CN103327997B - 膜突蛋白调节剂及其用途 - Google Patents
膜突蛋白调节剂及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103327997B CN103327997B CN201180059276.1A CN201180059276A CN103327997B CN 103327997 B CN103327997 B CN 103327997B CN 201180059276 A CN201180059276 A CN 201180059276A CN 103327997 B CN103327997 B CN 103327997B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- moesin
- cell
- antibody
- application
- disease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Abstract
本申请提供了用于治疗和诊断与膜突蛋白活化相关的病症和疾病的组合物和方法。
Description
技术领域
本申请总体涉及分子生物学和医学研究。更具体地,本申请关注用于调节膜突蛋白活性及相关病症的方法和组合物。
背景技术
膜突蛋白,代表膜组织延伸刺突蛋白,是一种最初在牛子宫中鉴定得到的膜结合细胞内蛋白,其特征为可能是肝素受体。Lankes等,Biochem J.251:831-42(1988)。全长天然人膜突蛋白具有577个氨基酸,其分子量约为75kD。其与小鼠膜突蛋白具有约98.3%的序列同一性。Sato等,J.Cell Sci.103:131-143(1992)。
进一步的研究将膜突蛋白作为埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ERM)蛋白家族成员。这些蛋白主要在细胞质中表达,集中在富含肌动蛋白的细胞-表面结构中。ERM蛋白的序列和结构分析显示,其在种间和分子间具有高度的同源性。ERM蛋白具有三个结构域:称为FERM结构域的N-末端结构域(条带4.1、埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白同源结构域),因为其与条带4.1蛋白具有同源性,中心螺旋结构域和C-末端尾结构域。C-末端尾结构域与F-肌动蛋白结合,而N-末端FERM结构域负责与细胞质膜中的粘附分子结合。Louvet-Vallee(2000)。
ERM蛋白的功能由N-末端FERM结构域和C-末端尾结构域之间的分子内相互作用调节。Pearson等,Cell 101:259-70(2000);Louvet-Vallee(2000)。ERM蛋白的活性存在两种状态:休眠状态和活化状态。活化形式参与了细胞间相互作用,休眠形式存在于细胞质中。这两种状态之间的差异取决于蛋白的构象。在休眠形式下,FERM结构域与尾结构域紧密结合,其互相遮蔽各结构域上针对其他分子的结合位点。中心螺旋结构域作为柔性连接能够使两个末端结构域接触和结合。当紧密结合结构张开时,休眠的膜突蛋白活化,其FERM结构域通过结合特定的膜蛋白附着于膜上,C-末端尾结构域的最后34个残基与肌动蛋白丝结合。
在尾结构域中,在膜突蛋白的558位存在有苏氨酸残基(Thr 558)(根蛋白为564位,埃兹蛋白为567位),已发现其磷酸化在ERM蛋白的活化中起关键作用。Pearson等(2000)。Thr 558的磷酸化削弱了FERM/尾部的相互作用,并且在磷脂的存在下使相关结构域上的膜蛋白和F-肌动蛋白结合位点暴露。此外,活化的FERM结构域还参与了Rho信号通路。Takahashi等,J.Biol.Chem.272:23371-5(1997)。在膜突蛋白中,据信Thr 558是通过rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)被磷酸化的。Oshiro等,J.Biol.Chem.273:34663-6(1998)。已知的使Thr 558磷酸化的其他蛋白激酶包括,但不限于PKC、PIP5KIa、P38和Slik。Hipfner等,Genes Dev.18:2243-8(2004)。
膜突蛋白和其他ERM蛋白的存在和功能与多种生理和病理条件相关。其充当了细胞质膜与肌动蛋白细胞骨架之间的结构连接体,在形成微绒毛、细胞间粘附、维持细胞形态、细胞的活动性和膜运输中发挥作用。后续研究揭示其还参与了多条信号通路包括Rho通路、PI3-激酶/Akt通路和CD14通路。Louvet-Vallee,Biol.Cell 92:305-16(2000);Thome等,Infect.Immun.67:3215(1999)。已表明膜突蛋白在某些癌症的生长和转移中发挥作用。
膜突蛋白还与自身免疫性疾病相关。Wagatsuma等报告了在类风湿性关节炎(RA)患者中检出抗-ERM自身抗体。Wagatsuma等,Mol.Immunol.33:1171-6(1996)。在已检测的71个患者血清中,有24个样品(33.8%)与至少一个重组ERM抗原反应且有10个样品(14%)仅与重组膜突蛋白反应。然而,该研究未发现在抗-ERM抗体的存在与临床表现如疾病的持续时间或阶段之间具有明显的相关性。此外,在其他自身免疫性疾病患者如原发性Sojgren综合症(PSS)和系统性红斑狼疮(SLE)患者的血清中未发现任何针对这三个ERM蛋白的反应性。
Takamatsu等报告了在获得性再生障碍贫血(AA)患者的血清中检出针对膜突蛋白的特定抗体。Takamatsu等,Blood 109:2514-20(2007)。使用ELISA发现,在67个AA患者中有25个(37%)表现出高滴度的抗-膜突蛋白抗体。进一步的体外研究显示,来自AA患者的抗-膜突蛋白抗体诱导产生了炎性细胞因子如TNF-α和IFN-γ,提示其在疾病的病理生理过程中发挥作用。Espinoza等,Intl.Immu.21:913-23(2009);Takamatsu等,J.Immunol.182:703(2009)。
鉴于人膜突蛋白在多种生理和病理环境下具有复杂和重要的功能,需要对能够调节膜突蛋白活化的临床相关分子实体,及其制备方法和用途进行探索。本申请所描述的本申请提供了这些和其他益处。
本申请中引用的所有参考文献,包括专利申请文件和公开文件,均整体参考并入。
发明内容
本申请提供了在体外和体内调节膜突蛋白活性的组合物和方法。在一个实施方式中,通过抑制膜突蛋白活化调节膜突蛋白的功能。可以将膜突蛋白的调节剂用在治疗上,用于治疗与膜突蛋白的异常活化相关的疾病和病理状况,如癌症、纤维化和呼吸系统疾病。在一个实施方式中,膜突蛋白调节剂是分离的抗体,其与人膜突蛋白的C-末端尾结构域结合。在一个实施方式中,抗体与膜突蛋白尾结构域的结合干扰或阻断了Thr 558在尾结构域内的磷酸化,以阻断膜突蛋白的活化。
一方面,膜突蛋白调节剂包括截短的膜突蛋白片段,其具有人膜突蛋白C-末端尾结构域(SEQ ID NO:1)至少十个连续的氨基酸残基。此类片段能够通过竞争性结合发挥干扰作用,所述片段干扰天然膜突蛋白与该蛋白的蛋白激酶的相互作用,以阻断天然膜突蛋白的活化,所述蛋白激酶用于Thr 558磷酸化。
人膜突蛋白C-末端尾结构域的氨基酸序列如下所示:
HVAEPAENEQDEQDENGAEASADLRADAMAKDRSEEERTTEAEKNERVQKHLKALTSE
LANARDESKKTANDMIHAENMRLGRDKYKTLRQIRQGNTKQRIDEFESM(SEQ IDNO:1)
在一个实施方式中,膜突蛋白片段调节剂包括在Thr558位点周围的残基,如序列GRDKYKTLRQIRQ(SEQ ID NO:2)。
一方面,膜突蛋白调节剂包括能够干扰人膜突蛋白的Thr 558磷酸化的小分子化合物。此类小分子抑制剂可能直接结合并阻断Thr 558位点,或可能结合至膜突蛋白上导致构象改变或阻碍的位置,以阻断Thr 558位点与蛋白激酶结合。
在一个实施方式中,本申请的膜突蛋白调节剂干扰膜突蛋白与其结合伴侣(例如,结构蛋白或膜突蛋白底物)之间的相互作用,以破坏膜突蛋白在细胞骨架或其信号通路中的结构作用。
一方面,本申请的膜突蛋白调节剂与毒素如细胞毒剂连接。这些分子/物质可以与添加剂/增强剂如放射和/或化疗剂联合制剂或给药。
本申请还提供了用于调节与膜突蛋白的异常活化相关的病症或病理状况的方法。因此,一方面,本申请提供了一种在主体中调节膜突蛋白活化的方法,所述方法包括给予所述主体本申请的抑制Thr 558磷酸化的调节分子,以调节膜突蛋白的活化。
膜突蛋白参与多种细胞结构和信号通路,所述细胞结构和信号通路对多种生物学和生理功能具有重要作用,包括例如细胞增殖、细胞存活、细胞迁移、细胞形态发生和细胞凋亡。因此,一方面,本申请提供了一种抑制膜突蛋白活化细胞的生长(例如,增殖和/或存活)的方法,所述方法包括将细胞或组织与本申请的膜突蛋白调节剂接触,以抑制与膜突蛋白的活化相关的细胞增殖。另一方面,本申请提供了一种抑制膜突蛋白活化细胞的增殖的方法,所述方法包括将细胞或组织与有效量的本申请的调节剂分子接触,以抑制与膜突蛋白的活化相关的细胞增殖。
在一个实施方式中,本申请提供了一种在细胞或组织中诱导或促进凋亡的方法,所述方法包括将靶细胞或组织与有效量的本申请的调节剂分子接触,以诱导或促进细胞或组织的凋亡。靶细胞或组织可以是癌细胞/组织、上皮细胞/组织或者内皮细胞/组织。
一方面,本申请提供了一种在主体中治疗与膜突蛋白的异常活化相关的病理状况的方法;所述方法包括给予主体有效量的本申请的调节剂分子,以治疗所述状况。
一方面,本申请提供了一种治疗患有癌性肿瘤的哺乳动物的治疗方法,所述癌性肿瘤包含膜突蛋白异常活化的细胞,所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的本申请的调节剂分子,以有效治疗所述哺乳动物。
一方面,本申请提供了一种用于治疗或预防与膜突蛋白的异常活化相关的细胞增殖性疾病的方法,所述方法包括给予需要此类治疗的主体有效量的本申请的调节剂分子,以有效治疗或预防所述的细胞增殖性疾病。在一个实施方式中,所述的增殖性疾病是癌症。在又一个实施方式中,所述的增殖性疾病是器官纤维化如肺纤维化、囊性纤维化、肝硬化、心内膜心肌纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、克隆氏病、瘢痕瘤、系统性硬化症或进行性大块纤维化。
在一个实施方式中,在本申请的方法中靶向的细胞是癌细胞。例如,癌细胞可以选自以下组:乳腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、肺癌细胞、乳头状癌细胞(例如,甲状腺的)、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、中枢神经系统癌细胞、成骨肉瘤细胞、肾癌细胞、肝细胞癌细胞、膀胱癌细胞、前列腺癌细胞、胃癌细胞、头颈部鳞状癌细胞、黑色素瘤细胞和白血病细胞。在一个实施方式中,在本申请的方法中靶向的细胞是过度增殖和/或过度增生的细胞。在一个实施方式中,在本申请的方法中靶向的细胞是发育异常的细胞。在又一个实施方式中,在本申请的方法中靶向的细胞是转移性细胞。
本申请的组合物可以与其他治疗剂联合使用。在一个实施方式中,本申请的组合物可以与一种或多种细胞因子联用,如促炎性细胞因子。与本申请的组合物联用的促炎性细胞因子的例子包括,但不限于TNF(TNF-α和TNF-β)、IL-1和IL-6。在一个实施方式中,本申请的治疗方法进一步包括一个步骤,其中将靶细胞和/或组织(例如,癌细胞)暴露于放疗、化疗剂或其他细胞毒剂。
一方面,本申请提供了一种组合物,其包括一种或多种本申请的调节剂分子和载体。在一个实施方式中,所述载体是药学上可接受的。
附图的简要说明
