JP2001318093A - 血小板ＧＰＩｂαの機能抑制物質を有効成分とする抗炎症剤 - Google Patents
血小板ＧＰＩｂαの機能抑制物質を有効成分とする抗炎症剤Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 白血球の血管への接着に起因する炎症性疾患
を抑制することができる抗炎症剤を、インビボでスクリ
ーニングする方法を提供すること。 【解決手段】 ラットに内毒素を投与して炎症反応を生
じせしめると同時又はその前後に被検物質を投与する
か、あるいは、炎症反応を常態で示す非ヒト哺乳動物に
被検物質を投与し、インビボにおける血小板を介しての
白血球と血管内皮細胞との接着状態を、白血球回転速度
（Ｖｗ）と赤血球速度（Ｖｒ）との比（Ｖｗ／Ｖｒ）で
求められる接着エネルギーを指標として評価し、血小板
上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する
抗炎症性物質をスクリーニングする。
を抑制することができる抗炎症剤を、インビボでスクリ
ーニングする方法を提供すること。 【解決手段】 ラットに内毒素を投与して炎症反応を生
じせしめると同時又はその前後に被検物質を投与する
か、あるいは、炎症反応を常態で示す非ヒト哺乳動物に
被検物質を投与し、インビボにおける血小板を介しての
白血球と血管内皮細胞との接着状態を、白血球回転速度
（Ｖｗ）と赤血球速度（Ｖｒ）との比（Ｖｗ／Ｖｒ）で
求められる接着エネルギーを指標として評価し、血小板
上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する
抗炎症性物質をスクリーニングする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血小板上に発現す
る糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗炎症性物
質のスクリーニング方法や、該スクリーニング方法によ
り得られる前記糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制す
る新規物質や、前記スクリーニング方法により得られる
抗炎症性物質を有効成分として含有する医薬組成物に関
する。
る糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗炎症性物
質のスクリーニング方法や、該スクリーニング方法によ
り得られる前記糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制す
る新規物質や、前記スクリーニング方法により得られる
抗炎症性物質を有効成分として含有する医薬組成物に関
する。
【０００２】
【従来の技術】血液中に存在する直径１〜２μｍの無核
の細胞として知られている血小板は、正常な状態におい
ては、微小血管内皮細胞に非常に接近しながらも接着せ
ずに循環すると考えられており、コラーゲンのような血
小板活性化内皮物質に曝されなければ、負傷領域に接着
することも、活性化させられることもないと考えられて
きた（Lab Invest. 42, 366-374, 1980）。初期接着段
階において、血小板は、種々のメディエータを放出し、
他の血小板を活性化することが知られており（Thromb H
aemost. 78, 611-616, 1997）、初期に接着した血小板
層が、安定した血栓形成性表面を形成すると、メディエ
ータ誘導による血小板同士の相互作用により止血性血栓
が発達することも知られている（Thromb Haemost. 78,
611-616, 1997）。
の細胞として知られている血小板は、正常な状態におい
ては、微小血管内皮細胞に非常に接近しながらも接着せ
ずに循環すると考えられており、コラーゲンのような血
小板活性化内皮物質に曝されなければ、負傷領域に接着
することも、活性化させられることもないと考えられて
きた（Lab Invest. 42, 366-374, 1980）。初期接着段
階において、血小板は、種々のメディエータを放出し、
他の血小板を活性化することが知られており（Thromb H
aemost. 78, 611-616, 1997）、初期に接着した血小板
層が、安定した血栓形成性表面を形成すると、メディエ
ータ誘導による血小板同士の相互作用により止血性血栓
が発達することも知られている（Thromb Haemost. 78,
611-616, 1997）。
【０００３】血小板の凝集に必要な接着分子の一つであ
るグリコプロテイン（ＧＰ）Ｉｂαは、未刺激の血小板
上に発現する糖タンパク質であり、この分子のレセプタ
ーの一つがフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）であるこ
とが知られている。本発明者らの一人である池田らは、
血小板が局所血流により生じるズリ応力を感知して一次
凝集を起こすことを見い出し、そのメカニズムとしてＧ
ＰＩｂαとｖＷＦの結合が重要であることを明らかにし
ており（Ikeda, et al. J. Clin. Invest. 87,1234-124
0, 1991）、このことからＧＰＩｂαは生体における止
血機序や血栓形成に重要な役割を果たすことが広く認め
られている。
るグリコプロテイン（ＧＰ）Ｉｂαは、未刺激の血小板
上に発現する糖タンパク質であり、この分子のレセプタ
ーの一つがフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）であるこ
とが知られている。本発明者らの一人である池田らは、
血小板が局所血流により生じるズリ応力を感知して一次
凝集を起こすことを見い出し、そのメカニズムとしてＧ
ＰＩｂαとｖＷＦの結合が重要であることを明らかにし
ており（Ikeda, et al. J. Clin. Invest. 87,1234-124
0, 1991）、このことからＧＰＩｂαは生体における止
血機序や血栓形成に重要な役割を果たすことが広く認め
られている。
【０００４】一方、本発明者らの一人である半田らは、
ヒトＧＰＩｂαを認識するモノクローナル抗体を作製
し、その中からｖＷＦとの結合を阻害する抗体であるＧ
ＵＲ８３／３５を見い出している（Moriki, T., et a
l.; Blood 90, 698-705, 1997、Asazuma, N., et al.;
Blood 90, 4789-4798, 1997）。この抗体はリストセチ
ン（ristocetin）によるＧＰＩｂαのコンフォメーショ
ン変化を介して起こる血小板の凝集を特異的に制御し、
本分子のＮ末端から１〜３０２アミノ酸残基が形成する
コンフォメーション特異的なエピトープ（epitope）を
認識することが報告されている。また最近、Gombartら
は、白血球の接着分子の１つであるＭａｃ-１(CD11b/CD
18) がトランスフェクトされた２９３細胞が、固相化さ
れたＧＰＩｂαに結合能を有することを報告（Blood,Vo
l.94,supplement I, 369a,1999）している。
ヒトＧＰＩｂαを認識するモノクローナル抗体を作製
し、その中からｖＷＦとの結合を阻害する抗体であるＧ
ＵＲ８３／３５を見い出している（Moriki, T., et a
l.; Blood 90, 698-705, 1997、Asazuma, N., et al.;
Blood 90, 4789-4798, 1997）。この抗体はリストセチ
ン（ristocetin）によるＧＰＩｂαのコンフォメーショ
ン変化を介して起こる血小板の凝集を特異的に制御し、
本分子のＮ末端から１〜３０２アミノ酸残基が形成する
コンフォメーション特異的なエピトープ（epitope）を
認識することが報告されている。また最近、Gombartら
は、白血球の接着分子の１つであるＭａｃ-１(CD11b/CD
18) がトランスフェクトされた２９３細胞が、固相化さ
れたＧＰＩｂαに結合能を有することを報告（Blood,Vo
l.94,supplement I, 369a,1999）している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】多くのヒト炎症性疾患
のうち、白血球の血管への接着反応は臓器障害の程度を
決定する重要な因子であり、この白血球接着反応が憎悪
すると考えられている疾患としては、動脈硬化、播種性
血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、多臓器不全（ＭＯＦ）な
どが挙げられる。また、自己免疫疾患では血小板を介し
たリンパ球の血管への接着が臓器障害の増悪因子となる
ことが実験的に示されている。従って血小板の活性化を
阻害する薬剤はこのような白血球を抑制する効果を持つ
場合があり、ホスフォジエステラーゼ（phosphodiester
ase）阻害剤や抗トロンビン（thrombin）剤などはその
典型例といえる。しかしこれらの薬剤は、白血球接着の
阻害活性を生体内で得るためには、通常、血小板凝集抑
制に必要な量よりも大量の用量が必要とされ、出血傾向
を助長させるリスクがあり、新しい治療ターゲットの創
出が待たれていた。本発明の課題は、白血球の血管への
接着に起因する炎症性疾患を抑制することができる抗炎
症剤を、インビボでスクリーニングする方法を提供する
ことにある。
のうち、白血球の血管への接着反応は臓器障害の程度を
決定する重要な因子であり、この白血球接着反応が憎悪
すると考えられている疾患としては、動脈硬化、播種性
血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、多臓器不全（ＭＯＦ）な
どが挙げられる。また、自己免疫疾患では血小板を介し
たリンパ球の血管への接着が臓器障害の増悪因子となる
ことが実験的に示されている。従って血小板の活性化を
阻害する薬剤はこのような白血球を抑制する効果を持つ
場合があり、ホスフォジエステラーゼ（phosphodiester
ase）阻害剤や抗トロンビン（thrombin）剤などはその
典型例といえる。しかしこれらの薬剤は、白血球接着の
阻害活性を生体内で得るためには、通常、血小板凝集抑
制に必要な量よりも大量の用量が必要とされ、出血傾向
を助長させるリスクがあり、新しい治療ターゲットの創
出が待たれていた。本発明の課題は、白血球の血管への
接着に起因する炎症性疾患を抑制することができる抗炎
症剤を、インビボでスクリーニングする方法を提供する
ことにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】インビボにおける、傍内
皮空間に沿って流れる血小板の密度分布又は速度分布に
ついての詳細な知識は、トロンボゲン発生の初期段階の
メカニズム、及びその結果生じる白血球接着を伴う炎症
反応を理解する上で重要である。第一に、局所における
血小板の密度の測定により、局所血小板搬送速度を予測
することができる。第二に、傍内皮血小板の速度分布分
析により、病的状態における血小板及び内皮細胞間の接
着力変化を予測することが可能になり、従って、フロー
状態における接着性変化に関する重要な知見が得られ
る。第三に、白血球表面のリガンド分子と結合する血小
板における種々の接着分子の存在を考慮すると、傍内皮
空間における血小板の密度は、急性炎症プロセスにおい
て細静脈への白血球の動員数を決定する要因となる（La
b Invest. 71, 380-386, 1994、J. Exp. Med. 187, 197
-204, 1998）。しかし、生体内の血小板を信頼性の高い
方法で可視化することは技術的に困難であるため、傍内
皮空間を流れる血小板の詳細な挙動についての情報は限
