O'Reilley et al., Baculovirus Expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994))에 따라 수행하였다.
이어서, 폴리-His 태그가 부착되어 발현된 PRO 폴리펩티드는, 예를 들어 Ni2+-킬레이트 친화 크로마토그래피로 하기와 같이 정제될 수 있다. 문헌(Rupert et al., Nature, 362: 175-179(1993))에 따라 재조합 바이러스-감염된 Sf9 세포로부터 추출액을 제조한다. 간략하게, Sf9 세포를 세척하여 초음파 처리 완충액 (25 ㎖ Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl2; 0.1 mM EDTA; 10% 글리세롤; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁시키고 얼음에서 20초간 2회 초음파 처리하였다. 초음파 처리물을 원심분리로 투명하게하고, 상층액을 로딩 완충액(50 mM 인산, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.8)에 50배 희석하여 0.45 ㎛ 필터로 여과시켰다. Ni2+-NTA 아가로즈 컬럼(Qiagen으로부터 구입)을 5 ㎖ 충진 부피로 제조하여 물 25 ㎖로 세척하고 로딩 완충액 25 ㎖로 평형화시켰다. 여과된 세포 추출물을 분당 0.5 ㎖로 컬럼에 로딩하였다. 로딩 완충액으로 A280기준선까지 컬럼을 세척하고, 이 시점에서 분획을 회수하기 시작하였다. 다음으로, 2차 세척 완충액(50 mM 인산염; 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 6.0)으로 컬럼을 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시켰다. A280이 기준선에 다시 도달하면, 컬럼을 2차 세척 완충액 중의 0 내지 500 mM 이미다졸 구배로 전개시켰다. 1 ㎖ 분획을 회수하여 SDS-PAGE 및 은 염색하거나 알카리 포스파타제에 결합된 Ni2+-NTA(Qiagen)로 웨스턴 블롯팅하여 분석하였다. 용출된 His10태그된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 분획을 모아 로딩 완충액에 대해 투석하였다.
별법으로, IgG 태그된 (또는 Fc 태그된) PRO 폴리펩티드의 정제는 공지된 크로마토그래피 기술, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 수행할 수 있다.
배큘로바이러스에 감염된 Sf9 곤충 세포에서 PRO187, PRO195, PRO224, PRO301, PRO364, PRO713, PRO788, PRO1274, PRO1286, PRO1303, PRO1319, PRO1313 및 PRO1376을 발현시켰다. 발현은 실제로 0.5 내지 2 L 규모로 수행되기는 했지만, 더 큰 제조 규모(예를 들어, 8 L)로 용이하게 규모를 키울 수 있다. 이들 단백질은, 단백질의 세포외 영역이 힌지, CH2 및 CH2 도메인을 포함하는 IgG1 불변 영역 서열에 결합된 IgG 구조체 (이뮤노어드헤신)로서 발현 및(또는) 폴리-His 태그가 부착된 형태로 발현되었다.
PCR 증폭 후에, 각각의 코딩 서열을 배큘로바이러스 발현 벡터(IgG 결합 단백질의 경우 pb.PH.IgG, 폴리-His 태그된 단백질의 경우 pb.PH.His.c)에 서브클로닝한 후, 리포펙틴(Gibco BRL)을 이용하여 이 벡터 및 배큘로골드(상표명) 배큘로바이러스 DNA(Pharmingen)를 105 스포도프테라 프루기페르다("Sf9") 세포(ATCC CRL1711)에 동시 형질감염시켰다. pb.PH.IgG 및 pb.PH.His.c는 상업적으로 시판되는 pVL1393 배큘로바이러스 발현 벡터(Pharmingen)를 His 또는 Fc 태그 영역이 포함되도록 변형시킨 벡터이다. 10% FBS가 포함된 힝크(Hink's) TNM-FH 배지(Hyclone)에서 세포를 배양하였다. 세포를 28℃에서 5일 동안 배양하였다. 상층액을 회수하여, 감염 다중성(MOI)이 약 10이 되도록 10% FBS가 포함된 힝크 TNM-FH 배지에서 Sf9 세포를 감염시킴으로써 수행되는 1차 바이러스 증폭에 이를 사용하였다. 세포를 28℃에서 3일 동안 배양하였다. 상층액을 회수하고, 히스티딘 태그된 단백질의 경우 Ni2+-NTA 비드(QIAGEN) 또는 IgG 태그된 단백질의 경우 단백질-A 세파로스 CL-4B 비드(Pharmacia) 25 ㎖에 상층액 1 ㎖을 배치 결합시킨 후에 쿠마시 블루 염색에 의해 알려진 농도의 단백질 표준과 비교하는 SDS-PAGE 분석에 의해 배큘로바이러스 발현 벡터 내 구조물의 발현을 확인하였다.
1차 바이러스 증폭 상층액을 사용하여, ESF-921 배지(Expression Systems LLC)가 들어있는 회전 플라스크 중의 Sf9 세포 배양액(500 ㎖)을 MOI 약 0.1로 감염시켰다. 세포를 28℃에서 3일 동안 배양하였다. 상층액을 회수하여 여과하였다. 필요한 경우, 회전 플라스크 배양액의 발현이 확인될 때까지 배치 결합 및 SDS-PAGE 분석을 반복하였다.
형질감염된 세포로부터의 조건화된 배지(0.5 내지 3 L)를 원심분리에 의해 회수하여 세포를 제거한 후, 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 폴리-His 태그된 구조물의 경우, Ni2+-NTA 컬럼(Qiagen)을 이용하여 단백질을 정제하였다. 정제하기 전에이미다졸을 5 mM 농도로 조건화된 배지에 가하였다. 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes, pH 7.4 완충액으로 평형화된 Ni-NTA 컬럼 6 ㎖에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 조건화된 배지를 주입하였다. 로딩 후에 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고, 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 단백질을 용출하였다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 25 ㎖의 G25 슈퍼파인(Pharmacia) 컬럼을 통해 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 완충액(pH 6.8)중으로 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.
조건화된 배지로부터 이뮤노어드헤신(Fc 포함) 구조물을 하기와 같이 정제하였다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.8)으로 평형화된 단백질 A 컬럼(Pharmacia) 5 ㎖에 주입하였다. 로딩 후, 컬럼을 평형 완충액으로 세척하고 100 mM 시트르산(pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎕의 1 M Tris 완충액(pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 폴리-His 태그된 단백질의 경우에 대해 상기 기재된 바와 같이 저장 완충액(pH 6.8) 중으로 염을 제거하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔(PAG) 전기영동과 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석으로 단백질의 균일함을 확인하였다.