图1(a)全长人膜突蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。
图1(b)全长人膜突蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO:4),其中划线部分表示大约编码C-末端结构域的核酸序列。
图2 pET32a(+)和pET28a(+)的限制性图谱和克隆谱。
图3在使用TNF-α(第1组)、针对全长膜突蛋白的抗体(第2组)、针对膜突蛋白C-末端尾结构域的抗体(第3组)、TNF-α和针对全长膜突蛋白的抗体(第4组)、TNF-α和针对膜突蛋白C-末端尾结构域的抗体(第5组)以及PBS溶液(第6组)处理后,HPMEC细胞增殖率的图示说明。
图4(a)在使用第1-6组处理后,HPMEC细胞早期凋亡的图示说明。
图4(b)在使用第1-6组处理后,晚期凋亡和死亡的HPMEC细胞的图示说明。
图5(a)HPMEC对照细胞培养36小时的电子显微镜照片(×6000)。
图5(b)仅经TNF-α处理36小时的HPMEC细胞的电子显微镜照片(×6000)。
图5(c)经TNF-α和针对全长膜突蛋白的抗体处理36小时的HPMEC细胞的电子显微镜照片(×6000)。
具体实施方式
除非另有说明,本申请的实施将采用常规的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术,其均在本领域常规技术手段的范围内。在文献中对此类技术进行了详细说明如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等,1989);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,1984版);Animal Cell Culture(R.I.Freshney,1987版);Methods in Enzymology丛书(Academic Press,Inc.);Current Protocols in MolecularBiology(F.M.Ausubel等,1987版,和定期更新);PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullis等,1994版)。本申请中使用的引物、多核苷酸和多肽可以采用本领域公知的标准技术制备。
除非另有定义,本申请所使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。Singleton等,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第二版,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994),和March,Advanced Organic ChemistryReactions,Mechanisms and Structure第四版,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992),针对本申请中使用的多个术语为本领域技术人员提供了一般性的指导。
定义
如Lankes和Furthmayr(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.,88:8297-8301中所描述的,术语“膜突蛋白”指膜组织延伸刺突蛋白。全长的人膜突蛋白是577个氨基酸的多肽,其具有如SEQID NO:3所示的氨基酸序列(图1)。根据下文中的进一步定义,膜突蛋白由三个结构域组成:N-末端FERM结构域、螺旋结构域和C-末端尾结构域。其属于ERM(埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白)家族。所述的三种ERM蛋白,主要在细胞质膜下的细胞质中表达,其具有高度的序列同源性,并作为细胞质膜和肌动蛋白细胞骨架之间的连接蛋白。此外,人膜突蛋白与其他种属如小鼠和牛的膜突蛋白之间具有高度的氨基酸序列同一性。Sato等,(1992)J.Cell Sci.103:131-143。
术语“截短的膜突蛋白片段”指短于全长野生型膜突蛋白的膜突蛋白多肽的一部分。特别地,该术语包括十个或更多个氨基酸的多肽,其具有膜突蛋白特定结构域(N-末端FERM结构域、螺旋结构域或C-末端尾结构域,将在下文中进一步定义)内的氨基酸序列。此类能够与结构域特异性抗膜突蛋白自身抗体结合的膜突蛋白片段在本申请中是有用的。
人膜突蛋白的“N-末端FERM结构域”指野生型人膜突蛋白的球状部分,其在结构上与所述蛋白的氨基末端邻近,在功能上负责将所述蛋白定位于细胞质膜并且与粘附分子相互作用。因为所述FERM结构域与条带4.1蛋白具有同源性而代表了条带4.1、埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白同源结构域。该FERM结构域定义了条带4.1蛋白超家族成员,其包括细胞骨架蛋白如红细胞条带4.1、踝蛋白和埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ERM)蛋白家族,以及若干酪氨酸激酶和磷酸酶及肿瘤抑制蛋白merlin。特别地,该术语指人膜突蛋白成熟形式的约前297个氨基酸残基(例如,氨基酸残基1-297)。在某些文献中,也将同一结构域称为N-ERM相关结构域(N-ERMAD),其包括在本申请的定义中。Bretscher等,(1995)Biochem.34,16830-7。
人膜突蛋白的“C-末端尾结构域”指野生型人膜突蛋白的一部分,其在结构上与所述蛋白的羧基末端邻近,在功能上负责与肌动蛋白丝结合并与其相互作用。膜突蛋白的尾结构域带正电并采用延伸、弯曲的结构。特别地,该术语指人膜突蛋白的约最后107个氨基酸残基(例如,氨基酸残基471-577)。在某些文献中,也将同一结构域称为C-ERM相关结构域(C-ERMAD),其包括在本申请的定义中。Bretscher等,(1995)。C-末端尾结构域的最后34个氨基酸残基在ERM蛋白中高度保守,并形成与F-肌动蛋白结合的区段。在F-肌动蛋白结合区段内,存在苏氨酸残基(在野生型人膜突蛋白中为Thr558),其在该蛋白活化的过程中磷酸化。
人膜突蛋白的“螺旋结构域”指位于N-末端FERM结构域和C-末端尾结构域之间的野生型人膜突蛋白的中间部分。其采用延伸的α-螺旋结构,作为两个末端结构域之间的连接子。特别地,该术语指包含人膜突蛋白大约298-470位氨基酸残基的区段。
关于肽或多肽序列的“氨基酸序列同一性百分率(%)”被定义为候选序列中与特定肽或多肽序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率,且是在序列比对后,且如果必要引入间隙以达到序列同一性的最大百分率,并且不把任何保守性氨基酸取代物作为所述序列同一性的一部分。用于确定氨基酸序列同一性百分率的比对可以通过本领域内公知的多种方法实现,例如使用公众可以获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能够确定用于测量比对的适宜参数,包括在待比较序列的全长范围内实现最大比对所需的任意算法。
“与膜突蛋白异常活化相关的疾病或病理状况”指在主体中由膜突蛋白异常活化引起或由其促进的疾病或状况。膜突蛋白的异常活化,其至少部分地由膜突蛋白C-末端尾结构域内的Thr 558磷酸化所致,与涉及异常上皮或内皮细胞的疾病过程和状况相关。与膜突蛋白异常活化相关的示例性病理状况包括,但不限于肿瘤的生长和转移、器官和组织的纤维化、肺动脉高压和炎症。
如本申请所使用的“肿瘤”指所有肿瘤细胞的生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,以及所有癌前以及癌细胞和组织。如本申请中所述的术语“癌症”、“癌”、“细胞增殖性疾病”和“肿瘤”并不是相互排斥的。
术语“癌症”和“癌”指或描述哺乳动物中的一种生理状况,其典型特征是细胞的生长/增殖失控。癌症的例子包括但不限于,癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症更具体的例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈部癌。
本申请中的“自身免疫性疾病”或“自身免疫性病症”是由定向针对个体自身的物质和组织产生免疫应答导致的疾病或病症。自身免疫性疾病或病症的例子包括,但不限于炎症应答如炎性皮肤疾病包括牛皮癣和皮炎(例如,特应性皮炎);系统性硬皮病和硬化症;与炎性肠病(如克隆氏病和溃疡性结肠炎)相关的应答;呼吸窘迫综合症(包括成人呼吸窘迫综合症;ARDS);皮炎;脑膜炎;脑炎;葡萄膜炎;结肠炎;肾小球肾炎;过敏性病症如湿疹和哮喘和其他病症包括T细胞浸润和慢性炎症应答;动脉粥样硬化;白细胞粘附缺陷;类风湿性关节炎;系统性红斑狼疮(SLE)(包括但不限于狼疮性肾炎、皮肤狼疮);糖尿病(例如,I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病);多发性硬化症;雷诺氏综合症;自身免疫性甲状腺炎;桥本氏甲状腺炎;变应性脑脊髓炎;干燥综合症;幼发型糖尿病;与一般见于结核病、结节病、多肌炎、肉芽肿和血管炎中,由细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性过敏症相关的免疫应答;恶性贫血(艾迪生氏病);涉及白细胞渗出的疾病;中枢神经系统(CNS)炎性疾病;多器官损伤综合症;溶血性贫血(包括,但不限于冷球蛋白血症或库姆斯阳性贫血);重症肌无力;抗原-抗体复合物介导的疾病;抗-肾小球基底膜病;抗磷脂综合症;过敏性神经炎;格雷夫斯氏病;兰伯特-伊顿肌无力综合症;大疱性类天疱疮;天疱疮;自身免疫性多发性内分泌病;莱特病;僵人综合症;白塞氏病;巨细胞动脉炎;免疫复合物性肾炎;IgA肾病;IgM多发性神经病;免疫性血小板减少性紫癜(YIP)或自身免疫性血小板减少等。
如本申请所使用的,“治疗”指临床干预,其试图改变被处理的个体或细胞的自然过程,并可以用于预防或在临床病理过程中实施。理想的治疗效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、减轻任何直接或间接的疾病的病理后果、防止转移、减少疾病进展的速度、改善或缓解疾病状态和缓解或改善预后。在某些实施方式中,本申请的抗体用于延缓病症或疾病的进展。
“有效量”指为了达到期望的治疗或预防结果,在所需剂量和时间内的有效量。
本申请的物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可以根据因素改变,所述因素如个体的疾病状态、年龄、性别和体重,以及物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引起所需应答的能力。治疗有效量也是所述物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗有益效果超过其任何毒性或不利作用的剂量。“预防有效量”指达到所需预防结果的剂量和所需时间的有效量。一般地,但不是必须的,由于预防剂量是在疾病的早期阶段或在此之前给予主体,因而预防有效量将低于治疗有效量。
如本申请所使用的,术语“药学上可接受的”指适宜给药的任何组分(例如,盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂)。
