KR20200005635A - 가변 면역글로불린 도메인의 글리코실화 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 조작된 글리코실화 억셉터 부위를 갖는 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 발명은 선택된 글리칸으로 변형된 면역글로불린 가변 도메인 및 이의 특이적 글리칸-접합체를 제공한다. 또한 본 명세서는 글리코실화된 면역글로불린 가변 도메인 및 이의 글리칸-접합체의 제조를 위한 방법을 제공한다.
Description
본 출원은 글리코실화 조작 분야, 보다 특히 면역글로불린 도메인 및 이의 글리코실화된 유도체에 관한 것이다. 특히 본 발명은 조작된 글리코실화 억셉터 부위를 갖는 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 따라서, 본 발명은 선택된 글리칸으로 변형된 면역글로불린 가변 도메인 단백질 및 이의 특이적 글리칸-접합체를 제공한다. 또한 본 명세서는 글리코실화된 면역글로불린 가변 도메인 및 이의 글리칸-접합체의 제조를 위한 방법을 제공한다.
재조합 항체 기술 분야는 주로 그들의 인간 치료 용도에서의 관심때문에, 지난 이십여년 동안 급속히 진척되어 왔다. 디스플레이 기술을 통해 특이적 인간 항체를 선택하고 분자적 진화를 통해 그들 친화성, 안정성 및 발현 수준을 개선시키는 능력은 이 분야를 더욱 부양시켰다. 전체 항체는 중쇄 및 경쇄로 이루어진 복합 분자이다. 단리된 항체 중쇄 및 경쇄가 항원-결합 특이성을 유지할 수 있더라도, 그들 친화성 및 가용성은 대개는 감소된다. 그러나, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 의 쌍형성된 N-말단 가변 도메인은 항원 결합에 충분하다. 이러한 항체 단편은 VH 및 VL 도메인이 폴리펩티드 링커에 의해 연결된, 단일-사슬 Fv (scFv) 또는 1가 항체 단편 (Fab)으로서 생산될 수 있다. 낙타과가 경쇄없이 기능성 항체를 생산한다는 뜻밖의 발견 (Hamers-Casterman et al (1993) Nature 363:446-448)은 그들 단일 N-말단 도메인 (VHH, 나노바디 (Nanobody)®라고도 알려짐)이 도메인 쌍형성을 요구하지 않고 항원에 결합한다는 것이 이후에 확인되었기 때문에 이 분야에서 새로운 사고 방식을 형성시켰다. 이들 중쇄 단독 항체는 또한 통상의 항체에서 경쇄와 회합되고 더 적은 정도로 VH 도메인과 상호작용하는, CH1 도메인이 결여되어 있다. 이러한 단일-도메인 항체는 이후에 또한 특정한 연골 어류에서 확인되었고 (Greenberg et al (1995) Nature 374:168-173), VHH와 함께 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체 (ISVD)라고 종종 표시된다. ISVD는 그들의 소형 크기, 높은 안정성, 유전자 융합에 의한 변형의 용이함, 및 미생물에서의 양호한 생산 수준 덕분에 흥미로운 치료적 가능성을 제시한다. 나노바디®가 진핵생물 세포에서 생산될 때, 그들 중 약 십분의 일은 글리코실화된다 (Functional Glycomics, June 11, 2009). 그러나, 글리코실화는 일반적으로 ISVD의 생산의 경우 피하게 되는데, 그런 이유로 글리칸의 존재가 불균질성을 유입시킬 수 있고, 또한 폴딩 및 항원 인식을 방해할 수 있으므로 글리코실화 억셉터 부위는 돌연변이된다. ISVD의 소형 크기는 또한 환자에게 투여되었을 때 그들의 순환계로부터의 빠른 제거때문에 치료적 단점이다. 다른 한편으로 ISVD의 소형 크기는 ISVD의 반감기 연장 분자와의 커플링, 또는 특별한 약제 (예를 들어, 항체-약제 접합체의 형성) 또는 추적자와의 커플링을 위한 기회를 제공한다. 다양한 커플링 방법은 당분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 특히 단일클론 항체의 변형 분야에서 적용됨), 이들 기술은 예를 들어 각각 아실화 또는 알킬화에 의해서, 1차 아민 기 (리신 잔기 및 N-말단)를 통하거나 또는 시스테인을 통한 접합에 집중한다. 그러나, 일반적으로 접합의 부위-제어가 낮아서 완전한 균질성은 거의 수득되지 않는다. 단일클론 항체의 글리칸-특이적 접합은 Synaffix BV (예를 들어 WO2014065661, WO2015057065 및 WO2015057064 참조)가 기술한 바와 같이 더 많은 균질성을 제공하지만, 이러한 전략은 글리칸이 그들이 추가적인 화학적 커플링에 적합하기 전에 시험관내에서 제조되어야만 한다는 사실로 인해 쉽지 않다. 이들 ISVD의 결합 또는 폴딩 기능에 지장을 주지않는 글리칸 구조에 의해 변형될 수 있고, 효율적인 글리코실화를 유도시켜서 그 결과 적합한 생산 시스템에서 생산될 때 균질하고, 화학적 커플링에 사용 준비된 글리칸 구조를 생성시키는 ISVD 내 특이적 부위를 확인하는 것이 바람직할 것이다. 종래 기술에서 글리칸으로 ISVD의 변형은 이미 존재하는 항-VH 자기항체와의 결합을 방지하는데 유용하다는 것이 확인되었다 (예를 들어 WO2016150845 참조). 그러나, 글리코실화 부위의 도입을 위한 특별한 디자인 전략이 사용되지 않았고 위치는 임의적으로 선택되었으며 주로 ISVD의 노출된 C-말단 영역에 집중되었다. 그 결과로, ISVD의 특별한 특성에 대한 글리칸 존재의 영향을 비롯하여 글리코실화의 효율은 현재 예측불가능하고 개별 기준으로 평가되어야 한다.
본 출원의 중요한 목적은 면역글로불린 가변 도메인 (IVD)을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 것이고, 여기서 IVD는 합리적인 디자인 접근법을 통해서 확인된 특이적으로 선택된 영역에 존재하는 글리코실화 억셉터 부위를 갖는다. IVD 내 특이적 영역에서 이들 특이적 글리코실화 억셉터 부위의 존재는 IVD와 그들 리간드의 결합 친화성에 지장을 주지않고 IVD의 폴딩을 방해하지 않으면서 효율적인 글리코실화를 가능하게 한다. 중요하게, IVD는 본 명세서에서 더욱 설명하는 바와 같이 다양한 모이어티로 더욱 변형될 수 있는 특이적 위치에 글리칸의 균질한 형태를 포함하는 적합한 숙주 세포에서 재조합적으로 생산될 수 있다.
따라서, 제1 양상에 따라서, 다음을 제공한다: IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 여기서 IVD는 다음의 식 (1): FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (1)에 따른 4개 프레임워크 영역 (FR) 및 3개 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 적합한 단편을 포함하고, 여기서 IVD는 IVD의 임의의 아미노산 83 내지 88 및/또는 임의의 아미노산 27 내지 40 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하는 글리코실화 억셉터 부위를 갖는다. 특정한 양상에서 상기 IVD는 면역글로불린 단일 가변 도메인이다. IVD의 글리코실화 억셉터 부위는 N-글리코실화될 수 있는 아스파라긴 잔기일 수 있다. 특히, 상기 IVD의 글리코실화 억셉터 부위는 NXT/NXS/NXC/NXV 모티프의 아스파라긴 잔기가 IVD의 임의의 위치 83 내지 88 및/또는 임의의 위치 27 내지 40 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하도록 NXT, NXS, NXC 또는 NXV 모티프 (여기서 X는 프롤린 (P)을 제외한 임의의 아미노산일 수 있음)를 함유한다. 특별한 실시형태에서 IVD는 IVD 내에 추가적인 글리코실화 억셉터 부위, 예컨대 위치 14 및/또는 48 (AHo 번호매김 협약에 따름)을 갖는다.
다른 양상에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는, IVD를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
다른 양상에 따라서 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 및 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
재조합 세포는 특정한 실시형태에 따라서, 고등 진핵생물 세포, 예컨대 포유동물 세포 또는 식물 세포, 하등 진핵생물 세포, 예컨대 사상 진균 세포 또는 효모 세포이거나, 또는 일정한 조건에서는 또한 원핵생물 세포이다. 글리코-조작된 세포, 특히 글리코-조작된 하등 진핵생물 세포가 특히 관련있다.
보다 특히, 본 발명에 따른 고등 진핵생물 세포는 척추동물 세포, 특히 포유동물 세포이다. 예에는 제한없이, CHO 세포 또는 HEK293 세포 (예를 들어, HEK293S 세포)가 포함된다.
이들 세포를 사용하면 IVD는 특이적인 합리적으로 선택된 부위에서 글리칸으로 변형된 것이 생산될 수 있다. 글리코-조작된 세포는 특히 바람직한 글리칸 및/또는 균질한 글리칸으로 변형된 IVD의 생산에 호의적이므로 특히 유리하다. 이러한 균질한 글리코실화 프로파일은 그의 특성이 충분히 예측가능한 생성물이 획득되므로 매우 바람직하다.
게다가, 상기 기술된 세포는 접합에 호의적인 GlcNAc, LacNAc, 또는 시알릴-LacNAc 글리칸에 의해 세포 내에서 직접적으로 변형되는 IVD의 생산에 유용하다. 게다가, 이들 세포의 적용은 균질한 글리코실화 프로파일을 갖는 IVD를 유도한다. 따라서, 수득된 생성물이 고도로 균질하므로 통상의 접근법보다 특정한 이득이 획득된다. 이것은 전형적으로 추가 변형을 위한 출발 지점으로서 GlcNAc, Gal, 또는 Sia 잔기를 제공하기 위해 불균질한 글리칸의 시험관내 효소 처리를 요구하는 통상의 접근법과 대조적이다. 높은 비용이외에도, 시험관내 효소 처리는 불완전한 프로세싱과 그에 따른 불균질한 생성물이라는 위험성이 있을 수 있다. 다른 통상의 접근법은 불균질하게 글리코실화된 단백질의 직접 프로세싱을 기반으로 하며, 그에 따라, 역시 최종 생성물은 균질성이 결여된다.
특별한 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 글리코실화된 IVD를 포함한다. 글리코실화는 특별한 실시형태에 따라서, 말단 GlcNAc, GalNAc, 갈락토스, 시알산, 글루코스, 글루코사민, 갈락토사민, 바실로사민, 만노스 또는 만노스-6-P 당을 갖는 하나 이상의 글리칸 또는 하나 이상의 글리칸에 존재하는 화학적으로 변형된 모노사카라이드 예컨대 GalNAz, GlcNAz, 또는 아지도-시알산을 포함한다. 다른 특별한 실시형태에 따라서, 글리코실화는 GlcNAc, LacNAc (= GlcNAc-Gal), 시알릴-LacNAc, Man5GlcNAc2, Man8GlcNAc2, Man9GlcNAc2, 복합 글리칸, 하이브리드 글리칸 및 GlcNAz, GlcNAc-GalNAz, 및 LacNAc-아지도-시알산으로 이루어진 목록으로부터 선택되는 하나 이상의 글리칸으로 이루어진다 (탄수화물의 명명법은 문헌 [Alan D. McNaught (1996) Pure & Appl. Chem. Vol. 68, No 10, 1919-2008] 참조). 상기 기술된 글리칸으로 일정한 위치에서 변형된 IVD는 글리칸-특이적 접합을 위해 특히 유용하다. 특히 GlcNAc, LacNAc, 또는 시알릴-LacNAc로 이루어진 글리코실화 프로파일이 부위-특이적 접합에 유리하다.
특별한 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 글리칸에 접합되는, 접합 모이어티를 포함하는 IVD 접합체가 제공된다.
합리적으로 선택된 위치에서 글리칸으로 변형된 IVD는 글리칸-기반 접합을 위해 이상적인 출발 지점이다. 예를 들어 IVD 상에 존재하는 글리칸과 모이어티의 연결은 IVD 접합체의 생산을 가능하게 하고, 여기서 IVD 및 접합 모이어티의 비율은 명확하다.
특히 효율적인 접합을 가능하게 하는 균질한 글리칸으로 변형된 IVD가 보다 더 유리하다. 접합은 화학적으로 (예를 들어, 글리칸 성분의 페리오데이트 산화의 사용 및 당분야에 공지된 방법 예컨대 옥심 결찰, 히드라존 결찰을 통하거나, 또는 환원적 아민화를 통한 후속 접합) 또는 효소적으로 (예를 들어, 갈락토스를 산화시키기 위해 갈락토스 옥시다제의 사용 및 옥심 결찰, 히드라존 결찰을 통하거나, 또는 환원적 아민화를 통한 후속 결찰) 수행될 수 있다. 대안적으로, 태그화된 글리칸 잔기는 후속 접합 반응 (예를 들어, 돌연변이체 갈락토실트랜스퍼라제를 사용한 글리칸 사슬 내에 GalNAz의 도입, 및 클릭 화학을 통한 후속 접합 반응)이 가능하도록 도입될 수 있다.
접합 모이어티는 반감기 연장 모이어티, 치료제, 검출 유닛 또는 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 글리칸 접합 방법론을 통해서 약제, 추적자 등과의 접합을 위한 생물-직교적 핸들로서 본 발명에 따른 IVD 상의 글리칸을 사용하기 위한 기회는 본 명세서에 기술된 예들에 제한되지 않는다.
본 출원은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 IVD를 포함하는 폴리펩티드 및 IVD-접합체를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 특히,
- 적합한 세포를 제공하는 단계,
- 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 상기 세포에 도입시키는 단계,
- 적합한 조건에서 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 발현시키는 단계, 및
- IVD를 포함하는 폴리펩티드를 단리하는 단계
를 포함하는, 적합한 세포에서 본 발명에 따른 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법이 제공된다.
상기 방법은 접합 모이어티를 폴리펩티드에 연결시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 IVD를 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 조성물은 약학 조성물이다. 보다 더 바람직하게, 상기 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보강제를 더 포함하고, 임의로는 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다.
도 1: 대표적인 ISVD, 여기서는 나노바디의 3차 구조 (좌) 및 2차 구조 토폴로지 (우) (PDB 등재 id: 3K74 유래의 사슬 B). 몇몇 가정 영역이 N-연결 글리코실화 시퀀 도입을 위해 결정되었다 (우측 패널에서, 9개 영역은 검은색으로 도시됨).
도 2: 기준 나노바디 PDB id: 3K74에서 N-연결 글리코실화 시퀀의 도입을 위해 선택된 10개의 특이적 부위 (X로 표시됨) (이 도면에서 번호매김은 aHo 번호매김 체계를 의미하고, 대체 (카밧 (Kabat)) 번호매김의 경우 도 9를 참조함).
도 3: 나노바디 GBP와 나노바디 3K74의 아미노산 정렬.
도 4: GBP 나노바디에 N-연결 글리코실화 서명의 도입을 위해 선택된 특이적 부위가 도시된다 (이 도면에서 번호매김은 aHo 번호매김 체계를 의미하고, 대체 (카밧) 번호매김의 경우 도 9 또는 11을 참조함). N-글리코실화 효율은 His-특이적 웨스턴 블롯 데이타 또는 질량 분석 데이타를 기반으로 추정하였다.
도 5: 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 야생형 (WT), GlycoSwitchM5 (GSM5), 및 GlycoDelete (GD) 균주에서 발현된, 나노바디 GBP 및 GBP-R86N 변이체 (AHo 번호매김)의 쿠마시 및 항-HIS 웨스턴 블롯.
도 6: 피키아 파스토리스 야생형 (WT) 및 GlycoSwitchM5 (GSM5)에서 발현된, GBP의 N-글리코태그 변이체의 쿠마시 및 항-HIS 웨스턴 블롯 (또는 동등한 표현인 His6-특이적 웨스턴 블롯). 샘플은 모의-처리되거나 또는 PNGaseF-분해하여 N-글리칸을 제거하였다.
도 7: 피키아 GlycoSwitchM5 (GSM5)에서 발현된, GBP의 9종의 '글리코변이체'의 쿠마시 및 항-HIS WB 분석. 샘플은 모의-처리되었거나 또는 PNGaseF-분해되어 N-글리칸을 제거하였다. 흰색 박스는 N-말단 (8개 아미노산) 또는 C-말단 (22개 아미노산) 글리코태그 아미노산 서열의 첨가로 인한 분자량의 증가를 표시한다.
도 8: 피키아 파스토리스 GlycoDelete (GD) 균주에서 생산된 나노바디 GBP-R86N의 ESI-QTOF MS 분석. N-글리코실화된 변이체는 13699 Da에서 검출된 한편, 비글리코실화된 분획은 13496 Da에서 검출된다.
도 9: 나노바디 Nb 41, F-VHH-4, 및 F-VHH-L66과 나노바디 GBP 및 3K74의 서열 정렬.
도 10: 피키아 파스토리스 야생형 (WT), GlycoSwitchM5 (GSM5), 및 GlycoDelete (GD)에서 발현된, Nb41 및 Nb41-K86N 변이체의 쿠마시 및 항-HIS WB 분석. 샘플은 모의-처리되었거나 또는 PNGaseF-분해되어 N-글리칸을 제거하였다.
도 11: 나노바디 GBP 글리코실화 부위의 개요.
도 12: GBP 글리코변이체의 용융 그래프. 피키아 파스토리스 GlycoSwitchM5 (GSM5) (Man5GlcNAc2 글리칸)에서 생산시키고 IMAC 및 SEC를 통해 정제하고, 포스페이트-완충 염수 (PBS, 위) 또는 HEPES-완충 염수 (HBS, 아래)에 용리시킨 나노바디. qPCR 기계에서 SYPRO 오렌지 염료를 사용한 열 이동 어세이.
도 13: GBP N-글리코실화 변이체 (GBP-P48N-K50T 제외)는 미변형된 GBP-WT와 유사한 특징으로 그들 항원 GFP에 결합한다. 나노바디는 피키아 파스토리스 GlycoSwitchM5 (GSM5, Man5GlcNAc2 글리칸)에서 생산하였고 IMAC 및 SEC를 통해 정제하였고, 포스페이트-완충 염수 (PBS) 또는 HEPES-완충 염수 (HBS)에 용리하였다. 생물층 간섭계 (BLI)는 스트렙타비딘 팁 상에 고정시킨 100 nM의 바이오틴화된 Avitag-GFP를 사용해 수행하였다. GBP 글리코변이체 (8 내지 0.125 nM)의 2배 연속 희석물에 대한 친화성은 96-웰 포맷으로 25℃에서 측정하였다. 친화성 매개변수의 요약은 위에 표시되어 있고, ForteBio Data Analysis 9.0 (오차 막대는 SEM을 의미함)으로 계산하였다.
도 14: RSV 특이적 VHH F-VHH-L66에 대한 중화 어세이. F-VHH-L66은 야생형 (wt) 피키아 파스토리스 및 GlycoSwitchM5 (GSM5) 및 Glycodelete (GD) 균주에서 생산하였다.
도 15: 영역 27-40 (위) 및 영역 83-88 (아래)에 글리코변이를 갖는 나노바디 GBP의 부분 서열 정렬.
도 16: N-글리칸은 사실상 나노바디 GBP 내 2개의 선택된 영역의 임의 위치에 도입될 수 있지만, 부위 점유는 가변적이다. GBP 글리코변이체는 피키아 파스토리스 GlycoSwitchM5 (GSM5)에서 발현시켰다. 모든 재조합 변이체의 상청액을 채취하였고, PNGaseF-처리하거나 또는 모의 처리하였고, 14-20% 농도구배 SDS-PAGE와 그 이후에 Bio-Rad TGX 염색제-무함유 검출 (위) 및 His-태그-특이적 웨스턴 블롯 분석 (아래)을 통해 N-글리코실화의 존재에 대해 어세이하였다. 야생형 GBP, 각 선택된 영역 내 글리코변이체 (영역 27-40 내 GBP-P30A-V31N-R33T 및 영역 83-88 내에 GBP-D84N-A85T) 및 인공 삽입부를 함유하는 글리코변이체 (GBP-33-39-긴삽입)의 상청액 샘플은 온전한 단백질 질량 분석법을 통해 분석하였다 (아래 우측). 뒤의 3개의 질량은 1216 Da으로 확인되고 Man5GlcNAc2 글리칸 변형은 하기에 개략적으로 표시된 바와 같이 존재한다. 정규화된 스펙트럼은 GBP-WT의 경우 2.27E3, GBP-D83N-A85T의 경우 4.29E3, GBP-P30T-V31N-R33T의 경우 7.64E2 및 GBP-33-39-긴삽입의 경우 2.14E3의 정규화된 길이 (NL)로 표시된다. S-S: 단일 디술피드 결합, pyroQ: N-말단 파이로글루타민 잔기, M5: Man5GlcNAc2 글리칸 변형.
도 17: 후속 옥심 결찰과 커플링되는, LacNAc-기반 페리오데이트 산화의 도식적 개요.
도 18: 후속 옥심 결찰과 커플링되는, 시알릴-LacNAc-기반 페리오데이트 산화의 도식적 개요.
도 19: 후속 옥심 결찰과 커플링되는, GAO-기반 LacNAc 산화의 도식적 개요.
도 20: 후속 옥심 결찰과 커플링되는, GAO-F2-기반 GlcNAc 산화의 도식적 개요.
도 21: GalNAc 의 아지드-변형된 형태 (GalNAz)와 단일 GlcNAc N-글리칸의 화학-효소 커플링 이후에 후속되는 아지드와 변형 알킨의 클릭 화학 반응에 대한 도식적 개요.
도 22: Sia 의 아지드-변형된 형태 (AzSia)와 LacNAc N-글리칸의 화학-효소 커플링 이후에 후속되는 아지드와 변형된 알킨의 클릭 화학 반응에 대한 도식적 개요.