별법으로, 하이-5(high-5) 세포에 혼입시키는 변형된 배큘로바이러스 방법을 이용할 수 있다. 이 방법에서는 원하는 서열을 코딩하는 DNA를 Pfu(Stratagene)과 같은 적합한 시스템으로 증폭시키거나, 배큘로바이러스 발현 벡터에 포함된 에피토프 태그의 (5') 상류에 결합시켰다. 이러한 에피토프 태그에는 폴리-His 태그 및면역글로불린 태그(예를 들어, IgG의 Fc 영역)가 포함된다. pIE1-1(Novagen)과 같이 상업적으로 시판되는 플라스미드에서 유도된 것을 포함하는 다양한 벡터가 사용될 수 있다. pIE1-1및 pIE1-2 벡터는 안정하게 형질전환된 곤충 세포에서 배큘로바이러스 ie1 프로모터로부터 재조합 단백질이 구성적으로 발현되도록 고안된 것이다. 이 플라스미드는 단지 다중 클로닝 부위의 방향만 다르고, 비감염 곤충 세포에서 ie1-매개 유전자 발현에 중요한 것으로 알려진 모든 프로모터 서열 및 hr5 인핸서를 포함하고 있다. pIE1-1및 pIE1-2는 번역 개시 부위를 포함하기 때문에 결합 단백질의 제조에 사용될 수 있다. 간략하게, 원하는 서열 또는 원하는 서열의 부분(예를 들어, 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열)을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 5' 프라이머는 인접한 (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 이어서, 생성물을 선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 예를 들어, pIE1-1의 유도체는 원하는 서열의 (3') 하류에 인간 IgG의 Fc 영역(pb.PH.IgG) 또는 8개의 히스티딘(pb.PH.His) 태그를 포함할 수 있다.
하이-5 세포를 CO2, 페니실린 및 스트렙토마이신이 없는 27℃의 조건하에서 50%가 채워지도록 배양하였다. 각각의 150 mm 플레이트에 사용하기 위해, 원하는 서열을 포함하는 pIE 기재의 벡터 30㎍을 Ex-세포 배지(배지: Ex-Cell 401 + 1/100 L-Glu, JHR Biosciences #14401-78P, 주의: 이 배지는 빛에 민감함) 1 ㎖과 혼합하고, 별도의 튜브에 셀펙틴(CellFECTIN, Gibco BRL #10362-010) 100㎕를 Ex-세포 배지 1 ㎖과 혼합(볼텍싱으로 혼합)하였다. 상기 2가지 용액을 혼합하여 상온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. Ex-세포 배지 8 ㎖을 DNA와 셀펙틴의 혼합물 2 ㎖에 가하고, 이를 미리 Ex-세포 배지로 1회 세척된 하이-5 세포에 가하였다. 이어서, 플레이트를 어두운 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. DNA와 셀펙틴의 혼합물을 흡입 제거하고, 세포를 Ex-세포 배지로 1회 세척하여 과량의 셀펙틱을 제거한 후, 신선한 Ex-세포 배지 30 ㎖을 가하고 세포를 28℃에서 3일 동안 배양하였다. 상층액을 회수하고, 히스티딘 태그된 단백질의 경우 Ni2+-NTA 비드(QIAGEN) 또는 IgG 태그된 단백질의 경우 단백질-A 세파로스 CL-4B 비드(Pharmacia) 25 ㎖에 상층액 1 ㎖을 배치 결합시킨 후에 쿠마시 블루 염색에 의해 알려진 농도의 단백질 표준과 비교하는 SDS-PAGE 분석에 의해 배큘로바이러스 발현 벡터 내 서열의 발현을 측정하였다.
형질감염된 세포로부터의 조건화된 배지(0.5 내지 3 L)를 원심분리에 의해 회수하여 세포를 제거한 후, 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 폴리-His 태그된 구조물의 경우, Ni2+-NTA 컬럼(Qiagen)을 이용하여 단백질을 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조건화된 배지에 가하였다. 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes, pH 7.4 완충액으로 평형화된 Ni-NTA 컬럼 6 ㎖에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 조건화된 배지를 주입하였다. 로딩 후에 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고, 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 단백질을 용출하였다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 25 ㎖의 G25슈퍼파인(Pharmacia) 컬럼을 통해 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 완충액(pH 6.8)중으로 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.
조건화된 배지로부터 이뮤노어드헤신(Fc 포함) 구조물을 하기와 같이 정제하였다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.8)으로 평형화된 단백질 A 컬럼(Pharmacia) 5 ㎖에 주입하였다. 로딩 후, 컬럼을 평형 완충액으로 세척하고 100 mM 시트르산(pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎕의 1 M Tris 완충액(pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 폴리-His 태그된 단백질의 경우에 대해 상기 기재된 바와 같이 저장 완충액 중으로 염을 제거하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔, 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석, 및 원하거나 필요한 경우 기타 분석 방법으로 단백질의 균일함을 확인하였다.
하이-5 세포를 포함하는 상기 변형된 배큘로바이러스 방법에 의해 PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO212, PRO216, PRO217, PRO224, PRO231, PR0235, PR0269, PR0287, PRO301, PRO323, PR0331, PR0356, PR0364, PR0526, PR0538, PR0713, PR0771, PR0788, PR0792, PR0812, PRO865, PRO1075, PRO1154, PRO1244, PRO1286, PRO1304, PRO1312, PRO1376, PRO1387 및 PRO1561을 성공적으로 발현하였다.
실시예 68: PRO 폴리펩티드에 결합하는 항체의 제조
본 실시예는 PRO 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 제조하는 방법을 예시한다.
모노클로날 항체를 제조하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 상기의 문헌(Goding)에 기재되어 있다. 이용될 수 있는 면역원에는 본 발명의 정제된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 결합 단백질, 및 세포 표면에 PRO 폴리펩티드 코딩 유전자를 발현하는 세포가 포함된다. 당업계 숙련자는 불필요한 실험없이도 면역원을 선택할 수 있다.
생쥐, 예를 들어 Balb/c를 프로인트 완전 면역보강제에 유화된 PRO 폴리펩티드 면역원 1 내지 100 ㎍을 피하 또는 복강내 주사하여 면역화시켰다. 별법으로, 면역원을 MPL-TDM 면역보강제(Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT)에 유화시켜 동물의 뒷발바닥에 주사하여 면역화시켰다. 이어서, 면역화된 생쥐를 10 내지 12일 후에 선택된 면역보강제 내에 유화된 추가의 면역원으로 부스팅하였다. 그 이후, 수주 동안 생쥐를 추가 면역 주사로 부스팅할 수 있다. 역회전 출혈법(retro-orbital bleeding)으로 생쥐에서 혈청 샘플을 주기적으로 채취하여, ELISA 분석법을 시험하여 항-PRO 항체를 검출하였다.
적합한 항체 타이터가 검출되면, 항체에 대해 "양성"인 동물에게 PRO 폴리펩티드를 최종 정맥주사하였다. 3 내지 4일 후에 생쥐를 희생시켜 비장 세포를 회수하였다. 이어서, 비장 세포를 선택된 쥐의 골수종 세포주, 예를 들어 ATCC CRL 1597로부터 입수가능한 P3X63AgU.1과 결합시켰다(35% 폴리에틸렌 글리콜 이용). 결합체는 비 결합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장세포 하이브리드의 증식을 억제하는 HAT 배지를 포함하는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅될 수 있는 하이브리도마 세포를 생성하였다.
