ES2316454T3 - Metodo de inhibicion de pap1 inducido por il-22. - Google Patents
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Abstract
Método de inhibición de la expresión inducida por IL-22 de PAP1 por células pancreáticas en un sistema que comprende dichas células, comprendiendo dicho método poner en contacto dicho sistema in vitro con un anticuerpo antagonista de IL-22 inhibiéndose de este modo dicha expresión de PAP1 por dichas células pancreáticas, en el que IL-22 es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID No. 2), con o sin el péptido señal.
Description
Método de inhibición de PAP1 inducido por
IL-22.
La presente invención se refiere generalmente a
interleuquina-22 (IL-22) y a métodos
de tratamiento de trastornos pancreáticos.
El páncreas es una gran glándula situada detrás
del estómago y cerca del duodeno. Secreta enzimas digestivos que
entran en el intestino delgado a través de un conducto. Estos
enzimas facilitan la digestión de proteínas, grasas y
carbohidratos. Además de las enzimas digestivas, el páncreas también
libera insulina y glucagón, que juegan un papel importante en el
metabolismo de los azúcares.
La pancreatitis es una enfermedad en la cual el
páncreas se inflama. El daño en el páncreas tiene lugar cuando se
activan las enzimas digestivas y comienzan a atacar la glándula. En
casos graves, puede haber hemorragia dentro de la glándula, daño de
tejido, infección y formación de quistes. Hay dos formas de
pancreatitis. Una forma aguda que aparece repentinamente y puede
ser mortal. Una forma crónica de pancreatitis puede surgir si el
paciente persiste en beber alcohol, lo cual provoca la reducción de
la función pancreática y dolor agudo y pérdida de peso. Existen
aproximadamente de 50.000 a 80.000 casos de pancreatitis aguda en
los Estados Unidos cada año. Es más común en hombres que en
mujeres.
Actualmente, el diagnóstico de la pancreatitis
es difícil. Normalmente, las pruebas de función pancreática ayudan
al médico a determinar si se están fabricando suficientes enzimas
pancreáticas. El rastreo ("scan") CAT puede determinar si
existen anormalidades en la propia glándula, tales como cálculos
biliares, que se asocian frecuentemente con este trastorno. Dado
que la pancreatitis crónica es un factor de riesgo importante para
el cáncer de páncreas, debería tratarse tan pronto como se realiza
el diagnóstico.
El páncreas está comprendido aproximadamente de
un 80% de células acinares, un 1%-2% de células islote y un 10%-15%
de células ductales cuboidales. El carcinoma de células acinares
representa el 1%-2% del carcinoma pancreático, con un 10%-15%
adicional de carcinoma pancreático comprendido de células acinares y
otros tipos de células [Nomura et al., Ultra. Path. (1992)
16:317-329]. Todas las causas de pancreatitis aguda
afectan a las células acinares de un modo que da lugar a la
activación y la retención de las enzimas digestivas, que dañan la
célula acinar y causan la liberación de citoquinas. Las citoquinas
atraen células inflamatorias, especialmente neutrófilos,
conduciendo a la secreción adicional de citoquinas. Se propone que
las moléculas inflamatorias liberadas inducen a un edema
pancreático, y necrosis local. Ciertos estudios han sugerido que
los inhibidores de citoquinas pueden mejorar la evolución de la
pancreatitis en situaciones clínicas específicas.
La interleuquina-22
(IL-22) es una citoquina recientemente identificada
producida por células T activadas y está relacionada con la
interleuquina-10 (IL-10).
IL-22 señaliza a través de un complejo receptor que
comprende CRF2-4, también conocido como
IL-10R\beta, y un nuevo miembro de la familia de
receptores de citoquinas de clase II, receptor de
interleuquina-22 (IL-22R) [Xie et
al., J. Biol. Chem. (2000) 275, 31335-31339]. De
los miembros de este complejo receptor. IL- 10R\beta se expresa
en diversos tejidos mientras que la expresión de
IL-22R está bastante restringida, con una expresión
elevada en el páncreas, sugiriendo que IL-22R
controla el sitio de acción de IL-22. Como ejemplo,
la IL-22 murina induce cambios en la expresión
génica en células acinares pancreáticas de diversos genes
incluyendo la proteína asociada a la pancreatitis (PAP1), un gen
sobreexpresado en la pancreatitis aguda [Iovanna et al, J.
Biol. Chem. (1991) 266, 24664-24669]. La
señalización de IL-22 a través de un complejo
receptor que se expresa altamente en el páncreas, sugiere que
IL-22 puede modular una respuesta
inmune/inflamatoria en el páncreas, y puede implicarse en
enfermedades del páncreas incluyendo la pancreatitis.
IL-22 se describe en WO 00/24758
y Dumontier et al. (2000) J. Immunol. 164:
1814-1819.
La presente invención se refiere a usos, tal y
como se define en las reivindicaciones, de antagonistas de
anticuerpo de polipéptido de IL-22.
En una realización adicional, tal y como se
define en las reivindicaciones, la presente invención se refiere a
un método de identificación de antagonistas a un polipéptido
IL-22 que comprende poner en contacto el
polipéptido IL-22 con una molécula candidata y
monitorizar una actividad biológica mediada por dicho polipéptido
IL-22. Preferiblemente, el polipéptido
IL-22 es un polipéptido IL-22
nativo.
Otra realización de la presente invención está
dirigida al uso de un antagonista de anticuerpo de polipéptido de
IL-22 para la preparación de un medicamento útil en
el tratamiento de un trastorno pancreático.
\newpage
En otras realizaciones, tal y como se define en
las reivindicaciones, la presente invención proporciona métodos de
detección y diagnóstico de trastornos pancreáticos mediante el
contacto de muestras biológicas sospechosas de trastornos
pancreáticos. La detección y el diagnóstico de un trastorno
pancreático en la muestra biológica pueden incluir la determinación
del nivel de expresión de IL-22, efectos de la
expresión de IL-22 en PAP-1, o el
sondeo de la muestra biológica con IL-22.
La Figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos
(SEC ID NO: 1) de un ADNc de IL-22 de secuencia
nativa, donde SEC ID NO: 1 es un clon designado en la presente
invención como "DNA125185-2906".
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
(SEC ID NO: 2) derivada de la secuencia codificante de SEC ID NO: 1
mostrada en la Figura 1.
La Figura 3 muestra transferencias Northern
sondadas con unas sonda de receptor de
interleuquina-22.
La Figura 4 muestra la expresión de ARN de
receptor de interleuquina-22 de varios tejidos
humanos tal y como se analiza mediante análisis Taqman^{TM}.
La Figura 5 muestra la activación de STAT en una
línea celular acinar pancreática estimulada con
IL-22.
La Figura 6A muestra la regulación por
incremento de ARN de Proteína Asociada a Pancreatitis
(PAP-1) en una línea celular acinar pancreática
estimulada con IL-22 tal y como se analiza mediante
transferencia Northern.
La Figura 6B muestra la regulación por
incremento de PAP1 y de ARN de Osteopontina en células acinares
pancreáticas primarias aisladas estimuladas con
IL-22 tal y como se analiza mediante transferencia
Northern.
La Figura 7 muestra la regulación por incremento
de PAP1 en páncreas in vivo utilizando ratones inyectados
con IL-22 y seguido de análisis de transferencia
Northern.
La Figura 8 muestra los niveles de producción de
interleuquina-6 (IL-6) en ratones de
tipo salvaje (WT) deficientes en receptor beta de
IL-10 (IL-10R\beta).
La Figura 9 que la expresión de PAP1 no se
regula por incremento en páncreas in vivo en ratones
deficientes en IL-10R\beta tratados con
IL-22 tal y como se analiza mediante transferencia
Northern.
La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos
del polipéptido IL-10R\beta.
La Figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos
del polipéptido IL-22R.
\vskip1.000000\baselineskip
Los términos "polipéptido
IL-22" y "IL-22" tal y como
se utilizan en la presente invención, se refieren a secuencias de
polipéptido específicas tal y como se describen en la presente
invención. Los polipéptidos IL-22 descritos en la
presente invención pueden aislarse de una variedad de fuentes, tales
como tipos de tejido humano o de otra fuente, o prepararse mediante
procedimientos recombinantes o sintéticos. Por ejemplo, las
descripciones de la preparación, purificación, derivación, formación
de anticuerpos para o contra el mismo, la administración,
composiciones que lo contienen, tratamiento de una enfermedad con,
etc., se refieren a cada polipéptido de la presente invención de
forma individual. El término "polipéptido
IL-22" también incluye variantes de los
polipéptidos IL-22 descritos en la presente
invención.
Un "polipéptido IL-22 de
secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma
secuencia de aminoácidos que el correspondiente polipéptido
IL-22 derivado de la naturaleza. Dichos polipéptidos
IL-22 de secuencia nativa se pueden aislar de la
naturaleza o pueden producirse mediante medios recombinantes o
sintéticos. El término "polipéptido IL-22 de
secuencia nativa" comprende específicamente formas secretadas o
truncadas naturales del polipéptido IL-22
específico, formas variantes naturales (por ejemplo, formas de
corte y empalme ("spliced") alternativas) y variantes alélicas
naturales del polipéptido. El polipéptido IL-22 de
secuencia nativa puede comprender los aminoácidos 1 a 179 de la
figura 2 (SEC ID No. 2) y son polipéptidos de secuencia nativa
maduros o de longitud completa que comprenden las secuencias de
aminoácidos de longitud completa. Los codones de inicio y parada se
muestran en letra negrita y están subrayadas en la figura 1 (SEC ID
No. 1). Sin embargo, aunque el polipéptido IL-2
descrito en la figura 2 (SEC ID No. 2) se muestra que empieza con
residuos de metionina designados en la presente invención como
posición 1 de los aminoácidos en la figura 2 (SEC ID No. 2), es
concebible y posible que se puedan utilizar otros residuos de
metionina situados "upstream" o "downstream" desde la
posición 1 de los aminoácidos en la figura 2 (SEC ID No. 2) como el
residuo de aminoácido de partida de los polipéptidos
IL-22.
La localización aproximada de los "péptidos
señal" de los diversos polipéptidos IL-22
descritos en la presente invención se muestra en la presente
descripción y/o las figuras que se acompañan. Sin embargo, hay que
indicar que el extremo C-terminal de un péptido
señal puede variar, pero muy probablemente por no más de
aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier parte del extremo
C-terminal del péptido señal según se ha
identificado inicialmente en la presente invención, donde el extremo
C-terminal del péptido señal se puede identificar
según el criterio utilizado habitualmente en la técnica para
identificar este tipo de elemento de secuencia de aminoácidos (por
ejemplo, Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6
(1997) y von Henje et al., Nucl. Acids. Res.
14:4683-4690 (1986)). Además, también se sabe que,
en algunos casos, la división de una secuencia señal de un
polipéptido secretado no es completamente uniforme, dando lugar a
más de una especie secretada. La presente invención también
contempla estos polipéptidos maduros, en los que el péptido señal se
divide en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier
parte del extremo C-terminal del péptido señal según
se ha identificado inicialmente en la presente invención, y los
polinucleótidos que los codifican.
La "variante de polipéptido
IL-22" significa un polipéptido
IL-22 activo tal y como se ha definido anterior o
posteriormente que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de
identidad en la secuencia de aminoácidos con una secuencia de
polipéptido IL-22 de secuencia nativa de longitud
completa tal y como se describe en la presente invención, una
secuencia de polipéptido IL-22 que carece del
péptido señal tal y como se describe en la presente invención, o
cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido
IL-22 de longitud completa tal y como se describe
en la presente invención. Entre dichas variantes de polipéptido
IL-22 se incluyen, por ejemplo, polipéptidos
IL-22 en los que uno o más residuos de aminoácidos
se añaden, o se eliminan, en el extremo N- o
C-terminal de la secuencia de aminoácidos nativa de
longitud completa. Habitualmente, una variante de polipéptido
IL-22 tendrá por lo menos aproximadamente un 80% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 82%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 84%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 86% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 88% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 90%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 92%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 94% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 96% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo
menos aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 98%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, y alternativamente por
lo menos aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de
aminoácidos a una secuencia de polipéptido IL-22 de
secuencia nativa de longitud completa con (a) los aminoácidos
aproximadamente 1 o aproximadamente 33 hasta aproximadamente 179 de
la secuencia del polipéptido IL-22 tal y como se ha
descrito en la figura 2 (SEC ID No. 2) (b) X hasta 179 de la
secuencia del polipéptido IL-22 mostrada en la
figura 2 (SEC ID No. 2), donde X es cualquier aminoácido desde 29
hasta 38 de la figura 2 (SEC ID No. 2), o (c) cualquier otro
fragmento definido específicamente de una secuencia del polipéptido
IL-22 de longitud completa tal como se muestra en
la figura 2 (SEC ID No. 2). Habitualmente, los polipéptidos
variantes de IL-22 tienen por los menos
aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, alternativamente por lo
menos aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, alternativamente
por lo menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud,
alternativamente por lo menos aproximadamente 40 aminoácidos de
longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 50
aminoácidos de longitud, alternativamente por lo menos
aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, alternativamente por lo
menos aproximadamente 70 aminoácidos de longitud, alternativamente
por lo menos aproximadamente 80 aminoácidos de longitud,
alternativamente por lo menos aproximadamente 90 aminoácidos de
longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 100
aminoácidos de longitud, alternativamente por lo menos
aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, alternativamente por
lo menos aproximadamente 200 aminoácidos de longitud,
alternativamente por lo menos aproximadamente 300 aminoácidos de
longitud, o más.
El "porcentaje (%) de identidad en la
secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias del
polipéptido IL-22 identificadas en la presente
invención se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en
una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de
aminoácidos en la secuencia específica de polipéptido
IL-22, después de la alineación de las secuencias y
la introducción de espacios, si es necesario, para conseguir el
máximo porcentaje de identidad en la secuencia, y sin considerar
ninguna sustitución conservativa como parte de identidad de la
secuencia. La alineación con el objetivo de determinar el porcentaje
de identidad en la secuencia de aminoácidos se puede conseguir de
varias maneras que están dentro de la técnica, por ejemplo,
utilizando software informático disponible públicamente, tal como
software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign
(DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar parámetros
apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo
necesario para conseguir el máximo de alineación sobre la longitud
completa de las secuencias que se comparan. Para los objetivos de
la presente invención, sin embargo, los valores en % de la identidad
en la secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa
informático de comparación de secuencias ALIGN-2,
en el que el código fuente completo para el programa
ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El
programa informático de comparación de secuencias
ALIGN-2 era de Genentech, Inc. y el código fuente
mostrado en la Tabla 1 siguiente se ha presentado con la
documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington
D.C. 20559, donde está registrado bajo el U.S. Copyright
Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está
disponible públicamente mediante Genentech Inc., South San
Francisco, California o se puede compilar a partir del código
fuente proporcionado en la Tabla 1 siguiente. El programa
ALIGN-2 debería compilarse para su utilización en
un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos
los parámetros de comparación de las secuencias son fijados por el
programa ALIGN-2 y no varían.
En las situaciones en las que se utiliza
ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de
aminoácidos, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de
una secuencia de aminoácidos determinada A a, con, o contra una
secuencia de aminoácidos determinada B (que se puede escribir
alternativamente como una secuencia de aminoácidos determinada A
que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de
aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos
determinada B) se calcula tal y como se indica a continuación:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de residuos de aminoácidos
identificados como emparejamientos idénticos por el programa de
alineación de secuencias ALIGN-2 en dicha alineación
del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de
aminoácidos en B. Se comprenderá que cuando la longitud de la
secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la
secuencia de aminoácidos B, el % de identidad en la secuencia de
aminoácidos de A a B no es igual al % de identidad en la secuencia
de aminoácidos de B a A. Como ejemplos de los cálculos del % de
identidad en la secuencia de aminoácidos utilizando este
procedimiento, las Tablas 2 y 3 demuestran cómo calcular el % de
identidad en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de
aminoácidos denominada "Proteína de comparación" con la
secuencia de aminoácidos denominada como
"IL-22", en la que "IL-22"
representa la secuencia de aminoácidos de un hipotético polipéptido
IL-22 de interés, "Proteína de comparación"
representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido contra el
que se está comparando el polipéptido "IL-22"
de interés, y "X", "Y" y "Z" representan cada uno
diferentes residuos de aminoácidos hipotéticos.
A menos que se afirme específicamente lo
contrario, todos los valores en % de identidad en la secuencia de
aminoácidos utilizados en la presente invención se obtienen tal y
como se describe en el párrafo inmediatamente anterior utilizando
el programa informático ALIGN-2. Sin embargo, los
valores en % de identidad en la secuencia de aminoácidos también se
pueden obtener tal y como se describe a continuación mediante la
utilización del programa informático
WU-BLAST-2 (Altschul et al.,
Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996). La
mayoría de los parámetros de búsqueda de
WU-BLAST-2 se fijan en los valores
por defecto. Los valores no fijados a valores por defecto, es
decir, los parámetros ajustables, se fijan según los siguientes
valores: espacio de solapamiento ("overlap span") = 1,
fracción de solapamiento ("overlap fraction") = 0,125, umbral
de palabra ("word threshold") T = 11, y matriz de puntuación
("scoring matrix") = BLOSUM 62. Cuando se utiliza
WU-BLAST-2, el valor en % de
identidad en la secuencia de aminoácidos se determina dividiendo (a)
el número de residuos de aminoácidos idénticos en el emparejamiento
entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido
IL-22 de interés que tiene una secuencia derivada
del polipéptido IL-22 nativo y la secuencia de
aminoácidos de comparación de interés (es decir, la secuencia
contra la que se compara el polipéptido IL-22 de
interés que puede ser un polipéptido variante
IL-22) según se determina por
WU-BLAST-2 entre (b) el número total
de residuos de aminoácidos del polipéptido IL-22 de
interés. Por ejemplo, en la afirmación "un polipéptido que
comprende una secuencia de aminoácidos A que tiene por lo menos un
80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de
aminoácidos de B", la secuencia de aminoácidos A es la secuencia
de aminoácidos de comparación de interés y la secuencia de
aminoácidos B es la secuencia de aminoácidos del polipéptido
IL-22 de interés.
El porcentaje de identidad en la secuencia de
aminoácidos también se puede determinar utilizando el programa de
comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul
et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402
(1997)). El programa de comparación de secuencias
NCBI-BLAST2 se puede descargar de
http://www.ncbi.nlmn.nih.gov o bien se obtiene del National
Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2
utiliza varios parámetros de búsqueda, en los que todos los
parámetros de búsqueda se fijan a valores por defecto incluyendo,
por ejemplo, desenmascarado = sí, cadena = todos, sucesos esperados
= 10, longitud mínima de baja complejidad = 15/5,
e-valor de multipaso = 0,01, constante para
multipaso = 25, caída para alineación con espacios final ("dropoff
for final gapped alignment") = 25 y la matriz de puntuación =
BLOSUM62.
En las situaciones en las que se utiliza
NCBI-BLAST2 para comparaciones de secuencias de
aminoácidos, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de
una secuencia de aminoácidos determinada A a, con, o contra una
secuencia de aminoácidos determinada B (que se puede escribir
alternativamente como una secuencia de aminoácidos determinada A
que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de
aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos
determinada B) se calcula tal y como se indica a continuación:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de residuos de aminoácidos
identificados como emparejamientos idénticos por el programa de
alineación de secuencias NCBI-BLAST2 en dicha
alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de
residuos de aminoácidos en B. Se comprenderá que cuando la longitud
de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la
secuencia de aminoácidos B, el % de identidad en la secuencia de
aminoácidos de A con B no será igual al % de identidad en la
secuencia de aminoácidos de B a A.
El "polipéptido variante
IL-22" o "secuencia de ácidos nucleicos
variante de IL-22" significa una molécula de
ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-22
activo tal y como se define a continuación y que tiene por lo menos
aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una
secuencia de polipéptido IL-22 de secuencia nativa
de longitud completa tal y como se describe en la presente
invención, una secuencia de polipéptido IL-22 de
secuencia nativa de longitud completa que carece del péptido señal
tal y como se describe en la presente invención, o cualquier otro
fragmento de una secuencia de polipéptido IL-22 de
longitud completa tal y como se describe en la presente invención.
Habitualmente, un polinucleótido variante IL-22
tendrá por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 82% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
84% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 85% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 86% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 87% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 88% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
89% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad
en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 92% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un
94% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
alternativamente por lo menos aproximadamente un 95% de identidad
en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos
aproximadamente un 96% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 97% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por
lo menos aproximadamente un 98% de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos, y alternativamente por lo menos aproximadamente un
99% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos con una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de
polipéptido IL-22 de secuencia nativa de longitud
completa tal y como se describe en la presente invención, una
secuencia de polipéptido IL-22 de secuencia nativa
de longitud completa que carece del péptido señal tal y como se
describe en la presente invención, un dominio extracelular de un
polipéptido IL-22, con o sin la secuencia del
péptido señal, tal y como se describe en la presente invención, o
cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido
IL-22 de longitud completa tal y como se describe en
la presente invención. Las variantes no comprenden la secuencia de
nucleótidos nativa.
Normalmente, los polinucleótidos variantes
IL-22 tienen por lo menos 30 nucleótidos de
longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 60
nucleótidos de longitud, alternativamente por lo menos
aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, alternativamente por lo
menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, alternativamente
por lo menos aproximadamente 150 nucleótidos de longitud,
alternativamente por lo menos aproximadamente 180 nucleótidos de
longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 210
nucleótidos de longitud, alternativamente por lo menos
aproximadamente 240 nucleótidos de longitud, alternativamente por lo
menos aproximadamente 270 nucleótidos de longitud, alternativamente
por lo menos aproximadamente 300 nucleótidos de longitud,
alternativamente por lo menos aproximadamente 450 nucleótidos de
longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 600
nucleótidos de longitud, alternativamente por lo menos
aproximadamente 900 nucleótidos de longitud, o más.
El "porcentaje (%) de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a las secuencias de
ácidos nucleicos que codifican IL-22 identificadas
en la presente invención se define como el porcentaje de
nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos con los
nucleótidos en la secuencia de ácidos nucleicos de
IL-22 de interés, después de la alineación de las
secuencias y la introducción de espacios, si es necesario, para
conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia. La
alineación con el objetivo de determinar el porcentaje de identidad
en la secuencia de ácidos nucleicos se puede conseguir de varias
maneras que están dentro de la técnica, por ejemplo, utilizando
software informático disponible públicamente, tal como software
BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Para los
objetivos de la presente invención, sin embargo, los valores en %
de la identidad en la secuencia de ácidos nucleicos se generan
utilizando el programa informático de comparación de secuencias
ALIGN-2, en el que el código fuente completo para el
programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1
siguiente. El programa informático de comparación de secuencias
ALIGN-2 era de Genentech, Inc. y el código fuente
mostrado en la Tabla 1 siguiente se ha presentado con la
documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington
D.C. 20559, donde está registrado bajo el U.S. Copyright
Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está
disponible públicamente mediante Genentech Inc., South San
Francisco, California o se puede compilar a partir del código fuente
proporcionado en la Tabla 1 siguiente. El programa
ALIGN-2 debería compilarse para su utilización en un
sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos
los parámetros de comparación de las secuencias son fijados por el
programa ALIGN-2 y no varían.