도 23: 피키아 파스토리스 야생형 (NRRLY11430), GlycoSwitchM5, 및 GlycoDelete 균주에서 생산된 나노바디 F-VHH-4 변이체 (위 패널) 및 F-VHH-L66 변이체 (아래 패널)의 쿠마시 및 항-HIS 웨스턴 블롯 분석. 쿠마시 분석의 경우, 3종의 상이한 클론의 상청액은 각각의 나노바디 - 피키아 균주 조합에 대해 시험되었고, 웨스턴 블롯 분석의 경우, 1종의 대표적인 클론의 상청액이 분석되었다.
도 2: 기준 나노바디 PDB id: 3K74에서 N-연결 글리코실화 시퀀의 도입을 위해 선택된 10개의 특이적 부위 (X로 표시됨) (이 도면에서 번호매김은 aHo 번호매김 체계를 의미하고, 대체 (카밧 (Kabat)) 번호매김의 경우 도 9를 참조함).
도 3: 나노바디 GBP와 나노바디 3K74의 아미노산 정렬.
도 4: GBP 나노바디에 N-연결 글리코실화 서명의 도입을 위해 선택된 특이적 부위가 도시된다 (이 도면에서 번호매김은 aHo 번호매김 체계를 의미하고, 대체 (카밧) 번호매김의 경우 도 9 또는 11을 참조함). N-글리코실화 효율은 His-특이적 웨스턴 블롯 데이타 또는 질량 분석 데이타를 기반으로 추정하였다.
도 5: 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 야생형 (WT), GlycoSwitchM5 (GSM5), 및 GlycoDelete (GD) 균주에서 발현된, 나노바디 GBP 및 GBP-R86N 변이체 (AHo 번호매김)의 쿠마시 및 항-HIS 웨스턴 블롯.
도 6: 피키아 파스토리스 야생형 (WT) 및 GlycoSwitchM5 (GSM5)에서 발현된, GBP의 N-글리코태그 변이체의 쿠마시 및 항-HIS 웨스턴 블롯 (또는 동등한 표현인 His6-특이적 웨스턴 블롯). 샘플은 모의-처리되거나 또는 PNGaseF-분해하여 N-글리칸을 제거하였다.
도 7: 피키아 GlycoSwitchM5 (GSM5)에서 발현된, GBP의 9종의 '글리코변이체'의 쿠마시 및 항-HIS WB 분석. 샘플은 모의-처리되었거나 또는 PNGaseF-분해되어 N-글리칸을 제거하였다. 흰색 박스는 N-말단 (8개 아미노산) 또는 C-말단 (22개 아미노산) 글리코태그 아미노산 서열의 첨가로 인한 분자량의 증가를 표시한다.
도 8: 피키아 파스토리스 GlycoDelete (GD) 균주에서 생산된 나노바디 GBP-R86N의 ESI-QTOF MS 분석. N-글리코실화된 변이체는 13699 Da에서 검출된 한편, 비글리코실화된 분획은 13496 Da에서 검출된다.
도 9: 나노바디 Nb 41, F-VHH-4, 및 F-VHH-L66과 나노바디 GBP 및 3K74의 서열 정렬.
도 10: 피키아 파스토리스 야생형 (WT), GlycoSwitchM5 (GSM5), 및 GlycoDelete (GD)에서 발현된, Nb41 및 Nb41-K86N 변이체의 쿠마시 및 항-HIS WB 분석. 샘플은 모의-처리되었거나 또는 PNGaseF-분해되어 N-글리칸을 제거하였다.
도 11: 나노바디 GBP 글리코실화 부위의 개요.
도 12: GBP 글리코변이체의 용융 그래프. 피키아 파스토리스 GlycoSwitchM5 (GSM5) (Man5GlcNAc2 글리칸)에서 생산시키고 IMAC 및 SEC를 통해 정제하고, 포스페이트-완충 염수 (PBS, 위) 또는 HEPES-완충 염수 (HBS, 아래)에 용리시킨 나노바디. qPCR 기계에서 SYPRO 오렌지 염료를 사용한 열 이동 어세이.
도 13: GBP N-글리코실화 변이체 (GBP-P48N-K50T 제외)는 미변형된 GBP-WT와 유사한 특징으로 그들 항원 GFP에 결합한다. 나노바디는 피키아 파스토리스 GlycoSwitchM5 (GSM5, Man5GlcNAc2 글리칸)에서 생산하였고 IMAC 및 SEC를 통해 정제하였고, 포스페이트-완충 염수 (PBS) 또는 HEPES-완충 염수 (HBS)에 용리하였다. 생물층 간섭계 (BLI)는 스트렙타비딘 팁 상에 고정시킨 100 nM의 바이오틴화된 Avitag-GFP를 사용해 수행하였다. GBP 글리코변이체 (8 내지 0.125 nM)의 2배 연속 희석물에 대한 친화성은 96-웰 포맷으로 25℃에서 측정하였다. 친화성 매개변수의 요약은 위에 표시되어 있고, ForteBio Data Analysis 9.0 (오차 막대는 SEM을 의미함)으로 계산하였다.
도 14: RSV 특이적 VHH F-VHH-L66에 대한 중화 어세이. F-VHH-L66은 야생형 (wt) 피키아 파스토리스 및 GlycoSwitchM5 (GSM5) 및 Glycodelete (GD) 균주에서 생산하였다.
도 15: 영역 27-40 (위) 및 영역 83-88 (아래)에 글리코변이를 갖는 나노바디 GBP의 부분 서열 정렬.
도 16: N-글리칸은 사실상 나노바디 GBP 내 2개의 선택된 영역의 임의 위치에 도입될 수 있지만, 부위 점유는 가변적이다. GBP 글리코변이체는 피키아 파스토리스 GlycoSwitchM5 (GSM5)에서 발현시켰다. 모든 재조합 변이체의 상청액을 채취하였고, PNGaseF-처리하거나 또는 모의 처리하였고, 14-20% 농도구배 SDS-PAGE와 그 이후에 Bio-Rad TGX 염색제-무함유 검출 (위) 및 His-태그-특이적 웨스턴 블롯 분석 (아래)을 통해 N-글리코실화의 존재에 대해 어세이하였다. 야생형 GBP, 각 선택된 영역 내 글리코변이체 (영역 27-40 내 GBP-P30A-V31N-R33T 및 영역 83-88 내에 GBP-D84N-A85T) 및 인공 삽입부를 함유하는 글리코변이체 (GBP-33-39-긴삽입)의 상청액 샘플은 온전한 단백질 질량 분석법을 통해 분석하였다 (아래 우측). 뒤의 3개의 질량은 1216 Da으로 확인되고 Man5GlcNAc2 글리칸 변형은 하기에 개략적으로 표시된 바와 같이 존재한다. 정규화된 스펙트럼은 GBP-WT의 경우 2.27E3, GBP-D83N-A85T의 경우 4.29E3, GBP-P30T-V31N-R33T의 경우 7.64E2 및 GBP-33-39-긴삽입의 경우 2.14E3의 정규화된 길이 (NL)로 표시된다. S-S: 단일 디술피드 결합, pyroQ: N-말단 파이로글루타민 잔기, M5: Man5GlcNAc2 글리칸 변형.
도 17: 후속 옥심 결찰과 커플링되는, LacNAc-기반 페리오데이트 산화의 도식적 개요.
도 18: 후속 옥심 결찰과 커플링되는, 시알릴-LacNAc-기반 페리오데이트 산화의 도식적 개요.
도 19: 후속 옥심 결찰과 커플링되는, GAO-기반 LacNAc 산화의 도식적 개요.
도 20: 후속 옥심 결찰과 커플링되는, GAO-F2-기반 GlcNAc 산화의 도식적 개요.
도 21: GalNAc 의 아지드-변형된 형태 (GalNAz)와 단일 GlcNAc N-글리칸의 화학-효소 커플링 이후에 후속되는 아지드와 변형 알킨의 클릭 화학 반응에 대한 도식적 개요.
도 22: Sia 의 아지드-변형된 형태 (AzSia)와 LacNAc N-글리칸의 화학-효소 커플링 이후에 후속되는 아지드와 변형된 알킨의 클릭 화학 반응에 대한 도식적 개요.
도 23: 피키아 파스토리스 야생형 (NRRLY11430), GlycoSwitchM5, 및 GlycoDelete 균주에서 생산된 나노바디 F-VHH-4 변이체 (위 패널) 및 F-VHH-L66 변이체 (아래 패널)의 쿠마시 및 항-HIS 웨스턴 블롯 분석. 쿠마시 분석의 경우, 3종의 상이한 클론의 상청액은 각각의 나노바디 - 피키아 균주 조합에 대해 시험되었고, 웨스턴 블롯 분석의 경우, 1종의 대표적인 클론의 상청액이 분석되었다.
본 발명은 특정한 실시형태에 대해서 일정한 도면을 참조하여 설명될 것이지만 본 발명은 이에 의해서가 아닌 청구항에 의해서만 제한된다. 청구항의 임의의 참조 표시는 그 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 기술된 도면은 단지 도식적이며 비제한적이다. 도면에서, 일부 구성요소의 크기는 예시적인 목적을 위해서 과장될 수 있고 비율적으로 도시되지 않을 수 있다. 용어 "포함하는"이 본 설명 및 청구항에서 사용되는 경우에, 다른 구성요소 또는 단계를 배제하는 것이 아니다. 단수 명사에 대해 언급될 때 부정 관사 또는 정관사 예를 들어 "한" 또는 "하나", "그"가 사용되는 경우에, 이것은 그 밖의 것들이 특별히 명시되지 않으면 그 명사의 복수를 포함한다.
뿐만 아니라, 설명 및 청구항에서 용어 제1, 제2, 제3 등은 유사한 구성요소간 구별을 위해 사용되고 반드시 순차적이거나 또는 연대기적인 순서를 설명하기 위해 사용되는 것은 아니다. 이렇게 사용되는 용어는 적절한 상황 하에서 상호교환적일 수 있고 본 명세서에 기술된 본 발명의 실시형태는 본 명세서에 기술되거나 또는 예시된 것 이외의 다른 순서로 작업될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
하기의 용어 또는 정의는 오로지 본 발명의 이해를 돕기위해 제공된다. 본 명세서에서 특별히 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어는 그들이 본 발명의 분야의 당업자에게 그러한 바와 동일한 의미를 갖는다. 특히 종사자들은 기술 분야의 정의 및 용어에 대해 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (2012)] 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 114), John Wiley & Sons, New York (2016)]을 따른다. 본 명세서에 제공된 정의는 당업자가 이해하는 것보다 작은 범주를 갖는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드 서열"은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이의 유사체인, 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 뉴클레오티드 서열은 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 기지 또는 미지의 임의 기능을 수행할 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 비제한적인 예는 유전자, 유전자 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 단리된 DNA, 제어 영역, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 뉴클레오티드 서열은 선형일 수 있거나 또는 원형일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 코딩 및 넌코딩 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 또는 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩티드 골격을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있는, 임의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 의미한다. 폴리펩티드 서열은 하기 본 명세서에 표시된 바와 같이 1글자 (또는 단일 글자) 아미노산 코드 또는 3글자 아미노산 코드로 표시될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역글로불린 도메인"은 항체 사슬 (예컨대 예를 들어, 통상의 4-사슬 항체 또는 중쇄 항체의 사슬)의 구상형 영역, 또는 이러한 구상형 영역으로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드를 의미한다. 면역글로불린 도메인은 그들이 임의로는 보존된 디술파이드 결합에 의해 안정화되는, 2개 베타-시트로 배열된 약 7개의 역평행 베타-가닥의 2층 샌드위치로 구성된, 항체 분자에 특징적인 면역글로불린 폴드를 보유한다는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역글로불린 가변 도메인"은 각각 "프레임워크 영역 1" 또는 "FR1"; "프레임워크 영역 2" 또는 "FR2"; "프레임워크 영역 3" 또는 "FR3"; 및 "프레임워크 영역 4" 또는 "FR4"로서 하기 본 명세서 및 당분야에서 언급하는 4개의 "프레임워크 영역"으로 본질적으로 이루어진 면역글로불린 도메인을 의미하고, 이러한 프레임워크 영역은 각각 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1"; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2"; 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"이라고 하기 본 명세서 및 당분야에서 언급되는 3개 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이 개재된다. 따라서, 면역글로불린 가변 도메인의 일반 구조 또는 서열은 다음과 같이 표시될 수 있다: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. 항원-결합 부위를 보유하여 항원에 대한 항체에 특이성을 부여하는 것은 면역글로불린 가변 도메인(들)이다.
용어 "단일 가변 도메인"과 동등한 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인" ("ISVD"로 축약)은 항원 결합 부위가 존재하고, 단일 면역글로불린 도메인에 의해 형성되는 것인 분자로 정의된다. 이것은 면역글로불린 단일 가변 도메인을 "통상의" 면역글로불린 또는 그들 단편과 구별하는데, 2개 면역글로불린 도메인, 특히 2개 가변 도메인이 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성한다. 전형적으로, 통상의 면역글로불린에서, 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)은 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성한다. 이러한 경우에, VH 및 VL 둘 모두의 상보성 결정 영역 (CDR)은 항원 결합 부위에 기여하게 될 것이고, 다시 말해서, 총 6개 CDR이 항원 결합 부위 형성에 관여하게 될 것이다.
상기 정의의 관점에서, 통상의 4-사슬 항체 (예컨대, 당분야에 공지된 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자) 또는 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편 예컨대 디술파이드 연결된 Fv 또는 scFv 단편, 또는 이러한 통상의 4-사슬 항체로부터 유래된 디아바디 (모두 당분야에 공지됨)의 항원 결합 도메인은 이들 경우에서, 항원의 개별 에피토프와의 결합이 보통은 하나 (단일)의 면역글로불린 도메인에 의해 일어나지 않지만, 개별 항원의 에피토프에 공동으로 결합하는, (회합된) 면역글로불린 도메인들 예컨대 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍에 의해서, 즉 면역글로불린 도메인의 VH-VL 쌍에 의해서 일어나므로, 대개는 면역글로불린 단일 가변 도메인으로서 간주되지 않는다.
대조적으로, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 추가적인 면역글로불린 가변 도메인의 쌍형성없이 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 면역글로불린 단일 가변 도메인의 결합 부위는 단일 VH/VHH 또는 VL 도메인에 의해 형성된다. 그런 이유로, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 항원 결합 부위는 3개 이하의 CDR에 의해 형성된다.
이와 같이, 단일 가변 도메인은 단일 항원 결합 유닛 (즉, 단일 항원 결합 도메인이 기능적 항원 결합 유닛을 형성하기 위해 다른 가변 도메인과 상호작용할 필요가 없도록, 단일 가변 도메인으로 본질적으로 이루어지는 기능적 항원 결합 유닛)을 형성할 수 있는 한, 경쇄 가변 도메인 서열 (예를 들어, VL-서열) 또는 이의 적합한 단편; 또는 중쇄 가변 도메인 서열 (예를 들어, VH-서열 또는 VHH 서열) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인 서열 (예를 들어, VH-서열)이고; 보다 특히, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 통상의 4-사슬 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 서열 또는 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 서열일 수 있다.
예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 (단일) 도메인 항체 (또는 (단일) 도메인 항체로서 사용에 적합한 아미노산 서열), "dAb" 또는 dAb (또는 dAb로서 사용에 적합한 아미노산 서열) 또는 나노바디 (본 명세서에 정의된 바와 같고, 제한없이, VHH를 포함); 다른 단일 가변 도메인, 또는 이의 어느 하나의 임의의 적합한 단편일 수 있다.
특히, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 나노바디 (Nanobody)® (본 명세서에 정의된 바와 같음) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다. [주: Nanobody®, Nanobodies® 및 Nanoclone®은 Ablynx N.V.의 등록 상표임]. 나노바디의 일반 설명은, 하기 설명을 비롯하여, 예컨대, 예를 들어 WO 08/020079 (페이지 16)에 기술된 바와 같은, 본 명세서에서 인용된 종래 기술을 참조한다.
VHH, VHH 도메인, VHH 항체 단편, 및 VHH 항체로도 알려진 "VHH 도메인"은 본래 "중쇄 항체" (즉, "경쇄가 없는 항체"; Hamers-Casterman et al (1993) Nature 363: 446-448)의 항원 결합 면역글로불린 (가변) 도메인으로서 설명되었다. 용어 "VHH 도메인"은 이들 가변 도메인을 통상의 4-사슬 항체 (본 명세서에서 "VH 도메인" 또는 "VH 도메인"이라고 함)에 존재하는 중쇄 가변 도메인 및 통상의 4-사슬 항체 (본 명세서에서 "VL 도메인" 또는 "VL 도메인"이라고 함)에 존재하는 경쇄 가변 도메인과 구별하기 위해서 선택되었다. VHH 및 나노바디의 추가 설명의 경우, Muyldermans (Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001)의 리뷰 논문을 비롯하여, 일반 배경 기술에서 언급된 다음의 특허 출원들을 참조한다: Vrije Universiteit Brussel의 WO 94/04678, WO 95/04079 및 WO 96/34103; Unilever의 WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 및 WO 02/48193; Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)의 WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 및 WO 03/055527; Algonomics N.V. 및 Ablynx N.V.의 WO 03/050531; National Research Council of Canada의 WO 01/90190; Institute of Antibodies의 WO 03/025020 (= EP 1433793); Ablynx N.V.의 WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/079372, WO 06/122786, WO 06/122787 및 WO 06/122825, 및 Ablynx N.V.의 추가의 공개 특허 출원. 또한 이들 출원에 언급된 추가의 종래 기술, 및 특히 국제 공개 특허 출원 WO 06/040153의 페이지 41-43에 언급된 참조 문헌 목록을 참조하고, 이러한 목록 및 참조문헌은 참조로 본 명세서에 편입된다. 이들 참조 문헌에 기술된 바와 같이, 나노바디 (특히, VHH 서열 및 부분적으로 인간화 나노바디)는 하나 이상의 프레임워크 서열 내 하나 이상의 "홀마크 잔기"의 존재를 특징으로 할 수 있다. 나노바디의 인간화 및/또는 낙타화를 비롯하여, 나노바디 및 그들 조제물의 반감기를 증가시키기 위한 다른 변형, 부분 또는 단편, 유도체 또는 "나노바디 융합체", 다가 구성체 (링커 서열의 일부 비제한적인 예 포함) 및 상이한 변형을 포함하여, 나노바디에 대한 추가 설명은 WO 08/101985 및 WO 08/142164에서 확인할 수 있다. 나노바디의 추가적일 일반 설명을 위해서, 예컨대, 예를 들어 WO 08/020079 (페이지 16)에 기술된 바와 같은, 본 명세서에서 인용하는 종래 기술을 참조한다.
"Dabs", "도메인 항체 (Domain Antibodies)", 및 "dAbs"로서도 알려진 "도메인 항체 (Domain antibodies)" (용어 "Domain Antibodies" 및 "dAbs"는 GlaxoSmithKline group of companies의 상표로서 사용됨)는 예를 들어 EP 0368684, Ward 등 (Nature 341: 544-546, 1989), Holt 등 (Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003) 및 WO 03/002609를 비롯하여, 예를 들어 WO 04/068820, WO 06/030220, WO 06/003388 및 Domantis Ltd.의 공개된 다른 특허 출원에 기술되어 있다. 도메인 항체는 본질적으로 낙타과 이외의 포유동물, 특히 인간 4-사슬 항체의 VH 또는 VL 도메인에 상응한다. 단일 항원 결합 도메인으로서, 다시 말해서, 개별적으로, VL 또는 VH 도메인과의 쌍형성없이, 에피토프에 결합하기 위해서, 예를 들어, 인간 단일 VH 또는 VL 도메인 서열의 라이브러리를 사용함으로써, 이러한 항원 결합 특성에 대한 특이적 선별이 요구된다. 도메인 항체는 VHH 처럼, 대략 13 내지 대략 16 kDa의 분자량을 가지며, 완전한 인간 서열로부터 유래되면, 예를 들어 인간에서의 치료적 용도를 위해서 인간화를 필요로 하지 않는다.
단일 가변 도메인은 일정한 상어 종으로부터 유래될 수 있다는 것을 이해해야 한다 (예를 들어, "IgNAR 도메인"이라고 함, 예를 들어, WO 05/18629 참조).
따라서, 본 발명의 의미에서, 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인" 또는 "단일 가변 도메인"은 인간이외의 공급원, 바람직하게 낙타과, 바람직하게 낙타과 중쇄 항체로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다. 그들은 이전에 기술된 바와 같이 인간화될 수 있다. 게다가, 이 용어는 예를 들어 Davies 및 Riechmann (FEBS 339: 285-290, 1994; Biotechnol. 13: 475-479, 1995; Prot. Eng. 9: 531-537, 1996), 및 Riechmann 및 Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999)에 기술된 바와 같이, "낙타화"된 낙타과 이외의 공급원, 예를 들어 마우스 또는 인간으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다.
IVD의 아미노산 잔기의 번호매김의 경우에, 상이한 번호매김 체계가 적용될 수 있다. 예를 들어, 번호매김은 낙타과 유래의 VHH 도메인에 적용된 바와 같이, Honegger, A. 및 Plukthun, A. (J.Mol.Biol. 309, 2001)가 제공하는 모든 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)에 대한 AHo 번호매김 체계에 따라 수행될 수 있다. VHH 도메인에 대한 것과 유사한 방식으로 적용될 수 있는, VH 도메인의 아미노산 잔기를 번호매김하기 위한 대안적인 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, FR 및 CDR 서열의 기술은 [Riechmann, L. and Muyldermans, S., 231(1-2), J Immunol Methods. 1999]의 논문에서 낙타과 유래 VHH 도메인에 적용된 바와 같은 카밧 (Kabat) 번호매김 체계를 사용해 수행될 수 있다. CDR 영역의 결정은 또한 상이한 방법에 따라 수행될 수 있다. 카밧에 따른 CDR 결정에서, VHH의 FR1은 위치 1-30의 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 CDR1은 위치 31-35의 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 FR2는 위치 36-49의 아미노산을 포함하고, VHH의 CDR2는 위치 50-65의 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 FR3은 위치 66-94의 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 CDR3은 위치 95-102의 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 FR4는 위치 103-113의 아미노산 잔기를 포함한다. 실시예 섹션에서 사용되는 특이적 나노바디에 적용되는 2가지 상이한 번호매김 체계의 개요는 도 9 또는 11에 도시되어 있다. 그러나, 본 설명 및 청구항에서, 상기 기술된 바와 같은 AHo에 따른 번호매김은 다음과 같을 것이다.