하이브리도마 세포를 PRO 폴리펩티드에 대한 반응성을 위한 ELISA로 스크리닝할 수 있다. PRO 폴리펩티드에 대한 목적하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포를 결정하는 방법은 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다.
양성 하이브리도마 세포는 동계의 Balb/c 생쥐가 항-PRO 모노클로날 항체를 포함하는 복수를 생산하도록 복강 내에 주사될 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 조직 배양 플라스크 또는 롤러 병에서 배양될 수 있다. 복수 내에서 생성된 모노클로날 항체는 황산암모늄 침전에 이은 겔 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다. 별법으로, 항체의 단백질 A 또는 단백질 G 결합을 기초로 하는 친화 크로마토그래피를 이용할 수도 있다.
물질의 기탁:
다음 물질들은 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁되었다.
물질 ATCC 기탁번호 기탁일
DNA35916-1161 209419 1997년 10월 28일
DNA23339-1130 209282 1997년 9월 18일
DNA16451-1388 209776 1998년 4월 14일
DNA27865-1091 209296 1997년 9월 23일
DNA27864-1155 209375 1997년 10월 16일
DNA28497-1130 209279 1997년 9월 18일
DNA26847-1395 209772 1998년 4월 14일
DNA30942-1134 209254 1997년 9월 16일
DNA32286-1191 209385 1997년 10월 16일
DNA33094-1131 209256 1997년 9월 16일
DNA33221-1133 209263 1997년 9월 16일
DNA34434-1139 209252 1998년 9월 16일
DNA35558-1167 209374 1997년 10월 16일
DNA35638-1141 209265 1997년 9월 16일
DNA33473-1176 209391 1997년 10월 17일
DNA38260-1180 209397 1997년 10월 17일
DNA39969-1185 209400 1997년 10월 17일
DNA40628-1216 209432 1997년 11월 7일
DNA35595-1228 209528 1997년 12월 10일
DNA40981-1234 209439 1997년 11월 7일
DNA47470-1130-P1 209422 1997년 10월 28일
DNA47365-1206 209436 1997년 11월 7일
DNA44184-1319 209704 1998년 3월 26일
DNA48613-1268 209752 1998년 4월 7일
DNA29101-1122 209653 1998년 3월 5일
DNA49646-1327 209705 1998년 3월 26일
DNA49829-1346 209749 1998년 4월 7일
DNA56405-1357 209849 1998년 5월 6일
DNA56352-1358 209846 1998년 5월 6일
DNA59205-1421 203009 1998년 6월 23일
DNA53974-1401 209774 1998년 4월 14일
DNA57689-1385 209869 1998년 5월 14일
DNA60615-1483 209980 1998년 6월 16일
DNA59814-1486 203359 1998년 10월 28일
DNA59846-1503 209978 1998년 6월 16일
DNA64883-1526 203253 1998년 9월 9일
DNA64885-1529 203457 1998년 11월 3일
DNA64889-1541 203250 1998년 9월 9일
DNA64903-1553 203223 1998년 9월 15일
DNA64905-1558 203233 1998년 9월 15일
DNA65409-1566 203232 1998년 9월 15일
DNA65406-1567 203219 1998년 9월 15일
DNA61873-1574 203132 1998년 8월 18일
DNA64966-1575 203575 1999년 1월 12일
DNA67300-1605 203163 1998년 8월 25일
DNA68872-1620 203160 1998년 8월 25일
DNA76538-1670 203313 1998년 10월 6일
DNA33087 203381 1997년 10월 16일
기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙(부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크 인크와 ATCC 사이 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시(이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙(37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.
본 출원의 양수인은 적합한 조건하에서 배양시 기탁 물질의 배양물이 사멸하거나 손실되거나 파손된 경우, 이를 통지하면 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임을 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
앞서 기술한 명세서는 당업계의 숙련인이 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 기탁된 실시양태가 본 발명의 특정 측면의 한 예시로서 의도되는 것이므로 본 발명은 기탁된 구조물의 범위에 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 임의의 구조물은 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 본 발명의 최선의 양식을 포함한 임의의 측면을 실시하기에 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허 청구 범위의 범위를 명세서에서 나타내는 구체적인 설명에 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 실제로, 앞서의 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 당업계 숙련자에게는 명백하고, 이는 첨부된 특허 청구의 범위 내에 있을 것이다.

Claims (81)

  1. 제약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 치료 유효량의 상기 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제를 포함하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 아고니스트가 항-PRO172, 항-PRO178, 항-PRO179, 항-PRO182, 항-PRO187, 항-PRO188, 항-PRO195, 항-PRO212, 항-PRO214, 항-PRO217, 항-PRO224, 항-PRO231, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO261, 항-PRO269, 항-PRO287, 항-PRO301, 항-PRO323, 항-PRO331, 항-PRO356, 항-PRO364, 항-PRO526, 항-PRO538, 항-PRO713, 항-PRO719, 항-PRO771, 항-PRO788, 항-PRO792, 항-PRO812, 항-PRO865, 항-PRO1075, 항-PRO1126, 항-PRO1130, 항-PRO1154, 항-PRO1244, 항-PRO1246, 항-PRO1274, 항-PRO1286, 항-PRO1294, 항-PRO1303, 항-PRO1304, 항-PRO1312, 항-PRO1313, 항-PRO1376, 항-PRO1387, 항-PRO1561 또는 항-PRO216 항체인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 길항제가 항-PRO172, 항-PRO178, 항-PRO179, 항-PRO182, 항-PRO187, 항-PRO188, 항-PRO195, 항-PRO212, 항-PRO214, 항-PRO217, 항-PRO224, 항-PRO231, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO261, 항-PRO269, 항-PRO287, 항-PRO301, 항-PRO323, 항-PRO331, 항-PRO356, 항-PRO364, 항-PRO526, 항-PRO538, 항-PRO713, 항-PRO719, 항-PRO771, 항-PRO788, 항-PRO792, 항-PRO812, 항-PRO865, 항-PRO1075, 항-PRO1126, 항-PRO1130, 항-PRO1154, 항-PRO1244, 항-PRO1246, 항-PRO1274, 항-PRO1286, 항-PRO1294, 항-PRO1303, 항-PRO1304, 항-PRO1312, 항-PRO1313, 항-PRO1376, 항-PRO1387, 항-PRO1561 또는 항-PRO216 항체인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 추가로 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 포함하는 조성물.
  6. PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313,PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제를 제약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 것을 포함하는, 제1항의 조성물의 제조 방법.
  7. (1) 제약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 (a) PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드, (b) PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드의 아고니스트, 또는 (c) PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865,PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드의 길항제를 포함하는 조성물;
    (2) 상기 조성물을 함유하는 용기; 및
    (3) 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 치료에 있어서 상기 조성물의 용도를 기재하고 있는, 상기 용기에 부착된 표지 또는 상기 용기에 포함된 포장 삽입물
    을 포함하는 제품.