En las situaciones en las que se utiliza
ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de ácidos
nucleicos, el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de
una secuencia de ácidos nucleicos determinada C a, con, o contra
una secuencia de ácidos nucleicos determinada D (que se puede
escribir alternativamente como una secuencia de ácidos nucleicos
determinada C que tiene o comprende un cierto % de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos a, con, o contra una secuencia de
ácidos nucleicos determinada D) se calcula tal y como se indica a
continuación:
100 veces la fracción W/Z
donde W es el número de nucleótidos
identificados como emparejamientos idénticos por el programa de
alineación de secuencias ALIGN-2 en dicha
alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total de
nucleótidos en D. Se comprenderá que cuando la longitud de la
secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la
secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad en la secuencia
de ácidos nucleicos de C con D no será igual al % de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos de D con C. Como ejemplos de los
cálculos del % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
las Tablas 4 y 5 demuestran cómo calcular el % de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ácidos nucleicos
denominada como "ADN de comparación" con la secuencia de
ácidos nucleicos denominada "ADN de IL-22", en
la que "ADN de IL-22" representa una
hipotética secuencia de ácidos nucleicos que codifica
IL-22 de interés, "ADN de comparación"
representa la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido
nucleico contra la que se está comparando la molécula de ácido
nucleico "ADN de IL-22" de interés, y "N",
"L" y "V" representan cada uno diferentes nucleótidos
hipotéticos.
A menos que se afirme específicamente lo
contrario, todos los valores en % de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos utilizados en la presente invención se obtienen tal
y como se describe en el párrafo inmediatamente anterior utilizando
el programa informático ALIGN-2. Sin embargo, los
valores en % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos
también se pueden obtener tal y como se describe a continuación
mediante la utilización del programa informático
WU-BLAST-2 (Altschul et al.,
Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996)). La
mayoría de los parámetros de búsqueda de
WU-BLAST-2 se fijan a los valores
por defecto. Los valores no fijados a valores por defecto, es
decir, los parámetros ajustables, se fijan según los siguientes
valores: espacio de solapamiento ("overlap span") = 1,
fracción de solapamiento ("overlap fraction") = 0,125, umbral
de palabra ("word threshold") T = 11, y matriz de puntuación
("scoring matrix") = BLOSUM 62. Cuando se utiliza
WU-BLAST-2, el valor en % de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos se determina
dividiendo (a) el número de nucleótidos idénticos en el
emparejamiento entre la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula
de ácido nucleico que codifica el polipéptido IL-22
de interés que tiene una secuencia derivada del ácido nucleico que
codifica el polipéptido IL-22 de secuencia nativa y
la molécula de ácido nucleico de comparación de interés (es decir,
la secuencia contra la que se compara la molécula de ácido nucleico
que codifica el polipéptido IL-22 de interés que
puede ser un polipéptido variante IL-22) según se
determina por WU-BLAST-2 entre (b)
el número total de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que
codifica el polipéptido IL-22 de interés. Por
ejemplo, en la afirmación "un molécula de ácido nucleico aislada
que comprende una secuencia de ácidos nucleicos A que tiene por lo
menos un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos con la
secuencia de ácidos nucleicos B", la secuencia de ácidos
nucleicos A es la molécula de ácido nucleico de comparación de
interés y la secuencia de ácidos nucleicos B es la secuencia de
ácidos nucleicos de la molécula de ácido nucleico que codifica el
polipéptido IL-22 de interés.
El porcentaje de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos también se puede determinar utilizando el programa
de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul
et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402
(1997)). El programa de comparación de secuencias
NCBI-BLAST2 se puede descargar de
http://www.ncbi.nlmn.nih.gov o bien se obtiene del National
Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2
utiliza varios parámetros de búsqueda, en los que todos los
parámetros de búsqueda se fijan a valores por defecto incluyendo,
por ejemplo, desenmascarado = sí, cadena = todos, sucesos esperados
= 10, longitud mínima de baja complejidad = 15/5,
e-valor de multipaso = 0,01, constante para
multipaso = 25, caída para alineación con espacios final "(dropoff
for final gapped alignment)" = 25 y la matriz de puntuación =
BLOSUM62.
En las situaciones en las que se utiliza
NCBI-BLAST2 para comparaciones de secuencias, el %
de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia
de ácidos nucleicos determinada C a, con, o contra una secuencia de
ácidos nucleicos determinada D (que se puede escribir
alternativamente como una secuencia de ácidos nucleicos determinada
C que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos
determinada D) se calcula tal y como se indica a continuación:
100 veces la fracción W/Z
donde W es el número de nucleótidos
identificados como emparejamientos idénticos por el programa de
alineación de secuencias NCBI-BLAST2 en dicha
alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total de
nucleótidos en D. Se comprenderá que cuando la longitud de la
secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la
secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad en la secuencia
de ácidos nucleicos de C con D no será igual al % de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos de D con C.
Los polinucleótidos variantes de
IL-22 pueden ser moléculas de ácido nucleico que
codifican un polipéptido IL-22 activo y que son
capaces de hibridarse, preferiblemente bajo condiciones de
hibridación y lavado astringentes, a secuencias de nucleótidos que
codifican un polipéptido IL-22 de longitud completa
tal y como se describe en la presente invención. Los polipéptidos
variantes de IL-22 pueden ser aquellos que son
codificados por un polinucleótido variante de
IL-22.
El término "aislado" cuando se utiliza para
describir los diversos polipéptidos descritos en la presente
invención, significa un polipéptido que se ha identificado y
separado y/o recuperado de un componente de su medio natural. Los
componentes contaminantes de su medio natural son materiales que
habitualmente interferirían con usos diagnósticos o terapéuticos
para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros
solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones
preferidas, se purificará el polipéptido (1) hasta un grado
suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de una secuencia de
aminoácidos N-terminal o interna mediante la
utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta una
homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no
reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o,
preferiblemente, tinción con plata. El polipéptido aislado incluye
el polipéptido in situ en el interior de células
recombinantes, ya que por lo menos un componente del medio natural
del polipéptido IL-22 no estará presente.
Normalmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará
mediante por lo menos una etapa de purificación.
Un ácido nucleico "aislado" que codifica un
polipéptido IL-22 u otro ácido nucleico
"aislado" que codifica un polipéptido es una molécula de ácido
nucleico que se identifica y se separa de por lo menos una molécula
de ácido nucleico contaminante con la que está asociada normalmente
en el medio natural del ácido nucleico que codifica el polipéptido.
Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido
está en una forma o composición diferente de la que se encuentra en
la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico
aisladas que codifican los polipéptidos se distinguen de la molécula
de ácido nucleico específica que codifica el polipéptido tal y como
existen en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido
nucleico aislada que codifica un polipéptido incluye moléculas de
ácido nucleico que codifican polipéptidos contenidas en células que
normalmente expresan el polipéptido, cuando, por ejemplo, la
molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica
diferente de la de las células naturales.
El término "secuencias de control" se
refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped
particular. Las secuencias de control que son adecuadas para
procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una
secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que
las células eucariotas utilizan promotores, señales de
poliadenilación y potenciadores.
Un ácido nucleico está "unido
operativamente" cuando está situado en una relación funcional con
otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una
presecuencia o secuencia líder secretora está unido operativamente
a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que
participa en la secreción del polipéptido; un promotor o
potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si
afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a
ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si
está situado para facilitar la traducción. Generalmente, "unido
operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen
están contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora,
contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no
tienen que estar contiguos. La unión se realiza mediante la unión
en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no
existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos
sintéticos se utilizan según la práctica convencional.
El término "anticuerpo" se utiliza en el
sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo, anticuerpos
monoclonales anti-IL-22
individuales (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas, y
neutralizantes), composiciones de anticuerpo
anti-IL-22 con especificidad
poliepitópica, anticuerpos
anti-IL-22 de cadena única, y
fragmentos de anticuerpos
anti-IL-22 (ver a continuación). El
término "anticuerpo monoclonal", tal y como se utiliza en la
presente invención, se refiere a un anticuerpo obtenido de una
población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los
anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a
excepción de posibles mutaciones naturales que pueden estar
presentes en pequeñas cantidades.
La "astringencia" de las reacciones de
hibridación se puede determinar fácilmente por un experto habitual
en la materia, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de
la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la
concentración de sal. En general, sondas más largas requieren
temperaturas más elevadas para una hibridación más correcta,
mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La
hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN
desnaturalizado para rehibridarse cuando las cadenas complementarias
están presentes en un medio por debajo de su temperatura de fusión.
Cuanto mayor es el grado de homología deseada entre la sonda y la
secuencia de hibridación, mayor es la temperatura relativa que se
puede utilizar. Como resultado, se deduce que temperaturas
relativas superiores tenderían a hacer las condiciones de reacción
más astringentes, mientras que temperaturas inferiores no tanto.
Para detalles adicionales y explicaciones de la astringencia de las
reacciones de hibridación, ver Ausubel y et al., Current
Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers,
(1995).
"Condiciones astringentes" o "condiciones
de astringencia elevada", tal como se definen en la presente
invención, se pueden identificar por aquéllas que: (1) utilizan una
fuerza iónica baja y una temperatura elevada para el lavado, por
ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil
sulfato sódico al 0,1% a 50ºC; (2) utilizan durante la hibridación
un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo,
formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficol
al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato sódico 50 mM
a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o
(3) utilizan formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico
0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%,
5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50
\mug/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con
lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y
formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado de astringencia
elevada que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.
Las "condiciones moderadamente
astringentes" se pueden identificar tal y como se describen en
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen la
utilización de una solución de lavado y condiciones de hibridación
(por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos
astringentes que las descritas anteriormente. Un ejemplo de
condiciones moderadamente astringentes es la incubación durante
toda la noche a 37ºC en una solución que comprende: formamida al
20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM), fosfato sódico 50
mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%,
y ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado 20 mg/ml,
seguido del lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente
37-50ºC. El experto en la materia sabrá como ajustar
la temperatura, la fuerza iónica, etc., según sea necesario para
acomodar factores, tales como la longitud de la sonda y
similares.
El término "epítopo etiquetado", cuando se
utiliza en la presente invención, se refiere a un polipéptido
quimérico que comprende un polipéptido IL-22
fusionado a un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta
tiene residuos suficientes para proporcionar un epítopo frente al
que se puede fabricar un anticuerpo, aunque es suficientemente
corto, de manera que no interfiere en la actividad del polipéptido
al que se fusiona. El polipéptido etiqueta es también
preferiblemente bastante único, de manera que el anticuerpo no
reacciona de forma cruzada sustancialmente con otros epítopos. Los
polipéptidos etiqueta adecuados tienen generalmente por lo menos
seis residuos de aminoácidos y habitualmente entre aproximadamente 8
y 50 residuos de aminoácidos (preferiblemente, entre
aproximadamente 10 y 20 residuos de aminoácidos).
Tal y como se utiliza en la presente invención,
el término "inmunoadhesina" designa moléculas de tipo
anticuerpo que combinan la especificidad de unión de una proteína
heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de
dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las
inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de
aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es diferente
de la de reconocimiento y sitio de unión a antígeno de un
anticuerpo (es decir, es "heterólogo"), y una secuencia de
dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una
molécula de inmunoadhesina habitualmente es una secuencia de
aminoácidos contigua que comprende por lo menos el sitio de unión de
un receptor o un ligando. La secuencia del dominio constante de
inmunoglobulina en la inmunoadhesina se puede obtener a partir de
cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos
IgG-1, IgG-2, IgG-3
o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e
IgA-2), IgE, IgD o IgM.
"Activo" o "actividad" para los
objetivos de la presente invención se refiere a una forma o formas
de un polipéptido IL-22 que conservan una actividad
biológica y/o inmunológica de IL-22 nativo o
natural, donde actividad "biológica" se refiere a una función
biológica (inhibidora o estimuladora) provocada por un
IL-22 nativo o natural diferente de la capacidad de
inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico
que se encuentra en un IL-22 nativo o natural y una
actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad de inducir
la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico que se
encuentra en un IL-22 nativo o natural. Una
actividad biológica preferida es la inducción de la expresión de
PAP1. PAP1 es una proteína secretada relacionada con la familia REG
de factores tróficos y se caracterizó inicialmente como una proteína
con expresión elevada en la pancreatitis (Iovanna et al.,
(1991) J. Biol.. Chem., 266, 24664-24669). La
inyección in vivo de IL-22 dio lugar a una
inducción rápida de la expresión de PAP1 en el páncreas.
El término "antagonista" se utiliza en el
sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que parcial o
totalmente bloquea, inhibe o neutraliza una actividad biológica de
un polipéptido IL-22 nativo descrito en la presente
invención. De forma similar, el término "agonista" se utiliza
en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que mimetiza
una actividad biológica de un polipéptido IL-22
nativo descrito en la presente invención. Entre las moléculas
agonistas o antagonistas adecuadas se incluyen específicamente
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, fragmentos o variantes de
secuencias de aminoácidos de polipéptidos IL-22
nativos, péptidos, oligonucleótidos antisentido, pequeñas moléculas
orgánicas agonistas o antagonistas, etc. Los procedimientos para
identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido
IL-22 pueden comprender poner en contacto un
polipéptido IL-22 con una molécula agonista o
antagonista candidata y medir un cambio detectable en una o más
actividades biológicas asociadas normalmente con el polipéptido
IL-22.
"Tratamiento" se refiere tanto al
tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o
preventivas, en el que es evitar o ralentizar (disminuir) la
condición o trastorno patológico diana. Entre los individuos que
necesitan un tratamiento se incluyen individuos que ya padecen el
trastorno, así como individuos propensos a padecer el trastorno o
individuos en los cuales va a evitarse el trastorno.
La administración "crónica" se refiere a la
administración del agente o agentes en un modo continuo en
oposición a un modo puntual, para mantener el efecto (actividad)
terapéutico inicial durante un periodo largo de tiempo. La
administración "intermitente" es el tratamiento que no se
realiza de forma consecutiva sin interrupción, sino que es bastante
cíclico en su naturaleza.
"Mamífero", para los objetivos de
tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como
mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y
animales de zoo, animales para deporte o mascotas, tales como
perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos,
etc. Preferentemente, el mamífero es humano.
La administración "combinada con" uno o más
agentes terapéuticos adicionales incluye la administración
simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
Los "portadores", tal y como se utilizan en
la presente invención, incluyen portadores, excipientes o
estabilizantes farmacéuticamente aceptables que son no tóxicos para
la célula o el mamífero expuestos a los mismos en las dosis y
concentraciones utilizadas. Frecuentemente, el portador
fisiológicamente aceptable es una solución acuosa tamponada de pH.
Entre los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables se
incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos
orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos
de peso molecular bajo (inferior a aproximadamente 10 residuos);
proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o
inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como
polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina,
asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros
carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas; agentes
quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcares, tales como
manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como
sodio; y/o tensoactivos no iónicos, tales como TWEENTM,
polietilenglicol (PEG) y PLURONICSTM.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden
una parte de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región
variable o de unión a antígeno del anticuerpo intacto. Entre los
ejemplos de fragmentos de anticuerpos se incluyen Fab, Fab',
F(ab')2 y fragmentos Fv; "diabodies"; anticuerpos
lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10):
1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpos de
cadena única; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos
de anticuerpos.
La digestión con papaína de anticuerpos produce
dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos
"Fab", cada uno con un sitio único de unión a antígeno y un
fragmento "Fc" residual, una nomenclatura que refleja la
capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina
produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de
combinación a antígeno y aún es capaz de reticular el antígeno.
"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo
que contiene un sitio completo de unión y reconocimiento de
antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable
de cadena pesada y cadena ligera en asociación estrecha no
covalente. Es en esta configuración que las tres CDRs de cada
dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a
antígeno en la superficie del dímero VH-VL.
Colectivamente, las seis CDRs confieren al anticuerpo una
especificidad de unión a antígeno. Sin embargo, incluso un único
dominio variable (o la mitad de una Fv que comprende sólo tres CDRs
específicas de antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a
antígeno, aunque con una menor afinidad que el sitio de unión
completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio
constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1)
de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos
Fab' por la adición de una serie de residuos en el extremo carboxi
terminal del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más
cisteínas de la región bisagra del anticuerpo.
Fab'-SH es la denominación en la presente invención
para Fab' en el que el residuo o residuos de cisteína de los
dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de
anticuerpos F(ab')2 se produjeron originalmente como parejas
de fragmentos de Fab' que tienen cisteínas bisagras entre ellos.
También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de
anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie de invertebrado se puede
asignar a uno de dos tipos claramente diferentes, llamados kappa y
lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios
constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del
dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se
pueden asignar a diferentes clases. Existen cinco clases principales
de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varios de éstas se
pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena
única" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL del
anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una única
cadena de polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende
además un polipéptido enlazador entre los dominios VH y VL que
permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a
antígeno. Para una revisión de sFv ver Pluckthun en The Pharmacology
of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds.,
Springer-Verlag, Nueva York, pp.
269-315 (1994).
El término "diabodies" se refiere a
pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a
antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena
pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL)
en la misma cadena de polipéptido (VH - VL). Utilizando un enlazador
que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los
dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a
emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crean
dos sitios de unión a antígeno. Los diabodies se describen más
detalladamente en, por ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger
y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:
6444-6448
(1993).
(1993).
Un anticuerpo "aislado" es el que se ha
identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de
su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural
son materiales que interferirían con las utilizaciones de
diagnóstico y terapéuticas del anticuerpo, y pueden incluir enzimas,
hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En
realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más
de un 95% en peso de anticuerpo según se determina por el método de
Lowry, y más preferiblemente más de un 99% en peso, (2) hasta un
grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia
de aminoácidos N-terminal o interna mediante la
utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la
homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones
reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o,
preferiblemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye
el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes ya
que por lo menos un componente del medio natural del anticuerpo no
estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se
preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.
Un anticuerpo que "se une específicamente
a" o es "específico para" un polipéptido o un epítopo
particular en un polipéptido particular es aquel que se une a este
polipéptido o epítopo particular en un polipéptido particular sin
unirse sustancialmente a ningún otro polipéptido o epítopo de
polipéptido.
La palabra "marcador" cuando se utiliza en
la presente invención se refiere a un compuesto o composición
detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo
para generar un anticuerpo "marcado". El "marcador" puede
ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisótopos o
marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático,
puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición
sustrato que es detec-
table.
table.
Por "fase sólida" se entiende una matriz no
acuosa a la que se puede adherir el anticuerpo de la presente
invención. Entre los ejemplos de fases sólidas que se engloban en la
presente invención se incluyen las formadas parcial o totalmente de
vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por
ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, polivinilalcohol
y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la
fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en
otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de
cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase
sólida discontinua de partículas discretas, tales como las
descritas en la Patente de Estados Unidos No. 4.275.149.
Un "liposoma" es una vesícula pequeña
compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos
que es útil para la liberación de un fármaco (tal como un
polipéptido IL-22 o un anticuerpo para el mismo) a
un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen habitualmente
en una formación de bicapa, similar a la disposición de las
membranas biológicas.
Una "molécula pequeña" se define en la
presente invención que tiene un peso molecular por debajo de
aproximadamente 500 Daltons.
Una "cantidad eficaz" de un polipéptido
descrito en la presente invención o un agonista o antagonista del
mismo es una cantidad suficiente para llevar a cabo un objetivo
indicado específicamente. Una "cantidad eficaz" se puede
determinar empíricamente y de forma rutinaria, en relación con el
objetivo indicado.
Un "páncreas activado", tal como se define
en la presente invención, es cuando las enzimas digestivas del
páncreas se activan y empiezan a atacar el tejido pancreático.
Una "molécula bioactiva" se define en la
presente invención como una toxina, un radiomarcador o un
anticuerpo.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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El presente documento describe secuencias de
nucleótidos aisladas que codifican a los que se hace referencia en
la presente solicitud como polipéptidos IL-22. En
particular, se han identificado y aislado los ADNc que codifican
varios polipéptidos IL-22, tal y como se describe
con mayor detalle en los posteriores ejemplos. Cabe indicar que a
las proteínas producidas en ciclos de expresión diferentes se les
pueden dar números IL-22 diferentes, pero el número
UNQ es único para cualquier ADN determinado y la proteína
codificada, y no cambiará. Sin embargo, por simplicidad, en el
presente documento la proteína codificada por las moléculas de ácido
nucleico nativo de longitud completa descritas en la presente
invención, así como todos los homólogos nativos adicionales y
variantes incluidas en la definición anterior de
IL-22, se referirán como
"IL-22", independientemente de su origen o
modo de preparación.
Tal y como se describe en los Ejemplos
posteriores, se han depositado varias clones de ADNc con el ATCC.
Las secuencias de nucleótidos reales de dichos clones se pueden
determinar fácilmente por un experto en la materia mediante la
secuenciación del clon depositado utilizando procedimientos
rutinarios en la técnica. La secuencia de aminoácidos prevista se
puede determinar a partir de la secuencia de nucleótidos utilizando
medios rutinarios. Para los polipéptidos IL-22 y los
ácidos nucleicos codificantes descritos en la presente invención,
los solicitantes han identificado lo que se cree que es el mejor
marco de lectura identificable con la información de la secuencia
disponible en el momento.
Además de los polipéptidos IL-22
de secuencia nativa de longitud completa descritos en la presente
invención, se contempla que se pueden preparar variantes de
IL-22. Las variantes de IL-22 se
pueden preparar introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en
el ADN de IL-22, y/o mediante la síntesis del
polipéptido IL-22 deseado. Los expertos en la
materia entenderán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los
procesos post-traduccionales del
IL-22, tales como el cambio del número o la posición
de los sitios de glicosilación o la alteración de las
características de anclaje a la membrana.
Las variaciones en el IL-22 de
secuencia nativa de longitud completa o en varios dominios del
IL-22 descritos en la presente invención, se pueden
realizar, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y
directrices para mutaciones conservativas y no conservativas
establecidas, por ejemplo, en la Patente USA 5.364.934. Las
variaciones pueden ser una sustitución, una eliminación o una
inserción de uno o más codones que codifican el
IL-22 que dan lugar a un cambio en la secuencia de
aminoácidos del IL-22 en comparación con el
IL-22 de secuencia nativa. Opcionalmente, la
variación es por sustitución de por lo menos un aminoácido por
cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del
IL-22. Al determinar qué residuo de aminoácido se
puede insertar, sustituir o eliminar sin afectar de forma adversa la
actividad deseada, se puede encontrar una guía mediante la
comparación de la secuencia del IL-22 con la de las
moléculas de proteínas conocidas homólogas y minimizando el número
de cambios en la secuencia de aminoácidos realizadas en regiones con
elevada homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el
resultado de la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido
que tiene una estructura y/o propiedades químicas similares, tales
como la sustitución de una leucina por una serina, es decir,
sustituciones de aminoácidos conservativos. Las inserciones o
eliminaciones pueden estar opcionalmente en el intervalo de
aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida se puede
determinar realizando sistemáticamente inserciones, eliminaciones o
sustituciones de aminoácidos en la secuencia y probando en las
variantes resultantes la actividad mostrada por la secuencia nativa
de longitud completa o madura.
En la presente invención se proporcionan
fragmentos de polipéptido IL-22. Dichos fragmentos
se pueden truncar en el extremo N-terminal o
C-terminal, o pueden carecer de residuos internos,
por ejemplo, cuando se compara con una proteína nativa de longitud
completa. Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácidos que
no son esenciales para una actividad biológica deseada del
polipéptido IL-22.