VH 도메인 및 VHH 도메인에 대해 당분야에서 충분히 공지된 바와 같이 - 각각의 CDR 내에서 아미노산 잔기의 총 개수는 다양할 수 있고 카밧 번호매김 또는 AHo 번호매김으로 표시되는 아미노산 잔기의 총 개수와 상응하지 않을 수 있다는 것을 이해해야 한다 (즉, 카밧 번호매김 또는 AHo에 따른 하나 이상의 위치는 실제 서열에서 점유되어 있지 않을 수 있거나, 또는 실제 서열은 카밧 번호매김 또는 AHo 번호매김에 의해 허용되는 개수보다 더 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있음). 이것은 일반적으로, 카밧 또는 AHo에 따른 번호매김이 실제 서열에서 아미노산 잔기의 실제 번호매김에 상응할 수 있거나 또는 상응하지 않을 수 있다는 것을 의미한다. VH 도메인 및 VHH 도메인에서 아미노산 잔기의 총 개수는 110 내지 120개, 종종 112 내지 115개의 범위일 것이다. 그러나, 더 작고 더 긴 서열이 또한 본 명세서에 기술된 목적에 적합할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
면역글로불린 단일 가변 도메인 예컨대 도메인 항체 및 나노바디 (VHH 도메인 포함)는 인간화를 겪을 수 있다. 특히, 인간화 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 나노바디 (VHH 도메인 포함)는 일반적으로 이전 단락에서 정의된 바와 같지만, (본 명세서에 정의된 바와 같은) 인간화 치환이고/이거나 그에 상응하는 적어도 하나의 아미노산 잔기 (및 특히 적어도 하나의 프레임워크 잔기)가 존재하는 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있다. 잠재적으로 유용한 인간화 치환은 천연 발생 VHH 서열의 프레임워크 영역의 서열을 하나 이상의 밀접하게 관련된 인간 VH 서열의 상응하는 프레임워크 서열과 비교하여 확인할 수 있고, 그 이후에 이렇게 결정된 하나 이상의 잠재적으로 유용한 인간화 치환 (또는 이의 조합)을 (본 명세서에 더욱 기술된 바와 같이, 그 자체로 공지된 임의 방식으로) 상기 VHH 서열에 도입시킬 수 있고 최종 인간화 VHH 서열은 표적에 대한 친화성, 안정성, 용이성 및 발현도, 및/또는 다른 바람직한 특성에 대해 시험될 수 있다. 이러한 방식으로, 제한된 정도의 시행 착오를 통해서, 다른 적합한 인간화 치환 (또는 이의 적합한 조합)은 본 명세서의 개시 내용을 기반으로 당업자가 결정할 수 있다. 또한, 이전에 기술된 것을 기반으로, 면역글로불린 단일 가변 도메인(의 프레임워크 영역), 예컨대 나노바디 (VHH 도메인 포함)는 부분적으로 인간화될 수 있거나 또는 완전하게 인간화될 수 있다.
면역글로불린 단일 가변 도메인 예컨대 도메인 항체 및 나노바디 (VHH 도메인 및 인간화 VHH 도메인 포함)는 또한 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열에 하나 이상의 변경을 도입시켜 친화성 성숙화가 수행될 수 있고, 이러한 변경은 그 결과로 각각의 부모 분자와 비교하여, 이의 각 항원에 대한 최종 면역글로불린 단일 가변 도메인의 개선된 친화성을 야기시킨다. 본 발명의 친화성-성숙화된 면역글로불린 단일 가변 도메인 분자는 예를 들어 Marks 등 (Biotechnology 10:779-783, 1992), Barbas 등 (Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813, 1994), Shier 등 (Gene 169: 147-155, 1995), Yelton 등 (Immunol. 155: 1994-2004, 1995), Jackson 등 (J. Immunol. 154: 3310-9, 1995), Hawkins 등 (J. MoI. Biol. 226: 889 896, 1992), Johnson 및 Hawkins (Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press, 1996)에 기술된 바와 같이, 당분야에 공지된 방법으로 제조될 수 있다.
면역글로불린 단일 가변 도메인 예컨대 도메인 항체 또는 나노바디로부터 출발하여 폴리펩티드를 디자인/선택 및/또는 제조하는 방법은 또한 본 명세서에서 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인을 "포맷한다 (formatting)"고 하고; 폴리펩티드의 일부를 만드는 면역글로불린 단일 가변 도메인은 상기 폴리펩티드"의 포맷"이라고 하거나 또는 "포맷된" 것이라고 한다. 면역글로불린 단일 가변 도메인이 포맷될 수 있는 방법의 예 및 이러한 포맷의 예는 본 명세서의 개시 내용을 기반으로 당업자에게 분명할 것이고; 이러한 포맷된 면역글로불린 단일 가변 도메인은 본 발명의 추가 양상을 형성한다.
용어 "글리코실화 억셉터 부위"는 N-글리코실화 또는 O-글리코실화될 수 있는, IVD 내 위치를 의미한다. N-연결된 글리칸은 전형적으로 아스파라긴 (Asn)에 부착되는 한편, O-연결된 글리칸은 통상적으로 세린, 트레오닌, 티로신, 히드록시리신, 또는 히드록시프롤린 측쇄의 히드록실 산소에 연결된다.
"NXT", "NXS", "NXC" 또는 "NXV" 모티프는 공통 서열 Asn-Xaa-Thr/Ser 또는 Asn-Xaa-Cys/Val을 의미하고, 여기서 Xaa는 프롤린 이외의 임의 아미노산일 수 있다 ([Shrimal, S. and Gilmore, R., J Cell Sci. 126(23), 2013], [Sun, S. and Zhang, H., Anal. Chem. 87 (24), 2015]). 잠재적인 N-글리코실화 억셉터 부위는 공통 서열 Asn-Xaa-Thr/Ser 또는 Asn-Xaa-Cys/Val에 특이적이라는 것은 당분야에 충분히 공지되어 있다. Asn 및 Thr/Ser 사이의 프롤린의 존재가 비효율적인 N-글리코실화를 초래한다는 것은 당분야에서 확인되었다. 특정한 양상에서, 본 발명에 따라서 IVD 또는 ISVD의 N-연결된 글리코실화 억셉터 부위는 천연 또는 조작된 방향족 아미노산 잔기 예컨대 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 히스티딘 (H) 또는 트립토판 (W)과 같은 방향족 잔기에 의해 확장된다. 이러한 변형은 즉, [Price, J.L. et al., Biopolymers. 98(3), 2012] 및 [Murray, A.N. et al., Chem Biol. 22(8), 2015]에 기술되어 있다. 보다 특정한 실시형태에서, 방향족 잔기는 N-연결된 글리코실화 시퀀 (N-x-T / N-x-S) 내 아스파라긴 (N) 잔기에 대해 위치 -1 (F/Y/H/W - N-x-T/S), -2 (F/Y/H/W - x1 - N-x-T/S), 또는 -3 (F/Y/H/W - x2 - x1 - N-x-T/S)에 위치된다 ([Murray AN et al (2015) Chem. Biol. 22(8):1052-62] 및 [Price JL et al (2012) Biopolymers 98(3):195-211]). 이러한 변형은 N-글리코실화 억셉터 부위의 글리코실화 효율, 글리칸, 균질성, 및 당단백질 안정성을 증가시키는데 특히 유용하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발현 벡터"는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터, 예컨대 람다 파지, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스, AAV 또는 배큘로바이러스 벡터, 또는 인공 염색체 벡터 예컨대 박테리아 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC), 또는 P1 인공 염색체 (PAC)를 포함하여, 당업자에게 공지된 임의 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 일반적으로 바람직한 코딩 서열 및 특정한 숙주 유기체 (예를 들어, 고등 진핵생물, 하등 진핵생물, 원핵생물)에서 작동적으로 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적절한 프로모터 서열을 함유한다.
전형적으로, 벡터는 발현가능한 프로모터 또는 조절성 뉴클레오티드 서열이 mRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 DNA 영역과 작동적으로 연결되거나, 또는 회합되어서, 조절성 뉴클레오티드 서열이 회합된 뉴클레오티드 서열의 전사 또는 발현을 조절할 수 있게 되는 것인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 전형적으로, 벡터의 조절성 뉴클레오티드 서열 또는 프로모터는 자연계에서 존재하는 바와 같이 회합된 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결되지 않고, 그러한 이유로 작동적으로 연결된 DNA 영역의 코딩 서열에 이종성이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "작용적으로" 또는 "작동적으로" "연결된"은 프로모터 서열이 관심 유전자의 전사를 개시할 수 있도록 하는, 관심 유전자 또는 DNA 영역 및 발현가능한 프로모터 서열 사이의 기능적 연결을 의미하고, 진핵생물 세포에서 전사의 적당한 종결을 보장하기 위한 전사 종결 서열 및 관심 유전자 사이의 기능적 연결을 의미한다. "유도성 프로모터"는 외부 자극 예컨대, 제한없이, 온도, pH, 일정한 영양분, 특이적 세포 신호에 반응하여 스위치 '온' 또는 '오프' 할 수 있는 (그리하여 유전자 전사를 조절하는) 프로모터를 의미한다. 프로모터가 계속적으로 스위치 '온'되는 것, 즉 유전자 전사가 항상적으로 활성인 "항상성 프로모터"와 구별하는데 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 "글리칸"은 일반적으로 글리코시드로 연결된 모노사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드를 의미한다. 그러한 이유로, 당접합체, 예컨대 당단백질, 당지질, 또는 프로테오글리칸의 탄화수소 부분은 본 명세서에서 "글리칸"이라고 한다. 글리칸은 모노사카라이드 잔기의 동종중합체 또는 이종중합체일 수 있고, 선형일 수 있거나 또는 분지형일 수 있다. N-연결된 글리칸은 GalNAc, 갈락토스, 뉴라민산, N-아세틸글루코사민, 푸코스, 만노스, 및 본 명세서에 더욱 예시되어 있는 바와 같은, 다른 모노사카라이드로 구성될 수 있다.
진핵생물에서, O-연결된 글리칸은 골지체에서 펩티드 사슬의 세린 또는 트레오닌 잔기 상에서 한 번에 하나의 당으로 조립된다. N-연결된 글리칸과 달리, 기지의 공통 서열이 존재하지 않지만 세린 또는 트레오닌에 대해 -1 또는 +3의 프롤린 잔기의 위치가 O-연결된 글리코실화에 호의적이다.
본 출원에서 사용되는 "복합 N-글리칸"은 전형적으로 하나, 둘 이상 (예를 들어, 최대 6)의 외부 분지를 가지며, 가장 흔하게는 내부 코어 구조 Man3GlcNAc2에 연결된 것인 구조를 의미한다. 용어 "복합 N-글리칸"은 당업자에게 충분히 공지되어 있고 문헌에 정의되어 있다. 예를 들어, 복합 N-글리칸은 적어도 하나의 분지, 또는 적어도 2개의 교대식 GlcNAc, 및 임의로는 또한 다양한 올리고사카라이드에서 종결될 수 있지만 전형적으로 만노스 잔기와 함께 종결되지 않을 것인 갈락토스 (Gal) 잔기를 가질 수 있다. 명확함을 위해서 당단백질의 N-글리코실화 부위 상에 존재하는 이들 단일 GlcNAc, LacNAc, 시알릴-LacNAc 또는 아지드-변형된 형태 (따라서, 내부 코어 구조 Man3GlcNAc2 결여)는 복합 N-글리칸으로서 간주되지 않는다.
"과만노실 글리칸"은 9개를 초과하는 만노스 잔기를 포함하는 N-글리칸이다. 전형적으로 이러한 과만노실 글리칸은 하등 진핵생물 세포 예컨대 효모 세포, 특히 야생형 효모 세포 예컨대 야생형 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 생산된다. 효모 세포 예컨대 피키아 파스토리스에서 생산된 N-글리칸은 또한 만노스-6-포스페이트 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "고등 진핵생물 세포"는 단세포 유기체 유래의 세포가 아닌 진핵생물 세포를 의미한다. 달리 말해서, 고등 진핵생물 세포는 다세포 진핵생물 예컨대 인간 세포주 또는 다른 포유동물 세포주 (예를 들어, CHO 세포주) 유래 (또는 세포 배양의 경우에, 그로부터 유래되는) 세포이다. 전형적으로, 고등 진핵생물 세포는 진균 세포가 아닐 것이다. 특히, 이 용어는 일반적으로 포유동물 세포, 인간 세포주 및 곤충 세포주를 의미한다. 보다 특히, 이 용어는 척추동물 세포, 보다 더 특히 포유동물 세포 또는 인간 세포를 의미한다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 고등 진핵생물 세포는 전형적으로 세포 배양의 일부분 (예를 들어, 세포주, 예컨대 HEK 또는 CHO 세포주)일 것이지만, 이것이 항상 절대적으로 요구되는 것은 아니다 (예를 들어, 식물 세포의 경우에, 식물 자체가 재조합 단백질을 생산하는데 사용될 수 있음).
"하등 진핵생물 세포"란 사상 진균 세포 또는 효모 세포를 의미한다. 효모 세포는 사카로마이세스 (Saccharomyces) (예를 들어, 사카로마이세스 세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae)), 한세눌라 (Hansenula) (예를 들어, 한세눌라 폴리몰파 (Hansenula polymorpha)), 알술라 (Arxula) (예를 들어, 알술라 아데니니보란스 (Arxula adeninivorans)), 야로위아 (Yarrowia) (예를 들어, 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) (예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis)), 또는 이전에 명명된 구 명칭 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)로 더 잘 알려져 있고 역시 본 명세서에도 이 명칭으로 사용되는 코마가타엘라 파피 (Komagataella phaffii)(Kurtzman, C.P. (2009) J Ind Microbiol Biotechnol. 36(11))의 종으로부터 유래될 수 있다. 특별한 실시형태에 따라서, 하등 진핵생물 세포는 피키아 세포이고, 가장 특정한 실시형태에서는 피키아 파스토리스 세포이다. 특별한 실시형태에서 사상 진균 세포는 미셀리오프토라 써모필라 (Myceliopthora thermophila)(Dyadic 사를 통해 C1으로도 알려짐), 아스퍼질러스 (Aspergillus) 종 (예를 들어, 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 니거 (Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리자 (Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 자포니커스 (Aspergillus japonicus)), 푸사리움 (Fusarium) 종 (예를 들어, 푸사리움 베네나텀 (Fusarium venenatum)), 히포크레아 (Hypocrea) 및 트리코더마 (Trichoderma) 종 (예를 들어, 트리코더마 리이세이 (Trichoderma reesei)이다.
"원핵생물 세포"는 전형적으로 박테리아 세포와 같은 비병원성 원핵생물 예컨대 예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli), 락토코커스 (Lactococcus) 및 바실러스 (Bacillus) 종을 의미한다.
특정한 실시형태에 따라서, 본 발명의 세포는 글리코-조작된 세포이다. "글리코-조작된 세포"는 야생형 배경에서와 비교하여 변경된 N-글리칸 구조 및/또는 O-글리칸 구조를 갖는 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포를 의미한다. 전형적으로, 당단백질 상에서의 천연 발생 변형은 글리코실화 경로에 관여하는 효소의 유전자 조작에 의해 변형되어 왔다. 일반적으로, N-연결 글리코실화의 당 사슬은 3개 유형: 고-만노스 (전형적으로 효모), 복합 (전형적으로 포유동물) 및 하이브리드 유형 글리코실화로 분류될 수 있다. 이것외에, 다양한 O-글리칸 패턴이 존재하는데, 예를 들어 효모의 올리고만노실글리칸은 포유동물 세포의 뮤신-유형 O-글리코실화와 상이하다. 상이한 유형의 N-글리코실화 및 O-글리코실화는 모두 당업자에게 충분히 공지되어 있고 문헌에 정의되어 있다. 당분야에 공지되어 있고 바람직한 N-및/또는 O-글리코실화 패턴을 갖는 당단백질을 생산하는 진핵생물 세포의 확인 및 그의 조작을 위한 전략의 최적화에 대해 상당한 노력이 기울여지고 있다 (예, De Pourcq, K. et al., Appl Microbiol Biotechnol. 87(5), 2010). 이러한 글리코-조작된 발현 시스템의 비제한적인 일례는 국제 공개 특허 출원 WO2010015722에 기술되어 있고 엔도글루코사미니다제 및 표적 단백질 둘 모두를 발현하는 (고등 또는 하등) 진핵생물에 관한 것이며, 여기서 재조합 분비된 표적 단백질은 균일한 N-글리코실화 패턴 (특히 하나의 단일 GlcNAc 잔기 (하등 진핵생물의 경우) 또는 이의 변형 예컨대 갈락토스 (LacNAc) 또는 시알릴-LacNAc (포유동물 세포의 경우)를 갖는 GlcNAc를 특징으로 한다. 또한 글리코실화 패턴은 인간-유사이거나 또는 인간화 (즉, 복합 유형 당단백질)인 단백질 또는 당단백질을 발현하도록 유전자 변형된 세포를 포함한다. 이것은 불활성화된 내생성 글리코실화 효소를 갖고/갖거나 복합 글리코실화에 필요한 적어도 하나의 효소를 코딩하는 적어도 하나의 다른 외생성 핵산 서열을 포함하는 세포, 특히 하등 진핵생물 세포를 제공하여 획득될 수 있다. 불활성화될 수 있는 내생성 글리코실화 효소는 알파-1,6-만노실트랜스퍼라제 Och1p, Alg3p, Mnn1p 패밀리의 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제, 베타-1,2-만노실트랜스퍼라제를 포함한다. 복합 글리코실화에 필요한 효소는 제한없이 N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 I, N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 II, 만노시다제 II, 갈락토실트랜스퍼라제, 푸코실트랜스퍼라제 및 시알릴트랜스퍼라제, 및 도너 당 뉴클레오티드 합성 또는 수송에 관여하는 효소를 포함한다. 여기서 고려되는 여전히 다른 글리코-조작된 세포, 특히 효모 세포는 고만노스 구조 (고만노스-유형 글리칸)의 생산에 관여되는 적어도 하나의 효소가 발현되지 않는다는 점을 특징으로 한다. 고만노스 구조의 생산에 관여되는 효소는 전형적으로 만노실트랜스퍼라제이다. 특히, 알파-1,6-만노실트랜스퍼라제 Och1p, Alg3p, Mnn1p 패밀리의 알파-1,3-만노실트랜스퍼라제, 베타-1,2-만노실트랜스퍼라제가 발현되지 않을 수 있다. 따라서, 세포는 높은 수율로 특정한 N-글리칸 구조의 생산을 할 수 있는, 하나 이상의 효소 또는 효소 활성을 발현하도록 추가적으로 또는 대안적으로 조작될 수 있다. 이러한 효소는 예를 들어, 효소와 정상적으로는 회합되지 않는 신호 펩티드를 통해서, 효소가 최적 활성을 가지게 될 숙주 세포하 소기관을 표적으로 할 수 있다. 본 명세서에 기술된 효소 및 그들 활성은 당분야에 충분히 공지되어 있다는 것은 분명하다.
특히 본 명세서에서 본 발명에 따른 "글리코-조작된 세포"로서 고려되는 것은 WO2010015722 및 WO2015032899에 기술된 바와 같은 세포 (GlycoDelete 세포로서 본 명세서에서 더욱 명시되거나 또는 GlycoDelete 배경을 갖는 세포)이다. 간략하게, 이러한 세포는 글리코실화 불균질성을 감소시키도록 조작되고 적어도 엔도글루코사미니다제 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 표적 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다.
글리코실화의 불균질성은 N-연결 당을 비롯하여, 당단백질에 부착된 O-글리칸으로부터 기원하므로, 본 발명의 폴리펩티드로부터 이들 다양한 탄수화물 사슬을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 WO2017005925에 기술된 바와 같은 내생성 UDP-갈락토스 4-에피머라제 (GalE)의 발현 및/또는 활성이 결핍된 세포에서 엔도글루코사미니다제 효소를 발현시켜 획득될 수 있다. 후자의 출원에 기술된 세포는 또한 특히 본 발명에 따른 글리코-조작된 세포로서 고려되고 본 명세서에서 GlycoDoubleDelete 세포 또는 GlycoDoubleDelete 배경을 갖는 세포로서 더욱 기술된다.
본 명세서에서 "글리코-조작된 세포"로서 언급되는 것은 특히 인간 N-글리코실화 경로를 모방하도록 조작된 포유동물 이외의 세포이다 (즉, GlycoSwitch®, 또한 [Laukens, B. et al (2015) Methods Mol Biol. 1321] 및 [Jacobs, P.P. et al. (2009) Nat Protoc. 4(1)] 참조).