如本申请所使用的,术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语包括放射性同位素(例如,At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和放射性同位素Lu),化疗剂例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花类生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂、酶及其片段如核酸分解酶、抗生素和毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素包括其片段和/或变体,以及下文中公开的多种抗肿瘤或抗癌剂。其他细胞毒剂如下文所述。肿瘤破坏剂导致肿瘤细胞的破坏。
“化疗剂”是用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂如塞替派和CYTOXAN.RTM.环磷酰胺;烷基磺酸盐如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡;氮丙啶类,如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替派(uredopa);乙烯亚胺类和甲基蜜胺类(methylamelamines)包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺;乙酰精宁(特别是布拉他辛和布拉他辛酮);δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚,MARINOL.RTM.);β-拉帕醌;拉帕醇;秋水仙碱;桦木酸;喜树碱(包括合成类似物托泊替康(HYCAMTIN.RTM.)、CPT-11(伊立替康,CAMPTOSAR.RTM.)、乙酰喜树碱、东莨菪亭和9-氨基喜树碱);苔藓抑素;callystatin;CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物);鬼臼毒素;鬼臼酸;替尼泊苷;隐藻素类(cryptophycins,特别是cryptophycin 1和cryptophycin 8);多拉司他汀;duocarmycin(包括其合成类似物KW-2189和CB1-TM1);eleutherobin;pancratistatin;sarcodictyin;海绵素;氮芥如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥;亚硝基脲如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀;抗生素如烯二炔类抗生素(例如,卡里奇霉素,特别是卡里奇霉素γ1I和卡里奇霉素ωI1(参见例如,Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994)));达内霉素,包括达内霉素A;埃斯培拉霉素;以及新制癌菌素显色团和相关色素蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素(包括ADRIAMYCIN.RTM.、吗啉基-阿霉素、氰基吗啉基-阿霉素、2-吡咯啉-阿霉素、阿霉素HCl脂质体注射剂(DOXIL.RTM.)和去氧阿霉素)、表阿霉素、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星;抗代谢剂如甲氨蝶呤、吉西他滨(GEMZAR.RTM.)、替加氟(UFTORAL.RTM.)、卡培他滨(XELODA.RTM.)、埃博霉素和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙;嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤;嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氟氧尿苷、依诺他滨、氟尿苷;雄激素如卡鲁睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯;抗肾上腺类如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦;叶酸补充剂如亚叶酸(frolinic acid);醋葡醛内酯;醛磷酰胺糖苷;氨基乙酰丙酸;恩尿嘧啶;安吖啶;bestrabucil;比生群;依达曲沙;地磷酰胺(defofamine);秋水仙胺;地吖醌;elfornithine;依利醋胺;依托格鲁;硝酸镓;羟基脲;香菇多糖;氯尼达明;美登素(maytansinoids)如美登生碱和安丝菌素;米托胍腙;米托蒽醌;莫哌达醇;二胺硝吖啶(nitraerine);喷司他丁;蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星;洛索蒽醌;2-乙基酰肼;丙卡巴肼;PSK.RTM.多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.);雷佐生;根霉菌素;西索菲兰;锗螺胺;细交链孢菌酮酸;三亚胺醌;2,2′,2″-三氯三乙胺;单端孢霉烯族毒素(特别是T-2毒素、verracurin A、漆斑菌素A和蛇形菌素);乌拉坦;长春地辛(ELDISINE.RTM.,FILDESIN.RTM.);达卡巴嗪;甘露醇氮芥;二溴甘露醇;二溴卫矛醇;哌泊溴烷;gacytosine;阿拉伯糖苷(“Ara-C”);塞替派;紫杉烷例如紫杉醇(TAXOL.RTM.)、紫杉醇白蛋白纳米工程制剂(ABRAXANE.TM.)和多西他赛(TAXOTERE.RTM.);苯丁酸氮芥;6-硫鸟嘌呤;巯基嘌呤;甲氨蝶呤;铂类似物如顺铂和卡铂;长春花碱(VELBAN.RTM.);铂;依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺;米托蒽醌;长春新碱(ONCOVIN.RTM.);奥沙利铂;亚叶酸(leucovovin);长春瑞滨(NAVELBINE.RTM.);诺肖林;依达曲沙;柔红霉素;氨基蝶呤;伊拜膦酸盐;拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类维生素A如维甲酸;以及上述任意物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物;以及两种或多种上述物质的组合如CHOP,其为环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松龙联合治疗的缩写,和FOLFOX,其为奥沙利铂(ELOXATIN.TM.)与5-FU和亚叶酸联合治疗方案的缩写。
在本定义中还包括抗激素剂,其作用为调节、降低、阻断或抑制激素促进癌症生长的作用,其通常用系统或全身治疗的形式。其可能是激素本身。例如包括抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)包括例如他莫昔芬(包括NOLVADEX.RTM.他莫昔芬)、雷洛昔芬(EVISTA.RTM.)、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(FARESTON.RTM.);抗孕激素;雌激素受体下调剂(ERD);雌激素受体拮抗剂如氟维司群(FASLODEX.RTM.);抑制或关闭卵巢功能的试剂例如促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂如醋酸亮丙瑞林(LUPRON.RTM.和ELIGARD.RTM.)、醋酸戈含瑞林、醋酸布含瑞林和曲普瑞林(tripterelin);其他抗雄激素如氟他米特、尼鲁米特和比卡鲁胺;和抑制芳香酶的芳香酶抑制剂,其在肾上腺中调节雌激素的产生,如4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮(MEGASE.RTM.)、依西美坦(AROMASIN.RTM.)、formestanie、法倔唑、伏氯唑(RIVISOR.RTM.)、来曲唑(FEMARA.RTM.)和阿那曲唑(ARIMIDEX.RTM.)。此外,化疗剂的此类定义包括双膦酸盐如氯膦酸二钠(例如,BONEFOS.RTM.或OSTAC.RTM.)、依替膦酸钠(DIDROCAL.RTM.)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(ZOMETA.RTM.)、阿仑膦酸盐(FOSAMAX.RTM.)、帕米膦酸盐(AREDIA.RTM.)、替鲁膦酸盐(SKELID.RTM.)或利塞膦酸盐(ACTONEL.RTM.);以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物);反义寡核苷酸,特别是抑制基因在涉及异常细胞增殖的信号通路中表达的那些,如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R);疫苗如THERATOPE.RTM.疫苗和基因治疗疫苗,例如ALLOVECTIN.RTM.疫苗、LEUVECTIN.RTM.疫苗和VAXID.RTM.疫苗;拓扑异构酶1抑制剂(例如,LURTOTECAN.RTM.);rmRH(例如,ABARELIX.RTM.);二甲苯磺酸拉帕替尼(ErbB-2和EGFR双酪氨酸激酶小分子抑制剂,也称为GW572016);COX-2抑制剂如塞来昔布(CELEBREX.RTM.;4-(5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-吡唑基-1-基)苯磺酰胺;以及上述任意物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
术语“细胞因子”是由一个细胞群释放的蛋白的通用术语,所述细胞群作为细胞间介质作用于其他细胞。此类细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子和常规的多肽激素。细胞因子包括生长激素如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素;甲状旁腺激素;甲状腺素;胰岛素;胰岛素原;松弛素;松弛素原;糖蛋白激素如卵泡刺激激素(FSH)、甲状腺刺激激素(TSH)和促黄体激素(LH);肝生长因子;成纤维细胞生长因子;催乳素;胎盘催乳素;肿瘤坏死因子-α和-β;苗勒抑制物质;小鼠促性腺激素相关肽;抑制素;激活素;血管内皮生长因子;整合素;血栓形成素(TPO);神经生长因子如NGF-β;血小板生长因子;转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β;胰岛素样生长因子-I和-II;促红细胞生成素(EPO);骨诱导因子;干扰素如干扰素-α、-β和-γ;集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF);粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF);和粒细胞-CSF(G-CSF);白介素(IL)如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15;肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β;以及其他多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。如本申请所使用的,术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养的蛋白以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。作为细胞因子的子集,“促炎性细胞因子”指诱导或促进炎性反应的细胞因子。促炎性细胞因子的例子包括TNF-α、TNF-β、IL-1和IL-6。