Los fragmentos de IL-22 se
pueden preparar mediante cualquiera de un grupo de técnicas
convencionales. Los fragmentos de péptidos deseados se pueden
sintetizar químicamente. Un enfoque alternativo implica la
generación de fragmentos de IL-22 mediante
digestión enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con una
enzima conocida para dividir proteínas en los sitios definidos por
residuos de aminoácidos particulares o mediante la digestión del
ADN con enzimas de restricción adecuadas y el aislamiento del
fragmento deseado. Otra técnica adecuada implica el aislamiento y
la amplificación de un fragmento de ADN que codifica un fragmento de
polipéptido deseado, mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen los extremos
deseados del fragmento de ADN se utilizan en los cebadores del
extremo 5' y 3' en la PCR. Preferiblemente, los fragmentos de
polipéptido IL-22 comparten por lo menos una
actividad biológica y/o inmunológica con el polipéptido
IL-22 nativo descrito en la presente invención.
Las sustituciones particulares de interés se
muestran en la Tabla 6 bajo el encabezamiento de sustituciones
preferidas. Si dichas sustituciones dan lugar a un cambio en la
actividad biológica, entonces se introducen más cambios
sustanciales, denominados sustituciones de ejemplo en la Tabla 6, o
tal y como se describen posteriormente en referencia a las clases
de aminoácidos, y se criban los productos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Las modificaciones sustanciales en la identidad
funcional o inmunológica del polipéptido IL-22 se
llevan a cabo mediante la selección de las sustituciones que
difieren significativamente en su efecto de mantener (a) la
estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la
sustitución, por ejemplo, como conformación de lámina o hélice, (b)
la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el
conjunto de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en
grupos en base a las propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrofóbica: norleucina, met, ala, val, leu,
ile;
(2) hidrofílica neutra: cys, ser, thr;
(3) ácida: asp, glu;
(4) básica: asn, gln, his, lys, arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de
la cadena: gly, pro; y
(6) aromática: trp, tyr, phe.
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Las sustituciones no conservativas comprenderán
el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
Dichos residuos sustituidos también se pueden introducir en sitios
de sustitución conservativa o, más preferiblemente, en los sitios
restantes (no conservados).
Las variaciones se pueden realizar utilizando
procedimientos conocidos en la técnica tales como la mutagénesis
mediada por oligonucleótidos (dirigida de sitio), el rastreo de
alanina, y mutágenesis por PCR. Para producir el ADN variante de
IL-22 se puede llevar a cabo sobre el ADN clonado
una mutagénesis dirigida de sitio [Carter et al., Nucl.
Acids. Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids.
Res., 10: 6487 (1987)], mutagénesis de cassette [Wells et
al., Gene, 34 315 (1985)], mutagénesis de selección de
restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London
SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas.
El análisis de aminoácido por rastreo también se
puede realizar para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de
una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de rastreo preferidos
están los aminoácidos pequeños y neutros. Entre dichos aminoácidos
se incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es
habitualmente un aminoácido de rastreo preferido en este grupo ya
que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos
probable que altere la conformación de la cadena principal de la
variante [Cunninghan y Wells, Science,
244:1081-1085 (1989)]. La alanina es también
habitualmente preferida ya que es el aminoácido más habitual.
Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones escondidas
como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman and Co.,
N.Y.), Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de
alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede
utilizar un aminoácido isotérico.
Las modificaciones covalentes de
IL-22 están incluidas en el alcance del término
"IL-22". Un tipo de modificación covalente
incluye la reacción de residuos de aminoácidos marcados de un
polipéptido IL-22 con un agente derivatizante
orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales
seleccionadas o los residuos N- o C-terminales del
IL-22. La derivatización con agentes bifuncionales
es útil, por ejemplo, para reticular IL-22 con una
matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su utilización
en el procedimiento para purificar anticuerpos
anti-IL-22, y viceversa. Entre los
agentes de reticulación utilizados habitualmente se incluyen, por
ejemplo,
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida,
por ejemplo, ésteres con ácido 4-azido salicílico,
imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres
disuccinimidílicos, tales como
3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato),
maleimidas bifuncionales, tales como
bis-N-maleimido-1,8-octano
y agentes, tales como
metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen la desamidación de
residuos glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes residuos
glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina
y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o
treonilo, metilación de los grupos \alpha-amino de
las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E.
Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.
Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86
(1983)], acetilación de la amina N-terminal, y la
amidación de cualquier grupo carboxilo
C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente del
polipéptido IL-22 comprende la alteración del patrón
de glicosilación nativo del polipéptido. Por "alteración del
patrón de glicosilación nativo" para los objetivos de la presente
invención se pretende indicar la eliminación de uno o más grupos
carbohidratos hallados en IL-22 de secuencia nativa
(mediante la eliminación del sitio de glicosilación subyacente o
mediante la eliminación de la glicosilación por medios químicos y/o
enzimáticos), y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación
que no están presentes en el IL-22 de secuencia
nativa. Además, la expresión incluye cambios cualitativos en la
glicosilación de las proteínas nativas, implicando un cambio en la
naturaleza y proporciones de los diversos grupos de carbohidrato
presentes.
La adición de sitios de glicosilación al
polipéptido IL-22 se puede realizar alterando la
secuencia de aminoácidos. La alteración se puede realizar, por
ejemplo, mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más
residuos de serina o treonina al IL-22 de secuencia
nativa (para sitios de glicosilación unidos a O). La secuencia de
aminoácidos de IL-22 puede alterarse opcionalmente a
través de los cambios a nivel de ADN, particularmente mediante la
mutación del ADN que codifica el polipéptido IL-22
en bases preseleccionadas, de manera que los codones que se generan
se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otros medios para aumentar el número de grupos
carbohidrato en el polipéptido IL-22 es mediante
acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido.
Dichos procedimientos están descritos en la técnica, por ejemplo,
en WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y
Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306
(1981).
La eliminación de grupos carbohidrato presentes
en el polipéptido IL-22 se puede realizar química o
enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que
codifican los residuos de aminoácidos que actúan como dianas para
la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación químicas son
conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, por
Hakimuddin, et. al. Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y
por Edge, et al. Anal. Biochem., 118:131 (1981). La división
enzimática de grupos carbohidrato del polipéptido se puede
conseguir mediante la utilización de un conjunto de endoglicosidasas
y exoglicosidasas tal y como se describe en Thotakura et al.
Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente de
IL-22 comprende la unión del polipéptido
IL-22 a uno de un conjunto de polímeros no
proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG),
polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la forma establecida en
las Patentes de Estados Unidos Nos: 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144;
4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.
El IL-22 también se puede
modificar de manera que forma una molécula quimérica que comprende
IL-22 fusionado a otro polipéptido o secuencia de
aminoácidos heterólogo.
Dicha molécula quimérica puede comprender una
fusión del IL-22 con un polipéptido etiqueta que
proporciona un epítopo al que se puede unir selectivamente un
anticuerpo anti-etiqueta. El
epítopo-etiqueta se sitúa generalmente en el
extremo terminal amino o carboxilo del IL-22. La
presencia de dichas formas epítopo etiquetadas del
IL-22 se pueden detectar utilizando un anticuerpo
contra el polipéptido etiqueta. Además, la disposición del epítopo
etiqueta permite que el IL-22 se purifique
fácilmente mediante purificación por afinidad utilizando un
anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de
afinidad que se une al epítopo etiqueta. En la técnica se conocen
varios polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos. Entre
los ejemplos se incluyen etiquetas de
poli-histidina (poli-his) o
poli-histidina-glicina
(poli-his-gly); el polipéptido
etiqueta de gripe HA y su anticuerpo 12C45 [Field et al.,
Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; la etiqueta
c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y
9E10 de la misma [Evan et al., Molecular and Cellular
Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; y la etiqueta de
gliproteína D (gD) del virus del Herpes Simplex y su anticuerpo
[Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6):
547-553 (1990)]. Entre otros polipéptidos etiqueta
se incluyen el péptido-Flag [Hopp et al.,
BioTechnology,6: 1204-1210 (1988)]; el péptido
epítopo KT3 [Martin et al., Science, 255:
192-194 (1992)]; un péptido epítopo de
\alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol.
Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; y el péptido
etiqueta de la proteína T7 del gen 10
[Lutz-Freyemuth et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)].
Alternativamente, la molécula quimérica puede
comprender una fusión del IL-22 con una
inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina.
Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida
como "inmunoadhesina"), dicha fusión podría ser a una región Fc
de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig incluyen preferiblemente
la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana eliminado
o inactivado) de un polipéptido IL-22 en lugar de
por lo menos una región variable de una molécula de Ig. De manera
particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye la
bisagra, CH2 y CH3, o la bisagra, regiones CH1, CH2 y CH3 de una
molécula de IgG1. Para la producción de fusiones de
inmunoglobulinas, véase también la Patente de USA No. 5.428.130
concedida el 27 de junio de 1995.
La siguiente descripción se refiere
principalmente a la producción de IL-22 mediante el
cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que
contiene ácido nucleico de IL-22. Naturalmente, se
prevé que se puedan utilizar procedimientos alternativos, que se
conocen bien en la técnica, para preparar IL-22.
Por ejemplo, la secuencia de IL-22, o partes de la
misma, se pueden producir mediante síntesis directa de péptidos
utilizando técnicas de fase sólida [véase, por ejemplo, Stewan et
al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H.
Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem.
Soc., 85: 2149-2154 (1963)]. La síntesis de
proteínas in vitro se puede realizar utilizando técnicas
manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada se
puede realizar, por ejemplo, utilizando un Applied Biosystems
Peptide Synthesizer (Foster City, CA) utilizando las instrucciones
del fabricante. Se pueden sintetizar químicamente varias partes del
IL-22 de forma separada y combinarse utilizando
procedimientos químicos o enzimáticos para producir
IL-22 de longitud completa.
El ADN que codifica IL-22 se
puede obtener a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir
de tejido que se cree que posee el ARNm de IL-22 y
expresarlo a un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN de
IL-22 humano se puede obtener convenientemente a
partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido
humano, tal como se describe en los Ejemplos. El gen que codifica
IL-22 también se puede obtener a partir de una
biblioteca genómica o mediante procedimientos sintéticos conocidos
(por ejemplo, síntesis de ácidos nucleicos automatizada).
Las bibliotecas se pueden cribar con sondas
(tales como anticuerpos para IL-22 u
oligonucleótidos de por lo menos aproximadamente
20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de
interés o la proteína codificada por el mismo. El cribado del ADNc
o biblioteca genómica con la sonda seleccionada se puede realizar
utilizando procedimientos estándar, tal como se describe en
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New
York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio
alternativo para aislar el gen que codifica IL-22
es utilizar la metodología de PCR [Sambrook et al.,
supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Los siguientes Ejemplos describen técnicas para
cribar una biblitoeca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos
seleccionadas como sondas deberían ser de longitud suficiente y
suficientemente inequívoca para minimizar los falsos positivos. El
oligonucleótido está preferiblemente marcado de manera que se puede
detectar tras la hibridación a ADN en la biblioteca que se criba.
Los procedimientos de marcado son bien conocidos en la técnica, e
incluyen la utilización de radiomarcadores como ATP marcado con 32P,
biotinilación o marcaje enzimático. Las condiciones de hibridación,
incluyendo la astringencia moderada y la astringencia elevada, se
proporcionan en Sambrook et al., supra.
Las secuencias identificadas en dichos
procedimientos de cribado de bibliotecas se pueden comparar y
alinear con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en
los bancos de datos públicos, tales como el Banco de Genes u otros
bancos de datos de secuencias. La identidad de secuencia (a nivel de
aminoácido o nucleótido) en las regiones definidas de la molécula o
a lo largo de la secuencia de longitud completa se puede determinar
utilizando procedimientos conocidos en la técnica y tal y como se
describen en la presente invención.
El ácido nucleico que tiene la secuencia de
codificación de la proteína se puede obtener mediante el cribado
del ADNc seleccionado o las bibliotecas genómicas utilizando la
secuencia de aminoácidos deducida descrita en la presente invención
por primera vez, y, si es necesario, utilizando procedimientos
convencionales de extensión con cebadores tal y como se describe en
Sambrook et al., supra, para detectar precursores e
intermedios de procesamiento de ARNm que no se han transcrito de
forma inversa en ADNc.
Las células huésped se transfectan o transforman
con vectores de expresión o clonación descritos en la presente para
la producción de IL-22 y se cultivan en medios
nutrientes convencionales modificados para que sean adecuados para
inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los
genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de
cultivo, tales como el medio, la temperatura, el pH y similares, se
pueden seleccionar por un técnico en la materia sin una
experimentación excesiva. En general, los principios, protocolos y
técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos
celulares se pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: a
Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook
et al., supra.
Los procedimientos de transfección de células
eucariotas y transformación de células procariotas son conocidos
por el técnico en la materia, por ejemplo, CaCl2, CaPO4, mediados
por liposomas y electroporación. Dependiendo de la célula huésped
utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar
adecuadas para dichas células. El tratamiento con calcio que
utiliza cloruro cálcico, tal y como se describe en Sambrook et
al., supra, o la electroporación se utilizan generalmente
para procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens
se utiliza para la transformación de ciertas células vegetales, tal
como describe Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859
publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamíferos sin
dichas paredes celulares, se puede utilizar el procedimiento de
precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology,
52: 456-457 (1978). En la Patente de Estados Unidos
No. 4.399.216 se han descrito aspectos generales de transfecciones
de sistemas de células huésped de mamíferos. Las transformaciones en
la levadura se llevan a cabo habitualmente según el procedimiento
de Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979). Sin
embargo, también se pueden utilizar otros procedimientos para
introducir ADN en células, tales como mediante microinyección
nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacteriano con
células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno,
poliornitina. Para varias técnicas para transformar células de
mamífero, ver Keown et al., Methods in enzymology,
185:527-537 (1990) y Manssur et al., Nature,
336. 348-352 (1988).
Entre las células huésped adecuadas para la
clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente
invención se incluyen células procariotas, de levadura, o eucariotas
superiores. Entre las procariotas adecuadas se incluyen, pero no se
limitan a, eubacterias, tales como organismos
Gram-negativo o Gram-positivo, por
ejemplo, Enterobacteriaceae, tal como E. coli. Varias cepas
de E. coli están disponibles públicamente, tales como la
cepa de E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776
(ATCC 31.537); cepa de E. coli W3110 (ATCC 27.325) y K5772
(ATCC 53.635). Entre otras células huésped procariotas adecuadas se
incluyen Enterobacteriaceae, tales como Escherichia, por ejemplo,
E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus,
Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia,
por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como
Bacilli, tal como B. subtilis y B. licheniformis (por
ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266.710
publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tal como P.
aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son más ilustrativos
que limitantes. La cepa W3110 es un huésped o huésped parental
particularmente preferible ya que es una cepa huésped para
fermentaciones de producto de ADN recombinante. Preferiblemente, la
célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticos.
Por ejemplo, la cepa W3110 se puede modificar para realizar una
mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas al
huésped, con ejemplos de dichos huéspedes incluyendo la cepa de
E. coli W3110 1A2, que tiene el genotipo completo tonA; la
cepa de E. coli W3110 9E4, que tiene el genotipo completo
tonA ptr3; la cepa de E. coli W3110 27C7 (ATCC 55.244), que
tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15
(argF-lac) 169 degP ompT kan'; la cepa de E.
coli W3110 37D6 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo
tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7
ilvG kan'; la cepa de E. coli W3110 40B4, que es una cepa
37D6 con una mutación por eliminación degP no resistente a
kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene proteasa
periplásmica mutante descrita en la Patente de Estados Unidos No.
4.946.783 concedida el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son
adecuados procedimientos de clonación in vitro, por ejemplo,
PCR u otras reacciones de ácido nucleico polimerasa.
Además de los procariotas, los microbios
eucariotas, tales como hongos o levaduras filamentosos, son
huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que
codifican IL-22. El Saccharomyces cerevisiae es un
microorganismo huésped eucariótico inferior utilizado habitualmente.
Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature,
290: 140 [1981]; EP 139.383 publicada el 2 de mayo de 1985);
huéspedes Kluyveromyces (Patente de Estados Unidos No. 4.943.529;
Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975
(1991)) tal como, por ejemplo, K. lactis
(MW98-8C, CBS683, CBS574; Louvencourt et al.
J. Bacterial., 154(2):737-742 [1983]),
K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC
16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC
56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et
al., Bio/Technology, 8:135(1990)), K.
thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226);
Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic.
Microbiol. 28:265-278 [1988]); Candida;
Trichoderma recia (EP 244.234); Neurospora crassa
(Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces, tales como
Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538, publicada el 31 de
octubre de 1990); y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo,
Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada el 10
de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus, tales como A.
nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 112:284-289 [1983]; Tilbum et al.,
Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A.
Niger (Nelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]).
Las levaduras metiltrópicas son adecuadas en la presente invención
e incluyen, pero no se limitan a, levadura capaz del crecimiento en
metanol seleccionado del género que consiste en Hansenula, Candida,
Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Una
lista de especies específicas que son ejemplos de esta clase de
levaduras se puede encontrar en C. Anthony, The Biochemistry of
Methylotrophs, 269 (1982).
Las células huésped adecuadas para la expresión
de IL-22 glicosilado se derivan de organismos
multicelulares. Entre los ejemplos de células de invertebrados se
incluyen células de insectos, tales como Drosophila S2 y Spodoptera
Sf9, así como células vegetales. Entre los ejemplos de líneas
celulares huésped de mamíferos útiles se incluyen células de ovario
de hámster chino (CHO) y células COS. Algunos ejemplos más
específicos incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por
SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón de
embrión humano (células 293 o células 293 subclonadas para el
crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen
Virol., 36:59 (1977)); células de ovario de hámster chino/-DHFR
(CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));
células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod.,
23:243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138,
ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); y tumor
mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCl51). La selección de la
célula huésped apropiada se estima que está dentro de la
técnica.
El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN
genómico), que codifica IL-22 se puede insertar en
un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o
para la expresión. Existen varios vectores disponibles
públicamente. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de
plásmido, cósmido, partícula viral, o fago. La secuencia de ácidos
nucleicos apropiada se puede insertar en el vector mediante una
serie de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio
o sitios de endonucleasa de restricción apropiados utilizando
técnicas conocidas en el sector. Los componentes de los vectores
incluyen generalmente, pero no se limitan a, una o más secuencias
señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un
elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de
la transcripción. La construcción de vectores adecuados que
contienen uno o más de estos componentes utiliza técnicas de unión
estándar que son conocidas por un técnico en la materia.
El IL-22 se puede producir
recombinantemente no sólo directamente, sino también como un
polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser
una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de
división específico en el extremo N-terminal de la
proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede
ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que
codifica el IL-22 que se inserta en el vector. La
secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota
seleccionada, por ejemplo, del grupo de las secuencias líderes de
fosfatasa alcalina, penicilinasa, 1pp o enterotoxina II estable
térmicamente. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal
puede ser, por ejemplo, la secuencia líder de invertasa de
levadura, la secuencia líder del factor alfa líder (incluyendo las
secuencias líderes del factor \alpha de Saccharomyces y
Kluyveromyces, el último descrito en la Patente de Estados Unidos
No. 5.010.182), o la secuencia líder de fosfatasa ácida, la
secuencia líder de C. Albicans glucoamilasa (EP 362.179
publicada el 4 de abril de 1990) o la señal descrita en WO
90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de
células de mamíferos, las secuencias señal de mamíferos se pueden
utilizar para dirigir la secreción de la proteína, tales como
secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o
especies relacionadas, así como secuencias líderes virales
secretoras.
Ambos vectores de expresión y clonación
contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite la
replicación del vector en una o más células huésped seleccionadas.
Dichas secuencias son conocidas para un conjunto de bacterias,
levaduras, y virus. El origen de la replicación del plásmido pBR322
es adecuado para la mayoría de bacterias
gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es
adecuado para la levadura, y orígenes virales varios (SV40,
polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de
clonación en células de mamíferos.
Los vectores de clonación y expresión contendrán
habitualmente un gen de selección, también denominado como marcador
seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas
que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por
ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b)
complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran
nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo,
el gen que codifica D-alanina racemasa para
Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables
adecuados para células de mamíferos son aquéllos que permiten la
identificación de células competentes para captar el ácido nucleico
que codifica IL-22, tal como DHFR o timidina
quinasa. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo
salvaje es la línea de células CHO deficiente en actividad de DHFR,
preparada y propagada tal y como se describe por Urlaub et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de
selección adecuado para su utilización en la levadura es el gen
trp1 presente en el plásmido de la levadura YRp7 [Stinchcomb et
al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141
(1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trp1
proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de
levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por
ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics,
85:12 (1977)].
Los vectores de clonación y expresión contienen
habitualmente un promotor unido operativamente a la secuencia de
ácido nucleico que codifica IL-22 para dirigir la
síntesis de ARNm. Se conocen promotores reconocidos por un conjunto
de células huésped potenciales. Entre los promotores adecuados para
utilizar con huéspedes procariotas se incluyen los sistemas de
promotores de \beta-lactamasa y lactosa [Chang
et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al.,
Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema de promotor
de triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP
36.776], y promotores híbridos, tales como el promotor tac [deBoer
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25
(1983)]. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos
también contendrán una secuencia de Shine-Dalgamo
(S.D.) unida operativamente al ADN que codifica
IL-22.
Entre los ejemplos de secuencias promotoras
adecuadas para su utilización con huéspedes de levadura se incluyen
promotores para 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman
et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otros enzimas
glicolíticos [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968);
Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tal como enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros promotores de levaduras, que son
promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de una
transcripción controlada mediante condiciones de crecimiento, son
las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo
C, fosfatasa ácida, enzimas degradativos asociados con el
metabolismo del nitrógeno, metalotioneina,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa
y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la
utilización en la expresión en levaduras se describen adicionalmente
en EP 73.657.
La transcripción de IL-22 desde
vectores en células huésped de mamíferos está controlada, por
ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus,
tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar (Patente
del Reino Unido 2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989),
adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus de papiloma bovino,
virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la
hepatitis-B y virus de simio 40 (SV40), de
promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de
actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de choque
térmico, siempre y cuando dichos promotores sean compatibles con
los sistemas de célula huésped.
Se puede incrementar la transcripción de un ADN
que codifica el IL-22 por eucariotas superiores
mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector.
Los potenciadores son elementos que actúan en cis de ADN,
habitualmente aproximadamente de 10 a 300 pb, que actúan en un
promotor para aumentar su transcripción. Actualmente, se conocen
muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina,
elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e
insulina). Habitualmente, sin embargo, se utilizará un potenciador
de un virus de célula eucariota. Entre los ejemplos se incluyen el
potenciador de SV40 en la cara tardía del origen de replicación (pb
100-270), el potenciador de promotor temprano de
citomegalovirus, el potenciador de polioma en la cara tardía del
origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. El potenciador
se puede cortar y empalmar ("splice") en el vector en una
posición 5' ó 3' con respecto a la secuencia codificante de
IL-22, pero se sitúa preferiblemente en un sitio 5'
con respecto al promotor.
Los vectores de expresión utilizados en células
huéspedes eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas,
animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos
multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la
terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm.
Dichas secuencias están disponibles habitualmente de las regiones
no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de ADNs o ADNcs eucariotas o
virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos
transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida
del ARNm que codifica IL-22.
En Gething et al., Nature,
293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature,
281:40-46 (1979); EP 117.060 y EP 117.058 se
describen adicionalmente otros procedimientos, vectores, y células
huésped adecuados para la adaptación a la síntesis de
IL-22 en cultivos de células de vertebrados
recombinantes.