"IVD 접합체" 또는 "ISVD 접합체"는 본 명세서에서 또한 "접합 모이어티"로서 정의된, 특이적 모이어티와 커플링 (또는 당 분야에서 동등한 용어로서, 접합 또는 연결)된 본 발명의 IVD 또는 ISVD를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. IVD 접합체 또는 ISVD 접합체 간 커플링은 IVD 또는 ISVD에 존재하는 특별한 아미노산 (예를 들어, 리신, 시스테인)을 통해서 일어날 수 있다. 바람직하게, 커플링은 상기 IVD 또는 ISVD의 폴리펩티드 서열에 존재하는 도입된 글리칸 (예를 들어, 도입된 N-글리칸)을 통해서 발생된다. 글리칸-특이적 접합은 IVD 또는 ISVD 의 도입된 글리칸 부위에 존재하는 글리칸으로 수행될 수 있다. 특별한 경우에서 글리칸은 그들이 "접합 모이어티"에 커플링되기 전에 시험관내에서 더욱 변형될 수 있다 (예를 들어, 특이적 엑소글리코시다제 효소에 의해 정돈됨). 또한, 커플링은 또한 i) 상기 IVD 또는 ISVD에 존재하는 특별한 아미노산 및 접합 모이어티 간 조합으로서, 그리고 ii) 도입된 글리칸 및 접합 모이어티를 통한 커플링으로서 일어날 수 있다. 접합은 당분야에 기술된 임의 방법으로 수행될 수 있고 일부 비제한적인 예시적인 실시형태는 실시예 섹션에서 약술될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "접합 모이어티"는 특정한 생물학적 또는 특이적 기능적 활성을 갖는 작용제 (예를 들어, 단백질 (예를 들어, 제2 IVD 또는 ISVD), 뉴클레오티드 서열, 지질, (다른) 탄수화물, 중합체, 펩티드, 약물 모이어티 (예를 들어, 세포독성 약물), 추적자 및 검출제)를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 접합 모이어티를 포함하는 IVD 또는 ISVD 접합체는 본 발명의 미접합된 IVD 또는 ISVD 폴리펩티드와 비교하여 적어도 하나의 추가적인 기능 또는 특성을 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 및 접합 모이어티로서 세포독성 약물을 포함하는 IVD 또는 ISVD 접합체는 제2 기능으로서 (즉, IVD 또는 ISVD 폴리펩티드에 의해 부여되는 항원 결합이외에) 약물 세포독성을 갖는 결합 폴리펩티드의 형성을 일으킨다. 또 다른 예에서, 본 발명의 IVD 또는 ISVD 폴리펩티드와 제2 결합 폴리펩티드의 접합은 추가적인 결합 특성을 부여할 수 있다. 일정한 실시형태에서, 접합 모이어티가 유전적으로 코딩된 치료 또는 진단 단백질 또는 뉴클레오티드 서열인 경우에, 접합 모이어티는 당분야에 충분히 공지된 펩티드 합성 또는 재조합 DNA 방법을 통해서 합성될 수 있거나 또는 발현될 수 있다. 다른 양상에서, 접합 모이어티가 비유전적으로 코딩된 펩티드, 예를 들어 약물 모이어티인 경우에, 접합 모이어티는 인공적으로 합성될 수 있거나 또는 천연 공급원으로부터 정제될 수 있다.
본 발명은 특이적 영역, 특히 효율적인 글리코실화를 가능하게 하는 영역에 존재하는 글리코실화 억셉터 부위를 갖는 IVD 또는 ISVD를 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 것을 목적으로 하고, 이러한 글리코실화는 IVD 또는 ISVD의 결합 및 폴딩을 방해하지 않아서, 추가 용도, 예를 들어 IVD 또는 ISVD 접합체의 제조에 그들을 보다 더 다루기 쉽게 만든다.
본 발명은 폴리펩티드가 항체 모방체를 포함하는 것인 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공하고 여기서 상기 항체 모방체는 임의의 가능한 위치에 도입된 적어도 하나의 인공적으로 조작된 N-글리코실화 부위를 가지며, 상기 글리코실화 억셉터 부위의 글리코실화는 GlcNAc, LacNAc 및 시알릴-LacNAc로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 글리칸으로 이루어진다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 폴리펩티드가 항체 모방체를 포함하는 것인 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 상기 항체 모방체는 임의의 가능한 위치에 도입된 적어도 하나의 인공적으로 조작된 N-글리코실화 부위를 갖고 상기 글리코실화 억셉터 부위의 글리코실화는 GlcNAc, LacNAc 및 시알릴-LacNAc로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 글리칸으로 이루어진다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 폴리펩티드가 항체 모방체를 포함하는 것인 폴리펩티드를 포함하는 접합체를 제공하고, 여기서 상기 항체 모방체는 임의의 가능한 위치에 도입된 적어도 하나의 인공적으로 조작된 N-글리코실화 부위를 갖고 상기 글리코실화 억셉터 부위의 글리코실화는 GlcNAc, LacNAc 및 시알릴-LacNAc로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 글리칸 및 상기 글리칸에 커플링된 접합 모이어티로 이루어진다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체 모방체"는 항체처럼, 항원에 특이적으로 결합할 수 있지만, 항체와 구조적으로 관련되지 않은 인공 (폴리-)펩티드를 의미한다. 그들은 일반적으로 약 3 내지 20 kDa의 몰질량을 갖는 항체보다 상당히 더 작다. 항체 모방체의 비제한적인 예는 아브두린, 아드넥틴, 아피바디, 아필린, 아피머, 알파바디, 아피틴, 안티칼린, 아비머, DARPin, 피노머, 쿠니츠 도메인 펩티드, 모노바디, 단백질 A의 Z 도메인, 감마 B 결정질, 유비퀴틴, 시스타틴, 술폴로버스 악시도칼다리우스 (Sulfolobus acidocaldarius) 유래 Sac7D, 리포칼린, 막 수용체의 A 도메인, 앵키린 반복 모티브, Fyn의 SH3 도메인, 프로테아제 억제제의 쿠니츠 도메인, 피브로넥틴의 제10 III형 도메인, 3-헬릭스 또는 4-헬릭스 번들 단백질, 아르마딜로 반복 도메인, 류신-풍부 반복 도메인, PDZ 도메인, SUMO 또는 SUMO-유사 도메인, 면역글로불린-유사 도메인, 포스포티로신-결합 도메인, 플렉스트린 상동성 도메인, src 상동성 2 도메인 또는 합성 펩티드 리간드, 예를 들어 (무작위) 펩티드 라이브러리 유래의 것을 포함한다. 항원 결합 단백질의 다른 예는 또한 합성 결합 단백질, 보다 특히 또한 모노바디 (예를 들어, [Sha et al., 2017. Protein Science. 26:910-924] 참조)를 포함한다. 모노바디는 피브로넥틴 III형 도메인을 기반으로 구축된 합성 단백질이다. 수용체의 세포외 도메인, 키나제, 스테로이드 호르몬 수용체 및 모듈식 단백질 도메인을 포함한, 표적의 다양한 어레이에 대해 높은 친화성으로 결합하는 모노바디가 단리되었다 (Koide, 2012).
또 다른 실시형태에서 본 발명은 폴리펩티드가 이의 폴리펩티드 서열에서 임의의 가능한 위치에 도입된 적어도 하나의 인공적으로 조작된 N-글리코실화 부위를 갖고 상기 글리코실화 억셉터 부위의 글리코실화는 GlcNAc, LacNAc 및 시알릴-LacNAc로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 글리칸으로 이루어지는 것인 ISVD 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 폴리펩티드가 이의 서열에서 임의의 가능한 위치에 도입된 적어도 하나의 인공적으로 조작된 N-글리코실화 부위를 갖고 상기 글리코실화 억셉터 부위의 글리코실화는 GlcNAc, LacNAc 및 시알릴-LacNAc로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 글리칸 및 상기 글리칸에 커플링된 접합 모이어티로 이루어진 것인 ISVD 폴리펩티드를 포함하는 접합체를 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공하고, 여기서 상기 IVD는 IVD의 임의의 아미노산 83 내지 88 및/또는 임의의 아미노산 27 내지 40 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하는 글리코실화 억셉터 부위를 갖는다. 명확함을 위해서, IVD의 임의의 아미노산 83 내지 88 및/또는 임의의 아미노산 27 내지 40 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하는 글리코실화 억셉터 부위를 갖는 IVD는 또한 본 명세서에서 "본 발명의 IVD" 또는 "본 발명의 ISVD"라고 명명한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공하고, 여기서 상기 IVD는 IVD의 임의의 아미노산 83 내지 88 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하는 글리코실화 억셉터 부위를 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공하고, 여기서 상기 IVD는 IVD의 임의의 아미노산 27 내지 40 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하는 글리코실화 억셉터 부위를 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공하고, 여기서 상기 IVD는 IVD의 임의의 아미노산 83 내지 88 및 임의의 아미노산 27 내지 40 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하는 글리코실화 억셉터 부위를 갖는다.
상기 글리코실화 억셉터 부위는 N-연결 또는 O-연결 글리칸으로 (반드시 그런 것은 아니지만) 변형될 수 있다. 특히 본 명세서에서는 본 발명이 N-글리코실화에 제한되지 않는다는 것을 고려한다. 본 개시 내용은 N-글리코실화 및 O-글리코실화 둘 모두를 적용하기 위한 수단을 제공한다.
본 발명에 따른 실시형태에서, IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제공되고, 여기서 상기 IVD는 IVD의 임의의 아미노산 84 내지 88, 85 내지 88, 86 내지 88, 87 및 88, 83 내지 87, 84 내지 87, 85 내지 87, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 83 내지 86, 84 내지 86, 85 및 86, 83 내지 85, 84 및 85 또는 83 및 84 및/또는 임의의 아미노산 28 내지 40, 29 내지 40, 30 내지 40, 31 내지 40, 32 내지 40, 33 내지 40, 34 내지 40, 35 내지 40, 36 내지 40, 37 내지 40, 38 내지 40, 39 및 40, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및 40, 27 내지 39, 28 내지 39, 29 내지 39, 30 내지 39, 31 내지 39, 32 내지 39, 33 내지 39, 34 내지 39, 35 내지 39, 36 내지 39, 37 내지 39, 38 및 39, 27 내지 38, 28 내지 38, 29 내지 38, 30 내지 38, 31 내지 38, 32 내지 38, 33 내지 38, 34 내지 38, 35 내지 38, 36 내지 38, 37 및 38, 27 내지 37, 28 내지 37, 29 내지 37, 30 내지 37, 31 내지 37, 32 내지 37, 33 내지 37, 34 내지 37, 35 내지 37, 36 및 37, 27 내지 36, 28 내지 36, 29 내지 36, 30 내지 36, 31 내지 36, 32 내지 36, 33 내지 36, 34 내지 36, 35 내지 36, 27 내지 35, 28 내지 35, 29 내지 35, 30 내지 35, 31 내지 35, 32 내지 35, 33 내지 35, 34 및 35, 27 내지 34, 28 내지 34, 29 내지 34, 30 내지 34, 31 내지 34, 32 내지 34, 33 및 34, 27 내지 33, 28 내지 33, 29 내지 33, 30 내지 33, 31 내지 33, 32 및 33, 27 내지 32, 28 내지 32, 29 내지 32, 30 내지 32, 31 및 32, 27 내지 31, 28 내지 31, 29 내지 31, 30 및 31, 27 내지 30, 28 내지 30, 29 및 30, 27 내지 29, 28 및 29 또는 27 및 28 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하는 글리코실화 억셉터 부위를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 실시형태에서 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제공되고, 여기서 상기 IVD는 IVD의 아미노산 86 및/또는 아미노산 27 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하는 글리코실화 억셉터 부위를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 실시형태에서 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제공되고, 여기서 상기 IVD는 IVD의 아미노산 86 및 아미노산 27 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하는 글리코실화 억셉터 부위를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 실시형태에서 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제공되고, 여기서 상기 IVD는 IVD의 아미노산 86 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하는 글리코실화 억셉터 부위를 갖는다.
본 발명에 따른 또 다른 실시형태에서 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제공되고, 여기서 상기 IVD는 IVD의 아미노산 27 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하는 글리코실화 억셉터 부위를 갖는다.
바람직한 실시형태에서 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제공되고, 여기서 상기 IVD는 IVD의 임의의 아미노산 83 내지 88 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하는 글리코실화 억셉터 부위를 갖는다. 보다 특히, IVD의 글리코실화 억셉터 부위는 아미노산 84 내지 88, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 85 내지 88, 86 내지 88, 87 및 88, 83 내지 87, 84 내지 87, 85 내지 87, 86 및 87, 83 내지 86, 84 내지 86, 85 및 86, 83 내지 85, 84 및 85 또는 83 및 84 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재한다. 가장 특히, 상기 IVD의 글리코실화 억셉터 부위는 IVD의 아미노산 86 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재한다.
본 발명에 따른 다른 실시형태에 따라서 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제공되고, 여기서 상기 IVD는 IVD의 임의의 아미노산 27 내지 40 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하는 글리코실화 억셉터 부위를 갖는다. 보다 특히, 상기 IVD의 글리코실화 억셉터 부위는 IVD의 임의의 아미노산 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 28 내지 40, 29 내지 40, 30 내지 40, 31 내지 40, 32 내지 40, 33 내지 40, 34 내지 40, 35 내지 40, 36 내지 40, 37 내지 40, 38 내지 40, 39 및 40, 27 내지 39, 28 내지 39, 29 내지 39, 30 내지 39, 31 내지 39, 32 내지 39, 33 내지 39, 34 내지 39, 35 내지 39, 36 내지 39, 37 내지 39, 38 및 39, 27 내지 38, 28 내지 38, 29 내지 38, 30 내지 38, 31 내지 38, 32 내지 38, 33 내지 38, 34 내지 38, 35 내지 38, 36 내지 38, 37 및 38, 27 내지 37, 28 내지 37, 29 내지 37, 30 내지 37, 31 내지 37, 32 내지 37, 33 내지 37, 34 내지 37, 35 내지 37, 36 및 37, 27 내지 36, 28 내지 36, 29 내지 36, 30 내지 36, 31 내지 36, 32 내지 36, 33 내지 36, 34 내지 36, 35 내지 36, 27 내지 35, 28 내지 35, 29 내지 35, 30 내지 35, 31 내지 35, 32 내지 35, 33 내지 35, 34 및 35, 27 내지 34, 28 내지 34, 29 내지 34, 30 내지 34, 31 내지 34, 32 내지 34, 33 및 34, 27 내지 33, 28 내지 33, 29 내지 33, 30 내지 33, 31 내지 33, 32 및 33, 27 내지 32, 28 내지 32, 29 내지 32, 30 내지 32, 31 및 32, 27 내지 31, 28 내지 31, 29 내지 31, 30 및 31, 27 내지 30, 28 내지 30, 29 및 30, 27 내지 29, 28 및 29 또는 27 및 28 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재한다.
가장 특히, 상기 IVD의 글리코실화 억셉터 부위는 IVD의 아미노산 27 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재한다.
위치 83 내지 88 및/또는 27 내지 40의 옆에 IVD 내 추가적인 위치는 글리코실화되기 쉬운 것을 선택할 수 있다는 것은 본 명세서에 제시된 개시 내용을 기반으로 당업자에게 분명할 것이다.
그러므로, 본 발명에 따른 특정 실시형태에서, IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제공되고, 여기서 상기 IVD는 IVD의 임의의 아미노산 83 내지 88 및/또는 임의의 아미노산 27 내지 40에 존재하는 글리코실화 억셉터 부위를 갖고, 위치 예컨대 위치 14 및/또는 위치 48 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하는, IVD 내에 추가적인 글리코실화 억셉터 부위를 갖는다. 특정한 실시형태에 따라서, 본 발명의 IVD는 상기 IVD 내 모든 가능한 위치에서 IVD 내에 도입된 추가적인 글리코실화 억셉터 부위를 갖는다. 다른 특정한 실시형태에 따라서, 본 발명의 IVD는 위치 14 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하는 IVD 내 추가적인 글리코실화 억셉터 부위를 갖는다. 다른 특정한 실시형태에 따라서, 본 발명의 IVD는 위치 48 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하는 IVD 내 추가적인 글리코실화 억셉터 부위를 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 IVD는 특정한 실시형태에 따라서, 위치 16 및/또는 49 및/또는 139에 존재하는 추가적인 글리코실화 억셉터 부위를 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 IVD는 글리코실화 억셉터 부위, 특히 N-글리칸 억셉터 부위를 포함하는 여분의 말단 아미노 (N-)-말단 태그 및/또는 여분의 카르복시 말단 (C-) 태그를 갖는다.
따라서 본 발명의 범주는 본 발명의 IVD 내에 적어도 둘 또는 그 이상의 글리코실화 억셉터 부위의 동시 사용을 포함한다는 것은 분명하다. 본 출원을 기반으로, 당업자는 본 발명의 IVD에서 확인된 특별한 글리코실화 억셉터 부위 내 또는 그 옆에 추가적인 글리코실화 억셉터 부위를 선택하는 방법을 알게되고 추가적인 위치의 확인/또는 사용 및 그들의 조합은 역시 제시된 바와 같은 본 발명의 범주 내이다.
특별한 실시형태에서, 본 발명은 앞서 본 명세서에 기술된 IVD 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 제공한다.
다른 실시형태에 따라서, 상기 IVD의 글리코실화 억셉터 부위는 N-글리코실화될 수 있는 아스파라긴 잔기이다. 보다 특히, 상기 IVD는 NXT/NXS/NXC/NXV 모티프의 아스파라긴 잔기가 임의의 아미노산 83 내지 88 및/또는 임의의 아미노산 27 내지 40에 존재하도록 NXT, NXS, NXC 또는 NXV 모티프 (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의 아미노산일 수 있음)를 함유한다. 보다 더 특히, 상기 IVD는 NXT/NXS 모티프를 함유한다.
특정한 실시형태에 따라서, 본 발명은 앞서 기술된 바와 같은 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공하고, 여기서 상기 IVD는 면역글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD)이다.
특정한 실시형태에 따라서, 앞서 기술된 바와 같은 ISVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제공되고, 여기서 상기 ISVD는 중쇄 가변 도메인 서열이다. 보다 특정한 실시형태에 따라서, ISVD는 중쇄 항체, 바람직하게 낙타과 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 서열이다.
다른 특정한 실시형태에서, 앞서 기술된 바와 같은 ISVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제공되고, 여기서 상기 폴리펩티드는 상기 ISVD로 이루어진다.
역시 다른 실시형태에서 앞서 기술된 바와 같은 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
본 발명에서 용어 'ISVD를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는'은 ISVD가 다른 폴리펩티드 예컨대 반감기 연장 폴리펩티드 (예를 들어, 혈청 알부민에 대한 VHH), 제2 VHH (예컨대, 이특이성 또는 2가 IgG의 생성을 위함), 효소, 치료 단백질, Fc 도메인 예컨대 IgA Fc 도메인 또는 IgG Fc 도메인에 융합 (또는 커플링)될 수 있다는 것을 의미한다.
역시 다른 실시형태에서 본 발명은 본 발명에 따른 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 특정한 실시형태에서, 세포는 고등 진핵생물 세포, 예컨대 포유동물 세포 또는 식물 세포, 하등 진핵생물 세포, 예컨대 사상 진균 세포 또는 효모 세포, 또는 원핵생물 세포이다.
고등 진핵생물 세포는 임의의 고등 진핵생물 유기체의 것일 수 있지만, 특정한 실시형태에서, 포유동물 세포가 고려된다. 사용된 세포의 성질은 전형적으로 바람직한 글리코실화 특성 및/또는 본 명세서에 기술된 IVD 또는 ISD의 제조 용이성 및 비용에 따라 좌우될 것이다. 포유동물 세포는 예를 들어 면역원성에 대한 문제를 피하기 위해 사용될 수 있다. 단백질 생산을 위한 고등 진핵생물 세포주는 변형된 글리코실화 경로를 갖는 세포주를 포함하여, 당분야에 충분히 공지되어 있다. 후속 단리 및/또는 정제를 위해 단백질을 수확, 발현, 및 생산하는데 적합한 동물 또는 포유동물 숙주 세포의 비제한적인 예는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO), 예컨대 CHO-K1 (ATCC CCL-61), DG44 ([Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556]; 및 [Kolkekar et al., 1997, Biochemistry, 36:10901-10909]), CHO-K1 Tet-On 세포주 (Clontech), ECACC 85050302로 명명된 CHO (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO 클론 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO 클론 B (GEIMG, Genova, IT), ECACC 93061607로 명명된 CHO-K1/SF (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), ECACC 92052129로 명명된 RR-CHOK1 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), 디히드로폴레이트 리덕타제 음성 CHO 세포 (CHO/-DHFR, Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216), 및 dp12.CHO 세포 (U.S. Pat. No. 5,721,121); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포 (COS 세포, COS-7, ATCC CRL-1651); 인간 배아 신장 세포 (예를 들어, 293 세포, 또는 293T 세포, 또는 현탁 배양 성장용으로 서브클로닝된 293 세포, [Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL-10); 원숭이 신장 세포 (CV1, ATCC CCL-70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL-2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL-34); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL-75); 인간 간세포암 세포 (HEP-G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 세포 (MMT 060562, ATCC CCL-51); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL-1442); TRI 세포 (Mather, 1982, Annals NYAcad. Sci., 383:44-68); MCR 5 세포; FS4 세포를 포함한다. 특정한 실시형태에 따라서, 세포는 CHO 세포, HEK293 세포 또는 COS 세포로부터 선택되는 포유동물 세포이다. 추가의 특정한 실시형태에 따라서, 포유동물 세포는 CHO 세포 및 HEK293 세포로부터 선택된다.
다른 특정한 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 세포는 식물 세포이다. 전형적인 식물 세포는 담배, 토마토, 당근, 옥수수, 조류, 알팔파, 쌀, 대두, 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 탁서스 커스피다타 (Taxus cuspidata), 니코티아나 벤타미아나 (Nicotiana benthamiana), 및 카타란터스 로세우스 (Catharanthus roseus) 유래의 세포를 포함한다. 본 발명에 따른 IVD 또는 ISVD 폴리펩티드의 생산에 유용할 수 있는 여전히 추가의 식물 종은 [Weathers, P.J. et al., Appl Microbiol Biotechnol. 85(5), 2010]에 기술되어 있다.
보다 특정한 실시형태에서, 본 발명에 따른 세포는 하등 진핵생물 세포, 예컨대 사상 진균 세포 또는 효모 세포이다. 사상 진균 및 효모 세포의 특별한 예는 앞서 본 명세서에 약술되어 있다.
보다 특정한 실시형태에서, 본 발명에 따른 세포는 원핵생물 세포, 예컨대 이. 콜라이, 락토코커스 종 또는 바실러스 종이다.
보다 특정한 실시형태에서, 앞서 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 세포는 글리코-조작된 세포이다. 글리코-조작된 세포는 원치않는 N-글리코실화 및/또는 O-글리코실화를 제거할 수 있다. 용어 글리코-조작된 세포는 이전에 본 명세서에서 약술되었다. 글리코-조작된 세포는 또한 앞서 기술된 바와 같이 인간 글리코실화 경로를 모방하도록 조작된 비포유동물 세포일 수 있다.