“分离的”多肽指已从其天然环境的污染组分中鉴别和分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染组分是干扰多肽的诊断或治疗用途的材料,其可以包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方式中,所述多肽将被纯化至(1)通过Lowry法测得多肽以重量计大于95%,或者以重量计大于99%,(2)通过使用转杯式测序仪测得达到足以获得至少15个N-末端或内部氨基酸序列残基的程度,或者(3)通过使用考马斯蓝或银染色法以还原或非还原条件下的SDS-PAGE测得具有同质性。分离的多肽包括在重组细胞内原位的多肽,因为多肽天然环境中的至少一种污染组分将不存在。然而,通常的,分离的多肽将通过至少一个纯化步骤制备。
术语“抗体”使用其最广泛的含义并且特别地涵盖了单克隆抗体(包括全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如,双特异性抗体)和只要其展示出所需的生物活性的抗体片段(见下文)即可。
如本申请所使用的,术语“单克隆抗体”指来自基本上具有同质性的抗体的群体,即包括所述群体的个体抗体除了可能存在的少量突变外是相同的,例如天然产生的突变。因此,改良剂“单克隆”指抗体的特征为不是离散抗体的混合物。单克隆抗体高度特异性地针对单一抗原。在某些实施方式中,单克隆抗体通常包括抗体,所述抗体包含与靶点结合的多肽序列,其中靶向结合的多肽序列通过一个过程获得,所述过程包括从多个多肽序列中选择单一靶向结合的多肽序列。例如,该选择过程可以是从多个克隆如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆中选择唯一克隆。应理解,可以对所选择的靶结合序列进行进一步改造,例如改善其对靶点的亲和性、将所述靶结合序列人源化、改善其在细胞培养物中的生产、降低其在体内的免疫原性、形成多特异性抗体等,并且包含改造的靶结合序列的抗体仍是本申请的单克隆抗体。与多克隆抗体制备物通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体不同,各单克隆抗体均针对抗原上的单一决定簇。除了具有特异性以外,单克隆抗体制备物通常还具有不会被其他免疫球蛋白污染的益处。
具有指定抗体的“生物特性”的抗体是指具有与其他抗体不同的一个或多个生物特性的抗体,所述其他抗体与相同的抗原结合。
为了筛选与抗原表位结合的抗体,所述抗原与所关注的抗体结合,可以进行常规的交叉阻断分析,如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlowand David Lane(1988)中描述的。
术语本申请多肽的“生物活性”和“生物学上的活性”指分子特异性结合至并调节细胞应答例如增殖、迁移等的能力。细胞应答还包括通过受体介导的那些,包括但不限于,迁移和/或增殖。在本申请中,术语“调节”包括促进和抑制。
可以使用任何表明对患者的益处的终点对患者的应答性进行评估,包括但不限于,在治疗后的给定时间点(1)在某种程度上抑制疾病的进展,包括延缓和完全阻止;(2)减少疾病发作的次数和/或减轻症状;(3)缩小损伤尺寸;(4)抑制(即,减少、延缓或完全阻止)疾病细胞向周围邻近的器官和/或组织浸润;(5)抑制(即,减少、延缓或完全阻止)疾病传播;(6)在某种程度上减轻与疾病相关的一个或多个症状;(7)治疗后增加无病期的长度;(8)减少自身免疫性应答,其可能,但不必须,导致疾病损伤消失或除去的结果,例如无进展生存;(9)增加总生存期;(10)提高应答率和/或(11)降低死亡率。
术语“益处”使用其最广泛的含义并且指任意令人满意的效果。
本申请提供了用于调节膜突蛋白活性和用于治疗疾病的组合物和方法,所述疾病与上皮细胞机能障碍相关。本申请可以通过使用本领域技术人员公知的常规方法实施。
膜突蛋白活性的调节剂
膜突蛋白活性的调节剂包括模拟或增强膜突蛋白(激动剂)的一种或多种生物活性的那些,以及阻止或干扰膜突蛋白(拮抗剂或抑制剂)作用的那些。一方面,本申请所述的膜突蛋白调节剂是膜突蛋白的抑制剂。破坏膜突蛋白活性的任何分子都可以作为候选的抑制剂。本领域技术人员公知的筛选技术均可以用于鉴别这些分子。抑制膜突蛋白的一种方法是通过阻断休眠形式的磷酸化或通过将其活化形式去磷酸化来干扰其活化。在一个实施方式中,在C-末端尾结构域内的Thr 558位点完成对膜突蛋白磷酸化的这种破坏。“膜突蛋白磷酸化抑制剂”包括部分或完全阻断、抑制或干扰膜突蛋白上磷酸化位点的任何分子。此类抑制剂的例子包括,但不限于:(1)小分子有机和无机化合物,(2)小肽,(3)抗体及其衍生物,(4)与膜突蛋白或其他ERM家族蛋白密切相关的肽和(5)核酸适体。
1.小分子调节剂
小分子可以是膜突蛋白活性有用的调节剂。小分子调节剂的例子包括小肽,肽样分子,以及合成的、非肽基有机或无机化合物。一方面,本申请的小分子调节剂是可溶性的。“小分子”指分子量低于约5kD,或低于约0.6kD的组分。小分子可以是核酸、肽、多肽、肽类似物、碳水化合物、脂质或者其他有机或无机分子。化学和/或生物混合物如真菌、细菌或藻类提取物库是本领域公知的,可以使用任意分析对其进行筛选。对分子库合成方法进行描述的例子为Carell等,Angewandte Chemie International Edition.33:2059-2061(1994);Carell等,Angewandte Chemie International Edition.33:2061-2064(1994);Cho等,Science.261:1303-5(1993);DeWitt等,Proc NatlAcad Sci USA.90:6909-13(1993);Gallop等,J Med.Chem.37:1233-51(1994);Zuckermann等,J Med.Chem.37:2678-85(1994)。
2.多肽/抗体调节剂
在一个实施方式中,本申请提供的膜突蛋白调节剂可以是多肽组合物。抑制膜突蛋白活化的多肽是可能有用的抑制剂。在一个实施方式中,多肽膜突蛋白抑制剂是抗膜突蛋白抗体,所述抗膜突蛋白抗体特异性地针对膜突蛋白的C-末端尾结构域。所述多肽膜突蛋白抑制剂可以通过阻断尾结构域Thr 558的磷酸化位点阻止膜突蛋白活化。在另一个实施方式中,多肽膜突蛋白抑制剂是C-末端尾结构域截短的、非功能性片段,所述片段包括Thr 558磷酸化位点。此类片段可以与内源性膜突蛋白分子竞争在Thr 558上的磷酸化,以防止或减少所述内源性膜突蛋白分子的活化。一方面,多肽膜突蛋白抑制剂包括Thr 558位点周围区段的至少十个连续的氨基酸残基。例如,所述多肽可以包括GRDKYKTLRQIRQ(SEQID NO:2)的部分或全部序列。
在一个实施方式中,可以使用标准蛋白纯化技术通过适宜的纯化方案将所述多肽调节剂从细胞或组织来源中分离。在另一个实施方式中,所述调节剂通过重组DNA技术生产。作为重组表达的替代,还可以使用标准的肽合成技术化学合成调节剂。
多肽膜突蛋白调节剂包括突变或变体蛋白,其任意一个残基均可以由这些肽相应的残基改变得到,但仍编码具有调节活性的肽。在一个实施方式中,对照多肽的变体与对照多肽的序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%的氨基酸序列同一性。在通常情况下,变体具有与对照多肽基本相同或更好的结合亲和性,例如基于本领域可接受的结合分析定量单位/度量,其为参照多肽结合亲和性的至少0.75倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.25倍或1.5倍。
人和非人多克隆和单克隆抗体(包括非人单克隆抗体的人源化形式),其调节膜突蛋白的生物学性质,也在本申请的考虑范围内。其包括抗体的氨基酸序列变体、糖基化变体和片段。可以使用本领域公知的和本申请简要描述的技术制备抗体调节剂或其变体。例如,抗体变体在抗体分子中可以具有至少一个氨基酸残基,所述氨基酸残基被不同残基所取代。对于抗体而言,取代突变最感兴趣的位点一般包括高变区,但是也会考虑框架区(FR)的改变。
对于抗体而言,取代变体的一种类型包括将母体抗体(例如,人源化的或人抗体)中的一个或多个高变区残基取代。在通常情况下,被选作进行进一步开发的变体与产生其的母体抗体相比将具有改善的生物学性质。用于产生此类取代变体的便利方法包括使用噬菌体展示技术的亲和力成熟。简言之,将若干高变区位点(例如,6-7个位点)突变以产生在各位点上所有可能的氨基酸取代。这样产生的抗体从丝状噬菌体颗粒中展示出来,所述抗体以与M13的基因III产物融合的形式展示,所述M13的基因III产物包装于各颗粒中。然后,如本申请所公开的,对噬菌体展示的变体的生物活性进行筛选(例如,结合亲和性)。为鉴别用于修饰的候选高变区,可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴别对抗原结合有明显作用的高变区残基。或者,或另外地,分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴别抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。根据本申请所阐述的技术,这种接触残基及周边残基是取代候选物。一旦产生了这样的变体,则如本申请所描述的对变体组(the panel of variants)进行筛选,可以选择在一项或多项相关检测中具有优越性能的抗体进行进一步的研发。
编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子由本领域公知的多种方法制备。这些方法包括,但不限于,从天然来源中分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况下)或由此前制备抗体的变体或非变体的寡核苷酸介导(或位点定向)诱变、PCR诱变和级联诱变制备。
可以对本申请的抗体进行进一步修饰以使其含有附加的非蛋白部分,所述非蛋白部分在本领域中是公知的和易于获得的。优选地,所述适于抗体衍生化的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括,但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三聚甲醛、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如,甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于聚乙二醇丙醛在水中的稳定性可能使其在生产中具有优势。聚合物可以是任意分子量的,可以是支链或无支链的。与抗体连接的聚合物的数量可以不同,如果连接一个以上的聚合物,则其可以是相同的或不同的分子。在通常情况下,可以基于以下考虑确定用于衍生化的聚合物的数量和/或类型,包括但不限于,待改进抗体的特定性质或功能,抗体衍生物是否将用于在规定条件下的疗法等。
在一个实施方式中,利用高通量竞争分析对膜突蛋白抑制剂进行筛选,其中对候选化合物与膜突蛋白竞争结合其结合物(例如,抗膜突蛋白抗体或作用于膜突蛋白磷酸化位点的激酶)的能力进行测量。无细胞分析包括将膜突蛋白或截短的膜突蛋白片段与已知的结合物化合物形成分析混合物,将该分析混合物与待测化合物接触,测定待测化合物与膜突蛋白或结合物化合物相互作用的能力,其中测定待测化合物与膜突蛋白或结合物化合物相互作用的能力包括测定膜突蛋白/结合物复合物可检测的特性是否可调节。例如,通过测定蛋白磷酸化的程度确定膜突蛋白与蛋白激酶的结合相互作用,其能够表明是否待测化合物能够调节膜突蛋白与激酶化合物之间的相互作用。可以通过本领域公知的方法评估复合物的量,例如ELISA(包括竞争性结合ELISA)、酵母双杂交和类似(例如,荧光共振能量转移,酶-底物)分析。