られていた。
皮空間に沿って流れる血小板の密度分布又は速度分布に
ついての詳細な知識は、トロンボゲン発生の初期段階の
メカニズム、及びその結果生じる白血球接着を伴う炎症
反応を理解する上で重要である。第一に、局所における
血小板の密度の測定により、局所血小板搬送速度を予測
することができる。第二に、傍内皮血小板の速度分布分
析により、病的状態における血小板及び内皮細胞間の接
着力変化を予測することが可能になり、従って、フロー
状態における接着性変化に関する重要な知見が得られ
る。第三に、白血球表面のリガンド分子と結合する血小
板における種々の接着分子の存在を考慮すると、傍内皮
空間における血小板の密度は、急性炎症プロセスにおい
て細静脈への白血球の動員数を決定する要因となる（La
b Invest. 71, 380-386, 1994、J. Exp. Med. 187, 197
-204, 1998）。しかし、生体内の血小板を信頼性の高い
方法で可視化することは技術的に困難であるため、傍内
皮空間を流れる血小板の詳細な挙動についての情報は限
られていた。
【０００７】本発明者らは、傍内皮空間に沿って流れる
血小板の密度分布又は速度分布等、インビボにおける血
小板の挙動を明らかにするために、生体内で血小板を染
色できる蛍光色素であるカルボキシフルオレセイン ジ
アセテート スクシニミディルエステル（ＣＦＳＥ）に
よる超高速増感顕微鏡検査を生体内において行ったとこ
ろ、内毒素血症のような病的状態において、後毛細血管
細静脈の傍内皮空間における白血球が血小板を介して転
回及び接着していることを偶然に見い出した。そこで、
血小板上のＧＰＩｂαのＮ末端から１〜３０２アミノ酸
残基が形成するコンフォメーション特異的なエピトープ
（epitope）を認識する前記モノクローナル抗体ＧＵＲ
８３／３５を投与したところ、炎症性刺激により生じる
白血球の血管内皮細胞への接着反応が、局所の血行動態
を低下させることなく抑制されることを確認し、本発明
を完成するに至った。
血小板の密度分布又は速度分布等、インビボにおける血
小板の挙動を明らかにするために、生体内で血小板を染
色できる蛍光色素であるカルボキシフルオレセイン ジ
アセテート スクシニミディルエステル（ＣＦＳＥ）に
よる超高速増感顕微鏡検査を生体内において行ったとこ
ろ、内毒素血症のような病的状態において、後毛細血管
細静脈の傍内皮空間における白血球が血小板を介して転
回及び接着していることを偶然に見い出した。そこで、
血小板上のＧＰＩｂαのＮ末端から１〜３０２アミノ酸
残基が形成するコンフォメーション特異的なエピトープ
（epitope）を認識する前記モノクローナル抗体ＧＵＲ
８３／３５を投与したところ、炎症性刺激により生じる
白血球の血管内皮細胞への接着反応が、局所の血行動態
を低下させることなく抑制されることを確認し、本発明
を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明は、非ヒト哺乳動物に炎症
反応を生じせしめると同時又はその前後に被検物質を投
与するか、あるいは、炎症反応を常態で示す非ヒト哺乳
動物に被検物質を投与し、インビボにおける血小板を介
しての白血球と血管内皮細胞との接着状態を検出・評価
することを特徴とする血小板上に発現する糖タンパク質
ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗炎症性物質のスクリーニ
ング方法（請求項１）や、エンドトキシンを投与して炎
症反応を生じせしめることを特徴とする請求項１記載の
血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑
制する抗炎症性物質のスクリーニング方法（請求項２）
や、血小板として、ＣＦＳＥで標識化された血小板を用
いることを特徴とする請求項１又は２記載の血小板上に
発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗炎
症性物質のスクリーニング方法（請求項３）や、接着状
態の検出・評価が、血管内の白血球回転速度（Ｖｗ）と
赤血球速度（Ｖｒ）との比（Ｖｗ／Ｖｒ）で求められる
接着エネルギーを指標とした検出評価であることを特徴
とする請求項１〜３のいずれか記載の血小板上に発現す
る糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗炎症性物
質のスクリーニング方法（請求項４）や、投与が静脈内
投与であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記
載の血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能
を抑制する抗炎症性物質のスクリーニング方法（請求項
５）や、血管内皮細胞が後毛細血管細静脈であることを
特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の血小板上に発
現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗炎症
性物質のスクリーニング方法（請求項６）や、非ヒト哺
乳動物がラットであることを特徴とする血小板上に発現
する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗炎症性
物質のスクリーニング方法（請求項７）に関する。
反応を生じせしめると同時又はその前後に被検物質を投
与するか、あるいは、炎症反応を常態で示す非ヒト哺乳
動物に被検物質を投与し、インビボにおける血小板を介
しての白血球と血管内皮細胞との接着状態を検出・評価
することを特徴とする血小板上に発現する糖タンパク質
ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗炎症性物質のスクリーニ
ング方法（請求項１）や、エンドトキシンを投与して炎
症反応を生じせしめることを特徴とする請求項１記載の
血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑
制する抗炎症性物質のスクリーニング方法（請求項２）
や、血小板として、ＣＦＳＥで標識化された血小板を用
いることを特徴とする請求項１又は２記載の血小板上に
発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗炎
症性物質のスクリーニング方法（請求項３）や、接着状
態の検出・評価が、血管内の白血球回転速度（Ｖｗ）と
赤血球速度（Ｖｒ）との比（Ｖｗ／Ｖｒ）で求められる
接着エネルギーを指標とした検出評価であることを特徴
とする請求項１〜３のいずれか記載の血小板上に発現す
る糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗炎症性物
質のスクリーニング方法（請求項４）や、投与が静脈内
投与であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記
載の血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能
を抑制する抗炎症性物質のスクリーニング方法（請求項
５）や、血管内皮細胞が後毛細血管細静脈であることを
特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の血小板上に発
現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗炎症
性物質のスクリーニング方法（請求項６）や、非ヒト哺
乳動物がラットであることを特徴とする血小板上に発現
する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗炎症性
物質のスクリーニング方法（請求項７）に関する。
【０００９】また本発明は、請求項１〜７のいずれか記
載の血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能
を抑制する抗炎症性物質のスクリーニング方法により得
られることを特徴とする血小板上に発現する糖タンパク
質ＧＰＩｂαの機能を抑制する物質（請求項８）や、血
小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制
する物質が、ＧＰＩｂα分子のＮ末端から１〜３０２ア
ミノ酸残基が形成するコンフォメーションの変化を生じ
させる物質であることを特徴とする請求項８記載の血小
板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制す
る物質（請求項９）や、ＧＰＩｂαのコンフォメーショ
ンの変化を生じさせる物質が、ＧＰＩｂα分子のＮ末端
から１〜３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメーシ
ョン特異的なエピトープを認識するモノクローナル抗体
であることを特徴とする請求項９記載の血小板上に発現
する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する物質（請
求項１０）や、ＧＰＩｂαのコンフォメーションの変化
を生じさせる物質が、ＧＰＩｂα分子のＮ末端から１〜
３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメーションと相
互作用するペプチドであることを特徴とする請求項９記
載の血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能
を抑制する物質（請求項１１）に関する。
載の血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能
を抑制する抗炎症性物質のスクリーニング方法により得
られることを特徴とする血小板上に発現する糖タンパク
質ＧＰＩｂαの機能を抑制する物質（請求項８）や、血
小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制
する物質が、ＧＰＩｂα分子のＮ末端から１〜３０２ア
ミノ酸残基が形成するコンフォメーションの変化を生じ
させる物質であることを特徴とする請求項８記載の血小
板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制す
る物質（請求項９）や、ＧＰＩｂαのコンフォメーショ
ンの変化を生じさせる物質が、ＧＰＩｂα分子のＮ末端
から１〜３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメーシ
ョン特異的なエピトープを認識するモノクローナル抗体
であることを特徴とする請求項９記載の血小板上に発現
する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する物質（請
求項１０）や、ＧＰＩｂαのコンフォメーションの変化
を生じさせる物質が、ＧＰＩｂα分子のＮ末端から１〜
３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメーションと相
互作用するペプチドであることを特徴とする請求項９記
載の血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能
を抑制する物質（請求項１１）に関する。
【００１０】さらに本発明は、請求項１〜７のいずれか
記載の血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機
能を抑制する抗炎症性物質のスクリーニング方法により
得られる抗炎症性物質を有効成分として含有することを