특정한 실시형태에서, 앞서 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 IVD를 포함하는 폴리펩티드가 제공되고, 여기서 폴리펩티드는 글리칸 (또는 하나 초과의 글리칸)을 포함하고, 글리칸은 말단 GlcNAc, GalNAc, 갈락토스, 시알산, 글루코스, 글루코사민, 갈락토사민, 바실로사민 (예를 들어 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilus) 및 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni)에서 기술된 희귀 아미노 당 (2,4-디아세타미도-2,4,6-트리데옥시글루코스), 만노스 또는 만노스-6-P 당 또는 화학적으로 변형된 모노사카라이드 예컨대 GalNAz, 아지도-시알산 (AzSia), 또는 GlcNAz를 갖는다. 특별한 당류를 갖는 글리칸을 포함하는 IVD 폴리펩티드는 생체 내에서 만들어질 수 있다. 예를 들어, 전형적으로 고등 진핵생물 세포는 말단 시알산을 갖는 글리칸을 생성시키게 될 것이고, 효모 세포는 말단 만노스 또는 만노스-6P를 갖는 글리칸을 생성시키게 될 것이고, 일정 사상 진균은 말단 갈락토스를 갖는 글리칸을 생성시키게 될 것이고, 일정한 글리코조작된 효모 세포는 말단 GlcNAc (예를 들어, WO2010015722에 기술된 바와 같음)를 생산하고, 일정한 글리코조작된 고등 진핵생물 세포는 말단 GlcNAc, 갈락토스 및 시알산을 갖는 글리칸의 혼합물 (예를 들어, WO2010015722 및 WO2015032899에 기술된 바와 같음)을 생산하고, 다른 글리코조작된 고등 진핵생물 세포는 말단 GlcNAc를 갖는 글리칸 (WO2017005925 참조)을 생산하고, 일정한 돌연변이체 갈락토실트랜스퍼라제를 포함하는 진핵생물 세포는 효소적으로 GalNAc를 비환원 GlcNAc 당에 부착시킬 수 있고 (WO2004063344 참조), UDP-GalNAz (C2-치환된 아지도아세타미도-갈락토스 UDP-유도체)를 공급한 돌연변이체 갈락토실트랜스퍼라제를 포함하는 진핵생물 세포는 GalNAz를 글리칸의 말단 비환원 GlcNAc에 도입 (WO2007095506 및 WO2008029281 참조)시키게 될 것이다. 임의로는 특별한 당을 갖는 글리칸을 포함하는 IVD 폴리펩티드는 바람직한 말단 당이 수득될 때까지 글리칸의 생체내 조합 이후 시험관내 트리밍 (trimming)을 통해서 만들어질 수 있고, 예를 들어 WO2015057065 (Synaffix)를 참조한다.
또 다른 특정한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 IVD는 글리칸 (또는 하나 초과의 글리칸)을 포함하고, 여기서 글리칸은 GlcNAc, LacNAc, 시알릴-LacNAc, Man5GlcNAc2, Man8GlcNAc2, Man9GlcNAc2, 과-만노실화 글리칸, 만노스-6-포스페이트 글리칸, 복합 글리칸, 하이브리드 글리칸 및 화학적으로 변형된 글리칸 예컨대 GlcNAz, GlcNAc-GalNAz, 아지도-시알산-LacNAc로 이루어진 군으로부터 선택되는 글리칸으로 이루어진다.
또 다른 특정한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 IVD는 글리칸 (또는 하나를 초과하는 글리칸)을 포함하고 여기서 글리칸은 GlcNAc, LacNAc, 시알릴-LacNAc, Man5GlcNAc2, Man8GlcNAc2, Man9GlcNAc2, 과만노실 글리칸, 만노스-6-포스페이트 글리칸, 복합 글리칸, 하이브리드 글리칸 및 화학적으로 변형된 글리칸 예컨대 GlcNAz, GlcNAc-GalNAz, 아지도-시알산-LacNAc로 이루어진 군으로부터 선택되는 글리칸으로 이루어지고, 상기 폴리펩티드 내 특정한 위치 또는 위치들에서 하나 이상의 이들 글리칸의 존재는 샘플 중 동일한 폴리펩티드에 대해서 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%이다.
앞서 본 명세서에 기술된 다양한 숙주 세포는 본 발명에 의해 제공된 IVD 상에 존재하는 특별한 글리칸을 생산하는데 특히 유용할 수 있지만, 역시 조합된 생체 내 및 시험관 내 접근법은 바람직한 글리칸 구조를 수득하는 것이 가능하다는 것을 염두해두어야 한다. 실제로, 진핵생물 숙주에서 생산된 본 발명의 IVD 또는 ISVD를 정제할 수 있고, 글리칸 구조는 적합한 엔도글루코사미니다제 또는 엑소글리코시다제에 의해 트리밍될 수 있고 그 이후에 다양한 글리코실트랜스퍼라제 (예를 들어, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 폴리시알릴트랜스퍼라제 등)의 시험관 내 사용을 통해 재구축될 수 있다.
IVD-접합체
특정한 실시형태에서 본 발명은 IVD-접합체를 제공한다. 바람직한 실시형태에서 본 발명에 따른 IVD 또는 ISVD 폴리펩티드는 상기 IVD 또는 ISVD 폴리펩티드 상에 존재하는 글리칸 구조를 통해서 특별한 모이어티 (앞서 본 명세서에 정의된 바와 같은 접합 모이어티)에 커플링된다. 특별한 모이어티와 이러한 글리칸 특이적 커플링은 당분야에서 글리칸-특이적 접합이라고 한다. 특별한 말단 탄수화물을 갖는 글리칸 구조 또는 IVD 또는 ISVD 폴리펩티드 상에 존재하는 앞서 기술된 바와 같은 특별한 글리칸 구조가 특별한 모이어티와의 커플링을 위한 출발점으로서 사용된다.
접합에 사용될 수 있는 특별한 모이어티
본 발명의 IVD 또는 ISVD에 존재하는 글리칸 구조와의 커플링에 사용할 수 있는 다수의 접합 모이어티가 존재한다. 접합 모이어티는 예를 들어 반감기 연장 모이어티, 치료제, 검출 유닛, 표적화 모이어티 또는 심지어 제2 (동일하거나 또는 상이한) IVD 또는 ISVD 폴리펩티드를 포함한다. 서로 상이할 수 있는 하나 이상의 접합 모이어티는 본 발명의 IVD 또는 ISVD에 연결될 수 있다. 심지어 하나의 접합 모이어티는 하나를 초과하는 기능을 가질 수 있고, 다시 말해서, 반감기 연장 모이어티는 표적화 모이어티로서 동시에 유용할 수 있다.
i) 반감기 연장 모이어티
다양한 반감기 연장 모이어티가 본 명세서에서 고려된다. 제한없이 간략하게, [Kontermann, R.E., Expert Opin Biol Ther. 16(7), 2016] 또는 [van Witteloostuijn, S.B., ChemMedChem. 11(22), 2016]에 기술된 반감기 연장 전략을 참조한다. 특히, 공유 화학 변형에 의존하는 다양한 반감기 연장 기술이 개발되었다. 이들 방법은 PEG화, 비구조적 폴리펩티드-기반 PEG 모방체와의 융합체, 폴리시알릴화의 적용 (예를 들어, 폴리시알릴트랜스퍼라제 효소의 효소적 사용), 바이오틴-커플링, 폴리옥사졸린-커플링, 대형 폴리사카라이드와의 접합, 지질화, 알부민 또는 IgG의 Fc 도메인 또는 IgA의 Fc 도메인과의 융합, 및 자가-조립을 지정하는 바이오-직교성 모이어티에 의한 유도체화를 포함한다. 또 다른 반감기 연장 모이어티는 혈청 알부민에 대한 IVD (예컨대 VHH)이다.
ii) 치료적 모이어티
일정한 실시형태에서, 접합 모이어티는 즉, 항염증제, 항암제, 세포독성제, 항감염제 (예를 들어, 항진균제, 항박테리아제, 항기생충제, 항바이러스제 등), 및 마취 치료제를 포함한 다양한 치료제를 포함한다. 특별한 실시형태에서 접합 모이어티는 독성 약물로 전환되는 프로드러그로 전환될 수 있는 효소이다. 독성제 (예를 들어, 독소, 세포독성 약물, 방사성 핵종)는 또한 치료적 목적에 적합할 수 있고 암 요법에서 특히 유용하다. 그러한 이유로, IVD-접합체의 특별한 예는 항체-약물-접합체 (ADC)이다. 이론적으로, 치료 목적에 적합한 모든 작용제가 본 명세서에서 고려된다. 기술된 바와 같은 치료제는 전형적으로 소형 분자 또는 생물제이지만, 치료제는 또한 당업자에게 자명해야 하는 다른 기원의 것일 수 있고 본 발명은 그에 제한되어서는 안된다.
iii) 검출 모이어티
일정한 실시형태에서, 접합 모이어티는 검출 모이어티를 포함한다. 용어 "검출 모이어티" 또는 "검출가능한 표지"는 검출 목적에 사용할 수 있는 기능 또는 특성을 보유하는 임의 유닛, 발색단 유닛, 형광성 유닛, 인광성 유닛, 발광성 유닛, 흡광성 유닛, 방사능 유닛, 및 전이 금속 동위원소 질량 태그 유닛을 포함하는 군으로부터 선택되는 것들을 의미한다. 제한없이, 검출 모이어티는 당업자에게 명확해야 하므로 소형 또는 대형 분자일 수 있다.
적합한 형광성 유닛은 면역형광 기술 분야에서 공지된 것, 예를 들어 유세포측정 또는 형광 현미경이다. 본 발명의 이들 실시형태에서, 검출 유닛을 포함하는 접합체는 검출 유닛을 여기시키고 최종 발광 (광 발광)을 검출하여 검출된다. 이러한 실시형태에서, 검출 유닛은 바람직하게 형광성 유닛이다.
유용한 형광성 유닛은 단백질-기반, 예컨대 피코빌리단백질, 중합체, 예컨대 폴리플루오렌 소형 유기 분자 염료, 예컨대 플루오레세인과 같은 잔텐, 또는 로다민, 시아닌, 옥사진, 쿠마린, 아크리딘, 옥사디아졸, 피렌, 피로메텐, 또는 금속-유기 착체, 예컨대 Ru, Eu, Pt 착체일 수 있다. 단일 분자 독립체 이외에도, 형광성 단백질 또는 소형 유기 분자 염료의 클러스터를 비롯하여, 나노입자, 예컨대 퀀텀 도트, 업컨버팅 나노입자, 금 나노입자, 염색된 중합체 나노입자가 또한 형광성 유닛으로서 사용될 수 있다.
광발광성 검출 유닛의 다른 그룹은 여기 후에 빛이 시간 지연 방출되는 인광성 유닛이다. 인광성 유닛은 금속-유기 착체, 예컨대 Pd, Pt, Tb, Eu 착체, 또는 인광성 안료 예컨대 란탄 계열 원소 도핑 SrAl2O4가 도입된 나노입자를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 검출 유닛을 포함하는 접합체는 조사를 통한 사전 여기없이 검출된다. 이러한 실시형태에서, 검출 유닛은 방사성 표지일 수 있다. 그들은 비방사성 동위원소를 그들 방사성 대응부, 예컨대 트리튬, 32P, 35S 또는 14C으로 교환하거나, 또는 공유 결합된 표지, 예컨대 티로신에 결합되는 125I, 플루오로데옥시글루코스 내 18F, 또는 금속-유기 착체, 즉 99Tc-DTPA를 도입시키는 것에 의한 방사성동위원소 표지의 형태일 수 있다.
다른 실시형태에서, 검출 유닛은 화학발광을 야기할 수 있고, 즉 루미놀의 존재 하의 홀스래디쉬 퍼옥시다제 표지이다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 검출 유닛을 포함하는 접합체는 방사선 방출에 의해서이지만, UV, 가시광, 또는 NIR 조사의 흡수를 통해서 검출된다. 적합한 빛-흡수 검출 모이어티는 형광 방출없는 빛 흡수 염료, 예컨대 N-아릴 로다민, 아조 염료, 및 스틸벤과 같은 소형 유기 분자 소광제 염료이다.
다른 실시형태에서, 빛-흡수 검출 유닛은 광음향 신호를 발생시키는, 펄스된 레이저광에 의해 조사될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 검출 유닛을 포함하는 접합체는 전이 금속 동위원소의 질량 분광분석 검출에 의해 검출된다. 전이 금속 동위원소 질량 태그 표지는 공유적으로 결합된 금속-유기 착체 또는 나노입자 성분으로서 도입될 수 있다. 란탄계열 및 인접한 후기 전이 원소의 동위원소 태그는 당분야에 공지되어 있다.
iv) 표적화 모이어티
일정한 실시형태에서, 접합 모이어티는 표적화 모이어티를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "표적화 모이어티"는 표적 분자에 결합하는 접합 모이어티를 의미한다. 소형 분자 또는 생물제는 둘 모두가 표적화 모이어티로서 적용될 수 있다. 표적화 모이어티는 제한없이, 단백질, 뉴클레오티드 서열, 지질, 다른 탄수화물 (예를 들어, 특별한 글리칸), 및 이의 조합 (예를 들어, 당단백질, 당펩티드, 및 당지질)을 포함할 수 있다. 표적에 결합할 수 있는 임의의 모이어티는 본 발명에 따라서 표적화 모이어티로서 적용될 수 있다.
IVD-접합체에 유용한 링커
일정한 실시형태에서, IVD-접합체는 글리칸 및 표적화 모이어티 사이에 링커를 포함한다. 일정한 링커는 다른 것보다 더 유용하고 특별한 링커의 사용은 용도에 따라 좌우될 것이다. 예를 들어, 특히 지방족 알데히드로부터 유도된 옥심 및 히드라존은 물 또는 더 낮은 pH에서 시간 경과에 따라 적은 안정성을 보인다. 방향족으로 안정된 구조는 글리칸을 접합 모이어티에 안정하게 연결시키는데 더 유용할 수 있다. 이러한 안정화된 링커는 그들이 특히 접합 모이어티가 종양 세포의 사멸을 의도하는 독성 물질일 때, 접합 모이어티의 조기 방출로 인해 부정적 효과를 제한할 수 있으므로, 또한 본 출원의 범주 내이다. 특히 흥미로운 것은 비시클로[6.1.0]논-4-인 시약을 비롯하여 방향족으로 안정화된 트리아졸 링커 및 술파미드 링커이다. 접합체의 증가된 안정성은 또한 상기 접합체 내에 포함된 임의의 모이어티의 감소된 응집 경향에 의할 수 있다는 것은 통상의 기술적 지식에 속한다. 안정성이 증가된 IVD 접합체의 생산을 위해서, 독자는 WO2013036748, WO2014065661, WO2015057064 및 WO2016053107을 비롯하여 본 명세서에서 명확히 언급한, Synaffix B.V가 출원한 다른 특허 출원을 비배타적으로 참조한다.
일반적으로 당분야에 공지된 다양한 링커는 본 발명에 따라서 IVD 및 접합 모이어티를 연결시키는데 사용할 수 있다. 명백한 바와 같이, 절단성 및 비절단성 링커는 바람직한 방출 프로파일을 획득하는데 적용될 수 있다. 일반적으로, 링커 및 접합 화학의 최적 조합은 각각의 고유한 양상: IVD, 접합 모이어티, 및 치료하려는 질환의 프로파일을 상호연결시키도록 독특하게 재단되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 항체-약물 접합체 및 링커에 대한 리뷰는 예를 들어 [Jessica R. McCombs and Shawn C. Owen, AAPS J. 17(2), 2015] 및 [Lu, J. et al., Int J Mol Sci. 17(4), 2016]를 비롯하여, 암 및 감염성 질환의 치료를 위한 접합체에서 신규한 4차 암모늄 염 링커를 기술하는 [Pillow, T.H., Pharm Pat Anal. 6(1), 2017]의 최신 리뷰를 참조한다.
여전히 다른 적합한 스페이서 또는 링커는 당업자에게 분명할 것이고, 일반적으로 당분야의 임의 링커 또는 스페이서일 수 있다. 특별한 양상에서 링커 또는 스페이서는 약학 용도가 의도되는 용도에서 사용에 적합하다. 예를 들어, ISVD-접합체 또는 IVD-접합체의 모이어티 및 글리칸 사이의 링커는 일정한 양상에서 또한 적합한 아미노산 서열, 특히 1 내지 50개, 또는 보다 특히 1 내지 30개 아미노산 잔기의 아미노산 서열일 수 있다. 이러한 아미노산 서열의 일부 예는 Gly-Ser (GS) 링커, 예컨대 예를 들어 WO 99/42077에 기술된 바와 같은 (GS)n 또는 (GGGSS)n 또는 (GSS)n, 및 본 명세서에 언급된 Ablynx에 의한 출원에 기술된 바와 같은 (G4S)3, GS30, GS15, GS9 및 GS7 링커 (예를 들어, WO 06/040153 및 WO 06/122825)를 비롯하여, 힌지-유사 영역, 예컨대 천연 발생 중쇄 항체 또는 유사한 서열의 힌지 영역 (예컨대 WO 94/04678에 기술된 바와 같음)을 포함한다. 여전히 다른 적합한 링커는 일반적으로 유기 화합물 또는 중합체, 특히 약학 용도를 위한 폴리펩티드에서 사용에 적합한 것들을 포함한다. 예를 들어, 폴리(에틸렌글리콜) 모이어티는 항체 도메인을 연결시키는데 사용되었고, 예를 들어 WO 04/081026을 참조한다. 링크의 길이, 탄성도 및/또는 다른 특성은 제한없이 특이적 표적에 대한 친화성, 특이성 또는 화합성을 포함하여, 본 발명의 최종 IVD 적합체의 특성에 일부 영향을 가질 수 있다는 것은 본 발명의 범주 내에 포함된다. 본 명세서의 개시 내용을 기반으로, 당업자는 임의로는 일부 제한된 통상의 실험 이후에, 본 발명의 특별한 IVD 또는 ISVD에서 사용을 위한 최적 링커를 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 제1 및 제2 표적에 대한, 빌딩 블록을 포함하는 본 발명의 다가 ISVD에서, 링커의 길이 및 탄성은 바람직하게 이것이 각각의 빌딩 블록이 이의 동족 표적에 결합할 수 있게 한다. 역시, 본 명세서의 개시 내용을 기반으로, 당업자는 임의로는 일부 제한된 통상의 실험이후에, 본 발명의 특별한 IVD 또는 ISVD에서 사용을 위한 최적 링커를 결정할 수 있을 것이다. 마지막으로, 둘 이상의 링커가 본 발명의 IVD 또는 ISVD에서 사용될 때, 이러한 링커는 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 역시, 본 명세서의 개시 내용을 기반으로, 당업자는 임의로는 일부 제한적인 통상의 실험 이후에, 본 발명의 특별한 폴리펩티드에서 사용을 위한 최적 링커를 결정할 수 있을 것이다. 일정한 특정 실시형태에서, 더 높은 친수성 및 그에 따라 개선된 수용성을 갖는 IVD 접합체를 제공할 수 있는, 예를 들어 탄수화물을 포함하는 더 긴 링커를 갖는 IVD 접합체를 생산하는 것이 바람직하다. 따라서 또한 더 많은 탄수화물을 갖는 링커를 포함하는 IVD 접합체는 본 출원의 범주 내이다. 역시 PEG로 변형되거나 또는 PEG로 이루어진 링커는 IVD 접합체의 친수성 특성을 증가시키는데 유용할 수 있다.
역시 다른 실시형태에서 본 발명은 본 발명의 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 적합한 발현 숙주에 본 발명의 IVD를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 도입시키는 단계, 본 발명의 상기 IVD를 발현시키는 단계 및 단리시키는 단계를 포함한다. 적합한 조건은 본 발명에 따른 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 발현시키도록 선택되어야 한다.
용어 "적합한 세포"란, 임의로는 글리코-조작된 고등 진핵생물 세포, 예컨대 포유동물 세포 또는 식물 세포, 하등 진핵생물 세포, 예컨대 사상 진균 세포 또는 효모 세포가 상기에 설명된 바와 같이 고려된다.
특히 본 명세서는 본 발명에 따른 IVD 또는 IVSD를 포함하는 폴리펩티드의 제조를 고려하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 글리코실화되고 말단 GlcNAc, GalNAc, 갈락토스, 시알산, 글루코스, 글루코사민, 갈락토사민, 바실로사민, 만노스 또는 만노스-6-P 당 또는 화학적으로 변형된 모노사카라이드 예컨대 GalNAz, AzSia, 또는 GlcNAz를 갖는 하나 이상의 글리칸을 포함한다.
예를 들어, 폴리펩티드가 N-글리코실화되고, 말단 GlcNAc, 갈락토스 또는 시알산을 갖는 N-글리칸의 혼합물을 포함하는 것인, 본 발명의 IVD를 포함하는 폴리펩티드는 전형적으로 WO2010015722 및 WO2015032899에 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 고등 진핵생물 글리코-조작된 세포에서 발현을 통해 수득될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드가 N-글리코실화되고 말단 GlcNAc를 갖는 N-글리칸을 포함하거나 또는 본질적으로 포함하는 것인, 본 발명의 IVD를 포함하는 폴리펩티드는 WO2010015722에 기술된 바와 같이 하등 진핵생물 세포에서 생산될 수 있다. 예를 들어, 말단 GlcNAc를 갖는 N-글리칸은 WO2017005925에 기술된 바와 같이 내생성 UDP-갈락토스 4-에피머라제 (GalE)의 발현 및/또는 활성이 결핍된 글리코-조작된 세포에서 생산될 수 있다.
본 명세서는 특히 본 발명에 따른 IVD를 포함하는 폴리펩티드의 제조를 고려하고, 여기서 상기 폴리펩티드의 글리코실화는 GlcNAc, LacNAc, 시알릴-LacNAc, Man5GlcNAc2, Man8GlcNAc2, Man9GlcNAc2, 복합 글리칸, 하이브리드 글리칸 및 GlcNAc-GalNAz로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 글리칸으로 이루어진다. 보다 더 특히 본 명세서는 본 발명에 따른 IVD를 포함하는 폴리펩티드의 제조를 고려하고, 여기서 상기 폴리펩티드의 글리코실화는 GlcNAc, LacNAc, 시알릴-LacNAc, Man5GlcNAc2, Man8GlcNAc2, Man9GlcNAc2 및 복합 글리칸으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 글리칸으로 이루어진다.