肽或多肽的重组生产
本申请的多肽可以使用易于获得的技术和材料来重组生产。对于本申请的多肽的重组生产而言,会将编码多肽的核酸分离并插入可复制载体中,所述载体供进一步克隆(DNA的扩增)或表达。使用常规方法可以容易地对编码本申请中多肽的DNA进行分离和测序。例如,通过使用寡核苷酸探针对编码人膜突蛋白的DNA进行分离和测序,所述探针能够特异性地与编码蛋白的基因结合。可以使用多种载体。载体组分一般包括,但不限于,下述中的一种或多种:信号序列、复制起点、一种或多种选择基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
本申请的多肽不仅可以直接重组生产,还可以作为带有异源多肽的融合多肽来重组生产,所述融合多肽一般地是在成熟蛋白或多肽的N-末端,具有特异性裂解位点的信号序列或其他多肽。一般选择的异源性信号序列可以被宿主细胞识别和处理(即,通过信号肽酶裂解)。对于原核宿主细胞而言,信号序列可以选自,例如原核信号序列碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导物。对于酵母分泌物,天然信号序列可以是例如酵母转化前导物、α因子前导物(包括酵母属和克鲁维酵母属α-因子前导物)或酸性磷酸酶前导物、白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前导物或WO 90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中,可以使用哺乳动物的信号序列以及病毒分泌前导物例如单纯疱疹gD信号。
将此类前体区的DNA在读码框中连接至编码本申请的多肽的DNA。表达和克隆载体均含有能够使载体在一个或多个选定的宿主细胞中复制的核酸序列。在一般情况下,在克隆载体中该序列可以使所述载体的复制独立于宿主染色体DNA,且包括复制起点或自发复制的序列。在多种细菌、酵母和病毒中,此类序列是公知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数的革兰氏阴性细菌、2μ质粒起点适用于酵母、以及多种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)均可在哺乳动物细胞中用于克隆载体。在一般情况下,在哺乳动物表达载体中不需要复制起点组分(一般地可以仅使用SV40起点,因为其含有早期启动子)。
表达和克隆载体可以含有选择基因,也称为选择性标记物。典型的选择基因编码蛋白,该蛋白(a)提供对抗生素或其他毒素的抗性,例如氨苄西林、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性,(b)弥补营养缺陷型缺陷,或者(c)提供从复合培养基中无法获得的关键营养成分,例如编码杆菌属D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个例子是利用药物阻止宿主细胞生长。那些被异源基因成功转化的细胞产生能赋予药物抗性的蛋白,因而在选择过程中得以存活。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
另一个用于哺乳动物细胞的适宜选择性标记物的例子是能够识别可以摄取抗体核酸的细胞那些,如DHFR、胸腺嘧啶激酶、金属硫蛋白-I和-II、典型的灵长类动物金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如,通过在含有DHFR的竞争性拮抗剂甲氨蝶呤(Mtx)的培养基中培养所有转化体,对使用DHFR选择基因转化的细胞首先进行鉴别。当引入野生型DHFR时适宜的宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
或者,可以在含有针对选择性标记物如氨基糖苷类抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的选择剂的培养基中,通过细胞生长对宿主细胞(特别是含有内源性DHFR的野生型宿主)进行选择,所述宿主细胞转化或共转化了编码本申请的多肽、野生型DHFR蛋白和其他选择性标记物如氨基糖苷3’-磷酸转移酶(APH)的DNA序列。参见美国专利号4,965,199。
在酵母中使用的适宜选择基因是在酵母质粒Yrp7中存在的trp1基因(Stinchcomb等,Nature,282:39(1979))。trp1基因提供了针对酵母突变株的选择标记物,所述酵母突变株在色氨酸中缺乏生长能力,例如ATCC No.44076或PEP4-1,Jones,Genetics,85:12(1977)。在酵母宿主细胞的基因组中的trp1的损伤提供了一个有效环境,所述环境用于通过在缺乏色氨酸条件下生长来检测转化。类似地,使用已知携带Leu2基因的质粒弥补Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。
此外,可以使用来自1.6μm环状质粒pKD1的载体来转化克鲁维酵母。或者,已报道了针对克鲁维乳酸酵母的用于大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。Van den Berg,Bio/Technology,8:135(1990)。用于成熟重组人血清白蛋白的分泌的稳定的多拷贝表达载体也已经公开,所述蛋白分泌利用了克鲁维酵母工业株。Fleer等,Bio/Technology,9:968-975(1991)。
表达和克隆载体通常含有启动子,其可被宿主生物体识别并且与编码本申请多肽的核酸可操作性地连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂交启动子如tac启动子。但是,其他已知的细菌启动子也是适宜的。在细菌系统中使用的启动子还含有与编码本申请多肽的DNA可操作性地连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
用于真核生物的启动子序列是已知的。几乎所有真核基因在转录起点上游约25至30个碱基的位置均具有富含AT的区段。多个基因的转录起点上游70至80个碱基处存在另一个序列,所述序列是CNCAAT区段,在该区段中N可以是任意核苷酸。在大多数真核基因的3’末端是AATAAA序列,所述序列可能是在编码序列的3’末端添加polyA尾的信号。所有这些序列均适宜插入真核表达载体。
供酵母宿主使用的适宜启动子序列的例子包括3-磷酸甘油激酶或其他糖解酶如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸-果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶的启动子。
其他酵母启动子,其是具有转录的附加优势的诱导型启动子,所述转录通过生长条件控制,所述酵母启动子是针对乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区段。在EP 73,657中对适宜在酵母表达中使用的载体和启动子作了进一步的描述。将酵母增强子与酵母启动子一起使用也是有利的。
通过例如来自病毒基因组的启动子,在哺乳动物宿主细胞的载体中控制本申请多肽的转录,所述病毒基因组例如多瘤病毒、鸟痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、鸟类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和典型地如猴病毒40(SV40),所述启动子还来自异源性哺乳动物的启动子如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子,来自热休克的启动子,所提供的此类启动子与宿主细胞系统具有相容性。
SV40病毒的早期和晚期启动子能够方便地以SV40限制性片段的形式获得,所述限制性片段也含有SV40病毒的复制起点。人巨细胞病毒的即刻早期启动子能够方便地以HindIII E限制性片段的形式获得。在美国专利号4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。在美国专利号4,601,978中描述了对该系统的改进。在来自单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶启动子的控制下,人β-干扰素cDNA在小鼠细胞中的表达亦可参见Reyes等,Nature 297:598-601(1982)。或者,可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
通过将增强子序列插入载体通常会增加高等真核细胞对编码本申请多肽的DNA的转录。现已知来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)的多个增强子序列。典型地,可以将使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括在复制起点后侧(bp 100-270)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点后侧的多瘤病毒增强子以及腺病毒增强子。用于真核启动子活化的增强元件亦可参见Yaniv,Nature297:17-18(1982)。增强子可以在多肽编码序列的5’或3’位点连接至载体,但是其一般位于启动子的5’位点。
在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或者来自其他多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体还将含有转录终止和稳定mRNA所必须的序列。此类序列通常来自真核或病毒DNA或cDNA的非转译区5’位点,有时来自3’位点。这些区段含有核苷酸片段,所述核苷酸片段转录为在编码本申请多肽的mRNA非转译部分中的聚腺苷酸片段。牛生长激素多聚腺苷酸化区段是一种有用的转录终止组分。参见WO94/11026和其中公开的表达载体。
用于在本申请所述的载体中克隆或表达编码本申请多肽DNA的适宜宿主细胞为上文所述的原核细胞、酵母或高等真核细胞。适宜的原核生物包括真细菌,如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体,例如肠杆菌科如埃希杆菌属例如大肠杆菌、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属例如鼠伤寒沙门氏菌、沙雷氏菌属例如粘质沙雷氏菌和志贺氏菌属以及杆菌属如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(例如,在1989年4月12日公开的DD 266,710中披露的地衣芽胞杆菌)、假单胞菌属如铜绿假单胞菌和链霉菌属。典型地,大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446),但是其他菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是适宜的。这些例子是说明性的而非限制性的。
除了原核生物以外,真核微生物如丝状真菌或酵母也是适宜用于编码本发明多肽的载体的克隆或表达宿主。在低等真核宿主微生物中,酿酒酵母或普通的面包酵母是最常用的。但是,多种其他的属、种和菌株通常在本申请中也是可用的和有用的,如粟酒裂殖酵母;克鲁维酵母菌属宿主例如克鲁维乳酸酵母、脆弱克鲁维酵母(ATCC 12,424)、克鲁维保加利亚酵母(ATCC 16,045)、维克拉姆克鲁维酵母(ATCC 24,178)、瓦尔特克鲁维酵母ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母;耶氏酵母属(EP 402,226);毕赤酵母属(EP 183,070);念珠菌属;瑞士木霉(EP 244,234);粗糙脉孢菌;许旺酵母属如许旺酵母;和丝状真菌例如链孢霉菌、青霉菌、弯颈霉菌和曲霉宿主如构巢曲霉和黑曲霉。