La amplificación y/o expresión de los genes se
puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, mediante
transferencia Southern convencional, transferencia Northern
convencional para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)],
transferencia de manchas ("blots") (análisis de ADN), o
hibridación in situ, utilizando una sonda marcada
apropiadamente, basada en las secuencias proporcionadas en la
presente invención. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos
que pueden reconocer cadenas dobles específicas, incluyendo cadenas
dobles de ADN, cadena doble de ARN, cadenas dobles híbridas de
ADN-ARN o cadena doble de
ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden
marcar y el ensayo se puede llevar a cabo cuando la cadena doble
está unida a una superficie, de manera que tras la formación de la
cadena doble en la superficie, se puede detectar la presencia de
anticuerpo unido a la cadena doble.
Alternativamente, la expresión génica se puede
medir mediante procedimientos inmunológicos, tales como tinción
inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y ensayo de
cultivo de células o fluidos corporales, para cuantificar
directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos
útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de fluidos de
ejemplo pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden preparar
en cualquier mamífero. De manera conveniente, los anticuerpos se
pueden preparar contra un polipéptido IL-22 de
secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en las
secuencias de ADN proporcionadas en la presente invención o contra
una secuencia exógena fusionada a ADN de IL-22 que
codifica un epítopo de anticuerpo específico.
Las formas de IL-22 se pueden
recuperar del medio de cultivo o de los lisatos de células huésped.
Si está unido a membrana, se puede liberar de la membrana
utilizando una solución de detergente adecuada (por ejemplo, Triton
X-100) o mediante división enzimática. Las células
utilizadas en la expresión de IL-22 se pueden
destruir mediante diversos medios físicos o químicos, tales como
ciclos de congelación-descongelación, sonicación,
destrucción mecánica, o agentes para lisar células.
Se puede desear purificar IL-22
a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los
siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de
purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de
intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa;
cromatografía sobre sílice o una resina de intercambio catiónico,
tal como DEAE; "cromatofocusing"; SDS-PAGE;
precipitación con sulfato amónico; filtración en gel utilizando,
por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A
sefarosa para eliminar contaminantes, tales como IgG, y columnas
quelantes de metales para unir formas etiquetadas con epítopo del
IL-22. Se pueden utilizar varios métodos de
purificación de proteínas y dichos métodos son conocidos en la
técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in
Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles
and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982). La
etapa o etapas de purificación seleccionadas dependerán, por
ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y el
IL-22 concreto producido.
Las secuencias de nucleótidos (o sus
complementarias) que codifican IL-22 tiene varias
aplicaciones en la disciplina de la biología molecular, incluyendo
usos como sondas de hibridación, en el mapeo de cromosomas y genes
y en la generación de ARN y ADN antisentido. El ácido nucleico de
IL-22 también será útil para la preparación de
polipéptidos IL-22 mediante las técnicas
recombinantes descritas en la presente invención.
El gen de IL-22 de secuencia
nativa de longitud completa, o partes del mismo, se pueden utilizar
como sondas de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar
el ADNc de IL-22 de longitud completa o para aislar
incluso otros ADNcs (por ejemplo, aquéllos que codifican variantes
naturales de IL-22 o IL-22 de otras
especies) que tienen una identidad en la secuencia deseada con la
secuencia de IL-22 nativa descrita en la presente
invención. Opcionalmente, la longitud de las sondas será de
aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases. Las sondas de
hibridación se pueden derivar de regiones por lo menos parcialmente
nuevas de la secuencia de nucleótidos nativa de longitud completa
en la que dichas regiones se pueden determinar sin una
experimentación excesiva o de secuencias genómicas que incluyen
promotores, elementos potenciadores e intrones de
IL-22 de secuencia nativa. A modo de ejemplo, un
procedimiento de cribado comprenderá el aislamiento de la región
codificante del gen de IL-22 utilizando la
secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de
aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación se pueden
marcar con una serie de marcadores, incluyendo radionucleótidos,
tales como 32P o 35S, marcadores enzimáticos, tales como fosfatasa
alcalina acoplada a la sonda a través de los sistemas de
acoplamiento avidina/biotina. Las sondas marcadas que tienen una
secuencia complementaria a la del gen de IL-22 de
la presente invención se pueden utilizar para cribar bibliotecas de
ADNc humano, ADN genómico o ARNm para determinar a qué miembros de
dichas bibliotecas se hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación
se describen con mayor detalle en los siguientes Ejemplos.
Cualquier secuencia EST descrita en la presente
solicitud se puede utilizar de forma similar como sondas,
utilizando los procedimientos descritos en la presente
invención.
Entre otros fragmentos útiles de los ácidos
nucleicos de IL-22 se incluyen oligonucleótidos
antisentido o sentido que comprenden una secuencia de ácidos
nucleicos de cadena única (ARN o ADN) capaz de unirse a secuencias
de ARNm de IL-22 diana (sentido) o ADN de
IL-22 diana (antisentido). Los oligonucleótidos
antisentido o sentido, según la presente invención, comprenden un
fragmento de la región codificante de ADN de IL-22.
Dicho fragmento comprende generalmente por lo menos aproximadamente
14 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 14 a 30
nucleótidos. La capacidad de derivar un oligonucleótido antisentido
o sentido, basado en una secuencia de ADNc que codifica una
proteína determinada se describe en, por ejemplo, Stein y Cohen
(Cancer Res., 48:2659, 1988) y van der Krol et al.
(BioTechniques 6:958, 1988).
La unión de oligonucleótidos sentido y
antisentido a secuencias de ácidos nucleico diana da lugar a la
formación de cadenas dobles que bloquean la transcripción o la
traducción de la secuencia diana mediante uno de los diferentes
medios, que incluyen una mayor degradación de las cadenas dobles, la
terminación prematura de la transcripción o la traducción, o
mediante cualquier otro medio. De este modo, los oligonucleótidos
antisentido se puede utilizar para bloquear la expresión de
proteínas IL-22. Los oligonucleótidos antisentido o
sentido comprenden además oligonucleótidos que tienen esqueletos de
azúcar-fosfodiéster modificados (u otras uniones a
azúcares, tales como las descritas en WO 91/06629) y en los que
dichas uniones a azúcares son resistentes a nucleasas endógenas.
Dichos oligonucleótidos con uniones a azúcares resistentes son
estables in vivo (es decir, capaces de resistir la
degradación enzimática) pero mantienen la especificidad de secuencia
para ser capaces de unirse a las secuencias de nucleótidos
diana.
Entre otros ejemplos de oligonucleótidos sentido
o antisentido se incluyen aquellos oligonucleótidos que están
unidos covalentemente a grupos orgánicos, tales como los descritos
en WO 90/10048, y otros grupos que aumentan la afinidad del
oligonucleótido por una secuencia de ácidos nucleicos diana, tal
como poli-(L-lisina). Además, los agentes
intercalantes, tales como elipticina, y agentes alquilantes o
complejos metálicos se pueden unir a oligonucleótidos sentido o
antisentido para modificar las especificidades de unión del
oligonucleótido antisentido o sentido para la secuencia de
nucleótidos diana.
Los oligonucleótidos sentido o antisentido se
pueden introducir en una célula que contiene la secuencia de ácidos
nucleicos diana mediante cualquier procedimiento de transferencia de
genes, incluyendo, por ejemplo, transfección de ADN mediada por
CaPO4, electroporación, o mediante la utilización de vectores de
transferencia de genes, tales como el virus
Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, un
oligonucleótido antisentido o sentido se inserta en un vector
retroviral adecuado. Una célula que contiene la secuencia de ácidos
nucleicos diana se pone en contacto con el vector retroviral
recombinante, in vivo o ex vivo. Entre los vectores
retrovirales adecuados se incluyen, pero no se limitan a, los
derivados de retrovirus murinos M-MuLV, N2 (un
retrovirus derivado de M-MuLV) o los vectores de
copia doble designados como DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase WO
90/13641).
Los oligonucleótidos sentido o antisentido
también se pueden introducir en una célula que contiene la
secuencia de nucleótidos diana mediante la formación de un conjugado
con una molécula de unión ligando, tal y como se describe en WO
91/04753. Entre las moléculas de unión ligandos se incluyen, pero no
se limitan a, receptores de la superficie de las células, factores
de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se unen a
receptores de la superficie de las células. Preferiblemente, la
conjugación de la molécula de unión ligando no interfiere
sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión ligando
para unirse a su correspondiente molécula o receptor, ni bloquea la
entrada del oligonucleótido sentido o antisentido o su versión
conjugada en la célula.
Alternativamente, se puede introducir un
oligonucleótido sentido o antisentido en una célula que contiene la
secuencia de ácidos nucleicos diana mediante la formación de un
complejo oligonucleótido-lípido, tal y como se
describe en WO 90/10448. El complejo oligonucleótido sentido o
antisentido-lípido se disocia preferiblemente en el
interior de la célula por una lipasa endógena.
Las moléculas de ARN o ADN antisentido o sentido
tienen generalmente por lo menos aproximadamente 5 bases de
longitud, aproximadamente 10 bases de longitud, aproximadamente 15
bases de longitud, aproximadamente 20 bases de longitud,
aproximadamente 25 bases de longitud, aproximadamente 30 bases de
longitud, aproximadamente 35 bases de longitud, aproximadamente 40
bases de longitud, aproximadamente 45 bases de longitud,
aproximadamente 50 bases de longitud, aproximadamente 55 bases de
longitud, aproximadamente 60 bases de longitud, aproximadamente 65
bases de longitud, aproximadamente 70 bases de longitud,
aproximadamente 75 bases de longitud, aproximadamente 80 bases de
longitud, aproximadamente 85 bases de longitud, aproximadamente 90
bases de longitud, aproximadamente 95 bases de longitud,
aproximadamente 100 bases de longitud, o más.
Las sondas también se pueden utilizar en
técnicas de PCR para generar un grupo de secuencias para la
identificación de secuencias de codificación de
IL-22 estrechamente relacionadas.
Las secuencias de nucleótidos que codifican un
IL-22 también se pueden utilizar para construir
sondas de hibridación para mapear el gen que codifica el
IL-22 y para el análisis genético de individuos con
trastornos genéticos. Las secuencias de nucleótidos proporcionadas
en la presente invención se pueden mapear en un cromosoma y
regiones específicas de un cromosoma utilizando técnicas conocidas,
tales como la hibridación in situ, el análisis de unión
contra marcadores cromosómicos conocidos, y el cribado de
hibridación con bibliotecas.
Cuando las secuencias codificantes de
IL-22 codifican una proteína que se une a otra
proteína (por ejemplo, cuando el IL-22 es un
receptor), el IL-22 se puede utilizar en ensayos
para identificar las otras proteínas o moléculas implicadas en la
interacción de unión. Mediante dichos procedimientos, se pueden
identificar los inhibidores de la interacción receptor/ligando. Las
proteínas implicadas en dichas interacciones de unión también se
pueden utilizar para cribar inhibidores o agonistas de péptidos o
moléculas pequeñas de la interacción de unión. Además, el receptor
IL-22 se puede utilizar para aislar el ligando o
ligandos correlativos. Se pueden diseñar ensayos de cribado
("screening") para encontrar compuestos candidatos que
mimetizan la actividad biológica de un IL-22 nativo
o un receptor para IL-22. Dichos ensayos de cribado
incluirán ensayos susceptibles de cribar con un alto rendimiento
bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente adecuados para
identificar pequeñas moléculas como fármacos candidatos. Entre las
pequeñas moléculas contempladas se incluyen compuestos orgánicos o
inorgánicos sintéticos. Los ensayos se pueden realizar en una
variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión
proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico,
inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien
caracterizados en la técnica.
Los ácidos nucleicos que codifican
IL-22 o sus formas modificadas también se pueden
utilizar para generar animales transgénicos o animales "knock
out" que, a su vez, son útiles en el desarrollo y cribado de
reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por
ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que tiene células que
contienen un transgén, el cual se introdujo en el animal o en un
antecesor del animal en estado prenatal, por ejemplo, una etapa
embrionaria. Un transgén es un ADN que está integrado en el genoma
de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal
transgénico. En una realización, el ADNc que codifica
IL-22 se puede utilizar para clonar ADN genómico
que codifica IL-22 según las técnicas establecidas y
las secuencias genómicas utilizadas para generar animales
transgénicos que contienen células que expresan ADN que codifica
IL-22. Los procedimientos para generar animales
transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas,
se han convertido en habituales en la técnica y se describen, por
ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.736.866 y
4.870.009. Habitualmente, se marcarían células concretas para la
incorporación del transgén de IL-22 con
potenciadores específicos de tejido. Se pueden utilizar animales
transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica
IL-22 introducido en la línea germinal del animal en
una etapa embrionaria, para examinar el efecto de la expresión
aumentada de ADN que codifica IL-22. Dichos animales
se pueden utilizar como animales de prueba para reactivos pensados
para conferir protección frente a, por ejemplo, condiciones
patológicas asociadas con su sobreexpresión. Según este aspecto de
la presente invención, el tratamiento de un animal con el reactivo
y la reducción de la incidencia de la condición patológica en
comparación con animales no tratados que llevan el transgén,
indicaría una potencial intervención terapéutica en la condición
patológica.
Alternativamente, se pueden utilizar homólogos
no humanos de IL-22 para construir un animal
"knock out" con IL-22 que tiene un gen
defectuoso o alterado que codifica IL-22 como
resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que
codifica IL-22 y el ADN genómico alterado que
codifica IL-22 introducido en una célula madre
embrionaria del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica
IL-22 se puede utilizar para clonar ADN genómico
que codifica IL-22 según las técnicas establecidas.
Una parte del ADN genómico que codifica IL-22 se
puede eliminar o sustituir por otro gen, tal como un gen que
codifica un marcador seleccionable que se puede utilizar para
monitorizar la integración. Habitualmente, se incluyen en el vector
varias kilobases de ADN flanqueante inalterado (en los extremos 5'
y 3') [véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987)
para una descripción de vectores de recombinación homólogos]. El
vector se introduce en una línea de células madres embrionarias
(por ejemplo, un ratón o una rata) para formar quimeras de
agregación [véase, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and
Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed.
(IRL, Oxford, 1987), páginas 113-152]. A
continuación, un embrión quimérico se puede implantar en un animal
criado hembra pseudoembarazada adecuado y el embrión nacido para
crear un animal "knock out". La progenie que alberga el ADN
recombinado homólogamente en las células germinales se puede
identificar mediante técnicas estándar y utilizar para criar
animales en los que todas las células de los mismos contienen el ADN
recombinado homólogamente. Los animales knock out se pueden
caracterizar, por ejemplo, por su capacidad de defenderse contra
ciertas condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones
patológicas debido a la ausencia del polipéptido
IL-22.
El ácido nucleico que codifica los polipéptidos
IL-22 también se pueden utilizar en terapia génica.
En aplicaciones de terapia génica, los genes se introducen en
células para conseguir una síntesis in vivo de un producto
genético terapéuticamente eficaz, por ejemplo, para la sustitución
de un gen defectuoso. La "terapia génica" incluye tanto la
terapia génica convencional en la que se consigue un efecto duradero
mediante un único tratamiento, como la administración de agentes
terapéuticos génicos, que implica la administración de una vez o
repetitiva de un ADN o ARN terapéuticamente eficaz. Se pueden
utilizar ADNs y ARNs antisentido como agentes terapéuticos para
bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. También se ha
observado que los oligonucleótidos antisentido cortos se pueden
importar en células en las que actúan como inhibidores, a pesar de
sus bajas concentraciones intracelulares causadas por su captación
limitada por la membrana celular. (Zamecnik et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]). Los
oligonucleótidos se pueden modificar para aumentar su captación,
por ejemplo, mediante la sustitución de sus grupos diéster cargados
negativamente por grupos no cargados.
Existe una variedad de técnicas disponibles para
introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían
dependiendo si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas
in vitro o in vivo en las células del huésped
deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido
nucleico en células de mamíferos in vitro incluyen la
utilización de liposomas, electroporación, microinyección, fusión
celular, DEAE-dextrano, el procedimiento de
precipitación con fosfato cálcico, etc. Entre las técnicas de
transferencia génica in vivo actuales preferidas se incluyen
la transfección con vectores virales (habitualmente retrovirales) y
la transfección mediada por liposoma-proteínas de
cubierta viral (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11,
205-210 [1993]). En algunas situaciones, es deseable
proporcionar la fuente de ácidos nucleicos con un agente que marca
las células diana, tales como un anticuerpo específico para una
proteína de membrana de la superficie de la célula o la célula
diana, un ligando para un receptor en la célula diana, etc. Cuando
se utilizan liposomas, se pueden utilizar proteínas que se unen a
una proteína de membrana de la superficie de la célula asociada con
endocitosis para dirigir y/o facilitar la captación, por ejemplo, de
proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas trópicas para un
tipo de célula concreta, anticuerpos para proteínas que experimentan
internalización en el ciclado, proteínas que dirigen la
localización intracelular y aumentan la vida media intracelular. La
técnica de la endocitosis mediada por receptor se describe en, por
ejemplo, Wu et al., J. Biol. Chem. 262,
4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Para una
revisión de los protocolos de marcaje génico y terapia génica,
véase Anderson et al., Science 256, 808-813
(1992).
Las formulaciones terapéuticas se preparan para
el almacenamiento mediante la mezcla del principio activo que tiene
el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o
estabilizantes opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's
Pharmaceutical Sciences 16ª Edición, Osol, A. Ed. (1980)) en forma
de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores,
excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los
receptores en las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen
tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos;
antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de peso
molecular bajo (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas,
tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros
hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona, aminoácidos, tales
como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina;
monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen
glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA;
alcoholes de azúcares, tales como manitol o sorbitol; contraiones
formadores de sales, tales como sodio; y/o tensoactivos no iónicos,
tales como TWEENTM, PLURONICSTM o PEG.
Las formulaciones a utilizar para la
administración in vitro debe ser estéril. Esto se realiza
fácilmente mediante la filtración a través de membranas de
filtración estériles, previamente o posteriormente a la
liofilización y reconstitución.
Las composiciones terapéuticas de la presente
invención generalmente se colocan en un recipiente que tiene un
puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución
intravenosa que tiene un tapón penetrable por una aguja de
inyección hipodérmica.
La ruta de administración está en concordancia
con procedimientos conocidos, por ejemplo, la inyección o la
infusión mediante las rutas intravenosa, intraperitoneal,
intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial o
intralesional, administración tópica, o mediante sistemas de
liberación controlada.
Las dosis y concentraciones del fármaco deseadas
de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden
variar dependiendo de la utilización particular prevista. La
determinación de la dosis o la ruta de administración apropiadas
están dentro del conocimiento de un médico habitual. Los
experimentos con animales proporcionan una guía fiable para la
determinación de las dosis eficaces para la terapia humana. El
escalado entre especies de dosis eficaces se puede llevar a cabo
siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell,
W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" en
Toxicokinetics y New Drug Development, Yacobi et al., Eds.,
Pergamon Press, Nueva York, 1989, páginas 42-96.
Cuando se utiliza la administración in
vivo de un antagonista de IL-22, las cantidades
de dosificación normales pueden variar desde aproximadamente 10
ng/kg hasta 100 mg/kg de masa corporal de mamífero o más por día,
preferiblemente aproximadamente 1 \mug/kg/día hasta 10 mg/kg/día,
dependiendo de la ruta de administración. Las guías de las dosis
concretas y los procedimientos de liberación se proporcionan en la
literatura; véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nos.
4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212. Se anticipa que diferentes
formulaciones serán eficaces para diferentes compuestos de
tratamiento y diferentes trastornos, que la administración que se
dirige a un órgano o tejido, por ejemplo, puede necesitar la
liberación de una manera diferente a la de otro órgano o
tejido.
La presente invención comprende procedimientos
de cribado de compuestos para identificar aquéllos que evitan el
efecto del polipéptido IL-22 (antagonistas). Los
ensayos de cribado para candidatos de fármacos antagonistas se
diseñan para identificar compuestos que se unen o forman complejos
con los polipéptidos IL-22 codificados por los
genes identificados en la presente invención, o bien interfieren con
la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas
celulares. Dichos ensayos de cribado incluirán ensayos susceptibles
de cribar con un alto rendimiento bibliotecas químicas, haciéndolos
particularmente adecuados para identificar pequeñas moléculas como
fármacos candidatos.
Los ensayos se pueden realizar en una variedad
de formatos incluyendo ensayos de unión
proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico,
inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien
caracterizados en la técnica.
Todos los ensayos para antagonistas son comunes
en que requieren el contacto del fármaco candidato con un
polipéptido IL-22 codificado por un ácido nucleico
identificado en la presente invención bajo condiciones y durante un
tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes
interaccionen.
En ensayos de unión, la interacción es la unión
y el complejo formado se puede aislar o detectar en la mezcla de
reacción. En una realización particular, el polipéptido
IL-22 codificado por el gen identificado en la
presente invención o el fármaco candidato se inmobilizan sobre una
fase sólida, por ejemplo, en una placa de microtítulos, mediante
enlaces covalentes o no covalentes. La unión covalente se realiza
generalmente mediante el recubrimiento de la superficie sólida con
una solución del polipéptido IL-22 y el secado.
Alternativamente, se puede utilizar un anticuerpo inmovilizado, por
ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido
IL-22 a inmovilizar, para anclarlo a la superficie
sólida. El ensayo se realiza mediante la adición del componente no
inmovilizado, que se puede marcar mediante un marcador detectable,
al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta
que contiene el componente anclado. Cuando se completa la reacción,
se extraen los componentes no reaccionados, por ejemplo, mediante
lavado, y se detectan los complejos anclados a la superficie
sólida. Cuando el componente originalmente no inmovilizado
transporta un marcador detectable, la detección del marcador
inmovilizado en la superficie indica que tuvo lugar la complejación.
Cuando el componente originalmente no inmovilizado no transporta un
marcador, se puede detectar la complejación, por ejemplo, utilizando
un anticuerpo marcado que se une específicamente al complejo
inmovilizado.
Si el compuesto candidato interacciona, pero no
se une a un polipéptido IL-22 particular codificado
por un gen identificado en la presente invención, su interacción con
este polipéptido se puede ensayar mediante procedimientos conocidos
para detectar interacciones proteína-proteína.
Dichos ensayos incluyen estrategias tradicionales, tales como, por
ejemplo, reticulación, coinmunoprecipitación y copurificación a
través de gradientes o columnas cromatográficas. Además, las
interacciones proteína-proteína se pueden
monitorizar mediante la utilización de sistemas genéticos basados
en levaduras descritos por Fields y colaboradores (Fields y Song,
Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582
(1991)), tal como se describe por Chevray y Nathans, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991)). Muchos
activadores transcripcionales, tales como GAL4 de levadura,
consisten en dos dominios modulares físicamente discretos, uno
actuando como el dominio de unión a ADN, el otro actuando como el
dominio de transcripción-activación. El sistema de
expresión en las levaduras descrito en las publicaciones anteriores
(referido generalmente como "el sistema de dos híbridos") saca
ventaja de esta propiedad e utiliza dos proteínas híbridas, una en
la que se fusiona la proteína diana al dominio de unión a ADN de
GAL4, y otra, en la que las proteínas activadoras candidatas se
fusionan al dominio de activación. La expresión de un gen informador
GAL1-lacZ bajo el control de un promotor activado
por GAL4 depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 a
través de la interacción de proteína-proteína. Las
colonias que contienen polipéptidos que interaccionan se detectan
con un sustrato cromatogénico para
\beta-galactosidasa. En Clontech se encuentra
disponible comercialmente un kit completo (MATCHMAKERTM) para
identificar interacciones proteína-proteína entre
dos proteínas específicas utilizando la técnica de dos híbridos.