폴리펩티드는 글리코실화되고, 글리코실화는 GlcNAc, LacNAc 및 시알릴-LacNAc 글리칸로 이루어진 것인 본 발명의 IVD를 포함하는 폴리펩티드는 전형적으로 WO2010015722 및 WO2015032899에 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 글리코-조작된 포유동물 세포에서 수득되지만, 이러한 GlcNAc, LacNAc 및 시알릴-LacNAc 글리칸은 또한 (예를 들어, 효모에서 포유동물 복합 글리코실화 경로의 도입을 통해서) 하등 진핵생물 세포에서 조작될 수 있다. 폴리펩티드는 글리코실화되고 글리코실화는 GlcNAc로 이루어진 것인, 본 발명의 IVD를 포함하는 폴리펩티드는 WO2017005925에 기술된 바와 같이 내생성 UDP-갈락토스 4-에피머라제 (GalE)의 발현 및/또는 활성이 결핍될 수 있는 본 발명에 따른 글리코-조작된 세포에서 생산될 수 있다. 폴리펩티드는 글리코실화되고 글리코실화는 복합 글리칸으로 이루어진 것인 본 발명의 IVD를 포함하는 폴리펩티드는 임의로는 글리코-조작된 본 발명에 따른 고등 진핵생물 세포에서 생산될 수 있다. 폴리펩티드는 글리코실화되고 글리코실화는 Man5GlcNAc2 글리칸, Man8GlcNAc2 글리칸, Man9GlcNAc2 글리칸, 과만노실화된 글리칸, 만노스-6-포스페이트 변형된 글리칸 및 복합 글리칸으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 글리칸으로 이루어지는 것인, 본 발명의 IVD를 포함하는 폴리펩티드는 본 발명에 따른 글리코-조작된 세포, 특히 효모 세포에서 생산될 수 있다.
IVD에 특별한 모이어티를 연결시키는 커플링 방법
역시 다른 실시형태에서 본 발명은 본 발명의 IVD 또는 ISVD 접합체를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 일반적으로, 이러한 방법은 적합한 선택 세포에서 본 발명에 따른 IVD를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 도입시키는 단계 이후, 얼마 동안 IVD 폴리펩티드를 발현시키는 단계, IVD 폴리펩티드를 정제하는 단계, 및 특별한 접합 모이어티를 정제된 IVD 폴리펩티드에 연결시키는 단계에 의해 시작된다. 커플링 방법 자체는 일반적으로 시험관 내에서 수행된다.
특별한 접합 모이어티를 본 발명의 IVD 폴리펩티드에 연결시키기 위한 몇몇 가능성이 당분야에 존재한다. 일반적으로 커플링 방법을 수행하기 위한 화학, 효소 및 조합된 화학-효소 접합 전략이 존재한다.
특정한 실시형태에 따라서, IVD-접합체를 제조하기 위한 상기 방법은
- 본 발명의 IVD를 포함하는 폴리펩티드의 글리칸에 존재하는 디올 또는 인접 디올을 산화시키는 단계,
- 수득된 유리 알데히드 기를 아미노옥시-함유 분자와 반응시키는 단계를 포함한다.
산화의 경우, 소듐 페리오데이트 또는 당분야에 공지된 몇몇 다른 비슷한 시약이 사용될 수 있다. 특별한 실시형태에서 산화시키려는 디올은 본 발명의 IVD 상에 존재하는 LacNAc 디사카라이드 또는 시알릴-LacNAc 트리사카라이드로부터 기원된다. 옥심은 통상적으로 LacNAc/시알릴-LacNAc 산화-옥심 결찰 화학으로서 기술된, 아미노옥시-함유 분자와 최종 자유 알데히드 기의 후속 반응에 의해 형성된다. 당분야에서 충분히 공지된 것은 파라-페닐렌디아민, 2-아미노페놀 또는 2-(아미노메틸)벤즈이미다졸과 같은 촉매의 사용이다. 옥심 및 히드라진 접합은 보다 복잡한 생물직교 변형 전략으로, 클릭-화학에 대한 유망한 대안이다. 환원성 아민화 조건 하에서, 알데히드 (예를 들어, 갈락토스 산화는 디알데히드를 발생시키고, 시알산 산화는 모노-알데히드를 발생시킴)는 안정한 옥사제핀 유도체를 야기시키는 아민과 반응할 수 있다.
다른 특정한 실시형태에 따라서, IVD-접합체를 제조하기 위한 상기 방법은 임의로는
- 본 발명의 IVD 상에 존재하는 말단 LacNAc N-글리칸의 Gal 잔기의 C6 히드록실 기를 산화시키는 단계,
- 유리 알데히드 기를 아미노옥시-함유 분자와 반응시키는 단계를 포함한다.
산화를 위해서, 효소 갈락토스 옥시다제 (GAO)가 사용될 수 있다. 상기 언급된 단계를 적용하면, 전형적으로 옥심 결합이, 임의로는 카탈라제의 존재 하에서 형성되고, 이 전부는 당분야에서 충분히 공지되어 있다.
옥심 및 히드라존의 안정성을 조정하거나 또는 특히 증가시키기 위해서, 이전에 기술된 바와 같은 링커의 사용이 특히 본 명세서에서 고려된다.
보다 특정한 실시형태에서, 접합 모이어티는 모노사카라이드 유도체를 통해서, IVD 상에 존재하는 글리칸, 특히 단일 GlcNAc 또는 LacNAc에 연결된다. 모노사카라이드 유도체는 글리코실트랜스퍼라제, 예컨대 β(1,4)-갈락토실트랜스퍼라제, β(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, 돌연변이 촉매성 도메인를 포함하는 β(1,4)-갈락토실트랜스퍼라제, 돌연변이 촉매성 도메인을 포함하는 β(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 또는 GalNAc 트랜스퍼라제의 존재 하에서 IVD 상에 존재하는 글리칸에 연결될 수 있다. 모노사카라이드는 아지도, 케토, 알키닐 또는 티올 기 또는 이의 전구체로부터 선택될 수 있는 1, 2, 3, 또는 4개 작용기를 포함할 수 있다. 작용기는 또한 할로겐, 술포닐옥시, 할로겐화 아세타미도, 머캅토아세타미도 또는 술포닐화 히드록시아세타미도 기로부터 선택될 수 있다. 상세한 프로토콜의 경우 독자는 WO2015057064 및 WO2015057065를 참조한다.
여전히 다른 특정한 실시형태에서, 접합 모이어티는 옥심-결합을 통해서 및/또는 말단 GlcNAc를 갖는 N-글리칸에 UDP-GalNAc의 아지드-변형된 형태의 접합을 통해서 글리칸에 연결된다. 보다 더 특정한 실시형태에서, 접합 모이어티는 변형된 갈락토실트랜스퍼라제를 사용하여 말단 GlcNAc를 갖는 N-글리칸에 UDP-GalNAc의 아지드-변형된 형태의 접합을 통해 글리칸에 연결된 후에 클릭-화학 기반 반응을 통해 관심 분자에 부착된다. 클릭-화학 기반 반응은 당업자에게 충분히 공지되어 있고 또한 본 명세서에 제공된 예들을 기반으로 분명하게 된다. 클릭-화학의 현행 접근법에 대한 리뷰 논문의 경우, 독자는 [Jain, N. et al. Pharm Res. 32(11), 2015], [Qasba, P.K. et al., Biotechnol Prog. 24(3), 2008] 또는 [Nwe, K. and Brechbiel, M.W., Cancer Biother Radiopharm. 24(3), 2009]를 참조한다.
앞서 기술된 바와 같은 IVD 접합체의 안정성을 조정하기 위한 링커의 사용이 본 명세서에서 특히 고려된다.
몇몇 특별한 방법이 하기 실시예 섹션에서 더욱 상세하게 명시된다.
본 발명의 IVD 및 IVD-접합체의 용도
특정한 실시형태에서, 본 발명의 IVD-접합체를 포함하는 폴리펩티드는 순환 반감기를 조정하기 위해서 또는 IVD 안정성을 증가시키기 위해서, 선택적 표적화를 위해서, IVD-접합체의 면역원성을 조정하기 위해서 또는 검출 목적을 위해서 사용된다.
역시 다른 실시형태에서 본 발명의 IVD-접합체는 약제로서 사용된다.
역시 다른 실시형태에서 본 발명의 IVD (임의 모이어티와 미접합)는 약제로서 사용된다.
역시 다른 실시형태에서 본 발명의 IVD (임의 모이어티와 미접합)는 사전 항체 결합을 방지하는데 사용된다.
역시 다른 실시형태에서 본 발명의 IVD (임의 모이어티와 비접합)는 면역원성을 감소시키는데 사용된다.
"순환 반감기를 조정하기 위해서"란 표현은 폴리펩티드 (예를 들어, IVD-접합체)의 반감기는 증가될 수 있거나 또는 감소될 수 있다는 것을 의미한다. 일부 용도의 경우에, 본 발명의 IVD를 포함하는 폴리펩티드 또는 본 발명의 IVD-접합체는 청구된 바와 같은 폴리펩티드 또는 IVD-접합체의 특별한 특성이 결여된 폴리펩티드 또는 접합체보다 더 짧은 기간 동안 혈류에 남아있는 것이 유용할 수 있다. 종종, 장기간의 반감기는, 많은 치료 분자가 신장 여과 한계치보다 작고 순환계로부터 신속하게 상실되어서 그들 치료 잠재성을 제한하므로 목표가 된다. 비제한적인 예로서, 상기 언급된 바와 같은 알부민 또는 다른 반감기 연장 모이어티는 이러한 분자의 순환 반감기를 증가시키기 위해서 당업자에게 공지된 다양한 방법에서 사용될 수 있다.
"선택적 표적화"란, 본 발명의 폴리펩티드 및 IVD-접합체는 관심 표적에 대해 독점적인 효과를 획득하는데 유용할 수 있다는 것을 의미한다. 이의 예는 정상 신체 세포와 상호작용하지 않고 암 세포의 선택적 표적화가 종종 실패하는 통상의 화학요법이다. 이의 결과로서 보다 적은 용량에 의한 손상된 치료 및 궁극적으로 저생존률을 야기하는 장기 손상을 포함한 심각한 부작용이 야기된다. 임의로는 표적화 모이어티를 포함하는, 본 발명의 폴리펩티드 및 IVD-접합체는 암 요법에 제한되지 않는 통상의 접근법의 단점을 극복하는데 유용할 수 있다.
면역원성을 조정하기 위한 본 발명의 폴리펩티드 및 접합체의 사용은 청구한 바와 같은 폴리펩티드 또는 IVD-접합체의 특별한 특성이 결합된 폴리펩티드 또는 IVD-접합체와 비교했을 때 획득될 수 있다. 예를 들어, 장기간 치료 동안, 면역원성이 낮은 것이 바람직하다. 특히 비제한적으로, 본 명세서에 기술된 바와 같은 글리칸은 면역원성을 변형시키기 위한 도구로서 이용될 수 있다. 당업자는 통상의 지식 및 본 명세서에 제공된 개시 내용을 기반으로 면역원성을 적용할 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리펩티드 및 접합체는 이미 존재하는 항체와의 결합을 방지하거나 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 효과는 ISVD 상의 글리칸에 대한 문헌에 기술되어 있다 (즉, WO2016150845 참조). 사전 항체 결합을 방지하기 위해 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 접합체의 사용은 본 개시 내용의 범주 내이고 또한 본 명세서에서 고려된다.
본 발명의 폴리펩티드 및 접합체는 특히 이전에 설명된 바와 같은 검출 유닛을 포함할 때, 검출 목적을 위해 제공된다. 특히, 본 발명의 폴리펩티드 및 접합체는 청구된 폴리펩티드 또는 접합체의 특별한 특성이 결여된 폴리펩티드 또는 접합체보다 검출 목적을 위해 보다 더 그러한 경향이 있다.
따라서, 특정한 실시형태에서 본 발명의 IVD-접합체는 또한 진단 목적을 위해 사용될 수 있다.
역시 다른 실시형태에서 본 발명은 본 발명의 IVD를 포함하는 키트를 제공한다.
역시 다른 실시형태에서 본 발명은 본 발명의 IVD-접합체를 포함하는 키트를 제공한다.
다른 실시형태에서, 약학 조성물은 앞서 기술된 바와 같은 IVD를 포함하는 폴리펩티드 또는 IVD-접합체를 포함하는 것이 제공된다.
그러므로, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 및 본 발명의 폴리펩티드, 뉴클레오티드 서열 및 IVD-접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체의 약학적 유효량이 포함되는 약학 조성물을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 바람직하게 담체로 인한 임의의 부작용이 활성 성분의 유리한 효과를 손상시키지 않도록 활성 성분의 유효한 활성과 일관된 농도로 환자에게 비교적 무독성이고 무해한 담체이다. 본 발명의 폴리펩티드, 뉴클레오티드 서열 및 접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체의 약학적 유효량은 바람직하게 치료되는 특정한 병태에 대해 결과를 일으키거나 또는 영향을 발휘하는 양이다. 본 발명의 폴리펩티드, 뉴클레오티드 서열 및 접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체는 즉시, 지연 및 정기 방출 조제물을 포함한, 임의의 유효한 통상의 제형을 사용하여 당분야에 충분히 공지된 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여될 수 있고, 당업자에게 통상적으로 공지된 임의의 것과 같은 임의의 적합한 경로를 통해서 투여될 수 있다. 요법의 경우, 본 발명의 약학 조성물은 표준 기술에 따라서 임의 환자에게 투여될 수 있다. 투여는 경구, 비경구, 국소, 비강, 안구, 척수내, 뇌실내, 설하, 직장, 질 등을 포함한 임의의 적절한 방식에 의할 수 있다. 투여 빈도 및 용량은 환자의 연령, 성별 및 상태, 다른 약물의 동시 투여, 금기 및 임상의 고려해야 하는 다른 매개변수에 따라 좌우될 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 저장을 위해 동결건조될 수 있고 사용전에 적합한 담체에 재구성될 수 있다.
동결건조 또는 액체로서 제조될 때, 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 안정화제가 본 발명의 약학 조성물에 첨가되는 것이 필요하다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 22th edition, Ed. Allen, Loyd V, Jr. (2012)). 담체, 부형제 및 안정화제의 용량 및 농도는 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 항산화제 예컨대 비타민 C, 소형 폴리펩티드, 단백질 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 PVP, 아미노산 예컨대 아미노 아세테이트, 글루타메이트, 아스파라긴, 아르기닌, 리신; 글리코스, 디사카라이드, 및 다른 탄수화물 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린, 킬레이트화제 예컨대 EDTA, 당알콜 예컨대 만니톨, 솔비톨; 반대이온 예컨대 Na+, 및/또는 계면활성제 예컨대 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 PEG 등을 포함하여, 대상체 (인간, 마우스 및 다른 포유동물)에 안전해야 한다.
본 발명의 약학 조성물을 함유하는 조제물은 주사 전에 멸균되어야 한다. 이러한 절차는 동결건조 및 재구성 이전 또는 이후에 멸균 여과막을 사용해 수행될 수 있다.
약학 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트가 구비된 용기, 예컨대 코르크가 구비된 i.v. 용액병에 충전된다. 코르크는 피하주사 바늘이 침투할 수 있다.
특정한 실시형태, 특별한 입체구성을 비롯하여 재료 및/또는 분자가 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열, 세포, 폴리펩티드, 접합체 및 방법에 대해 본 명세서에서 기술되었지만, 형태 및 상세사항의 다양한 변화 또는 변형이 본 발명의 범주 및 사조를 벗어나지 않고 만들어질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 하기 실시예는 특정한 실시형태를 더욱 잘 예시하기 위해서 제공되고, 그들은 본 출원을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본 출원은 오직 청구항에 의해서만 제한된다.
실시예 1: N-글리칸을 도입시키는 합리적인 디자인 접근법으로서 ISVD 구조의 결정학적 데이타의 사용
본 실시예에서 우리는 인공 N-글리코실화 부위의 도입에 적합한 구조 내 영역을 확인하기 위해서 대표적인 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드의 입수가능한 결정학적 구조 (RCSB 단백질 데이타 뱅크 (Protein Data Bank), 또는 짧게: PDB 데이타 베이스로부터 분리된 등재 3K74의 사슬 B; 3K74는 2개 사슬, 다시 말해 A 사슬 (디히드로폴레이트 리덕타제) 및 B 사슬 (디히드로폴레이트 리덕타제에 결합하는 나노바디)를 함유하고; 본 명세서에서 또한 우리는 나노바디 (B-사슬)만을 명시하기 위해 3K74를 사용함)로부터 시작하였다. 이러한 3K74 ISVD 폴리펩티드는 [Oyen D. et al (2011) J.Mol.Biol. 407: 138-148]에 의해 처음 기술된 나노바디이고, 이의 2차 단백질 구조는 도 1에 개략적으로 도시된다.
우리의 합리적인 디자인 접근법에서, 우리는 N-글리칸의 도입을 위한 2차 구조 내 잠재적인 영역은 항체의 항원 인식 부위를 방해해서는 안되고 (또는 파괴해서는 안되고), 중요하게, 폴딩 동안 베타 시트의 형성을 방해해서는 안된다고 추론하였다. 나노바디의 CDR 영역이 항원 인식에 중요하고 베타-시트 구조가 올바른 폴딩에 중요하므로, 우리는 CDR 영역 및 베타 가닥 사이의 단백질 영역이 아마도 소수의 변형 예컨대 N-글리칸의 부착에 덜 민감할 것이라고 가정하였다.
실시예 2: N-글리코실화 서명의 도입을 위한 ISVD 내 9개 가정적 영역의 선택
실시예 1에 약술된 우리의 합리적인 디자인 접근법 및 특별한 기준을 기반으로, 우리는 대표적인 나노바디 3K74에 존재하는 총 9개 영역을 선택하였다 (도 1, 우측 패널 참조, 인공 N-글리칸 억셉터 부위의 도입을 위해 선택된 9개 영역은 검은색으로 표시됨). 베타-시트 구조적 구성요소에 존재하는 영역이외에, 우리는 SEQ ID NO: 1에 도시된 실제 나노바디 아미노산 서열에 N-말단 및 C-말단 글리코실화의 첨가를 계획하였다.
N-말단 및 C-말단 태그없는, 나노바디 3K74의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시되어 있다. SEQ ID NO: 1에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은 밑줄표시되어 있다.
SEQ ID NO: 2는 CDR1을 표시하고, SEQ ID NO: 3은 CDR2를 표시하고, SEQ ID NO: 4는 CDR3을 표시하고, SEQ ID NO: 5는 FR1을 표시하고, SEQ ID NO: 6은 FR2를 표시하고, SEQ ID NO: 7은 FR3을 표시하고 SEQ ID NO: 8은 FR4를 표시한다.
SEQ ID NO: 1 (115개 아미노산):
다시 실시예 1에 약술된 기준을 기반으로, 우리는 나노바디 3K74의 9개 선택 단백질 영역 내에서 특별한 아미노산 서열을 선택하였다 (나노바디 구조의 9개의 상이한 영역에 도입시키고자 하는 제안된 10개 N-글리칸 억셉터 부위를 도시하는, 도 2 참조).
실시예 3: GFP-결합 나노바디를 사용한 개념 증명
GFP-결합 나노바디 (GBP로 축약, [Kubala, M.H. et al (2010) Protein Sci. 19(12)]에 공개)는 실시예 1에 명시된 10개의 합리적으로 디자인하고 제안된 N-글리코실화 억셉터 부위의 도입을 위한 벤치마크 ISVD로서 선택되었다. 우리는 인공 N-말단 글리코-태그화된 변이체 (야생형 GBP에 QVQLVESGGA 대신에, QADDANATVQLVESGGA) 및 또한 C-말단 글리코-HIS-태그화된 변이체 (야생형 (HIS-태그됨) GBP에 VSSHHHHHH 대신에, VSSLQAAAAAANATVAAASGDVWDIHHHHHH)를 포함시켰다. 모든 GBP 변이체는 정제 및/또는 검출을 용이하게 하는 C-말단 히스티딘-태그 (6xHIS)를 장착하였다.
나노바디 GBP의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9로 표시된다. SEQ ID NO: 9에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은 밑줄표시된다.
SEQ ID NO: 10은 CDR1을 표시하고, SEQ ID NO: 11은 CDR2를 표시하고, SEQ ID NO: 12는 CDR3을 표시하고, SEQ ID NO: 13은 FR1을 표시하고, SEQ ID NO: 14는 FR2를 표시하고, SEQ ID NO: 15는 FR3을 표시하고, SEQ ID NO: 16은 FR4를 표시한다.
도 3은 실시예 1의 기준 나노바디 3K74와 GBP 나노바디의 아미노산 정렬을 도시한다. N-연결 글리코실화 서명은 3K74 기준 나노바디 결정 구조의 합리적인 분석을 통해 확인된 가정적 위치에서 GBP 단백질에 도입되었다. 나노바디 GBP의 N-글리칸 억셉터 부위를 수득하기 위해 도입된 특별한 돌연변이는 도 4에 도시되어 있다.
몇몇 키메라 유전자를 구축하였다: 도 4에 도시된 바와 같이 특별한 위치에 N-글리코실화 억셉터 부위가 도입된 상이한 돌연변이체 및 야생형 GBP 나노바디의 코딩 서열은 피키아 파스토리스의 AOX1 프로모터 (메탄올 유도성 프로모터)에 작동적으로 연결된다. 최종 발현 벡터는 3가지 상이한 피키아 파스토리스 균주: 야생형 (WT), GlycoSwitch M5 (GSM5) 및 GlycoDelete (GD)에 도입되었다. GlycoSwitch M5 균주는 이의 당단백질을 주로 Man5GlcNAc2 구조에 의해 변형시키는 한편 (Jacobs, P.P. et al., (2009) Nat Protoc. 4(1)), GlycoDelete 균주에서 발현되는 단백질은 단일 GlcNAc 잔기로 균질하게 변형된다 (예를 들어, [Claes, K. et al. (2016) ACS Synth Biol. 5(10)] 및 국제 공개 특허 출원 WO2010015722에 기술된 일반 GlycoDelete 기술 참조).