  8. 제7항에 있어서, 상기 아고니스트가 항-PRO172, 항-PRO178, 항-PRO179, 항-PRO182, 항-PRO187, 항-PRO188, 항-PRO195, 항-PRO212, 항-PRO214, 항-PRO217, 항-PRO224, 항-PRO231, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO261, 항-PRO269, 항-PRO287, 항-PRO301, 항-PRO323, 항-PRO331, 항-PRO356, 항-PRO364, 항-PRO526, 항-PRO538, 항-PRO713, 항-PRO719, 항-PRO771, 항-PRO788, 항-PRO792, 항-PRO812, 항-PRO865, 항-PRO1075, 항-PRO1126, 항-PRO1130, 항-PRO1154, 항-PRO1244, 항-PRO1246, 항-PRO1274, 항-PRO1286, 항-PRO1294, 항-PRO1303, 항-PRO1304, 항-PRO1312, 항-PRO1313, 항-PRO1376, 항-PRO1387, 항-PRO1561 또는 항-PRO216 항체인 제품.
  9. 제7항에 있어서, 상기 길항제가 항-PRO172, 항-PRO178, 항-PRO179, 항-PRO182, 항-PRO187, 항-PRO188, 항-PRO195, 항-PRO212, 항-PRO214, 항-PRO217, 항-PRO224, 항-PRO231, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO261, 항-PRO269, 항-PRO287, 항-PRO301, 항-PRO323, 항-PRO331, 항-PRO356, 항-PRO364, 항-PRO526, 항-PRO538, 항-PRO713, 항-PRO719, 항-PRO771, 항-PRO788, 항-PRO792, 항-PRO812, 항-PRO865, 항-PRO1075, 항-PRO1126, 항-PRO1130, 항-PRO1154, 항-PRO1244, 항-PRO1246, 항-PRO1274, 항-PRO1286, 항-PRO1294, 항-PRO1303, 항-PRO1304, 항-PRO1312, 항-PRO1313, 항-PRO1376, 항-PRO1387, 항-PRO1561 또는 항-PRO216 항체인 제품.
  10. 제7항에 있어서, 상기 조성물이 제약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 치료 유효량의 상기 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제를 포함하는 것인 제품.
  11. (a) 세포와 스크리닝할 시험 화합물을 PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응의 유도에 적합한 조건 하에 접촉시키고;
    (b) 시험 화합물이 효과적인 아고니스트인지를 결정하기 위해 상기 세포 반응의 유도 (이는 시험 화합물이 효과적인 아고니스트임을 표시함)를 확인하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드의 아고니스트를 확인하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응이 세포 증식의 자극인 방법.
  13. 시험 화합물을 PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드와 그들이 상호작용할 수 있는 조건 하에서 충분한 시간동안 접촉시키고, 상기 폴리펩티드의 활성이 억제되는지를 확인하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드의 활성을 억제하는 화합물의 확인 방법.
  14. (a) 세포와 스크리닝할 시험 화합물을 PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드의 존재 하에 그에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응의 유도에 적합한 조건 하에서 접촉시키는 단계; 및
    (b) 시험 화합물이 효과적인 길항제인지를 결정하기 위해 상기 세포 반응의 유도를 확인하는 단계를 포함하는, 상기 폴리펩티드의 활성을 억제하는 화합물의 확인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응이 세포 증식의 자극인 방법.
  16. 세포와 시험 화합물을 PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126,PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드를 발현시키기에 적합한 조건 하에 접촉시키고, 상기 폴리펩티드의 발현이 억제되는지를 확인하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드를 정상적으로 발현하는 세포에서 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물의 확인 방법.
  17. PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드의 아고니스트.
  18. PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드의 길항제.
  19. PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드를 발현하는 포유동물 세포에서 상기 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물.
  20. 제19항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드인 화합물.
  21. PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체.
  22. 제21항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  23. 제21항에 있어서, 항체 단편인 항체.
  24. 제21항에 있어서, 단일쇄 항체인 항체.
  25. PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드-코딩 핵산 서열에서 돌연변이의 존재 또는 부재 (이는 돌연변이와 관련된 질환 또는 이 질환에 대한 감수성의 존재 또는 부재를 표시함)를 확인하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드-코딩 핵산 서열의 돌연변이와 관련된 질환 또는 이 질환에 대한 감수성의 진단 방법.
  26. (a) 포유동물로부터 수득한 조직 세포의 시험 샘플 및 (b) 동일한 세포 유형의 공지된 정상 조직세포의 대조 샘플에서 PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는PRO216 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현도 (대조 샘플과 비교하여 상기 포유동물로부터 수득한 조직 세포의 시험 샘플에서의 보다 높은 발현 또는 보다 낮은 발현은 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 존재의 표시임)를 분석하는 것을 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 진단 방법.
  27. 포유동물로부터 수득한 조직 세포의 시험 샘플에서 PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드의 존재 또는 부재 (상기 시험 샘플에서 상기 폴리펩티드의 존재 또는 부재는 포유동물에서 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 존재의 표시임)를 검출하는 것을 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 진단 방법.
  28. (a) 포유동물로부터 수득한 조직 세포의 시험 샘플과 항-PRO172, 항-PRO178, 항-PRO179, 항-PRO182, 항-PRO187, 항-PRO188, 항-PRO195, 항-PRO212, 항-PRO214, 항-PRO217, 항-PRO224, 항-PRO231, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO261, 항-PRO269,항-PRO287, 항-PRO301, 항-PRO323, 항-PRO331, 항-PRO356, 항-PRO364, 항-PRO526, 항-PRO538, 항-PRO713, 항-PRO719, 항-PRO771, 항-PRO788, 항-PRO792, 항-PRO812, 항-PRO865, 항-PRO1075, 항-PRO1126, 항-PRO1130, 항-PRO1154, 항-PRO1244, 항-PRO1246, 항-PRO1274, 항-PRO1286, 항-PRO1294, 항-PRO1303, 항-PRO1304, 항-PRO1312, 항-PRO1313, 항-PRO1376, 항-PRO1387, 항-PRO1561 또는 항-PRO216 항체를 접촉시키고, (b) 상기 항체와 상기 시험 샘플 중 PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드 사이의 결합체 형성을 검출하는 것 (상기 결합체의 형성은 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 존재의 표시임)을 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 진단하는 방법.
  29. PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313,PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 항-PRO172, 항-PRO178, 항-PRO179, 항-PRO182, 항-PRO187, 항-PRO188, 항-PRO195, 항-PRO212, 항-PRO214, 항-PRO217, 항-PRO224, 항-PRO231, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO261, 항-PRO269, 항-PRO287, 항-PRO301, 항-PRO323, 항-PRO331, 항-PRO356, 항-PRO364, 항-PRO526, 항-PRO538, 항-PRO713, 항-PRO719, 항-PRO771, 항-PRO788, 항-PRO792, 항-PRO812, 항-PRO865, 항-PRO1075, 항-PRO1126, 항-PRO1130, 항-PRO1154, 항-PRO1244, 항-PRO1246, 항-PRO1274, 항-PRO1286, 항-PRO1294, 항-PRO1303, 항-PRO1304, 항-PRO1312, 항-PRO1313, 항-PRO1376, 항-PRO1387, 항-PRO1561 또는 항-PRO216 항체와 접촉시키고, 상기 샘플의 성분과 상기 항체의 결합을 확인하는 것을 포함하는, 샘플에서 상기 폴리펩티드의 존재를 확인하는 방법.