特徴とする医薬組成物（請求項１２）や、抗炎症性物質
が、血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂα分子の
Ｎ末端から１〜３０２アミノ酸残基が形成するコンフォ
メーションの変化を生じさせる物質であることを特徴と
する請求項１２記載の医薬組成物（請求項１３）や、Ｇ
ＰＩｂαのコンフォメーションの変化を生じさせる物質
が、ＧＰＩｂα分子のＮ末端から１〜３０２アミノ酸残
基が形成するコンフォメーション特異的なエピトープを
認識するモノクローナル抗体であることを特徴とする請
求項１３記載の医薬組成物（請求項１４）や、モノクロ
ーナル抗体が、抗ＧＰＩｂαモノクローナル抗体ＧＵＲ
８３／３５であることを特徴とする請求項１４記載の医
薬組成物（請求項１５）や、ＧＰＩｂαのコンフォメー
ションの変化を生じさせる物質が、ＧＰＩｂα分子のＮ
末端から１〜３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメ
ーションと相互作用するペプチドであることを特徴とす
る請求項１３記載の医薬組成物（請求項１６）や、抗炎
症性物質が、動脈硬化、播種性血管内凝固症候群、多臓
器不全、又は自己免疫疾患に対する抗炎症作用を有する
物質であることを特徴とする請求項１２〜１６のいずれ
か記載の医薬組成物（請求項１７）に関する。
記載の血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機
能を抑制する抗炎症性物質のスクリーニング方法により
得られる抗炎症性物質を有効成分として含有することを
特徴とする医薬組成物（請求項１２）や、抗炎症性物質
が、血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂα分子の
Ｎ末端から１〜３０２アミノ酸残基が形成するコンフォ
メーションの変化を生じさせる物質であることを特徴と
する請求項１２記載の医薬組成物（請求項１３）や、Ｇ
ＰＩｂαのコンフォメーションの変化を生じさせる物質
が、ＧＰＩｂα分子のＮ末端から１〜３０２アミノ酸残
基が形成するコンフォメーション特異的なエピトープを
認識するモノクローナル抗体であることを特徴とする請
求項１３記載の医薬組成物（請求項１４）や、モノクロ
ーナル抗体が、抗ＧＰＩｂαモノクローナル抗体ＧＵＲ
８３／３５であることを特徴とする請求項１４記載の医
薬組成物（請求項１５）や、ＧＰＩｂαのコンフォメー
ションの変化を生じさせる物質が、ＧＰＩｂα分子のＮ
末端から１〜３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメ
ーションと相互作用するペプチドであることを特徴とす
る請求項１３記載の医薬組成物（請求項１６）や、抗炎
症性物質が、動脈硬化、播種性血管内凝固症候群、多臓
器不全、又は自己免疫疾患に対する抗炎症作用を有する
物質であることを特徴とする請求項１２〜１６のいずれ
か記載の医薬組成物（請求項１７）に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明の血小板上に発現する糖タ
ンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗炎症性物質のス
クリーニング方法としては、非ヒト哺乳動物に炎症反応
を生じせしめると同時又はその前後に被検物質を投与す
るか、あるいは、炎症反応を常態で示す非ヒト哺乳動物
に被検物質を投与し、インビボにおける血小板を介して
の白血球と血管内皮細胞との接着状態を検出・評価する
スクリーニング方法であれば特に制限されるものではな
く、ここで、炎症反応とは、微小循環系が分布している
組織の有害刺激に対応する局所性反応をいい、有害刺激
としては、外来性の異物、物理エネルギー、傷害された
組織自体等を例示することができる。また、上記外来性
の異物としては、炎症を確実に惹起しうる炎症起因物
質、例えばエンドトキシンが好ましい。かかるエンドト
キシン等の炎症起因物質を用いる場合、炎症起因物質と
被検物質は、同時又はいずれか一方を先に他方を後に非
ヒト哺乳動物の静脈等に投与することになる。
ンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗炎症性物質のス
クリーニング方法としては、非ヒト哺乳動物に炎症反応
を生じせしめると同時又はその前後に被検物質を投与す
るか、あるいは、炎症反応を常態で示す非ヒト哺乳動物
に被検物質を投与し、インビボにおける血小板を介して
の白血球と血管内皮細胞との接着状態を検出・評価する
スクリーニング方法であれば特に制限されるものではな
く、ここで、炎症反応とは、微小循環系が分布している
組織の有害刺激に対応する局所性反応をいい、有害刺激
としては、外来性の異物、物理エネルギー、傷害された
組織自体等を例示することができる。また、上記外来性
の異物としては、炎症を確実に惹起しうる炎症起因物
質、例えばエンドトキシンが好ましい。かかるエンドト
キシン等の炎症起因物質を用いる場合、炎症起因物質と
被検物質は、同時又はいずれか一方を先に他方を後に非
ヒト哺乳動物の静脈等に投与することになる。
【００１２】本発明のスクリーニング方法はインビボ系
で行われることを大きな特徴とし、インビトロ系スクリ
ーニングと異なり、目的とする抗炎症剤をより正確に効
率よく選択することができる。かかるインビボにおける
血小板を介しての白血球と血管内皮細胞との接着状態の
検出・評価方法としては、インビボにおける血小板を介
しての白血球と血管内皮細胞との接着状態を検出（測
定）・評価しうる方法であれば特に制限されるものでは
ないが、後毛細血管細静脈等における傍内皮空間（内皮
に近接した空間）における血小板の挙動を正確に把握す
るために、血小板を標識化することが好ましく、生体内
で血小板を染色できる蛍光色素であるカルボキシフルオ
レセイン ジアセテート スクシニミディル エステル
（ＣＦＳＥ）による標識化を行い、血小板を可視化する
ことが特に好ましく、かかる標識化により超高速増感顕
微鏡を用いての血小板の画像化が可能となる。
で行われることを大きな特徴とし、インビトロ系スクリ
ーニングと異なり、目的とする抗炎症剤をより正確に効
率よく選択することができる。かかるインビボにおける
血小板を介しての白血球と血管内皮細胞との接着状態の
検出・評価方法としては、インビボにおける血小板を介
しての白血球と血管内皮細胞との接着状態を検出（測
定）・評価しうる方法であれば特に制限されるものでは
ないが、後毛細血管細静脈等における傍内皮空間（内皮
に近接した空間）における血小板の挙動を正確に把握す
るために、血小板を標識化することが好ましく、生体内
で血小板を染色できる蛍光色素であるカルボキシフルオ
レセイン ジアセテート スクシニミディル エステル
（ＣＦＳＥ）による標識化を行い、血小板を可視化する
ことが特に好ましく、かかる標識化により超高速増感顕
微鏡を用いての血小板の画像化が可能となる。
【００１３】上記インビボにおける血小板を介しての白
血球と血管内皮細胞との接着状態の検出・評価方法とし
ては、血小板を介しての白血球と血管内皮細胞との接着
エネルギー及び／又は血小板を介しての血管内皮細胞へ
の接着白血球数を指標とする検出評価方法を具体的に例
示することができる。上記接着エネルギーは、血管内の
白血球回転速度（Ｖｗ）と赤血球速度（Ｖｒ）との比
（Ｖｗ／Ｖｒ）として求められ、Ｖｗ／Ｖｒが高い値の
場合は接着エネルギーの低下を、低い値の場合は接着エ
ネルギーの上昇を示す。また、白血球回転速度（Ｖｗ）
及び赤血球速度（Ｖｒ）は、単位時間当たりの白血球及
び赤血球のそれぞれの中心の移動距離で求められる。ま
た、上記接着白血球数は、観察画面上で３０秒以上同一
領域に接着している細胞数として計測することができ
る。
血球と血管内皮細胞との接着状態の検出・評価方法とし
ては、血小板を介しての白血球と血管内皮細胞との接着
エネルギー及び／又は血小板を介しての血管内皮細胞へ
の接着白血球数を指標とする検出評価方法を具体的に例
示することができる。上記接着エネルギーは、血管内の
白血球回転速度（Ｖｗ）と赤血球速度（Ｖｒ）との比
（Ｖｗ／Ｖｒ）として求められ、Ｖｗ／Ｖｒが高い値の
場合は接着エネルギーの低下を、低い値の場合は接着エ
ネルギーの上昇を示す。また、白血球回転速度（Ｖｗ）
及び赤血球速度（Ｖｒ）は、単位時間当たりの白血球及
び赤血球のそれぞれの中心の移動距離で求められる。ま
た、上記接着白血球数は、観察画面上で３０秒以上同一
領域に接着している細胞数として計測することができ
る。
【００１４】本発明における非ヒト哺乳動物としては特
に制限されるものではないが、ヒトＧＰＩｂαと交差反
応性を有するｖＷＦやＰ−セレクチンを有する非ヒト哺
乳動物が好ましく、かかる非ヒト哺乳動物としてラット
を具体的に例示することができる。
に制限されるものではないが、ヒトＧＰＩｂαと交差反
応性を有するｖＷＦやＰ−セレクチンを有する非ヒト哺
乳動物が好ましく、かかる非ヒト哺乳動物としてラット
を具体的に例示することができる。
【００１５】本発明の血小板上に発現する糖タンパク質
ＧＰＩｂαの機能を抑制する物質としては、上記の血小
板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制す
る抗炎症性物質のスクリーニング方法により得ることが
できる新規な物質であれば特に制限されるものではない
が、ＧＰＩｂα分子のＮ末端から１〜３０２アミノ酸残
基が形成するコンフォメーションの変化を生じさせる物
質、例えば、ＧＰＩｂα分子のＮ末端から１〜３０２ア
ミノ酸残基が形成するコンフォメーション特異的なエピ
トープを認識するモノクローナル抗体や、ＧＰＩｂα分
子のＮ末端から１〜３０２アミノ酸残基が形成するコン
フォメーションと相互作用するペプチドを具体的に例示
することができる。前記のように、ＧＰＩｂα分子のＮ
末端から１〜３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメ
ーション特異的なエピトープを認識するモノクローナル
抗体として、モノクローナル抗体ＧＵＲ８３／３５が知
られているが、これらＧＰＩｂα分子のＮ末端から１〜
３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメーション特異
的なエピトープを認識するモノクローナル抗体は、ＧＵ
Ｒ８３／３５をも含め、前記論文（Moriki, T., et a
l.; Blood 90, 698-705, 1997、Asazuma, N., et al.;
Blood 90, 4789-4798, 1997）記載の方法により調製す
ることができる。
ＧＰＩｂαの機能を抑制する物質としては、上記の血小
板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制す
る抗炎症性物質のスクリーニング方法により得ることが
できる新規な物質であれば特に制限されるものではない
が、ＧＰＩｂα分子のＮ末端から１〜３０２アミノ酸残
基が形成するコンフォメーションの変化を生じさせる物
質、例えば、ＧＰＩｂα分子のＮ末端から１〜３０２ア
ミノ酸残基が形成するコンフォメーション特異的なエピ
トープを認識するモノクローナル抗体や、ＧＰＩｂα分
子のＮ末端から１〜３０２アミノ酸残基が形成するコン
フォメーションと相互作用するペプチドを具体的に例示
することができる。前記のように、ＧＰＩｂα分子のＮ
末端から１〜３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメ
ーション特異的なエピトープを認識するモノクローナル
抗体として、モノクローナル抗体ＧＵＲ８３／３５が知