후속하여, 상이한 재조합 피키아 파스토리스 배양은 48시간 동안 28℃에서 단독 탄소원으로서 글리세롤을 함유하는 배지에서 먼저 성장시켰고, 이후에 재조합 단백질 발현은 글리세롤을 메탄올로 치환시켜 유도시켰다. 28℃에서 추가 48시간 이후에, 각각의 재조합 배양물의 성장 배지 (상청액)를 수집하였다. 배양 상청액은 이후에 엔도글리코시다제 PNGaseF (N-글리칸의 제거를 위함)를 처리하거나 또는 모의 처리하였고, 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE 및 His-태그-특이적 웨스턴 블롯을 통해서 어세이하였다. 이 분석의 결과는 도 5, 6 및 7에 도시되어 있다.
우리의 데이타는 N-글리코실화의 효율이 다양하지만 나노바디 GBP의 글리코실화는 거의 모든 이의 글리코변이체 (S73N-K75T 변이체 (aHo 번호매김) 제외)에 대해 수득될 수 있다는 것을 보여준다. 글리코실화 효율을 명시하는 개요는 표 1을 참조한다. 이것은 또한 도 4의 상부에 도시되어 있다 (글리코실화 효율에 대해 +++, + 및 -로 표시). 현저하게, 매우 효율적인 글리코실화를 야기시키는 4개의 특별한 위치가 나노바디 단백질 구조: 위치 14, 위치 27, 위치 48 및 위치 86에서 확인되었다. 또한 현저하게, 이들 위치 중 2개 (27 및 86)는 N-글리칸 부위의 도입에 대해서 나노바디의 경우에 전혀 기술된 적이 없었다. 위치 14 및 48은 WO2016150845에서 우연히 인용된다. 위치 14, 27, 48 및 86은 Aho 번호매김에 따른다.
특히 피키아 파스토리스 GlycoDelete 배경에서 생산된, D 및 E 가닥 사이 루프에서 변형된, 고도로 효율적인 글리코실화된 GBP-R86N 변이체 (aHo 번호매김)는표준 Ni2+ 친화성 크로마토그래피 및 겔 여과를 사용한 정제 이후에 상세하게 더욱 특징규명되었고, 이후에 ESI-QTOF 질량 분광기를 사용해 분석되었다. 결과는 도 8에 도시되어 있다.
나노바디 GBP-R86N은 주로 이의 글리코실화된 형태로 존재한다. 우리는 글리코변이가 매우 효율적인 글리코실화를 가능하게 한다는 것을 보여준다.
나노바디 기능이 유지되는지 여부를 검증하기 위해서, 우리는 위치 14, 27, 48 및 86에서 4개의 선택된 글리코실화 변이체 및 미변형된 GBP 나노바디의 열적 안정성 및 GFP 결합 친화성을 분석하였다. 선택된 글리코변이체는 피키아 파스토리스 Kai3 ([Vervecken, N. et al (2007) Modication of the N-glycosylation pathway to produce homogeneous, human-like glycans using GlycoSwitch plasmids, in: J.M. Cregg (Ed.), Pichia Protocols, Humana Press, New York, pp. 119-138] 참조)으로서, 재조합 단백질 상에 Man5GlcNAc2 유형 N-글리칸을 생성시키는 피키아 균주에서 재조합적으로 생산되었다. GBP-WT 및 이의 글리코변이체의 용융 그래프는 qPCR 기계에서 SYPRO 오렌지 염료를 사용한 열 이동 어세이에서 수득되었다 (Huynh K & Partch CL in Current Protocols in Protein Sciences 79, 2015). Man5GlcNAc2 type N-글리칸이 위치 14, 27 또는 48에 도입되면, 용융 그래프 형상은 변화된다: GBP-WT 및 글리코변이체 R86N에 대해 관찰된 2개의 변성 피크 대신에 오직 하나의 변성 피크를 보여준다 (도 12 참조). 그러나, 열 변성이 개시된 온도는 이동되지 않는다. 두드러지게, 우리는 나노바디 기능 (항원 결합)이 4개의 특이적 영역 내 N-글리칸의 존재에 의해 손상되지 않는다는 것을 관찰하였다: GFP 결합 친화성은 나노몰 이하 범위이다 (도 13 참조). Man5GlcNAc2 유형 N-글리칸이 위치 48에 존재할 때만, 대체로 감소된 결합 속도 (kon)에 기인하여, 항원 친화성이 약하게 감소된다 (해리 상수KD 는 증가됨) (도 13 참조).
실시예 4: 접근법의 일반화
우리가 이들 결과를 다른 나노바디에 외삽시킬 수 있는지를 평가하기 위해서, 우리는 몇몇 다른 나노바디에 N-연결-글리코실화 서명을 도입시켰다. 나노바디 Nb41 ([Claes, K. et al (2016) ACS Synth Biol. 5(10)]에서 NbCA4141로 표시)에서, 우리는 기준 나노바디 3K74의 K86N 및 GBP 나노바디의 R86N에 상응하는 부위에 N-글리코실화 시퀀을 도입시켰다. Nb41의 서열은 SEQ ID NO: 17로 도시되어 있다. SEQ ID NO: 18은 CDR1을 표시하고, SEQ ID NO: 19는 CDR2를 표시하고, SEQ ID NO: 20은 CDR3을 표시하고, SEQ ID NO: 21은 FR1을 표시하고, SEQ ID NO: 22는 FR2를 표시하고, SEQ ID NO: 23은 FR3를 표시하고 SEQ ID NO: 24는 FR4를 표시한다.
나노바디 F-VHH-4 및 F-VHH-L66 (Rossey, I. et al. (2017) Nat. Commun. 8, 14158)에서, 우리는 GBP의 G27N 및/또는 R86N에 상응하는 위치에 N-글리코실화 시퀀을 도입시켰고, 그리하여 1개 또는 2개의 N-연결 글리코실화 서명을 보유하는 나노바디를 수득하였다. F-VHH-4 및 F-VHH-L66의 서열은 각각 SEQ ID NO: 25 및 SEQ ID NO: 26으로 표시된다.
3개 CDR 영역은 밑줄표시되어 있다.
도 9는 나노바디 Nb41, F-VHH-4, 및 F-VHH-L66과 나노바디 GBP 및 3K74의 서열 정렬을 도시한다.
야생형 Nb41 (임의의 N-글리코실화 서명 없음)은 실시예 3에 약술된 것과 유사하게, 피키아 WT에서 재조합적으로 생산되었다. Nb41에서, K86N 돌연변이는 GBP-R86N 돌연변이와 동등하다. Nb41-K86N은 실시예 3에 약술된 것과 유사하게, 피키아 WT, 피키아 GSM5 및 피키아 GlycoDelete에서 재조합적으로 생산되었다. 발현의 유도 이후에, 모든 재조합 생성물의 상청액을 수집하였고, PNGaseF-처리 또는 모의 처리하였고, 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE 및/또는 His-태그-특이적 웨스턴 블롯 분석을 통해 어세이하였다. 데이타의 편집은 도 10에 도시되어 있다.
Nb41의 경우, 우리는 글리코실화가 (예상대로) WT 나노바디에 존재하지 않지만, 위치 86 (AHo 번호매김)에 글리코실화 서명의 도입은 효율적인 N-글리칸 변형을 가능하게 하였다는 것을 보여준다.
야생형 F-VHH-4 및 F-VHH-L66 (임의의 N-글리코실화 서명 없음)을 비롯하여, G27N 및/또는 K86N 돌연변이 (각각 GBP의 G27N 및 R86N에 상응; AHo 번호매김)를 보유하는 변이체는 실시예 3에 약술된 바와 유사하게 피키아 WT, 피키아 GSM5 (피키아 Kai3 균주와 동일명) 및 피키아 GlycoDelete에서 재조합적으로 생산되었다. 발현의 유도 이후에, 모든 재조합 생산물의 상청액을 수집하였고 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE 분석, 히스-태그-특이적 웨스턴 블롯 분석, 및 질량 분광 분석을 통해 어세이하였다. 쿠마시 블루 및 웨스턴 블롯 데이타는 도 23에 도시되어 있다.
F-VHH-4 및 F-VHH-L66의 경우, 우리는 글리코실화가 (예상대로) WT 나노바디에 존재하지 않는 한편, 위치 27 또는 86 (AHo 번호매김)에 글리코실화 서명의 도입이 효율적인 N-글리칸 변형을 가능하게 하였다는 것을 확인하였다. 동일한 골격 내 위치 27 및 위치 86에서 N-연결 글리코실화 서명의 동시 도입은 양쪽 부위에서 효율적인 N-글리칸 변형을 야기시켰다.
위치 27 및 86 (AHo 번호매김)에서 글리코실화 효율을 객관적으로 평가하기 위해서, 우리는 피키아 파스토리스 GlycoSwitchM5에서 생산된 VHH 글리코변이체의 His-태그-특이적 웨스턴 블롯 상에서 농도계 분석을 수행하였다. F-VHH-4-G27N의 부위 점유율은 96%로서 결정되었고 (도 23), F-VHH-4-R86N의 경우는 93% (도 23)였고, GBP-G27N-P30T의 경우 86% (도 7)였으며, GBP-R86N은 93% (도 5)였다. 위치 27 및 86에 N-글리코실화 부위를 갖는 모든 다른 나노바디 변이체의 경우에, 아래쪽 밴드 (비글리코실화 나노바디에 해당)는 형광도 획득이 위쪽의 밴드 (N-글리코실화 나노바디에 해당)의 과노출을 방지할 정도로 충분하게 낮게 설정되었다면 검출될 수 없었다. 이것은 적어도 80%의 N-글리코실화를 시사한다.
상이한 재조합 피키아 파스토리스 배경에서 GBP, Nb41, F-VHH-4, 및 F-VHH-L66 나노바디에 의해 수득된 글리코실화 효율의 편집은 표 1에 요약되어 있다 (또한 GBP 돌연변이체는 특히 도 11을 참조함).
표 1: N-글리코실화 나노바디 변이체의 개요. 피키아 균주: WT = 야생형, GSM5 = GlycoSwitchM5 (피키아 Kai3 균주의 대체명), GD = GlycoDelete. N-글리코실화 유형: HighMan = 고-만노스 N-글리코실화, Man5 = Man5GlcNAc2 및 GlcNAc = 단일 GlcNAc 잔기. * 피키아 GlycoDelete에서 생산된 나노바디 GBP-R86N의 경우, N-글리코실화는 ESI-QTOF 질량 분광법으로 검증 및 정량되었다. CB = 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 SDS-PAGE 분석. WB = His-태그-특이적 웨스턴 블롯 분석, MS = 질량 분광 분석.
상이한 피키아 배경 (WT, GSM5 (GS Man5로서 도 14에 표시됨), 및 GlycoDelete)에서 생산된, RSV-특이적 VHH인 F-VHH-L66 및 F-VHH-4는 RSV 중화 어세이에서 그들 중화 능력에 대해 어세이되었다. 간략하게, Vero 세포는 15,000 세포/웰의 밀도로 96웰 플레이트에 파종하였고 37℃에서 배양하였다. 다음 날, Optimem 중 정제된 VHH의 4-배 연속 희석물 (400 ng/mL에서 시작)은 동일한 부피의 RSV A2 (1,34 PFU/㎕)와 혼합하였고, 30분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 이후에, Vero 세포는 1회 Optimem으로 세척하였고, Optimem은 50 ㎕의 VHH-바이러스 혼합물로 교체하였다. 세포는 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 3시간 후에, 50 ㎕의 DMEM + 1.2% 아비셀 + 1% FCS를 세포에 첨가하였고, 세포를 37℃에서 3일 동안 더욱 인큐베이션시켰다. 마지막으로, 세포를 2% 파라포름알데히드로 고정시켰고 다클론 염소 항-RSV 항체로 염색하였으며, 플라크를 계측하였다. VHH F-VHH-L66에 대한 결과는 도 14에 도시되어 있다.
우리의 결과는 이들 VHH 내 글리코실화 부위의 도입이 VHH의 RSV와의 결합 및 중화를 차단하지 않는다는 것을 보여준다. 그럼에도 불구하고, 존재하는 글리칸(들)(의 유형)의 효과가 확인될 수 있다. 글리칸 크기는 VHH의 중화 능력과 반비례적으로 상호관련되는 것으로 나타나서, 유체역학 반경이 큰 글리칸은 보다 작은 글리칸보다 중화를 더 방해한다는 것을 시사한다 (WT 글리칸 > Man5 글리칸 > GlycoDelete 글리칸). 게다가, 이들 VHH의 경우에, 부위 27 (AHo 번호매김)의 글리칸은 부위 86 (AHo 번호매김)의 글리칸보다 약간 더 중화를 방해하는 것으로 보이고, 양쪽 부위에 글리칸의 존재는 가산적 효과를 갖는다.
따라서, 우리는 놀랍게도 VHH의 상이한 위치에 소형 GlycoDelete 유형 글리칸 (GlcNAc, LacNAc 및 시알릴-LacNAc)의 도입은 RSV 바이러스에 대한 VHH에서 확인된 본 명세서에서와 같은 VHH의 효율의 감소를 야기시키지 않는다고 결론내릴 수 있다.
우리는 효율적인 N-글리코실화를 가능하게 하는 ISVD (여기서 나노바디 상에 적용) 내 위치는 구조적 기준을 기반으로 합리적으로 선택될 수 있고, 이들 위치는 ISVD 내에서 보존되며, 우리의 개념을 상이한 나노바디에 적용할 수 있다고 결론내린다. ISVD의 기능에 영향없이 효율적인 N-글리칸 생산을 야기시키는 ISVD의 서열 내 특히 바람직한 위치는 2개 영역 83 내지 88 및 27 내지 40 (AHo 번호매김)이다.
실시예 5: ISVD 속에 효율적인 N-글리칸 도입을 위해 확인된 위치의 일반화
222개 VHH 코딩 사슬의 서열 (PDB 검색은 검색어 "VHH" 또는 nanobody로 수행되었고, 거대분자 명칭이 'nanobody', 'nb', 'nab', 'vhh' 또는 'cab'를 함유하거나, 또는 제공 종이 카멜러스 드로메다리우스 (Camelus dromedarius), 라마 그라마 (Lama glama) 또는 비쿠그나 파코스 (Vicugna pacos)이거나; 또는 보존된 아미노산 서열 'VQL'이 처음 40개 아미노산 잔기 내에 존재하는 것인 최종 PDB ID에 따라 하나의 사슬을 선택함)은 RCSB 단백질 데이타 뱅크 (짧게 PDB)에서 발췌하여 PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.3 Schrodinger, LLC.)을 사용해 정렬시켰다. 이들 VHH 각각에서, 아미노산 83 내지 88 (AHo)의 영역 및 아미노산 27 내지 40 (AHo)의 영역은 2차 구조의 베타 가닥을 연결하는 아미노산을 구성한다. 이후에 이들 보존된 링커 영역의 존재는 항체 가변 도메인 데이타베이스 (ABVDDB)에서 정렬된 VHH 코딩 서열의 거의 100% (1668 중 1667)에서 확인되었다. 특정 가설에 제한하지 않고 우리는 이들 선택 영역에서, 글리칸 치환체는 항원 인식이 최소로 방해되도록, 항원 결합 영역으로부터 멀리 돌출된다고 추론한다. 이들 2개의 보존된 영역 내에 위치된 위치에 도입된 글리코실화 억셉터 부위는 예상대로 모든 나노바디에서 효율적으로 N-글리코실화될 인공 N-글리칸 부위의 도입에 사용될 수 있다고 결론내린다.
다음 단계에서, 우리는 아미노산 83 내지 88 (AHo) 및 아미노산 27 내지 40 (AHo)의 모든 단일 위치에 N-x-T 시퀀을 도입시켜 GBP 나노바디 변이체를 코딩하는 다양한 발현 플라스미드를 생성시켜서, 각각의 변이체에서, N (Asn)이 시퀀에 존재하지만 상이한 위치 (예를 들어, 82, 83, 84, 85, 85 내지 86에 인공 삽입된 서열, 86, 87, 88, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 33 내지 39 사이에 인공 삽입된 서열, 39 또는 40)에 존재하게 된다 (도 15 참조). 특히 GBP 나노바디 아미노산 서열의 경우 AHo-번호매김 위치 28 및 34-38은 존재하지 않는다는 것을 주의한다. 모든 이들 나노바디 변이체는 상기 기술된 바와 같이 재조합 피키아 파스토리스 Kai3 균주에서 생산되었고, 위치 29 및 85의 아미노산이 아르기닌으로 돌연변이된 변이체 (F29N-P30A-V31T 및 A85N)는 피키아 파스토리스를 효율적으로 형질전환시키지 않아서 평가하지 않았다. 이후에, 모든 재조합 변이체의 상청액을 수집하였고, PNGaseF-처리 또는 모의 처리하였으며, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 SDS-PAGE 및/또는 His-태그-특이적 웨스턴 블롯 분석을 통해 N-글리코실화의 존재에 대해 어세이하였다 (도 16 참조). N-글리칸의 존재는 각각의 발현된 나노바디 변이체에서 확인할 수 있었지만, N-글리칸 첨가의 효율 (부위 점유율)은 N-글리코실화 시퀀 도입을 위해 선택되는 정확한 아미노산 위치에 강력하게 의존적이다 (표 2 참조). 존재하는 글리칸이 실제로 (GlcNAc)2Man5 이라는 것을 확인하기 위해서, 야생형 GBP, 각각의 선택된 영역 (영역 27-40의 GBP-P30A-V31N-R33T 및 영역 83-88의 GBP-D84N-A85T)의 글리코변이체 및 제1 영역에 인공 삽입부를 함유하는 글리코변이체 (GBP-33-39-긴삽입)의 상청액 샘플은 온전한 단백질 질량 분광법을 통해 분석하였다 (도 16, 우측 아래). 각각의 글리코변이체의 경우에, 1216 Da (GlcNAc)2Man5 변형의 존재를 의미하는 피크가 관찰되었다.
상기 결과들은 N-글리칸의 존재가 항원 인식 및 단백질 폴드에 영향을 미치지 않는 합리적으로 선택된, 보존된 영역에서 효율적으로 글리코실화될 수 있다는 것을 보여준다. 이들 데이타는 글리칸-매개된 표적화 및 부위-특이적 글리칸-기반 접합 전략을 위한 길을 마련한다.
표 2: 선택된 영역 내에서 N-글리코실화 GBP 변이체의 개요. 피키아 균주 GSM5 = GlycoSwitchM5. Man5 = Man5GlcNAc2. * 피키아 GlycoDelete에서 생산된 나노바디 GBP-R86N의 경우, N-글리코실화는 쿠마시 브릴리언트 블루 (CB)에 의한 SDS-PAGE 및 항-HIS 웨스턴 블롯 (WB) 검출에 의해 정량되었다. pKai61 벡터의 기원은 [Schoonooghe S et al (2009) BMC Biotechnol. 9, 70]에 기술되어 있다.
실시예 6: 글리칸-특이적 접합 방법의 개발
이전 실시예의 데이타는 ISVD (나노바디로 예시됨)는 글리칸의 존재가 항원 인식 및 단백질 폴드에 영향을 미치지 않는 합리적으로 선택되고, 보존된 영역에서 효율적으로 글리코실화될 수 있다는 것을 확실하게 보여준다. 이들 데이타는 ISVD의 글리칸-매개된 표적화 및 부위-특이적 글리칸-기반 접합 전략에 대한 길을 마련한다. 하기 실시예에서, 우리는 글리칸-특이적 적합 방법의 적용을 위해 인공적으로 조작된 N-글리코실화 부위 (실시예 3, 4, 및 5에 약술된 바와 같은)에 단순하고 균질한 N-연결된 글리칸을 갖는 나노바디를 사용한다. 실제로, GlcNAc 단독 및/또는 LacNAc 단독 및/또는 시알릴-LacNAc 단독을 포함하는 N-글리칸은 시험관내 접근법을 통해 수득될 수 있거나 또는 WO2010015722에 기술된 바와 같은 GlycoDelete 기술을 통해서 또는 WO2017005925에 기술된 GlycoDoubleDelete 기술을 통해서 생체 내에서 수득될 수 있다. 단순한 N-글리칸은 광범위하게 다양한 바람직한 모이어티, 예를 들어 PEG 사슬, 킬레이터, 독성 약물 등과의 커플링에 사용할 수 있는 단백질 상의 생물직교성 핸들을 제공한다. 상이한 글리칸-기반 접합 화학은 상업적으로 입수가능한 바이오틴화된 PEG를 사용해, 평가/최적화된다. 기본적으로 접합을 위해 2가지 광범위한 방법: 실시예 7에 예시된 바와 같은 화학 접합 및 실시예 8에 예시된 바와 같은 조합된 화학 및 효소 접합 방법이 존재한다.
실시예 7: 화학 접합 전략
이 실시예에서 우리는 위치 86 (Aho 번호매김)에 인공적으로 도입된 N-글리칸을 갖는 나노바디가 글리칸 상에서 PEG-바이오틴으로 어떻게 특이적으로 변형될 수 있는가를 보여준다. 나노바디는 갈락토실트랜스퍼라제를 과발현하는, HEK293 GlycoDelete 세포 (WO2010015722 참조), HEK293 GlycoDoubledelete 세포 (WO2017005925 참조), 피키아-GlycoDelete 세포, 또는 피키아-GlycoDelete 세포에서 먼저 재조합적으로 발현된다. 사용된 GlycoDelete 방법에 따라서, 나노바디는 GlcNAc, LacNAc 및 시알릴-LacNAc로 이루어진 군으로부터 선택디는 글리칸에 의해 변형된 것이 수득된다.