  30. 적당한 포장 내에 항-PRO172, 항-PRO178, 항-PRO179, 항-PRO182, 항-PRO187, 항-PRO188, 항-PRO195, 항-PRO212, 항-PRO214, 항-PRO217, 항-PRO224, 항-PRO231, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO261, 항-PRO269, 항-PRO287, 항-PRO301, 항-PRO323, 항-PRO331, 항-PRO356, 항-PRO364, 항-PRO526, 항-PRO538, 항-PRO713, 항-PRO719, 항-PRO771, 항-PRO788, 항-PRO792, 항-PRO812, 항-PRO865, 항-PRO1075, 항-PRO1126, 항-PRO1130, 항-PRO1154, 항-PRO1244, 항-PRO1246, 항-PRO1274, 항-PRO1286, 항-PRO1294, 항-PRO1303, 항-PRO1304, 항-PRO1312, 항-PRO1313, 항-PRO1376, 항-PRO1387, 항-PRO1561 또는 항-PRO216 항체 및 담체를 포함하는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환용 진단 키트.
  31. 치료 유효량의 PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 치료하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 인간이 심근경색증을 앓는 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 인간이 심비대증, 외상, 암 또는 연령-관련 황반퇴화증을 앓는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 심비대증이 고농도의 PGF2α의 존재에 의해 특징지워지는 것인 방법.
  36. 제31항에 있어서, PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드가 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관형성제와 함께 투여되는 것인 방법.
  37. 제34항에 있어서, PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드가 1차 혈관성형술 후에 투여되는 것인 방법.
  38. 제31항에 있어서, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환이 암인 방법.
  39. 제38항에 있어서, PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드가 화학요법제, 성장 억제제 또는 세포독성제와의 조합으로 투여되는 것인 방법.
  40. 제31항에 있어서, 상기 아고니스트가 항-PRO172, 항-PRO178, 항-PRO179, 항-PRO182, 항-PRO187, 항-PRO188, 항-PRO195, 항-PRO212, 항-PRO214, 항-PRO217, 항-PRO224, 항-PRO231, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO261, 항-PRO269, 항-PRO287, 항-PRO301, 항-PRO323, 항-PRO331, 항-PRO356, 항-PRO364, 항-PRO526, 항-PRO538, 항-PRO713, 항-PRO719, 항-PRO771, 항-PRO788, 항-PRO792, 항-PRO812, 항-PRO865, 항-PRO1075, 항-PRO1126, 항-PRO1130, 항-PRO1154, 항-PRO1244, 항-PRO1246, 항-PRO1274, 항-PRO1286, 항-PRO1294, 항-PRO1303, 항-PRO1304, 항-PRO1312, 항-PRO1313, 항-PRO1376, 항-PRO1387, 항-PRO1561 또는 항-PRO216 항체인 방법.
  41. 제31항에 있어서, 상기 길항제가 항-PRO172, 항-PRO178, 항-PRO179, 항-PRO182, 항-PRO187, 항-PRO188, 항-PRO195, 항-PRO212, 항-PRO214, 항-PRO217, 항-PRO224, 항-PRO231, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO261, 항-PRO269, 항-PRO287, 항-PRO301, 항-PRO323, 항-PRO331, 항-PRO356, 항-PRO364, 항-PRO526, 항-PRO538, 항-PRO713, 항-PRO719, 항-PRO771, 항-PRO788, 항-PRO792, 항-PRO812, 항-PRO865, 항-PRO1075, 항-PRO1126, 항-PRO1130, 항-PRO1154, 항-PRO1244, 항-PRO1246, 항-PRO1274, 항-PRO1286, 항-PRO1294, 항-PRO1303, 항-PRO1304, 항-PRO1312, 항-PRO1313, 항-PRO1376, 항-PRO1387, 항-PRO1561 또는 항-PRO216 항체인 방법.
  42. PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제를 코딩하는 핵산 분자를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 치료하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 아고니스트가 항-PRO172, 항-PRO178, 항-PRO179, 항-PRO182, 항-PRO187, 항-PRO188, 항-PRO195, 항-PRO212, 항-PRO214, 항-PRO217, 항-PRO224, 항-PRO231, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO261, 항-PRO269, 항-PRO287, 항-PRO301, 항-PRO323, 항-PRO331, 항-PRO356, 항-PRO364, 항-PRO526, 항-PRO538, 항-PRO713, 항-PRO719, 항-PRO771, 항-PRO788, 항-PRO792, 항-PRO812, 항-PRO865, 항-PRO1075, 항-PRO1126, 항-PRO1130, 항-PRO1154, 항-PRO1244, 항-PRO1246, 항-PRO1274, 항-PRO1286, 항-PRO1294, 항-PRO1303, 항-PRO1304, 항-PRO1312, 항-PRO1313, 항-PRO1376, 항-PRO1387, 항-PRO1561 또는 항-PRO216 항체인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 길항제가 항-PRO172, 항-PRO178, 항-PRO179, 항-PRO182, 항-PRO187, 항-PRO188, 항-PRO195, 항-PRO212, 항-PRO214, 항-PRO217, 항-PRO224, 항-PRO231, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO261, 항-PRO269, 항-PRO287, 항-PRO301, 항-PRO323, 항-PRO331, 항-PRO356, 항-PRO364, 항-PRO526, 항-PRO538, 항-PRO713, 항-PRO719, 항-PRO771, 항-PRO788, 항-PRO792, 항-PRO812, 항-PRO865, 항-PRO1075, 항-PRO1126, 항-PRO1130, 항-PRO1154, 항-PRO1244, 항-PRO1246, 항-PRO1274, 항-PRO1286, 항-PRO1294, 항-PRO1303, 항-PRO1304, 항-PRO1312, 항-PRO1313, 항-PRO1376, 항-PRO1387, 항-PRO1561 또는 항-PRO216 항체인 방법.
  45. 제42항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
  46. 제42항에 있어서, 상기 핵산 분자가 생체외 유전자 치료법을 통해 투여되는 것인 방법.
  47. 본질적으로 (1) 프로모터, (2) PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245,PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제를 코딩하는 핵산, 및 (3) 상기 폴리펩티드의 세포 분비용 신호 서열로 구성되고, 레트로바이러스 구조 단백질과 결합되어 있는 레트로바이러스 벡터를 포함하는 재조합 레트로바이러스 입자.
  48. 레트로바이러스 구조 단백질을 발현하며, 본질적으로 (1) 프로모터, (2) PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303, PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제를 코딩하는 핵산, 및 (3) 상기 폴리펩티드의 세포 분비용 신호 서열로 구성된 레트로바이러스 벡터를 포함하는 핵산 구축물을 포함하며, 구조 단백질과 결합되어 재조합 레트로바이러스 입자를 생산하도록 상기 레트로바이러스 벡터를 패키징하는 생체외 생산 세포.