Este sistema también se puede extender para mapear dominios de
proteínas implicados en las interacciones de proteínas específicas
así como para precisar los residuos de aminoácidos que son cruciales
para estas interacciones.
Los compuestos que interfieren con la
interacción de un gen que codifica un polipéptido
IL-22 identificado en la presente invención y otros
componentes intracelulares o extracelulares se puede ensayar tal y
como se indica a continuación: habitualmente se prepara una mezcla
de reacción que contiene el producto del gen y el componente
intracelular o extracelular bajo condiciones y durante un tiempo que
permite la interacción y unión de los dos productos. Para ensayar
la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la
reacción se desarrolla en ausencia y en presencia del compuesto de
prueba. Además, se puede añadir un placebo a una tercera mezcla de
reacción para usar como control positivo. La unión (formación de
complejo) entre el compuesto de prueba y el componente intracelular
o extracelular presente en la mezcla se monitoriza tal y como se
describe anteriormente en la presente invención. La formación del
complejo en la reacción o reacciones de control, pero no en la
mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba, indica que
el compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto
de prueba y su compañero de reacción.
Para ensayar antagonistas, el polipéptido
IL-22 se puede añadir a una célula junto con el
compuesto a cribar para una actividad concreta y la capacidad del
compuesto para inhibir la actividad de interés en presencia del
polipéptido IL-22 indica que el compuesto es un
antagonista del polipéptido IL-22. Alternativamente,
los antagonistas se pueden detectar mediante la combinación del
polipéptido IL-22 y un antagonista potencial con
los receptores o receptores recombinantes de polipéptido
IL-22 unidos a membrana bajo condiciones apropiadas
para un ensayo de inhibición competitiva. El polipéptido
IL-22 se puede marcar, por ejemplo, mediante
radiactividad, de manera que el número de moléculas de polipéptidos
IL-22 unidas al receptor se pueden utilizar para
determinar la eficacia del potencial antagonista. El gen que
codifica el receptor se puede identificar mediante numerosos
procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por
ejemplo, "panning" de ligando y clasificación por FACS.
Coligan et al. Current Protocols in Immun., 1(2):
Capítulo 5 (1991). Preferiblemente, se utiliza la clonación de la
expresión en la que el ARN poliadenilado se prepara a partir de una
célula sensible al polipéptido IL-22 y una
biblioteca de ADNc creada a partir de este ARN se divide en grupos y
se utiliza para transfectar células COS u otras células que no son
sensibles al polipéptido IL-22. Las células
transfectadas que se desarrollan sobre portamuestras de vidrio se
exponen a polipéptido IL-22 marcado. El polipéptido
IL-22 se puede marcar mediante una variedad de
medios que incluyen la yodación o inclusión de un sitio de
reconocimiento para una proteína quinasa específica de sitio. Tras
la fijación e incubación, los portamuestras se someten a un
análisis autorradiográfico. Los grupos positivos se identifican y
los sub-grupos se preparan y se retransfectan
utilizando un proceso de subagrupación y recribado interactivos,
obteniendo finalmente un único clon que codifica el receptor
putativo.
En otro ensayo para antagonistas, las células de
mamíferos o una preparación de membrana que expresa el receptor se
incubarían con polipéptido IL-22 marcado en
presencia del compuesto candidato. A continuación, se podría medir
la capacidad del compuesto para aumentar o bloquear esta
interacción.
Más ejemplos específicos de antagonistas
potenciales incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones
de inmunoglobulina con polipéptido IL-22, y, en
particular, anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos
policlonales y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos
de cadena única, anticuerpos anti-idiotípicos y las
versiones quiméricas o humanizadas de dichos anticuerpos o
fragmentos, así como anticuerpos humanos y fragmentos de
anticuerpos. Alternativamente, un antagonista potencial puede ser
una proteína estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma
mutada del polipéptido IL-22 que reconoce el
receptor pero no transmite el efecto, inhibiendo así
competitivamente la acción del polipéptido
IL-22.
Otro potencial antagonista del polipéptido
IL-22 es una construcción de ADN o ARN antisentido
preparada utilizando tecnología antisentido, cuando, por ejemplo,
una molécula de ADN o ARN antisentido actúa para bloquear
directamente la traducción del ARNm mediante la hibridación a ARNm
marcado y evitando la traducción de la proteína. La tecnología
antisentido se puede utilizar para controlar la expresión génica a
través de la formación de una triple hélice o ADN o ARN
antisentido, ambos procedimientos basados en la unión de un
polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la parte codificante 5' de
la secuencia del polinucleótido, que codifica los polipéptidos
IL-22 maduros de la presente invención, se utiliza
para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de
aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Se diseña un
oligonucleótido de ADN para que sea complementario a una región del
gen implicado en la transcripción (triple hélice - véase Lee et
al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al.,
Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251: 1360
(1991)), evitando así la transcripción y la producción del
polipéptido IL-22. El oligonucleótido de ARN
antisentido se hibrida al ARNm in vivo y bloquea la
traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido
IL-22 (antisentido - Okano, Neurochem., 56:560
(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene
Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Los oligonucleótidos
descritos anteriormente también se pueden liberar a las células, de
manera que el ARN o ADN antisentido se pueden expresar in
vivo para inhibir la producción del polipéptido
IL-22. Cuando se utiliza ADN antisentido, se
prefieren oligodesoxinucleótidos derivados del sitio de iniciación
de la traducción, por ejemplo, entre aproximadamente las posiciones
-10 y +10 de la secuencia de nucleótidos del gen diana.
Entre los antagonistas potenciales se incluyen
pequeñas moléculas que se unen al sitio activo, el sitio de unión
al receptor, o el factor de crecimiento u otro sitio de unión
relevante del polipéptido IL-22, bloqueando de esta
manera la actividad biológica normal del polipéptido
IL-22. Entre los ejemplos de moléculas pequeñas se
incluyen, pero no se limitan a, péptidos pequeños o moléculas
similares a péptidos, preferiblemente péptidos solubles y
compuestos orgánicos o inorgánicos no peptídicos sintéticos.
Las ribozimas son moléculas de ARN enzimático
capaces de catalizar la división específica de ARN. Las ribozimas
actúan mediante la hibridación específica de secuencia al ARN diana
complementario, seguido de la división endonucleolítica. Los sitios
de división específica de la ribozima en un ARN potencial diana se
pueden identificar mediante técnicas conocidas. Para más detalles,
véase, por ejemplo, Rossi, Current Biology,
4:469-471 (1994) y publicación de PCT No. WO
97/33551 (publicada el 18 de septiembre de 1997).
Las moléculas de ácido nucleico en la formación
de triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción deberían
ser de cadena única y compuestas de desoxinucleótidos. La
composición de las bases de estos oligonucleótidos se diseña de
manera que induce la formación de la triple hélice a través de las
reglas de emparejamiento de bases de Hoogsteen, que generalmente
requiere tramos considerables de purinas o pirimidinas en una hebra
de una doble cadena. Para más detalles, véase, por ejemplo, la
publicación de PCT No. WO 97/33551, supra.
Estas pequeñas moléculas se pueden identificar
mediante uno o más de los ensayos de cribado descritos
anteriormente en la presente invención y/o mediante cualquier otra
técnica de cribado conocida para un experto en la materia.
Los usos diagnósticos y terapéuticos de las
moléculas descritas en la presente invención también se pueden
basar en los resultados de ensayos funcionales positivos descritos a
continuación, tal como se define en las reivindicaciones.
Entre los anticuerpos
anti-IL-22 de ejemplo se incluyen
anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos
y heteroconjugados.
Los anticuerpos
anti-IL-22 pueden comprender
anticuerpos policlonales. Los procedimientos de preparación de
anticuerpos policlonales son conocidos para el experto en la
materia. Los anticuerpos policlonales se pueden desarrollar en un
mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente
inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Habitualmente, el agente
inmunizante y/o adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante
inyecciones múltiples subcutáneas o intraperitoneales. El agente
inmunizante puede incluir el polipéptido IL-22 o
una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente
inmunizante a una proteína conocida por ser inmunógenoica en el
mamífero que se inmuniza. Entre los ejemplos de dichas proteínas
inmunógenoicas se incluyen, pero no se limitan a hemocianina de la
lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, e
inhibidor de tripsina de soja. Entre los ejemplos de adyuvantes que
se pueden utilizar se incluyen el adyuvante completo de Freund y el
adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A,
dicorinomicolato de trehalosa sintético). El protocolo de
inmunización puede ser seleccionado por un experto en la materia sin
una gran experimentación.
Los anticuerpos
anti-IL-22 pueden ser,
alternativamente, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos
monoclonales se pueden preparar utilizando procedimientos de
hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature,
256: 495 (1975). En un procedimiento de hibridoma, se inmuniza
habitualmente un ratón, un hámster u otro animal huésped apropiado
con un agente inmunizante para obtener linfocitos que producen o
son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al
agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos se pueden
inmunizar in vitro.
El agente inmunizante incluirá habitualmente el
polipéptido IL-22 o una proteína de fusión del
mismo. Generalmente, se utilizan linfocitos de sangre periférica
("PLBs") si se desean células de origen humano, o se utilizan
células de bazo o células de nódulos linfáticos si se desean fuentes
de mamíferos no humanos. A continuación, los linfocitos se fusionan
con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión
adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de
hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,
Academia Press, (1986), páginas 59-103]. Las líneas
celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero
transformadas, particularmente células de mieloma de origen roedor,
bovino y humano. Habitualmente, se utilizan líneas celulares de
mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar
en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o
más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las
células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células
parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina
fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para
los hibridomas incluirá habitualmente hipoxantina, aminopterina y
timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias evitan el crecimiento
de células deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas
son aquéllas que se fusionan de manera eficaz, permiten un nivel de
expresión elevado estable del anticuerpo por las células productoras
de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como
un medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son
líneas de mieloma murino, que se pueden obtener, por ejemplo, del
Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la
American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. También se han
descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de
ratón-humano para la producción de anticuerpos
monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur
et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) páginas,
51-63].
A continuación, el medio de cultivo en el que se
cultivan las células de hibridoma se pueden ensayar para la
presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el
IL-22. Preferiblemente, la especificidad de unión
de anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma
se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de
unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo
inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA). Dichas técnicas y ensayos
se conocen en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo
monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis
Scatchard de Munson y Poliard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma
deseadas, los clones se pueden subclonar limitando los
procedimientos de dilución y se pueden desarrollar mediante
procedimientos estándar [Goding, supra]. Entre los medios de
cultivo adecuados para este objetivo se incluyen, por ejemplo, medio
de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640.
Alternativamente, las células de hibridoma se pueden desarrollar
in vitro como ascites en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones se pueden aislar o purificar del medio de cultivo o
fluido de ascites mediante procedimientos de purificación de
inmunoglobulinas convencionales, tales como, por ejemplo, proteína
A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatito,
eletroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales también se pueden
fabricar mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como
los descritos en la Patente de Estados Unidos No. 4.816.567. El ADN
que codifica los anticuerpos monoclonales de la presente invención
se pueden aislar fácilmente y secuenciar utilizando procedimientos
convencionales (por ejemplo, mediante la utilización de sondas de
oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes
que codifican las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos murinos).
Las células de hibridoma de la presente invención sirven como una
fuente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede situar en
vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células
huésped, tales como células COS de simio, células de ovario de
hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de ningún
modo proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de
anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El
ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la
secuencia codificante para los dominios constantes de cadena pesada
y ligera humanos en lugar de las secuencias homólogas murinas
[Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; Morrison et al.,
supra] o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de
inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un
polipéptido que no es inmunoglobulina. Dicho polipéptido que no es
inmunoglobulina se puede sustituir por los dominios constantes de
un anticuerpo de la presente invención, o se pueden sustituir por
los dominios variables de un sitio de combinación a antígeno de un
anticuerpo de la presente invención para crear un anticuerpo
quimérico bivalente.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos
monovalentes son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un
procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera
y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. La cadena
pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc
para evitar la reticulación de la cadena pesada. Alternativamente,
los residuos de cisteína pertinentes se sustituyen por otro residuo
de aminoácido o se eliminan para evitar la reticulación.
Los procedimientos in vitro también son
adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de
anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente,
fragmentos Fab, se puede realizar utilizando técnicas rutinarias
conocidas en el sector.
Los anticuerpos
anti-IL-22 de la presente invención
pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos
humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por
ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de
inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab,
Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de
los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de
inmunoglobulina no humana. Entre los anticuerpos humanizados se
incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que
los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR)
del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie
no humana (anticuerpo dador), tal como ratón, rata o conejo que
tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos
casos, los residuos de la estructura ("framework") Fv de la
inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos
correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden
comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo
receptor ni en las secuencias de la CDR o la estructura importados.
En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente
todos de por lo menos uno, y habitualmente dos, dominios variables,
en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR
corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o
sustancialmente todas las regiones de FR son las de una secuencia
de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado de
forma óptima también comprenderá por lo menos una parte de una
región constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una
inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:
522-525 (1986); Riechmann et al., Nature,
332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct.
Biol., 2: 593-596 (1992)].
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no
humanos son conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo
humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en
el mismo de un origen no humano. Estos residuos de aminoácidos no
humanos se indican frecuentemente como residuos "importados",
que se adquieren habitualmente de un dominio variable
"importado". La humanización se puede realizar esencialmente
siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et
al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann
et al., Nature, 332: 323-327 (1988);
Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536
(1988)], mediante la sustitución de CDRs o secuencias de CDR de
roedor por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano.
Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son
anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567), en
los que sustancialmente menos de un dominio variable intacto humano
ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie
no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son
habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de
CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos
de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
Los anticuerpos humanos también se pueden
producir utilizando varias técnicas conocidas en el sector,
incluyendo las bibliotecas de expresión de fagos [Hoogenboom y
Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J.
Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. Las técnicas de Cole et al. y
Boerner et al. están también disponibles para la preparación
de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77 (1985) y
Boerner et al., J. Inmunol., 147(1):
86-95 (1991)]. De forma similar, los anticuerpos
humanos se pueden fabricar mediante la introducción de loci de
inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo,
ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógena han sido
parcial o completamente inactivados. Tras la estimulación, se
observa la producción de anticuerpos humanos, que se parece
estrechamente a la observada en humanos en todos los aspectos,
incluyendo el reajuste de genes, el ensamblaje, y el repertorio de
anticuerpos. Esta estrategia se describe, por ejemplo, en las
Patentes de Estados Unidos Nos. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825;
5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes publicaciones
científicas: Marks et al., Bio/Technology 10,
779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368,
856-859 (1994); Morrison, Nature 368,
812-13 (1994); Fishwild et al., Nature
Biotechnology 14, 845-51, (1996); Neuberger, Nature
Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev.
Immunol. 13 65-93 (1995).
Los anticuerpos también se pueden madurar por
afinidad utilizando procedimientos de selección y/o mutagénesis
conocidos tal como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos
madurados por afinidad preferidos tienen una afinidad que es cinco
veces, más preferiblemente 10 veces, incluso más preferiblemente 20
ó 30 veces mayor que el anticuerpo de partida (generalmente murino,
humanizado o humano) a partir del cual se prepara el anticuerpo
maduro.
Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales,
preferiblemente humanos o humanizados, anticuerpos que tienen
especificidades de unión con por lo menos dos antígenos diferentes.
En el presente caso, una de las especificidades de unión es por el
IL-22, el otro es por cualquier otro antígeno, y
preferiblemente por una proteína o receptor o subunidad del
receptor de la superficie celular.
Los procedimientos para fabricar anticuerpos
biespecíficos son conocidos en la técnica. Habitualmente, la
producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la
coexpresión de dos parejas de cadena pesada/cadena ligera de
inmunoglobulina, en las que las dos cadenas pesadas tienen
especificidades diferentes [Millstein y Cuello, Nature, 305:
537-539 (1983)]. Debido a la variedad aleatoria de
cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas
(cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas
diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene la
estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula
correcta se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografía
de afinidad. En WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en
Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659
(1991) se describen procedimientos similares.
Los dominios variables de anticuerpo con las
especificidades de unión deseadas (sitios de combinación
anticuerpo-antígeno) se pueden fusionar a secuencias
de dominios constantes de inmunoglobulinas. La fusión
preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de
inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la bisagra,
CH2, y regiones CH3. Se prefiere tener la primera región constante
de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la
unión a cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones.
Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de
inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de
inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y
se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Para más
detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase,
por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzimology, 121: 210
(1986).
Según otra estrategia descrita en WO 96/27011,
la interfase entre una pareja de moléculas de anticuerpos se puede
diseñar para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se
recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfase
preferida comprende por lo menos una parte de la región de CH3 de un
dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más
cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase de la
primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales
mayores (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean
"cavidades" compensatorias de tamaño similar o idéntico a la
cadena o cadenas laterales grandes en la interfase de la segunda
molécula de anticuerpo mediante la sustitución de cadenas laterales
grandes de aminoácidos por más pequeñas (por ejemplo, alanina o
treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el
rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no
deseados, tales como homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar
como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos
(por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2). Las
técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de
fragmentos de anticuerpos se han descrito en la literatura. Por
ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar
utilizando uniones químicas. Brennan et al., Science 229:81
(1985) describen un procedimiento en el que los anticuerpos
intactos se dividen proteolíticamente para generar fragmentos
F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente
complejante de ditiol, arsenito sódico, para estabilizar los
ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuro
intermolecular. A continuación, los fragmentos Fab' generados se
convierten en derivados de nitrobenzoato (TNB). A continuación, uno
de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte a
Fab'-tiol mediante la reducción con
mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro
derivado de Fab'-TNB para formar en anticuerpo
biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden
utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de
enzimas.
Los fragmentos Fab' se pueden recuperar
directamente de E. coli y acoplar químicamente para formar
anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:
217-225 (1992) describen la producción de una
molécula de anticuerpo biespecífico totalmente humanizado
F(ab')2. Cada fragmento de Fab' se secretó por separado de
E. coli y se sometió a un acoplamiento químico dirigido in
vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo
biespecífico formado de esta manera era capaz de unirse a células
que sobreexpresan el receptor ErbB2 y células T humanas normales,
así como de desencadenar la actividad lítica de linfocitos
citotóxicos humanos contra tumores de mama humanos dianas.
Se han descrito varias técnicas para fabricar y
aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de
cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido
anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina.
Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):
1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera de leucina
de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes de Fab' de dos
anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros del
anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros
y, a continuación, se reoxidaron para formar los heterodímeros del
anticuerpo. Este procedimiento también se puede utilizar para la
producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de
"diabody" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado
un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpos
biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de
cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera
(VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el
emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por
consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento son forzados a
emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro
fragmento, formando así dos sitios de unión a antígeno. También se
ha descrito otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpos
biespecíficos mediante la utilización de dímeros de Fv de cadena
única (sFv). Véase, Gruber et al., J. Immunol. 152:5368
(1994). Se consideran anticuerpos con más de dos valencias. Por
ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et
al., J. Immunol. 147:60 (1991).
Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo se
pueden unir a dos epítopos diferentes en un polipéptido
IL-22 determinado de la presente invención.
Alternativamente, un brazo anti-polipéptido
IL-22 se puede combinar con un brazo que se une a
una molécula desencadenante en un leucocito, tal como una molécula
receptora de células T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28, o B7), o
receptores Fc para IgG (Fc\gammaR), tales como Fc\gammaRI
(CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16) para centrar
los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa el
polipéptido IL-22 particular. Los anticuerpos
biespecíficos también se pueden utilizar para confinar agentes
citotóxicos a células que expresan un polipéptido
IL-22 particular. Estos anticuerpos poseen un brazo
de unión a IL-22 y un brazo que se une a un agente
citotóxico o un radionúcleo quelante, tal como BOTUBB, DPTA, DOTA o
TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une al polipéptido
IL-22 y además se une al factor tisular (TF).
Los anticuerpos heteroconjugados se pueden
utilizar también dentro del alcance de la presente invención. Los
anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos
unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por
ejemplo, para dirigir células del sistema inmune a células no
deseadas [Patente de Estados Unidos No. 4.676.980] y para el
tratamiento de la infección por VIH [WO 91/00360: WO 92/300373; EP
03089]. Se considera que los anticuerpos se pueden preparar in
vitro utilizando procedimientos conocidos en la química
sintética de proteínas, incluyendo los que implican agentes de
reticulación. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas
utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o mediante la
formación de un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos
adecuados para este objetivo se incluyen el iminotiolato y
metil-4-mercaptobutirimidato y los
descritos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No.
4.676.980.
Se puede desear modificar el anticuerpo con
respecto a la función efectora con el fin de aumentar, por ejemplo,
la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Por
ejemplo, el residuo o residuos de cisteínas se pueden introducir en
la región Fc, permitiendo de esta manera la formación de enlaces
disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico
generado de esta manera puede mejorar la capacidad de
internalización y/o incrementar la citólisis mediada por el
complemento y la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
(ADCC). Véase Caron et al., J. Exp. Med., 176:
1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148:
2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con
una actividad anti-tumoral aumentada también se
pueden preparar utilizando reticuladores heterobifuncionales tal y
como se describe en Wolf et al. Cancer Research, 53:
2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede diseñar
un anticuerpo para que tenga regiones Fc duales y, de esta manera,
pueda aumentar la lisis complementaria y las capacidades de ADCC.
Véase, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug
Design, 3:219-230 (1989).
La presente invención también puede utilizar
inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente
citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por
ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano,
fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo
radioactivo (es decir, un radioconjugado).
Los agentes quimioterapéuticos útiles para la
generación de dichos inmunoconjugados se han descrito
anteriormente. Entre las toxinas enzimáticamente activas y
fragmentos de las mismas que se pueden utilizar se incluyen la
cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de toxina de
difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena
A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina,
alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii,
proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI,
PAPII, y PAPS), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina,
inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina,
restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Existe un
conjunto de radionúcleos disponibles para la producción de
anticuerpos radioconjugados. Algunos ejemplos incluyen 212Bi, 131I,
131In, 90Y y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente
citotóxico se fabrican utilizando un conjunto de agentes
bifuncionales acopladores de proteínas, tales como
N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato
(SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres
(tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como
disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído),
compuestos bis-azido (tales como
bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina),
derivados de bis-diazonio (tales como
bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina),
diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato)
y compuestos de flúor bis-activos (tales como
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina tal y
como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098
(1987). El ácido
1-isotiocianatobencil-3-metildietilen
triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono
14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de
radionúcleos al anticuerpo. Ver WO94/11026.
En otra realización, el anticuerpo se puede
conjugar a un "receptor" (tal como estreptavidina) para la
utilización en el premarcado de tumores en los que el conjugado
anticuerpo-receptor se administra al paciente,
seguido de la eliminación de conjugado no enlazado de la circulación
utilizando un agente purificador y, a continuación, la
administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se
conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionúcleo).