用于表达本申请多肽的适宜宿主细胞可以来自多细胞生物体。非脊椎动物细胞包括植物和昆虫细胞。已鉴定了多种杆状病毒菌株及其变体和相应的许可昆虫宿主细胞,其来自宿主如草地夜蛾(幼虫)、埃及伊蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)和家蚕。用于转染的多种病毒菌株是可以公开获得的,例如苜蓿银纹夜蛾NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5菌株,此类病毒可以在此作为根据本申请的病毒使用,特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛和番茄的植物细胞培养物也能够作为宿主。
然而,最感兴趣的是脊椎动物细胞,在培养基(组织培养基)中繁殖脊椎动物细胞已成为常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCC CRL 1651);人胚肾细胞系(用于在悬浮培养物中生长的亚克隆293或293细胞,Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977));幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10);中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980));小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL2);犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34);布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442);人肺细胞(W138,ATCC CCL 75);人肝细胞(Hep G2,HB 8065);小鼠乳房肿瘤(MMT060562,ATCC CCL51);TRI细胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982));MRC 5细胞;FS4细胞;和人肝癌细胞系(Hep G2)。
使用上文所述的用于生产本申请多肽的表达或克隆载体转化宿主细胞,并在常规营养培养基中对其进行培养,所述培养基被修饰为适合诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。
用于生产本申请的多肽的宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售的培养基如Ham’sF10(Sigma)、最低必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和达尔伯克改良伊戈尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)(Sigma)均适于培养宿主细胞。此外,Ham等,Meth.Enz.58:44(1979),Barnes等,Anal.Biochem.102:255(1980),美国专利号4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5,122,469;WO 90/03430;WO 87/00195;或美国专利复审号30,985中描述的任意培养基也可以作为宿主细胞的培养基。必要时可以用激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙盐、镁盐和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩范围的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量来源补充这些培养基中的任意一种。还可以补充本领域技术人员公知的适宜浓度的任意其他必要的添加剂。培养条件如温度、pH等均是此前被选择用于表达宿主细胞的那些,其对本领域的普通技术人员而言是显而易见的。
肽或多肽的化学合成
本申请的多肽还可以通过化学合成生产,例如Merrifield in J.A.C.S.85:2149-2154(1963)中描述的固相合成法,或Bodanszky等,第二版,John Wiley and Sons,1976的《肽合成》中描述的标准溶液合成方法。这些书籍整体参考并入本申请。
肽合成的固相合成方法的一般步骤包括首先将肽被保护的C-末端氨基酸与树脂连接。连接后,过滤、洗涤树脂并除去C-末端氨基酸α氨基基团上的保护基团(例如,t-叔丁氧羰基)。当然,除去该保护基团必须在不破坏氨基酸与树脂之间连接的前提下进行。然后在得到的树脂肽偶联倒数第二个C-末端被保护的氨基酸。进行这一偶联时,在第二个氨基酸的游离羧基与连接在树脂上的第一个氨基酸的氨基之间形成一个酰胺键。用连续的氨基酸重复这一反应过程,直到肽全部的氨基酸均与树脂连接。最后,从树脂上裂解下被保护的肽,除去保护基团,得到所需的肽。用于从树脂上分离肽和除去保护基团的裂解技术取决于所选择的树脂和保护基团,这些技术对熟悉肽合成领域的人来说是已知的。
上述树脂可以是任意适宜的聚合物并且其含有能够通过共价键与第一个被保护的氨基酸牢固连接的官能团。多种聚合物均适用于这一目的,如纤维素、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯。可以在固相合成中使用的适宜保护基团包括叔丁氧羰基(BOC)、苄基(BZL)、叔戊氧基羰基(AOC)、对甲苯磺酰基(TOS)、邻溴苯基甲氧羰基(BrZ)、2,6-二氯苄基(BZLCl2)和苯基甲氧羰基(Z或CBZ)。其他保护基团亦可参见J.F.W.McOmie,″Protective Groups in Organic Chemistry″,Plenum Press,New York,1973中的描述。这本书整体参考并入本申请。
可以使用形成酰胺键的化学或酶学方法通过氨基酸或肽片段分步或嵌段偶联的方式进行标准溶液合成方法。这些溶液合成方法是本领域公知的。
多肽的纯化
可以从主体中回收本申请的多肽或蛋白。当使用重组技术时,本申请的多肽可能在细胞内、细胞周质间隙中产生,或者直接分泌到培养基中。可以从培养基或从宿主细胞的裂解物中回收本申请的多肽。如果是膜结合的,可以使用适宜的去垢剂溶液(例如,Triton-X100)或通过酶解将其从膜上释放。可以通过多种物理或化学方法破坏本申请多肽表达中使用的细胞,如反复冻融、超声、机械破坏或细胞溶解剂。
如果肽是化学合成的,可以通过任意适宜的技术将本申请的肽从反应基质中回收,所述技术能够将所需的多肽与基质中的其他组分分离。对于固相合成而言,首先使用适宜的裂解溶液将被保护的肽从树脂上裂解。裂解溶液的选择依赖于树脂以及与其结合的氨基酸的性质(如FMOC法使用三氟乙酸)。裂解通常在酸性条件下进行。裂解完成后,获得分离的肽,并使用任意适宜的技术对其进一步纯化(如下文中描述的方法)。
下述方法是示例性的适宜的蛋白纯化方法:在离子交换柱上分离;乙醇沉淀;反相HPLC;在二氧化硅上层析、在肝素SEPHAROSETM上层析、在阴离子或阳离子交换树脂上层析(如聚天冬氨酸柱、DEDA等);聚焦层析;SDS-PAGE;硫酸铵沉淀;使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤;除去污染物如IgG的蛋白A琼脂糖柱;以及与本申请的多肽以表位标记的形式结合的金属螯合柱。可以采用多种蛋白纯化方法,此类方法是本领域公知的并且已在例如Deutscher,Methods in Enzymology,182(1990);Scopes,ProteinPurification:Principles and Practice,Springer-Verlag,New York(1982)中描述。纯化步骤的选择将依赖于例如所使用的生产工艺和所生产的本申请特定蛋白的性质。
治疗或预防应用
本申请的膜突蛋白调节剂可以在治疗上使用,用于在体外或体内调节细胞的活性。一方面,膜突蛋白抑制剂可以用于阻止膜突蛋白活化,以治疗与膜突蛋白的异常活化相关的疾病。
一方面,本申请提供了一种在主体中抑制异常的上皮或内皮细胞增殖的方法,所述主体患有与膜突蛋白的异常活化相关的疾病。另一方面,本申请提供了一种在主体中诱导或促进异常的上皮或内皮细胞凋亡的方法,所述主体患有与膜突蛋白的异常活化相关的疾病。
可以预期本申请的组合物可以用于治疗哺乳动物。在一个实施方式中,例如将所述组合物给予非人哺乳动物以获得临床前数据。待治疗的示例性非人哺乳动物包括非人灵长类、犬、猫、啮齿类和进行临床前研究的其他哺乳动物。此类哺乳动物可以用于建立使用所述组合物治疗的疾病的动物模型,或者可以用于研究所关注组合物的毒性。在这些实施方式的每一个中,可以在哺乳动物中进行渐增剂量的研究。
此外,或者在替代方案中,使用所述组合物治疗人类,例如罹患病症或疾病的患者,其将从所述组合物的给药中获益。
在一个实施方式中,本申请包括治疗与膜突蛋白的异常活化相关的增殖性疾病。由于异常的细胞增殖与原发性肿瘤生长和转移相关,因而本申请提供的疗法能够抑制原发灶肿瘤的生长以及阻止肿瘤向继发灶的转移,因此允许通过其他疗法对肿瘤发起攻击。在本申请中待治疗癌症的例子包括,但不限于,癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症更特别的例子包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾或肾脏癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝肿瘤和各种类型的头颈部癌,以及B-细胞淋巴瘤(包括低分级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL));小淋巴细胞(SL)NHL;中分级/滤泡性NHL;中分级弥散性NHL;高分级免疫母细胞NHL;高分级淋巴母细胞NHL;高分级小非裂解细胞NHL;巨大肿块疾病NHL;套细胞淋巴瘤;AIDS相关的淋巴瘤;和华氏巨球蛋白血症);慢性淋巴细胞白血病(CLL);急性淋巴母细胞白血病(ALL);毛细胞白血病;慢性母髓细胞白血病;和移植后淋巴增殖性障碍疾病(PTLD),以及与瘢痣病、水肿(如与脑肿瘤相关的)和梅格斯综合症相关的异常血管增殖。更特别地,适合本申请的抗体治疗的癌症包括乳腺癌、结直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波济氏肉瘤、类癌、头颈部癌、黑色素瘤、卵巢癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤。
药物制剂
可以将多种物质或分子(包括肽等)作为治疗剂。根据本领域公知的方法可以将这些物质或分子制成药学上有用的组合物,以使得所述产品与药学上可接受的载体混合。通过将具有所需纯度的活性成分与任选地生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980))混合,制备以冻干剂型或水溶液形式储存的治疗剂型。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对受体无毒性,并包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸;抗氧化剂包括抗坏血酸;低分子量(小于约10个残基)多肽;蛋白,如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮,氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂如EDTA;糖醇如甘露醇或山梨醇;成盐的抗衡离子如钠;和/或非离子表面活性剂如TWEEN.TM.、PLURONICS.TM.或PEG。