  49. PRO172, PRO178, PRO179, PRO187, PRO188, PRO214, PRO216, PRO217, PRO235, PRO261, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO364, PRO538, PRO713, PRO719, PRO788, PRO812, PRO865, PRO1126, PRO1130, PRO1246, PRO1274, PRO1294, PRO1304, PRO1376 또는 PRO1387 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 내피세포 성장을 억제하는 방법.
  50. PRO179, PRO212, PRO245, PRO771, PRO1075, PRO1154, PRO1244, PRO1286, PRO1303, PRO1313, PRO1376 또는 PRO1561 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 내피세포 성장을 자극하는 방법.
  51. PRO179, PRO212, PRO245, PRO771, PRO1075, PRO1154, PRO1244, PRO1286, PRO1303, PRO1313, PRO1376 또는 PRO1561 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 내피세포 성장을 억제하는 방법.
  52. PRO172, PRO178, PRO179, PRO187, PRO188, PRO214, PRO216, PRO217, PRO235, PRO261, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO364, PRO538, PRO713, PRO719, PRO788, PRO812, PRO865, PRO1126, PRO1130, PRO1246, PRO1274, PRO1294, PRO1304, PRO1376 또는 PRO1387 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 내피세포 성장을 자극하는 방법.
  53. PRO269 또는 PRO356 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심비대증을 완화시키는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 심비대증이 심근경색증에 의해 유도된 것인 방법.
  55. PRO179, PRO182, PRO195, PRO224, PRO231, PRO526, PRO713, PRO792, PRO1246 또는 PRO1312 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심비대증을 유도하는 방법.
  56. PRO179, PRO182, PRO195, PRO224, PRO231, PRO526, PRO713, PRO792, PRO1246 또는 PRO1312 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심비대증을 완화시키는 방법.
  57. PRO269 또는 PRO356 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심비대증을 유도하는 방법.
  58. 치료 유효량의 항-PRO179, 항-PRO212, 항-PRO245, 항-PRO771, 항-PRO1075, 항-PRO1154, 항-PRO1244, 항-PRO1286, 항-PRO1303, 항-PRO1313, 항-PRO1376 또는 항-PRO1561 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 PRO179, PRO212, PRO245, PRO771, PRO1075, PRO1154, PRO1244, PRO1286, PRO1303, PRO1313,PRO1376 또는 PRO1561 폴리펩티드에 의해 유도된 혈관신생을 억제하는 방법.
  59. 치료 유효량의 PRO179, PRO212, PRO245, PRO771, PRO1075, PRO1154, PRO1244, PRO1286, PRO1303, PRO1313, PRO1376 또는 PRO1561 폴리펩티드를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 상기 폴리펩티드에 의해 유도된 혈관신생을 자극하는 방법.
  60. 도 2 (서열 4), 도 4 (서열 9), 도 6 (서열 14), 도 8 (서열 16), 도 10 (서열 21), 도 12 (서열 26), 도 14 (서열 31), 도 16 (서열 36), 도 18 (서열 41), 도 20 (서열 46), 도 22 (서열 51), 도 24 (서열 56), 도 26 (서열 62), 도 28 (서열 67), 도 30 (서열 72), 도 32 (서열 77), 도 34 (서열 85), 도 36 (서열 90), 도 38 (서열 98), 도 40 (서열 107), 도 42 (서열 112), 도 44 (서열 117), 도 46 (서열 127), 도 48 (서열 132), 도 50 (서열 137), 도 52 (서열 143), 도 54 (서열 148), 도 56 (서열 153), 도 58 (서열 155), 도 60 (서열 160), 도 62 (서열 162), 도 64 (서열 170), 도 66 (서열 181), 도 68 (서열 183), 도 70 (서열 191), 도 72 (서열 193), 도 74 (서열 195), 도 76 (서열 197), 도 78 (서열 199), 도 80 (서열 201), 도 82 (서열 203), 도 84 (서열 205), 도 86 (서열 214), 도 88 (서열 216), 도 90 (서열 218), 도 92 (서열 220), 도 94 (서열 222) 및 도 96 (서열 227)에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 단리된 핵산.
  61. 도 1 (서열 3), 도 3 (서열 8), 도 5 (서열 13), 도 7 (서열 15), 도 9 (서열 20), 도 11 (서열 25), 도 13 (서열 30), 도 15 (서열 35), 도 17 (서열 40), 도 19 (서열 45), 도 21 (서열 50), 도 23 (서열 55), 도 25(서열 61), 도 27 (서열 66), 도 29 (서열 71), 도 31 (서열 76), 도 33 (서열 84), 도 35 (서열 89), 도 37 (서열 97), 도 39 (서열 106), 도 41 (서열 111), 도 43 (서열 116), 도 45 (서열 126), 도 47 (서열 131), 도 49 (서열 136), 도 51 (서열 142), 도 53 (서열 147), 도 55 (서열 152), 도 57 (서열 154), 도 59 (서열 159), 도 61 (서열 161), 도 63 (서열 169), 도 65 (서열 180), 도 67 (서열 182), 도 69 (서열 190), 도 71 (서열 192), 도 73 (서열 194), 도 75 (서열 196), 도 77 (서열 198), 도 79 (서열 200), 도 81 (서열 202), 도 83 (서열 204), 도 85 (서열 213), 도 87 (서열 215), 도 89 (서열 217), 도 91 (서열 219), 도 93 (서열 221) 및 도 95 (서열 226)에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 단리된 핵산.
  62. 도 1 (서열 3), 도 3 (서열 8), 도 5 (서열 13), 도 7 (서열 15), 도 9 (서열 20), 도 11 (서열 25), 도 13 (서열 30), 도 15 (서열 35), 도 17 (서열 40), 도 19 (서열 45), 도 21 (서열 50), 도 23 (서열 55), 도 25(서열 61), 도 27 (서열 66), 도 29 (서열 71), 도 31 (서열 76), 도 33 (서열 84), 도 35 (서열 89), 도 37 (서열 97), 도 39 (서열 106), 도 41 (서열 111), 도 43 (서열 116), 도 45(서열 126), 도 47 (서열 131), 도 49 (서열 136), 도 51 (서열 142), 도 53 (서열 147), 도 55 (서열 152), 도 57 (서열 154), 도 59 (서열 159), 도 61 (서열 161), 도 63 (서열 169), 도 65 (서열 180), 도 67 (서열 182), 도 69 (서열 190), 도 71 (서열 192), 도 73 (서열 194), 도 75 (서열 196), 도 77 (서열 198), 도 79 (서열 200), 도 81 (서열 202), 도 83 (서열 204), 도 85 (서열 213), 도 87 (서열 215), 도 89 (서열 217), 도 91 (서열 219), 도 93 (서열 221) 및 도 95 (서열 226)에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 서열로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 단리된 핵산.