Los anticuerpos descritos en la presente
invención también se pueden formular como inmunoliposomas. Los
liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante
procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en
Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985);
Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77: 4030 (1980); y
las Patentes U.S. Nos. 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con un
mayor tiempo de circulación se describen en la Patente U.S. No.
5.013.556.
Se pueden generar liposomas particularmente
útiles mediante el procedimiento de evaporación de fase inversa con
una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol,
y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE).
Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro
definido para obtener liposomas con el diámetro deseado. Los
fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden
conjugar a los liposomas tal y como se describen en Martin et
al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)
mediante la reacción de intercambio de enlaces disulfuro.
Opcionalmente, el liposoma contiene un agente quimioterapéutico (tal
como Doxorubicina). Véase Gabizon et al., J. Nacional Cancer
Inst., 81(19): 1484 (1989).
Los anticuerpos que se unen específicamente a un
polipéptido IL-22 identificado en la presente
invención, así como otras moléculas identificadas por los ensayos
de cribado descritos anteriormente en la presente invención, se
pueden administrar para el tratamiento de varios trastornos en forma
de composiciones farmacéuticas.
Si el polipéptido IL-22 es
intracelular y los anticuerpos completos se utilizan como
inhibidores, se prefieren anticuerpos de internalización. Sin
embargo, se pueden utilizar también las lipofecciones o liposomas
para liberar el anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, en las
células. Cuando se utilizan fragmentos de anticuerpos, se prefiere
el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al
dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, en base a las
secuencias de región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar
moléculas peptídicas que mantienen la capacidad de unirse a la
secuencia de la proteína diana. Dichos péptidos pueden sintetizarse
químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante.
Véase, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 90: 7889-7893 (1993).
La formulación de la presente invención también
puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para
la enfermedad particular en tratamiento, preferiblemente aquéllos
con actividades complementarias que no afectan de forma adversa
entre sí. Alternativamente o adicionalmente, la composición puede
comprender un agente que potencia su función, tal como, por
ejemplo, un agente citotóxico, una citoquina, un agente
quimioterapéutico o un agente inhibidor del crecimiento. Dichas
moléculas están presentes de forma adecuada combinadas en cantidades
que son eficaces para el objetivo deseado.
Los principios activos también se pueden
introducir en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante
técnicas de coacervación o mediante polimerización por interfase,
por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y
microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en
sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo,
liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas
y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen
en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.
Las formulaciones a utilizar en la
administración in vivo deben ser estériles. Esto se realiza
fácilmente mediante la filtración a través de membranas de
filtración estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación
controlada. Entre algunos ejemplos de preparaciones de liberación
controlada se incluyen matrices semipermeables de polímeros
hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices
están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o
microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación
controlada se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo,
poli(2-hidroxietil-metacrilato)
o poli(vinilalcohol), poliláctidos (Patente de Estados Unidos
No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y
\gamma-etil-L-glutamato,
etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros
de ácido láctico-ácido glicólico no degradables, tales como el
LUIL-22N DEPOTTM (microesferas inyectables
compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato
de leuprolida), y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Mientras que polímeros, tales como etileno-acetato
de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de
moléculas durante aproximadamente 100 días, ciertos hidrogeles
liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los
anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un periodo
largo de tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado
de la exposición a humedad a 37ºC, dando lugar a una pérdida de
actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se
pueden idear estrategias razonables para la estabilización
dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que
el mecanismo de agregación es la formación de enlaces
S-S intermoleculares a través del intercambio
tio-disulfuro, la estabilización se puede conseguir
mediante la modificación de residuos sulfhidrilo, la liofilización
de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, la
utilización apropiada de aditivos, y el desarrollo de composiciones
de matrices de polímero específicas.
Los anticuerpos
anti-IL-22 tienen varias utilidades.
Por ejemplo, los anticuerpos
anti-IL-22 se pueden utilizar en
ensayos de diagnóstico para IL-22, por ejemplo,
detectando su expresión (y en algunos casos, su expresión
diferencial) en células específicas, tejidos o suero. Se pueden
utilizar varias técnicas de ensayo de diagnóstico conocidas en el
sector, tales como ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich
directo o indirecto y ensayos de inmunoprecipitación realizados en
fases heterogéneas u homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A
Manual of Techniques, CRC PRess, Inc. (1987) páginas
147-158]. Los anticuerpos utilizados en los ensayos
de diagnóstico se pueden marcar con un grupo detectable. El grupo
detectable debería ser capaz de producir, directa o indirectamente,
una señal detectable. Por ejemplo, el grupo detectable puede ser un
radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I, un compuesto
fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de
fluoresceína, rodamina, o luciferina, o una enzima, tal como
alcalina fosfatasa, beta-galactosidasa o peroxidasa
de rábano picante. Se puede utilizar cualquier procedimiento
conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo al grupo
detectable, incluyendo aquellos procedimientos descritos por Hunter
et al., Nature, 144: 945 (1962); David et al.,
Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol.
Meth., 40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:
407 (1982).
Los anticuerpos
anti-IL-22 también son útiles para
la purificación por afinidad de IL-22 a partir de
un cultivo de células recombinantes o de origen natural. En este
proceso, los anticuerpos contra IL-22 se
inmovilizan sobre un soporte adecuado, tal como una resina Sephadex
o papel de filtro, utilizando procedimientos conocidos en la
técnica. A continuación, el anticuerpo inmovilizado se pone en
contacto con una muestra que contiene el IL-22 a
purificar, y posteriormente se lava el soporte con un disolvente
adecuado que extraerá sustancialmente todo el material en la
muestra a excepción del IL-22, que está unido al
anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro
disolvente adecuado que liberará el IL-22 del
anticuerpo. Los anticuerpos
anti-IL-22 también son útiles en la
unión a IL-22 y, por tanto, inhibiendo, la expresión
de PAP1, pueden aliviar la gravedad de los trastornos
pancreáticos.
Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo con
objetivos ilustrativos, y no pretenden limitar de ningún modo el
alcance de la presente invención.
Los reactivos disponibles comercialmente a los
que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron de acuerdo con
las instrucciones del fabricante a menos de que se indique lo
contrario. El origen de estas células identificadas en los
siguientes ejemplos, y a lo largo del documento, por los números de
acceso de la ATCC, es la American Type Culture Collection,
Manassas, VA.
Se identificó la
Interleuquina-22 (DNA125185-2806)
mediante la aplicación de un algoritmo de búsqueda de secuencia
señal privado desarrollado por Genentech, Inc. (South San Francisco,
CA) sobre ESTs, así como fragmentos de EST agrupados y ensamblados
a partir de bases de datos públicas (por ejemplo, GenBank) y/o
privadas (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA).
El algoritmo de secuencia señal calcula una puntuación de señal de
secreción basada en el carácter de los nucleótidos de ADN que rodean
el codón o codones de la primera metionina y opcionalmente la
segunda metionina (ATG) en el extremo 5' de la secuencia o el
fragmento de secuencia en consideración. Los oligonucleótidos
siguientes al primer ATG deben codificar para por lo menos 35
aminoácidos inequívocos sin ningín codón de parada. Si el primer ATG
tiene los aminoácidos requeridos, no se examina el segundo. Si
ninguno cumple el requerimiento, no se puntúa la secuencia
candidata. Con el fin de determinar si la secuencia de EST contiene
una secuencia señal auténtica, se puntúan el ADN y las secuencias
de aminoácidos correspondientes que rodean el codón ATG utilizando
un equipo de siete sensores (parámetros de evaluación) conocidos
por asociarse con señales de secreción.
El uso del algoritmo de secuencia señal descrito
anteriormente permitió la identificación de una secuencia de grupos
de EST de la base de datos Incyte, designada 5086173H1 en la
presente invención. A continuación, se comparó esta secuencia de
grupos de EST con un conjunto de bases de datos de marcadores de
secuencia expresada (EST) que incluían bases de datos de EST
públicas (por ejemplo, GenBank) y una base de datos de ADN de EST
privada (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) para
identificar homologías existentes. Se realizó la búsqueda por
homología utilizando el programa informático BLAST o BLAST2 (Altshul
et al., Methods in Enzymology 266: 460-480
(1996)). Se agruparon y ensamblaron aquellas comparaciones que daban
lugar a una puntuación de BLAST de 70 (o en algunos casos de 90) o
más que no codificaban proteínas conocidas en una secuencia de ADN
de consenso con el programa "phrap" (Phil Green, University of
Washington, Seattle, Washington). En la presente invención se
designa como DNA110880 a la secuencia de consenso obtenida de este
modo.
En vista de la homología de secuencia observada
entre la secuencia DNA110880 y una secuencia EST comprendida dentro
del clon nº 5088384 a partir de la base de datos Incyte, se adquirió
el clon nº 5088384 y se obtuvo y se secuenció el inserto de ADNc.
En la presente invención se observó que este inseto de ADNc
codificaba una proteína de longitud completa. En la Figua 1 se
muestra la secuencia de este inserto de ADNc y en la presente
invención se la designa como IL-22
(DNA125185-2806).
El clon DNA125185-2806 contiene
un único marco de lectura abierto con un sitio de iniciación
traduccional aparente en las posiciones de nucleótidos
58-60 y de finalización en el codón de parada en las
posiciones de nucleótidos 595-597 (Figura 1, SEC ID
NO 1). El precursor de polipéptido previsto tiene 179 aminoácidos
de largo (Figura 2, SEC ID NO: 2). La proteína IL-22
de longitud completa mostrada en la Figura 2 tiene un peso
molecular estimado de aproximadamente 20.011 daltons y un pI de
aproximadamente 8,10. El análisis de la secuencia de
IL-22 de longitud completa mostrada en la Figura 2
(SEC ID NO:2) pone de manifiesto la presencia de una variedad de
dominios de polipéptido importantes tal y como se muestra en la
Figura 2, donde las localizaciones dadas para estos dominios de
polipéptido importantes son aproximados tal y como se describe
anteriormente. Se ha depositado IL-22
(DNA125185-2806) con ATCC el 7 de Diciembre de 1999
y se asignó el depósito de ATCC nº PTA-1031.
En este ensayo, se evaluan varios polipéptidos
IL-22 por la capacidad de unirse a un panel de
potenciales moléculas receptoras o ligando con el propósito de
identificar interaciones receptor/ligando. La identificación de un
ligando para un receptor conocido, un receptor para un ligando
conocido o una nueva pareja receptor/ligando es útil para un
conjunto de indicaciones incluyendo, por ejemplo, el reconocimiento
de moléculas bioactivas (enlazadas al ligando o al receptor) en una
célula conocida por expresar el receptor o el ligando, el uso del
receptor o el ligando como reactivo para detectar la presencia del
ligando o receptor en una composición sospechosa de contener el
mismo, donde la composición puede comprender células sospechosas de
expresar el ligando o el receptor, la modulación del crecimiento u
otra actividad biológica o inmunológica de una célula que se sabe
que expresa o que responde al receptor o al ligando, la modulación
de la respuesta inmune de células o hacia células que expresan el
receptor o el ligando, permitir la preparación de agonistas,
antagonistas y/o anticuerpos dirigidos contra el receptor o el
ligando que modulará el crecimiento o una actividad biológica o
inmunológica de una célula que expresa el receptor o el ligando, y
otras diversas indicaciones que serán fácilmente evidentes para el
experto habitual en la materia.
El ensayo se realiza de la siguiente manera. Se
expresa un polipéptido IL-22 de la presente
invención sospechoso de ser un ligando para un receptor como una
proteína de fusión que contiene el dominio de Fc de IgG humana (una
inmunoadhesina). Se detecta la unión receptor/ligando al permitir la
interacción del polipéptido de inmunoadhesina con células (por
ejemplo células Cos) que expresan receptores de polipéptidos
IL-22 candidatos y la visualización de
inmunoadhesina unida con reactivos fluorescentes dirigidos hacia el
dominio de fusión de Fc y el examen mediante microscopio. Las
células que expresan receptores candidatos se producen mediante la
transfección transitoria, en paralelo, de subconjuntos definidos de
una biblioteca de vectores de expresión de ADNc que codifican
polipéptidos IL-22 que pueden funcionar como
moléculas receptoras. A continuación, se incuban las células
durante 1 hora en presencia de la inmunoadhesina de polipéptido
IL-22 que está siendo evaluada por su posible unión
receptora. A continuación, se lavan las células y se fijan con
paraformaldehido. A continuación, se incuban las células con
anticuerpo conjugado fluorescente dirigido contra la parte Fc de la
inmunoadhesina de polipéptido IL-22 (por ejemplo,
anticuerpo anti-Fc-humano de cabra
conjugada con FITC). A continuación, se lavan otra vez las células
y se examinan en el microscopio. Se considera una interacción
positiva mediante la presencia de marcaje fluorescente de células
transfectadas con ADNc que codifica un receptor de polipéptido
IL-22 concreto o un conjunto de receptores y una
ausencia de marcaje fluorescente similar de células preparadas de
modo similar que se han transfectado con otro ADNc o conjuntos de
ADNc. Si se considera positivo un conjunto definido de vectores de
expresión de ADNc para la interacción con una inmunoadhesina de
polipéptido de IL-22, se evaluan individualmente las
muestras de ADNc individuales que comprenden el conjunto (el
conjunto se "descompone") para determinar el ADNc específico
que codifica un receptor capaz de interaccionar con la
inmunoadhesina de polipéptido IL-22.
En otra realización de este ensayo, se permite
que un potencial polipéptido IL-22 ligando
etiquetado con un epítopo (por ejemplo una etiqueta de 8 histidinas
"His") interaccione con un panel de potenciales moléculas de
polipéptido IL-22 receptoras que se han expresado
como fusiones con el dominio de Fc de IgG humanas (inmunoadhesinas).
Pasada una hora de co-incubación con el polipéptido
IL-22 etiquetado con epítopo, se inmunoprecipitó
cada uno de los receptores candidatos con partículas de proteína A
y se lavaron las partículas. Se determina la interacción del
ligando potencial mediante análisis de transferencia western de los
complejos inmunoprecipitados con anticuerpo dirigido hacia la
etiqueta epítopo. Se considera que tiene lugar una interacción si se
observa una banda del peso molecular anticipado de la proteína
etiquetada con epítopo en el análisis de transferencia western con
un receptor candidato, pero no se observa que tenga lugar con los
otros miembros del panel de receptores potenciales.
Utilizando estos ensayos, en la presente
invención se han identificado las siguientes interacciones
receptor/ligando:
1. IL-22 se une a
IL-10R\beta. Figura 10 (SEC ID NO: 3)
2. IL-22 se une a
IL-22R. Figura 11 (SEC ID NO: 4)
(Ver también [Xie et al., J. Biol. Chem
(2000) 275, 31335-31339]).
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron "blots" Northern de múltiples
tejidos de Clontech (Palo Alto, CA). Se hibridaron estos
"blots" con una sonda fabricada mediante el marcaje en el
extremo de un oligonucleótido específico de receptor de
IL-22 de 50 unidades utilizando
32P-\gammaATP y T4 polipéptido quinasa. Se lavaron
los "blots" 3 veces con 2XSSC/0,2% SDS y 1 vez con
0,2XSSC/0,1% SDS a 42ºC. A continuación, se expusieron los
"blots" a una película X-OMAT con pantallas
intensificadoras durante 16 horas. Se muestra el resultado en la
Figura 3. Esto muestra que el receptor de IL-22 es
muy expresado en el páncreas, con un menor nivel de receptor
IL-22 observado en el intestino delgado, el hígado,
el riñón y el cólon.
Se obtuvo el ARN total mediante la
homogenización de tejidos en tampón de lisis y se puso en capas el
lisato sobre cloruro de cesio (CsCl 5,7 M/EDTA 50 mM) y sev
centrifugó a 35.000 X g durante 16 horas. A continuación, los
residuos celulares se resuspendieron en agua sin ARNasa. A
continuación, se utilizaron 50 nanogramos de ARN para realizar el
análisis Taqman^{TM}. El valor de la expresión se estableció en
relación con el gen de mantenimineto ("housekeeping")
GADPH.
La reacción TaqMan^{TM} es una técnica
fluorescente basada en PCR que utiliza la actividad de la 5'
exonucleasa de la enzima Taq ADN polimerasa para controlar la
amplificaicón a tiempo real. Se utilizan dos cebadores de
oligonucleótidos para generar un amplicón típico de una reacción de
PCR. Se diseña un tercer oligonucleótido, o sonda, para detectar la
secuencia de nucleótidos situada entre los dos cebadores de PCR. La
sonda no es extendible por la enzima Taq ADN polimerasa y está
marcada con un colorante fluorescente informador y un colorante
fluorescente desactivador. Cualquier emisión inducida por láser
procedente del colorante informador es desactivado por el colorante
desactivante cuando los dos colorantes se localizan de manera
próxima ya que están en la sonda. Durante la reacción de
amplificación, la enzima Taq ADN polimerasa divide la sonda de
manera dependiente con la plantilla. Los fragmentos de sonda
resultantes se disocian en solución y la señal del colorante
informador liberado está libre del efecto desactivador del segundo
fluoróforo. Se libera una molécula de colorante informador para
cada nueva molécula sintetizada, y la detección del colorante
informador no desactivado proporciona la base para la
interpretación cuantitativa de los datos.
\newpage
Los resultados de la reacción de TaqMan^{TM}
se expresan como unidades delta (A) Ct. Los datos del ensayo
TaqMan^{TM} se expresan inicialmente como Ct, o el ciclo umbral.
Éste se define como el ciclo en el que la señal informadora se
acumula por encima del nivel base de fluorescencia. Los valores ACt
se utilizan como medida cuantitativa del número relativo de copias
de partida de una secuencia diana particular en una muestra de
ácido nucleico cuando se comparan los resultados de cáncer con
resultados humanos normales. Una unidad corresponde a 1 ciclo de
PCR o a aproximadamente a una amplificación de 2 veces respecto a la
normal; dos unidades corresponden a 4 veces; 3 unidades a una
amplificación de 8 veces, etc. La cuantificación se obtuvo
utilizando cebadores y una sonda fluorescente TaqMan^{TM}
derivada del gen que codifica el receptor de IL-22
(IL-22R). Las regiones de IL-22R
que más probablemente contienen secuencias de ácido nucleico únicas
y que menos probablemente tienen intrones ayustados ("spliced
out") son las preferidas para la derivación del cebador y la
sonda, por ejemplo, regiones 3' no traducidas. Las secuencias para
los cebadores y las sondas (directa, inversa y sonda) utilizadas
para el análisis de la amplificación del gen de
IL-22R fueron las siguientes:
165608.tm.f1 (cebador directo)
| 5'TGCAACCTGACGGTGGAGA 3' | (SEC ID NO: 5) |
\vskip1.000000\baselineskip
165608.tm.r1 (cebador inverso)
| 5'AGAGAGCTGAACCTGTCAGTCATCTT 3' | (SEC ID NO: 6). |
\vskip1.000000\baselineskip
165608.tm.p1(sonda)
| 5' CAGTGCGGGAGGCCGGTCA 3' | (SEC ID NO: 7) |
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento de TaqMan^{TM} se realiza en
un dispositivo de PCR cuantitativo a tiempo real, tal como el de
ABI Prism 7700TM. El sistema consiste en un termociclador, un láser,
una cámara de dispositivo acoplado a la carga (CCD) y un ordenador.
El sistema amplifica las muestras en un formato de 96 pocillos en un
termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente
inducida por el láser se recoge a tiempo real a través de cables de
fibra óptica para los 96 pocillos, y se detecta en la CCD. El
sistema incluye el programa para poner en marcha el instrumento y
para analizar los datos.
La concentración de ARNm determinada por
fluorimetría se utilizó a continuación para diluir cada muestra a
10 ng/\mul en ddH2O. Esto se realizó simultáneamente en todas las
muestras de plantilla para un solo ensayo en placas TaqMan^{TM},
y con material suficiente para realizar diversos ensayos. Las
muestras se analizaron por triplicado con cebadores TaqMan^{TM} y
sondas, tanto \beta-actina como GAPDH, en una sola
placa con ARNm humano normal, sin añadir Transcriptasa Inversa y
controles sin plantilla. La transcriptasa inversa utilizada fue
SuperScript II (Life Technologies Inc., Grand Island, NY). La Taq
Polimerasa, tampones y dNTPs fueron suministrados por Perkin Elmer
(Perkin Elmer, Applied Biosystems División, Foster City, CA). Las
condiciones del termociclador fueron las siguientes:
| a. | 1 ciclo de: | Transcripción inversa | 48ºC, | 30 minutos |
| b. | 1 ciclo de: | Desnaturalizar | 95ºC, | 10 minutos |
| c. | 40 ciclos de: | Desnaturalizar | 95ºC, | 30 segundos |
| Extender | 60ºC, | 90 segundos |
Los resultados de esto se muestran en la figura
4. El receptor de interleuquina-22 se expresó
mayoritariamente en el páncreas, detectando expresión en hígado
fetal, hígado adulto, riñón, intestino y colon.
266-6 es una línea celular
derivada de células acinares pancreáticas de ratón y se obtuvo de
ATCC (depósito de ATCC Nº CRL-2151). Se cultivaron
estas células en DMEM complementado con 10% FBS
penicilina/estreptomicina y L-glutamina 2 mM (Life
Technologies Gaithersburg, MD) y se mantuvieron en una cámara
humidificada con CO2 al 5%. Se estimularon las células
266-6 con control de IL-22 de ratón
etiqueado con his que contenía sobrenadante de baculovirus (10%
vol/vol) durante 10 minutos a 37ºC. Se prepararon lisatos celulares
y se realizaron ensayos por desplazamiento en gel. Se adquirieron
anticuerpos utilizados para experimentos de superdesplazamiento
("supershift") de STAT en Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz,
CA). Las proteínas de unión a STAT inducidas por
IL-22 murino podían superdesplazarse con anticuerpos
hasta STAT 3, tal y como se muestra en la Figura 5. Esto demuestra
que la línea celular acinar pancreática 266-6
responde a IL-22 murino mediante la activación del
mecanismo de Janus Kinase (JAK-STAT), y a través de
STAT3 específicamente. La línea celular beta pancreática
(NIT-1), no utiliza el mecanismo
JAK-STAT (no se muestran datos).
La Proteína Asociada a la Pancreatitis (PAP1) es
una proteína secretada y se sobreexpresa en la pancreatitis aguda,
con niveles de expresión casi completamente ausentes en páncreas
normales [Iovanna et al., J Biol Chem.(1991), 266,
24664-24669]. Se desconoce la función exacta de
PAP1, aunque está relacionada estructuralmente con el dominio de
reconocimiento de carbohidratos de lectinas tipo c y es un miembro
de la familia de moléculas REG. Algunos documentos han sugerido
actividades tróficas para los miembros de la familia REG [Nishimune
et al., (2000) Nat Cell Biol 2(12),
906-14]. La inducción de PAP1 con otras citoquinas,
tales como IL-1 ó IL-6, tanto solos
como combinados, no han conseguido regular por incremento PAP1
[Dusetti et al., (1995) J. Biol Chem 270.,
22417-22421]. Se observan niveles incrementados en
suero de PAP1 en pacientes con enfermedad Celíaca, [Carroccio et
al., (1997) Digestion 58, 98-103] un trastorno
del intestino delgado, y en pacientes con fibrosis quística
[Iovanna et al., (1994) C.R. Acad. Sci 317,
561-564].
Se trataron células 266-6 con
IL-22 murino etiquetado con his purificado durante
6 horas. Se extrajo el ARN total mediante la homogenización de las
células en tampón de lisis y la formación de capas de los lisatos
celulares de cloruro de cesio (5,7 M CsCl/50 mM EDTA). Se
centrifugaron los lisatos celulares a 35.000 X g durante 16 horas.