られているが、これらＧＰＩｂα分子のＮ末端から１〜
３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメーション特異
的なエピトープを認識するモノクローナル抗体は、ＧＵ
Ｒ８３／３５をも含め、前記論文（Moriki, T., et a
l.; Blood 90, 698-705, 1997、Asazuma, N., et al.;
Blood 90, 4789-4798, 1997）記載の方法により調製す
ることができる。
【００１６】本発明の医薬組成物は、上記の血小板上に
発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗炎
症性物質のスクリーニング方法により得られる抗炎症性
物質を有効成分として含有するものであれば特に制限さ
れるものではないが、上記抗炎症性物質としては、動脈
硬化、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、多臓器不全
（ＭＯＦ）、又は自己免疫疾患に対する抗炎症作用を有
する物質が好ましく、具体的には、血小板上に発現する
糖タンパク質ＧＰＩｂα分子のＮ末端から１〜３０２ア
ミノ酸残基が形成するコンフォメーションの変化を生じ
させる物質、例えば抗ＧＰＩｂαモノクローナル抗体Ｇ
ＵＲ８３／３５などのＧＰＩｂα分子のＮ末端から１〜
３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメーション特異
的なエピトープを認識するモノクローナル抗体や、ＧＰ
Ｉｂα分子のＮ末端から１〜３０２アミノ酸残基が形成
するコンフォメーションと相互作用するペプチドを挙げ
ることができる。
発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗炎
症性物質のスクリーニング方法により得られる抗炎症性
物質を有効成分として含有するものであれば特に制限さ
れるものではないが、上記抗炎症性物質としては、動脈
硬化、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、多臓器不全
（ＭＯＦ）、又は自己免疫疾患に対する抗炎症作用を有
する物質が好ましく、具体的には、血小板上に発現する
糖タンパク質ＧＰＩｂα分子のＮ末端から１〜３０２ア
ミノ酸残基が形成するコンフォメーションの変化を生じ
させる物質、例えば抗ＧＰＩｂαモノクローナル抗体Ｇ
ＵＲ８３／３５などのＧＰＩｂα分子のＮ末端から１〜
３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメーション特異
的なエピトープを認識するモノクローナル抗体や、ＧＰ
Ｉｂα分子のＮ末端から１〜３０２アミノ酸残基が形成
するコンフォメーションと相互作用するペプチドを挙げ
ることができる。
【００１７】本発明の医薬組成物の投与方法としては、
経口投与、静脈注射等の非経口投与のいずれでもよく、
投与量は、投与方法、患者の症状・年齢、抗炎症性物質
の物性等を考慮して適宜設定することができる。また、
剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロ
ップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼
付剤、吸入剤、注射剤等を具体的に例示することがで
き、これらの製剤は製剤用担体と混合して調製した製剤
の形で通常投与される。
経口投与、静脈注射等の非経口投与のいずれでもよく、
投与量は、投与方法、患者の症状・年齢、抗炎症性物質
の物性等を考慮して適宜設定することができる。また、
剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロ
ップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼
付剤、吸入剤、注射剤等を具体的に例示することがで
き、これらの製剤は製剤用担体と混合して調製した製剤
の形で通常投与される。
【００１８】
【実施例】以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体
的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施
例に限定されるものではない。 実施例１［ラット血小板のインビボ標識化］ （実験動物の調製）ウイスター系雄性ラット（３００−
３５０ｇ）にペントバルビタールナトリウム（ネンブタ
ール；pentobarbital sodium）５０ｍｇ／ｋｇを大腿筋
に筋肉内注射することにより麻酔した後、この麻酔した
ラットの大腿静脈にＰＥ−５０ポリエチレン製カテーテ
ルを挿入して薬物投与経路とし、カルボキシフルオレセ
インジアセテート スクシニミディル エステル（ＣＦＤ
ＡＳＥ、Molecular Probes,Inc.製、オレゴン州ユージ
ン）を注入してラット体内の血小板を標識した（Suemat
su M., et al.; Lab Invest. 70, 684-695, 1994）。上
記注入されたＣＦＤＡＳＥは、細胞内に拡散し、主に血
小板及び白血球で起こるエステラーゼによる反応後、安
定した蛍光色素ＣＦＳＥを形成する非蛍光前駆物質であ
る。このＣＦＤＡＳＥ注入から５〜１０分後、上記標識
したラットの腹部正中切開により、回盲部腸間膜を露出
させ、管径２５〜４０μｍの後毛細血管細静脈を観察し
た。腸間膜は、窒素９５％及び二酸化炭素５％からなる
混合ガスで飽和された、３７℃に保温されたＫｒｅｂｓ
緩衝液（ｐＨ７．４）で上記腸間膜表面を１ｍｌ／分の
速度で潅流した。４０-ｘ対物レンズの顕微鏡観察によ
ると、ＣＦＳＥ標識化血小板は針先大の蛍光活性を示
し、他方、ＣＦＳＥ標識化白血球はより大きい球形細胞
として血小板と容易に識別しえた。
的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施
例に限定されるものではない。 実施例１［ラット血小板のインビボ標識化］ （実験動物の調製）ウイスター系雄性ラット（３００−
３５０ｇ）にペントバルビタールナトリウム（ネンブタ
ール；pentobarbital sodium）５０ｍｇ／ｋｇを大腿筋
に筋肉内注射することにより麻酔した後、この麻酔した
ラットの大腿静脈にＰＥ−５０ポリエチレン製カテーテ
ルを挿入して薬物投与経路とし、カルボキシフルオレセ
インジアセテート スクシニミディル エステル（ＣＦＤ
ＡＳＥ、Molecular Probes,Inc.製、オレゴン州ユージ
ン）を注入してラット体内の血小板を標識した（Suemat
su M., et al.; Lab Invest. 70, 684-695, 1994）。上
記注入されたＣＦＤＡＳＥは、細胞内に拡散し、主に血
小板及び白血球で起こるエステラーゼによる反応後、安
定した蛍光色素ＣＦＳＥを形成する非蛍光前駆物質であ
る。このＣＦＤＡＳＥ注入から５〜１０分後、上記標識
したラットの腹部正中切開により、回盲部腸間膜を露出
させ、管径２５〜４０μｍの後毛細血管細静脈を観察し
た。腸間膜は、窒素９５％及び二酸化炭素５％からなる
混合ガスで飽和された、３７℃に保温されたＫｒｅｂｓ
緩衝液（ｐＨ７．４）で上記腸間膜表面を１ｍｌ／分の
速度で潅流した。４０-ｘ対物レンズの顕微鏡観察によ
ると、ＣＦＳＥ標識化血小板は針先大の蛍光活性を示
し、他方、ＣＦＳＥ標識化白血球はより大きい球形細胞
として血小板と容易に識別しえた。
【００１９】（血小板ＣＦＳＥ標識化による影響）上記
インビボで標識化したラットから採血し、培養皿上に分
取したＣＦＳＥ標識化血小板画分の透過光線像を図１
（参考写真１参照）に示す。また、インビボでの血小板
ＣＦＳＥ標識化による影響を、血小板のリストセチン及
びＡＤＰに対する凝集形成挙動について調べた。図２に
示されるように、リストセチン処理又はＡＤＰ処理によ
り、ＣＦＳＥ標識化血小板とＣＦＳＥ非標識化血小板と
は、同程度の微小凝集形成性を示した。すなわち、リス
トセチンやＡＤＰにより誘発された小凝集塊形成（ｓ）
及び大凝集塊形成（ｌ）並びに最大凝集反応強度及びそ
の反応を示すまでの時間（％Ｔ）は、グループ間で統計
学的に異ならなかった。さらに、これらのピーク値が観
察された時間も顕著には異ならなかった。また、インビ
ボにＣＦＤＡＳＥを投与した群と投与しない群とでは循
環血流中の血小板数に差異が認められなかった。これら
のことから、本法による血小板ＣＦＳＥ標識化は、刺激
による血小板凝集能に影響を与えないことがわかった。
インビボで標識化したラットから採血し、培養皿上に分
取したＣＦＳＥ標識化血小板画分の透過光線像を図１
（参考写真１参照）に示す。また、インビボでの血小板
ＣＦＳＥ標識化による影響を、血小板のリストセチン及
びＡＤＰに対する凝集形成挙動について調べた。図２に
示されるように、リストセチン処理又はＡＤＰ処理によ
り、ＣＦＳＥ標識化血小板とＣＦＳＥ非標識化血小板と
は、同程度の微小凝集形成性を示した。すなわち、リス
トセチンやＡＤＰにより誘発された小凝集塊形成（ｓ）
及び大凝集塊形成（ｌ）並びに最大凝集反応強度及びそ
の反応を示すまでの時間（％Ｔ）は、グループ間で統計
学的に異ならなかった。さらに、これらのピーク値が観
察された時間も顕著には異ならなかった。また、インビ
ボにＣＦＤＡＳＥを投与した群と投与しない群とでは循
環血流中の血小板数に差異が認められなかった。これら
のことから、本法による血小板ＣＦＳＥ標識化は、刺激
による血小板凝集能に影響を与えないことがわかった。
【００２０】実施例２［赤血球の流速の測定］ 微小血管を流れる個々の赤血球を、前報（Am J Physio
l. 264, G828-834, 1993、Am J Physiol. 253, G596-60
0, 1987）のように、生体内超高速増幅ビデオ顕微鏡（E
ktapro-2000/TMD-2、コダック社製、カリフォルニア
州）で可視化した。枝分かれのない直線状の前毛細血管
細動脈及び後毛細血管細静脈を選択し、焦点を細静脈内
皮層に調整して、透過光線下４０-ｘ水浸式対物レンズ
で赤血球を可視化し、１０００フレーム／秒で１秒間ビ
デオ録画したところ、図３Ａ（参考写真２参照）に示さ
れているように、赤血球を粒状パターン像として認識す
ることができた（図中、ａ：細動脈、ｖ：細静脈、バ
ー：３０μｍ）。次に、撮像のため選択した微小血管の
横断面を同心円状にほぼ５分割した場合における各領域
について、５ｍsecに相当する５フレーム間の移動距離
を測定することにより、赤血球細胞の流速を算出した。
また、測定は各領域における少なくとも５つの異なる赤
血球について行った。結果を図４に示す。図４には、最
も流速が大きい中心線領域の流速を１００％とした赤血
球の相対速度（ｚ軸）が、測定時間（ｘ軸）及び測定領
域（ｙ軸）の関数として表されている。なお、ｙ軸にお
けるＰｃは中心線領域、Ｐｅは傍内皮領域、Ｐ1/4、Ｐ2
/4、Ｐ3/4はそれらの間の領域を示している。図４に示
されているように、細静脈中心線領域で測定された速度
は、大きくは変動することなく、また細静脈内を流れる
赤血球の速度は、中心領域から傍内皮領域の方にいくに
したがって低下することがわかる。
l. 264, G828-834, 1993、Am J Physiol. 253, G596-60
0, 1987）のように、生体内超高速増幅ビデオ顕微鏡（E
ktapro-2000/TMD-2、コダック社製、カリフォルニア
州）で可視化した。枝分かれのない直線状の前毛細血管
細動脈及び後毛細血管細静脈を選択し、焦点を細静脈内
皮層に調整して、透過光線下４０-ｘ水浸式対物レンズ
で赤血球を可視化し、１０００フレーム／秒で１秒間ビ