  63. ATCC 기탁 번호 제209419호, 제209282호, 제209776호, 제209296호, 제209375호, 제209279호, 제209772호, 제209254호, 제209385호, 제209256호, 제209263호, 제209252호, 제209374호, 제209265호, 제209391호, 제209397호, 제209400호, 제209432호, 제209528호, 제209439호, 제209422호, 제209436호, 제209704호, 제209752호, 제209653호, 제209705호, 제209749호, 제209849호, 제209846호, 제203009호, 제209774호, 제209869호, 제209980호, 제203359호, 제209978호, 제203253호, 제203457호, 제203250호, 제203223호, 제203233호, 제203232호, 제203219호, 제203132호, 제203575호, 제203163호, 제203160호, 제203313호 또는 제209381호의 DNA의 전장 코딩 서열과 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 단리된 핵산.
  64. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  65. 제64항에 있어서, 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열과 작동가능하게 결합된 벡터.
  66. 제64항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  67. 제66항에 있어서, CHO 세포인 숙주 세포.
  68. 제66항에 있어서, 대장균 (E. coli)인 숙주 세포.
  69. 제66항에 있어서, 효모 세포인 숙주 세포.
  70. 제66항에 있어서, 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포인 숙주 세포.
  71. 제66항의 숙주 세포를 PRO172, PRO178, PRO179, PRO182, PRO187, PRO188, PRO195, PRO212, PRO214, PRO217, PRO224, PRO231, PRO235, PRO245, PRO261, PRO269, PRO287, PRO301, PRO323, PRO331, PRO356, PRO364, PRO526, PRO538, PRO713, PRO719, PRO771, PRO788, PRO792, PRO812, PRO865, PRO1075, PRO1126, PRO1130, PRO1154, PRO1244, PRO1246, PRO1274, PRO1286, PRO1294, PRO1303,PRO1304, PRO1312, PRO1313, PRO1376, PRO1387, PRO1561 또는 PRO216 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하고, 상기 세포 배양물로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드의 제조 방법.
  72. 도 2 (서열 4), 도 4 (서열 9), 도 6 (서열 14), 도 8 (서열 16), 도 10 (서열 21), 도 12 (서열 26), 도 14 (서열 31), 도 16 (서열 36), 도 18 (서열 41), 도 20 (서열 46), 도 22 (서열 51), 도 24 (서열 56), 도 26 (서열 62), 도 28 (서열 67), 도 30 (서열 72), 도 32 (서열 77), 도 34 (서열 85), 도 36 (서열 90), 도 38 (서열 98), 도 40 (서열 107), 도 42 (서열 112), 도 44 (서열 117), 도 46 (서열 127), 도 48 (서열 132), 도 50 (서열 137), 도 52 (서열 143), 도 54 (서열 148), 도 56 (서열 153), 도 58 (서열 155), 도 60 (서열 160), 도 62 (서열 162), 도 64 (서열 170), 도 66 (서열 181), 도 68 (서열 183), 도 70 (서열 191), 도 72 (서열 193), 도 74 (서열 195), 도 76 (서열 197), 도 78 (서열 199), 도 80 (서열 201), 도 82 (서열 203), 도 84 (서열 205), 도 86 (서열 214), 도 88 (서열 216), 도 90 (서열 218), 도 92 (서열 220), 도 94 (서열 222) 및 도 96 (서열 227)에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단리된 폴리펩티드.
  73. 도 2 (서열 4), 도 4 (서열 9), 도 6 (서열 14), 도 8 (서열 16), 도 10 (서열 21), 도 12 (서열 26), 도 14 (서열 31), 도 16 (서열 36), 도 18 (서열 41),도 20 (서열 46), 도 22 (서열 51), 도 24 (서열 56), 도 26 (서열 62), 도 28 (서열 67), 도 30 (서열 72), 도 32 (서열 77), 도 34 (서열 85), 도 36 (서열 90), 도 38 (서열 98), 도 40 (서열 107), 도 42 (서열 112), 도 44 (서열 117), 도 46 (서열 127), 도 48 (서열 132), 도 50 (서열 137), 도 52 (서열 143), 도 54 (서열 148), 도 56 (서열 153), 도 58 (서열 155), 도 60 (서열 160), 도 62 (서열 162), 도 64 (서열 170), 도 66 (서열 181), 도 68 (서열 183), 도 70 (서열 191), 도 72 (서열 193), 도 74 (서열 195), 도 76 (서열 197), 도 78 (서열 199), 도 80 (서열 201), 도 82 (서열 203), 도 84 (서열 205), 도 86 (서열 214), 도 88 (서열 216), 도 90 (서열 218), 도 92 (서열 220), 도 94 (서열 222) 및 도 96 (서열 227)에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 비교할 때 80% 이상의 양성을 기록하는 단리된 폴리펩티드.
  74. ATCC 기탁 번호 제209419호, 제209282호, 제209776호, 제209296호, 제209375호, 제209279호, 제209772호, 제209254호, 제209385호, 제209256호, 제209263호, 제209252호, 제209374호, 제209265호, 제209391호, 제209397호, 제209400호, 제209432호, 제209528호, 제209439호, 제209422호, 제209436호, 제209704호, 제209752호, 제209653호, 제209705호, 제209749호, 제209849호, 제209846호, 제203009호, 제209774호, 제209869호, 제209980호, 제203359호, 제209978호, 제203253호, 제203457호, 제203250호, 제203223호, 제203233호, 제203232호, 제203219호, 제203132호, 제203575호, 제203163호, 제203160호, 제203313호 또는제209381호의 DNA의 전장 코딩 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단리된 폴리펩티드.
  75. 이종 아미노산 서열에 결합된, 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자.
  76. 제75항에 있어서, 상기 이종 아미노산 서열이 에피토프 태그 서열인 키메라 분자.
  77. 제75항에 있어서, 상기 이종 아미노산 서열이 이뮤노글로불린의 Fc 영역인 키메라 분자.
  78. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
  79. 제78항에 있어서, 모노클로날 항체, 인간화된 항체 또는 단일쇄 항체인 항체.