供体内给药使用的制剂必须是无菌的。通过在冻干或复溶前后利用无菌滤膜过滤能够很容易地实现。
本申请中的治疗组合物一般置于具有无菌入口的容器中,例如静脉溶液袋,或具有可使用皮下注射针穿刺的瓶塞的小瓶中。
可以预期的是,当用于治疗多种疾病如肿瘤时,本申请的调节剂可以与其他适用于相同或类似疾病的治疗剂联用。当用于治疗癌症时,本申请的调节剂可以与常规的癌症治疗联用,如手术、放疗、化疗或其组合。
在某些其他方面,用于与本申请的膜突蛋白拮抗剂联合治疗肿瘤的其他治疗剂包括与肿瘤生长相关的其他因子的拮抗剂,如EGFR、ErbB2(也称为Her2)、ErbB3、ErbB4或TNF。优选地,本申请的抗-NRP1抗体可以与小分子受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)联用,所述小分子受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)靶向至一个或多个酪氨酸激酶受体如VEGF受体、FGF受体、EGF受体和PDGF受体。多种治疗性小分子RTKI均是本领域公知的,包括但不限于瓦他拉尼(PTK787)、厄洛替尼(TARCEVA.RTM.)、OSI-7904、ZD6474(ZACTIMA.RTM.)、ZD6126(ANG453)、ZD1839、舒尼替尼(SUTENT.RTM.)、司马沙尼(SU5416)、AMG706、AG013736、伊马替尼(GLEEVEC.RTM.)、MLN-518、CEP-701、PKC-412、拉帕替尼(GSK572016)、VELCADE.RTM.、AZD2171、索拉非尼(NEXAVAR.RTM.)、XL880和CHIR-265。
本申请的膜突蛋白调节剂,单用或与另一种治疗剂联用可以进一步用于与一种或多种化疗剂联用。多种化疗剂可用于本申请的联合疗法。拟使用化疗剂的示例性和非限制性列表参见本申请的“定义”部分。
给药途径为公知方法,例如通过静脉、腹腔、脑内、肌内、眼内、动脉内或病灶内途径注射或输液,局部给药,或者通过持续释放系统。
本申请药物组合物的剂量和所需药物浓度可以依据预计的特定用途而改变。如何确定适宜给药的剂量或途径是普通医师所公知的。动物实验为人类治疗有效剂量的确定提供了可靠的指引。在种属间对有效剂量进行按比例的缩放可以根据在下文中描述的原则实施,Mordenti,J.和Chappell,W.″The use of interspecies scaling in toxicokinetics″In Toxicokineticsand New Drug Development,Yacobi等,Eds.,Pergamon Press,New York 1989,第42-96页。
当在体内给予本申请的物质或分子时,正常剂量可以在每日以哺乳动物体重计约10ng/kg至高达100mg/kg或以上范围内改变,优选约1mg/kg/天至10mg/kg/天,视给药途径而定。在文献中提供了针对特定给药剂量和递送方法的指导原则;参见例如美国专利号4,657,760;5,206,344;或5,225,212。预计不同制剂将对不同治疗化合物和不同病症有效,例如向某一器官或组织的靶向给药可能需要以不同方式向另一个器官或组织递送。
当制剂中需要持续释放给药的物质或分子,可以使用所述物质或分子的微囊。所述制剂具有释放特性,所述释放特性适于治疗任意需要给予所述物质或分子的疾病或病症。已成功在人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN-)、白介素-2和MN rgp120中实现了持续释放的重组蛋白微囊。Johnson等,Nat.Med.,2:795-799(1996);Yasuda,Biomed.Ther.,27:1221-1223(1993);Hora等,Bio/Technology,8:755-758(1990);Cleland,″Design andProduction of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide MicrosphereSystems,″in Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach,Powell and Newman,eds,(Plenum Press:New York,1995),第439462页;WO 97/03692、WO 96/40072、WO 96/07399;和美国专利号5,654,010。
由于其具有生物相容性和广泛的生物可降解性质,因而可以使用聚乳酸羟基乙酸(PLGA)共聚物开发持续释放制剂。PLGA的降解产物乳酸和羟基乙酸可以在人体内被迅速清除。而且,依据其分子量和组成可以在数月至数年范围内调节该聚合物的降解度。Lewis,″Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer,″in:M.Chasin and R.Langer(Eds.),Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker:New York,1990),第1-41页。
组合物(例如,药物组合物)可以与给药说明书一并包括在试剂盒、容器、包装或分配器内。当以试剂盒形式提供时,可以将所述组合物的不同组分包装在独立容器中并在使用前混合。所述组分的这种独立包装可以使其长期贮存且不会导致活性成分功能的损失。试剂盒还可以包括置于独立容器中便于进行特定检验的试剂,所述特定检验如诊断检验或组织分型。
试剂盒中的试剂可以置于任意种类的容器中,以使得不同的组分得以保存且不会被容器的材料吸附或改变。例如,密封玻璃安瓿中可以含有冻干调节底物/分子和/或缓冲剂,其在中性、非反应性气体如氮气下包装。安瓿可以由任意适宜的材料组成如玻璃、有机聚合物如聚碳酸酯、聚苯乙烯等,陶瓷、金属或一般用于存放试剂的任意其他材料。适宜容器的其他例子包括简单的瓶子,其可以由与安瓿类似的物质制造,以及封套,其可以由金属箔内衬组成,如铝或合金。其他容器包括试管、小瓶、烧瓶、瓶子、注射器等。容器可能具有无菌入口,如具有可使用皮下注射针穿刺的瓶塞的瓶子。其他容器可以具有两个室,其被易于除去的膜所分隔,将膜除去后可以使所述组分混合。可除去的膜可以是玻璃、塑料、橡胶等。
试剂盒还可以与说明性材料一并提供。说明书可以被印刷于纸上或其他基材上,和/或以电子可读介质的形式提供,如软盘、CD-ROM、DVD-ROM、压缩盘、录像带、光盘、录音带等。详细的说明书可以不在实物上与试剂盒相关联;作为替代,可以引导使用者到试剂盒的生产厂商或经销商指定的网站,或以电子邮件形式提供说明。
在本申请的另一个实施方式中,提供了含有用于治疗上文所述病症的材料的制品。所述制品包括容器和标签。适宜的容器包括,例如瓶子、小瓶、注射器和试管。所述容器可以由多种材料制成如玻璃或塑料。所述容器存放有效治疗病症的组合物且可以具有无菌入口(例如,容器可以是静脉注射溶液袋或小瓶,其具有可使用皮下注射针穿刺的瓶塞)。组合物中的活性剂是抗体。在容器上或与之关联的标签表明所述组合物用于治疗选定的疾病。所述制品可以进一步包括第二个容器,其包含药学上可接受的缓冲剂,如磷酸缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其可以进一步包括从商业和使用者的角度来看所需的其他材料,包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和插有使用说明书的包装。
下述实施例用以说明本申请的优选实施方式。本领域技术人员应理解在实施例中披露的技术代表了发明人发现的技术,其在本申请的实践中发挥良好的作用,因此可以认为其构成了该实践的优选模式。然而,在本公开的教导下,本领域技术人员应知晓在不脱离本申请的主旨和范围的前提下,可以在已公开的特定实施方式中进行多种改变,其仍能获得同样或类似的结果。
实施例
实施例1 抗膜突蛋白抗体的制备
采用常规的杂交瘤方法制备针对膜突蛋白C-末端尾结构域的单克隆抗体。为产生具有序列SEQ ID NO:1的C-末端尾结构域,使用PCR扩增cDNA片段,所述cDNA片段与上文所述的C-末端尾结构域对应(参见图1所示的SEQ ID NO:4,其中的划线部分是所述C-末端尾结构域的cDNA序列)。
将PCR扩增的膜突蛋白DNA片段克隆至选自pET32a(+)和pET28a(+)的表达载体。然后使用已构建的载体转化用于培养和表达的大肠杆菌宿主细胞系BL21(DE3)。pET32a(+)和pET28a(+)的限制性和克隆谱分别见图2(a)和2(b)。使用限制性酶切反应对针对C-末端结构域构建的表达系统进行验证,所述限制性酶切反应通过测序以确认C-末端结构域表达的正确阅读框。
充分培养后,收获已表达C-末端结构域的宿主细胞,根据标准蛋白表达方案采集和纯化C-末端结构域。使用SDS-PAGE对最终得到的蛋白片段进行分析,以确认其种类和纯度。
然后通过杂交瘤方法利用BALB/C小鼠,使用已表达的C-末端结构域制备针对膜突蛋白C-末端尾结构域的单克隆抗体。
杂交瘤方法首先由Kohler和Milstein描述,Nature,256:495(1975),其整体参考并入本申请。在典型的杂交瘤方法中,使用抗原(例如,C-末端尾结构域)免疫小鼠(例如,BALB/C小鼠),然后将已免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。将融合细胞采集至使杂交瘤选择性生长的培养基中,存活的杂交瘤集落生长起来。经过足够长的时间后,通过使用所述抗原(例如,C-末端结构域)的ELISA检验和免疫组化分析对上清液进行筛选。将阳性细胞选定做进一步亚克隆。通过有限稀释法将选定的克隆亚克隆。进行亚克隆直至所有的克隆均为ELISA阳性。然后选择所述阳性克隆以获得杂交瘤,所述杂交瘤产生针对所述抗原的单克隆抗体。
针对全长膜突蛋白的抗体从贝克顿迪金森公司购买获得,其也能够依据上文所述的杂交瘤方法,使用全长的膜突蛋白代替C-末端结构域生产得到。
实施例2 评估膜突蛋白抑制剂抑制细胞增殖的能力
通过该实验评估膜突蛋白抑制剂抑制或降低细胞增殖的能力。
使用人肺微血管内皮细胞系(HPMEC)进行细胞增殖分析。将细胞以106个细胞/cm2的密度接种于六孔板上,在存在多种如下文所述的检验和对照试剂的情况下,在室温条件下培养所述细胞。培养确定的一段时间后,采集并标记细胞以进行流式细胞术分析。通过将检验组的OD570平均值除以在细胞培养初始时与检验组具有相同细胞数的组别的OD570平均值,来确定2小时、24小时和36小时的增殖率。
待测和对照组如下:
1)仅TNF-α;
2)针对全长膜突蛋白的抗体(抗膜突蛋白);
3)仅针对C-末端尾结构域的抗体(抗-M3);
4)TNF-α+抗膜突蛋白;
5)TNF-α+抗-M3;
6)PBS溶液(阴性对照)
培养结束后将所得到的细胞和上清液进行细胞形态分析、western印迹以及流式细胞术和免疫荧光分析。检查和鉴定不同试剂的作用,特别是抗-M3抗体。结果见图3。培养约24小时后,细胞的增殖率开始下降。当与阴性对照(第6组)比较时,使用抗膜突蛋白和抗-M3处理使细胞的增殖率降低,使用抗膜突蛋白和抗-M3联合TNF-α处理甚至使细胞的增殖率降低更多。仅使用TNF-α降低细胞的增殖率,但其程度不及其与抗膜突蛋白或抗-M3联用时。该结果表明抗膜突蛋白和抗-M3能够抑制细胞增殖。
实施例3 膜突蛋白的细胞间表达和凋亡分析