デオ録画したところ、図３Ａ（参考写真２参照）に示さ
れているように、赤血球を粒状パターン像として認識す
ることができた（図中、ａ：細動脈、ｖ：細静脈、バ
ー：３０μｍ）。次に、撮像のため選択した微小血管の
横断面を同心円状にほぼ５分割した場合における各領域
について、５ｍsecに相当する５フレーム間の移動距離
を測定することにより、赤血球細胞の流速を算出した。
また、測定は各領域における少なくとも５つの異なる赤
血球について行った。結果を図４に示す。図４には、最
も流速が大きい中心線領域の流速を１００％とした赤血
球の相対速度（ｚ軸）が、測定時間（ｘ軸）及び測定領
域（ｙ軸）の関数として表されている。なお、ｙ軸にお
けるＰｃは中心線領域、Ｐｅは傍内皮領域、Ｐ1/4、Ｐ2
/4、Ｐ3/4はそれらの間の領域を示している。図４に示
されているように、細静脈中心線領域で測定された速度
は、大きくは変動することなく、また細静脈内を流れる
赤血球の速度は、中心領域から傍内皮領域の方にいくに
したがって低下することがわかる。
【００２１】実施例３［微小血管における血小板の挙
動］ （血小板相対速度の測定）赤血球撮像用透過光線光源か
ら落射蛍光用水銀ランプ（ＨＢ−１００、ニコン、東
京）に換えて、細静脈内を流れるＣＦＳＥ標識化血小板
を、４７０ｎｍの落射蛍光による蛍光像として可視化し
た。すなわち、標識化血小板からの蛍光放射を、５１０
ｎｍ以上の波長域透過フィルター、及び増幅器へ導かれ
た背景光を弱める近赤外線遮断フィルターを透過させ
た。ＣＦＳＥ標識化血漿部分により確認された血管内と
血管外との間の中間面の画質確認による焦点調整後、超
高速撮像を１０００フレーム／秒で２秒間行った。傍内
皮領域及び中心線領域に沿って流れる血小板の速度を、
高速ビデオ画像の再生によりフレーム毎に分析して測定
した（Am J Physiol. 264, G828-834, 1993）。
動］ （血小板相対速度の測定）赤血球撮像用透過光線光源か
ら落射蛍光用水銀ランプ（ＨＢ−１００、ニコン、東
京）に換えて、細静脈内を流れるＣＦＳＥ標識化血小板
を、４７０ｎｍの落射蛍光による蛍光像として可視化し
た。すなわち、標識化血小板からの蛍光放射を、５１０
ｎｍ以上の波長域透過フィルター、及び増幅器へ導かれ
た背景光を弱める近赤外線遮断フィルターを透過させ
た。ＣＦＳＥ標識化血漿部分により確認された血管内と
血管外との間の中間面の画質確認による焦点調整後、超
高速撮像を１０００フレーム／秒で２秒間行った。傍内
皮領域及び中心線領域に沿って流れる血小板の速度を、
高速ビデオ画像の再生によりフレーム毎に分析して測定
した（Am J Physiol. 264, G828-834, 1993）。
【００２２】ＣＦＳＥで標識化された血小板を可視化す
ることができたが、血管内における厳密な局在位置は、
その移動速度が速いため通常のビデオレートでは図３Ｂ
（参考写真２参照）に示したようにほとんど確認するこ
とができなかったが、数フレーム／秒で再生し、針先大
の蛍光を示す焦点の合った血小板のみを分析のために選
択することにより、血小板の血管壁に沿った動きを追跡
することができた。図３Ｃ〜Ｈ（参考写真２参照）に
は、２０ｍsec又は４０ｍsec間隔での連続蛍光像が示さ
れている。特に、細静脈壁との相互作用が、“星印”と
“矢印”を付した２つの血小板により示されている。図
３Ｃ〜Ｈに示すように、“星印”を付した血小板の流速
は遅く、“矢印”を付した血小板は速いことを示してい
る。すなわち、細静脈の傍内皮領域で移動する個々の血
小板の速度にはバラツキがあることがわかった。
ることができたが、血管内における厳密な局在位置は、
その移動速度が速いため通常のビデオレートでは図３Ｂ
（参考写真２参照）に示したようにほとんど確認するこ
とができなかったが、数フレーム／秒で再生し、針先大
の蛍光を示す焦点の合った血小板のみを分析のために選
択することにより、血小板の血管壁に沿った動きを追跡
することができた。図３Ｃ〜Ｈ（参考写真２参照）に
は、２０ｍsec又は４０ｍsec間隔での連続蛍光像が示さ
れている。特に、細静脈壁との相互作用が、“星印”と
“矢印”を付した２つの血小板により示されている。図
３Ｃ〜Ｈに示すように、“星印”を付した血小板の流速
は遅く、“矢印”を付した血小板は速いことを示してい
る。すなわち、細静脈の傍内皮領域で移動する個々の血
小板の速度にはバラツキがあることがわかった。
【００２３】血小板の流速は、赤血球の追突など赤血球
速度により影響されることから、同一血管部位における
血小板速度（Ｖｐ）と赤血球速度（Ｖｒ）との比（Ｖｐ
／Ｖｒ）で表される血小板相対速度を、中心線領域と傍
内皮領域について調べてみた。個々の血小板速度（Ｖ
ｐ）は、赤血球の場合と同様に、５ｍsecに相当する５
フレーム間の移動距離を測定することにより算出した。
またこれとは別に、血管内皮細胞と相互作用する個々の
血小板の瞬間的な速度変化を調べるために、血管内皮細
胞に沿った１０μｍ又は２０μｍの移動にかかる時間を
血小板と赤血球とについて測定することによりＶｐ／Ｖ
ｒを求めた。中心線領域と傍内皮領域において測定され
た少なくとも６０個の血小板の測定から求めた血小板相
対速度の分布を図５に示す。図５からわかるように、中
心線領域におけるＶｐ／Ｖｒ値はほぼ一定で約１００％
であるのに対し、傍内皮領域におけるＶｐ／Ｖｒ値は変
動し、５０％まで低下することもあった。このことは、
傍内皮領域の血小板と微小血管内皮細胞との接着相互作
用の存在を示しており、傍内皮領域におけるＶｐ／Ｖｒ
値は、血小板と内皮細胞との接着エネルギーの指標とし
うることがわかる。
速度により影響されることから、同一血管部位における
血小板速度（Ｖｐ）と赤血球速度（Ｖｒ）との比（Ｖｐ
／Ｖｒ）で表される血小板相対速度を、中心線領域と傍
内皮領域について調べてみた。個々の血小板速度（Ｖ
ｐ）は、赤血球の場合と同様に、５ｍsecに相当する５
フレーム間の移動距離を測定することにより算出した。
またこれとは別に、血管内皮細胞と相互作用する個々の
血小板の瞬間的な速度変化を調べるために、血管内皮細
胞に沿った１０μｍ又は２０μｍの移動にかかる時間を
血小板と赤血球とについて測定することによりＶｐ／Ｖ
ｒを求めた。中心線領域と傍内皮領域において測定され
た少なくとも６０個の血小板の測定から求めた血小板相
対速度の分布を図５に示す。図５からわかるように、中
心線領域におけるＶｐ／Ｖｒ値はほぼ一定で約１００％
であるのに対し、傍内皮領域におけるＶｐ／Ｖｒ値は変
動し、５０％まで低下することもあった。このことは、
傍内皮領域の血小板と微小血管内皮細胞との接着相互作
用の存在を示しており、傍内皮領域におけるＶｐ／Ｖｒ
値は、血小板と内皮細胞との接着エネルギーの指標とし
うることがわかる。
【００２４】（血小板密度の測定）次に、微小血管の傍
内皮領域及び中心線領域における血小板密度の差異を調
べた。前記のように、赤血球速度は中心線領域が傍内皮
領域よりも速く、傍内皮領域に比べてより多くの循環血
小板が中心線領域に供給されると考え、中心線領域にお
けるＣＦＳＥ標識化血小板の密度（Ｄｐｃ）と傍内皮領
域の密度（Ｄｐｅ）とを次式のようにそれぞれ定義し
た。
内皮領域及び中心線領域における血小板密度の差異を調
べた。前記のように、赤血球速度は中心線領域が傍内皮
領域よりも速く、傍内皮領域に比べてより多くの循環血
小板が中心線領域に供給されると考え、中心線領域にお
けるＣＦＳＥ標識化血小板の密度（Ｄｐｃ）と傍内皮領
域の密度（Ｄｐｅ）とを次式のようにそれぞれ定義し
た。
【数１】 （式中、Ｎｐｃ及びＮｐｅ、Ａｐｃ及びＡｐｅ、Ｖｐｃ
及びＶｐｅは、それぞれ中心線領域及び傍内皮領域にお
ける、単位時間に観察された血小板数、血小板を含む局
所血管領域範囲、血小板速度を表す。したがって、Ａｐ
ｃ・Ｖｐｃ及びＡｐｅ・Ｖｐｅは単位時間当たりの流量
を表すことになる。）また、Ｄｐｅ／Ｄｐｃを傍内皮空
間における血小板の相対密度とすることができる。
及びＶｐｅは、それぞれ中心線領域及び傍内皮領域にお
ける、単位時間に観察された血小板数、血小板を含む局
所血管領域範囲、血小板速度を表す。したがって、Ａｐ
ｃ・Ｖｐｃ及びＡｐｅ・Ｖｐｅは単位時間当たりの流量
を表すことになる。）また、Ｄｐｅ／Ｄｐｃを傍内皮空
間における血小板の相対密度とすることができる。
【００２５】実施例４［ＬＰＳ投与による血小板への影
響］ （血小板相対速度）炎症反応が生じている場合の血小板
の挙動を調べるために、エンドトキシンで誘発される播
種性血管内凝固症候群実験モデルに関する文献（Am J P
athol. 65,51-58, 1971）の記載に準じて、ラットに内
毒素（ＬＰＳ；Ｏ１１１Ｂ４、Sigma製、ミズーリ州セ
ントルイス）を１．０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒで静脈内注射し
た。なお、対照として、担体としての生理食塩水を同様
に静脈内注射した。ＬＰＳ投与区、対照区とも６匹以上
のラットを用い、両区とも約１００個の異なる血小板に
ついて傍内皮領域における血小板相対速度（Ｖｐ／Ｖ
ｒ）を測定した。結果を図６に示す。対照区における平
均Ｖｐ値は、平均Ｖｒ値の約９２％であったが、図６か
らわかるように、ＬＰＳでラットを処理することによ
り、血小板と血管内皮細胞との相互作用が高まり、血小
板相対速度（Ｖｐ／Ｖｒ）が全体的に低下した。
響］ （血小板相対速度）炎症反応が生じている場合の血小板
の挙動を調べるために、エンドトキシンで誘発される播
種性血管内凝固症候群実験モデルに関する文献（Am J P
athol. 65,51-58, 1971）の記載に準じて、ラットに内
毒素（ＬＰＳ；Ｏ１１１Ｂ４、Sigma製、ミズーリ州セ
ントルイス）を１．０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒで静脈内注射し
た。なお、対照として、担体としての生理食塩水を同様
に静脈内注射した。ＬＰＳ投与区、対照区とも６匹以上
のラットを用い、両区とも約１００個の異なる血小板に
ついて傍内皮領域における血小板相対速度（Ｖｐ／Ｖ
ｒ）を測定した。結果を図６に示す。対照区における平
均Ｖｐ値は、平均Ｖｒ値の約９２％であったが、図６か
らわかるように、ＬＰＳでラットを処理することによ
り、血小板と血管内皮細胞との相互作用が高まり、血小
板相対速度（Ｖｐ／Ｖｒ）が全体的に低下した。
【００２６】（細静脈壁ズリ速度）赤血球の壁ズリ速度
γ（sec-1）は次式により求めることができる（J Clin
Invest. 96, 2009-2016, 1995）。
γ（sec-1）は次式により求めることができる（J Clin
Invest. 96, 2009-2016, 1995）。
【数２】 （式中、Ｖｍは前記赤血球の中心線領域流速の平均値／
１．６で求められる平均赤血球速度を、Ｄｖは血管内径
をそれぞれ表す。）かかる赤血球の細静脈壁ズリ速度γ
（sec-1）を上記ＬＰＳ投与区、対照区について測定し
たところ、投与開始後３０分では、それぞれ４８６±３
９sec-1及び４７６±５２sec-1（７実験の平均値±Ｓ
Ｄ）であり、統計学的差異を示さなかった。この細静脈
壁ズリ速度の結果と前記血小板相対速度の結果とを考慮
すると、ＬＰＳがインビボで傍内皮血小板と細静脈内皮
との接着エネルギーを増加させることがわかる。
１．６で求められる平均赤血球速度を、Ｄｖは血管内径
をそれぞれ表す。）かかる赤血球の細静脈壁ズリ速度γ
（sec-1）を上記ＬＰＳ投与区、対照区について測定し
たところ、投与開始後３０分では、それぞれ４８６±３
９sec-1及び４７６±５２sec-1（７実験の平均値±Ｓ
Ｄ）であり、統計学的差異を示さなかった。この細静脈
壁ズリ速度の結果と前記血小板相対速度の結果とを考慮