Se resuspendieron los residuos celulares en agua sin ARNm. Se
resolvieron 20 microgramos de ARN utilizando un gel
desnaturalizante de formaldehído y se transfirieron a membranas de
celulosa. Se realizó la hibridación utilizando una sonda de
oligonucleótido marcada con 32P-\gammaATP
específica de PAP1. Se lavaron los "blots" 3 veces con 2X
SSC/0,2% SDS y 1 vez con 0,2XSSC/0,1% SDS a 42ºC. Se expusieron los
"blots" a una película X-OMAT con pantallas
intensificadoras durante 16 horas. A continuación, se deshicieron
los "blots" y se resondaron utilizando una sonda de
oligonucleótido específico de GAPDH marcada con
32P-\gammaATP. Este resultado se muestra en la
Figura 6A. La incubación de las células 266-6 con
IL-22 murino dio lugar a una inducción espectacular
de la expresión de gen de PAP1. Para determinar si las células
acinares pancreáticas primarias también son capaces de responder al
IL-22 murino, se aislaron células acinares primarias
de páncreas de ratón mediante digestión con colagenasa y se
incubaron durante 6 horas con o sin IL-22 murino
purificado. Se preparó ARN tal y como se describe anteriormente y
se examinó la expresión de PAP1. Del mismo modo que con la línea
celular 266-6, el IL-22 murino
indujo una regulación por incremento sustancial de la expresión de
PAP1 en las células acinares pancreáticas primarias aisladas.
Con el fin de examinar los efectos de
IL-22 murino in vivo, a tres grupos de
ratones se inyectaron intraperitonealmente 25 microgramos de
IL-22 murino o PBS. Los ratones se recogieron a las
2, 6 ó 24 horas después de la inyección y se extrajeron sus
páncreas y se congelaron rápidamente. Se preparó el ARN de este
tejido y se realizó un análisis de transferencia Northern, tal y
como se describe en el Ejemplo 5 utilizando una sonda específica
del gen de PAP1. Tal como se muestra en la figura 7, PAP1 se reguló
por incremento en las dos primeras horas después de la inyección de
IL-2 murino, alcanzando una expresión máxima en
aproximadamente 6 horas y aún estaba inducida a las 24 horas.
Para confirmar que la respuesta de páncreas
observada era debido a la señalización mediada por el receptor de
IL-22 en lugar de una toxicidad no específica de la
proteína recombinante, se inyectó mIL-22 en ratones
deficientes de IL-10R\beta (-/-). Estos ratones
carecen de una cadena funcional del complejo
IL-10R\beta/IL-22R para la
señalización de IL-22. Previamente se describió que
los ratones deficientes de IL-10R\beta carecían
de sensibilidad a IL-10. Los monocitos esplénicos
aislados de ratones deficientes de IL-10R\beta no
muestran una inhibición mediada por IL-10 de la
secreción de IL-6 inducida por lipopolisacáridos
(LPS) (figura 8) o TNF-alfa (no mostrado). Tal como
se ha indicado previamente, IL-22 parece que no
afecta a la respuesta de monocitos a LPS (Xie et al., (2000)
J. Biol. Chem., 275, 31335-31339).
IL-22 no parece afectar a la respuesta de monocitos
a LPS.
Los ratones que son deficientes o "knocked
out" de IL-10R\beta, carecen de una cadena
funcional del complejo receptor
IL-22R/IL-10R\beta necesario para
la señalización de IL-22, y previamente se describió
que los ratones deficientes de IL-10R\beta
carecían de sensibilidad a IL-10. A ratones
deficientes de IL-10R\beta y ratones de tipo
salvaje se inyectaron intraperitonealmente con o sin
IL-22 murino y se recogieron 16 horas después de la
inyección y se realizó un análisis de transferencia Northern sobre
el ARN pancreático utilizando sondas de PAP1 tal y como se describe
previamente. Dado que los ratones IL-10R\beta
carecen de una de las cadenas necesarias para transducir una señal
intracelular, no había una inducción de PAP1 evidente tal y como se
muestra en la figura 9. En cambio, los ratones de tipo salvaje
mostraron una fuerte inducción de expresión de PAP1 también
mostrada en la figura 9.
El siguiente procedimiento describe el uso de
una secuencia de nucleótidos que codifica IL-22 como
sonda de hibridación.
El ADN que comprende la secuencia codificante de
IL-22 de longitud completa o madura tal y como se
describe en la presente invención, se utiliza como sonda para cribar
los ADNs homólogos (tales como aquéllos que codifican variantes
naturales de IL-22) en bibliotecas de ADNc de tejido
humano o bibliotecas genómicas de tejido humano.
La hibridación y el lavado de filtros que
contienen cualquier ADN de biblioteca se realizan según las
siguientes condiciones de astringencia elevada. La hibridación de la
sonda radiomarcada derivada de IL-22 a los filtros
se realiza en una solución al 50% de formamida, 5x SSC, SDS al 0,1%,
pirofosfato de sodio al 0,1%, 50 mM de fosfato de sodio, pH 6,8, 2x
de solución de Denhardt, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante
20 horas. El lavado de los filtros se realiza en una solución
acuosa de 0,1x SSC y SDS al 0,1% a 42ºC.
A continuación, se pueden identificar los ADNs
que tienen una identidad en la secuencia deseada con el ADN que
codifica el IL-22 de secuencia nativa de longitud
completa utilizando las técnicas estándar conocidas en la
literatura.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
no glicosilada de IL-22 mediante la expresión
recombinante en E. coli.
La secuencia de ADN que codifica
IL-22 se amplifica inicialmente utilizando cebadores
de PCR seleccionados. Los cebadores deberían contener sitios para
enzimas de restricción que se correspondan con los sitios para
enzimas de restricción del vector de expresión seleccionado. Se
puede utilizar un conjunto de vectores de expresión. Un ejemplo de
un vector adecuado es el pBR322 (derivado del E. coli, véase
Bolivar et. al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para
la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. El vector se
digiere con una enzima de restricción y se defosforila. A
continuación, las secuencias amplificadas por PCR se unen en el
vector. El vector preferiblemente incluirá secuencias que codifican
un gen resistente a un antibiótico, un promotor trp, una secuencia
líder de polihis (incluyendo los primeros seis codones STII,
secuencia polihis, y sitio de división para la enteroquinasa), la
región codificante de IL-22, el finalizador
transcripcional lambda, y un gen argU.
A continuación, la mezcla de unión se utiliza
para transformar una cepa seleccionada de E. coli utilizando
los procedimientos descritos en Sambrook et. al.,
supra. Los transformantes se identifican por su capacidad
para crecer en placas de LB y, a continuación, se seleccionan las
colonias resistentes a los antibióticos. El ADN plásmido se puede
aislar y confirmar mediante el análisis de restricción y la
secuenciación del ADN.
Los clones seleccionados se pueden desarrollar
durante toda la noche en un medio de cultivo líquido, tal como
caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche
se puede utilizar posteriormente para inocular un cultivo a mayor
escala. A continuación, las células se desarrollan hasta una
densidad óptica deseada, durante la cual se activa el promotor de
la expresión.
Después de cultivar las células durante más
horas, las células se pueden recoger mediante centrifugación. El
residuo celular obtenido mediante la centrifugación se puede
solubilizar utilizando diversos agentes conocidos en la técnica y,
a continuación, la proteína IL-22 solubilizada se
puede purificar utilizando una columna quelante metálica en
condiciones que permiten la unión fuerte de la proteína.
El IL-22 puede expresarse en
E. coli en forma de etiqueta de poli-His,
utilizando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica
IL-22 se amplifica inicialmente utilizando cebadores
de PCR seleccionados. Los cebadores contendrán sitios para enzimas
de restricción que se corresponden con los sitios para enzimas de
restricción del vector de expresión seleccionado, y otras
secuencias útiles que proporcionan una iniciación de la traducción
eficaz y fiable, una purificación rápida en una columna quelante
metálica, y la extracción proteolítica con enteroquinasa. Las
secuencias etiquetadas con poli-His amplificadas por
PCR se unen a continuación en un vector de expresión que se utiliza
para transformar un E. coli huésped basado en la cepa 52
(W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts)
clpP(laclq). Los transformantes se cultivan en primer lugar
en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina a 30ºC con agitación
hasta alcanzar una D.O. 600 de 3-5. Los cultivos se
diluyen a continuación 50-100 veces en un medio
CRAP (preparado mezclando 3,57 g de (NH4)2SO4, 0,71 g de
citrato de sodio\cdot2H2O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de
levadura Difco, 5,36 g de Sheffield hycase SF en 500 ml de agua,
además de 110 mM de MPOS, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y 7 mM de
MgSO4) y se cultivan durante aproximadamente 20-30
horas a 30ºC con agitación. Las muestras se extraen para verificar
la expresión mediante un análisis SDS-PAGE, y el
volumen del cultivo se centrifuga hasta que las células son residuos
de centrifugación. Los residuos celulares se congelan hasta la
purificación y el repliegue.
La masa de E. coli de fermentaciones de
0,5 a 1 L (6-10 g de residuos celulares) se
resuspende en 10 volúmenes (p/v) de 7 M de guanidina, 20 mM de
Tris, tampón de pH 8. Se añade sulfito sódico sólido y tetrationato
de sodio para que las concentraciones finales sean de 0,1 M y 0,02
M, respectivamente, y la solución se agita durante toda la noche a
4ºC. Esta etapa da lugar a una proteína desnaturalizada con todos
los residuos de cisteína bloqueados por sulfitolización. La
solución se centrifuga a 40.000 rpm durante 30 minutos en una
ultracentrífuga Beckman. El sobrenadante se diluye con
3-5 volúmenes de tampón de columna quelante metálica
(6 M de guanidina, 20 mM de Tris, pH 7,4) y se filtra a través de
filtros de 0,22 micras para aclarar. El extracto purificado se
carga en una columna quelante metálica Qiagen Ni-NTA
de 5 ml equilibrada con el tampón de columna quelante metálica. La
columna se lava con un tampón adicional que contiene 50 mM de
imidazol (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluye
con un tampón que contiene 250 mM de imidazol. Las fracciones que
contienen la proteína de interés se agrupan y se guardan a 4ºC. La
concentración de la proteína se estima según su absorbancia a 280
nm utilizando el coeficiente de extinción calculado en base a su
secuencia de aminoácidos.
Las proteínas se repliegan mediante la dilución
lenta de la muestra en tampón de repliegue preparado nuevo
consistente en: 20 mM de Tris, pH 8,6, 0,3 M de NaCl, 2,5 M de urea,
5 mM de cisteína, 20 mM de glicina y 1 mM de EDTA. Los volúmenes de
repliegue se escogen de manera que la concentración final de
proteína está entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de
repliegue se agita suavemente a 4ºC durante 12-36
horas. La reacción de repliegue se desactiva mediante la adición de
TFA hasta una concentración final del 0,4% (pH de aproximadamente
3). Antes de otra purificación de la proteína, la solución se filtra
a través de un filtro de 0,22 micras y se añade acetonitrilo hasta
una concentración final del 2-10%. La proteína
replegada se somete a una columna de cromatografía de fase inversa
Poros R1/H utilizando un tampón móvil de TFA al 0,1% con elución
con un gradiente de acetonitrilo del 10 al 80%. Las alícuotas de
fracciones con una absorbancia A280 se analizan en geles de SDS
poliacrilamida y las fracciones que contienen proteína replegada
homogénea se agrupan. Generalmente, las muestras replegadas
correctamente de la mayoría de las proteínas se eluyen a las
concentraciones más bajas de acetronitrilo, ya que esas muestras
son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos protegidos de
la interacción con la resina de fase inversa. Las muestras agregadas
se eluyen normalmente a concentraciones de acetonitrilo superiores.
Además de solucionar las formas mal plegadas de proteínas de la
manera deseada, la etapa de la fase inversa también elimina la
endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contienen el polipéptido
IL-22 plegado deseado se agrupan y se elimina el
acetonitrilo utilizando una corriente suave de nitrógeno dirigida a
la solución. Las proteínas se formulan en 20 mM Hepes, pH 6,8 con
0,14 M de cloruro sódico y manitol al 4% por diálisis o por
filtración en gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia)
equilibradas en el tampón de formulación y filtradas estériles.
Muchos de los polipéptidos IL-22
descritos en la presente invención se expresaron de forma
satisfactoria tal y como se ha descrito anteriormente.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
potencialmente glicosilada de IL-22 mediante la
expresión recombinante en células de mamíferos.
El vector pRK5 (véase EP 307.247, publicada el
15 de marzo de 1989) se utiliza como vector de expresión.
Opcionalmente, el ADN de IL-22 está unido en el pRK5
con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción
del ADN de IL-22 utilizando procedimientos de unión
tales como los descritos en Sambrook et. al., supra.
El vector resultante se denomina
pRK5-IL-22.
En una realización, las células huésped
seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC
CCL 1573) se desarrollan para unirse en placas de cultivo de tejidos
en un medio tal como DMEM suplementado con suero de ternera fetal y
opcionalmente, componentes nutricionales y/o antibióticos. Se
mezclan aproximadamente 10 \mug de ADN de
pRK5-IL-22 con 1 \mug de ADN que
codifica el gen del ARN de VA [Thimmappaya et. al., Cell,
31:543 (1982)] y se disuelve en 500 \mul de 1 mM de
Tris-HCl, 0,1 mM de EDTA, 0,227 M de CaCl2. A esta
mezcla se le añade, gota a gota, 500 \mul de 50 mM de HEPES (pH
7,35), 280 mM de NaCl, 1,5 mM de NaPO4, y se deja formar un
precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspende y
se añade a células 293 y se deja reposar durante aproximadamente
cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml
de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. A continuación, las
células 293 se lavan con medio sin suero, se añade medio nuevo y
las células se incuban durante aproximadamente 5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las
transfecciones, el medio de cultivo se extrae y se reemplaza por
medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200
\muCi/ml de 35S-cisteína y 200 \muCi/ml de
35S-metionina. Tras una incubación de 12 horas, se
recoge el medio acondicionado, se concentra en un filtro de giro y
se carga en un gel SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y
exponerse a una película durante un período de tiempo concreto para
revelar la presencia del polipéptido IL-22. Los
cultivos que contienen células transfectadas pueden experimentar
una incubación adicional (en medio sin suero) y el medio se examina
en bioensayos concretos.
En una técnica alternativa, se puede introducir
IL-22 en células 293 transitoriamente utilizando el
procedimiento del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et.
al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981). Las células 293
se desarrollan hasta la máxima densidad en un frasco giratorio y se
añaden 700 \mug de ADN de
pRK5-IL-22. En primer lugar, las
células se concentran a partir del fraco giratorio mediante
centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de
ADN-dextrano se incuba sobre el residuo celular
durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20%
durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejido, y se
reintroducen en el frasco giratorio que contiene el medio de cultivo
de tejido, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de
transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el
medio acondicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las
células y los debris. La muestra que contiene el
IL-22 expresado se puede concentrar a continuación
y purificar mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como
la diálisis y/o cromatografía en columna.
En otra realización, el IL-22
puede expresarse en células CHO. El
pRK5-IL-22 puede transfectarse en
células CHO utilizando reactivos conocidos, tales como CaPO4 o
DEAE-dextrano. Tal y como se ha descrito
anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio
puede reemplazarse por medio de cultivo (solo) o medio que contiene
un radiomarcador, tal como la 35S-metionina. Después
de determinar la presencia del polipéptido IL-22,
el medio de cultivo puede reemplazarse por medio sin suero.
Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6
días y, a continuación, se recoge el medio acondicionado. A
continuación, el medio que contiene el IL-22
expresado puede concentrarse y purificarse mediante cualquier
procedimiento seleccionado.
El IL-22 etiquetado con epítopo
puede expresarse también en células CHO huésped. El
IL-22 puede subclonarse fuera del vector pRK5. El
inserto del subclon puede experimentar PCR para fusionarse en el
marco con una etiqueta de epítopo seleccionada, tal como una
etiqueta de poli-his en un vector de expresión de
Baculovirus. El inserto de IL-22 etiquetado con
poli-his puede subclonarse a continuación en un
vector conductor SV40 que contiene un marcador de selección, tal
como DHFR, para seleccionar clones estables. Finalmente, las células
CHO pueden transfectarse (tal y como se describe anteriormente) con
el vector conductor SV40. El marcaje puede realizarse, tal y como
se ha descrito anteriormente, para verificar la expresión. El medio
de cultivo que contiene el IL-22 etiquetado con
poli-His expresado puede a continuación concentrarse
y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal
como mediante cromatografía de afinidad de
quelante-Ni2+.
El IL-22 puede expresarse
también en células CHO y/o COS mediante un procedimiento de
expresión transitoria o en células CHO mediante otro procedimiento
de expresión estable.
La expresión estable en células CHO se realiza
utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresan
como una construcción IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias
codificantes de las formas solubles (por ejemplo, los dominios
extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan a una
secuencia de región constante de IgGI que contiene la bisagra, CH2
y los dominios de CH2 y/o es una forma etiquetada de
poli-his.
Tras la amplificación por PCR, los ADNs
respectivos se subclonan en un vector de expresión de CHO utilizando
técnicas estándar descritas en Ausubel et. al., Current
Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley and Sons
(1997). Los vectores de expresión de CHO se construyen para tener
sitios de restricción 5' y 3' compatibles del ADN de interés para
permitir el trasporte adecuado de los ADNc. El vector utilizado en
la expresión en las células CHO es tal y como se describe en Lucas
et. al., Nucl. Acid Res. 24:9 (1774-1779
(1996), y utiliza el promotor/potenciador temprano de SV40 para
dirigir la expresión del ADNc de interés y la dihidrofolato
reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para el
mantenimiento estable del plásmido tras la transfección.
Se introducen doce microgramos del ADN plásmido
deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando
reactivos de transfección Superfect® (Quiagen), Dosper® o Fugene®
(Boehringer Mannheim) disponibles comercialmente. Las células se
desarollan tal y como se describe en Lucas et. al.,
supra. Se congelan aproximadamente 3 x 10-7
células en una ampolla para un crecimiento y producción posterior
tal y como se describe a continuación.
Las ampollas que contienen el ADN plásmido se
descongelan colocándolas en un baño de agua y se mezclan mediante
centrifugación. El contenido se pipetea en un tubo de centrífuga que
contiene 10 mL de medio y se centrifuga a 1000 rpm durante 5
minutos. El sobrenadante se aspira y las células se resuspenden en
10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado a 0,2 \mum con un 5% de
suero bovino fetal dialfiltrado a 0,2 \mum). A continuación, las
células se fraccionan en un centrifugador de 100 mL que contiene 90
mL del medio selectivo. Después de 1-2 días, las
células se transfieren a un centrifugador de 250 mL lleno con 150 mL
de medio de crecimiento selectivo y se incuban a 37ºC. Después de
otros 2-3 días, se siembran centrifugadores de 250
mL, 500 mL y 2000 mL con 3 x 105 células/mL. El medio celular se
cambia por medio nuevo mediante centrifugación y resuspensión en el
medio de producción. Aunque se puede utilizar cualquier medio de CHO
adecuado, en realidad se puede utilizar un medio de producción
descrito en la patente estadounidense No. 5.122.469, concedida el
16 de junio de 1992. Se siembra un centrifugador de 3 L de
producción hasta 1,2 x 106 células/ml. En el día 0, se determina el
pH del número de células. En el día 1, se toman muestras en el
centrifugador y se inicia el burbujeo con aire filtrado. En el día
2, se toman muestras en el centrifugador, la temperatura se cambia
a 33ºC, y se toman 30 mL de glucosa a 500 g/L y 0,6 mL de antiespuma
al 10% (por ejemplo 35% de emulsión de polidimetilsiloxano, Dow
Corning 365 Medical Grade Emulsion). Durante toda la producción, el
pH se ajusta según la necesidad manteniéndose en valores alrededor
de 7,2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad cae por
debajo del 70%, el cultivo celular se recoge mediante centrifugación
y se filtra a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se
guarda a 4ºC o se carga inmediatamente en columnas para la
purificación.
Para las construcciones etiquetadas con
poli-his, las proteínas se purifican utilizando una
columna de Ni-NTA (Qiagen). Antes de la
purificación, se añade imidazol al medio acondicionado hasta una
concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombea en una
columna de 6 ml de Ni-NTA equilibrada en 20 mM
Hepes, pH 7,4, tampón que contiene 0,3 M de NaCl y 5 mM de imidazol
a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min. a 4ºC. Tras
cargarse, la columna se lava con un tampón de equilibrio adicional y
la proteína se eluye con el tampón de equilibrio que contiene 0,25
M de imidazol. La proteína altamente purificada se desala
posteriormente en un tampón de almacenamiento que contiene 10 mM
Hepes, 0,14 M de NaCl y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25
Superfine (Pharmacia) de 25 ml y se guarda a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contienen Fc) se purifican a partir del medio acondicionado tal y
como se indica a continuación. El medio acondicionado se bombea a
una columna de Proteína A (Pharmacia) de 5 ml que ha sido
equilibrada en un tampón de 20 mM de fosfato sódico, pH 6,8. Después
de cargarse, la columna se lava ampliamente con tampón de
equilibrio antes de la elución con 100 mM de ácido cítrico, pH 3,5.
La proteína eluída se neutraliza inmediatamente recogiendo
fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 \muL de tampón de
Tris 1M, pH 9. La proteína altamente purificada se desala
posteriormente en un tampón de almacenamiento, tal como el descrito
anteriormente para las proteínas etiquetadas con
poli-his. La homogeneidad se calcula mediante geles
de poliacrilamida SDS y mediante la secuenciación de los aminoácidos
N-terminales mediante degradación Edman.
Muchos de los polipéptidos IL-22
descritos en la presente invención se expresaron de forma
satisfactoria tal y como se ha descrito anteriormente.
El siguiente procedimiento describe la expresión
recombinante de IL-22 en levadura.
En primer lugar, los vectores de expresión de
levadura se construyen para la producción o secreción intracelular
de IL-22 a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN
que codifica IL-22 y el promotor se insertan en los
sitios para enzimas de restricción adecuados en el plásmido
seleccionado para dirigir la expresión intracelular de
IL-22. Para la secreción, el ADN que codifica
IL-22 puede clonarse en el plásmido seleccionado,
junto con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido
señal de IL-22 nativo u otro péptido señal de
mamífero, o, por ejemplo, una secuencia señal/líder de factor alfa
de levadura o la secuencia señal/líder secretora de la invertasa, y
secuencias enlazadoras (si se necesitan) para la expresión de
IL-22.
Las células de levadura, tales como la cepa
AB110 de la levadura, pueden a continuación transformarse con los
plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en medio
de fermentación seleccionado. Los sobrenadantes de levadura
transformados pueden analizarse mediante precipitación con ácido
tricloroacético al 10% y separación mediante
SDS-PAGE, seguido de la tinción de los geles con
azul de Coomassie.
El IL-22 recombinante puede
aislarse posteriormente y purificarse mediante la extracción de las
células de levadura del medio de fermentación mediante la
centrifugación y, a continuación, la concentración del medio
utilizando filtros de cartucho específicos. El concentrado que
contiene IL-22 puede purificarse adicionalmente
utilizando resinas de cromatografía en columna concretas.