첫번째 접합 전략에 따라서, 글리칸 내 인접 디올(들)은 소듐 페리오데이트 (NaIO4)에 의해 산화된다. 이러한 화학의 초기 형태는 예를 들어 형광 표지된 항체를 생성시키기 위해서 수십년 동안 사용되어 왔다. GlycoDelete 기술을 통해서 수득된 글리코-조작된 나노바디는 페리오데이트 산화가 순수한 생성물을 산출시키는 글리칸을 보유한다 (야생형 글리칸의 상황과 대조적). LacNAc 유형 글리칸 (GlcNAc-Gal)은 산화될 수 있는 갈락토스 잔기 (C3 및 C4 고리 위치에)의 단일 인접 '시스' 디올을 함유한다. 시알릴-LacNAc 유형 글리칸은 갈락토스 잔기의 인접한 시스 디올이외에도, 페리오데이트 산화에 감수성인 말단 시알산 잔기의 글리세롤 측쇄 내에 인접 디올을 함유한다. 시알산의 인접 디올은 갈락토스보다 페리오데이트에 의해 훨씬 더 쉽게 산화되어서, 생성물 균질성을 여전히 보유하면서 시알산 산화에 호의적인 약한 산화 조건의 사용을 가능하게 한다. 글리칸 내에 존재하는 인접 디올의 페리오데이트 산화는 물에서 즉시 안정화되는, 옥심을 형성시키도록 아미노옥시-함유 분자와 쉽게 반응할 수 있는 유리 알데히드 기를 생성시킨다. 대안적으로, 유리 알데히드는 히드라진-함유 분자와 반응하여 안정한 히드라존 연결부를 형성할 수 있거나, 또는 그들은 환원적 아민화를 통해 아민-함유 분자에 연결될 수 있다. 이러한 방식으로 접합된 LacNAc 및 시알릴-LacNAc 글리칸은 리소솜 내 접합체 분해성 관점에서 호의적인, 단백질 아스파라긴에 직접적으로 연결된 온전한 GlcNAc 잔기를 보유한다. 후속 옥심 결찰과 커플링시킨, LacNAc- 및 시알릴-LacNAc-기반 페리오데이트 산화의 도식적 개요는 도 17 (LacNAc) 및 18 (시알릴-LacNAc)에 예시된다.
간략하게, R86N 돌연변이를 보유하는 GBP는 HEK293 GlycoDelete 세포에서 재조합적으로 생산되었고 정제되어서, 비글리코실화된 단백질 및 단일 LacNAc 또는 시알릴-LacNAc 사슬을 보유하는 단백질의 혼합물을 산출시킨다. 그 다음으로 정제된 단백질은 약한 페리오데이트 산화, 및 짧은 바이오틴화 및 아미노옥시-변형된 PEG 사슬과의 후속 옥심 결찰이 수행되었다. 질량 분광 분석은 PEG 사슬이 시알릴-LacNAc-보유 GBP에 선택적으로 연결된 것을 보여주었다.
실시예 8: 화학-효소 접합 전략
이러한 예에서, 대안적인 접합 전략이 적용된다. 글리칸의 페리오데이트 산화 대신에, 우리는 관심 나노바디 상의 인공적으로 도입된 LacNAc 글리칸 (실시예 7에서 수득된 바와 같음) 중 Gal 잔기의 C6 히드록실 기를 산화시키기 위해 효소 갈락토스 옥시다제 (GAO)를 사용한다. 이러한 효소적 산화는 또한 실시예 7에 기술된 바와 같이, 옥심 결찰, 히드라존 결찰 또는 환원적 아민화 (Park, A. et al., Endocrinology 154, 2013)를 통해서 관심 분자에 연결될 수 있는, 유리 알데히드 기를 생성시키다. 후속 옥심 결찰과 커플링되는, GAO-기반 LacNAc 산화의 도식적 개요는 도 19에 예시되어 있다. 유사한 접근법으로, 갈락토스 옥시다제의 돌연변이체 형태 (GAO-F2; [Rannes, J.B. et al.(2011), J. Am. Chem. Soc., 133, 8436-8439] 참조)는 GlcNAc의 C6 히드록실 기를 산화시키는데 사용될 수 있고; 그 다음으로 관심 카고는 GlcNAc 잔기에 직접적으로 연결될 수 있다. 후속 옥심 결찰과 커플링되는, GAO-F2-기반 GlcNAc 산화의 도식적 개요는 도 20에 예시되어 있다.
간략하게, R86N 돌연변이를 보유하는 GBP는 갈락토실트랜스퍼라제를 동시 발현하는 피키아 GlycoDelete 세포 또는 피키아 GlycoDelete 세포에서 재조합적으로 생산되었다. 단백질을 정제하여, 비글리코실화된 단백질 및 단일 GlcNAc 잔기를 보유하는 단백질의 혼합물 (피키아-GlycoDelete), 또는 비글리코실화된 단백질 및 GlcNAc 또는 LacNAc를 보유하는 단백질의 혼합물 (갈락토실트랜스퍼라제 공발현하는 피키아-GlycoDelete)을 산출하였다. 그 다음으로 갈락토실트랜스퍼라제 공발현의 피키아-GlycoDelete로부터 유래된 정제된 단백질은 원-포트 반응으로 GAO에 의해 산화시켰고 짧은 바이오틴화 및 아미노옥시-변형된 PEG 사슬에 연결시켰다. 질량 분광 분석은 PEG 사슬은 LacNAc-보유 GBP에 선택적으로 연결되었다는 것을 보여주었다. 피키아-GlycoDelete로부터 유래된 정제된 단백질은 원-포트 반응으로 GAO-F2에 의해 산화시키고 짧은 바이오틴화 및 아미노옥시-변형된 PEG 사슬에 연결시켰다. 질량 분광 분석은 PEG 사슬이 GlcNAc-보유 GBP에 선택적으로 연결되었다는 것을 보여주었다.
대안적인 화학-효소 전략에서, 우리는 Sia의 아지드-변형된 형태 (AzSia)를 LacNAc에 접합시키는데 효소 hST6Gal1 (Wu, Z.L., Carbohydrate Research 412, 2015)를 사용할 수 있거나, 또는 GalNAc의 아지드-변형된 형태 (GalNAz)를 우리의 관심 나노바디 상에 존재하는 단일 GlcNAc N-글리칸에 접합시키는데 인간 베타-1,4-갈락토실/GalNAc 트랜스퍼라제의 돌연변이된 형태 (van Geel, R., Bioconjug. Chem. 26, 2015)를 사용할 수 있다. 아지드 기능을 통해, 나노바디 상에 도입된 GalNAz/AzSia는 클릭 화학 (예를 들어, 구리-무함유 아지드-알킨 고리첨가 반응)을 적용하여 PEG 사슬 또는 다른 관심 분자로 균질하게 그리고 부위-특이적으로 작용화될 수 있다. 도식적 개요는 도 21 (GalNAz) 및 22 (AzSia)에 예시되어 있다.
아지드-변형된 GlcNAc, LacNAc, 및 시알릴-LacNAc 글리칸은 또한 아지드-변형된 모노사카라이드 전구체 (GlcNAz, GalNAz, AzSia)를 관심 단백질을 생산하는 GlycoDelete 세포에 공급하여 수득될 수 있고, 이것은 클릭 화학을 통한 후속 부위-특이적 작용화를 가능하게 한다.
간략하게, R86N 돌연변이를 보유하는 GBP는 갈락토실트랜스퍼라제를 공발현시키는 피키아 GlycoDelete 세포 또는 피키아 GlycoDelete 세포에서 재조합적으로 생산되었다. 단백질을 정제하여, 비글리코실화된 단백질 및 단일 GlcNAc 잔기를 보유하는 단백질의 혼합물 (피키아-GlycoDelete), 또는 비글리코실화된 단백질 및 GlcNAc 또는 LacNAc를 보유하는 단백질 (갈락토실트랜스퍼라제 공발현의 피키아-GlycoDelete)의 혼합물을 생성시켰다. 그 다음으로 갈락토실트랜스퍼라제 공발현의 피키아-GlycoDelete로부터 유래된 정제된 단백질은 CMP-아지도-시알산 및 재조합 hST6Gal1 효소와 인큐베이션시켜서 AzSia 잔기를 LacNAc 사슬에 첨가하였고, 그 다음으로 짧은 바이오틴화 및 DBCO-변형된 PEG 사슬과의 클릭 반응을 수행하였다. 질량 분광 분석은 PEG 사슬이 LacNAc-보유 GBP에 선택적으로 연결되었다는 것을 보여주었다. 피키아-GlycoDelete로부터 유래된 정제된 단백질은 UDP-GalNAz 및 인간 베타-1,4-갈락토실/GalNAc 트랜스퍼라제 효소의 돌연변이된 형태와 인큐베이션시켜서 GalNAz 잔기를 단일 GlcNAc 글리칸에 첨가시켰고, 그 다음으로 짧은 바이오틴화 및 DBCO-변형된 PEG 사슬과의 클릭 반응을 수행하였다. 질량 분광 분석은 PEG 사슬이 GlcNAc-보유 GBP에 선택적으로 연결되었다는 것을 보여주었다.
<110> VIB VZW
UNIVERSITEIT GENT
<120> GLYCOSYLATION OF IMMUNOGLOBULIN DOMAINS
<130> NC/NbGly/586
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<170> PatentIn version 3.5
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20 25 30
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Part of wildtype GBP
<400> 31
Val Ser Ser His His His His His His
1 5
Claims (20)
- 면역글로불린 가변 도메인 (IVD)을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, IVD는 다음의 식 (1): FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (1)에 따른 4개의 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 IVD는 IVD의 아미노산 범위 83 내지 88로부터 선택되는 아미노산 및/또는 IVD의 아미노산 범위 27 내지 40으로부터 선택되는 아미노산 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하는 글리코실화 억셉터 부위를 갖는 것인 뉴클레오티드 서열.
- 제1항에 있어서, 상기 IVD는 면역글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD)인 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 IVD의 글리코실화 억셉터 부위는 N-글리코실화될 수 있는 아스파라긴 잔기인 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
- 제3항에 있어서, IVD는 NXT/NXS/NXC/NXV 모티프의 아스파라긴 잔기가 IVD의 아미노산 범위 83 내지 88로부터 선택되는 아미노산 및/또는 IVD의 아미노산 범위 27 내지 40으로부터 선택되는 아미노산 (AHo 번호매김 협약에 따름)에 존재하도록 NXT, NXS, NXC 또는 NXV 모티프 (여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있음)를 함유하는 것인 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, IVD는 IVD 내에 추가적인 글리코실화 억셉터 부위, 예컨대 위치 14 및/또는 48 (AHo 번호매김 협약에 따름)을 갖는 것인 IVD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
- 제6항에 따른 발현 벡터를 포함하는 세포.
- 제7항에 있어서, 세포는 고등 진핵생물 세포, 예컨대 포유동물 세포 또는 식물 세포, 하등 진핵생물 세포, 예컨대 사상 진균 세포 또는 효모 세포, 또는 원핵생물 세포인 세포.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 세포는 글리코-조작된 세포인 세포.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 IVD를 포함하는 폴리펩티드.
- 제10항에 있어서, 글리코실화되고, 하나 이상의 글리칸을 포함하며, 글리칸은 말단 GlcNAc, GalNAc, 갈락토스, 시알산, 글루코스, 글루코사민, 갈락토사민, 바실로사민, 만노스 또는 만노스-6-P 당 또는 화학적으로 변형된 모노사카라이드 예컨대 GalNAz, GlcNAz 및 아지도-시알산을 갖는 것인 IVD를 포함하는 폴리펩티드.
- 제10항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 글리코실화는 GlcNAc, LacNAc, 시알릴-LacNAc, Man5GlcNAc2, Man8GlcNAc2, Man9GlcNAc2, 과-만노실화 글리칸, 만노스-6-포스페이트 글리칸, 복합 글리칸, 하이브리드 글리칸 및 화학적으로 변형된 글리칸 예컨대 GlcNAz, GlcNAc-GalNAz, 아지도-시알산-LacNAc로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 글리칸으로 이루어지는 것인 IVD를 포함하는 폴리펩티드.
- 글리칸-특이적 접합을 위한 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
- 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 및 접합 모이어티를 포함하는 IVD 접합체.
- 제14항에 있어서, 상기 접합 모이어티는 N-연결된 글리칸에 연결되는 것인 IVD 접합체.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 접합 모이어티는 반감기 연장 모이어티, 치료제, 검출 유닛 또는 표적화 모이어티를 포함하는 것인 IVD 접합체.
- 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 제6항에 따른 발현 벡터를 적합한 세포에 도입시키는 단계, 상기 폴리펩티드를 발현시키는 단계 및 단리시키는 단계를 포함하는 것인 제조 방법.
- 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 IVD 접합체를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 제6항에 따른 발현 벡터를 적합한 세포에 도입시키는 단계, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 발현시키는 단계 및 폴리펩티드에 접합 모이어티를 연결시키는 단계를 포함하는 것인 제조 방법.
- 순환 반감기를 조절하거나, 당단백질 안정성을 증가시키거나, 선택적 표적화를 위하거나, 면역원성을 조절하거나, 사전-항체 결합을 방지하거나 또는 검출 목적을 위한, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 IVD를 포함하는 폴리펩티드 또는 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 IVD 접합체의 용도.
- 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 제14항 또는 제16항에 따른 IVD 접합체를 포함하는 약학 조성물.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU634186B2 (en) | 1988-11-11 | 1993-02-18 | Medical Research Council | Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors |
| DE69330523T4 (de) | 1992-08-21 | 2012-08-23 | Vrije Universiteit Brussel | Immunoglobuline ohne leichte ketten |
| US6838254B1 (en) | 1993-04-29 | 2005-01-04 | Conopco, Inc. | Production of antibodies or (functionalized) fragments thereof derived from heavy chain immunoglobulins of camelidae |
| FR2708622B1 (fr) | 1993-08-02 | 1997-04-18 | Raymond Hamers | Vecteur recombinant contenant une séquence d'un gène de lipoprotéine de structure pour l'expression de séquences de nucléotides. |
| US5443953A (en) * | 1993-12-08 | 1995-08-22 | Immunomedics, Inc. | Preparation and use of immunoconjugates |
| EP0739981A1 (en) | 1995-04-25 | 1996-10-30 | Vrije Universiteit Brussel | Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes |
| US5721121A (en) | 1995-06-06 | 1998-02-24 | Genentech, Inc. | Mammalian cell culture process for producing a tumor necrosis factor receptor immunoglobulin chimeric protein |
| AU740043B2 (en) | 1996-06-27 | 2001-10-25 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw | Recognition molecules interacting specifically with the active site or cleft of a target molecule |
| WO1999037681A2 (en) | 1998-01-26 | 1999-07-29 | Unilever Plc | Method for producing antibody fragments |
| JP2003525016A (ja) | 1998-02-19 | 2003-08-26 | エクサイト セラピーズ， インコーポレイテッド | リンパ球活性化を調節するための組成物および方法 |
| AU3041100A (en) | 1999-01-05 | 2000-07-24 | Unilever Plc | Binding of antibody fragments to solid supports |
| ATE276359T1 (de) | 1999-01-19 | 2004-10-15 | Unilever Nv | Verfahren zur herstellung von antikörperfragmenten |
| AU776824B2 (en) | 1999-04-22 | 2004-09-23 | Unilever Plc | Inhibition of viral infection using monovalent antigen-binding proteins |
| WO2001004269A1 (en) * | 1999-07-14 | 2001-01-18 | D. Collen Research Foundation Vzw | Ligands for use in therapeutic compositions for the treatment of hemostasis disorders |
| WO2005016455A2 (en) * | 2003-08-14 | 2005-02-24 | D. Collen Research Foundation Vzw | Antibodies against factor viii with modified glycosylation in the variable region |
| US6479280B1 (en) | 1999-09-24 | 2002-11-12 | Vlaams Interuniversitair Institutuut Voor Biotechnologie Vzw | Recombinant phages capable of entering host cells via specific interaction with an artificial receptor |
| ES2275563T3 (es) | 1999-11-29 | 2007-06-16 | Unilever N.V. | Inmovilizacion de proteinas mediante el uso de un segmento polipeptidico. |
| PT1233987E (pt) | 1999-11-29 | 2009-12-28 | Bac Ip B V | Imobilização de moléculas de ligação ao antigénio de um domínio |
| ATE428733T1 (de) | 2000-03-14 | 2009-05-15 | Unilever Nv | Variabele domänen der schweren kette eines antikörpers gegen menschliche ernährungslipasen und deren verwendungen |
| AU2001268855A1 (en) | 2000-05-26 | 2001-12-03 | National Research Council Of Canada | Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies |
| AU2002229639A1 (en) | 2000-12-13 | 2002-06-24 | De Haard, Johannes Joseph Wilhelmus | Camelidae antibody arrays |
| AU2002319402B2 (en) | 2001-06-28 | 2008-09-11 | Domantis Limited | Dual-specific ligand and its use |
| US20060073141A1 (en) | 2001-06-28 | 2006-04-06 | Domantis Limited | Compositions and methods for treating inflammatory disorders |
| EP1433793A4 (en) | 2001-09-13 | 2006-01-25 | Inst Antibodies Co Ltd | METHOD FOR CREATING A CAMEL ANTIBODY LIBRARY |
| JP2005289809A (ja) | 2001-10-24 | 2005-10-20 | Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) | 突然変異重鎖抗体 |
| AU2002351896A1 (en) | 2001-12-11 | 2003-06-23 | Ablynx N.V. | Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts |
| AU2002360068B2 (en) | 2001-12-21 | 2009-09-03 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw | Method for cloning of variable domain sequences |
| WO2003055527A2 (en) | 2002-01-03 | 2003-07-10 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw | Immunoconjugates useful for treatment of tumours |
| US20060228355A1 (en) | 2003-11-07 | 2006-10-12 | Toon Laeremans | Camelidae single domain antibodies vhh directed against epidermal growth factor receptor and uses therefor |
| EP1558647B1 (en) | 2002-11-08 | 2015-06-10 | Ablynx N.V. | Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor |
| CA2505316C (en) | 2002-11-08 | 2014-08-05 | Ablynx N.V. | Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor |
| CA2512545C (en) | 2003-01-10 | 2015-06-30 | Karen Silence | Recombinant vhh single domain antibody from camelidae against von willebrand factor (vwf) |
| EP1587919A4 (en) | 2003-01-10 | 2006-10-11 | Us Gov Health & Human Serv | CATALYTIC DOMAINS OF BETA / 1,4) -GALACTOSYLTRANSFERASE I WITH CHANGED DONOR AND ACCEPTOR SPECIFICATIONS, THE IN-VITRO-PROTEIN FILLING PROMOTING DOMAINS, AND METHODS FOR THEIR USE |
| US7461263B2 (en) | 2003-01-23 | 2008-12-02 | Unspam, Llc. | Method and apparatus for a non-revealing do-not-contact list system |
| CN1845938B (zh) | 2003-06-30 | 2010-05-26 | 杜门蒂斯有限公司 | 多肽 |
| CA2535550A1 (en) | 2003-08-12 | 2005-03-03 | William M. Yarbrough | Treatment for acne vulgaris and method of use |
| US7563443B2 (en) | 2004-09-17 | 2009-07-21 | Domantis Limited | Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof |
| CA2583017A1 (en) | 2004-10-13 | 2006-04-20 | Ablynx N.V. | Single domain camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenerative neural diseases such as alzheimer's disease |
| JP2008528010A (ja) | 2005-01-31 | 2008-07-31 | アブリンクス ナームローゼ フェンノートシャップ | 重鎖抗体の可変ドメイン配列を作出する方法 |
| LT2949668T (lt) | 2005-05-18 | 2019-11-11 | Ablynx Nv | Pagerinti nanokūnai tm prieš navikų nekrozės faktorių alfa |
| EP2007814A2 (en) | 2005-05-20 | 2008-12-31 | Ablynx N.V. | Single domain vhh antibodies against von willebrand factor |
| EP1987068B1 (en) | 2006-02-10 | 2018-08-08 | Life Technologies Corporation | Oligosaccharide modification and labeling of proteins |
| CA2666599A1 (en) | 2006-08-18 | 2008-02-21 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with il-6-mediated signalling |
| US20110118185A9 (en) | 2007-02-21 | 2011-05-19 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against vascular endothelial growth factor and polypeptides comprising the same for the treatment of conditions and diseases characterized by excessive and/or pathological angiogenesis or neovascularization |
| NZ581097A (en) | 2007-05-24 | 2012-03-30 | Ablynx Nv | Amino acid sequences directed against rank-l and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders |
| US8815580B2 (en) | 2008-08-08 | 2014-08-26 | Vib Vzw | Cells producing glycoproteins having altered glycosylation patterns and method and use thereof |
| US20130066063A1 (en) | 2011-09-09 | 2013-03-14 | John Cooke Hodges | Bicyclo[6.1.0]non-4-yne regents for chemical modification of oligonucleotides |
| PL2911699T3 (pl) | 2012-10-23 | 2018-04-30 | Synaffix B.V. | Zmodyfikowane przeciwciało, koniugat przeciwciała i sposób ich otrzymywania |
| EP3041949B1 (en) | 2013-09-05 | 2021-04-28 | Vib Vzw | Cells producing fc containing molecules having altered glycosylation patterns and methods and use thereof |
| EP3058083B1 (en) | 2013-10-14 | 2018-04-11 | SynAffix B.V. | Modified glycoprotein, protein-conjugate and process for the preparation thereof |
| US20160235861A1 (en) | 2013-10-14 | 2016-08-18 | SynAffix. B.V. | Glycoengineered antibody, antibody-conjugate and methods for their preparation |
| CN107106701B (zh) | 2014-10-03 | 2020-11-06 | 西纳福克斯股份有限公司 | 磺酰胺接头、其缀合物及制备方法 |
| WO2016150845A1 (en) | 2015-03-20 | 2016-09-29 | Ablynx Nv | Glycosylated immunoglobulin single variable domains |
| DK3320105T3 (da) | 2015-07-09 | 2021-06-07 | Vib Vzw | Celler, der producerer glycoproteiner med ændrede o- og o-glycosyleringsmønstre, samt tilhørende fremgangsmåder og anvendelse |
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