すると、ＬＰＳがインビボで傍内皮血小板と細静脈内皮
との接着エネルギーを増加させることがわかる。
【００２７】実施例５［抗ヒトＧＰＩｂαモノクローナ
ル抗体ＧＵＲ８３／３５のインビボ投与におけるＬＰＳ
誘発接着エネルギーの抑制］ （血小板の転回反応の抑制）実施例４におけるＬＰＳ投
与の５分前に、抗ヒトＧＰＩｂαモノクローナル抗体Ｇ
ＵＲ８３／３５を生体内注射（１．５ｍｇ／ｋｇ）によ
り投与した。また比較のために、抗ヒトＧＰＩｂαモノ
クローナル抗体ＷＧＡ３を同様に投与した。前記のよう
に、抗体ＧＵＲ８３／３５は、ヒトＧＰＩｂαのＮ末端
から１〜３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメーシ
ョン特異的なエピトープを認識し、リストセチン存在下
におけるｖＷＦのヒト血小板への結合を阻止するが、抗
体ＷＧＡ３は、ヒトＧＰＩｂαの同領域に結合するが、
この反応を阻止しない（Blood.90, 4789-4798, 199
7）。対照区、ＬＰＳ投与区、ＧＵＲ８３／３５・ＬＰ
Ｓ投与区及びＷＧＡ３・ＬＰＳ投与区について、各区６
匹のラットを用いて、循環血小板数、前記傍内皮領域に
おける血小板の相対密度（Ｄｐｅ／Ｄｐｃ）及び傍内皮
空間における血小板相対速度（Ｖｐ／Ｖｒ）を、生理食
塩水又はＬＰＳ投与２０分後に測定した。結果を図７に
示す。
ル抗体ＧＵＲ８３／３５のインビボ投与におけるＬＰＳ
誘発接着エネルギーの抑制］ （血小板の転回反応の抑制）実施例４におけるＬＰＳ投
与の５分前に、抗ヒトＧＰＩｂαモノクローナル抗体Ｇ
ＵＲ８３／３５を生体内注射（１．５ｍｇ／ｋｇ）によ
り投与した。また比較のために、抗ヒトＧＰＩｂαモノ
クローナル抗体ＷＧＡ３を同様に投与した。前記のよう
に、抗体ＧＵＲ８３／３５は、ヒトＧＰＩｂαのＮ末端
から１〜３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメーシ
ョン特異的なエピトープを認識し、リストセチン存在下
におけるｖＷＦのヒト血小板への結合を阻止するが、抗
体ＷＧＡ３は、ヒトＧＰＩｂαの同領域に結合するが、
この反応を阻止しない（Blood.90, 4789-4798, 199
7）。対照区、ＬＰＳ投与区、ＧＵＲ８３／３５・ＬＰ
Ｓ投与区及びＷＧＡ３・ＬＰＳ投与区について、各区６
匹のラットを用いて、循環血小板数、前記傍内皮領域に
おける血小板の相対密度（Ｄｐｅ／Ｄｐｃ）及び傍内皮
空間における血小板相対速度（Ｖｐ／Ｖｒ）を、生理食
塩水又はＬＰＳ投与２０分後に測定した。結果を図７に
示す。
【００２８】図７からわかるように、ＬＰＳ投与によ
り、血液中の血小板量は著しく低下したが、相対密度
（Ｄｐｅ／Ｄｐｃ）は約２０％上昇した。ＬＰＳ誘発に
よる傍内皮領域における血小板の相対密度の上昇は、傍
内皮空間における血小板相対速度（Ｖｐ／Ｖｒ）の低下
が示したと同様に、血小板と内皮細胞との接着相互作用
の増加を表している。また、抗体ＧＵＲ８３／３５をＬ
ＰＳ投与に先だって予めインビボ投与した場合、対照区
と同じ程度まで上記ＬＰＳにより誘発される血小板と血
管内皮細胞との相互作用を抑制しうることがわかった
が、他方、抗体ＷＧＡ３を予めインビボ投与した場合、
ＬＰＳにより誘発される血小板と血管内皮細胞との相互
作用を何ら抑制しないことがわかった（図７中、“＊”
は対照区と比べて、また“＊＃”はＧＵＲ８３／３５・
ＬＰＳ投与区と比べて、統計学的に有意差があることを
示す。）。また、図７には示されていないが、抗体ＧＵ
Ｒ８３／３５又は抗体ＷＧＡ３をＬＰＳ未処理ラットへ
投与した場合における各種測定値は対照区の値と変わら
なかった。
り、血液中の血小板量は著しく低下したが、相対密度
（Ｄｐｅ／Ｄｐｃ）は約２０％上昇した。ＬＰＳ誘発に
よる傍内皮領域における血小板の相対密度の上昇は、傍
内皮空間における血小板相対速度（Ｖｐ／Ｖｒ）の低下
が示したと同様に、血小板と内皮細胞との接着相互作用
の増加を表している。また、抗体ＧＵＲ８３／３５をＬ
ＰＳ投与に先だって予めインビボ投与した場合、対照区
と同じ程度まで上記ＬＰＳにより誘発される血小板と血
管内皮細胞との相互作用を抑制しうることがわかった
が、他方、抗体ＷＧＡ３を予めインビボ投与した場合、
ＬＰＳにより誘発される血小板と血管内皮細胞との相互
作用を何ら抑制しないことがわかった（図７中、“＊”
は対照区と比べて、また“＊＃”はＧＵＲ８３／３５・
ＬＰＳ投与区と比べて、統計学的に有意差があることを
示す。）。また、図７には示されていないが、抗体ＧＵ
Ｒ８３／３５又は抗体ＷＧＡ３をＬＰＳ未処理ラットへ
投与した場合における各種測定値は対照区の値と変わら
なかった。
【００２９】（白血球の転回抑制）上記の実験におい
て、抗体ＧＵＲ８３／３５のインビボ投与における白血
球の挙動に与える影響について調べた。また、参考のた
め、ＬＰＳ未処理ラットへ抗体ＧＵＲ８３／３５を投与
した。対照区、ＧＵＲ８３／３５投与区（参考区）、Ｌ
ＰＳ投与区、ＧＵＲ８３／３５・ＬＰＳ投与区につい
て、傍内皮領域における赤血球速度（Ｖｒ）、傍内皮空
間における白血球相対速度（Ｖｗ／Ｖｒ）及び接着白血
球数を測定した。傍内皮領域における白血球速度（Ｖ
ｗ）は、赤血球速度や血小板速度と同様にして測定し
た。白血球相対速度（Ｖｗ／Ｖｒ）は、血小板相対速度
（Ｖｐ／Ｖｒ）と同様に、白血球と血管内皮細胞との接
着相互作用を示し、この値が大きいと接着エネルギーが
低下したことを、小さいと接着エネルギーが増加したこ
とを示す。また、上記接着白血球数は、観察画面上で３
０秒以上同一部位に接着している細胞数として計測し
た。したがって、接着白血球数が多くなると、白血球と
血管内皮細胞との接着相互作用が増大していることを意
味する。結果を表１に示す。
て、抗体ＧＵＲ８３／３５のインビボ投与における白血
球の挙動に与える影響について調べた。また、参考のた
め、ＬＰＳ未処理ラットへ抗体ＧＵＲ８３／３５を投与
した。対照区、ＧＵＲ８３／３５投与区（参考区）、Ｌ
ＰＳ投与区、ＧＵＲ８３／３５・ＬＰＳ投与区につい
て、傍内皮領域における赤血球速度（Ｖｒ）、傍内皮空
間における白血球相対速度（Ｖｗ／Ｖｒ）及び接着白血
球数を測定した。傍内皮領域における白血球速度（Ｖ
ｗ）は、赤血球速度や血小板速度と同様にして測定し
た。白血球相対速度（Ｖｗ／Ｖｒ）は、血小板相対速度
（Ｖｐ／Ｖｒ）と同様に、白血球と血管内皮細胞との接
着相互作用を示し、この値が大きいと接着エネルギーが
低下したことを、小さいと接着エネルギーが増加したこ
とを示す。また、上記接着白血球数は、観察画面上で３
０秒以上同一部位に接着している細胞数として計測し
た。したがって、接着白血球数が多くなると、白血球と
血管内皮細胞との接着相互作用が増大していることを意
味する。結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】表１からわかるように、ＬＰＳ未処理の場
合（対照区及び参考区）、抗体ＧＵＲ８３／３５の有無
にかかわらず、白血球相対速度（Ｖｗ／Ｖｒ）や接着白
血球数において有意な差は認められなかった。これに対
して、ＬＰＳ投与区では、赤血球速度（Ｖｒ）において
は対照区と変わりがないが、白血球相対速度（Ｖｗ／Ｖ
ｒ）は５０％程度の低下を示し、また、接着白血球数も
顕著に増加し、白血球と血管内皮細胞との接着エネルギ
ーが増大したことが示された。他方、インビボで抗体Ｇ
ＵＲ８３／３５を投与し、５分後にＬＰＳを投与したＧ
ＵＲ８３／３５・ＬＰＳ投与区では、ＬＰＳにより誘発
される接着エネルギーの増加を、白血球相対速度、接着
白血球数ともに統計学上有意な差をもって、顕著に抑制
した。これらの結果は、ＧＰＩｂαの機能を抑制するこ
とにより、刺激に伴う白血球の接着反応が抑制されるこ
とを示しており、また、参考区の結果からして、ＧＰＩ
ｂαの機能を抑制することにより生じる、白血球接着に
対する抑制効果は、血管が刺激を受けた状況下において
のみ発現することがわかった。
合（対照区及び参考区）、抗体ＧＵＲ８３／３５の有無
にかかわらず、白血球相対速度（Ｖｗ／Ｖｒ）や接着白
血球数において有意な差は認められなかった。これに対
して、ＬＰＳ投与区では、赤血球速度（Ｖｒ）において
は対照区と変わりがないが、白血球相対速度（Ｖｗ／Ｖ
ｒ）は５０％程度の低下を示し、また、接着白血球数も
顕著に増加し、白血球と血管内皮細胞との接着エネルギ
ーが増大したことが示された。他方、インビボで抗体Ｇ
ＵＲ８３／３５を投与し、５分後にＬＰＳを投与したＧ
ＵＲ８３／３５・ＬＰＳ投与区では、ＬＰＳにより誘発
される接着エネルギーの増加を、白血球相対速度、接着
白血球数ともに統計学上有意な差をもって、顕著に抑制
した。これらの結果は、ＧＰＩｂαの機能を抑制するこ
とにより、刺激に伴う白血球の接着反応が抑制されるこ
とを示しており、また、参考区の結果からして、ＧＰＩ
ｂαの機能を抑制することにより生じる、白血球接着に
対する抑制効果は、血管が刺激を受けた状況下において
のみ発現することがわかった。
【００３２】実施例６［抗ヒトＧＰＩｂαモノクローナ
ル抗体ＧＵＲ８３／３５による血小板のインビトロ処理
におけるＬＰＳ誘発接着エネルギーの抑制］ （ヒト及びラット血小板のインビトロＣＦＳＥ標識化）
上記ＬＰＳ処理ラットにおける抗ヒトＧＰＩｂαモノク
ローナル抗体ＧＵＲ８３／３５によるラット血小板やラ
ット白血球の血管内皮細胞との接着抑制効果がヒト血小
板においても同様に発現するかどうかを、ＬＰＳ投与ラ
ットにヒト血小板を注射して、ラット後毛細血管細静脈
におけるヒト血小板のインビボにおける挙動を、前記生
体内顕微鏡を用いて調べた。ヒト血小板のＣＦＳＥ標識
化は、当然のことながらインビトロで行われることか
ら、インビトロ標識化も含めてこの実験のコントロール
としてラット血小板のインビトロＣＦＳＥ標識化も併せ
て行った。
ル抗体ＧＵＲ８３／３５による血小板のインビトロ処理
におけるＬＰＳ誘発接着エネルギーの抑制］ （ヒト及びラット血小板のインビトロＣＦＳＥ標識化）
上記ＬＰＳ処理ラットにおける抗ヒトＧＰＩｂαモノク
ローナル抗体ＧＵＲ８３／３５によるラット血小板やラ
ット白血球の血管内皮細胞との接着抑制効果がヒト血小
板においても同様に発現するかどうかを、ＬＰＳ投与ラ
ットにヒト血小板を注射して、ラット後毛細血管細静脈
におけるヒト血小板のインビボにおける挙動を、前記生
体内顕微鏡を用いて調べた。ヒト血小板のＣＦＳＥ標識
化は、当然のことながらインビトロで行われることか
ら、インビトロ標識化も含めてこの実験のコントロール
としてラット血小板のインビトロＣＦＳＥ標識化も併せ
て行った。
【００３３】健康なボランティアから採取したヒト血液
サンプルを用いてヒト血小板を調製した（J Clin Inves
t. 101, 479-486, 1998）。通常この調製には、α−ト
ロンビン抑制剤が凝集阻害剤として使用されるが、この
実験系では内毒素血症ラットで内因性トロンビン活性に
より誘発される細胞の接着反応を阻害する可能性を除外
するために、３．８％クエン酸ナトリウムを抗凝血剤と
して用いた。次に、ヒト血小板が豊富に含まれる血漿
（ＰＲＰ）サンプルを、９０μＭのＣＦＤＡＳＥで１０
分間室温でインキュベートし、その後一回洗浄すること
により、ＣＦＳＥ標識化ヒト血小板を調製した。また、
蛍光標識化ヒト血小板を最終濃度２０μｇ／ｍｌの抗ヒ
トＧＰＩｂαモノクローナル抗体ＧＵＲ８３／３５又は
ＷＧＡ３の存在下で浮遊させ、５．０×１０5細胞／ｍ
ｌで含む抗体処理ヒト血小板懸濁液を調製し、１２５μ
ｌ／分で４分間かけてラットに静脈注射した。かかる静
脈注射により、ヒト血小板はラットの腸間膜微小血管系
において鮮明なスポットとして認識できるようになっ
た。
サンプルを用いてヒト血小板を調製した（J Clin Inves