Muchos de los polipéptidos IL-22
descritos en la presente invención se expresaron de forma
satisfactoria tal y como se ha descrito anteriormente.
El siguiente procedimiento describe la expresión
recombinante de IL-22 en células de insecto
infectadas de Baculovirus.
La secuencia que codifica IL-22
se fusiona en dirección 5' a un epítopo etiqueta contenido en un
vector de expresión de baculovirus. Dichas epítopo etiquetas
incluyen etiquetas de poli-his y etiquetas de
inmunoglobulina (como las regiones Fc de 1gG). Pueden utilizarse un
conjunto de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de los
plásmidos disponibles comercialmente, tales como pVL1393 (Novagen).
Brevemente, la secuencia que codifica IL-22 o la
parte deseada de la secuencia que codifica IL-22,
tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una
proteína transmembrana o la secuencia que codifica la proteína
madura si la proteína extracelular se amplifica mediante PCR con
cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5'
puede incorporar sitios para enzimas de restricción flanqueantes
(seleccionados). El producto se digiere a continuación con todas
esas enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector
de expresión.
El baculovirus recombinante se genera mediante
la cotransfección del plásmido anterior y el ADN del virus
BaculoGoldTM (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda
("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (disponible
comercialmente de GIBCO-BRL). Después de
4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados
se recogen y se utilizan para amplificaciones adicionales. La
infección viral y la expresión de la proteína se realizan tal y
como describe en O'Reilley et. al., Baculovirus expresion
vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press
(1994).
A continuación, el IL-22
etiquetado con poli-His expresado puede purificarse,
por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad con Ni2+-quelato
tal y como se indica a continuación. Los extractos se preparan a
partir de las células recombinantes Sf9 infectadas del virus tal y
como se ha descrito por Rupert et. al., Nature, 362:
175-179 (1993). Brevemente, las células Sf9 se
lavan, se resuspenden en el tampón de sonicación (25 ml Hepes, pH
7,9; 12,5 mM de MgCl2; 0,1 mM de EDTA: glicerol al 10%;
NP-40 a 0,1%; 0,4 M de KCl), y se sonica dos veces
durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se purifican por
centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en el tampón
de carga (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH 7,8)
y se filtra a través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara una
columna de agarosa Ni2+-NTA (comercialmente disponible de Qiagen)
con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se
equilibra con 25 ml del tampón de carga. El extracto celular
filtrado se carga en la columna a 0,5 mL por minuto. La columna se
lava hasta la línea base a A280 con el tampón de carga, en cuyo
punto se inicia la recogida de la fracción. A continuación, la
columna se lava con un tampón de lavado secundario (50 mM fosfato;
300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye las proteínas
unidas no específicamente. Después de alcanzar de nuevo la línea
base a A280, la columna se desarrolla con un gradiente de 0 a 500
mM de imidazol en el tampón de lavado secundario. Se recogen
fracciones de un mL y se analizan mediante SDS-PAGE
y tinción con plata o transferencia Western con Ni2+-NTA conjugado
a fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen
IL-22 etiquetado con His10 eluído se agrupan y se
dializan contra el tampón de carga.
Alternativamente, la purificación del
IL-22 etiquetado con IgG (o con Fc) puede realizarse
usando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo, por
ejemplo, cromatografía en columna con Proteína A o proteína G.
Muchos de los polipéptidos IL-22
descritos en la presente invención se expresaron de forma
satisfactoria tal y como se ha descrito anteriormente.
Este ejemplo ilustra la preparación de
anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a
IL-22.
Las técnicas para producir los anticuerpos
monoclonales son conocidas en la técnica y están descritas, por
ejemplo, en Goding, supra. Entre los inmunógenos que se
pueden utilizar se incluyen IL-22 purificado,
proteínas de fusión que contienen IL-22, y células
que expresan IL-22 recombinante en la superficie
celular. La selección del inmunógeno puede realizarse según el
técnico en la materia sin una gran experimentación.
Los ratones, tales como Balb/c, se inmunizan con
el inmunógeno de IL-22 emulsionado en adyuvante
completo de Freund y se injecta subcutáneamente o
intraperitonealmente en una cantidad de 1-100
microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsiona en el
adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research,
Hamilton, MT) y se inyecta en las bases de las patas traseras del
animal. A continuación, los ratones inmunizados a continuación son
reforzados 10 a 12 días después con inmunógeno adicional emulsionado
en el adyuvante seleccionado. A continuación, durante diversas
semanas, los ratones también se pueden reforzar con inyecciones de
inmunización adicionales. Las muestras de suero se pueden obtener
periódicamente de los ratones mediante muestras de sangre
retro-orbitales para ser analizadas en ensayos
ELISA para detectar anticuerpos
anti-IL-22.
Después de detectar un título de anticuerpo
adecuado, a los animales "positivos" para anticuerpos se les
puede inyectar una inyección intravenosa final de
IL-22. De tres a cuatro días más tarde, los ratones
se sacrifican y se recogen las células del bazo. A continuación, las
células del bazo se fusionan (usando polietilenglicol al 35%) a una
línea celular de mieloma murino seleccionada, tal como la
P3X63AgU.1, disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan
células de hibridoma que se pueden colocar a continuación en placas
de cultivo de tejido de 96 pocillos que contienen un medio HAT
(hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la
proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e
híbridos de células de bazo.
Las células de hibridomas se cribarán en un
ELISA por la reactividad contra IL-22. La
determinación de células de hibridomas "positivas" que
secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra
IL-22 está dentro de la técnica.
Las células de hibridomas positivas se pueden
inyectar intraperitonialmente en ratones singeneicos Balb/c para
producir ascites que contienen anticuerpos monoclonales
anti-IL-22. Alternativamente, las
células de hibridomas pueden desarrollarse en matraces de cultivos
de tejidos o en botellas en rodillo. La purificación de los
anticuerpos monoclonales producidos en los ascites se puede realizar
usando precipitación con sulfato de amonio, seguido por
cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede usarse la
cromatografía por afinidad basada en la unión del anticuerpo a la
proteína A o la proteína G.
Los polipéptidos IL-22 nativos o
recombinantes se pueden purificar mediante una variedad de técnicas
estándar en el campo de purificación de proteínas. Por ejemplo, se
purifica el polipéptido pro-IL-22,
el polipéptido IL-22 maduro, o el polipéptido
pre-IL-22 mediante cromatografía de
inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para el polipéptido
IL-22 de interés. En general, se construye una
columna de inmunoafinidad mediante acoplamientos covalentes de
anticuerpos de anti-polipéptido
IL-22 a una resina de cromatografía activada.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a
partir de sueros inmunes mediante precipitación con sulfato de
amonio o mediante purificación en la Proteína A inmovilizada
(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J). Asimismo, los
anticuerpos monoclonales se preparan a partir de los fluidos de
ascites de ratón mediante la precipitación con sulfato de amonio o
cromatografía en Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina
parcialmente purificada se une covalentemente a una resina
cromatográfica, tal como la SEPHAROSETM activada con CnBr (Pharmacia
LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina, la resina
se bloquea y la resina derivada se lava de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Dicha columna de inmunoafinidad se utiliza en la
purificación del polipéptido IL-22 mediante la
preparación de una fracción a partir de células que contienen
polipéptido IL-22 en una forma soluble. Esta
preparación se deriva por solubilización de toda la célula o de una
fracción subcelular obtenida mediante centrifugación diferencial
por adición de detergente o mediante otros procedimientos conocidos
en la técnica. Alternativamente, el polipéptido
IL-22 soluble que contiene una secuencia señal
podría secretarse en una cantidad útil en el medio en el que las
células crecen.
Una preparación que contiene polipéptido
IL-22 soluble se pasa por la columna de
inmunoafinidad, y la columna se lava en condiciones que permiten la
absorbancia preferencial del polipéptido IL-22 (por
ejemplo, tampones de fuerza iónica elevada en presencia de
detergente). A continuación, la columna se eluye en condiciones que
rompen la unión anticuerpo/polipéptido IL-22 (por
ejemplo, un tampón de pH bajo, tal como aproximadamente un pH de
2-3, o una alta concentración de caótropo, tal como
urea o ión tiocianato), y se recoge el polipéptido
IL-22.
La presente invención es particularmente útil
para cribar compuestos mediante la utilización de polipéptidos
IL-22 o fragmentos de unión de los mismos en
cualquiera de un conjunto de técnicas de cribado de fármacos. El
polipéptido IL-22 o el fragmento utilizado en dicha
prueba puede estar libre en solución, fijado a un soporte sólido,
adsorbido en una superficie celular o situado intracelularmente. Un
procedimiento de cribado de fármaco utiliza células huésped
eucariotas o procariotas, las cuales se transforman de forma estable
con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido
IL-22 o un fragmento. Los fármacos se criban contra
dichas células transformadas en ensayos de unión competitiva.
Dichas células, tanto en forma viable como fija, se pueden utilizar
para ensayos de unión estándar. Se puede medir, por ejemplo, la
formación de complejos entre el polipéptido IL-22 o
un fragmento y el agente que se está probando. Alternativamente, se
puede examinar la disminución en la formación del complejo entre el
polipéptido IL-22 y su célula diana o receptores
diana causada por el agente que se está probando.
De este modo, la presente invención proporciona
procedimientos de cribado para fármacos o cualquier otro agente que
puede afectar a una enfermedad o un trastorno asociados al
polipéptido IL-22. Estos procedimientos comprenden
el contacto de dicho agente con un polipéptido IL-22
o fragmento del mismo y el ensayo (I) de la presencia de un
complejo entre el agente y el polipéptido IL-22 o un
fragmento, o (II) de la presencia de un complejo entre el
polipéptido IL-22 o un fragmento y la célula,
mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. En dichos
ensayos de unión competitiva, el polipéptido IL-22 o
un fragmento están normalmente marcados. Después de una incubación
adecuada, el polipéptido IL-22 o un fragmento libres
se separan de la forma unida, y la cantidad de marca libre o no
complejada es una medida de la capacidad del agente concreto para
unirse al polipéptido IL-22 o para interferir en el
complejo polipéptido IL-22/célula.
Otra técnica para el cribado de fármacos
proporciona un cribado de alto rendimiento de compuestos que tienen
una afinidad de unión adecuada a un polipéptido y se describe en
detalle en WO 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984.
Brevemente, una gran cantidad de compuestos de diferentes péptidos
pequeños de prueba se sintetizan en un sustrato sólido, tal como
agujas de plástico o alguna otra superficie. Tal y como se aplica a
un polipéptido IL-22, las compuestos de péptidos de
prueba se hacen reaccionar con polipéptido IL-22 y
se lavan. Se detecta el polipéptido IL-22 unido
mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. El
polipéptido IL-22 purificado también puede
recubrirse directamente en placas para utilizar en las técnicas de
cribado de fármacos mencionadas anteriormente. Además, se pueden
utilizar anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e
inmovilizarlo en el
soporte sólido.
soporte sólido.
La presente invención también contempla la
utilización de ensayos de cribado de fármacos competitivos en los
cuales los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse a
polipéptidos IL-22 compiten específicamente con un
compuesto de prueba para unirse a polipéptido IL-22
o fragmentos del mismo. De esta manera, pueden utilizarse
anticuerpos para detectar la presencia de cualquier péptido que
comparte uno o más determinantes antigénicos con el polipéptido
IL-22.
El objetivo del diseño racional de fármacos es
producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente
activos de interés (es decir, un polipéptido IL-22)
o de pequeñas moléculas con las cuales interaccionan, por ejemplo,
agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos
se puede utilizar para crear fármacos que son formas más activas o
estables del polipéptido IL-22 o que potencian o
interfieren con la función del polipéptido IL-22
in vivo (c.f. Hodgson, Bio/Technology, 9:
19-21 (1991)).
En una estrategia, se determina la estructura
tridimensional del polipéptido IL-22, o de un
complejo polipéptido
IL-22-inhibidor, mediante
cristalografía de rayos X, mediante modelación por ordenador o, más
habitualmente, mediante una combinación de las dos estrategias.
Deben comprobarse la forma y las cargas del polipéptido
IL-22 para elucidar la estructura y para determinar
el sitio o sitios activos de la molécula. Con menor frecuencia,
podría obtenerse la información útil con respecto a la estructura
del polipéptido IL-22 mediante la modelación basada
en la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, la
información estructural pertinente se utiliza para diseñar
moléculas análogas de tipo polipéptido IL-22 o para
identificar inhibidores eficaces. Entre los ejemplos útiles de
diseño racional de fármacos se pueden incluir moléculas que han
mejorado la actividad o la estabilidad, tal como se muestra por
Braxton y Wells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)
o que actúan como inhibidores, agonistas o antagonistas de péptidos
nativos tal y como se muestra por Athauda et. al., J.
Biochem., 113: 742-746 (1993).
También es posible aislar un anticuerpo
específico de diana, seleccionado mediante un ensayo funcional, tal
y como se ha descrito anteriormente y, a continuación solucionar su
estructura cristalina. Esta estrategia, en principio, produce un
profármaco en el que puede basarse el diseño de fármacos posterior.
Es posible evitar una cristalografía de toda la proteína mediante
la generación de anticuerpos anti-idiotípico
(anti-ids) a un anticuerpo funcional
farmacológicamente activo. Como imagen especular de una imagen
especular, se esperaría que el sitio de unión del
anti-ids sería un análogo del receptor original. A
continuación, el anti-ids podría utilizarse para
identificar y aislar péptidos de bancos de péptidos producidos
química o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían entonces
como el profármaco.
En virtud de la presente invención, se pueden
fabricar cantidades suficientes del polipéptido
IL-22 para realizar estudios analíticos, tales como
la cristalografía de rayos-X. Además, el
conocimiento de la secuencia de aminoácidos del polipéptido
IL-22 proporcionada en la presente invención
proporcionará una guía para los usuarios de técnicas de modelación
por ordenador en lugar de o adicionalmente a la cristalografía de
rayos-X.
Los siguientes materiales se han depositado con
la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd..,
Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):
Estos depósitos se realizaron según lo
estipulado en el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del
Procedimiento en Materia de Patentes y el Reglamento bajo el mismo
(Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo
viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha del
depósito. Los depósitos estarán disponibles mediante la ATCC según
los términos del Tratado de Budapest, y están sujetos a un acuerdo
entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura la disponibilidad
permanente y sin restricción de la progenie del cultivo del depósito
al uso público tras la publicación de la respectiva patente
estadounidense o tras ponerse abierta a la inspección pública de
cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, la que
sea primera, y asegura la disponibilidad de la progenie para
alguien determinado por la U.S. Commissioner of Patents and
Trademarks para tener el derecho a la misma de acuerdo con 35 USC
\NAK 122 y las normas de la Commissioner según las mismas
(incluyendo 37 CFER \NAK 1.14 con referencia concreta a 886 OG
638).
El cesionario de la presente solicitud ha
acordado que si un cultivo de los materiales en el depósito muriera
o se perdiera o se destruyera cuando se cultiva en las condiciones
adecuadas, los materiales serán inmediatamente reemplazados en una
notificación por otros iguales. La disponibilidad del material
depositado no se interpreta como una licencia para realizar la
invención contraviniendo los derechos concedidos bajo la autoridad
de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patente.
La memoria escrita anterior se considera que es
suficiente para permitir a un experto en la materia realizar la
invención. La presente invención no se limita en su alcance por la
construcción depositada, ya que la realización depositada pretende
ser una ilustración individual de ciertos aspectos de la presente
invención y otras construcciones que son funcionalmente
equivalentes están dentro del alcance de la presente invención tal
y como se define en las reivindicaciones. El depósito del material
de la presente invención no constituye una admisión de que la
descripción escrita contenida en la presente invención sea
inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la
invención, incluyendo el modo óptimo de la misma, ni se interpreta
como limitante del alcance de las reivindicaciones a las
ilustraciones específicas que representa. De hecho, las diversas
modificaciones además de las mostradas y descritas en la presente
invención serán evidentes para los expertos en la materia a partir
de la descripción anterior y caen dentro del alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
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Biochem., 1993, vol. 113, 742-746
[0266].
Claims (21)
1. Método de inhibición de la expresión inducida
por IL-22 de PAP1 por células pancreáticas en un
sistema que comprende dichas células, comprendiendo dicho método
poner en contacto dicho sistema in vitro con un anticuerpo
antagonista de IL-22 inhibiéndose de este modo dicha
expresión de PAP1 por dichas células pancreáticas, en el que
IL-22 es un polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID No. 2), con o sin el
péptido señal.
2. Uso de un anticuerpo antagonista de
IL-22 tal como se define en la reivindicación 1, en
la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o
profiláctico de un trastorno pancreático en un mamífero.
3. Uso según la reivindicación 2, en el que el
trastorno pancreático es pancreatitis aguda, pancreatitis crónica,
carcinoma pancreático, incluyendo carcinoma de células acinares o
carcinoma pancreático de una población de células mixtas,
activación pancreática o inflamación pancreática.
4. Método de diagnóstico del estado activado o
inflamatorio del páncreas en un mamífero, que comprende poner en
contacto una muestra biológica obtenida del páncreas de dicho
mamífero con IL-22 tal como se define en la
reivindicación 1, y medir el superdesplazamiento del polipéptido
STAT3, en el que la presencia del superdesplazamiento es indicativo
de la presencia de dicho trastorno.
5. Método de detección del polipéptido
IL-22 tal como se define en la reivindicación 1, en
una muestra sospechosa de contener un polipéptido
IL-22, comprendiendo dicho método poner en contacto
dicha muestra con un polipéptido IL-10R\beta
(figura 12; SEC ID No. 3) o un polipéptido IL-22R
(figura 11; SEC ID No. 4) y determinar la formación de un conjugado
de polipéptidos IL-22/IL-10R\beta
o un conjugado de polipéptidos
IL-22/IL-22R en dicha muestra, en
el que la formación de un conjugado es indicativa de la presencia de
un polipéptido IL-22 en dicha muestra.
6. Método según la reivindicación 5, en el que
dicha muestra comprende células sospechosas de expresar dicho
polipéptido IL-22.
7. Método según la reivindicación 5 o la
reivindicación 6, en el que dicho polipéptido
IL-10R\beta o dicho polipéptido
IL-22R están marcados con un marcador detectable o
están unidos a un soporte sólido.
8. Método de detección de un polipéptido
IL-22R tal como se define en la reivindicación 5, o
un polipéptido IL-10R\beta en una muestra
sospechosa de contener un polipéptido IL-22R o un
polipéptido IL-10R\beta, comprendiendo dicho
método poner en contacto dicha muestra con un polipéptido
IL-22 tal como se define en la reivindicación 1, y
determinar la formación de un conjugado de polipéptidos
IL-22R/IL-22 o un conjugado de
polipéptidos IL-10R\beta/IL-22 en
dicha muestra, en el que la formación de un conjugado es indicativa
de la presencia de un polipéptido IL-22R o un
polipéptido IL-10R\beta en dicha muestra.
9. Método según la reivindicación 8, en el que
dicha muestra comprende células sospechosas de expresar un
polipéptido IL-22R o un polipéptido
IL-10R\beta.
10. Método según la reivindicación 8 o la
reivindicación 9, en el que dicho polipéptido IL-22
está marcado con un marcador detectable o está unido a un soporte
sólido.
11. Método de unión de una molécula bioactiva a
una célula que expresa un polipéptido IL-22, tal
como se define en la reivindicación 1, comprendiendo dicho método
poner en contacto dicha célula in vitro con un polipéptido
IL-22R tal como se define en la reivindicación 5, o
un polipéptido IL-10R\beta, que están unidos a
dicha molécula bioactiva y permitir la unión de dicho polipéptido
IL-22 o dicho polipéptido IL-22 y
dicho polipéptido IL-22R y dicho polipéptido
IL-10R\beta, uniendo de este modo dichas moléculas
bioactivas a dicha célula.
12. Método de unión de una molécula bioactiva a
una célula que expresa un polipéptido IL-22R, tal
como se define en la reivindicación 5, o un polipéptido
IL-10R\beta, comprendiendo dicho método poner en
contacto dicha célula in vitro con un polipéptido
IL-22 tal como se define en la reivindicación 1, que
está unido a dicha molécula bioactiva y permitir la unión de dicho
polipéptido IL-22 y dicho polipéptido
IL-22R o dicho polipéptido IL-22 y
dicho polipéptido IL-10R\beta, uniendo de este
modo dichas moléculas bioactivas a dicha célula.
13. Método según la reivindicación 11 o la
reivindicación 12, en el que dicha molécula bioactiva es una toxina,
un radiomarcador o un anticuerpo.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13, en el que dicha molécula bioactiva provoca
la muerte de dicha célula.
15. Método de modulación de por lo menos una
actividad biológica de una célula que expresa un polipéptido
IL-22 tal como se define en la reivindicación 1,
comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula in
vitro con (a) un polipéptido IL-22R tal como se
define en la reivindicación 5, (b) un polipéptido
IL-10R\beta, o (c) un anticuerpo
anti-polipéptido IL-22, donde dichos
(a) polipéptido IL-22R, (b) polipéptido
IL-10R\beta, o (c) anticuerpo
anti-polipéptido IL-22, se unen a
dicho polipéptido IL-22, modulando de este modo por
lo menos una actividad biológica de dicha célula.
16. Método de modulación de por lo menos una
actividad biológica de una célula que expresa un polipéptido
IL-22R tal como se define en la reivindicación 5, o
un polipéptido IL-10R\beta, comprendiendo dicho
método poner en contacto dicha célula in vitro con (a) un
polipéptido IL-22 tal como se define en la
reivindicación 1, (b) un anticuerpo
anti-polipéptido IL-22R, o (c) un
anticuerpo anti-polipéptido
IL-10R\beta, donde dichos (a) polipéptido
IL-22, (b) anticuerpo
anti-polipéptido IL-22R, o (c)
anticuerpo anti-polipéptido
IL-10R\beta, se unen a dicho polipéptido
IL-22R o polipéptido IL-10R\beta,
modulando de este modo por lo menos una actividad biológica de
dicha célula.
17. Método según las reivindicaciones 15 y 16,
en el que se asesina dicha célula.
18. Método de identificación de una molécula
para el tratamiento de un trastorno pancreático, comprendiendo el
método:
cribar las moléculas candidatas por la propiedad
de ser un antagonista de IL-22 tal como se define en
la reivindicación 1, mediante el contacto del polipéptido
IL-22 con una molécula candidata y la medición de
una inhibición detectable de uno o más de:
(a) polipéptido IL-22 que se une
al polipéptido IL-22R y/o el polipéptido
IL-10R\beta en una mezcla de reacción,
(b) expresión inducida por IL-22
de PAP1 por células pancreáticas cultivadas, y/o
(c) polipéptido STAT3 inducido por
IL-22 en células pancreáticas cultivadas, e
identificar una molécula que tiene la propiedad
de ser un antagonista de IL-22 como molécula para el
tratamiento de un trastorno pancreático.
19. Método según la reivindicación 18, en el que
el trastorno pancreático es tal como se define en la reivindicación
3.
20. Anticuerpo antagonista de
IL-22 tal como se define en la reivindicación 1,
para su uso en un método de tratamiento terapéutico o profiláctico
de un trastorno pancreático en un mamífero.
21. Anticuerpo de IL-22 según la
reivindicación 20, en el que el trastorno pancreático es
pancreatitis aguda, pancreatitis crónica, carcinoma pancreático,
incluyendo carcinoma de células acinares o carcinoma pancreático de
una población de células mixtas, activación pancreática o
inflamación pancreática.
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