  80. (a) 결합된 신호 펩티드가 없는, 도 2 (서열 4), 도 4 (서열 9), 도 6 (서열 14), 도 8 (서열 16), 도 10 (서열 21), 도 12 (서열 26), 도 14 (서열 31), 도 16(서열 36), 도 18 (서열 41), 도 20 (서열 46), 도 22 (서열 51), 도 24 (서열 56), 도 26 (서열 62), 도 28 (서열 67), 도 30 (서열 72), 도 32 (서열 77), 도 34 (서열 85), 도 36 (서열 90), 도 38 (서열 98), 도 40 (서열 107), 도 42 (서열 112), 도 44 (서열 117), 도 46 (서열 127), 도 48 (서열 132), 도 50 (서열 137), 도 52 (서열 143), 도 54 (서열 148), 도 56 (서열 153), 도 58 (서열 155), 도 60 (서열 160), 도 62 (서열 162), 도 64 (서열 170), 도 66 (서열 181), 도 68 (서열 183), 도 70 (서열 191), 도 72 (서열 193), 도 74 (서열 195), 도 76 (서열 197), 도 78 (서열 199), 도 80 (서열 201), 도 82 (서열 203), 도 84 (서열 205), 도 86 (서열 214), 도 88 (서열 216), 도 90 (서열 218), 도 92 (서열 220), 도 94 (서열 222) 및 도 96 (서열 227)에 나타낸 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
    (b) 결합된 신호 펩티드가 있는, 도 2 (서열 4), 도 4 (서열 9), 도 6 (서열 14), 도 8 (서열 16), 도 10 (서열 21), 도 12 (서열 26), 도 14 (서열 31), 도 16 (서열 36), 도 18 (서열 41), 도 20 (서열 46), 도 22 (서열 51), 도 24 (서열 56), 도 26 (서열 62), 도 28 (서열 67), 도 30 (서열 72), 도 32 (서열 77), 도 34 (서열 85), 도 36 (서열 90), 도 38 (서열 98), 도 40 (서열 107), 도 42 (서열 112), 도 44 (서열 117), 도 46 (서열 127), 도 48 (서열 132), 도 50 (서열 137), 도 52 (서열 143), 도 54 (서열 148), 도 56 (서열 153), 도 58 (서열 155), 도 60 (서열 160), 도 62 (서열 162), 도 64 (서열 170), 도 66 (서열 181), 도 68 (서열 183), 도 70 (서열 191), 도 72 (서열 193), 도 74 (서열 195), 도 76 (서열 197), 도 78 (서열 199), 도 80 (서열 201), 도 82 (서열 203), 도 84 (서열 205), 도 86(서열 214), 도 88 (서열 216), 도 90 (서열 218), 도 92 (서열 220), 도 94 (서열 222) 및 도 96 (서열 227)에 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는
    (c) 결합된 신호 펩티드가 없는, 도 2 (서열 4), 도 4 (서열 9), 도 6 (서열 14), 도 8 (서열 16), 도 10 (서열 21), 도 12 (서열 26), 도 14 (서열 31), 도 16 (서열 36), 도 18 (서열 41), 도 20 (서열 46), 도 22 (서열 51), 도 24 (서열 56), 도 26 (서열 62), 도 28 (서열 67), 도 30 (서열 72), 도 32 (서열 77), 도 34 (서열 85), 도 36 (서열 90), 도 38 (서열 98), 도 40 (서열 107), 도 42 (서열 112), 도 44 (서열 117), 도 46 (서열 127), 도 48 (서열 132), 도 50 (서열 137), 도 52 (서열 143), 도 54 (서열 148), 도 56 (서열 153), 도 58 (서열 155), 도 60 (서열 160), 도 62 (서열 162), 도 64 (서열 170), 도 66 (서열 181), 도 68 (서열 183), 도 70 (서열 191), 도 72 (서열 193), 도 74 (서열 195), 도 76 (서열 197), 도 78 (서열 199), 도 80 (서열 201), 도 82 (서열 203), 도 84 (서열 205), 도 86 (서열 214), 도 88 (서열 216), 도 90 (서열 218), 도 92 (서열 220), 도 94 (서열 222) 및 도 96 (서열 227)에 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
    과 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 단리된 핵산.
  81. (a) 결합된 신호 펩티드가 없는, 도 2 (서열 4), 도 4 (서열 9), 도 6 (서열 14), 도 8 (서열 16), 도 10 (서열 21), 도 12 (서열 26), 도 14 (서열 31), 도 16(서열 36), 도 18 (서열 41), 도 20 (서열 46), 도 22 (서열 51), 도 24 (서열 56), 도 26 (서열 62), 도 28 (서열 67), 도 30 (서열 72), 도 32 (서열 77), 도 34 (서열 85), 도 36 (서열 90), 도 38 (서열 98), 도 40 (서열 107), 도 42 (서열 112), 도 44 (서열 117), 도 46 (서열 127), 도 48 (서열 132), 도 50 (서열 137), 도 52 (서열 143), 도 54 (서열 148), 도 56 (서열 153), 도 58 (서열 155), 도 60 (서열 160), 도 62 (서열 162), 도 64 (서열 170), 도 66 (서열 181), 도 68 (서열 183), 도 70 (서열 191), 도 72 (서열 193), 도 74 (서열 195), 도 76 (서열 197), 도 78 (서열 199), 도 80 (서열 201), 도 82 (서열 203), 도 84 (서열 205), 도 86 (서열 214), 도 88 (서열 216), 도 90 (서열 218), 도 92 (서열 220), 도 94 (서열 222) 및 도 96 (서열 227)에 나타낸 폴리펩티드;
    (b) 결합된 신호 펩티드가 있는, 도 2 (서열 4), 도 4 (서열 9), 도 6 (서열 14), 도 8 (서열 16), 도 10 (서열 21), 도 12 (서열 26), 도 14 (서열 31), 도 16 (서열 36), 도 18 (서열 41), 도 20 (서열 46), 도 22 (서열 51), 도 24 (서열 56), 도 26 (서열 62), 도 28 (서열 67), 도 30 (서열 72), 도 32 (서열 77), 도 34 (서열 85), 도 36 (서열 90), 도 38 (서열 98), 도 40 (서열 107), 도 42 (서열 112), 도 44 (서열 117), 도 46 (서열 127), 도 48 (서열 132), 도 50 (서열 137), 도 52 (서열 143), 도 54 (서열 148), 도 56 (서열 153), 도 58 (서열 155), 도 60 (서열 160), 도 62 (서열 162), 도 64 (서열 170), 도 66 (서열 181), 도 68 (서열 183), 도 70 (서열 191), 도 72 (서열 193), 도 74 (서열 195), 도 76 (서열 197), 도 78 (서열 199), 도 80 (서열 201), 도 82 (서열 203), 도 84 (서열 205), 도 86(서열 214), 도 88 (서열 216), 도 90 (서열 218), 도 92 (서열 220), 도 94 (서열 222) 및 도 96 (서열 227)에 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인; 또는
    (c) 결합된 신호 펩티드가 없는, 도 2 (서열 4), 도 4 (서열 9), 도 6 (서열 14), 도 8 (서열 16), 도 10 (서열 21), 도 12 (서열 26), 도 14 (서열 31), 도 16 (서열 36), 도 18 (서열 41), 도 20 (서열 46), 도 22 (서열 51), 도 24 (서열 56), 도 26 (서열 62), 도 28 (서열 67), 도 30 (서열 72), 도 32 (서열 77), 도 34 (서열 85), 도 36 (서열 90), 도 38 (서열 98), 도 40 (서열 107), 도 42 (서열 112), 도 44 (서열 117), 도 46 (서열 127), 도 48 (서열 132), 도 50 (서열 137), 도 52 (서열 143), 도 54 (서열 148), 도 56 (서열 153), 도 58 (서열 155), 도 60 (서열 160), 도 62 (서열 162), 도 64 (서열 170), 도 66 (서열 181), 도 68 (서열 183), 도 70 (서열 191), 도 72 (서열 193), 도 74 (서열 195), 도 76 (서열 197), 도 78 (서열 199), 도 80 (서열 201), 도 82 (서열 203), 도 84 (서열 205), 도 86 (서열 214), 도 88 (서열 216), 도 90 (서열 218), 도 92 (서열 220), 도 94 (서열 222) 및 도 96 (서열 227)에 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인
    과 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단리된 폴리펩티드.
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