t. 101, 479-486, 1998）。通常この調製には、α−ト
ロンビン抑制剤が凝集阻害剤として使用されるが、この
実験系では内毒素血症ラットで内因性トロンビン活性に
より誘発される細胞の接着反応を阻害する可能性を除外
するために、３．８％クエン酸ナトリウムを抗凝血剤と
して用いた。次に、ヒト血小板が豊富に含まれる血漿
（ＰＲＰ）サンプルを、９０μＭのＣＦＤＡＳＥで１０
分間室温でインキュベートし、その後一回洗浄すること
により、ＣＦＳＥ標識化ヒト血小板を調製した。また、
蛍光標識化ヒト血小板を最終濃度２０μｇ／ｍｌの抗ヒ
トＧＰＩｂαモノクローナル抗体ＧＵＲ８３／３５又は
ＷＧＡ３の存在下で浮遊させ、５．０×１０5細胞／ｍ
ｌで含む抗体処理ヒト血小板懸濁液を調製し、１２５μ
ｌ／分で４分間かけてラットに静脈注射した。かかる静
脈注射により、ヒト血小板はラットの腸間膜微小血管系
において鮮明なスポットとして認識できるようになっ
た。
【００３４】同様に、ex vivoでＣＦＳＥ標識した濃度
５．０×１０5細胞／ｍｌのラット血小板を調製した。
この標識化ラット血小板を豊富に含む血漿を用いて、イ
ンビトロにおいて細胞が刺激依存性凝集を適切に示すか
どうかを、ＡＤＰ及びリストセチンを刺激剤として用い
るレーザー微小凝集測定法により試験した。この試験に
より、単離過程におけるテクニカルエラーにより起こる
ことがある凝集能が低下した血小板サンプルを排除する
ことができた。また、ヒト血小板におけると同様に、抗
体ＧＵＲ８３／３５でインビトロにおいて前処理した
後、ラットに静脈注射した。
５．０×１０5細胞／ｍｌのラット血小板を調製した。
この標識化ラット血小板を豊富に含む血漿を用いて、イ
ンビトロにおいて細胞が刺激依存性凝集を適切に示すか
どうかを、ＡＤＰ及びリストセチンを刺激剤として用い
るレーザー微小凝集測定法により試験した。この試験に
より、単離過程におけるテクニカルエラーにより起こる
ことがある凝集能が低下した血小板サンプルを排除する
ことができた。また、ヒト血小板におけると同様に、抗
体ＧＵＲ８３／３５でインビトロにおいて前処理した
後、ラットに静脈注射した。
【００３５】（ラットの標識化血小板及び白血球の挙
動）前記超高速撮像条件では録画時間に制限（１〜２
分）があったため、蛍光標識した血小板を外から投与す
るこの実験では、標識化血小板の挙動をより長期間撮像
することができるように、超高感度シリコン増幅ターゲ
ットカメラ（ＳＩＴ、Ｃ２４００−０８、Hamamatsu Ph
otonics製、浜松市）を用いた。このカメラで３０フレ
ーム／秒で撮像し、数分間蛍光像を得ることができたの
で、再生ビデオ画像を用いて比較的転回速度の遅い血小
板のフレーム毎の解析を行った。図８（参考写真３参
照）には、ＬＰＳ処理したラット細静脈におけるモノク
ローナル抗体処理又は未処理ラット血小板を、上記ＳＩ
Ｔカメラを用いて撮像した結果が示されている。図８か
ら、注入された血小板は一過性接着及び転回を示した
が、いくつかの細胞は細静脈内皮への固定接着を示すこ
とがわかった。また、傍内皮空間を流れている血小板の
ある集団は、しばしば転回白血球に付着し、白血球−血
小板複合体を形成して、白血球の転回速度をさらに減速
させた。なお、図８における左上の数値は標識化ラット
血小板注射後の経過時間を表し、白抜き及び黒の“星
印”はそれぞれ転回血小板、捕捉血小板を示し、白抜き
の“矢印”は転回白血球の表面に接着した血小板を、黒
の“矢印”は流動状態の血小板が衝突して複合体を形成
し血管細胞壁にゆっくりと接着していく白血球を示して
いる（バーは４０μｍ）。
動）前記超高速撮像条件では録画時間に制限（１〜２
分）があったため、蛍光標識した血小板を外から投与す
るこの実験では、標識化血小板の挙動をより長期間撮像
することができるように、超高感度シリコン増幅ターゲ
ットカメラ（ＳＩＴ、Ｃ２４００−０８、Hamamatsu Ph
otonics製、浜松市）を用いた。このカメラで３０フレ
ーム／秒で撮像し、数分間蛍光像を得ることができたの
で、再生ビデオ画像を用いて比較的転回速度の遅い血小
板のフレーム毎の解析を行った。図８（参考写真３参
照）には、ＬＰＳ処理したラット細静脈におけるモノク
ローナル抗体処理又は未処理ラット血小板を、上記ＳＩ
Ｔカメラを用いて撮像した結果が示されている。図８か
ら、注入された血小板は一過性接着及び転回を示した
が、いくつかの細胞は細静脈内皮への固定接着を示すこ
とがわかった。また、傍内皮空間を流れている血小板の
ある集団は、しばしば転回白血球に付着し、白血球−血
小板複合体を形成して、白血球の転回速度をさらに減速
させた。なお、図８における左上の数値は標識化ラット
血小板注射後の経過時間を表し、白抜き及び黒の“星
印”はそれぞれ転回血小板、捕捉血小板を示し、白抜き
の“矢印”は転回白血球の表面に接着した血小板を、黒
の“矢印”は流動状態の血小板が衝突して複合体を形成
し血管細胞壁にゆっくりと接着していく白血球を示して
いる（バーは４０μｍ）。
【００３６】次に、標識化ラット血小板を抗体ＧＵＲ８
３／３５で前処理した場合の転回血小板数を調べた。画
像領域において血管に沿った一過性的に転回を示す血小
板は、血管の特定部位で捕捉されたものと同様に、転回
細胞とした。このような転回血小板数を、標識化ラット
血小板（ＰＬＴ）のみ投与の対照区、ＰＬＴ・ＬＳＰ投
与区及びＰＬＴ・ＧＵＲ８３／３５・ＬＳＰ投与区につ
き、各５匹の異なるラットの血管内で１分間測定した。
結果を図９に示す。図９から、抗体ＧＵＲ８３／３５で
前処理した場合、ＬＰＳにより誘発された血小板と血管
内皮細胞との接着作用が、ＬＰＳ未処理の対照区とほぼ
同程度まで抑制されることがわかった。このことは、血
小板上に構成的に発現するＧＰＩｂαの機能阻害が、前
記インビボで標識化した血小板の場合と同様な結果を与
えることを示している。
３／３５で前処理した場合の転回血小板数を調べた。画
像領域において血管に沿った一過性的に転回を示す血小
板は、血管の特定部位で捕捉されたものと同様に、転回
細胞とした。このような転回血小板数を、標識化ラット
血小板（ＰＬＴ）のみ投与の対照区、ＰＬＴ・ＬＳＰ投
与区及びＰＬＴ・ＧＵＲ８３／３５・ＬＳＰ投与区につ
き、各５匹の異なるラットの血管内で１分間測定した。
結果を図９に示す。図９から、抗体ＧＵＲ８３／３５で
前処理した場合、ＬＰＳにより誘発された血小板と血管
内皮細胞との接着作用が、ＬＰＳ未処理の対照区とほぼ
同程度まで抑制されることがわかった。このことは、血
小板上に構成的に発現するＧＰＩｂαの機能阻害が、前
記インビボで標識化した血小板の場合と同様な結果を与
えることを示している。
【００３７】（ヒト標識化血小板の挙動）上記標識化ラ
ット血小板を外から注入した場合における結果を踏まえ
て、標識化ヒト血小板を外から注入した場合における、
インビボでのヒト血小板とラット血管内皮細胞との接着
相互作用、特にＧＰＩｂαの機能阻害による接着相互作
用ついて調べた。図１０には、生理食塩水注射後にヒト
血小板を注射した対照区と、ＬＰＳ注射後にヒト血小板
を注射したＬＰＳ投与区との、傍内皮領域におけるヒト
血小板の転回速度（Ｖｐ）のヒストグラムがそれぞれ示
されている。ヒト血小板の転回速度は、標識化ラット血
小板を外から注射開始後４〜８分間の血管壁上の転回血
小板数を再生ビデオテープにより測定した。図１０に示
されるように、ＬＰＳ処理ラットに投与されたヒト血小
板は、対照区と比べ、転回速度の全範囲において、より
高頻度で現出し、０．２ｍｍ／秒より低速度のスロー転
回を示すヒト血小板数は、ＬＰＳ処理グループにおいて
著しく上昇した。このことは、ラットにおけるインビボ
の実験系がヒトの抗炎症剤のスクリーニングに適してい
ることを示している。
ット血小板を外から注入した場合における結果を踏まえ
て、標識化ヒト血小板を外から注入した場合における、
インビボでのヒト血小板とラット血管内皮細胞との接着
相互作用、特にＧＰＩｂαの機能阻害による接着相互作
用ついて調べた。図１０には、生理食塩水注射後にヒト
血小板を注射した対照区と、ＬＰＳ注射後にヒト血小板
を注射したＬＰＳ投与区との、傍内皮領域におけるヒト
血小板の転回速度（Ｖｐ）のヒストグラムがそれぞれ示
されている。ヒト血小板の転回速度は、標識化ラット血
小板を外から注射開始後４〜８分間の血管壁上の転回血
小板数を再生ビデオテープにより測定した。図１０に示
されるように、ＬＰＳ処理ラットに投与されたヒト血小
板は、対照区と比べ、転回速度の全範囲において、より
高頻度で現出し、０．２ｍｍ／秒より低速度のスロー転
回を示すヒト血小板数は、ＬＰＳ処理グループにおいて
著しく上昇した。このことは、ラットにおけるインビボ
の実験系がヒトの抗炎症剤のスクリーニングに適してい
ることを示している。
【００３８】また、図１１には、生理食塩水注射後にヒ
ト血小板を注射した対照区と、ＬＰＳ注射後にヒト血小
板を注射したＬＰＳ投与区と、ＬＰＳ注射後にヒト血小
板を注射したＬＰＳ投与区と、ＬＰＳ注射後に抗体ＧＵ
Ｒ８３／３５処理ヒト血小板を注射したＧＵＲ８３／３
５・ＬＰＳ処理区及びＬＰＳ注射後に抗体ＷＧＡ３処理
ヒト血小板を注射したＷＧＡ３・ＬＰＳ処理区における
転回ヒト血小板数について、各５匹の異なるラットの血
管内で１分間測定した結果が示されている。図１１に示
されるように、ＬＰＳ誘発による転回ヒト血小板数の増
加は、モノクローナル抗体ＧＵＲ８３／３５によりイン
ビトロで前処理した場合、有意に減少したが、抗体ＷＧ
Ａ３による前処理では減少しなかった。このことは、ヒ
トＧＰＩｂαの機能を阻害する抗ヒトＧＰＩｂαモノク
ローナル抗体ＧＵＲ８３／３５が、ヒト白血球のヒト血
管内皮細胞への接着に起因する炎症性疾患を抑制するこ
とができることを示している。
ト血小板を注射した対照区と、ＬＰＳ注射後にヒト血小
板を注射したＬＰＳ投与区と、ＬＰＳ注射後にヒト血小
板を注射したＬＰＳ投与区と、ＬＰＳ注射後に抗体ＧＵ
Ｒ８３／３５処理ヒト血小板を注射したＧＵＲ８３／３
５・ＬＰＳ処理区及びＬＰＳ注射後に抗体ＷＧＡ３処理
ヒト血小板を注射したＷＧＡ３・ＬＰＳ処理区における
転回ヒト血小板数について、各５匹の異なるラットの血
管内で１分間測定した結果が示されている。図１１に示
されるように、ＬＰＳ誘発による転回ヒト血小板数の増
加は、モノクローナル抗体ＧＵＲ８３／３５によりイン
ビトロで前処理した場合、有意に減少したが、抗体ＷＧ
Ａ３による前処理では減少しなかった。このことは、ヒ
トＧＰＩｂαの機能を阻害する抗ヒトＧＰＩｂαモノク
ローナル抗体ＧＵＲ８３／３５が、ヒト白血球のヒト血
管内皮細胞への接着に起因する炎症性疾患を抑制するこ
とができることを示している。
【００３９】
【発明の効果】本発明によると、白血球の血管への接着
に起因する炎症性疾患を抑制することができる抗炎症剤
をラット等の動物を用いてインビボでスクリーニングす
ることができることから、インビトロでのスクリーニン
グに比べて、精確かつ効率よく抗炎症剤を見い出すこと
ができる。例えば、インビボにおける本スクリーニング
方法により見い出された抗ヒトＧＰＩｂαモノクローナ
ル抗体ＧＵＲ８３／３５は、動脈硬化、播種性血管内凝
固症候群、多臓器不全、自己免疫疾患等に対する抗炎症
剤として使用することができる。
に起因する炎症性疾患を抑制することができる抗炎症剤
をラット等の動物を用いてインビボでスクリーニングす
ることができることから、インビトロでのスクリーニン
グに比べて、精確かつ効率よく抗炎症剤を見い出すこと
ができる。例えば、インビボにおける本スクリーニング
方法により見い出された抗ヒトＧＰＩｂαモノクローナ
ル抗体ＧＵＲ８３／３５は、動脈硬化、播種性血管内凝
固症候群、多臓器不全、自己免疫疾患等に対する抗炎症
剤として使用することができる。
【図１】インビボＣＦＳＥ標識化ラット血小板の透過光
源像を示す図である。
源像を示す図である。
【図２】インビボＣＦＳＥ標識化血小板とＣＦＳＥ非標
識化血小板における、リストセチン及びＡＤＰに対する
凝集形成挙動を示す図である。
識化血小板における、リストセチン及びＡＤＰに対する
凝集形成挙動を示す図である。
【図３】時間的経過にしたがって撮像した微小血管を流
れるインビボＣＦＳＥ標識化血小板と赤血球を示す図で
ある。
れるインビボＣＦＳＥ標識化血小板と赤血球を示す図で
ある。
【図４】微小血管の各領域において測定された赤血球の
相対速度、測定時間、測定領域を３次元的に示す図であ
る。
相対速度、測定時間、測定領域を３次元的に示す図であ
る。
【図５】中心線領域と傍内皮領域におけるインビボＣＦ
ＳＥ標識化血小板相対速度の分布を示す図である。
ＳＥ標識化血小板相対速度の分布を示す図である。
【図６】ＬＰＳ投与によるインビボＣＦＳＥ標識化血小
板相対速度（Ｖｐ／Ｖｒ）における影響を示す図であ
る。
板相対速度（Ｖｐ／Ｖｒ）における影響を示す図であ
る。
【図７】抗体ＧＵＲ８３／３５投与による循環インビボ
ＣＦＳＥ標識化血小板数、血小板の相対密度及び血小板
相対速度における影響を示す図である。
ＣＦＳＥ標識化血小板数、血小板の相対密度及び血小板
相対速度における影響を示す図である。
【図８】ＬＰＳ処理したラット細静脈におけるインビト
ロＣＦＳＥ標識化ラット血小板を示す図である。
ロＣＦＳＥ標識化ラット血小板を示す図である。
【図９】抗体ＧＵＲ８３／３５投与によるインビトロＣ
ＦＳＥ標識化ラット血小板の転回血小板数における影響
を示す図である。
ＦＳＥ標識化ラット血小板の転回血小板数における影響
を示す図である。
【図１０】抗体ＧＵＲ８３／３５投与によるＣＦＳＥ標
識化ヒト血小板の転回速度における影響を示す図であ
る。
識化ヒト血小板の転回速度における影響を示す図であ
る。
【図１１】抗体ＧＵＲ８３／３５投与によるＣＦＳＥ標
識化転回ヒト血小板数における影響を示す図である。
識化転回ヒト血小板数における影響を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/02 Ａ６１Ｐ 37/02 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/53 33/53 Ｖ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CA24 CA25 DA36 FB03 FB07 FB12 GC15 4B063 QA01 QA18 QQ02 QR72 QX10 4B064 AG27 DA08 4C084 AA17 NA14 ZA451 ZA541 ZB071 ZB112 ZC511 4C085 AA14 BA42 BB12 DD61 4H045 AA11 AA30 CA42 DA76 EA22
Claims (17)
- 【請求項１】 非ヒト哺乳動物に炎症反応を生じせしめ
ると同時又はその前後に被検物質を投与するか、あるい
は、炎症反応を常態で示す非ヒト哺乳動物に被検物質を
投与し、インビボにおける血小板を介しての白血球と血
管内皮細胞との接着状態を検出・評価することを特徴と
する血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能
を抑制する抗炎症性物質のスクリーニング方法。 - 【請求項２】 エンドトキシンを投与して炎症反応を生
じせしめることを特徴とする請求項１記載の血小板上に
発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗炎
症性物質のスクリーニング方法。 - 【請求項３】 血小板として、ＣＦＳＥで標識化された
血小板を用いることを特徴とする請求項１又は２記載の
血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑
制する抗炎症性物質のスクリーニング方法。 - 【請求項４】 接着状態の検出・評価が、血管内の白血
球回転速度（Ｖｗ）と赤血球速度（Ｖｒ）との比（Ｖｗ
／Ｖｒ）で求められる接着エネルギーを指標とした検出
評価であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記
載の血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能
を抑制する抗炎症性物質のスクリーニング方法。 - 【請求項５】 投与が静脈内投与であることを特徴とす
る請求項１〜４のいずれか記載の血小板上に発現する糖
タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗炎症性物質の
スクリーニング方法。 - 【請求項６】 血管内皮細胞が後毛細血管細静脈である
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の血小板
上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する
抗炎症性物質のスクリーニング方法。 - 【請求項７】 非ヒト哺乳動物がラットであることを特
徴とする血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの
機能を抑制する抗炎症性物質のスクリーニング方法。 - 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか記載の血小板上
に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する抗
炎症性物質のスクリーニング方法により得られることを
特徴とする血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂα
の機能を抑制する物質。 - 【請求項９】 血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩ
ｂαの機能を抑制する物質が、ＧＰＩｂα分子のＮ末端
から１〜３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメーシ
ョンの変化を生じさせる物質であることを特徴とする請
求項８記載の血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂ
αの機能を抑制する物質。 - 【請求項１０】 ＧＰＩｂαのコンフォメーションの変
化を生じさせる物質が、ＧＰＩｂα分子のＮ末端から１
〜３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメーション特
異的なエピトープを認識するモノクローナル抗体である
ことを特徴とする請求項９記載の血小板上に発現する糖
タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する物質。 - 【請求項１１】 ＧＰＩｂαのコンフォメーションの変
化を生じさせる物質が、ＧＰＩｂα分子のＮ末端から１
〜３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメーションと
相互作用するペプチドであることを特徴とする請求項９
記載の血小板上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機
能を抑制する物質。 - 【請求項１２】 請求項１〜７のいずれか記載の血小板
上に発現する糖タンパク質ＧＰＩｂαの機能を抑制する
抗炎症性物質のスクリーニング方法により得られる抗炎
症性物質を有効成分として含有することを特徴とする医
薬組成物。 - 【請求項１３】 抗炎症性物質が、血小板上に発現する
糖タンパク質ＧＰＩｂα分子のＮ末端から１〜３０２ア
ミノ酸残基が形成するコンフォメーションの変化を生じ
させる物質であることを特徴とする請求項１２記載の医
薬組成物。 - 【請求項１４】 ＧＰＩｂαのコンフォメーションの変
化を生じさせる物質が、ＧＰＩｂα分子のＮ末端から１
〜３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメーション特
異的なエピトープを認識するモノクローナル抗体である
ことを特徴とする請求項１３記載の医薬組成物。 - 【請求項１５】 モノクローナル抗体が、抗ＧＰＩｂα
モノクローナル抗体ＧＵＲ８３／３５であることを特徴
とする請求項１４記載の医薬組成物。 - 【請求項１６】 ＧＰＩｂαのコンフォメーションの変
化を生じさせる物質が、ＧＰＩｂα分子のＮ末端から１
〜３０２アミノ酸残基が形成するコンフォメーションと
相互作用するペプチドであることを特徴とする請求項１
３記載の医薬組成物。 - 【請求項１７】 抗炎症性物質が、動脈硬化、播種性血
管内凝固症候群、多臓器不全、又は自己免疫疾患に対す
る抗炎症作用を有する物質であることを特徴とする請求
項１２〜１６のいずれか記載の医薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000136496A JP2001318093A (ja) | 2000-05-09 | 2000-05-09 | 血小板ＧＰＩｂαの機能抑制物質を有効成分とする抗炎症剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000136496A JP2001318093A (ja) | 2000-05-09 | 2000-05-09 | 血小板ＧＰＩｂαの機能抑制物質を有効成分とする抗炎症剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001318093A true JP2001318093A (ja) | 2001-11-16 |
Family
ID=18644426
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000136496A Pending JP2001318093A (ja) | 2000-05-09 | 2000-05-09 | 血小板ＧＰＩｂαの機能抑制物質を有効成分とする抗炎症剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001318093A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006517789A (ja) * | 2003-01-10 | 2006-08-03 | アブリンクス エン．ヴェー． | 治療用ポリペプチド、その相同物、その断片、および血小板媒介凝集の調節での使用 |
| CN109107535A (zh) * | 2018-08-23 | 2019-01-01 | 苏州科技大学 | 一种离子液体磁性类沸石咪唑酯纳米材料及其制备方法与应用 |
-
2000
- 2000-05-09 JP JP2000136496A patent/JP2001318093A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006517789A (ja) * | 2003-01-10 | 2006-08-03 | アブリンクス エン．ヴェー． | 治療用ポリペプチド、その相同物、その断片、および血小板媒介凝集の調節での使用 |
| CN109107535A (zh) * | 2018-08-23 | 2019-01-01 | 苏州科技大学 | 一种离子液体磁性类沸石咪唑酯纳米材料及其制备方法与应用 |
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