在存在实施例1所述的抗-膜突蛋白抗体情况下,对细胞培养物进行凋亡分析和表面抗原分析,以评估抗体促进内皮细胞凋亡和对膜突蛋白细胞间表达(表明所述蛋白的活性形式)的作用。
使用Annexin V分析研究凋亡。将采集得到的细胞用PBS洗涤、离心,并依次加入70%的乙醇、RNAs(200mg/l)和PI(20mg/l)。然后使用Annexin-V FITC/PI试剂盒对细胞进行染色,所述试剂盒用于FITC和PI双染,因为活细胞对FITC和PI均为阴性,而早期凋亡细胞对FITC阳性但对PI阴性,晚期凋亡或已经死亡的细胞对FITC和PI均为阳性。使用流式细胞仪对染色细胞进行分析,确定在存在不同检测剂的情况下凋亡细胞的数量。测定经检验组和对照组处理后,早期凋亡细胞的百分率和晚期凋亡细胞或死亡细胞的百分率,其结果分别见图4(a)和图4(b)。结果显示抗膜突蛋白处理会稍许增加早期凋亡细胞和晚期凋亡或死亡细胞的百分率。TNF-α能够大量增加抗膜突蛋白和抗-M3诱导凋亡的作用。仅TNF-α能够诱导细胞凋亡,但作用不及其与抗膜突蛋白或抗-M3联用的效果。
使用免疫荧光分析探测膜突蛋白的细胞表面表达。使用0.05%胰酶/0.02%EDTA处理HPMEC,然后加入抗膜突蛋白抗体,并在加入荧光-标记的二抗前培养细胞。在荧光显微镜下,针对细胞表面存在的膜突蛋白对细胞进行研究。将不含抗膜突蛋白抗体的细胞培养物作为阴性对照。
上述检测的结果显示,未加入抗膜突蛋白抗体时,检测不到细胞表面膜突蛋白。使用Western印迹法,在上清液中也检测不到任何膜突蛋白。在存在抗膜突蛋白抗体但不存在刺激因子TNF-α时,细胞骨架无明显改变,凋亡未出现显著增加。但是在加入TNF-α后,与对照组相比,凋亡和细胞表面膜突蛋白均增加。
实施例4 观察膜突蛋白抑制剂对细胞形态变化的影响
在存在实施例1中描述的不同检测剂的情况下,在显微镜下针对形态变化,对细胞进行研究。
细胞骨架形态:
在对照第6组中,细胞骨架结构表现正常,具有清晰的细胞边缘、规则的形状和正常的细胞核尺寸。
而在仅加入抗膜突蛋白抗体的组中(第2组加入抗膜突蛋白和第3组加入抗-M3),细胞表现为初始正常,仅在培养36小时后观察到F-肌动蛋白结构部分破坏和边缘不规则。未见核改变。
与第2组类似,在仅加入TNF-α的组中(第1组)未观察到明显的结构变化,直至36小时后才观察到F-肌动蛋白结构部分破坏。细胞核未见明显变化。
然而,在经TNF-α和抗膜突蛋白抗体处理的组中,24小时后细胞骨架瓦解,F-肌动蛋白铺展至细胞质,形成由非极性肌动蛋白丝组成的纤维束。36小时后,可见表示凋亡过程的细胞核浓缩。
微绒毛形态
如图5(a)所示,正常的HPMEC在其表明上有光滑的、圆柱形和规则形状的微绒毛。加入TNF-α36小时后(第1组),如图5(b)所示这些微绒毛变得更小和更稀疏。加入TNF-α和抗膜突蛋白抗体36小时后(第4和5组),如图5(c)所示在HPMEC表面上的微绒毛显著减少或者甚至完全消失。
我们的结果提示抗膜突蛋白抗体作为膜突蛋白的抑制剂能够导致细胞结构破坏甚至细胞死亡。但是当不存在炎症因子如TNF-α时这些作用是有限的。然而,在存在TNF-α时,对细胞的这种损伤作用明显增强。
Claims (8)
1.包含能够抑制人膜突蛋白活化的膜突蛋白抑制剂的组合物在制备用于在主体中治疗与膜突蛋白异常活化相关的疾病或病理状况的药物中的用途,其中所述疾病或病理状况与呼吸系统相关或是器官纤维化,且其中所述膜突蛋白抑制剂是能与人膜突蛋白C-末端尾结构域SEQ ID NO:1结合的分离的抗体,或者是包括人膜突蛋白C-末端尾结构域SEQ ID NO:1至少十个连续氨基酸残基的截短的膜突蛋白片段,其中所述截短的膜突蛋白片段包括磷酸化位点Thr 558,并且所述截短的膜突蛋白片段能够与全长的人膜突蛋白竞争所述磷酸化位点Thr 558的磷酸化。
2.根据权利要求1所述的用途,其中所述的器官纤维化是肺纤维化、囊性纤维化、肝硬化、心内膜心肌纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、克隆氏病、瘢痕瘤、系统性硬化症或进行性大块纤维化。
3.根据权利要求1所述的用途,其中所述疾病或病理状况是肺动脉高压。
4.根据权利要求1所述的用途,其中所述截短的膜突蛋白片段包括序列GRDKYKTLRQIRQ(SEQ ID NO:2)的至少十个连续的氨基酸残基。
5.根据权利要求1所述的用途,其进一步包括给予所述主体有效量的适于与所述膜突蛋白抑制剂联用的第二治疗剂。
6.根据权利要求5所述的用途,其中所述第二治疗剂是细胞因子。
7.根据权利要求6所述的用途,其中所述细胞因子是促炎性细胞因子。
8.根据权利要求7所述的用途,其中所述促炎性细胞因子是TNF-α、TNF-β、IL-1或IL-6。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201180059276.1A CN103327997B (zh) | 2010-10-08 | 2011-10-08 | 膜突蛋白调节剂及其用途 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2010077589 | 2010-10-08 | ||
CNPCT/CN2010/077589 | 2010-10-08 | ||
CN201180059276.1A CN103327997B (zh) | 2010-10-08 | 2011-10-08 | 膜突蛋白调节剂及其用途 |
PCT/CN2011/080520 WO2012045274A1 (en) | 2010-10-08 | 2011-10-08 | Moesin modulators and uses thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103327997A CN103327997A (zh) | 2013-09-25 |
CN103327997B true CN103327997B (zh) | 2015-09-02 |
Family
ID=49196238
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201180059276.1A Active CN103327997B (zh) | 2010-10-08 | 2011-10-08 | 膜突蛋白调节剂及其用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103327997B (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10365282B2 (en) | 2014-04-22 | 2019-07-30 | Shanghai Kexin Biotech Co., Ltd. | Method and biomarker for detecting metastasis of sarcoma |
WO2015161792A1 (en) | 2014-04-22 | 2015-10-29 | Shanghai Kexin Biotech Co., Ltd. | Method and biomarker for detecting cancer |
CN111111480B (zh) * | 2020-01-09 | 2021-09-14 | 南京工业大学 | 一种唑来磷酸改性纳滤膜及其制备方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006015079A2 (en) * | 2004-07-27 | 2006-02-09 | Yale University | Erm family binding agents and their use in diagnosis and treatment of proliferative conditions |
-
2011
- 2011-10-08 CN CN201180059276.1A patent/CN103327997B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006015079A2 (en) * | 2004-07-27 | 2006-02-09 | Yale University | Erm family binding agents and their use in diagnosis and treatment of proliferative conditions |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103327997A (zh) | 2013-09-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20190203209A1 (en) | Method of Modulating Fibroblast Accumulation or Collagen Deposition | |
Scheller et al. | Interleukin-6 and its receptor: from bench to bedside | |
Striz | Cytokines of the IL-1 family: recognized targets in chronic inflammation underrated in organ transplantations | |
CN101743253B (zh) | 神经毡蛋白片段与神经毡蛋白抗体复合物的晶体结构 | |
US20150246120A1 (en) | Moesin modulators and uses thereof | |
US20060039910A1 (en) | Methods and compositions for treating allergic inflammation | |
CN103142999A (zh) | 用于治疗微生物病症的组合物和方法 | |
JP2018531014A6 (ja) | 抗cd30キメラ抗原受容体 | |
JP2018531014A (ja) | 抗cd30キメラ抗原受容体 | |
CN101896198A (zh) | 治疗血液恶性肿瘤和自身免疫疾病的hvem配体 | |
US11834485B2 (en) | IL-2 variants with reduced binding to IL-2 receptor alpha and uses thereof | |
CN103327997B (zh) | 膜突蛋白调节剂及其用途 | |
US20220242964A1 (en) | Compositions and methods for regulating erythropoiesis | |
CN104001158A (zh) | Bv8和/或EG-VEGF促进造血的用途 | |
WO2023016559A1 (zh) | 一类靶向pd-l1的超高亲和力小蛋白及用途 | |
CN108392492A (zh) | Ldlr过表达在nk细胞过继治疗中的应用 | |
CN104902916A (zh) | 衍生自TGFβ的多肽及其用途 | |
CN112979764B (zh) | 特异结合人cd47分子的多肽及其用途 | |
Akbarian et al. | Evaluation of DPP4/CD26 Potential Role for the Management of Inflammation in COVID-19 Patients | |
CN1802169A (zh) | Bv8和/或EG-VEGF促进造血的用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |