ES2308826T3 - Inmunoglobulinas hibridas para su uso en metodos terapeuticos. - Google Patents
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Abstract
Dímero de cadena pesada de inmunoglobulina, en el que una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión al ligando que es una cadena única y es un receptor que no es miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulina o una proteína homóloga al mismo y no es un polipéptido de múltiples subunidades codificado por genes discontinuos, se sustituye por las regiones variables de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, las cuales mantienen por lo menos los dominios bisagra, CH2 y CH3 de la región constante de la cadena pesada, para su uso en un método terapéutico de tratamiento de un paciente.
Description
Inmunoglobulinas híbridas para su uso en métodos
terapéuticos.
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La presente invención se refiere a nuevas
moléculas de unión al ligando y receptores, y a composiciones y
procedimientos para mejorar la vida media del plasma circulante de
moléculas de unión al ligando. En particular, la presente invención
también se refiere a moléculas de inmunoglobulinas híbridas.
Las inmunoglobulinas son moléculas que contienen
cadenas polipeptídicas que se mantienen unidas mediante enlaces
disulfuro, teniendo de forma característica dos cadenas ligeras y
dos cadenas pesadas. En cada cadena, un dominio (V) tiene una
secuencia aminoacídica variable que depende de la especificidad del
anticuerpo de la molécula. Y el otro dominio (C) tiene una
secuencia constante común entre las moléculas de la misma clase. La
secuencia de los dominios se numera a partir del extremo
aminoterminal.
La superfamilia de genes de inmunoglobulinas
consiste de moléculas con dominios semejantes a la inmunoglobulina.
Los miembros de esta familia incluyen los antígenos de
histocompatibilidad principal de clase I y clase II, las
inmunoglobulinas, las cadenas \alpha, \beta, \gamma y \delta
del receptor de células T, CD1, CD2, CD4, CD8, CD28, las cadenas
\gamma, \delta y \varepsilon de CD3, OX-2,
Thy-1, las moléculas de adhesión celular
intercelular o neural (I-CAM o
N-CAM), el antígeno-3 asociado a la
función linfocítica (LFA-3), la proteína
neurocitoplásmica (NCP-3), el receptor de
poli-Ig, la glicoproteína asociada a mielina (MAG),
el receptor de IgE de alta afinidad, la glicoproteína principal de
mielina periférica (Po), el receptor del factor de crecimiento
derivado de plaquetas, el receptor del factor-1
estimulador de colonias, el receptor Fc de macrófagos, los
receptores gamma Fc y el antígeno carcinoembrionario.
Es sabido que es posible sustituir diversos
dominios variables (incluyendo las regiones hipervariables) de una
inmunoglobulina por otra, y de una especie por otra. Ver, por
ejemplo, las patentes europeas EP 0 173494; EP 0 1 250 23; Munro,
Nature, 312: (13 de diciembre de 1984); Neuberger et al.,
Nature, 312: (13 de diciembre de 1984); Sharon et al.,
Nature, 309: (24 de mayo de 1984); Morrison et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison
et al., Science, 229:1202-1207 (1985); y
Boulianne et al., Nature, 312:643-646 (13 de
diciembre de 1984).
Morrison et al., Science,
229:1202-1207 (1985) muestran la preparación de una
quimera de inmunoglobulinas que tiene una región variable de una
especie fusionada con una región constante de una inmunoglobulina de
otra especie. Esta referencia propone moléculas que tienen
secuencias de inmunoglobulina fusionadas con secuencias que no son
de inmunoglobulina (por ejemplo secuencias de enzimas de
restricción), sin embargo la referencia muestra sólo dominios
variables de inmunoglobulinas unidos a la secuencia que no es de
inmunoglobulina. Morrisson et al., patente europea EP 0 173
494 muestran una quimera similar. Mientras que el término
"receptor" es utilizado por los autores y la sección de
antecedentes hace referencia a "receptores como las
inmunoglobulinas, enzimas y proteínas de membrana", el término
"receptores de interés" incluye los receptores de células B y
células T, más particularmente, las inmunoglobulinas, como IgM,
IgG, IgA, IgD y IgE, así como los diversos subtipos de los grupos
individuales'' (página 3, líneas 10-13). La
descripción de esta referencia es específica de las quimeras de
inmunoglobulinas (ver por ejemplo la página 3, líneas
21-30).
Se ha observado también que es posible sustituir
dominios de tipo variable de inmunoglobulina de dos miembros de la
superfamilia CD4 de genes de inmunoglobulina y el receptor de
células T para un dominio variable en una inmunoglobulina; véase,
por ejemplo, Capon et al., Nature 337:
525-531, 1989, Traunecker et al., Nature
339: 68-70, 1989, Gascoigne et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 84: 2936-2940, 1987, y la solicitud
de Patente Europea publicada EP 0325 224 A2.
Se sabe que un gran número de sustancias
proteínicas funciona mediante su unión específica con moléculas
diana. Estas moléculas diana son generalmente, aunque no es
imprescindible, proteínas. Las sustancias que se unen a las
moléculas diana o a los ligandos están referidas aquí como parejas
de unión al ligando, e incluyen los receptores y proteínas
transportadoras, así como hormonas, proteínas de adhesión celular,
factores de adhesión específicos de tejido, moléculas de unión a
lectinas, factores de crecimiento, enzimas, sustancias nutrientes y
similares.
Los linfocitos son ejemplos de células que están
dirigidas a tejidos específicos. Los linfocitos son mediadores de
la inflamación de tejido normal así como de la lesión tisular
patológica como ocurre en la artritis reumatoide y otras
enfermedades autoinmunes. Los vertebrados han desarrollado un
mecanismo para la distribución de linfocitos con especificidades
antigénicas diversas por regiones espacialmente distintas del
organismo (Butcher, E.C., Curr. Top. Micro. Immunol., 128, 85
(1986); Gallatin, W.M., et al., Cell 44, 673 (1986);
Woodruff, J.J., et al., Ann. Rev. Immunol., 5, 201 (1987);
Duijvestijn, A., et al., Immunol. Today, 10, 23 (1989);
Yednock, T.A., et al., Adv. Immunol, (en publicación)
(1989)).
Este mecanismo implica la recircularización
continua de los linfocitos entre la sangre y los órganos linfoides.
La migración de linfocitos entre la sangre, donde las células tienen
el mayor grado de movilidad, y los órganos linfoides, donde los
linfocitos hallan el antígeno secuestrado y procesado, se inicia
mediante una interacción adhesiva entre receptores de la superficie
de los linfocitos y los ligandos en las células endoteliales de
vénulas postcapilarmente especializadas, por ejemplo, vénulas
endoteliales altas (HEV) y vasos semejantes a HEV inducidos en el
sinovio inflamado de forma crónica.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Las moléculas de adhesión de linfocitos se han
denominado específicamente receptores de localización, ya que
permiten a estas células localizarse en o situarse en determinados
órganos linfoides secundarios.
Se han identificado candidatos para el receptor
de localización de linfocitos en el ratón, la rata y en el hombre
(Gallatin, W. M., et al., Nature, 303, 30 (1983) Rasmussen,
R.A., et al., J. Immunol., 135, 19 (1985); Chin, Y. H.,
et al., J. Immunol., 136, 2556 (1986); Jalkanen, S., et
al., Eur. J. Immunol., 10, 1195 (1986)). La siguiente
literatura describe el trabajo realizado en esta área con la
utilización de un anticuerpo monoclonal, denominado Mel 14,
dirigido contra una forma murina de una proteína de superficie de
linfocitos (Gallatin, w. M., et al., supra; (Mountz,
J.D., et al., J. Immunol., 140, 2943 (1988); (Lewinsohn, D.
M., et al., J. Immunol., 138, 4313 (1987); Siegelman, M.,
et al., Science, 231, 823 (1986); St. John, T. et
al., Science, 231, 845 (1986)).
Los experimentos de inmunoprecipitación han
mostrado que este anticuerpo reconoce una proteína de superficie
celular difusa de 90.000 daltons en los linfocitos (Gallatin, W.M.,
et al., supra) y una proteína de 100.000 daltons en
neutrófilos (Lewinsohn, D.M., et al., supra).
Se describió por Siegelman et al.
(Siegelman, M. et al., Science, 231, 823 (1986)) una
secuencia parcial - 13 residuos - de un receptor de localización de
linfocitos, la cual se identificó mediante secuenciación
aminoacídica de marcaje radiactivo de una glicoproteína definida por
el anticuerpo Mel 14.
Las lectinas son proteínas con un dominio de
unión de carbohidratos que se han hallado en diversos animales,
incluyendo los humanos así como también el percebe y el moscón gris
de la carne. El concepto de lectinas con función en la adhesión
celular se ejemplifica por la interacción de ciertos virus y
bacterias con células huésped eucariotas (Paulson, J.C., The
Receptors vol. 2, P.M. Conn, Eds. (Academic Press, NY, 1985), pág.
131; Sahron, N., FEBS Lett., 217, 145 (1897)). En las interacciones
célula-célula de eucariotas, se han deducido las
funciones adhesivas de las lectinas endógenas en diversos sistemas
(Grable, L., et al., Cell, 17, 477 (1979); Fenderson, B.,
et al., J. Exp. Med., 160, 1591 (1984); Kunemund, V., J. Cell
Biol., 106. 106, 213 (1988); Bischoff, R., J. Cell. Biol., 102,
2273 (1986); Crocker, P.R., et al., J. Exp. Med., 164, 1862
(1986); incluyendo la fertilización de invertebrados (Glabae, C. G.,
et al., J. Cell. Biol. 94, 123 (1982); DeAngelis, P., et
al., J. Biol. Chem., 262, 13946 (1987)) y la de vertebrados
(Bleil, J. D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85,
6778 (1988); Lopez, L. C., et al., J. Cell Biol., 101, 1501
(1985)). La utilización de interacciones
proteína-azúcar como medio de lograr el
reconocimiento celular específico es bien conocida.
La literatura sugiere que una lectina puede
estar implicada en la interacción adhesiva entre linfocitos y sus
ligandos (Rosen, S.D., y col, Science, 228, 1005 (1985); Rosen,
S.D., et al., J. Immunol., (en publicación) (1989);
Stoolman, L. M., et al., J. Cell Biol., 96, 722 (1983);
Stoolman, L. M., et al., J. Cell Biol., 99, 1535 (1984);
Yednock, T. A., et al., J. Cell Biol., 104, 725 (1987);
Stoolman, L. M., et al., Blood, 70, 1842 (1987); una
aproximación relacionada por Brandley, B.K., et al., J. Cell
Biol., 105, 991 (1987); Yednock, T.A., et al., en
preparación; y Yednock, T.A., et al., J. Cell Biol., 104, 725
(1987)).
Se investigaron las características de una
glicoproteína de superficie que puede estar implicada en la
localización de linfocitos humanos con una serie de anticuerpos mono
y policlonales denominados genéricamente Hermes. Estos anticuerpos
reconocen una glicoproteína de superficie de 90.000 daltons que se
halló en un gran número de tipos celulares inmunes y no inmunes,
los cuales mediante experimentos de preaclaramiento de anticuerpos
se mostró que estaban relacionados con el antígeno de Mel 14.
(Jalkanen, S., et al., Ann. Rev. Med., 38,
467-476 (1987); Jalkanen, S., et al., Blood,
66 (3), 577-582 (1985); Jalkanen, S. et al.,
J. Cell Biol., 105, 983-990 (1987); Jalkanen, S.,
et al., Eur. J. Immunol., 18, 1195-1202
(1986).
Se han hallado dominios semejantes al factor de
crecimiento epitelial en una amplia gama de proteínas, incluyendo
factores de crecimiento, receptores de superficie celular, productos
de genes del desarrollo, proteínas de la matriz extracelular,
factores de coagulación, activadores del plasminógeno y el
complemento (Doolitle, R.F., et al., CSH Symp. 51, 447
(1986)).
Una glicoproteína de la superficie de células
linfocitos (a la que se hace referencia en la presente invención
como "LHR") se ha caracterizado por mediar en la unión de
linfocitos al endotelio de tejido linfoide. Se han identificado y
aislado clones de ADNc de longitud completa y ADN que codifica la
LHR humana y murina (HuLHR y MLRH, respectivamente) y, además, este
ADN se expresa fácilmente mediante células huésped recombinantes.
La secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la LHR humana (HuLHR)
se muestra en la figura 1. La secuencia de nucleótidos y
aminoácidos de la LHR murina (MLHR) se muestra en la figura 2.
También se proporcionan LHR que tienen secuencias de aminoácidos
variantes o con glicosilación que no se encuentran en ningún caso en
la naturaleza, así como otros derivados de la LHR que tiene
propiedades mejoradas incluyendo una mayor actividad específica y
una vida media en plasma modificada, así como procedimientos aptos
para la preparación de dichas variantes.
En la presente invención se muestra que la LHR
es una glicoproteína que contiene los siguientes dominios de
proteína: una secuencia señal, un dominio de unión de carbohidrato,
un dominio de tipo del factor de crecimiento epidérmico (egf), por
lo menos uno y preferiblemente dos dominios de repetición de dominio
de unión a complemento, un dominio de unión transmembrana (TMD) y
un dominio intracelular o citoplasmático cargado. La LHR de la
presente invención contiene por lo menos uno de todos estos
dominios, pero no necesariamente todos.
Una estrategia exitosa en el desarrollo de
fármacos para el tratamiento de muchas anomalías en las
interacciones de la pareja de unión al ligando ha sido la
identificación de antagonistas que bloquean la unión o la
interacción entre el ligando y la pareja de unión. Una aproximación
ha sido la utilización de una pareja de unión exógena como un
antagonista competitivo para la pareja de unión nativa. Sin embargo,
muchas parejas de unión al ligando son proteínas de membrana
celular que están ancladas en la bicapa lipídica de las células. La
presencia de componentes de membrana es indeseable desde el punto de
vista de fabricación y purificación. Y ya que estas moléculas se
hallan normalmente presentes sólo en las superficies celulares,
sería deseable producirlas en una forma que sea más estable en la
circulación. Además, las parejas de unión al ligando truncadas o
solubles puede que no sean óptimamente eficaces como terapéuticos ya
que poseen una vida media plasmática in vivo relativamente
corta, puede que no atraviesen la placenta u otras barreras
biológicas, y ya que secuestran su sitio de reconocimiento del
ligando sin permitir la acción de una función efectora, pueden ser
inadecuadas para propósitos terapéuticos.
Según ello, es un objetivo de la presente
invención el producir parejas de unión al ligando fusionadas con
porciones que sirvan para prolongar la vida media plasmática in
vivo de la pareja de unión al ligando, es decir dominios de
inmunoglobulina, y facilitar su purificación por la proteína A. Es
otro objetivo el proporcionar nuevas moléculas de inmunoglobulina
híbridas que combinen características de adhesión y unión a la diana
de una pareja de unión al ligando con funciones efectoras de
inmunoglobulina como la unión al complemento, unión al receptor
celular y similar. Otro objetivo es proporcionar moléculas con
funciones nuevas tales como las descritas anteriormente para
utilización terapéutica, o para utilizar como reactivos diagnósticos
para el ensayo in vitro de las parejas de unión al ligando o
de sus dianas. Es otro objetivo el proporcionar moléculas
multifuncionales en las que diversas parejas de unión al ligando
(cada una de las cuales puede ser la misma o diferente) se
ensambla, por lo que las moléculas son capaces de unirse a y/o
activar más de un ligando.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar heterodímeros híbridos de inmunoglobulina y la pareja
de unión al ligando que se utilizan en el reconocimiento de grupos
terapéuticos a tejidos y ligandos específicos.
Según la presente invención, se proporciona un
dímero de cadena pesada de inmunoglobulina en el que una secuencia
de aminoácidos de una pareja de unión al ligando que es una única
cadena y es un receptor que no es miembro de la superfamilia de
genes de inmunoglobulina o una proteína homóloga al mismo y no es un
polipéptido de múltiples subunidades codificado por genes
discontinuos, se sustituye por las regiones variables de las
cadenas pesadas de inmunoglobulina, las cuales mantienen por lo
menos los dominios bisagra, CH2 y CH3 de la región constante de la
cadena pesada, para su uso en un método terapéutico de tratamiento
de un paciente.
La LHR útil en la presente invención es LHR
madura de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos
descrita en la presente invención en las figuras 1 y 2, y alelos
naturales, derivados covalentes producidos mediante derivatización
in vitro, o variantes de secuencias de aminoácidos
predeterminadas o con glicosilación de las mismas.
Las nuevas composiciones que se proporcionan
aquí se purifican y formulan en vehículos aceptables
farmacológicamente para la administración a los pacientes que
necesitan una terapia antiviral, neuromoduladora o inmunomoduladora,
y para la utilización en la modulación de la adhesión celular. Esta
invención es particularmente útil para el tratamiento de pacientes
que tienen anomalías mediadas por receptor. Además, las
composiciones que se proporcionan aquí son intermediarios útiles en
la purificación de la pareja de unión al ligando a partir del
cultivo de células recombinantes, en donde los anticuerpos u otras
sustancias capaces de unirse al componente de proteína plasmática
estable se utilizan para absorber la fusión, o son útiles en los
ensayos diagnósticos para la pareja de unión al ligando en donde la
proteína plasmática estable sirve como un marcador indirecto.
La Figura 1 muestra la secuencia aminoacídica y
del ADN de la LHR humana (HuLHR).
La Figura 2 muestra la secuencia aminoacídica y
del ADN de la LHR murina (MLHR).
La Figura 3 muestra una comparación entre las
secuencias aminoacídicas de la HuLHR y MLHR.
Las Figuras 4A-4B muestran los
resultados del aislamiento y de la secuenciación del extremo
N-terminal de la MLHR. La Figura 4A muestra los
resultados de la degradación de Edmann en fase gaseosa de una banda
de 90.000 daltons a partir de un gel de
poliacrilamida-SDS a partir de material purificado
por cromatografía de afinidad con el anticuerpo monoclonal Mel 14
de un extracto obtenido con detergente de bazos murinos. Los
residuos subrayados entre los aminoácidos 7 y 15 se eligieron para
producir la sonda oligonucleotídica que se muestra en la Figura 4B.
La Figura 4B muestra como sonda un oligonucleótido de
26-mer 32 veces redundante.
La Figura 5 muestra la expresión transitoria del
clon de ADNc de MLHR. Los carriles A-F corresponden
a lo siguiente: A) Lisados de células 293 transfectadas con un
plásmido de expresión de MLHR e inmunoprecipitadas con el
anticuerpo monoclonal Mel 14. B) Sobrenadantes de las células 293
transfectadas con un plásmido de expresión de MLHR e
inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14. C) Lisados
de las células 293 transfectadas con un plásmido que expresa la
glicoproteína de la cubierta gp120 de VIH e inmunoprecipitadas con
el anticuerpo monoclonal Mel 14. D) Sobrenadantes de las células 293
transfectadas con el plásmido de expresión de la cubierta de VIH
inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14. E)
Sobrenadantes de las células 38C13 e inmunoprecipitadas con el
anticuerpo monoclonal Mel 14. F) Lisados de las células 38C13
marcadas en la superficie con I^{126} e inmunoprecipitadas con el
anticuerpo monoclonal Mel 14.
Las Figuras 6A-6C muestran las
secuencias proteínicas que son heterólogas pero funcionalmente
comparables con la MLHR, las líneas marcadas "MLHR"
corresponden a la MLHR de la Figura 2. La Figura 6A compara los
dominios de unión de carbohidrato; la Figura 6B compara los
dominios del factor de crecimiento epitelial; y la Figura 6C
compara los dominios del factor de unión al complemento.
La Figura 7 es un esquema de los dominios
proteínicos hallados en la LHR, incluyendo la secuencia señal, el
dominio de unión de carbohidratos, el dominio del factor de
crecimiento epitelial (egf), dos repeticiones en el dominio de
unión al complemento (flechas), el dominio de unión transmembrana
(TMD) y el dominio intracelular cargado.
La Figura 8 muestra la construcción de quimeras
de MLHR-IgG que contienen la lectina,
lectina-egf y
lectina-egf-motivos reguladores del
complemento.
La Figura 9 muestra la electroforesis en gel de
los productos de la expresión y purificación de las quimeras de
MLHR-IgG.
La Figura 10 muestra el análisis de unión del
éster de polifosfomanano (PPME) de varias quimeras de
MLHR-IgG.
Las parejas de unión al ligando tal como se
definen en la presente invención son proteínas conocidas por actuar
en la unión específica a moléculas ligando diana y se encuentran en
general en su estado nativo como polipéptidos secretados o unidos a
membrana; las parejas de unión al ligando unidas a membrana incluyen
habitualmente una región transmembrana hidrofóbica o fosfolípido
ancla. Entre las parejas de unión al ligando se incluyen receptores
y proteínas portadoras, así como hormonas, proteínas adhesivas
celulares (proteínas que dirigen o inducen la adhesión de una
célula a otra), moléculas de unión a lectina, factores de
crecimiento, enzimas, sustancias nutrientes y similares. Los
antígenos CD que no son miembros de la superfamilia de genes de
inmunoglobulina o en cualquier caso excluidos tal como se ha
indicado anteriormente son parejas de unión al ligando adecuadas,
Knapp et al. Immunology Today 10 (8):
253-258, 1989. El receptor del factor de crecimiento
plaquetario y el receptor de insulina pueden ser opcionalmente
parejas de unión al ligando. Las parejas de unión al ligando
incluyen no solamente la forma nativa de longitud completa, sino
también truncamientos u otras variantes de secuencias de
aminoácidos que mantienen la capacidad de unirse al ligando
normal.
Como se utiliza aquí, el término "pareja de
unión al ligando" excluye específicamente los miembros
polimórficos y no polimórficos de la superfamilia de los genes de
inmunoglobulina, y las proteínas que son homólogas a éstos, como
los antígenos de histocompatibilidad principal de clase I y clase
II, inmunoglobulinas, cadenas \alpha, \beta, \gamma y
\delta del receptor de células T, CD1, CD2, CD4, CD8, CD28, las
cadenas \gamma, \delta y \varepsilon de CD3,
OX-2, Thy-1, las moléculas de
adhesión celular intercelular o neural (I-CAM o
N-CAM), el antígeno-3 asociado con
la función linfocítica (LFA-3), la proteína
neurocitoplasmática (NCP-3), el receptor
poli-Ig, glicoproteína asociada a mielina (MAG), el
receptor de alta afinidad IgE, la glicoproteína principal de
mielina periférica (Po), el receptor del factor de crecimiento
derivado de plaquetas, el receptor del factor-1
estimulador de colonias, el receptor Fc de macrófagos, los
receptores gamma Fc y el antígeno carcinoembrionario. Homólogo a un
miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulina, únicamente
con el propósito de exclusión de esta superfamilia, quiere decir
tener la secuencia de un miembro de la superfamilia de genes de
inmunoglobulinas, o tener una secuencia de ello que tenga
sustancialmente la misma (o un elevado grado de) homología de
secuencia aminoacídica con un miembro conocido de la superfamilia,
como los ejemplos específicos proporcionados anteriormente tienen
en relación con la secuencia de un dominio variable o constante de
inmunoglobulina. Se ha de tener en cuenta que esto no excluye las
realizaciones en las que una fusión de una pareja de unión al
ligando se ensambla en un multímero con, además, un miembro o fusión
de un miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulinas.
También se excluyen de forma específica del
término "pareja de unión al ligando" los polipéptidos de
subunidades múltiples (cadenas) codificados por genes discretos
(genes que no codifican un polipéptido precursor de cadena sencilla
que conduce al polipéptido de subunidades múltiples), con al menos
una subunidad del polipéptido insertada de forma ordinaria en la
membrana de la célula, incluyendo los receptores celulares (por
ejemplo, integrinas) para moléculas de la matriz extracelular, como
se ejemplifica en la PCT Pub. WO90/06953 publicada el 28 de junio,
1990. Se ha de tener en cuenta que esto no excluye las realizaciones
en las que una fusión de la pareja de unión al ligando se ensambla
en un multímero con, además, un polipéptido de subunidades múltiples
o fusión de un polipéptido de subunidades múltiples tal como se
define en este párrafo.
En algunas realizaciones preferidas, la pareja
de unión es una LHR. La LHR se define como un polipéptido que tiene
una actividad biológica cualitativa en común con la LHR de la figura
1 o la figura 2, y que preferiblemente contiene un dominio con una
homología superior a aproximadamente el 70% con el dominio de unión
de carbohidrato, el dominio del factor de crecimiento epidérmico o
el dominio de unión de carbohidrato de la LHR de la figura 1 o la
figura 2.
La homología en relación con una LHR se define
aquí como el porcentaje de residuos en la secuencia de candidatos
que son idénticos con los residuos en el dominio de unión de
carbohidrato, el dominio del factor de crecimiento epitelial, o los
dominios de unión al complemento en la Figura 1 o Figura 2 después
de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario,
para lograr el porcentaje máximo de homología.
Se incluyen dentro del ámbito de la LHR, tal
como se utiliza aquí este término, las LHRs que tienen secuencias
aminoacídicas de la HuLHR o MLHR como se indica en la Figura 1 o 2,
derivados desglicosilados o no glicosilados de la LHR, variantes de
secuencia aminoacídica homóloga de la secuencia de la Figura 1 o la
2, y variantes homólogas generadas in vitro y derivadas de la
LHR, que son capaces de presentar una actividad biológica común con
la LHR de la Figura 1 o Figura 2.
La actividad biológica de la LHR o del fragmento
de LHR se definen como 1) la reactividad cruzada con al menos un
epitopo de la LHR, o 2) la posesión de al menos una función
adhesiva, reguladora o efectora cualitativamente común con la
LHR.
Un ejemplo de las actividades biológicas
cualitativas de la LHR es su unión a ligandos en células
endoteliales altamente especializadas de los tejidos linfoides.
También, se requiere frecuentemente para la unión al ligando un
catión divalente como el calcio.
Que reacciona de forma cruzada inmunológicamente
tal como se utiliza aquí quiere decir que el polipéptido candidato
es capaz de inhibir competitivamente la actividad biológica
cualitativa de la LHR que tiene esta actividad con antisueros
policlonales contra el análogo activo conocido. Tales antisueros se
preparan de manera convencional mediante inyección en cabras o
conejos, por ejemplo, de forma subcutánea con el análogo activo
conocido en adyuvante completo de Freund, seguido por la inyección
de refuerzo intraperitoneal o subcutánea en Freund incompleto.
Estructuralmente, como se muestra en la Figura
3, la LHR incluye varios dominios que se identifican de la manera
siguiente (con + 10 residuos): una secuencia señal (residuos
20-32), que se continua por un dominio de unión de
carbohidrato (identificado en la Figura 3 como un dominio de
"lectina") (residuos 39-155), un dominio del
factor de crecimiento epitelial (egf) (residuos
160-193), un dominio de unión al factor del
complemento (residuos 197-317), un dominio de unión
transmembrana (TMD) (residuos 333-355) y un dominio
citoplasmático (residuos 356-372). La unión para el
dominio extracelular de LHR se halla a, o en aproximadamente 30
residuos del extremo N-terminal del dominio
transmembrana, y se identifica fácilmente a partir del análisis de
la secuencia de LHR. Cualquiera de estos dominios se utiliza en la
práctica de la presente invención.
Las Figuras 6A-6C muestran
varias proteínas que tienen cierta homología con tres de estos
dominios. La Figura 6A muestra los dominios de unión de
carbohidrato, la Figura 6B muestra los dominios del factor de
crecimiento epitelial la Figura 6C muestra cierta homología con los
dominios de unión al complemento.
En la Figura 3 se muestra una comparación de las
secuencias aminoacídicas de HuLHR y MLHR, y se muestra un elevado
grado de homología en toda la secuencia global (83%). Los grados de
homología entre los diversos dominios hallados en la HuLHR
versus la MLHR son, sin embargo, variables. Por ejemplo, el
grado de conservación de secuencia entre la MLHR y la HuLHR en el
dominio de unión de carbohidrato y el dominio de egf es
aproximadamente del 83%, mientras que el grado de conservación en
la primera repetición de unión del complemento se halla en el 79% y
sólo en el 63% en la segunda repetición, para una homología global
del dominio de unión al complemento del 71%. Además, mientras que
las dos repeticiones del dominio de unión al complemento de MLHR son
idénticas, las de HuLHR presentan diferencias y difieren también
con las repeticiones murinas. Es interesante destacar que el grado
de conservación entre los dos receptores en la secuencia
transmembrana y regiones de alrededor es virtualmente idéntico, con
sólo una sustitución hidrofóbica conservativa, probablemente dentro
de la región de anclaje
transmembrana.
transmembrana.
La glicoproteína de superficie, que es
reconocida por las series de anticuerpos mono y policlonales
denominados Hermes como se describió anteriormente está
específicamente excluida del ámbito de la presente invención.
Las inmunoglobulinas y ciertas variantes de lo
mismo son conocidas y muchas se preparan en cultivos de células
recombinantes. Ver por ejemplo, la patente americana U.S. 4.745.055;
la patente europea EP 256. 654; Faulkner et al., Nature,
298: 286 (1982); la patente europea EP 120.694; la patente europea
EP 125.023; Morrison, J. Immun., 123: 793 (1979); Kohler et
al., P.N.A.S. USA 77:2197 (1980); Raso et al., Cancer
Res., 41:2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol.,
2:239 (1984); Morrison, Science, 229: 1202 (1985); Morrison et
al., P.N.A.S. USA, 81:6851 (1984); la patente europea EP
255.694; la patente europea EP 266.663; y la patente internacional
WO 88/03559. También son conocidas las cadenas de inmunoglobulinas
recombinadas. Ver por ejemplo, la patente americana U.S. 4.444.878;
la patente internacional WO 88/03565; y la patente europea EP 68.763
y las referencias allí citadas.
La pareja de unión al ligando se fusiona por la
C-terminal al N-terminal de la
región constante de cadenas pesadas de inmunoglobulina que retienen
por lo menos los dominios bisagra, CH_{2} y CH_{3} de la región
constante de la cadena pesada en lugar de las región o regiones
variables de la misma. Preferiblemente antes de la fusión se
inactivan o se eliminan las regiones transmembrana o las secuencias
de reconocimiento ancla de lípido o fosfolípido de parejas de unión
de ligando que comprenden dichas regiones o secuencias.
Dichas fusiones mantienen funcionalmente activos
por lo menos los dominios bisagra, CH2 y CH3 de la región constante
de la cadena pesada de inmunoglobulina. Las fusiones también se
realizan al C-terminal de la parte Fc de un dominio
constante, o inmediatamente N-terminal al CH1 de la
cadena pesada. Esto se lleva a cabo habitualmente mediante la
construcción de la secuencia de ADN apropiada y la expresión de ésta
en un cultivo celular recombinante. Como alternativa, no obstante,
los polipéptidos de esta invención pueden sintetizarse de acuerdo
con los procedimientos conocidos.
El sitio preciso en el que se realiza la fusión
no es crítico; se conocen bien los sitios concretos y pueden
seleccionarse con el fin de optimizar la actividad biológica, la
secreción o las características de unión de la pareja de unión. Se
determinará el sitio óptimo mediante experimentación rutinaria.
Las inmunoglobulinas híbridas se ensamblan como
dímeros. Generalmente, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán
unidades estructurales conocidas tal y como se representa en los
siguientes diagramas.
En los diagramas de la presente invención,
"A" significa por lo menos una parte de una pareja de unión al
ligando que contiene un sitio de unión al ligando que es capaz de
unir su ligando; X es un agente adicional, que es otra pareja de
unión al ligando funcional (el mismo que A o diferente) y C_{H}
representa los dominios constantes de cadena pesada de una
inmunoglobulina.
homodímero:
heterodímero:
Se entenderá que estos diagramas son simplemente
ilustrativos, y que las cadenas de los multímeros se cree que están
unidas con puentes disulfuro del mismo modo que las inmunoglobulinas
nativas. Según la presente invención, las inmunoglobulinas híbridas
se secretan fácilmente a partir de células de mamífero transformadas
con el ácido nucleico apropiado. Las formas secretadas son aquellas
en las que el epítopo de pareja de unión está presente en dímeros
de cadenas pesadas.
Una realización particularmente preferida es una
fusión de una parte N-terminal de una LHR, que
contiene el sitio de unión para el endotelio de tejido linfoide, a
la parte Fc C-terminal de un anticuerpo, que
contiene las funciones efectoras de la inmunoglobulina G_{1}.
Existen dos realizaciones preferidas de este tipo; en una, se
fusiona la región constante de la cadena pesada entera con una parte
de la LHR; en la otra, se fusiona una secuencia que empieza en la
región bisagra justo "upstream" con respecto al sitio de
división por papaína que define la Fc de IgG químicamente (residuo
216, tomando como primer residuo de la región constante de la
cadena pesada el 114 [Kabat et al., "Sequences of Proteins
of Immunological Interest" 4th Ed., 1987], o sitios análogos de
otras inmunoglobulinas) con una parte de la LHR. Esta última
realización se describe en el Ejemplo 4.
Se cree que las composiciones de la presente
invención en las que una parte biológicamente activa de una pareja
de unión al ligando se sustituye por las regiones variables de un
dímero de cadena pesada de inmunoglobulina muestran una vida media
en plasma in vivo mejor. Estas inmunoglobulinas híbridas se
construyen de un modo similar a las construcciones en las que un
dominio de tipo inmunoglobulina se sustituye por el dominio variable
de una inmunoglobulina, ver por ejemplo Capon et al., Nature
337:525-531, 1989, Traunacker et al., Nature
339:68-70, 1989, Gascoigne et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. 84:2936-2940, 1987, y la solicitud de
Patente Europea publicada EP 0 325 224 A2. Las inmunoglobulinas
híbridas de la presente invención también se construyen de un modo
similar a los anticuerpos quiméricos en los que un dominio variable
de un anticuerpo de una especie se sustituye por el dominio
variable de otra especie. Ver, por ejemplo, EP 0 125 023; Munro,
Nature 312: (13 de diciembre de 1984); Neuberger et al.,
Nature 312: (13 de diciembre de 1984); Sharon et al., Nature
309: (24 de mayo de 1984); Morrison et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Morrison et
al. Science 229:1202-1207 (1985); y Boulianne
et al., Nature 312:643-646 (13 de diciembre
de 1984). El ADN codificante de la pareja de unión se divide
mediante una enzima de restricción en el extremo 3' o próximo del
ADN codificante del dominio o dominios de la pareja de unión
deseados y en un punto o cerca del ADN codificante del extremo
N-terminal del polipéptido maduro (donde se
contempla el uso de un líder diferente) o en o próximo a la región
codificante del N-terminal para la pareja de unión
(donde se emplea una señal nativa). A continuación, se inserta
fácilmente este fragmento de ADN en el ADN codificante de una región
constante de cadena pesada de inmunoglobulina y, si es necesario,
se ajusta mediante mutagénesis supresora. Preferiblemente, ésta es
una inmunoglobulina humana cuando la variante está destinada a
terapia in vivo para humanos.
Generalmente, el dominio extracelular de LHR se
fusiona en su C-terminal a la región constante de la
inmunoglobulina. El sitio exacto en el que se realiza la fusión no
es crítico; pueden seleccionarse otros sitios próximos o en la
región extracelular con el objetivo de optimizar las características
de secreción o de unión de la fusión LHR-Ig
soluble. Se determinará el sitio óptimo mediante experimentación
rutinaria. Típicamente la fusión puede reemplazar uno o ambos
dominios transmembrana y citoplasmático.
Se conoce o se dispone fácilmente el ADN
codificante de regiones constantes de cadena ligera o pesada de
inmunoglobulina a partir de bibliotecas de ADNc o se sintetiza. Ver
por ejemplo, Adams et al., Biochemistry
19:2711-2719 (1980); Gough et al.,
Biochemistry 19:2702-2710 (1980); Dolby et
al., P.N.A.S. USA, 77:6027-6031 (1980); Rice
et al., P.N.A.S. USA 79:7862-7865 (1982);
Falkner et al., Nature 298:286-288 (1982); y
Morrison et al., Ann. Rev. Immunol.
2:239-256 (1984).
En la presente invención se proporcionan
secuencias de ADN codificantes de la LHR. En la práctica de la
presente invención son adecuadas secuencias de ADN codificantes de
otras parejas de unión deseadas que se conocen o están disponibles
fácilmente a partir de bibliotecas de ADNc.
El ADN codificante de una fusión de la presente
invención se transfecta en de una célula huésped para la expresión.
La célula huésped se transforma con el ADN codificante de cada
cadena que formará el multímero, seleccionando de manera óptima la
célula huésped que para que sea capaz de ensamblar las cadenas de
los multímeros del modo deseado.
En general, se ha descubierto que las fusiones
se expresan intracelularmente y se secretan bien, pero se encuentra
rutinariamente mucha variación en el grado de secreción de varias
fusiones de huéspedes recombinantes.
La presente invención también contempla
variantes de secuencia de aminoácidos de la LHR u otra pareja de
unión. Se preparan variantes de secuencia de aminoácidos de la
pareja de unión con varios objetivos en mente, incluyendo
incrementar de la afinidad de la pareja por su ligando, facilitar la
estabilidad, purificación y preparación de la pareja de unión,
modificar su vida media en plasma, mejorar la eficacia terapéutica,
y disminuir la gravedad o la aparición de efectos secundarios
durante el uso terapéutico de la pareja de unión. En la discusión
siguiente, se proporcionan variantes de secuencia de aminoácidos de
la LHR, ejemplos de las variantes que pueden seleccionarse para
otras parejas de unión de ligando.
Las variantes de secuencia de aminoácido de la
pareja de unión al ligando se encuentran en una o más de las tres
clases: variantes por inserción, sustitución o eliminación.
Normalmente estas variantes se preparan mediante mutagénesis
específica de sitio de nucleótidos en el ADN codificante de la
pareja de unión del ligando, mediante la cual se obtiene el ADN
codificante de la variante, y a continuación se expresa el ADN en el
cultivo celular recombinante. No obstante, se preparan
convenientemente fragmentos que tienen hasta aproximadamente
100-150 residuos de aminoácidos mediante síntesis
in vitro. Aunque la siguiente discusión se refiere en parte
a LHR, se aplica con el mismo efecto a cualquier pareja de unión al
ligando en la medida en que sea aplicable a la estructura o la
función de la misma.
Las variantes de la secuencia de aminoácidos de
la LHR son variantes predeterminadas que no se encuentran en la
naturaleza o alelos naturales. Habitualmente, las variantes de LHR
muestran la misma actividad biológica cualitativa - por ejemplo, la
actividad de unión a ligando- que los análogos HuLHR o MLHR
naturales. No obstante, las variantes de LHR y derivados que no son
capaces de unirse a sus ligandos son útiles, sin embargo, (a) como
reactivo en ensayos diagnósticos para la LHR o anticuerpos de la
LHR, (b) cuando se insolubiliza de acuerdo con los procedimientos
conocidos, como agentes para purificar los anticuerpos
anti-LHR de los antisueros o del sobrenadante de
cultivo de hibridoma, y (c) como inmunógenos para aumentar los
anticuerpos para la LHR o como componentes de un kit de
inmunoensayo (marcados, como un reactivo competitivo para la LHR
nativa o sin marcar como un patrón para el ensayo de LHR), siempre
y cuando por lo menos quede un epítopo de LHR activo.
Aunque el sitio para introducir una variación en
la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la mutación per
se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, con el
objetivo de optimizar la realización de la mutación en un sitio
determinado, se realiza una mutagénesis aleatoria o de saturación
(en la que se insertan los 20 residuos posibles) en el codón diana
y se criba la variante de LHR expresada para la combinación óptima
de actividades deseadas. Dicho cribado está dentro de la práctica
habitual en la materia.
Las inserciones de aminoácidos normalmente serán
del orden de aproximadamente de 1 a 10 residuos de aminoácidos; las
sustituciones se introducen normalmente por residuos individuales; y
las eliminaciones variarán entre aproximadamente de 1 y 30
residuos. Las eliminaciones o las inserciones se realizan
preferiblemente en pares contiguos, es decir, una eliminación de 2
residuos o una inserción de 2 residuos. A partir de la siguiente
descripción será completamente obvio que las sustituciones,
eliminaciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas se
introducen o se combinan para llegar a una construcción final.
Las variantes de secuencia de aminoácidos por
inserción de la LHR son aquellas en las que uno o más residuos de
aminoácidos externos a LHR se introducen en un sitio predeterminado
en la LHR diana y que reemplazan los residuos preexistentes.
Habitualmente, las variantes por inserción son
fusiones de proteínas o polipéptidos heterólogos al extremo amino o
carboxilo de la LHR. A dichas variantes se hace referencia como
fusiones de la LHR y un polipéptido que contiene una secuencia que
es diferente de la que normalmente se encuentra en la LHR en la
posición insertada. En la presente invención se contemplan diversos
grupos de fusión.
Las fusiones deseables de la pareja de unión,
que también pueden ser o no inmunológicamente activas, incluyen
fusiones de la secuencia de la pareja de unión madura con una
secuencia señal heteróloga a la pareja de unión.
En el caso de la LHR, y cuando se desee con
otras proteínas de unión seleccionadas, se emplean fusiones de
secuencia señal con la finalidad de dirigir más rápidamente la
secreción de la LHR. La señal heteróloga reemplaza la señal de la
LHR nativa, y cuando se reconoce la fusión resultante, es decir, es
procesada y dividida por la célula huésped, se secreta la LHR. Las
señales se seleccionan en base a la célula huésped prevista, y
puede incluir secuencias de bacterias, levadura, mamífero y virales.
La señal LHR nativa o la señal de glicoproteína gD de herpes es
adecuada para utilizarse en sistemas de expresión de mamíferos.
Las variantes por sustitución son aquellas en
las que se ha eliminado por lo menos un residuo en la secuencia de
la Fig. 1 o 2 y se ha insertado un residuo diferente en su lugar.
Generalmente tales sustituciones se realizan de acuerdo con la
siguiente Tabla 1 cuando se desea modular con precisión las
características de la LHR.
Las secuencias de aminoácidos novedosas, así
como análogos isostéricos (aminoácidos u otro tipo), se incluyen
dentro del ámbito de esta invención.
Se realizan cambios sustanciales en la función o
la identidad inmunológica mediante la selección de sustituciones
que son menos conservativas que aquellas de la Tabla 1, es decir,
seleccionando residuos que se diferencian más significativamente en
su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto
del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo como una
conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o la
hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de
la cadena lateral. Las sustituciones que en general se espera que
produzcan los mayores cambios en las propiedades de la LHR serán
aquellas en las que (a) un residuo hidrofílico, por ejemplo serilo
o treonilo, se sustituye para (o por) un residuo hidrofóbico, por
ejemplo leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una
cisteína o una prolina se sustituye para (o por) cualquier otro
residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral
electropositiva, por ejemplo lisilo, arginilo, o histidilo, se
sustituye para (o por) un residuo electronegativo, por ejemplos
glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena
lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina; se sustituye para (o
por) uno que no tenga una cadena lateral, por ejemplo, glicina.
Algunas eliminaciones, inserciones y
sustituciones no producirán cambios radicales en las características
de la molécula de LHR. No obstante, cuando es difícil predecir el
efecto exacto de la sustitución, la eliminación, o la inserción por
adelantado, por ejemplo cuando se modifica el dominio de unión de
carbohidrato de la LHR o un epítopo inmune, un experto en la
materia entenderá que el efecto se evaluará mediante ensayos de
cribado rutinarios. Por ejemplo, una variante se produce
habitualmente mediante la mutagénesis específica de sitio del ácido
nucleico codificante de LHR, la expresión del ácido nucleico
variante en el cultivo celular recombinante y, opcionalmente, la
purificación a partir del cultivo celular, por ejemplo, mediante
adsorción por inmunoafinidad en una columna
anti-LHR policlonal (con el objetivo de adsorber la
variante mediante por lo menos un epítopo inmune restante). A
continuación, se criba la actividad del lisado celular o la variante
de LHR purificada en un ensayo de cribado adecuado para la
característica deseada. Por ejemplo, se mide un cambio en el
carácter inmunológico de la LHR, como la afinidad para un
anticuerpo determinado como el Mel-14, mediante un
inmunoensayo de tipo competitivo. Cuanto más se sepa sobre las
funciones in vivo de la LHR otros ensayos serán útiles en
dicho cribado. Se ensayan modificaciones de propiedades proteicas
tales como la estabilidad redox o térmica, la hidrofobicidad, la
susceptibilidad a la degradación proteolítica, o la tendencia a
agregarse con portadores o en multímeros mediante procedimientos
bien conocidos por el experto.
Las variantes por sustitución de la LHR también
incluyen variantes donde los dominios funcionalmente homólogos de
otras proteínas se sustituyen mediante procedimientos rutinarios por
uno o más de los dominios de la LHR identificados anteriormente.
Cuando la variante es un fragmento de un dominio concreto de la LHR,
preferiblemente, pero no necesariamente, tiene por lo menos un
\sim70% de homología con el dominio de LHR correspondiente tal y
como se define en la presente invención. Las Figuras
6A-6C pueden ser utilizadas por los expertos en la
materia para las fuentes de dichos dominios sustituibles. Por
ejemplo, la lectina de la mosca de la carne cuya secuencia se
muestra en la Figura 6A puede modificarse para alcanzar un nivel de
por lo menos un \sim70% de homología con el dominio de unión de
carbohidrato de la LHR, y a continuación sustituirse por ese
dominio. De forma similar, el Factor X de coagulación, cuya
secuencia se muestra en la Figura 6B puede modificarse para
alcanzar un nivel de por lo menos un \sim70% de homología con el
dominio egf de la LHR, y a continuación sustituirse por ese
dominio. De manera deseable, pueden realizarse sustituciones
similares para la secuencia señal, el dominio de unión de
complemento, el dominio transmembrana, y para el dominio
citoplasmático.
Otra clase de variantes de LHR son las variantes
por eliminación. Las eliminaciones se caracterizan por la
eliminación de uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de
la LHR. Habitualmente, se suprimen los dominios transmembrana y
citoplasmáticos, o sólo los dominios citoplasmáticos de la LHR. No
obstante, es adecuada la eliminación desde el
C-terminal de la LHR hasta cualquier otro sitio
N-terminal adecuado en la región transmembrana que
conserva la actividad biológica o la reactividad cruzada inmune de
la LHR. Se excluyes del ámbito de las variantes por eliminación los
fragmentos de digestión proteica obtenidas hasta este momento en el
transcurso de la elucidación de las secuencias de aminoácidos de la
LHR, y los fragmentos de proteína que tienen menos de un \sim70%
de homología de secuencia con cualquiera de los dominios de la LHR
identificados anteriormente.
Las fusiones de inmunoglobulina pueden
realizarse con fragmentos de la LHR, tales como el dominio de unión
de complemento, el dominio de carbohidrato, y el dominio del factor
de crecimiento epidérmico. La fusión de dominio de unión de
complemento es útil en el diagnóstico y el tratamiento de
enfermedades mediadas por complemento, así como en la
oligomerización de la fusión con la LHR o con otros componentes en
la superficie del linfocito.
También pueden ser deseables eliminaciones de
cisteína u otros residuos lábiles, por ejemplo, en el incremento de
la estabilidad oxidativa de la LHR. La eliminación o las
sustituciones de sitios de proteólisis potenciales, por ejemplo Arg
Arg, se realiza mediante la eliminación de uno de los residuos
básicos o sustituyendo uno por residuos de glutaminilo o
histidilo.
En una realización, la LHR está comprendida del
dominio de unión de carbohidrato en ausencia de un dominio de unión
de complemento y/o el dominio egf. Esta realización puede contener o
no alguna de las regiones transmembrana y citoplasmástica o
ambas.
Una clase preferente de variantes por
sustitución o por eliminación son aquellas que implican una región
transmembrana de la LHR. Las regiones transmembrana de las
subunidades de LHR son dominios altamente hidrofóbicos o
lipofílicos que son del tamaño apropiado para abarcar la bicapa
lipídica de la membrana celular. Se cree que sujetan la LHR en la
membrana de la célula, y permiten la formación del complejo homo- o
heteropolimérico con la LHR.
La inactivación del dominio transmembrana de la
LHR y cualquier otra pareja de unión en la que esté una variante
presente, habitualmente mediante la eliminación o la sustitución de
residuos de hidroxilación del dominio transmembrana, facilitarán la
recuperación y la formulación mediante la reducción de su afinidad
por lípidos celulares o de membrana y el aumento de su solubilidad
acuosa. Si se eliminan los dominios transmembrana y citoplasmático
se evita la introducción de epítopos potencialmente inmunogénicos,
ya sea mediante la exposición de otros polipéptidos intracelulares
que podrían ser reconocidos como extraños por el cuerpo o mediante
la inserción de polipéptidos heterólogos que son potencialmente
inmunogénicos. La inactivación de la función de unión de membrana
se realiza mediante la eliminación de los residuos suficientes para
producir un perfil de hidropatía sustancialmente hidrofílico en
este sitio o mediante la sustitución con residuos heterólogos que
logran el mismo resultado.
Una ventaja principal de la LHR inactivada de
membrana es que puede secretarse en el medio de cultivo de
huéspedes recombinantes. Esta variante es soluble en fluidos
corporales tales como la sangre y no tiene una afinidad apreciable
por los lípidos de la membrana celular, de este modo simplificando
considerablemente su recuperación del cultivo celular
recombinante.
Como propuesta general, no todas las variantes
tendrán un dominio transmembrana funcional y preferiblemente no
tendrán una secuencia citoplasmática funcional.
Por ejemplo, el dominio transmembrana puede
sustituirse por cualquier secuencia de aminoácidos, por ejemplo una
secuencia aleatoria o predeterminada de aproximadamente 5 a 50
residuos de serina, treonina, lisina, arginina, glutamina, ácido
aspártico y de tipo hidrofílico, los cuales todos juntos muestran un
perfil hidropático hidrofílico. Al igual que la LHR (truncada) por
eliminación, estas variantes se secretan en el medio de cultivo de
huéspedes recombinantes.
En la tabla siguiente se describen ejemplos de
variantes de secuencia de aminoácidos de HuLHR. El residuo que
sigue al número de residuo indica los aminoácidos de sustitución o
insertados.
Preferiblemente, las variantes representan
sustituciones conservativas. Se entenderá que algunas variantes
pueden mostrar una actividad biológica reducida o ausente. Estas
variantes sin embargo son útiles como patrones en inmunoensayos
para la LHR, siempre y cuando mantengan por lo menos un epítopo
inmune de la LHR.
Se incluyen variantes de glicosilación dentro
del ámbito de la HuLHR. Éstas incluyen variantes que carecen
completamente de glicosilación (no glicosilada) y variantes que
tienen por lo menos un sitio glicosilado menos que la forma nativa
(desglicosilada), así como variantes en las que se ha cambiado la
glicosilación. Se incluyen las variantes de secuencia de
aminoácidos desglicosiladas y no glicosiladas, LHR desglicosilada y
no glicosilada que tiene la secuencia de aminoácidos no modificada
nativa de la LHR, y otras variantes de glicosilación. Por ejemplo,
se utiliza mutagénesis por sustitución o eliminación para eliminar
los sitios de glicosilación unidos a N u O de la LHR, como por
ejemplo, se elimina o se sustituye el residuo de asparagina por
otro residuo básico tal como la lisina o la histidina. Como
alternativa, se sustituyen o se eliminan los residuos flanqueantes
que forman el sitio de glicosilación, aún cuando los residuos de
asparagina permanecen inalterados, con el objetivo de evitar la
glicosilación mediante la eliminación del sitio de reconocimiento
de glicosilación.
Adicionalmente, se produce la LHR no glicosilada
que tiene la secuencia de aminoácidos de la LHR nativa en un
cultivo celular procariota recombinante, ya que las procariotas son
incapaces de introducir la glicosilación en los polipéptidos.
Las variantes de glicosilación se producen
mediante la selección de células huésped apropiadas o mediante
procedimientos in vitro. La levadura, por ejemplo, introduce
una glicosilación que varía significativamente de la de los
sistemas mamíferos. De modo similar, se criban de forma rutinaria
células de mamífero que tienen un origen de especie diferente (por
ejemplo, hámster, murino, insecto, porcino, bovino u ovino) u origen
tisular diferente (por ejemplo pulmón, hígado, linfoide,
mesenquimal o epidérmico) que la fuente de la LHR, por la capacidad
de introducir glicosilación variante tal como se caracteriza, por
ejemplo, mediante niveles elevados de manosa o proporciones
variantes de manosa, mucosa, ácido siálico y otros azúcares que se
hallan habitualmente en glicoproteínas de mamífero. El
procesamiento in vitro de la LHR se realiza habitualmente mediante
hidrólisis enzimática, por ejemplo, digestión con
neuraminidasa.
Se incluyen dentro del ámbito de la presente
invención las modificaciones covalentes de la molécula de LHR.
Dichas modificaciones se introducen haciendo reaccionar los residuos
de aminoácidos diana de la proteína recuperada con un agente
derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas
laterales seleccionadas o con los residuos terminales, o
aprovechando los mecanismos de modificación
post-traduccional que funcionan en células huésped
recombinantes seleccionadas. Los derivados covalentes resultantes
son útiles en programas dirigidos a identificar residuos
importantes para la actividad biológica, para inmunoensayos de la
LHR o para la preparación de anticuerpos anti-LHR
para la purificación por inmunoafinidad de la LHR recombinante. Por
ejemplo, la inactivación completa de la actividad biológica de la
proteína después de la reacción con ninhidrina sugeriría que por lo
menos un residuo arginilo o lisilo es crítico para su actividad,
donde los residuos individuales que se modificaron en las
condiciones seleccionadas se identifican mediante el aislamiento de
un fragmento de péptido que contiene el residuo de aminoácidos
modificado. Dicha modificaciones son de práctica habitual en la
materia y se realizan sin una gran experimentación.
La derivatización con agentes bifuncionales es
útil en la preparación de agregados intermoleculares de la
inmunoglobulina híbrida con polipéptidos, así como para la unión de
la inmunoglobulina híbrida a una matriz o superficie soporte
insoluble en agua para utilizar en el ensayo, o para la purificación
por afinidad de sus ligandos. Además, un estudio de las uniones
intracatenarias proporcionará información directa sobre la
conformación estructural. Los agentes de unión incluyen el
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida,
por ejemplo los ésteres con el ácido
4-azidosalicílico, los imidoésteres
homobi-funcionales incluyendo los ésteres de
disuccinimidil como el 3,3'-ditiobis
(succinimidil-propionato), y las maleimidas
bifuncionales como el
bis-N-maleimido-1,8-octano.
Los agentes derivatizantes como el
metil-3-[(p-azido-fenil)ditio]
propiomidato rinden intermediarios fotoactivables que son capaces
de formar uniones en presencia de luz. Alternativamente, matrices
insolubles en agua y reactivas como los carbohidratos activados por
bromuro de cianógeno y los sistemas que reaccionan en presencia de
sustratos descritos en las patentes americanas U.S. 3.959.080;
3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; 4.055.635; y
4.330.440 se utilizan para la inmovilización y la unión de
proteínas.
Ciertas derivatizaciones
post-traduccionales son el resultado de la acción de
células huésped recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los
residuos de glutaminil y asparaginil son frecuentemente desamidados
post-traduccionalmente en los residuos glutamil y
aspartil correspondiente. Alternativamente, estos residuos se
desamidan en condiciones ligeramente acídicas. Cualquier forma de
estos residuos se halla dentro del ámbito de la presente
invención.
Otras modificaciones
post-traduccionales incluyen la hidroxilación de
residuos de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo
de residuos de seril o treonil, la metilación de los grupos
\alpha-amino de las cadenas laterales de lisina,
arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and
Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco pág.
79-86 [1983], la acetilación de la amina del extremo
N-terminal, y en algunos casos, la amidación del
carboxilo del extremo C-terminal.
Otros derivados comprenden los polipéptidos
nuevos de la presente invención unidos covalentemente a un polímero
no proteico. El polímero no proteico es generalmente un polímero
sintético hidrofílico, es decir, un polímero que no se halla en la
naturaleza. Sin embargo, los polímeros que existen en la naturaleza
y que son producidos mediante procedimientos recombinantes o in
vitro son también útiles, como lo son los polímeros aislados de
la naturaleza. Se hallan dentro del ámbito de la presente invención
los polímeros de polivinil hidrofílicos, por ejemplo, el
polivinilalcohol y la polivinilpirrolidona. De especial utilidad son
los ésteres de polialquileno como el polietilén glicol, el
polipropilén glicol, los ésteres de polioxietileno o metoxi
polietilén glicol; los polioxialquilenos como el polioxietilén, el
polioxipropilén y copolímeros en bloque de polioxietilén y
polioxipropilén (Pluronics); los polimetacrilatos; los carbamatos;
polisacáridos ramificados o no que comprenden los monómeros de
azúcares como la D-manosa, la D- y
L-galactosa, la fucosa, la fructosa, la
D-xilosa, la L-arabinosa, el ácido
D-glucurónico, el ácido siálico, el ácido
D-galacturónico, el ácido
D-manurónico (por ejemplo, el ácido polimanurónico,
o el ácido algínico), la D-glucosamina, la
D-galactosamina, la D-glucosa y el
ácido D-neuramínico incluyendo los homopolisacáridos
y heteropolisacáridos como la lactosa, la amilopectina, el almidón,
el hidroexitil almidón, la amilosa, el sulfato de dextrano, el
dextrano, las dextrinas, el glucógeno, o la subunidad de
polisacáridos de mucopolisacáridos ácidos, por ejemplo, el ácido
hialurónico; polímeros de alcoholes de azúcar como el polisorbitol y
el polimanitol; y la heparina o el heparón.
Si el polisacárido es la glicosilación nativa o
la glicosilación que se espera de la expresión recombinante,
entonces el sitio de sustitución puede localizarse en un sitio
distinto al sitio de N- u O-glicosilación nativa,
en donde se haya introducido un sitio de N- u
O-glicosilación adicional o sustitutivo en la
molécula. Se pueden utilizar mezclas de tales polímeros, o el
polímero puede ser homogéneo. Antes de la unión, no es necesario
que el polímero sea soluble en agua, aunque es preferible, en
cambio, que el conjugado final sí lo sea. Además, el polímero no
debería ser altamente inmunogénico en la forma conjugada, ni debería
presentar viscosidad, lo que es incompatible con la infusión o
inyección intravenosa si se pretende administrar por dichas
vías.
De forma preferente, el polímero sólo contiene
un grupo reactivo. Esto ayuda a evitar la unión cruzada de
moléculas proteicas. Sin embargo, se halla dentro del ámbito de la
presente invención el optimizar las condiciones de reacción para
reducir la unión cruzada, o para purificar los productos de reacción
a través de filtración en gel o criba cromatográfica para recuperar
los derivados esencialmente homogéneos.
El peso molecular del polímero se hallará de
forma deseable en el margen de unos 100 a 500.000, y preferentemente
de unos 1.000 a 20.000. El peso molecular elegido dependerá de la
naturaleza del polímero y del grado de sustitución. En general,
cuanto mayor es la hidrofilicidad del polímero mayor es el grado de
sustitución y menor el peso molecular que se puede utilizar. Los
pesos moleculares óptimos se determinarán mediante experimentación
de rutina.
Generalmente, el polímero está unido
covalentemente a la inmunoglobulina híbrida mediante un agente de
unión multifuncional que reacciona con el polímero y con uno o más
residuos aminoacídicos o de azúcares del híbrido. Sin embargo, se
halla dentro del ámbito de la presente invención el unir de forma
directa el polímero haciendo reaccionar un polímero derivatizado
con el híbrido o viceversa.
El sitio de unión covalente en la
inmunoglobulina híbrida incluye los grupos amino y épsilon amino
del extremo N-terminal que se hallan en los residuos
de lisina, así como otros grupos amino, imino, carboxil, sulfidril,
hidroxil u otros grupos hidrofílicos. El polímero puede unirse de
forma covalente directamente al híbrido sin utilizar un agente de
unión multifuncional (generalmente bifuncional). La unión covalente
con los grupos amino se logra mediante reacciones químicas
conocidas basadas en cloruro cianúrico, diimidazol carbonil, grupos
reactivos de aldehídos (PEG alcóxido más dietil acetal de
bromoacetaldehído; PEG más DMSO y anhídrido acético, o PEG cloruro
más fenóxido de 4-hidroxibenzaldehído, ésteres
activos de succinimidil, PEG activado por ditiocarbonato, PEG
activado por 2,4,5-triclofenilcloroformato o
p-nitrofenilcloroformato). Los grupos carboxilo se
derivatizan mediante conjugación de PEG-amina
utilizando carbodiimida.
Los polímeros se conjugan con grupos de
oligosacáridos mediante oxidación utilizando reactivos químicos,
por ejemplo, metaperyodato, o enzimas, por ejemplo, glucosa o
galactosa oxidasa, (produciendo cualquiera de ellos el derivado
aldehído del carbohidrato), seguido de la reacción con hidrazida o
polímeros amino-derivatizados, de la misma manera
que se describe por Heitzmann et al., P.N.A.S.,
71:3537-3541 (1974) o Bayer et al., Methods
in Enzymology, 62:310 (1979), para el marcaje de los oligosacáridos
con biotina o avidina. Además, son también adecuados otros
procedimientos químicos o enzimáticos que se han utilizado
anteriormente para unir oligosacáridos y polímeros. Los
oligosacáridos sustituidos son particularmente ventajosos porque, en
general, hay menos sitios de sustitución que en los aminoácidos
para la derivatización, y por ello los productos de oligosacáridos
son más homogéneos. También, se modifica opcionalmente los
sustituyentes de oligosacáridos mediante digestión enzimática para
eliminar los azúcares, por ejemplo, mediante digestión por
neuraminidasa, antes de la derivatización del polímero.
El polímero llevará un grupo que reacciona
directamente con la cadena lateral del aminoácido, o el extremo N-
o C-terminal del polipéptido, o que reacciona con el
agente de unión multifuncional. En general, los polímeros que
llevan tales grupos reactivos son bien conocidos en la preparación
de proteínas inmovilizadas. Con el fin de emplear tales reacciones
químicas, se debería utilizar un polímero soluble en agua o
derivatizado de la misma forma que los polímeros insolubles
utilizados anteriormente para la inmovilización de proteínas. La
activación por bromuro de cianógeno es un procedimiento de
particular utilidad para utilizar en la unión de polisacáridos.
"Soluble en agua" en relación con el
polímero inicial quiere decir que el polímero o su intermediario
reactivo utilizado para la conjugación es suficientemente soluble en
agua como para participar en la reacción de derivatización.
"Soluble en agua" en relación con el
conjugado de polímeros quiere decir que el conjugado es soluble en
fluidos fisiológicos como la sangre.
El grado de sustitución de un tal polímero
variará dependiendo del número de sitios reactivos en la proteína,
si se utiliza toda la proteína o un fragmento de ella, si la
proteína es una fusión con una proteína heteróloga, del peso
molecular, de las características hidrofílicas y otras
características del polímero y de los sitios elegidos para la
derivatización de la proteína en particular. En general, el
conjugado contiene aproximadamente de 1 a 10 moléculas de polímero,
mientras que cualquier secuencia heteróloga puede sustituirse con
un número esencialmente ilimitado de moléculas de polímero siempre y
cuando la actividad deseada no se vea afectada negativamente de
forma significativa. El grado óptimo de unión se puede determinar
fácilmente con ayuda de una matriz experimental y haciendo variar
las condiciones de tiempo, temperatura y otras condiciones de la
reacción para cambiar el grado de sustitución, después de lo cual se
determina la capacidad de los conjugados para funcionar en la forma
deseada.
El polímero, por ejemplo PEG, se une mediante
muy diversos procedimientos conocidos per se para lograr la
modificación covalente de proteínas con polímeros no proteicos como
el PEG. Sin embargo, algunos de estos procedimientos no son
adecuados para los actuales propósitos. La química del cloruro
cianúrico conduce a muchas reacciones secundarias, incluyendo la
unión de proteínas. Además, es muy probable que conduzca a la
inactivación de proteínas que contienen grupos sulfidrilo. La
química del carbonil diimidazol (Beauchamp et al., Anal.
Biochem., 131:25-33 [1983]) requiere un pH elevado
(>8,5), que puede inactivar proteínas. Además, ya que el
intermediario de "PEG activado" puede reaccionar con agua, se
necesita un gran exceso molar de "PEG activado" en relación a
la proteína. La elevada concentración de PEG que se necesita para la
química del carbonil diimidazol también conlleva a problemas con la
purificación, por lo que tanto la cromatografía de filtración en
gel como la cromatografía de interacción hidrofóbica se ven
negativamente afectadas. Además, la elevada concentración de "PEG
activado" puede precipitar la proteína, un problema que ya se
había observado anteriormente (Davis, patente americana U.S.
4.179.337). Por otra parte, la química del aldehído (Royer, patente
americana U.S. 4.002.531) es más eficiente ya que solamente requiere
un exceso molar de 40 veces de PEG y de 1-2 h de
incubación. Sin embargo, el dióxido de manganeso sugerido por Royer
para la preparación del aldehído de PEG es problemático "debido a
la tendencia pronunciada del PEG de formar complejos con agentes
oxidantes con base de elementos metálicos" (Harris et
al., J. Polym. Sci., Polym. Chem. Ed. 22:341-352
[1984]). La utilización de la oxidación de moffatt, con DMSO y
anhídrido acético, solventa este problema. Además, el borohidrato de
sodio sugerido por Royer debe utilizarse a un pH alto y tiene una
tendencia significativa para reducir enlaces disulfuro. En cambio,
es preferible el cianoborohidruro de sodio, que es efectivo a un pH
neutro y tiene una leve tendencia a reducir los enlaces
disulfuro.
Los conjugados de la presente invención se
separan de los materiales iniciales que no han reaccionado mediante
filtración en gel. De la misma manera, las especies heterólogas de
los conjugados se purifican una de otra.
El polímero también puede ser insoluble en agua,
como un gel hidrofílico o un artículo de determinada forma como un
tubo quirúrgico en la forma de un catéter o un conducto de
drenaje.
El ADN codificante de la LHR y de otras parejas
de unión al ligando se sintetiza mediante procedimientos in
vitro o se obtiene fácilmente a partir de bibliotecas de ADNc de
linfocito. Los medios para la creación sintética del ADN
codificante de la LHR, ya sea manualmente o con un aparato
automático, son en general conocidos por un experto en la materia,
particularmente en vista de las enseñanzas contenidas en la presenta
invención. Como ejemplos del estado actual de la técnica relativa a
la síntesis de polinucleótidos, debe dirigirse a Maniatis et
al. Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory (1984), y Horvath et al. An
Automated DNA Synthesizer Employing Deoxynucleoside
3'-Phosphoramidites, Methods in Enzymology 154:
313-326, 1987.
Como alternativa, para obtener el ADN
codificante de la LHR a partir de fuentes diferentes de murina o
humana, dado que se proporciona la secuencia de ADN completa para la
realización preferida de la HuLHR (Figura 1) y de la MLHR (Figura
2), sólo se necesita realizar el cribado de hibridación con ADN
marcado codificante de HuLHR o MLHR o fragmentos de los mismos
(normalmente, mayores de aproximadamente 20, y habitualmente de
aproximadamente 50 pb) con el objetivo de detectar clones que
contienen secuencias homólogas en las bibliotecas de ADNc derivadas
de los linfocitos del animal concreto, seguido del análisis de los
clones mediante un análisis con enzimas de restricción y la
secuenciación de ácidos nucleicos para identificar clones de
longitud completa. Si los clones de longitud completa no están
presentes en la biblioteca, entonces se recuperan fragmentos
apropiados a partir de los diversos clones y se ligan en los sitios
de restricción comunes a los fragmentos para ensamblar un clon de
longitud completa. El ADN codificante de la LHR de otra especie
animal se obtiene mediante el sondeo de bibliotecas de dichas
especies con las secuencias humanas o murinas, o mediante la
síntesis del ADN in vitro de los genes para otras parejas de
unión que tienen secuencia conocida que puede obtenerse con el uso
de procedimientos de hibridación rutinarios análogos.
En la presente invención se proporcionan
secuencias de ácido nucleico que se hibridan bajo condiciones
astringentes a un fragmento de la secuencia de ADN en la Figura 1 o
la Figura 2, cuyo fragmento tiene aproximadamente 10 pb,
preferiblemente 20-50 pb e incluso más de 100 pb.
También se incluyen en el alcance de la presente invención
secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan bajo condiciones
astringentes a un fragmento de la LHR diferente de los dominios
señal, transmembrana o citoplasmáticos.
Dentro del alcance de la presente invención
también se incluyen las sondas de ácido nucleico que son capaces de
hibridarse bajo condiciones astringentes al ADNc de la LHR o al gen
genómico para la LHR (incluyendo intrones y las regiones
flanqueantes de 5' o 3' que se extienden hasta los genes adyacentes
o aproximadamente 5.000 pb, lo que sea mayor).
La identificación del ADN genómico para la LHR u
otra pareja de unión es una cuestión sencilla de sondeo de una
biblioteca genómica concreta con el ADNc o sus fragmentos que han
sido marcados con un grupo detectable, como por ejemplo
radiofósforo, y la recuperación del clon o clones que contienen el
gen. Si es necesario se ensambla el gen completo mediante
"walking". Habitualmente, dichas sondas no codifican secuencias
con menos de un 70% de homología con HuLHR o MLHR, y varían de
aproximadamente 10 hasta 100 pb de longitud. Las homologías y los
tamaños con respecto a otras parejas de unión pueden determinarse
sin experimentación excesiva.
En general, se utilizan procariotas para clonar
las secuencias de ADN en la construcción de los vectores útiles en
la presente invención. Por ejemplo, la cepa 294 de E. coli
K12 (ATCC Nº 31446) es particularmente útil. Otras cepas
microbianas que pueden utilizarse incluyen el E. coli B y el
E. coli X1776 (ATCC Nº 31537). Estos ejemplos son más
ilustrativos que limitantes. Como alternativa, son adecuados los
procedimientos in vitro de clonación, por ejemplo la
reacción en cadena de la polimerasa.
Los polipéptidos de la presente invención se
expresan directamente en un cultivo celular recombinante como un
análogo del metionilo N-terminal, o como una fusión
con un polipéptido heterólogo al híbrido/parte, preferiblemente una
secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de división
específico en el extremo N terminal del híbrido/parte. Por ejemplo,
en la construcción de un vector de expresión secretor procariota
para la LHR, se emplea la señal de LHR nativa con huéspedes que
reconocen esa señal. Cuando el líder secretor es "reconocido"
por el huésped, la peptidasa señal del huésped es capaz de dividir
la fusión del polipéptido líder fusionado en su extremo
C-terminal a la LHR madura deseada. Para huéspedes
procariotas que no procesan la señal de LHR, se sustituye la señal
por una señal procariota seleccionada por ejemplo del grupo de los
líderes de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, Ipp o la
enterotoxina II estable al calor. Para la secreción en levaduras la
señal de LHR humana puede sustituirse por los líderes de la
invertasa de levadura, el factor alfa o la fosfatasa ácida. En la
expresión celular de mamíferos la secuencia nativa es satisfactoria
para la LHR de mamífero, aunque son adecuadas otras señales de
proteínas secretoras de mamífero, como lo son los líderes
secretores virales, por ejemplo la señal de gD del herpes
simplex.
Los nuevos polipéptidos se pueden expresar en
cualquier célula huésped, pero preferentemente se sintetizan en
huéspedes de mamífero. Sin embargo, también son útiles para la
expresión las células huésped de procariotas, hongos, levaduras,
insectos y similares. Ejemplos de procariotas son las cepas
adecuadas para el clonaje como E. coli W3110
(F-'\lambda-'prototrófico, ATCC No. 27325), otras
enterobacteriáceas como Serratia marcesans, bacilli y
diversas pseudomonas. Preferentemente, la célula huésped debería
secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas.
Los huéspedes de expresión se transforman de
forma típica con el ADN que codifica el híbrido que ha sido ligado
en un vector de expresión. Tales vectores contienen generalmente un
origen de replicación (aunque no es necesario si tiene lugar la
integración cromosómica). Los vectores de expresión también incluyen
secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar la selección
fenotípica en las células transformadas, como se discutirá más
adelante. Por ejemplo, E. coli se transforma de forma típica
utilizando un pBR322, un plásmido derivado de una especie E.
coli (Bolivar, et al., Gene 2: 95 (1977)]. El pBR322
contiene genes para la resistencia a ampicilina y tetraciclina y
por ello proporciona medios fáciles para la identificación de
células transformadas, tanto para clonar o expresar. Los vectores
de expresión también contendrán de forma óptima secuencias que son
de utilidad para el control de la transcripción y la traducción, por
ejemplo, secuencias promotoras y de Shine-Dalgarno
(para procariotas) o promotores e incrementadores (para células de
mamífero). Los promotores pueden ser, aunque no es obligatorio,
inducibles; sorprendentemente, incluso promotores constitutivos
poderosos como el promotor CMV de huéspedes de mamífero producen
LHR sin causar toxicidad en la célula huésped. Aunque es concebible
que los vectores de expresión no necesiten contener ningún elemento
control de expresión, orígenes de replicación o genes de selección,
su ausencia puede dificultar la identificación de los transformantes
híbridos y el lograr un alto nivel de expresión de la
inmunoglobulina híbrida.
Los promotores adecuados para su uso con
huéspedes procariotas incluyen de manera ilustrativa los sistemas
de promotores de la \beta-lactamasa y la lactosa
(Chang et al., "Nature", 275: 615 [1978]; y Goeddel
et al., "Nature" 281: 544 [1979]), la fosfatasa
alcalina, el sistema de promotores del triptófano (trp) (Goeddel
"Nucleic Acids Res", 8: 4057 [1980] y EPO Appln. Publ. No.
36,776) y promotores híbridos tales como el promotor tac (H. de
Boer et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 80:
21-25 [1983]). No obstante, son adecuados otros
promotores bacterianos funcionales. Generalmente se conocen sus
secuencias de nucleótidos, permitiendo de ese modo que un técnico
los ligue operativamente al ADN codificante de la LHR (Siebenlist
et al., "Cell" 20: 269 [1980]) utilizando enlazadores o
adaptadores para proporcionar cualquier sitio de restricción
requerido. Los promotores que se usan en sistemas bacterianos
también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno
(S.D.) enlazada operativamente al ADN codificante de la LHR.
Además de las procariotas, son satisfactorios
los microbios eucariotas como la levadura o los hongos
filamentosos. El Saccharomyces cerevisae es el microorganismo
eucariota que se usa más habitualmente, aunque están normalmente
disponibles otras cepas. El plásmido YRp7 es un vector de expresión
satisfactorio en levadura (Stinchcomb, et al. Nature 282: 39
[1979]; Kingsman et al., Gene 7: 141 [1979]; Tschemper et
al. Gene 10: 157 (1980)). Este plásmido ya contiene el gen trp1
que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de
levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por
ejemplo ATCC no. 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics
85: 12 [1977]). La presencia de la lesión de trp1 como una
característica del genoma de la célula huésped de la levadura
proporciona entonces un medio eficaz para detectar la transformación
mediante crecimiento en ausencia de triptófano.
Secuencias promotoras adecuadas para utilizar
con huéspedes de levadura incluyen los promotores de la
3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J.
Biol. Chem. 255:2073 [1980]) u otras enzimas glicolíticas (Hess
et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 [1968]; y Holland,
Biochemistry 17:4900 [1978]), como la enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores
inducibles que tienen la ventaja adicional de una transcripción
controlada mediante las condiciones de crecimiento, son las regiones
promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la
fosfatasa ácida, las enzimas degradadoras asociadas con el
metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa y las enzimas responsables de la utilización de
maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para
utilizar en la expresión de levaduras se describen con mayor
detalle en R. Hitzeman et al., patente europea EP
73.73.557A.
Las secuencias control de la expresión son bien
conocidas en eucariotas. En general, todos los genes eucariotas
tienen una región rica en A-T localizada a
aproximadamente 25 a 30 bases cadena arriba del sitio de inicio de
la transcripción. Otra secuencia que se halla a unas 70 a 80 bases
cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción de muchos
genes es la región CXCAAT donde X puede ser cualquier nucleótido. En
el extremo 3' de la mayoría de genes eucariotas se halla una
secuencia AATAAA que puede ser la señal de adición de la cola poliA
en el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias
se insertan en los vectores de expresión de mamíferos.
Se obtienen fácilmente promotores adecuados para
el control de la transcripción de vectores en células huésped de
mamífero a partir de diversas fuentes, por ejemplo, los genomas de
virus como el virus del polioma, SV40, adenovirus, MMV (inducible
por esteroides), retrovirus (por ejemplo, el LTR o el VIH), el virus
de la hepatitis B y más preferentemente el citomegalovirus, o a
partir de promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo el
promotor de la beta actina. Los promotores tardío y temprano de SV40
se obtienen de forma conveniente de un fragmento de restricción de
SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40.
Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978). El promotor temprano
inmediato del citomegalovirus humano se obtiene de forma
conveniente como un fragmento de restricción HindIII. Greenaway,
P.J. et al., Gene 18:355-360 (1982).
La transcripción de un ADN que codifica para la
inmunoglobulina híbrida y/o porciones del híbrido por eucariotas
superiores se incrementa mediante la inserción de una secuencia
intensificadora en el vector. Las secuencias intensificadoras son
elementos de ADN que actúan en cis, generalmente de unas
10-300 pb, que actúan sobre un promotor para
incrementar su transcripción. Las secuencias intensificadoras tienen
una orientación y posición relativamente independiente, se han
hallado en 5' (Laimins, L. et al., PNAS 78:993 [1981] y en
3' (Lusky, M.L. et al., Mol. Cell. Biol. 3: 1108 [1983]) de
la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji, J.L.
et al., Cell 33:729 [1983]), así como también dentro de la
propia secuencia codificante (Osborne, T.F., et al., Mol.
Cell. Biol. 4:1293 [1984]). Se conocen actualmente muchas secuencias
intensificadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa,
albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Sin
embargo, se utilizará de forma característica una secuencia
intensificadora de un virus de células eucariotas. Ejemplos incluyen
la secuencia intensificadora de SV40 en el sitio tardío del origen
de replicación (pb 100-270), la secuencia
intensificadora del promotor temprano de citomegalovirus, la
secuencia intensificadora del polioma en el sitio tardío del origen
de replicación y las secuencias intensificadoras del adenovirus.
Los vectores de expresión que se utilizan en
células huésped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas,
animales, humanos o células nucleadas de otros organismos
multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para
la finalización de la transcripción, que puedan afectar la expresión
del mRNA. Estas regiones se transcriben como segmentos
poliadenilados en la parte no traducida del mRNA que codifica la
inmunoglobulina híbrida. Las regiones 3' no traducidas también
incluyen los sitios de finalización de la transcripción.
Los vectores de expresión pueden contener un gen
de selección, también denominado marcador seleccionable. Ejemplos
de marcadores seleccionables de células de mamífero son la
dihidrofolato reductasa (DHFR), la timidina quinasa (TK) o la
neomicina. Cuando tales marcadores seleccionables se transfieren con
éxito a la célula huésped de mamífero, ésta es capaz de sobrevivir
si se la coloca bajo presión selectiva. Existen dos categorías
distintas ampliamente utilizadas de regímenes de selección. La
primera categoría se basa en el metabolismo de las células y en la
utilización de una línea celular mutante que carece de la capacidad
de crecer de forma independiente de un medio suplementado. Dos
ejemplos son las células CHO DHFR- y las células de ratón LTK-.
Estas células carecen de la capacidad de crecer sin la adición de
nutrientes como timidina o hipoxantina. Debido a que estas células
carecen de ciertos genes necesarios para una vía de síntesis de
ácidos nucleicos completa, no pueden sobrevivir si no se les
proporciona el nucleótido carente en un medio suplementado. Una
alternativa al medio suplementado es introducir un gen DHFR o TK
intacto en las células carentes de los respectivos genes, alterando
así sus requerimientos de crecimiento. Las células individuales que
no fueron transformadas con el gen DHFR o el TK no serán entonces
capaces de sobrevivir en un medio no suplementado.
La segunda categoría de regímenes selectivos es
la selección dominante que hace referencia a un esquema de
selección utilizado con cualquier tipo de células y no requiere la
utilización de una línea celular mutante. Estos esquemas utilizan
típicamente un fármaco para parar el crecimiento de una célula
huésped. Aquellas células que se transformen con éxito con un gen
heterólogo expresan una proteína que les confiere resistencia al
fármaco y por lo tanto sobreviven al régimen de selección. Ejemplos
de tal selección dominante utilizan los fármacos neomicina
(Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982)),
ácido micofenólico (Mulligan et al., Science 209:1422
(1980)) o higromicina (Sudgen et al., Mol. Cell. Biol.
5:410-413 (1985)). Los tres ejemplos dados
anteriormente utilizan genes bacterianos bajo control eucariótico
para convertir la resistencia al fármaco G418 o neomicina
(geneticina), xgpt (ácido micofenólico) o higromicina,
respectivamente.
Células huésped eucariotas adecuadas para la
expresión de la inmunoglobulina híbrida incluyen la línea CV1 de
riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL
1651); la línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293
subclonadas para crecer en cultivo en suspensión, Graham, F.L. et
al., J. Gen. Virol., 36:59 [1977]); células de riñón de bebé
hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster
chino-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, PNAS (USA)
77:4216, [1980]); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, J.P.,
Biol. Reprod. 23:243-251); células de riñón de mono
(CV1ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano
(VERO-76, ATCC CRL-1587); células
de carcinoma cervical (HELA, ATCC CCL2); células de riñón canino
(MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC
CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de
hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562,
ATCC CCL51); y células TRI (Mather, J.P. et al., Annals N.Y.
Acad. Sci. 383:44-68 [1982]).
La construcción de vectores adecuados que
contienen las secuencias codificantes y control deseadas emplea las
técnicas de ligación estándares. Los plásmidos aislados o los
fragmentos de ADN se cortan, se forman extremos compatibles y se
religan en la forma deseada para producir los plásmidos
requeridos.
En el análisis para confirmar la presencia de
secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de
ligación se utilizan para transformar la cepa 294 de E. coli
K12 (ATCC 31446) y se seleccionan los transformantes con éxito
mediante su resistencia a ampicilina o tetraciclina, según sea el
caso. Se preparan plásmidos a partir de los transformantes, y se
analizan mediante restricción y/o secuenciación por el procedimiento
de Messing et al., Nucleic Acids Res. 9:309 (1981) o
mediante el procedimiento de Maxam et al., Methods in
Enzymology 65:499 (1980).
Se transforman las células huésped con los
vectores de expresión de la presente invención y se cultivan en
medio nutritivo convencional modificado según se requiera para
inducir los promotores, seleccionar los transformantes o amplificar
los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de
cultivo, como la temperatura, el pH y similar, son las utilizadas
previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y
serán evidentes para cualquier experto en la materia.
Las células huésped referidas en esta
descripción abarcan las células en cultivo in vitro así como
las células dentro del animal huésped.
La "transformación" significa la
introducción de ADN en un organismo de modo que el ADN sea
replicable, bien como un elemento extracromosómico o mediante
integración cromosómica. Salvo que se indique lo contrario, el
procedimiento utilizado aquí para la transformación de las células
huésped es el procedimiento de Graham, F. y van der Eb, A.,
Virology 52:456-457 (1973). Sin embargo, también se
pueden utilizar otros procedimientos para la introducción de ADN en
las células como la inyección nuclear o la fusión de protoplastos.
Si se utilizan células procariotas o células que contienen una
importante pared celular, el procedimiento preferido de transfección
es el tratamiento con calcio utilizando cloruro cálcico tal como se
describe por Cohen, F.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA), 69:2110 (1972).
La "transfección" hace referencia a la
introducción de ADN en una célula huésped independientemente de que
se exprese cualquiera de las secuencias codificantes que contiene
dicho ADN. Numerosos procedimientos de transfección son conocidos
por cualquier experto en la materia, por ejemplo, CaPO_{4} y la
electroporación. La transformación de células huésped es el indicio
de una transfección con éxito.
El polipéptido nuevo se recupera y se purifica
de los cultivos de células recombinantes mediante procedimientos
conocidos, incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol,
extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o
catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de
afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de
lectina. Otros procedimientos de purificación conocidos utilizan
carbohidratos, factor de crecimiento epidérmico o dominios de
complemento inmovilizados. Además, la HPLC de fase inversa y la
cromatografía que utiliza ligandos para la inmunoglobulina híbrida
son útiles para la purificación del híbrido. De manera deseable,
durante la purificación pueden estar presentes concentraciones bajas
(aproximadamente 1-5 mM) de ion calcio. La LHR se
puede purificar preferiblemente en presencia de un inhibidor de
proteasa tal como PMSF.
El híbrido LHR-inmunoglobulina
se utiliza terapéuticamente para competir con la unión normal de
linfocitos al tejido linfoide. El híbrido es por tanto
particularmente útil para el rechazo de órganos o injertos y para
el tratamiento de pacientes con inflamaciones, tales como, por
ejemplo, debido a la artritis reumatoide u otras enfermedades
inmunes. El híbrido LHR-inmunoglobulina también es
aplicable en el control de metástasis de linfoma y en el
tratamiento de enfermedades en las que existe una acumulación de
linfocitos.
De este modo, la selección de parejas de unión
del ligando con una afinidad específica por tejidos concretos
aumenta claramente la capacidad de liberar agentes terapéuticos que
son estables, tienen vidas medias relativamente largas y son
capaces de adaptarse de manera precisa sin una gran
experimentación.
El nuevo polipéptido se dispone en formulaciones
isotónicas estériles junto con los cofactores necesarios y se
administra de forma opcional mediante métodos estándares bien
conocidos en la materia. La formulación es preferentemente líquida,
y es generalmente una solución salina fisiológica que contiene
calcio 0,5-10 mM, tampón no fosfatado a pH
6,8-7,6, o puede ser un polvo liofilizado.
Es preferible que la ruta principal para la
administración terapéutica sea la liberación intravenosa, o la
liberación a través de catéter u otro conducto quirúrgico. Rutas
alternativas incluyen tabletas y similares, nebulizadores
disponibles comercialmente para formulaciones líquidas e inhalación
de receptores liofilizados o aerosolizados. Las formulaciones
líquidas se pueden utilizar después de la reconstitución de
formulaciones en polvo.
El nuevo polipéptido también puede administrarse
mediante microesferas, liposomas u otros sistemas de liberación de
micropartículas o formulaciones de liberación sostenida colocadas en
ciertos tejidos, incluyendo la sangre. Ejemplos adecuados de
transportadores de liberación sostenida incluyen las matrices de
polímeros semipermeables en la forma de artículos con formas
determinadas, por ejemplo, supositorios, o microcápsulas. Las
matrices de liberación sostenida implantables o microcapsulares
incluyen los poliláctidos (patente americana U.S. 3.773.919,
patente europea EP 58.481), copolímeros del ácido
L-glutámico y gamma
etil-L-glutamato (U. Sidman et
al., 1985, Biopolymers 22 (11):547-556),
poli(2-hidroexietil-metacrilato)
o etilén vinil acetato (R. Langer et al., 1981, J. Biomed.
Mater. Res. 15:167-227 y R. Langer, 1982, Chem.
Tech. 12:98-105). Los liposomas que contienen la
inmunoglobulina híbrida se preparan mediante procedimientos bien
conocidos: patente danesa DE 3.218.121A; Epstein et al.,
1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692;
Hwang et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77:4030-4034; patentes europeas EP 36676A, EP
88046A, EP 143949A, EP 142541A; solicitud de patente japonesa
83-11808; patentes americanas U.S. 4.485.045 y
4.544.545; y UP 102.342A. Generalmente, los liposomas son del tipo
unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800
Angstroms) en donde el contenido lipídico es superior a 30 mol.% de
colesterol, la proparte seleccionada se ajusta a la tasa óptima de
liberación sostenida del polipéptido.
Las preparaciones polipeptídicas de liberación
sostenida se implantan o inyectan en la proximidad del sitio de
inflamación o terapia, por ejemplo adyacentes a las articulaciones
artríticas o a los nódulos linfáticos periféricos.
Las dosis de los nuevos polipéptidos
administrados dependerán de las propiedades del híbrido utilizado,
por ejemplo su actividad de unión y la vida media plasmática in
vivo, la concentración del híbrido en la formulación, la ruta
de administración del híbrido, el sitio y la tasa de dosificación,
la tolerancia clínica del paciente implicado, la condición
patológica que lo afecta y similar, así como también dependerán de
la competencia del clínico.
Los polipéptidos de la presente invención,
pueden administrarse solos o junto con otros agentes farmacológicos
utilizados para tratar las condiciones citadas anteriormente, como
antibióticos, agentes antiinflamatorios y agentes antitumorales.
También puede ser útil administrar el polipéptido junto con otras
proteínas terapéuticas como el interferón gamma y otros
inmunomoduladores.
Con el fin de facilitar la comprensión de los
ejemplos siguientes se describirán algunos procedimientos y/o
términos utilizados corrientemente.
Los "plásmidos" se denominan mediante una p
en minúscula precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o
números. Los plásmidos iniciales de la presente invención están
disponibles comercialmente, disponibles al público sin
restricciones, o pueden construirse a partir de plásmidos
disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, los
plásmidos equivalentes a los descritos son conocidos en la materia y
serán evidentes para cualquier experto en la materia.
En particular, es preferible que estos plásmidos
tengan todas o alguna de las características siguientes: (1)
contener un número mínimo de secuencias del organismo huésped; (2)
ser estables en el huésped deseado; (3) ser capaces de estar
presente en un número elevado de copias en el huésped deseado; (4)
tener un promotor regulable; y (5) tener al menos una secuencia de
ADN que codifica una característica seleccionable presente en una
parte del plásmido separada del lugar donde se insertará la
secuencia de ADN nueva. La alteración de plásmidos para alcanzar
los criterios anteriores se realiza fácilmente por aquellos expertos
en la materia a la luz de la literatura disponible y de las
enseñanzas de la presente invención. Se sobreentenderá que pueden
existir en la actualidad vectores de clonaje adicionales, o se
descubrirán nuevos vectores que tengan las propiedades
anteriormente indicadas y sean por ello adecuados para utilizar en
la presente invención, por lo tanto dichos vectores se contemplan
también dentro del ámbito de la presente invención.
La "digestión" de ADN hace referencia al
corte catalítico del ADN con una enzima de restricción que actúa
sólo en ciertas secuencias del ADN. Las diversas enzimas de
restricción utilizadas aquí están disponibles comercialmente y sus
condiciones de reacción y otros requisitos se utilizaron como es
conocido por cualquier experto en la materia. Con fines analíticos,
se utiliza generalmente 1 \mug de plásmido o fragmento de ADN con
aproximadamente 2 unidades de enzima en unos 20 \mul de solución
tamponada. Para el propósito de aislamiento de los fragmentos de
ADN para la construcción del plásmido, se digiere generalmente de 5
a 50 \mug de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un gran
volumen. Las cantidades de tampón y sustrato a utilizar para cada
enzima determinado se especifican por el fabricante. Los tiempos de
incubación son de aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero pueden variar
de acuerdo con las instrucciones suministradas. Después de la
digestión la reacción se migra directamente en una electroforesis
en gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.
La separación por tamaño de los fragmentos de
restricción se realiza utilizando un gel de poliacrilamida del 8
por ciento descrito por Goeddel, D. et al., Nucleic. Acids
Res., 8:4057 (1980).
\newpage
La "desfosforilación" hace referencia a la
eliminación de los fosfatos 5' mediante el tratamiento con
fosfatasa alcalina bacteriana (BAP). Este procedimiento evita que
los dos extremos digeridos por restricción de un fragmento de ADN
se "recircularicen" o formen un bucle cerrado que impida la
inserción de otro fragmento de ADN en el sitio de restricción. Los
procedimientos y reactivos para la desfosforilación son
convencionales. Maniatis, T. et al., Molecular Cloning pág.
113-134 (1982). Las reacciones que utilizan BAP se
llevan a cabo en Tris 50 mM a 68ºC para suprimir la actividad de
cualquier exonucleasa que esté presente en las preparaciones
enzimáticas. Las reacciones se llevan a cabo durante 1 hora. Después
de la reacción, el ADN se migra en una electroforesis en gel y se
purifica del gel.
Los "oligonucleótidos" hacen referencia a
un polidesoxinucleótido de cadena sencilla o a dos cadenas de
polidesoxinucleótidos complementarias que pueden sintetizarse
químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato
5' y por lo tanto no se ligarán con otro oligonucleótido sin la
adición de un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un
oligonucleótido sintético se ligará a un fragmento que no se ha
desfosforilado.
La "ligación" hace referencia a la
formación de enlaces fosfodiésteres entre fragmentos de ácido
nucleico de doble cadena (Maniatis, T. et al., Id.
pág. 146). Salvo que se especifique lo contrario, la ligación se
realiza utilizando tampones y condiciones conocidas con 10 unidades
de T4 ADN ligasa ("ligasa") por cada 0,5 \mug de cantidades
equimolares aproximadamente de los fragmentos de ADN a ligar.
El "relleno" o "formación de extremos
romos" hace referencia a procedimientos mediante los cuales el
extremo de cadena sencilla en un extremo protuberante de un ácido
nucleico digerido con una enzima de restricción se convierte en una
cadena doble. Esto elimina los extremos protuberantes y forma
extremos romos. Este proceso es una herramienta versátil para
convertir un extremo de corte de restricción que puede ser
protuberante con los extremos creados por sólo una o unas pocas
enzimas de restricción en un extremo compatible con cualquier
endonucleasa de restricción que produce extremos romos u otro
extremo protuberante rellenado. Típicamente, la formación de
extremos romos se logra mediante incubación de 2-15
\mug del ADN diana en tampón de MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 1
mM, NaCl 50 mM, Tris 10 mM (pH 7,5) a aproximadamente 37ºC en
presencia de 8 unidades de fragmento Klenow de la ADN polimerasa I
y 250 \muM de cada uno de los cuatro desoxinucleótidos trifosfato.
La incubación se finaliza generalmente al cabo de 30 min y se
realiza una extracción con fenol y cloroformo y una precipitación
con etanol.
Actualmente se piensa que la estructura
tridimensional de las composiciones de la presente invención es
importante para su funcionamiento tal como se ha descrito aquí. Por
ello, todos los análogos estructurales relacionados que mimeticen
la estructura activa de los formados por las composiciones
reivindicadas aquí se incluyen específicamente dentro del ámbito de
la presente invención.
Se entiende que la aplicación de las enseñanzas
de la presente invención a un problema o situación específico se
hallará dentro de las capacidades de cualquier experto en la materia
a la luz de las enseñanzas aquí contenidas. Procesos
representativos para el aislamiento, utilización y fabricación de
moléculas de inmunoglobulina-LHR híbridas aparecen
más adelante, y son ilustrativos de la invención aunque se refieren
al receptor de localización de linfocitos.
Todas las referencias en estos ejemplos al
anticuerpo monoclonal "Mel 14" o a "Mel 14" se refiere a
un anticuerpo monoclonal dirigido contra una forma presuntamente
murina de una proteína de superficie de linfocito, descrita por
Gallatin et al. supra Nature 303, 30 (1983). Sin
embargo, el uso de Mel 14 no es necesario para realizar la presente
invención debido a la disposición en la presente invención de
secuencias completas para el ADN y los aminoácidos de la LHR.
\vskip1.000000\baselineskip
La MLHR se aisló de bazos de ratón tratados con
detergente mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando el
anticuerpo monoclonal Mel 14.
En una preparación típica, se trocearon 300
bazos de ratones hembras ICR (16 semanas) y luego se homogeneizaron
con un molinillo de tejidos Potter-Elvehjem en 180
ml de TritonX-100 al 2% en
PBS-Dulbecco que contenía PMSF 1 mM y aprotinina al
1%. La lisis se continuó durante 30 minutos en un agitador a 4ºC. El
lisado se centrifugó sucesivamente a 2.000 g durante 5 minutos y a
40.000 g durante 30 minutos.
El sobrenadante se filtró a través de un filtro
Nitex preaclarado mediante adsorción con suero de rata conjugado
con Sepharose 4B activada con bromuro de cianógeno (10 ml de gel
empaquetado). El suero de rata se diluyó a 1:10 para la
conjugación, la cual se llevó a cabo de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Se aplicó el flujo a una columna de 3
ml conjugada con anticuerpo MEL-14 a 0,5 mg por ml
de Sepharose 4B. Todos los tampones de la columna contenían azida
de sodio al 0,02%.
La columna se lavó con 25 ml de Triton
X-100 al 2% en PBS seguido por 25 ml de CHAPS 10 mM
en el mismo tampón. El antígeno se liberó mediante la adición de 10
ml de CHAPS 10 mM en glicina 100 mM, NaCl 200 mM, pH 3 y se
neutralizó recogiéndolo en 1 ml de Tris-HCl pH 7,6.
Después de lavar la columna con trietilamina 20 mM, NaCl 200 mM, pH
11 y reequilibrarse en CHAPS 10 mM en PBS, el antígeno neutralizado,
se diluyó en 100 ml del tampón de la columna, se reaplicó a la
columna y se repitieron las etapas de lavado y liberación.
La proteína purificada se concentró en un
Centricon 30 (Amicon, Inc.) y se analizó mediante
SDS-PAGE (acrilamida al 7,5%) con la utilización de
tinción de plata para su visualización. Una purificación típica
produjo de 30-40 \mug de antígeno por 300 ratones,
basándose en la comparación con los estándares de orosomucoides.
En resultados no mostrados, un gel de
poliacrilamida del material purificado mostró una banda difusa de
migración a aproximadamente 90.000 daltons y una proteína de peso
molecular superior a aproximadamente 180.000 daltons. El cociente
del componente de 90.000 daltons con relación al de 180.000 daltons
fue de 10:1 o superior en todas las amplias series de
preparaciones. El material se visualizó mediante tinción de plata
de un gel de poliacrilamida al 10%.
La degradación de Edman de fase gaseosa de la
banda de 90.000 daltons dio como resultado la identificación de una
secuencia N-terminal única (Figura 4A), incluyendo
el aminoácido del extremo más N-terminal. Se
identificaron 38 aminoácidos en el extremo
N-terminal, con cuatro huecos (X) en las posiciones
1, 19, 33 y 34. La asparagina (N) en la posición 22 se dedujo de la
ausencia de una señal aminoacídica en esta posición combinada con
los residuos siguientes de tirosina (Y) y treonina (T), lo que dio
como resultado una secuencia consenso de sitio de glicosilación
(NXT/S).
La secuencia de 13 residuos que se muestra en la
Figura 4A en el extremo N-terminal de 38 residuos
de largo es la que se dedujo previamente por Siegelman et
al., supra mediante secuenciación aminoacídica
radioactiva, que muestra un alto nivel de homología (11 de 13
residuos) con la secuencia de la LHR determinada aquí.
No se obtuvo ninguna secuencia de ubquitina a
partir de las tres migraciones de secuencia que se realizaron con
dos preparaciones de MLHR por separado. Seguramente, esta
modificación estaba ausente en los esplenocitos de ratón, o el
extremo N-terminal de la ubiquitina se bloqueó
durante la degradación de Edman en la LHR de esta fuente.
La secuencia de aminoácidos de la Figura 2 se
comparó con secuencias conocidas en la base de datos de proteínas
de Dayhoff, mediante la utilización del algoritmo de Lipman, D.
et al., Science 227:1435-1441 (1981).
Los residuos que están subrayados en la Figura
4A entre los aminoácidos 7 y 15 se eligieron para producir la sonda
oligonucleotídica que se muestra en la Figura 4B. Una sonda
oligonucleotídica de 26-mer 32 veces redundante se
diseñó a partir de estos residuos y se sintetizó en un sintetizador
de oligonucleótidos Applied Biosystems. Todas las redundancias
posibles se incluyeron en esta sonda, con la excepción de la prolina
en posición 9, donde el codón CCC se eligió basándose en las reglas
de utilización de codones de mamíferos.
El rastreo de una librería de ADNc de bazo
murina, obtenida a partir de bazos diseccionados de ratones con
esta sonda, dio como resultado el aislamiento de un sólo clon de
ADNc que hibridaba. Se sembraron 600.000 calvas a 50.000 fagos por
placa (12 placas) de una librería de ADNcs en lambda gt10 cebada con
oligo-dT, de 10 bazos murinos obtenida a partir de
mRNA aislados de esplenocitos murinos con 5 \mug/ml de
Concanavalina A durante 6 horas. Las placas se hibridaron con la
sonda oligonucleotídica de 26-mer 32 veces
redundante que se muestra en la Figura 4B, en tampón de formamida
al 20%, 5XSSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato
sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardts 5X, sulfato de dextrano
al 10% y 20 \mug/ml de esperma de salmón troceado y
desnaturalizado a 42ºC durante toda la noche. Estos parámetros hacen
referencia aquí a "condiciones de estringencia". Los filtros
se lavaron en 1XSSC, SDS al 0,1% a 42ºC durante 2X 30 min y se
autoradiografiaron a -70ºC durante toda la noche. Un clon positivo
duplicado se rastreó de nuevo, se aisló en inserto EcoRI y se
insertó en los vectores M13 o PUC 118/119 y se determinó la
secuencia nucleotídica a partir de moldes de cadena sencilla
utilizando cebadores específicos de la secuencia.
La Figura 2 muestra la secuencia de ADN completa
del inserto EcoRI de 2,2 Kb contenido en este bacteriófago. El
mayor marco de lectura abierto se inicia con un codon metionina en
la posición 106-108. Se halló una homología con la
caja Kozak alrededor de este codón metionina, lo que sugiere que
probablemente este codon funcione iniciando la traducción proteica.
Una secuencia proteica de 373 aminoácidos de aproximadamente 42.000
daltons de peso molecular está codificada en este marco de lectura
abierto. La proteína traducida muestra una secuencia desde el
residuo 40 al 76 que corresponde exactamente con la secuencia
aminoacídica del extremo N-terminal determinada a
partir de la MLHR aislada.
Este resultado sugiere que el extremo maduro
N-terminal de la MLHR se inicia con el residuo de
triptófano en la posición 39. Sin embargo, se cree que puede haber
ocurrido algún proceso proteolítico del extremo
N-terminal actual de la LHR durante el aislamiento
de la proteína.
Un perfil de hidrofobicidad de la proteína puso
de manifiesto un dominio hidrofóbico localizado en el extremo
N-terminal que podría funcionar como una secuencia
señal para la inserción en el lumen del retículo endoplasmático. La
secuencia deducida para las posiciones 39 a 333 es predominantemente
hidrofílica seguida por un dominio de 22 residuos hidrofóbico, que
es característico de un dominio de parada de transferencia o de
anclaje de membrana.
La región intracelular putativa en el extremo
C-terminal de la proteína es bastante corta, sólo 17
residuos de longitud. En el sitio inmediato al
C-terminal del dominio transmembrana existen
diversos aminoácidos básicos, un hecho típico de uniones entre
anclajes de membrana y dominios citoplasmáticos de receptores de
superficie celular, Yarden et al., Nature. Un sólo residuo de
serina, potencialmente un sitio para la fosforilación, está
presente dentro del dominio citoplasmático putativo.
La proteína contiene diez sitios de
N-glicosilación potenciales, estando todos ellos
dentro del dominio extracelular que sobresale. La ausencia de
asparagina en la posición 60 (residuo 22 de la proteína madura) en
el análisis de secuencia peptídica confirma la glicosilación en este
sitio y establece la orientación extracelular de esta región. La
región codificante contiene un total de 25 residuos de cisteína,
aunque 4 de estos residuos de cisteína están localizados en la
secuencia líder putativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Figura 6, la comparación
de la secuencia aminoacídica de MLHR deducida con otras proteínas
de la base de datos de secuencia proteica de Dayhoff mediante la
utilización del programa fastp (Lipman, D., y Pearson, W., Science,
227:1435-1441, 1985) puso de manifiesto diversas
homologías de secuencia interesantes.
Las proteínas con los niveles de homología de
secuencia más elevados se muestran con cajas que rodean las
regiones de mayor homología de secuencia. Los números en el inicio
de las secuencias muestran la posición dentro de las proteínas
donde estas secuencias homólogas se localizan.
La Figura 6A muestra que el motivo del extremo
N-terminal de la LHR (residuos 39 a 155) tiene
ciertas homologías de proteína de unión con carbohidratos, como se
indica (el porcentaje de homología de estas secuencias con la MLHR
se muestra entre paréntesis, y las referencias indicadas se
proporcionan después de los Ejemplos): Drickamer, los residuos
aminoacídicos hallados por Drickamer et al., (1); MuLHR, la
secuencia de MLHR; Hu.HepLec (27,8%), lectina hepática humana (2);
Barn. lec (25%), lectina de percebe (3); Ra.HepLec (23,5%), lectina
hepática de rata (4); Ch.Hepl.Lec (27,5%), lectina hepática de pollo
(5); Hu.IgERec (28,6%), receptor de IgE humano (6); RaHepLec2
(22,6%), lectina hepática de rata 2 (7); Ra.ASGRec (22,6%), receptor
de asialoglicoproteína de rata (8); RA.IRP (25,6%), proteína de
regeneración de islotes de rata (9); Ra.MBP (26,1%), proteína de
unión a manosa de rata (10); RA.MBDa (26,1%), precursor de la
proteína de unión a manosa de rata A (11); RA.KCBP (27%), proteína
de unión de células Kuppfer de rata (12); FlyLec (23,1%), lectina
del moscón gris de la carne (Sarcophaga) (13); y Rab.Surf (20,9%),
tensoactivo de pulmón de conejo (14).
Como se puede ver en la Figura 6A se muestra que
el motivo localizado en el extremo N-terminal de la
LHR muestra un nivel elevado de homología con varias lectinas
animales dependientes de calcio, es decir, lectinas de tipo C (1).
Estas incluyen pero no se limitan a, diversas proteínas de unión de
azúcares hepáticos del pollo, rata y humanos, lectinas de unión a
manosa soluble, una lectina de células Kupffer, el receptor de
asialoglicoproteína, una proteína del core de proteoglicano del
cartílago, apoproteínas tensoactivas pulmonares y dos lectinas de
invertebrados del moscón gris de la carne y del percebe. A pesar del
adjetivo "invariante" para los aminoácidos reconocido
inicialmente por Drickamer et al., supra, como una
característica común de las lectinas animales de tipo C, éstas no
tienen todas una secuencia completamente conservada en el dominio
de unión de carbohidrato de la MLHR, aunque el grado de homología en
estos residuos y en otras posiciones es evidente. Las lectinas
conocidas pertenecientes a la familia de tipo C presentan un margen
de especificidades de unión a azúcares, incluyendo los
oligosacáridos con galactosa terminal,
N-acetilglucosamina y manosa (1).
El hecho de que existan muchos residuos que son
invariantes en todas estas proteínas de unión de carbohidratos,
sugiere de forma importante que esta región funciona como un dominio
de unión de carbohidrato en la MLHR y explica aparentemente la
capacidad observada de los linfocitos para unirse al endotelio
especializado del tejido linfoide, dependiendo su unión al azúcar
de la presencia de calcio. En algunas realizaciones, en la práctica
de la presente invención se utiliza el dominio de unión de
carbohidrato de la LHR sólo, sin ninguna región flanqueante.
El próximo motivo (residuos
160-193) que se halla casi inmediatamente después
del dominio de unión de carbohidrato muestra un elevado grado de
homología con la familia de factores de crecimiento epitelial
(egf). La Figura 6B muestra las homologías con el factor de
crecimiento epitelial (egf): MLHR, secuencia de MLHR; Notch
(38,5%), locus notch de Drosophila melanogaster (15);
S. purp (31,7%), proteína semejante al egf de Strongylocentrotur
purpuratus (16); Pro.Z (34,1%), proteína Z bovina (17); Fact. X
(34,2%), factor de coagulación X (18); Fact. VII (27,3%), factor
VII de coagulación (19); Fact. IX (33,3%), factor IX de coagulación
(20); Lin-12 (32,1%), locus Lin-12
de Caenorhabditis elegans (21); Fact. XII (26%), factor de
coagulación XII (22); y Mu.egf (30%), egf murino (23).
Como se puede ver en la Figura 6B, el mayor
grado de homología en esta región de la MLHR se halló con el locus
neurogénico de Drosophila, notch, aunque también existe
homología significativa con otros miembros de esta gran familia. La
localización variable de este dominio entre los miembros de esta
familia sugiere que esta región puede estar contenida dentro de un
segmento genómico que puede hallarse en proteínas diferentes para
funciones distintas.
Además de los 6 residuos de cisteína, por
término general todos los miembros de esta familia comparten tres
residuos de glicina. La conservación de los residuos de cisteína y
glicina es consistente con la posibilidad de un papel estructural
para esta región en la LHR. Se cree que este dominio puede colocar
el extremo N-terminal localizado en la región de
unión de carbohidrato en una orientación adecuada para la
interacción con el ligando. Además se cree que este dominio puede
servir para reforzar la interacción entre el linfocito y el
endotelio mediante la unión con un homólogo del receptor de egf
sobre una superficie endotelial.
El motivo de la proteína final en la región
extracelular de la MLHR está codificado por los aminoácidos 197 a
328. Esta región de la glicoproteína contiene dos repeticiones
directas de una secuencia de 62 residuos que contiene un motivo
aminoacídico con elevada homología con diversas proteínas de unión
del factor del complemento (Figura 6C).
La Figura 6C muestra las homologías de la
proteína de unión al complemento: MLHR, secuencia de MLHR; HuComH
(31,9%), precursor H de la proteína del complemento humana (24);
MuComH (28,9%), precursor H de la proteína del complemento murina
(25); HuBeta (25,6%), glicoproteína I beta-2 humana
(26); HuCR1 (29,9%), CR1 humana (27); EBV/3d (25,6%), receptor del
virus de Epstein-Barr humano/Cd3 (28); HuC2 (27,1%),
precursor del complemento humano (29); HuB (23,1%), factor B del
complemento humano (30); MuC4b (22%), precursor de unión de C4b
murino (31); HuC1s (29,2%), zimógeno C1s humano (32); HuC4b (26,1%),
proteína de unión a C4b humana (33); HuDAF (27,1%), factor de
deceleración humana (34); VacSecP (26,2%), péptido secretor del
virus vaccinia (35).
Estas proteínas, que codifican un amplio margen
de múltiplos de este dominio repetido, incluyen, entre otras, los
precursores del complemento H humano y murino, la glicoproteína beta
2 humana, el receptor del virus de Epstein Barr/Cd3, la proteína de
unión de C4b humana, el factor de deceleración y el polipéptido
secretor del virus vaccinia.
La Figura 7C muestra las homologías entre las
dos repeticiones directas halladas en la MLHR y en las halladas en
las proteínas incluidas en la familia de unión al complemento.
Muchos de los aminoácidos que están conservados en esta clase de
proteínas de unión al complemento, incluyendo diversos residuos de
cisteína conservados, también se hallan en las dos repeticiones en
esta región de la MLHR.
Es interesante remarcar, que las dos
repeticiones contenidas dentro de la MLHR no son sólo duplicaciones
exactas una de otra a nivel aminoacídico, sino que también muestran
homología exacta a nivel de secuencia nucleotídica (residuos
nucleotídicos 685-865 y 866-1056).
Aunque es posible que este resultado sea debido a un artefacto de
clonaje, se halló una región duplicada en varios otros clones
aislados separadamente de una librería de ADNc producida a partir
de la línea celular que expresa la MLHR, 38C13 (disponible por la
Universidad de Stanford, Palo Alto, California, U.S.A.), así como en
una homóloga humana de la MLHR (que se discute más adelante).
Además, varios genes, principalmente el gen Lp(a), muestran
un elevado nivel de conservación de la secuencia de repetición
intragénica de este dominio. Estos resultados sugieren que la MLHR,
al igual que otros miembros de la familia de unión al complemento,
contiene múltiples repeticiones de este dominio de unión.
En conclusión, parece ser que la región
extracelular de la MLHR contiene tres motivos proteicos separados
que se han unido para brindar una nueva función o funciones. En la
Figura 7 se muestra un resumen de los motivos proteicos dentro de
esta glicoproteína.
\vskip1.000000\baselineskip
En general, el clonaje de HuLHR se realizó como
en el ejemplo descrito anteriormente. Se aisló el inserto EcoR1 de
2,2 Kb del clon de ADNc del antígeno de Mel 14 murino descrito
anteriormente, se marcó mediante síntesis "random primed" con
la ADN polimerasa y trifosfatos marcados con P^{32} a elevada
actividad específica y se utilizó para rastrear los 600.000 clones
de una librería de ADNc en lambda gt10 cebada con oligo dT y
obtenida a partir del mRNA de linfocitos de sangre periférica. Los
filtros se hibridaron durante toda la noche a 42ºC con formamida al
40%, 5XSSC (1XSSC es NaCl 30 mM, citrato trisódico 3 mM), fosfato
sódico 50 mM (pH 6,8), sulfato de dextrano al 10%, solución de 5X
Denhardt y 20 \mug/ml de ADN de esperma de salmón troceado y
desnaturalizado. Los filtros se lavaron 2X40 min en 0,2XSSC, sodio
dodecil sulfato al 0,1% a 55ºC. Se repicaron 12 clones
(aproximadamente 1 positivo por cada placa de 50.000 fagos), y se
aisló el inserto EcoR1 mayor (2,2 Kb) y se determinó la secuencia
del ADN mediante secuenciación con dideoxinucleótidos en el
bacteriófago m13 utilizando cebadores específicos de secuencia.
Este clon de 2,2 Kb codificaba para un marco de
lectura abierto de 372 aminoácidos con un peso molecular de
aproximadamente 42.200 daltons que se iniciaba con una metionina
precedida por una homología con la caja Kozak. La proteína
codificada contenía 26 residuos de cisteína y 8 sitios de
N-glicosilación potenciales. Una región altamente
hidrofóbica en el extremo N-terminal de la proteína
(residuos 20-33) fue una secuencia señal potencial,
mientras que otra región altamente hidrofóbica localizada en el
extremo C-terminal de 22 aminoácidos de longitud
(residuos 335-357) fue una parada de transferencia
potencial o dominio de anclaje de membrana. Esta región hidrofóbica
en el extremo C-terminal estaba seguida por una
región cargada, presumiblemente citoplasmática.
La comparación de la secuencia nucleotídica de
este clon humano con la hallada previamente para la MLHR mostró un
elevado grado de homología de secuencia de ADN (83%). Los grados
relativos de conservación de secuencia aminoacídica entre la MLHR y
la HuLHR en cada uno de los dominios de la LHR son: 83% para el
dominio de unión de carbohidrato; 82% para el dominio semejante a
egf; 79% para la repetición 1 de unión del complemento; 63% para la
repetición 2 de unión del complemento; 71% para el dominio de unión
del complemento en general; y 96% para el dominio
transmembrana.
La comparación de la secuencia Hermes publicada,
Jalkanen, supra con la secuencia HuLHR de la Figura 1
muestra una falta de homología de secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de comprobar de forma concluyente que
el clon de ADNc murino aislado aquí codificaba para la MLHR, se
insertó el clon en un vector de expresión y se analizó en un ensayo
de transfección celular transitoria. La expresión de la HuLHR se
realizó de forma similar.
El fragmento EcoR1 que contenía el marco de
lectura abierto descrito anteriormente (fragmento EcoR1 de 2,2 Kb
cuya secuencia se muestra en la Figura 2) se aisló y se ligó en el
vector pRK5 que contiene un promotor de citomegalovirus (Eaton, D.,
et al., Biochemistry 25:8343-8347, 1986;
patente europea EP 307247 publicada el 15 de marzo de 1989). Se
seleccionó un plásmido que contenía el ADNc insertado en la
orientación correcta relativa al promotor y se transfectó en las
células renales embrionales humanas 293 utilizando el método de la
precipitación con CaPO_{4}.
Al cabo de dos días las células se incubaron con
500 microcuries de cisteína S^{35} y metionina S^{35}. Se
prepararon los lisados y los sobrenadantes como se describió
previamente (Lasky, L., et al., Cell,
50:975-985, 1987) y se inmunoprecipitaron con el
anticuerpo monoclonal Mel 14 (purificado mediante cromatografía de
inmunoafinidad) utilizando un anticuerpo policlonal IgG
anti-rata en un sándwich entre el anticuerpo
monoclonal Mel 14 y la proteína A Sepharose.
Al mismo tiempo, el linfoma de células B, 38C13,
una línea celular que expresa la MLHR, se marcó metabólicamente con
metionina o cisteína, para el análisis de la MLHR del sobrenadante,
o se marcaron las glicoproteínas de superficie celular con
I^{125} y lactoperoxidasa para el análisis de la LHR asociada a
células, y se analizaron mediante inmunoprecipitación con el
anticuerpo Mel 14.
Los inmunoprecipitados resultantes se analizaron
en geles de poliacrilamida al 7,5% y SDS y se autoradiografiaron
durante toda la noche a -70ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de estos ensayos se muestran en
la Figura 5. En dicha figura, los carriles A-F
corresponden a lo siguiente:
- A. Lisados de células 293 transfectadas con un
plásmido de expresión de MLHR, e imunoprecipitadas con el
anticuerpo monoclonal Mel 14.
- B. Sobrenadantes de células 293 transfectadas
con un plásmido de expresión de MHLR, e inmunoprecipitadas con el
anticuerpo monoclonal Mel 14.
- C. Lisados de células 293 transfectadas con un
plásmido que expresa la glicoproteína de cubierta gp120 de VIH e
imunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14.
- D. Sobrenadantes de células 293 transfectadas
con un plásmido de expresión de la cubierta de VIH e
inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14.
- E. Sobrenadantes de las células 38C13
inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14.
- F. Lisados de las células 38C13 marcadas en la
superficie con I^{125} e inmunoprecipitadas con el anticuerpo
monoclonal Mel 14.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se puede ver en la Figura 5, las células
transfectadas con esta construcción producen dos proteínas
asociadas a células que reaccionan de forma específica con el
anticuerpo Mel 14. Las proteínas asociadas a células migraron a
aproximadamente 70.000 daltons y 85.000 daltons, lo que sugiere que
la proteína del core de 42.000 daltons se glicosila en las células
transfectadas. Tras el tratamiento con sialidasa, la banda mayor
sufrió un desplazamiento en su peso molecular (resultados no
mostrados), lo que sugiere que es una forma relativamente madura de
la glicoproteína, mientras que la banda de menor peso molecular fue
resistente a la enzima, lo que indicaba que podía ser una forma
precursora.
El análisis por FACS de las líneas celulares
transfectadas con el anticuerpo Mel 14 mostró que una parte de la
LHR expresada en dichas células se detectaba es la superficie
celular (resultados no mostrados).
Se observó que la glicoproteína de mayor peso
molecular producida en la línea celular transfectada era
ligeramente menor que la producida por el linfoma de células B de
localización en nódulo linfático periférico, 38C13 (Figura 5,
carril F), un resultado que ya se había observado con otras líneas
celulares transfectadas y que puede ser debido a diferencias
celulares específicas en la glicosilación.
Es interesante remarcar que las células 38C13 y
las células humanas transfectadas secretan en el medio una forma de
MLHR de menor peso molecular (Figura 5, carriles B y E). La
naturaleza de esta molécula secretada es incierta, aunque su peso
molecular reducido sugiere que puede ser un producto de hidrólisis
de la forma proteica de superficie celular que resulta de la
proteolisis cerca del anclaje de membrana.
En conclusión, estos resultados demuestran de
forma convincente que el clon de ADNc que se había aislado codifica
la MLHR.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 8 muestra la construcción de quimeras
de MLHR-IgG que contienen la lectina,
lectina-egf y
lectina-egf-motivos reguladores del
complemento. La parte superior de la figura muestra los dominios
proteicos del receptor de localización de linfocitos murinos (MLHR)
incluyendo la secuencia señal del extremo N-terminal
(SS), la lectina, el factor de crecimiento epitelial (egf) y los
dominios reguladores del complemento (CDB) así como también un
dominio de anclaje transmembrana (TMD) y una secuencia corta
citoplasmática. Las tres quimeras MLHR-IgG
truncadas que contienen la lectina (MLHR-L+IgG), la
lectina y el egf (MLHR-LE+IgG) y la lectina, egf y
dos motivos reguladores del complemento
(MLHR-LEC+IgG) también se muestran en la Figura 8.
Todas estas proteínas truncadas están unidas a una región de cadena
pesada de gamma 1 humana justo cadena arriba del dominio bisagra
(H), de modo que tales quimeras contienen los dos residuos cisteína
(C) de la bisagra responsables de la dimerización de la
inmunoglobulina así como también de las regiones constantes CH2 y
CH3. Se utilizó una caja de región constante de cadena pesada de
IgG1 humana caracterizada previamente (Capone et al.,
supra, 1989). Los sitios de unión entre las secuencias de LHR
e IgG humana se eligieron de modo que la unión de las moléculas
cerca de la región bisagra diera como resultado moléculas quiméricas
que se sintetizaran y dimerizaran de forma eficiente en la ausencia
de producción de cadena ligera. Además, la utilización de la región
constante de IgG1 humana obvia cualquier dificultad debida a la
reactividad cruzada con IgGs murinas endógenas en los experimentos
inmunohistoquímicos descritos más adelante.
Como se puede ver a partir de la figura 9, estas
quimeras se sintetizaron y secretaron de forma eficiente en estos
ensayos de transfección transitoria. La reactividad de estas
quimeras con la proteína A sepharose en ausencia de anticuerpos
añadidos demuestra que los dominios de la región constante se
pliegan normalmente. La Figura 9 muestra que estas moléculas se
dimerizan en condiciones no reductoras, lo que demuestra que la
región bisagra es completamente funcional en estas quimeras. Por
último, la reactividad de la proteína A también permite la
purificación casi homogénea de estas quimeras en columnas de
proteína A sepharose. Los resultados presentes demuestran la
producción de entidades semejantes a anticuerpos, cuyo dominio
"variable", se puede decir, deriva de la MLHR mientras que el
dominio constante deriva de la cadena pesada de la IgG gamma 1
humana.
Se inició con un plásmido de expresión
MLHR-PRK5 descrito anteriormente (Eaton et
al., 1986; Lasky et al., Cell
50:975-985, 1987) y una copia de ADNc de una cadena
pesada de IgG humana (Capon et al., Nature
337:525-531, 1989). Un fragmento HindIII de 1.100 pb
que codifica las regiones CH1-CH3 de la región
constante de IgG1 humana se insertó en 3' del sitio poliA del ADNc
de MLHR. Este plásmido se convirtió en un molde de cadena sencilla
utilizando un origen de replicación de m13 y el fago auxiliar K07,
después de lo cual las regiones entre la bisagra y la lectina, egf
y la segunda repetición de unión del complemento
N-terminal a la región de anclaje transmembrana
putativa, se eliminaron mediante formación y escisión de un bucle
por mutagénesis in vitro utilizando oligonucleótidos de
48-mer (Zoller y Smith, 1982). Los mutantes
resultantes se rastrearon con oligonucleótidos de 21 mer marcados
con P^{32} abar-
cando las junturas de la deleción, y se secuenciaron los mutantes aislados mediante secuenciación de cadena doble.
cando las junturas de la deleción, y se secuenciaron los mutantes aislados mediante secuenciación de cadena doble.
Se analizaron los mutantes correctos para
conocer su expresión mediante transfección en células 293 renales
humanas mediante la utilización de los procedimientos descritos
anteriormente. Se analizaron los sobrenadantes marcados con
metionina y cisteína marcados con S^{35} mediante
inmunoprecipitación con bolas de proteína A sepharose en ausencia
de anticuerpos añadidos. Las proteínas precipitadas se analizaron en
geles de poliacrilamida al 7,5% y SDS con o sin reducción por beta
mercaptoetanol. Los plásmidos que dieron como resultado quimeras
expresadas correctamente se introdujeron en células 293 mediante
transfección en presencia de plásmidos de selección que codificaban
para la resistencia a G418 así como la dihidrofolato reductasa. Los
clones se seleccionaron en G418 y los plásmidos incorporados se
amplificaron en presencia de metotrexato. Las líneas celulares
estables que expresaban niveles elevados de cada construcción se
crecieron a gran escala en frascos de cultivo T y los sobrenadantes
celulares se clarificaron mediante centrifugación y filtración. Los
sobrenadantes resultantes se concentraron mediante filtración en
Amicon y se pasaron por columnas de proteína A sepharose, se lavaron
con PBS y se eluyeron con ácido acético 0,1 M, NaCl 0,15 M (pH
3,5). El material eluido se neutralizó inmediatamente con Tris 3 M,
pH 9 y se cuantificó mediante electroforesis en gel con SDS así como
también en un ensayo ELISA.
Los resultados de la electroforesis en gel
descritos en el párrafo anterior se muestran en la Figura 9. Las
proteínas reducidas se muestran en los carriles A-F,
las proteínas no reducidas en los carriles G-I y
las proteínas purificadas en los carriles J-L. Los
pesos moleculares de marcadores se muestran en kilodaltons. Los
carriles se indentificaron de la forma siguiente: A.
MLHRLEC-IgG secretada, B.
MLHRLEC-IgG intracelular, C.
MLHRLE-IgG secretada, D. MLHRLE-IgG
intracelular, E. MLHRL-IgG secretada, F.
MLHRL-IgG intracelular, G.
MLHRLEC-IgG secretada, H. MLHRLE-IgG
secretada, I. MLHRL-IgG secretada, J.
MLHRLEC-IgG purificada, K.
MLHRLE-IgG purificada y L.
MLHRL-IgG purificada.
Las quimeras LHR-IgG aisladas se
cuantificaron utilizando un formato ELISA que consistía de pocillos
de microtitulación recubiertos con un anticuerpo monoclonal de ratón
específico anti-IgG 1 humana. Se incubaron las
muestras desconocidas y el estándar de inmunoadhesión
CD4-IgG1 humano altamente purificado con las placas
recubiertas de anticuerpo, después se lavaron las placas y el
material unido se hizo reaccionar con anticuerpo de cabra
anti-IgG1 humana conjugado a peroxidasa de rábano,
se prosiguió por diversos lavados y adición de sustrato. Este
ensayo cuantitativo permitió la cuantificación de cantidades del
orden de subnanogramos de las quimeras LHR-IgG
aisladas.
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de diversas quimeras para reconocer
el carbohidrato de pared celular de levaduras, éster de
polifosfomanano o PPME se analizó mediante un formato ELISA tal como
se describió anteriormente (Imae et al., 1989). Brevemente,
se recubrieron pocillos de microtitulación con cantidades
aproximadamente equivalentes de quimeras purificadas, durante toda
la noche a 4ºC. Los sitios no específicos se bloquearon con BSA,
después de lo cual los antígenos unidos se hicieron reaccionar con
5 \mug por ml de una solución de PPME. El carbohidrato unido se
detectó con un anticuerpo policlonal dirigido contra éste y mediante
reactivos estándares de tinción inmunohistoquímica (Vector). La
inhibición con Mel 14 se realizó mediante preincubación de los
pocillos que contenían MLHRLEC-IgG con el
anticuerpo monoclonal antes de la adición de PPME, mientras que la
dependencia de calcio de la interacción receptor de
localización-carbohidrato se demostró mediante la
inclusión de EGTA 10 mM durante la reacción de unión. En los
ensayos para examinar la inhibición se añadieron diversos otros
aditivos antes de la incubación con PPME. Al cabo de 1 h a 22ºC, las
placas se lavaron e incubaron con un anticuerpo policlonal de
conejo dirigido contra el PPME durante 1 h a 22ºC. Las placas se
lavaron e incubaron con
Vector-ABC-AP durante 30 min, se
lavaron y revelaron. Los ensayos resultantes se cuantificaron en un
lector de placas. Los carbohidratos utilizados en los ensayos
inhibitorios se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis,
MO.).
Los resultados de la unión con PPME se muestran
en la Figura 10. Los carriles contienen las siguientes quimeras
MLHR-IgG: A. unión de PPME con quimeras MLHRL-,
MLHRLE- y MLHRLEC-IgG. B. Inhibición de la unión de
MLHRLEC-IgG-PPME con el anticuerpo
monoclonal Mel 14 y EGTA. C. Inhibición de la unión de
MLHRLEC-IgG-PPME con otros
carbohidratos.
Trabajos anteriores habían demostrado que la LHR
era capaz de unirse a un manano, éster de fosfomanano o PPME de
pared celular de levadura (Yednock et al., J. Cell Biol.,
104:725-731, 1987), y por ello esta unión inhibía
la capacidad de los linfocitos de adherirse a vénulas endoteliales
altas de nódulos linfáticos periféricos, de acuerdo con la
suposición de que el dominio de lectina de LHR del nódulo linfático
periférico puede reconocer un carbohidrato en el endotelio del
nódulo linfático periférico. Además, se halló que el anticuerpo Mel
14 inhibía la unión de PPME con la superficie del linfocito
(Yednock et al., supra, 1987), lo que era consistente
con la noción de que este carbohidrato se unía dentro del dominio de
lectina de la LHR del nódulo linfático periférico.
Se halló que la quimera que se unía al PPME era
la que contenía la lectina, el egf y las estructuras de repetición
de unión del complemento duplicadas. Esta unión era inhibida por el
anticuerpo Mel 14, de acuerdo con los resultados que demostraban
que la quimera MLHRLEC-IgG era reconocida por este
anticuerpo (resultados no mostrados), y era comparable
cuantitativamente con la hallada previamente utilizando la MLHR
aislada a partir de células del bazo (Imai et al., enviado a
publicación, 1989), lo que sugiere que dicha unión representa la
misma interacción proteína-carbohidrato que se había
hallado con la LHR en la superficie de linfocitos (Yednock et
al., supra, 1987). Además, se halló que la unión era
dependiente de calcio (Stoolman y Rosen, J.Cell. Biol.
96:722-729), lo que implicaba que el dominio de
lectina dependiente de calcio o de tipo C (Drickamer, J. Biol.
Chem, 263:9557-9560, 1988) era al menos responsable
de esta interacción, como se había mostrado para el receptor
asociado de linfocitos (figura 9b).
Trabajos anteriores habían demostrado que
diversos carbohidratos además del PPME eran capaces de ser
reconocidos por la MLHR derivada del bazo (Yednock et al.,
supra; Imai et al., supra, 1989). Estos
incluyen la fucoidina, sulfato de dextrano y sulfatidas derivadas
del cerebro. Se examinó la capacidad de estos carbohidratos para
inhibir la interacción entre la quimera MLHRLEC-IgG
y el PPME con el fin de investigar la especificidad de esta
molécula versus la glicoproteína derivada del bazo descrita
anteriormente (Imai y col, supra, 1989). Como se puede ver
en la figura 9, la fucoidina, el sulfato de dextrano y la sulfatida
son capaces de inhibir la interacción entre el PPME y la
MLHRLEC-IgG, lo que implica que la especificidad
del carbohidrato de esta proteína derivada recombinante mimetiza la
anteriormente descrita para la proteína natural. La falta de
inhibición provocada por los otros dos carbohidratos cargados,
condroitín sulfato y heparina, sugiere que la inhibición es debida
al reconocimiento específico del carbohidrato y no a la
interferencia inespecífica debida a la naturaleza altamente cargada
de los componentes.
El ensayo bloqueante de células de
Stampfer-Woodruff (Stampfer y Woodruff, J. Exp.
Med. 144:828-833, 1976) se realizó con secciones de
cortes con criostato de nódulos linfáticos periféricos de ratón, así
como también con las placas de Peyer como se describió
anteriormente (Geoffrey Rosen, J. Cell Biol., en publicación,
1989). Brevemente, las secciones de tejido congelado se incubaron
con linfocitos mesentéricos en presencia de quimeras
MLHR-IgG, MLHR derivadas de bazos aislados, o sólo
con tampón. Las quimeras MLHR-IgG se incluyeron en
concentraciones tan elevadas como 10 \mug por sección y se
preincubaron en secciones congeladas antes de la adición de 1 x
10^{7} células por ml. Los portaobjetos se lavaron, y se
cuantificó la unión de los linfocitos mediante morfometría digital
como el número de linfocitos unidos a HEV en estos órganos linfoides
por unidad de área.
En resultados no mostrados, se halló que la
quimera MLHRLEC-IgG inhibía la unión de linfocitos
con HEV del nódulo linfático periférico a un nivel de inhibición de
aproximadamente el 75% mientras que, en este ensayo, la MLHR
derivada del bazo bloqueaba a un nivel de aproximadamente el 50%.
Esta inhibición era dependiente de calcio y era bloqueada por la
inclusión del anticuerpo monoclonal Mel 14 (resultados no
mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron quimeras MLHR-IgG
aisladas para experimentos inmunohistoquímicos utilizando
procedimientos idénticos a los descritos para los anticuerpos
monoclonales. Secciones de 8-10 micras de tejido se
cortaron en un criostato y se fijaron con cacodilato 0,1 M,
paraformaldehído al 1% durante 30 minutos a 4ºC. Las secciones se
lavaron con PBS de Dulbecco y se tiñeron con cantidades variables de
la quimera MLHR-IgG en suero de ratón normal al 5%
a 4ºC durante 30 min. Luego, se lavaron las secciones y se incubaron
en una segunda etapa con un anticuerpo específico Fc
anti-humano de cabra biotinilado (Vector). La
peroxidasa endógena se eliminó mediante tratamiento de las
secciones con peróxido de hidrógeno-metanol después
de la adición del reactivo de la segunda etapa y antes de la
adición del complejo Vector ABC. Las secciones se lavaron e
incubaron con el sustrato (AEC) durante 5-10
minutos. Por último, las secciones se contrastaron con tinción de
hematoxilina acuosa (Biomedia) y se visualizaron con un Zeiss
Axiophot.
Estos análisis inmunohistoquímicos de las tres
quimeras MLHR-IgG utilizaron nódulos linfáticos
periféricos como fuente de tejido. La elección del nódulo linfático
periférico como fuente histológica fue dictada por la amplia
bibliografía al respecto que demostraba que los linfocitos se unen a
las HEV de este tejido linfoide de manera que la unión pueda ser
bloqueada por Mel-14, lo que implicaba que el mayor
nivel de ligando reconocido por la MLHR debería hallarse en este
tejido (Gallatin et al., Nature, 304:30-34,
1983). La quimera MLHRLEC-IgG fue capaz de teñir
las HEV del nódulo linfático periférico. La tinción se halló
exclusivamente sobre las células del endotelio altamente tabicado,
sin que se tiñeran otras regiones ad- o abluminales. Además esta
tinción podía bloquearse por el anticuerpo Mel 14 y era dependiente
de la presencia de calcio, lo que sugiere que la unión de
MLHRLEC-IgG con las HEV del nódulo linfático
periférico mimetiza la adhesión entre los linfocitos y las HEV. De
acuerdo con los resultados de unión con PPME, la tinción de HEV del
nódulo linfático periférico por MLHRLEC-IgG se
podía inhibir por la fucoidina y el sulfato de dextrano (figura 5),
mientras que el condroitín sulfato y los mananos sencillos eran
incapaces de inhibir la reacción de tinción (resultados no
mostrados), lo que implica de nuevo que la reacción de tinción era
debida al reconocimiento de un ligando del carbohidrato expresado
en las HEV del nódulo linfático periférico. Estos resultados ponen
de manifiesto que este tipo de reactivo inmunohistoquímico puede
utilizarse para analizar la distribución de la molécula(s)
endotelial capaz de interaccionar con la LHR del nódulo linfático
periférico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se halló, en los resultados de los ensayos
inmunohistoquímicos no mostrados, que la quimera
MLHRLEC-IgG es, sorprendentemente, capaz de
reconocer específicamente del endotelio de las placas de Peyer. La
quimera parece teñir el endotelio altamente tabicado de los vasos
de las placas de Peyer que contienen linfocitos. Esta tinción es
inhibida por el anticuerpo Mel 14 y también es dependiente de
calcio. Es interesante resaltar que la tinción de HEV de las placas
de Peyer de parece algo más débil en relación con la hallada para la
tinción de HEV del nódulo linfático periférico, lo que implica que
en este órgano linfoide se expresa un nivel inferior de
ligando(s) de MLHR. Estos resultados demuestran que, aunque
otros sistemas de adhesión puedan estar implicados en este órgano
(Holzman et al., Cell, 56:37-46, 1989), el
ligando(s) para la LHR del nódulo linfático periférico se
expresa y, por ello, está implicado en la unión de linfocitos con el
endotelio de este órgano linfoide.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Drickamer, K., J. Biol. Chem.,
263, 9557 (1988); Dricakmaer, K., Kidney Int.,
32, S167 (1987).
2. Spiess, M., et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 82:6465 (1985).
3. Muramoto, K., et al.,
Biochem. Biophys. Acta 874:285 (1986).
4. Leung, J., et al., J. Biol.
Chem. 260:12523 (1985); Holland, E., et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:7388
(1984).
5. Drickamer, K., J. Biol. Chem.
256:5827 (1981).
6. Kikutani, H., et al.,
Cell 47:657 (1986).
7. McPhaul, M., et al., Molec.
Cell Biol. 7:1841 (1987).
8. Halberg, D., et al., J.
Biol. Chem., 262:9828 (1987).
9. Terzaono, K., et al., J.
Biol. Chem., 263:2111 (1988).
10. Drickamer, K., J. Biol. Chem.,
262:2582 (1987).
11. Drickamer, K., J. Biol. Chem.,
261:6878 (1986).
12. Hoyle, G., et al., J. Biol.
Chem., 263:7487 (1988).
13. Takahashi, H., et al., J.
Biol. Chem., 260:12228 (1985).
14. Boggaram, V., et al., J.
Biol. Chem., 263:2939 (1988).
15. Kidd, S., et al., Mol. Cell
Biol. 6:3094 (1986).
16. Hursh, D., et al.,
Science, 237:1487 (1987).
17. Hojrup, P., et al., FEBS
Lett. 184:333 (1985).
18. Fung, M., et al.,
Nucl.Acids. Res. 12:4481 (1984).
19. Takeya, H., et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 76:4990 (1979).
20. McMullen, B., et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 115: 8 (1983).
21. Greenwald, I., Cell, 43:583
(1985).
22. Cool, D., et al., Biol.
Chem., 260:13666 (1985).
23. Gray, A., et al.,
Nature, 303:722 (1983).
24. Schulz, T., et al., Eur. J.
Immunol., 16:1351 (1986).
25. Kristensen, T., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83:3963 (1986).
26. Lozier, J., et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., USA., 81:3640 (1984).
27. Bentley, D., Biochem. J.,
239:339 (1986).
28. Moore, M., et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 84:9194 (1987).
29. Bentley, D., Proc. Natl. Acad.
Sci., USA 81:1212 (1984).
30. Mole, J., et al., J. Biol.
Chem., 263:549 (1988).
31. DiScipio, R., et al., J.
Biol. Chem., 263:549 (1984).
32. Kusomoto, H., et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 85:7307 (1988).
33. Lintin, S., et al., FEBS
Lett., 204:77 (1986).
34. Caras, I., et al.,
Nature, 325:545 (1987).
35. Kotwat, G., et al.,
Nature, 335:176 (1988).
\vskip1.000000\baselineskip
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una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se
pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes
declina cualquier responsabilidad al respecto.
\bullet EP 0173494 A [0004] [0005]
\bullet EP 0126023 A [0004]
\bullet EP O0325224 A2 [0006] [0048]
\bullet WO 8008953 A [0029]
\bullet US 4745055 A [0040]
\bullet EP 256854 A [0040]
\bullet EP 120694 A [0040]
\bullet EP 125023 A [0040]
\bullet EP 255694 A [0040]
\bullet EP 266663 A [0040]
\bullet WO 8603559 A [0040]
\bullet US 4444878 A [0040]
\bullet WO 8803565 A [0040]
\bullet EP 68763 A [0040]
\bullet EP 0125023 A [0048]
\bullet US 3959080 A [0082]
\bullet US 3969287 A [0082]
\bullet US 3691016 A [0082]
\bullet US 4195128 A [0082]
\bullet US 4247642 A [0082]
\bullet US 4229537 A [0082]
\bullet US 4055635 A [0082]
\bullet US 4330440 A [0082]
\bullet US 4179337 A, Davis [0096]
\bullet US 4002531 A, Royer [0096]
\bullet EP 36776 A [0108]
\bullet EP 73657 A [0111]
\bullet US 3773919 A [0130]
\bullet EP 58481 A [0130]
\bullet DE 3218121 A [0130]
\bullet EP 52322 A [0130]
\bullet EP 36676 A [0130]
\bullet EP 88046 A [0130]
\bullet EP 143949 A [0130]
\bullet EP 142541 A [0130]
\bullet JP 58011808 A [0130]
\bullet US 4485045 A [0130]
\bullet US 4544545 A [0130]
\bullet US 102342 A [0130]
\bullet EP 307247 A [0182]
\bulletMUNRO. Nature, 13
December 1984, vol. 312 [0004] [0048]
\bulletNEUBERGER. Nature, 13
December 1984, vol. 312 [0004]
\bulletSHARON et al.
Nature, 24 May 1984, vol. 309 [0004] [0048]
\bulletMORRISON et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81,
6851-6855 [0004] [0048]
\bulletMORRISON et al.
Science, 1985, vol. 229, 1202-1207
[0004] [0048]
\bulletBOULIANNE et al.
Nature, 13 December 1984, vol. 312,
843-646 [0004]
\bulletMORRISSON et al.
Science, 1985, vol. 229, 1202-1207
[0005]
\bulletCAPON. Nature,
1989, vol. 337, 525-531 [0006]
\bulletTRAUNECKER et al.
Nature, 1989, vol. 339, 68-70
[0006]
\bulletGASCOIGNE et al.
Proc. Nat. Acad. Sci., 1987, vol. 84,
2936-2940 [0006] [0048]
\bulletBUTCHER, E. C. Curr. Top.
Micro. Immunol., 1986, vol. 128, 85 [0008]
\bulletGALLATIN, W. M. et al.
Cell, 1986, vol. 44, 673 [0008]
\bulletWOODRUFF, J. J. et al.
Ann. Rev. Immunol., 1987, vol. 5, 201 [0008]
\bulletDUIJVESTIJN, A. et al.
Immunol. Today, 1989, vol. 10, 23 [0008]
\bulletYEDNOCK, T. A. et al.
Adv. Immunol, 1989 [0008]
\bulletGALLATIN, W. M. et al.
Nature, 1983, vol. 303, 30 [0011]
\bulletRASMUSSEN, R. A. et al.
J. Immunol., 1985, vol. 135, 19 [0011]
\bulletCHIN, Y. H. et al. J.
Immunol., 1986, vol. 136, 2556 [0011]
\bulletJALKANEN, S. et al.
Eur. J. Immunol., 1986, vol. 10, 1195 [0011]
\bulletMOUNTZ, J. D. et al.
J. Immunol., 1988, vol. 140, 2943 [0011]
\bulletLEWINSOHN, D. M. et al.
J. Immunol., 1987, vol. 138, 4313 [0011]
\bulletSIEGELMAN, M. et al.
Science, 1986, vol. 231, 823 [0011]
\bullet ST. JOHN, T. et al.
Science, 1986, vol. 231, 845 [0011]
\bulletSIEGALMAN, M. et al.
Science, 1986, vol. 231, 823 [0013]
\bulletPAULSON, J. C. The Receptors.
Academic Press, 1985, vol. 2, 131 [0014]
\bulletSHARON, N. FEBS Lett.,
1987, vol. 217, 145 [0014]
\bulletGRABEL, L. et al.
Cell, 1979, vol. 17, 477 [0014]
\bulletFENDERSON, B. et al.
J. Exp. Med., 1984, vol. 160, 1591 [0014]
\bulletKUNEMUND, V. J. Cell
Biol., 1988, vol. 106, 213 [0014]
\bulletBISCHOFF, R. J. Cell
Biol., 1986, vol. 102, 2273 [0014]
\bulletCROCKER, P. R. et al.
J. Exp. Med., 1986, vol. 164, 1862 [0014]
\bulletGLABE, C. G. et al.
J. Cell. Biol., 1982, vol. 94, 123 [0014]
\bulletDEANGELIS et al. J.
Biol. Chem., 1987, vol. 262, 13946 [0014]
\bulletBLEIL, J. D. et al.
Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 1988, vol. 85, 6778
[0014]
\bulletLOPEZ, L. C. et al.
J. Cell Biol., 1985, vol. 101, 1501 [0014]
\bulletROSEN, S. D. et al.
Science, 1985, vol. 228, 1005 [0015]
\bulletROSEN, S. D. et al.
J. Immunol., 1989 [0015]
\bulletSTOOLMAN, L. M. et al.
J. Cell Biol, 1983, vol. 96, 722 [0015]
\bulletSTOOLMAN, L. M. et al.
J. Cell Biol., 1984, vol. 99, 1535 [0015]
\bulletYEDNOCK, T. A. et al.
J. Cell Bio., 1987, vol. 104, 725 [0015]
\bulletSTOOLMAN, L. M. et al.
Blood, 1987, vol. 70, 1842 [0015]
\bulletBRANDLEY, B. K. et al.
J. Cell Biol., 1987, vol. 105, 991 [0015]
\bulletYEDNOCK, T. A. et al.
J. Cell Biol., 1987, vol. 104, 725 [0015]
\bulletJALKANEN, S. et al.
Ann. Rev. Med., 1987, vol. 38, 467-476
[0016]
\bulletJALKANEN, S. et al.
Blood, 1985, vol. 66 (3), 577-582
[0016]
\bulletJALKANEN, S. et al.
J. Cell Siol., 1987, vol. 105, 983-990
[0016]
\bulletJALKANEN, S. et al.
Eur. J. Immunol., 1986, vol. 18,
1195-1202 [0016]
\bulletDOOLITTLE, R. F. et al.
CSH Symp., 1986, vol. 51, 447 [0017]
\bulletKNAPP et al.
Immunology Today, 1989, vol. 10 (8),
253-258 [0027]
\bulletFAULKNER et al.
Nature, 1982, vol. 298, 286 [0040]
\bulletMORRISON. J. Immun.,
1979, vol. 123, 793 [0040]
\bulletKÖHLER et al.
P.N.A.S. USA, 1980, vol. 77, 2197 [0040]
\bulletRASO et al. Cancer
Ras., 1981, vol. 41, 2073 [0040]
\bulletMORRISON et al. Ann.
Rev. Immunol., 1984, vol. 2, 239 [0040]
\bulletMORRISON. Science,
1986, vol. 229, 1202 [0040]
\bulletMORRISON et al.
P.N.A.S. USA, 1984, vol. 81, 6851 [0040]
\bulletKABAT et al. Sequences
of Proteins of Immunological Interest. 1987 [0047]
\bulletCAPON et al.
Nature, 1989, vol. 337, 525-531 [0048]
[0194]
\bulletTRAUNACKER et al.
Nature, 1989, vol. 339, 68-70
[0048]
\bulletNEUBERGER et al.
Nature, 13 December 1984, vol. 312 [0048]
\bulletBOULIANNE et al.
Nature, 13 December 1984, vol. 312,
643-646 [0048]
\bulletADAMS et al.
Biochemistry, 1980, vol. 19, 2711-2719
[0050]
\bulletGOUGH. Biochemistry,
1980, vol. 19, 2702-2710 [0050]
\bulletDOLBY et al. P.N.A.S.
USA, 1980, vol. 77, 6027-6031 [0050]
\bulletRICE et al. P.N.A.S.
USA, 1982, vol. 79, 7862-7865 [0050]
\bulletFALKNER et al.
Nature, 1982, vol. 298, 286-288
[0050]
\bulletMORRISON et al. Ann.
Rev. Immunol., 1984, vol. 2, 239-256
[0050]
\bullet T.E. CREIGHTON. Proteins:
Structure and Molecular Properties. W.H. Freeman & Co,
1983, 79-86 [0084]
\bulletHEITZMANN et al.
P.N.A.S., 1974, vol. 71, 3537-3541
[0091]
\bulletBAYER et al. Methods
in Enzymology, 1979, vol. 62, 310 [0091]
\bulletBEAUCHAMP et al.
Anal. Biochem., 1983, vol. 131, 25-33
[0096]
\bulletHARRIS et al. J.
Polym. Sci., Polym. Chem. Ed., 1984, vol. 22,
341-352 [0096]
\bulletMANIATIS et al.
Molecular Cloning-A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor Laboratory, 1984 [0099]
\bulletHORVATH et al. An
Automated DNA Synthesizer Employing Deoxynucleoside
3'-Phosphoramidites. Methods in Enzymology,
1987, vol. 154, 313-326 [0099]
\bulletBOLIVAR et al.
Gene, 1977, vol. 2, 95 [0107]
\bulletCHANG et al.
Nature, 1978, vol. 275, 615 [0108]
\bulletGOEDDEL et al.
Nature, 1979, vol. 281, 544 [0108]
\bulletGOEDDEL. Nucleic Acids
Res, 1980, vol. 8, 4057 [0108]
\bullet H. DE BOER et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, vol. 80,
21-25 [0108]
\bulletSIEBENLIST et al.
Cell, 1980, vol. 20, 269 [0108]
\bulletSTINCHCOMB et al.
Nature, 1979, vol. 282, 39 [0109]
\bulletKINGSMAN et al.
Gene, 1979, vol. 7, 141 [0109]
\bulletTSCHEMPER et al.
Gene, 1980, vol. 10, 157 [0109]
\bulletJONES. Genetics,
1977, vol. 85, 12 [0109]
\bulletHITZEMAN et al. J.
Biol. Chem., 1980, vol. 255, 2073 [0110]
\bulletHESS et al. J. Adv.
Enzyme Reg., 1968, vol. 7, 149 [0110]
\bulletHOLLAND. Biochemistry,
1978, vol. 17, 4900 [0110]
\bulletFIERS et al.
Nature, 1978, vol. 273, 113 [0113]
\bulletGREENAWAY, P.J. et al.
Gene, 1982, vol. 18, 355-360
[0113]
\bulletLAIMINS, L. et al.
PNAS, 1981, vol. 78, 993 [0114]
\bulletLUSKY, M.L. et al.
Mol. Cell Bio., 1983, vol. 3, 1108 [0114]
\bulletBANERJI, J.L et al.
Cell, 1983, vol. 33, 729 [0114]
\bulletOSBORNE, T.F. et al.
Mol. Cell Bio., 1984, vol. 4, 1293 [0114]
\bulletSOUTHERN et al. J.
Molec. Appl. Genet., 1982, vol. 1, 327 [0117]
\bulletMULLIGAN et al.
Science, 1980, vol. 209, 1422 [0117]
\bulletSUGDEN et al. Mol.
Cell. Biol., 1985, vol. 5, 410-413
[0117]
\bulletGRAHAM, F.L. et al.
J. Gen Virol., 1977, vol. 36, 59 [0118]
\bulletCHO; URLAUB;
CHASIN. PNAS (USA), 1980, vol. 77, 4216
[0118]
\bulletMATHER, J.P. Biol.
Reprod., 1980, vol. 23, 243-251
[0118]
\bulletMATHER, J.P. et al.
Annals N.Y. Acad. Sci., 1982, vol. 383,
44-68 [0118]
\bulletMESSING et al.
Nucleic Acids Res., 1981, vol. 9, 309 [0120]
\bulletMAXAM et al. Methods
in Enzymology, 1980, vol. 65, 499 [0120]
\bulletGRAHAM, F.; VAN DER EB,
A. Virology, 1973, vol. 52, 456-457
[0123]
\bulletCOHEN, F.N. et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1972, vol. 69, 2110
[0123]
\bulletSIDMAN et al.
Biopolymers, 1985, vol. 22 (1),
547-556 [0130]
\bullet R. LANGER et al. J.
Biomed. Mater. Res., 1981, vol. 15,
167-277 [0130]
\bullet R. LANGER. Chem. Tech.,
1982, vol. 12, 98-105 [0130]
\bulletEPSTEIN ERAT. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 3688-3692
[0130]
\bulletHWANG et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77,
4030-4034 [0130]
\bulletGOEDDEL, D. et al.
Nucleic Acids Res., 1980, vol. 8, 4057 [0138]
\bulletMANIATIS, T. et al.
Molecular Cloning, 1982, 133-134
[0139]
\bulletGALLATIN et al.
Nature, 1983, vol. 303, 30 [0145]
\bulletLIPMAN, D. et al.
Science, 1981, vol. 227, 1435-1441
[0155]
\bulletLIPMAN, D.; PEARSON, W.
Science, 1985, vol. 227, 1435-1441
[0163]
\bulletEATON, D. et al.
Biochemistry, 1986, vol. 25, 8343-8347
[0182]
\bulletLASKY, L. et al.
Cell, 1987, vol. 50, 975-985
[0183]
\bulletLASKY et al.
Cell, 1987, vol. 50, 975-985
[0194]
\bulletYEDNOCK et al. J.
Cell Biol., 1987, vol. 104, 725-731
[0200]
\bulletSTOOLMAN; ROSEN. J.
Cell Biol., 1983, vol. 96, 722-729
[0201]
\bulletDRICKAMER. J. Biol.
Chem., 1988, vol. 263, 9557-9560
[0201]
\bulletSTAMPER; WOODRUFF. J.
Exp. Med., 1976, vol. 144, 828-833
[0203]
\bulletGEOFFREY; ROSEN. J.
Cell Biol., 1989 [0203]
\bulletGALLATIN et al.
Nature, 1983, vol. 304, 30-34
[0206]
\bulletHOLZMAN et al.
Cell, 1989, vol. 56, 37-46 [0207]
\bulletDRICKAMER, K. J. Biol.
Chem., 1988, vol. 263, 9557 [0208]
\bulletDRICKAMER, K. Kidney
Int., 1987, vol. 32, 167 [0208]
\bulletSPIESS, M. et al.
Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 1985, vol. 82, 6465
[0208]
\bulletMURAMOTO, K. et al.
Biochem Biophys. Acta, 1986, vol. 874, 285 [0208]
\bulletLEUNG, J. et al. J.
Biol. Chem., 1985, vol. 260, 12523 [0208]
\bulletHOLLAND, E. et al.
Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 1984, vol. 81, 7338
[0208]
\bulletDRICKAMER, K. J. Biol.
Chem., 1981, vol. 256, 5827 [0208]
\bulletKIKUTANI, H. et al.
Cell, 1986, vol. 47, 657 [0208]
\bulletMCPHAUL, M. et al.
Molec. Cell. Biol., 1987, vol. 7, 1841 [0208]
\bulletHALBERG, D. et al. J.
Biol. Chem., 1987, vol. 262, 9828 [0208]
\bulletTERZAONO, K. et al.
J. Biol. Chem., 1988, vol. 263, 2111 [0208]
\bulletDRICKAMER, K. et al.
J. Biol. Chem., 1987, vol. 262, 2582 [0208]
\bulletDRICKAMER, K. et al.
J. Biol. Chem., 1986, vol. 261, 6878 [0208]
\bulletHOYLE, G. et al. J.
Biol. Chem., 1988, vol. 263, 7487 [0208]
\bulletTAKAHASHI, H. J. Biol.
Chem., 1985, vol. 260, 12228 [0208]
\bulletBOGGARAM, V. et al.
J. Biol. Chem., 1988, vol. 263, 2939 [0208]
\bulletKIDD, S. et al. Mol.
Cell. Biol., 1986, vol. 6, 3094 [0208]
\bulletHURSH, D. et al.
Science, 1987, vol. 237, 1487 [0208]
\bulletHOJRUP, P. et al.
FEBS Lett., 1985, vol. 184, 333 [0208]
\bulletFUNG, M. et al. Nucl.
Acids Res., 1984, vol. 12, 4481 [0208]
\bulletTAKEYA, H. et al.
Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 1979, vol. 76, 4990
[0208]
\bulletMCMULLEN, B. et al.
Biochem Biophys, Res. Commun., 1983, vol. 115, 8
[0208]
\bulletGREENWALD, I. Cell,
1985, vol. 43, 583 [0208]
\bulletCOOL, D. et al. Biol.
Chem., 1985, vol. 260, 13666 [0208]
\bulletGRAY, A. et al.
Nature, 1983, vol. 303, 722 [0208]
\bulletSCHULZ, T. et al.
Eur. J. Immunol., 1986, vol. 16, 1351 [0208]
\bulletKRISTENSEN, T. et al.
Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 1986, vol. 83, 3963
[0208]
\bulletLOZIER, J. et al.
Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 1984, vol. 81, 3640
[0208]
Claims (2)
1. Dímero de cadena pesada de inmunoglobulina,
en el que una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión al
ligando que es una cadena única y es un receptor que no es miembro
de la superfamilia de genes de inmunoglobulina o una proteína
homóloga al mismo y no es un polipéptido de múltiples subunidades
codificado por genes discontinuos, se sustituye por las regiones
variables de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, las cuales
mantienen por lo menos los dominios bisagra, CH2 y CH3 de la región
constante de la cadena pesada, para su uso en un método terapéutico
de tratamiento de un paciente.
2. Dímero según la reivindicación 1, en el que
dos regiones variables se sustituyen por secuencias de aminoácidos
de parejas de unión al ligando diferentes.
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US5336603A (en) * | 1987-10-02 | 1994-08-09 | Genentech, Inc. | CD4 adheson variants |
US5567584A (en) * | 1988-01-22 | 1996-10-22 | Zymogenetics, Inc. | Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF |
US5750375A (en) * | 1988-01-22 | 1998-05-12 | Zymogenetics, Inc. | Methods of producing secreted receptor analogs and biologically active dimerized polypeptide fusions |
US6018026A (en) | 1988-01-22 | 2000-01-25 | Zymogenetics, Inc. | Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions |
US6685941B1 (en) | 1988-11-23 | 2004-02-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods of treating autoimmune disease via CTLA-4Ig |
US6406697B1 (en) | 1989-02-23 | 2002-06-18 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
US5225538A (en) * | 1989-02-23 | 1993-07-06 | Genentech, Inc. | Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins |
US5242687A (en) * | 1989-03-15 | 1993-09-07 | Tkb Associates Limited Partnership | Method of reducing cellular immune response involving T-cells using CD8-bearing antigen presenting cells |
US7264944B1 (en) | 1989-04-21 | 2007-09-04 | Amgen Inc. | TNF receptors, TNF binding proteins and DNAs coding for them |
DE59010941D1 (de) * | 1989-04-21 | 2005-03-24 | Amgen Inc | TNF-Rezeptor, TNF bindende Proteine und dafür kodierende DNAs |
US6143866A (en) * | 1989-07-18 | 2000-11-07 | Amgen, Inc. | Tumor necrosis factor (TNF) inhibitor and method for obtaining the same |
IL95031A (en) | 1989-07-18 | 2007-03-08 | Amgen Inc | A method of producing a recombinant human necrotic factor absorber |
US6267964B1 (en) * | 1989-08-01 | 2001-07-31 | Affibody Technology Sweden Ab | Stabilized protein or peptide conjugates able to bond albumin having extended biological half-lives |
US5395760A (en) * | 1989-09-05 | 1995-03-07 | Immunex Corporation | DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors |
NZ235148A (en) * | 1989-09-05 | 1991-12-23 | Immunex Corp | Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences |
US5605690A (en) * | 1989-09-05 | 1997-02-25 | Immunex Corporation | Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor |
US6541610B1 (en) | 1989-09-05 | 2003-04-01 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor |
US5945397A (en) * | 1989-09-05 | 1999-08-31 | Immunex Corporation | Purified p75 (type II) tumor necrosis factor receptor polypeptides |
DK0939121T4 (da) * | 1989-09-12 | 2008-02-04 | Ahp Mfg B V | TNF-bindende proteiner |
US5216132A (en) * | 1990-01-12 | 1993-06-01 | Protein Design Labs, Inc. | Soluble t-cell antigen receptor chimeric antigens |
US6552170B1 (en) * | 1990-04-06 | 2003-04-22 | Amgen Inc. | PEGylation reagents and compounds formed therewith |
GB9022543D0 (en) * | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Antibody production |
DE4037837A1 (de) * | 1990-11-28 | 1992-06-04 | Behringwerke Ag | Zellfreie rezeptorbindungsteste, ihre herstellung und verwendung |
US7070991B2 (en) * | 1991-02-08 | 2006-07-04 | Progenics Pharmaceuticals, Inc. | Cells expressing a CD4-IgG2 chimeric heterotetramer |
WO1992013947A1 (en) | 1991-02-08 | 1992-08-20 | Progenics Pharmaceuticals, Inc. | CD4-GAMMA2 AND CD4-IgG2 CHIMERAS |
CA2081028C (en) * | 1991-03-12 | 1999-12-14 | Barbara P. Wallner | Cd2 binding domain of lymphocyte function associated antigen 3 |
MX9203138A (es) * | 1991-03-12 | 1992-09-01 | Biogen Inc | Dominio de enlace cd2-de antigeno 3 (lfa-3) asociado con funcion linfositos. |
US6582959B2 (en) * | 1991-03-29 | 2003-06-24 | Genentech, Inc. | Antibodies to vascular endothelial cell growth factor |
US20030206899A1 (en) * | 1991-03-29 | 2003-11-06 | Genentech, Inc. | Vascular endothelial cell growth factor antagonists |
US5318890A (en) * | 1991-05-06 | 1994-06-07 | The Regents Of The University Of California | Assays for inhibitors of leukocyte adhesion |
US6797492B2 (en) | 1991-05-17 | 2004-09-28 | Merck & Co., Inc. | Method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains |
US5851795A (en) * | 1991-06-27 | 1998-12-22 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble CTLA4 molecules and uses thereof |
US5844095A (en) * | 1991-06-27 | 1998-12-01 | Bristol-Myers Squibb Company | CTLA4 Ig fusion proteins |
EP0533006A1 (en) * | 1991-09-18 | 1993-03-24 | F.Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft | Chimaeric interleukin 5-receptor/immunoglobulin polypeptides |
US6764681B2 (en) * | 1991-10-07 | 2004-07-20 | Biogen, Inc. | Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the CD2/LFA-3 interaction |
US5871734A (en) * | 1992-01-13 | 1999-02-16 | Biogen, Inc. | Treatment for asthma with VLA-4 blocking agents |
US6399368B1 (en) | 1992-01-17 | 2002-06-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Secretion of T cell receptor fragments from recombinant Escherichia coli cells |
FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
US5932214A (en) * | 1994-08-11 | 1999-08-03 | Biogen, Inc. | Treatment for inflammatory bowel disease with VLA-4 blockers |
WO1993019777A1 (en) * | 1992-03-30 | 1993-10-14 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor |
WO1993022332A2 (en) * | 1992-04-24 | 1993-11-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells |
US5540926A (en) * | 1992-09-04 | 1996-07-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble and its use in B cell stimulation |
WO1994005314A1 (en) * | 1992-09-08 | 1994-03-17 | Centocor, Inc. | Peptide inhibitors of leukocyte adhesion |
WO1994006476A1 (en) * | 1992-09-15 | 1994-03-31 | Immunex Corporation | Method of treating tnf-dependent inflammation using tumor necrosis factor antagonists |
CA2144081C (en) * | 1992-09-16 | 2004-11-30 | Filip Roos | Protection against liver damage by hgf |
WO1994006469A1 (en) * | 1992-09-18 | 1994-03-31 | La Jolla Institute For Allergy And Immunology | Hiv fusion polypeptide |
US6270766B1 (en) | 1992-10-08 | 2001-08-07 | The Kennedy Institute Of Rheumatology | Anti-TNF antibodies and methotrexate in the treatment of arthritis and crohn's disease |
US5474766A (en) * | 1992-12-18 | 1995-12-12 | Washington University | Methods and compositions for inhibition of hepatic clearance of tissue-type plasminogen activator |
US5710123A (en) * | 1992-12-18 | 1998-01-20 | Centocor, Inc. | Peptide inhibitors of selectin binding |
SG48892A1 (en) * | 1993-01-25 | 1998-05-18 | Dana Faber Cancer Inst Inc | Chimeric L- and P-selectin by exchange of domains-uses thereof |
US7537932B1 (en) | 1993-05-19 | 2009-05-26 | Schering Corporation | Antibodies that bind purified mammalian FLT3 ligands |
US20050129670A1 (en) * | 1993-07-26 | 2005-06-16 | Genetics Institute, Llc. | Tumor cells modified to express B7-2 with increased immunogenicity and uses therefor |
US5861310A (en) * | 1993-11-03 | 1999-01-19 | Dana-Farber Cancer Institute | Tumor cells modified to express B7-2 with increased immunogenicity and uses therefor |
US6084067A (en) * | 1993-07-26 | 2000-07-04 | Dana-Farber Cancer Institute | CTLA4/CD28 ligands and uses therefor |
US6130316A (en) * | 1993-07-26 | 2000-10-10 | Dana Farber Cancer Institute | Fusion proteins of novel CTLA4/CD28 ligands and uses therefore |
US6723705B1 (en) | 1993-08-19 | 2004-04-20 | Gentics Institute, Inc. | Tumor cells modified to express B7-2 with increased immunogenicity and uses therefor |
US6824779B1 (en) | 1993-07-26 | 2004-11-30 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for inhibiting the interaction of B7-2 with its natural ligand |
SE9302855D0 (sv) * | 1993-09-06 | 1993-09-06 | Martin Lindberg | Method and means for producing plasmaproteinase inhibitor binding proteins |
WO1995014787A1 (en) * | 1993-11-22 | 1995-06-01 | Centocor, Inc. | Peptide inhibitors of selecting binding |
DE69521789T2 (de) * | 1994-02-01 | 2002-04-25 | Us Health | Fusionierte proteine die antikörper-teile und nicht-antikörper-teile enthalten |
US7294331B2 (en) * | 1994-03-07 | 2007-11-13 | Immunex Corporation | Methods of using flt3-ligand in hematopoietic cell transplantation |
EP0749323B1 (en) * | 1994-03-08 | 2000-11-29 | Dana-Farber Cancer Institute | Methods for modulating t cell anergy |
US5877016A (en) | 1994-03-18 | 1999-03-02 | Genentech, Inc. | Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors |
IL113484A0 (en) * | 1994-04-28 | 1995-07-31 | Immunex Corp | Viral proteins pharmaceutical compositions containing them their preparation and use |
USRE38313E1 (en) | 1994-05-06 | 2003-11-11 | Institut Gustave Roussy | Soluble polypeptide fractions of the LAG-3 protein, production method, therapeutic composition, anti-idiotype antibodies |
US6001968A (en) | 1994-08-17 | 1999-12-14 | The Rockefeller University | OB polypeptides, modified forms and compositions |
US6471956B1 (en) | 1994-08-17 | 2002-10-29 | The Rockefeller University | Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto |
US6429290B1 (en) | 1994-08-17 | 2002-08-06 | The Rockefeller University | OB polypeptides, modified forms and derivatives |
US6048837A (en) * | 1994-08-17 | 2000-04-11 | The Rockefeller University | OB polypeptides as modulators of body weight |
US6309853B1 (en) | 1994-08-17 | 2001-10-30 | The Rockfeller University | Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
US6350730B1 (en) | 1994-08-17 | 2002-02-26 | The Rockefeller University | OB polypeptides and modified forms as modulators of body weight |
US6124448A (en) * | 1994-08-17 | 2000-09-26 | The Rockfeller University | Nucleic acid primers and probes for the mammalian OB gene |
US5541087A (en) * | 1994-09-14 | 1996-07-30 | Fuji Immunopharmaceuticals Corporation | Expression and export technology of proteins as immunofusins |
US5814464A (en) * | 1994-10-07 | 1998-09-29 | Regeneron Pharma | Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2 |
US6410008B1 (en) * | 1994-12-12 | 2002-06-25 | Beth Israel Hospital Association | Chimeric IL-10 proteins and uses thereof |
CA2205572A1 (en) * | 1994-12-12 | 1996-06-20 | Beth Israel Hospital Association | Chimeric cytokines and uses thereof |
US6808709B1 (en) * | 1994-12-30 | 2004-10-26 | The Regents Of The University Of California | Immunoglobulins containing protection proteins and their use |
US6086875A (en) * | 1995-01-17 | 2000-07-11 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of immunogens |
US6485726B1 (en) * | 1995-01-17 | 2002-11-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
US6030613A (en) * | 1995-01-17 | 2000-02-29 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
US6455685B1 (en) | 1995-03-03 | 2002-09-24 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the treatment and diagnosis of immune disorders |
US20030069196A1 (en) * | 1995-03-03 | 2003-04-10 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the treatment and diagnosis of immune disorders |
US6066322A (en) | 1995-03-03 | 2000-05-23 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods for the treatment of immune disorders |
US6211142B1 (en) * | 1995-03-10 | 2001-04-03 | Genentech, Inc. | Compositions comprising gas6 polypeptides and articles of manufacture comprising the same |
US6680057B1 (en) * | 1995-03-23 | 2004-01-20 | Immunex Corporation | Methods of treating autoimmune disease by administering interleukin-17 receptor |
JP4373495B2 (ja) * | 1995-03-23 | 2009-11-25 | イミュネックス・コーポレーション | Il−17受容体 |
IL117645A (en) * | 1995-03-30 | 2005-08-31 | Genentech Inc | Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration |
US20060193862A1 (en) * | 1995-03-30 | 2006-08-31 | Genentech, Inc. | Vascular endothelial cell growth factor antagonists |
US7153508B2 (en) * | 1995-06-07 | 2006-12-26 | Biogen Idec Inc. | Treatment of B cell lymphoma using anti-CD80 antibodies that do not inhibit the binding of CD80 to CTLA-4 |
US6113898A (en) * | 1995-06-07 | 2000-09-05 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies |
US7175847B1 (en) * | 1995-06-07 | 2007-02-13 | Biogen Idec Inc. | Treating intestinal inflammation with anti-CD80 antibodies that do not inhibit CD80 binding to CTLA-4 |
US7150992B1 (en) | 1995-10-04 | 2006-12-19 | Innunex Corporation | Methods of preparing dendritic cells with flt3-ligand and antigen |
US7361330B2 (en) * | 1995-10-04 | 2008-04-22 | Immunex Corporation | Methods of using flt3-ligand in the treatment of fibrosarcoma |
US20020034517A1 (en) * | 1995-10-04 | 2002-03-21 | Kenneth Brasel | Dendritic cell stimulatory factor |
US6936439B2 (en) * | 1995-11-22 | 2005-08-30 | Amgen Inc. | OB fusion protein compositions and methods |
US20030040467A1 (en) * | 1998-06-15 | 2003-02-27 | Mary Ann Pelleymounter | Ig/ob fusions and uses thereof. |
US20030026779A1 (en) * | 1999-10-15 | 2003-02-06 | Liming Yu | Treatment of tumors and viral infections with a hybrid conjugate of interferon and an immunoglobulin Fc |
GB9526733D0 (en) * | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
EP1619250B1 (en) | 1996-01-08 | 2009-11-25 | Genentech, Inc. | OB receptor variant and ligands |
US6750334B1 (en) * | 1996-02-02 | 2004-06-15 | Repligen Corporation | CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor |
US5917026A (en) * | 1996-02-05 | 1999-06-29 | Loewenadler; Bjoern | Fusion proteins of immunopotentiating activity |
NZ503548A (en) | 1996-02-09 | 2001-09-28 | Amgen Inc | A fusion protein comprising an IL-1ra receptor antagonist with a constant domain of human immunoglobulin at the carboxy terminus |
EA002474B1 (ru) * | 1996-02-20 | 2002-06-27 | Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. | Гибридный белок, образующий гетеродимеры, способ его получения и использования |
US6194177B1 (en) * | 1996-02-20 | 2001-02-27 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | DNA encoding a hybrid heterodimeric protein |
GB9604518D0 (en) * | 1996-03-02 | 1996-05-01 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
JPH11507843A (ja) * | 1996-03-28 | 1999-07-13 | ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー | タンパク質の可溶性二価および多価ヘテロ二量体類縁体 |
US6458354B1 (en) | 1996-03-28 | 2002-10-01 | The Johns Hopkins University | Molecular complexes which modify immune responses |
US7026116B1 (en) * | 1996-04-04 | 2006-04-11 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Polymorphisms in the region of the human hemochromatosis gene |
US6140305A (en) * | 1996-04-04 | 2000-10-31 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Hereditary hemochromatosis gene products |
US7063965B2 (en) * | 1996-04-05 | 2006-06-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid encoding TIE-2 ligand |
US6060054A (en) * | 1996-04-10 | 2000-05-09 | National Jewish Medical And Research Center | Product for T lymphocyte immunosuppression |
US6117977A (en) * | 1996-04-24 | 2000-09-12 | Genentech, Inc. | Type C lectins |
US6451308B1 (en) * | 1996-04-26 | 2002-09-17 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Antagonists of interleukin-15 |
WO1997041232A1 (en) * | 1996-04-26 | 1997-11-06 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Antagonists of interleukin-15 |
DE69733773T2 (de) | 1996-05-02 | 2006-04-20 | Mochida Pharmaceutical Co. Ltd. | Fas ANTIGEN-DERIVATE |
US6100071A (en) | 1996-05-07 | 2000-08-08 | Genentech, Inc. | Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production |
US6849399B1 (en) | 1996-05-23 | 2005-02-01 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for diagnosis and treatment of iron misregulation diseases |
TW555765B (en) * | 1996-07-09 | 2003-10-01 | Amgen Inc | Low molecular weight soluble tumor necrosis factor type-I and type-II proteins |
NZ333325A (en) * | 1996-07-12 | 2000-06-23 | Genentech Inc | Recombinant chimeric heteromultimer adhesins comprising extracellular domains of ErbB receptors |
AU727606B2 (en) * | 1996-07-12 | 2000-12-14 | Genentech Inc. | Gamma-heregulin |
US5851984A (en) * | 1996-08-16 | 1998-12-22 | Genentech, Inc. | Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides |
US6159462A (en) * | 1996-08-16 | 2000-12-12 | Genentech, Inc. | Uses of Wnt polypeptides |
EP2002846B1 (en) | 1996-12-06 | 2017-01-25 | Amgen Inc. | Combination therapy using an IL-1 inhibitor for treating IL-1 mediated diseases |
DE69724451T2 (de) | 1996-12-06 | 2004-03-18 | Amgen Inc., Thousand Oaks | Kombinationtherapie mit einem tnf-bindendem protein zür behandlung von durch tnf verursachten erkrangungen |
AU737910B2 (en) * | 1997-01-31 | 2001-09-06 | Regents Of The University Of California, The | Chimeric antibody fusion proteins for the recruitment and stimulation of an antitumor immune response |
US6268411B1 (en) | 1997-09-11 | 2001-07-31 | The Johns Hopkins University | Use of multivalent chimeric peptide-loaded, MHC/ig molecules to detect, activate or suppress antigen-specific T cell-dependent immune responses |
US7435793B2 (en) * | 1998-05-15 | 2008-10-14 | Genentech, Inc. | Peptides that induce chondrocyte redifferentiation |
US20020137890A1 (en) * | 1997-03-31 | 2002-09-26 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
DE69842225D1 (de) | 1997-04-16 | 2011-05-26 | Millennium Pharm Inc | Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper, der selektiv an ein cysteinreiches sekretiertes Protein (CRSP) bindet |
US6190909B1 (en) * | 1997-04-17 | 2001-02-20 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | TH2-specific gene |
EP0980432A1 (en) * | 1997-05-01 | 2000-02-23 | Amgen, Inc. | Chimeric opg polypeptides |
US7951917B1 (en) | 1997-05-02 | 2011-05-31 | Genentech, Inc. | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
US20030207346A1 (en) * | 1997-05-02 | 2003-11-06 | William R. Arathoon | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
AU751659B2 (en) | 1997-05-02 | 2002-08-22 | Genentech Inc. | A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
US20020062010A1 (en) * | 1997-05-02 | 2002-05-23 | Genentech, Inc. | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
ATE462717T1 (de) | 1997-06-13 | 2010-04-15 | Bio Rad Laboratories | Verfahren und zusammensetzungen für die diagnose und die behandlung von krankheiten, die mit eisenüberschuss oder eisenmangel assoziiert sind |
US20030083461A1 (en) * | 1997-06-16 | 2003-05-01 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US20040191256A1 (en) * | 1997-06-24 | 2004-09-30 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for galactosylated glycoproteins |
KR100220645B1 (ko) * | 1997-07-04 | 1999-09-15 | 구광시 | 벤젠유도체의 제조방법 |
US6187564B1 (en) | 1997-07-10 | 2001-02-13 | Beth Israel Deaconess Medical Center | DNA encoding erythropoietin multimers having modified 5′ and 3′ sequences and its use to prepare EPO therapeutics |
US6165476A (en) * | 1997-07-10 | 2000-12-26 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker |
US6242570B1 (en) | 1997-07-10 | 2001-06-05 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Production and use of recombinant protein multimers with increased biological activity |
US20030073169A1 (en) * | 1997-09-18 | 2003-04-17 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US6391311B1 (en) * | 1998-03-17 | 2002-05-21 | Genentech, Inc. | Polypeptides having homology to vascular endothelial cell growth factor and bone morphogenetic protein 1 |
WO1999020758A1 (en) * | 1997-10-21 | 1999-04-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor-like proteins tr11, tr11sv1, and tr11sv2 |
US6503184B1 (en) | 1997-10-21 | 2003-01-07 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor-like proteins TR11, TR11SV1 and TR11SV2 |
US6689607B2 (en) | 1997-10-21 | 2004-02-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor, necrosis factor receptor-like proteins TR11, TR11SV1 and TR11SV2 |
US20040136986A1 (en) * | 1997-10-31 | 2004-07-15 | Genentech, Inc. | Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms |
US6576743B1 (en) * | 1997-11-26 | 2003-06-10 | Zymogenetics, Inc. | Mammalian cytokine-like polypeptide-10 |
WO1999029732A2 (en) | 1997-12-08 | 1999-06-17 | Lexigen Pharmaceuticals Corporation | Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation |
US6207413B1 (en) * | 1998-01-22 | 2001-03-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acids encoding novel orphan cytokine receptors |
US20030105294A1 (en) * | 1998-02-25 | 2003-06-05 | Stephen Gillies | Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins |
US7198789B2 (en) * | 1998-03-17 | 2007-04-03 | Genetics Institute, Llc | Methods and compositions for modulating interleukin-21 receptor activity |
US6057128A (en) | 1998-03-17 | 2000-05-02 | Genetics Institute, Inc. | MU-1, member of the cytokine receptor family |
US7189400B2 (en) * | 1998-03-17 | 2007-03-13 | Genetics Institute, Llc | Methods of treatment with antagonists of MU-1 |
US7371836B2 (en) * | 1998-03-27 | 2008-05-13 | Genentech, Inc. | PRO526 nucleic acids |
US7723488B2 (en) * | 1998-03-27 | 2010-05-25 | Genentech, Inc. | Monoclonal antibodies to secreted and transmembrane polypeptides |
DE69931908T2 (de) * | 1998-04-15 | 2007-01-11 | Lexigen Pharmaceuticals Corp., Lexington | Steigerung der antikörper-zytokin-fusionsproteinmediierten immunantwort durch mitverabreichung mit einem angiogeneseinhibitor |
US7256039B2 (en) * | 1998-05-15 | 2007-08-14 | Genentech, Inc. | PRO4405 nucleic acids |
JP3577586B2 (ja) * | 1998-05-15 | 2004-10-13 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | Il−17相同的ポリペプチドとその治療用途 |
CA2328498A1 (en) | 1998-06-12 | 1999-12-16 | Genentech, Inc. | Monoclonal antibodies, cross-reactive antibodies and method for producing the same____________________________________ |
DE69933216T2 (de) * | 1998-06-15 | 2007-09-20 | GTC Biotherapeutics, Inc., Framingham | Erythropoietin-analog-menschliches serum-albumin fusionsprotein |
US20050181482A1 (en) * | 2004-02-12 | 2005-08-18 | Meade Harry M. | Method for the production of an erythropoietin analog-human IgG fusion proteins in transgenic mammal milk |
US20070003545A9 (en) * | 1999-06-02 | 2007-01-04 | Eaton Dan L | Interleukin-8 homologous polypeptides and therapeutic uses thereof |
US7291712B2 (en) * | 1998-06-25 | 2007-11-06 | Genentech, Inc. | Interleukin-8 homologous polypeptides and therapeutic uses thereof |
US20020099197A1 (en) * | 1998-07-21 | 2002-07-25 | Rory A.J. Curtis | Novel potassium channel molecules and uses therefor |
US20030166132A1 (en) * | 1998-08-26 | 2003-09-04 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
ES2252999T3 (es) * | 1998-08-31 | 2006-05-16 | Biogen Idec Ma Inc. | Modulacion de celulas t efectoras y de memoria con un ligando de cd2. |
AU762616B2 (en) | 1998-10-16 | 2003-07-03 | Biogen Ma Inc. | Polymer conjugates of interferon beta-1a and uses |
PL200586B1 (pl) * | 1998-10-16 | 2009-01-30 | Biogen Idec Inc | Polipeptydy zawierające mutanty interferonu-beta-1a, kodujące je cząsteczki kwasów nukleinowych, komórki gospodarza transformowane tymi cząsteczkami, sposób wytwarzania polipeptydów, zawierające je kompozycje farmaceutyczne i zastosowania polipeptydów |
US6660843B1 (en) * | 1998-10-23 | 2003-12-09 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
MEP42108A (en) | 1998-10-23 | 2011-02-10 | Kiren Amgen Inc | Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to mp1 receptor and having thrombopoietic activity |
US7488590B2 (en) * | 1998-10-23 | 2009-02-10 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
WO2000027885A1 (fr) * | 1998-11-05 | 2000-05-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Nouveau popypeptide chimerique |
CA2350771A1 (en) * | 1998-11-10 | 2000-05-18 | Human Genome Sciences, Inc. | Chemokine .beta.-7 |
US7294482B2 (en) * | 1998-11-19 | 2007-11-13 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | EGF-like nucleic acids |
US7238790B2 (en) * | 1999-01-12 | 2007-07-03 | Genentech, Inc. | PRO1313 polypeptides |
AU3224700A (en) * | 1999-02-08 | 2000-08-25 | Chiron Corporation | Fibroblast growth factor receptor-immunoglobulin fusion |
AU764382B2 (en) | 1999-03-19 | 2003-08-14 | Genentech Inc. | Treatment of LFA-1 associated disorders with increasing doses of LFA-1 antagonist |
US7011833B1 (en) * | 1999-05-06 | 2006-03-14 | Genetics Institute, Inc. | Enhancing immune responses with B7-1 or B7-2 in the absence of a crosslinking agent |
US20050079577A1 (en) * | 1999-05-14 | 2005-04-14 | Ashkenazi Avi J. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
DK1187852T3 (da) * | 1999-05-19 | 2007-11-26 | Merck Patent Gmbh | Ekspression og eksport af interferon-alpha-proteiner som Fc-fusionsproteiner |
CA2375700A1 (en) * | 1999-06-01 | 2000-12-07 | Biogen, Inc. | Polymer conjugates of hedgehog proteins and uses |
WO2000073498A1 (en) * | 1999-06-02 | 2000-12-07 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the treatment and diagnosis of immune disorders |
US6924359B1 (en) * | 1999-07-01 | 2005-08-02 | Yale University | Neovascular-targeted immunoconjugates |
CA2373735A1 (en) * | 1999-07-02 | 2001-01-11 | Genentech, Inc. | Fviia antagonists |
JP4387625B2 (ja) | 1999-07-02 | 2009-12-16 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | Her2に結合する化合物 |
US7011967B1 (en) * | 1999-07-12 | 2006-03-14 | Merck Patent Gmbh | Seripancrin |
US7067110B1 (en) | 1999-07-21 | 2006-06-27 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
SK782002A3 (en) * | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
WO2001007084A1 (en) * | 1999-07-23 | 2001-02-01 | Regents Of The University Of California | Anti-growth factor receptor avidin fusion proteins as universal vectors for drug delivery |
JP2003512303A (ja) * | 1999-08-06 | 2003-04-02 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 因子viiaのペプチドアンタゴニスト |
MXPA02001417A (es) * | 1999-08-09 | 2002-08-12 | Lexigen Pharm Corp | Complejos multiples de citosina-anticuerpo. |
PT1210428E (pt) | 1999-08-23 | 2015-07-21 | Genetics Inst Llc | Pd-1, um recetor para b7-4 e suas utilizações |
US20030166858A1 (en) * | 1999-09-16 | 2003-09-04 | Samuel Davis | TIE-2 ligands, methods of making and uses thereof |
US6323334B1 (en) * | 1999-09-24 | 2001-11-27 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid molecules encoding a 103 gene product and uses therefor |
IL149202A0 (en) * | 1999-11-05 | 2002-11-10 | Biogen Inc | Hedgehog fusion proteins and uses |
US20050202538A1 (en) * | 1999-11-12 | 2005-09-15 | Merck Patent Gmbh | Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics |
JP2003514552A (ja) | 1999-11-12 | 2003-04-22 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | 改善された性質を有するエリトロポエチンの形態 |
US7122632B2 (en) * | 1999-12-23 | 2006-10-17 | Zymogenetics, Inc. | Soluble Interleukin-20 receptor |
US6610286B2 (en) * | 1999-12-23 | 2003-08-26 | Zymogenetics, Inc. | Method for treating inflammation using soluble receptors to interleukin-20 |
US7307153B2 (en) * | 1999-12-23 | 2007-12-11 | Genentech, Inc. | Antibodies that bind PRO9912 |
US7164001B2 (en) * | 2000-01-20 | 2007-01-16 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immune related diseases |
EP1252192B1 (en) | 2000-02-11 | 2006-08-16 | MERCK PATENT GmbH | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
KR20020086540A (ko) * | 2000-02-21 | 2002-11-18 | 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이. | Il-18 저해물질의 용도 |
US7572631B2 (en) * | 2000-02-24 | 2009-08-11 | Invitrogen Corporation | Activation and expansion of T cells |
US7541184B2 (en) * | 2000-02-24 | 2009-06-02 | Invitrogen Corporation | Activation and expansion of cells |
US20060073547A1 (en) * | 2000-03-01 | 2006-04-06 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US6984519B2 (en) | 2000-03-01 | 2006-01-10 | Genetech, Inc. | Nucleic acids encoding peptides that induce chondrocyte redifferentiation |
US20060002943A1 (en) * | 2000-03-02 | 2006-01-05 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin |
US20020064820A1 (en) * | 2000-03-13 | 2002-05-30 | Jean-Michel Dayer | Apo-A-I regulation of T-cell signaling |
US7514239B2 (en) * | 2000-03-28 | 2009-04-07 | Amgen Inc. | Nucleic acid molecules encoding beta-like glycoprotein hormone polypeptides and heterodimers thereof |
JP2003530108A (ja) * | 2000-04-10 | 2003-10-14 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | クリプティック様分泌型タンパク質 |
CA2405709A1 (en) * | 2000-04-12 | 2001-10-25 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US6946134B1 (en) | 2000-04-12 | 2005-09-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US20050100991A1 (en) * | 2001-04-12 | 2005-05-12 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
AU5914201A (en) * | 2000-04-25 | 2001-11-07 | Idec Pharma Corp | Intrathecal administration of rituximab for treatment of central nervous system lymphomas |
US6756480B2 (en) | 2000-04-27 | 2004-06-29 | Amgen Inc. | Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein |
AU2001257445B2 (en) * | 2000-04-28 | 2006-11-02 | Planet Biotechnology, Inc. | Immunoadhesin for the prevention of rhinovirus infection |
US20060015969A1 (en) * | 2000-04-28 | 2006-01-19 | Planet Biotechnology, Inc. | Novel immunoadhesins for treating and prventing toxicity and pathogen-mediated diseases |
AU2001259432B2 (en) * | 2000-05-03 | 2005-04-21 | Amgen Inc. | Modified peptides, comprising an FC domain, as therapeutic agents |
US20020102232A1 (en) * | 2000-05-11 | 2002-08-01 | Chang Tse W. | Compositions and methods for induction of active autoimmunity |
BR0110779A (pt) * | 2000-05-12 | 2005-01-11 | Beth Israel Hospital | Composições e métodos para adquirir supressão imunológica |
EP1714661A3 (en) | 2000-05-19 | 2012-03-14 | The Center for Blood Research, INC. | Methods for diagnosing and treating hemostatic disorders by modulating p-selectin activity |
US20040034193A1 (en) * | 2001-06-13 | 2004-02-19 | Samy Ashkar | Biosynthetic oncolytic molecules and uses therefor |
US20050048614A1 (en) * | 2000-06-13 | 2005-03-03 | Children's Medical Center Corporation | Biosynthetic oncolytic molecules and uses therefor |
DK1325115T3 (en) * | 2000-06-26 | 2016-11-21 | Zymogenetics Inc | CYTOKINRECEPTOR ZCYTOR17 |
US20030096339A1 (en) * | 2000-06-26 | 2003-05-22 | Sprecher Cindy A. | Cytokine receptor zcytor17 |
CA2414331C (en) | 2000-06-28 | 2011-11-29 | Genetics Institute, Llc. | Pd-l2 molecules: novel pd-1 ligands and uses therefor |
RU2272644C2 (ru) * | 2000-06-29 | 2006-03-27 | Мерк Патент Гмбх | Усиление иммунной реакции, медиатором которой является слитый протеин антитело-цитокин, при помощи комбинированного лечения агентами, увеличивающими поглощение иммуноцитокина |
UA81743C2 (uk) | 2000-08-07 | 2008-02-11 | Центокор, Инк. | МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО ЛЮДИНИ, ЩО СПЕЦИФІЧНО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З ФАКТОРОМ НЕКРОЗУ ПУХЛИН АЛЬФА (ФНПα), ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЩО ЙОГО МІСТИТЬ, ТА СПОСІБ ЛІКУВАННЯ РЕВМАТОЇДНОГО АРТРИТУ |
US7288390B2 (en) | 2000-08-07 | 2007-10-30 | Centocor, Inc. | Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses |
US6902734B2 (en) | 2000-08-07 | 2005-06-07 | Centocor, Inc. | Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof |
JP5015404B2 (ja) * | 2000-08-08 | 2012-08-29 | ザイモジェネティクス, インコーポレイテッド | 可溶性zcytor11サイトカイン受容体 |
US20030215916A1 (en) * | 2000-08-18 | 2003-11-20 | Feder John N. | Novel imidazoline receptor homologs |
CA2417432C (en) | 2000-09-01 | 2010-11-02 | The Center For Blood Research, Inc. | Modified polypeptides stabilized in a desired conformation and methods for producing same |
US20020119148A1 (en) | 2000-09-01 | 2002-08-29 | Gerritsen Mary E. | ErbB4 antagonists |
JP2004525076A (ja) * | 2000-09-14 | 2004-08-19 | ベス・イスラエル・ディーコニス・メディカル・センター・インコーポレーテッド | Il−2およびil−15媒介t細胞応答の調節 |
DE60135158D1 (de) | 2000-09-26 | 2008-09-11 | Genentech Inc | Antagonisten des ige-rezeptors |
AU2001294913A1 (en) * | 2000-09-29 | 2002-04-08 | Bristol-Myers Squibb Company | Identification and cloning of a full-length human cink-related gene, mist (mast cell immunoreceptor signal transducer) |
US20030211549A1 (en) * | 2000-10-06 | 2003-11-13 | Murphy Andrew J. | Functional proteins and therapeutic and diagnostic methods for use thereof |
EP1364019A2 (en) * | 2000-11-07 | 2003-11-26 | Board of Regents, The University of Texas System | Methods and compositions relating to muscle specific sarcomeric calcineurin-binding proteins (calsarcins) |
AU2002216481B2 (en) * | 2000-12-04 | 2008-05-01 | Auckland Uniservices Limited | Immunomodulatory constructs and their uses |
EP1642910B1 (en) * | 2000-12-05 | 2012-02-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Rationally designed antibodies |
US20040253242A1 (en) * | 2000-12-05 | 2004-12-16 | Bowdish Katherine S. | Rationally designed antibodies |
US7396917B2 (en) * | 2000-12-05 | 2008-07-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Rationally designed antibodies |
EP1430121A4 (en) * | 2001-02-16 | 2004-09-22 | Bristol Myers Squibb Co | A NEW GLYCINE RECEPTOR ALPHA UNIT EXPRESSED IN THE GASTRIDGE TRACT, HGRA4, CODING POLYNUCLEOTIDES AND SPLICE VERSION THEREOF |
DK1366067T3 (da) * | 2001-03-07 | 2012-10-22 | Merck Patent Gmbh | Ekspressionsteknologi for proteiner indeholdende en hybrid isotype-antistof-enhed |
US8163289B2 (en) | 2001-03-09 | 2012-04-24 | Iterative Therapeutics, Inc. | Methods and compositions involving polymeric immunoglobulin fusion proteins |
CA2437958C (en) | 2001-03-09 | 2018-10-30 | University Of Chicago | Polymeric immunoglobulin fusion proteins that target low-affinity fc.gamma.receptors |
US6992174B2 (en) * | 2001-03-30 | 2006-01-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
CA2442066C (en) | 2001-04-02 | 2005-11-01 | Wyeth | Pd-1, a receptor for b7-4, and uses therefor |
US20060084794A1 (en) * | 2001-04-12 | 2006-04-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US7507413B2 (en) | 2001-04-12 | 2009-03-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US20050054051A1 (en) * | 2001-04-12 | 2005-03-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US20050244931A1 (en) * | 2001-04-12 | 2005-11-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
ITRE20010042A1 (it) * | 2001-04-24 | 2002-10-24 | Corghi Spa | Dispositivo sollevatore per macchine smontagomme |
US20050089932A1 (en) * | 2001-04-26 | 2005-04-28 | Avidia Research Institute | Novel proteins with targeted binding |
US7265208B2 (en) * | 2001-05-01 | 2007-09-04 | The Regents Of The University Of California | Fusion molecules and treatment of IgE-mediated allergic diseases |
BR0209177A (pt) * | 2001-05-03 | 2004-10-05 | Merck Patent Gmbh | Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo |
CA2446189C (en) | 2001-05-11 | 2011-10-18 | Amgen, Inc. | Peptides and related molecules that bind to tall-1 |
US20100056762A1 (en) | 2001-05-11 | 2010-03-04 | Old Lloyd J | Specific binding proteins and uses thereof |
JP2004537991A (ja) * | 2001-06-15 | 2004-12-24 | タノックス インコーポレーテッド | アレルギー及び喘息治療用Fcε融合タンパク質 |
US20060073141A1 (en) * | 2001-06-28 | 2006-04-06 | Domantis Limited | Compositions and methods for treating inflammatory disorders |
WO2004003019A2 (en) * | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Domantis Limited | Immunoglobin single variant antigen-binding domains and dual-specific constructs |
AU2002320352A1 (en) * | 2001-07-24 | 2003-02-17 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods for treating or preventing sclerotic disorders using cd2-binding agents |
JP2005507870A (ja) * | 2001-08-13 | 2005-03-24 | ユニバーシティ・オブ・サザン・カリフォルニア | 低毒性のインターロイキン−2突然変異体 |
US6900292B2 (en) * | 2001-08-17 | 2005-05-31 | Lee-Hwei K. Sun | Fc fusion proteins of human erythropoietin with increased biological activities |
NZ543755A (en) | 2001-08-29 | 2008-04-30 | Genentech Inc | Bv8 nucleic acids and polypeptides with mitogenic activity |
AU2002323501C1 (en) * | 2001-08-30 | 2010-04-29 | Biorexis Technology, Inc | Modified transferrin fusion proteins |
US6797493B2 (en) | 2001-10-01 | 2004-09-28 | Lee-Hwei K. Sun | Fc fusion proteins of human granulocyte colony-stimulating factor with increased biological activities |
WO2003030821A2 (en) * | 2001-10-05 | 2003-04-17 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US7138370B2 (en) | 2001-10-11 | 2006-11-21 | Amgen Inc. | Specific binding agents of human angiopoietin-2 |
US7205275B2 (en) * | 2001-10-11 | 2007-04-17 | Amgen Inc. | Methods of treatment using specific binding agents of human angiopoietin-2 |
DE60224822T2 (de) * | 2001-10-19 | 2009-01-22 | Zymogenetics, Inc., Seattle | Dimerisierter wachstumsfaktor sowie materialien und verfahren zu seiner herstellung |
WO2003040311A2 (en) * | 2001-10-25 | 2003-05-15 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Efficient inhibition of hiv-1 viral entry through a novel fusion protein including of cd4 |
US20070118934A1 (en) * | 2001-10-26 | 2007-05-24 | Planet Biotechnology, Inc. | Chimeric toxin receptor proteins and chimeric toxin receptor proteins for treatment and prevention of anthrax |
PT1454138E (pt) * | 2001-12-04 | 2012-03-28 | Merck Patent Gmbh | Imunocitoquinas com seletividade modulada |
ES2337989T3 (es) * | 2001-12-18 | 2010-05-03 | Endocube Sas | Nuevas proteinas asociadas a la muerte de la familia thap y rutas par4 relacionadas implicadas en el control de la apoptosis. |
US7858297B2 (en) * | 2001-12-18 | 2010-12-28 | Centre National De La Recherche Scientifique Cnrs | Chemokine-binding protein and methods of use |
AU2002364587A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-07-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
CA2471363C (en) * | 2001-12-21 | 2014-02-11 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
KR101271635B1 (ko) * | 2001-12-21 | 2013-06-12 | 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 | 알부민 융합 단백질 |
EP1961811B1 (en) | 2002-01-18 | 2010-08-25 | ZymoGenetics, Inc. | Cytokine ligand for the treatment of asthma and airway hyper-responsiveness |
GEP20074024B (en) | 2002-01-18 | 2007-01-10 | Biogen Idec Inc | Polyalkylene glycol comprising a radical for conjugation of biologically active compound |
US7164002B2 (en) | 2002-02-06 | 2007-01-16 | Genentech, Inc. | FVIIa antagonists |
US20030211470A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-11-13 | Olson William C. | CD4-IgG2-based salvage therapy of HIV-1 infection |
MXPA04009874A (es) * | 2002-04-10 | 2005-10-19 | Applied Research Systems | Antagonistas novedosos de proteinas mcp. |
US20040016010A1 (en) * | 2002-04-17 | 2004-01-22 | Marion Kasaian | IL-21 receptor knockout animal and methods of use thereof |
WO2003100056A1 (fr) | 2002-05-29 | 2003-12-04 | Yamasa Corporation | Nouvelle enzyme polyphosphate :amp phosphotransferase |
DE60334453D1 (de) * | 2002-05-30 | 2010-11-18 | Macrogenics Inc | Cd16a bindungsproteine und verwendung zur behandlung von immunkrankheiten |
NZ519371A (en) * | 2002-06-04 | 2004-11-26 | Auckland Uniservices Ltd | Immunomodulatory constructs and their uses |
EP1369128A1 (en) * | 2002-06-07 | 2003-12-10 | Procorde GmbH | Inhibitors of glycoprotein VI and their therapeutic use |
US20090130021A1 (en) * | 2002-06-07 | 2009-05-21 | Gotz Munch | Methods, products and uses involving platelets and/or the vasculature |
US20070071744A1 (en) * | 2002-06-07 | 2007-03-29 | Gotz Munch | Agents which bind to epitopes of glycoprotein VI |
US7531178B2 (en) * | 2002-06-07 | 2009-05-12 | Trigen Gmbh | Immunoadhesin comprising a glycoprotein VI domain |
US8029803B2 (en) | 2002-06-20 | 2011-10-04 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for eliciting an immune response |
US8025873B2 (en) * | 2002-06-20 | 2011-09-27 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for eliciting an immune response |
US20070104710A1 (en) * | 2002-06-28 | 2007-05-10 | Domants Limited | Ligand that has binding specificity for IL-4 and/or IL-13 |
AU2003280130B2 (en) | 2002-06-28 | 2009-06-11 | Centocor, Inc. | Mammalian CH1 deleted mimetibodies, compositions, methods and uses |
CN1241946C (zh) * | 2002-07-01 | 2006-02-15 | 美国福源集团 | 对多种细胞具刺激增生作用的人血清白蛋白重组融合蛋白 |
JP5068931B2 (ja) * | 2002-07-12 | 2012-11-07 | ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー | 独自のクローン形質のリンパ球受容体に結合する試薬および方法 |
WO2004007682A2 (en) * | 2002-07-15 | 2004-01-22 | Wyeth | Methods and compositions for modulating t helper (th) cell development and function |
US20040110681A1 (en) * | 2002-08-08 | 2004-06-10 | Xiao-Min Fan | Method to identify targeting molecules |
US20040136992A1 (en) | 2002-08-28 | 2004-07-15 | Burton Paul B. J. | Compositions and method for treating cardiovascular disease |
DE10251463A1 (de) * | 2002-11-05 | 2004-05-19 | BSH Bosch und Siemens Hausgeräte GmbH | Elektrisch angetriebene Pumpe |
US20050054054A1 (en) * | 2002-11-12 | 2005-03-10 | Foss Francine M. | Interleukin-7 molecules with altered biological properties |
CA2510180C (en) * | 2002-12-17 | 2012-09-11 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Humanized antibody (h14.18) of the mouse 14.18 antibody binding to gd2 and its fusion with il-2 |
JP2006523090A (ja) * | 2002-12-27 | 2006-10-12 | ドマンティス リミテッド | リガンドに、そしてリガンド受容体に特異的な二重特異性単一ドメイン抗体 |
GB0230203D0 (en) * | 2002-12-27 | 2003-02-05 | Domantis Ltd | Fc fusion |
US20110223168A1 (en) * | 2002-12-27 | 2011-09-15 | Greg Winter | Ligand that has binding specificity for il-4 and/or il-13 |
EP1596804A4 (en) * | 2003-01-13 | 2008-02-06 | Macrogenics Inc | SOLUBLE FCyR FUSION PROTEINS AND METHODS OF USE |
CA2513213C (en) | 2003-01-22 | 2013-07-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US20060234340A1 (en) * | 2003-02-06 | 2006-10-19 | Novozymes A/S | Human heavy chain antibody expression in flamentous fungi |
US20050096264A1 (en) * | 2003-02-25 | 2005-05-05 | Macdonald Lynn | Methods for treating obesity and related conditions with glycoprotein hormone beta family hormones |
EP1615659B1 (en) | 2003-03-12 | 2014-04-16 | Genentech, Inc. | Use of bv8 and/or eg-vegf to promote hematopoiesis |
US20050142139A1 (en) * | 2003-03-21 | 2005-06-30 | Norbert Schulke | CD4-IgG2 formulations |
EA009026B1 (ru) * | 2003-03-24 | 2007-10-26 | Займоджинетикс, Инк. | Антитела против il-22ra, их партнеры по связыванию и способы их применения при воспалениях |
SI1606318T1 (sl) * | 2003-03-26 | 2009-12-31 | Apogenix Gmbh | Izboljšani Fc fuzijski proteini |
TWI353991B (en) * | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
CA2522690A1 (en) * | 2003-05-06 | 2004-11-25 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | Inhibition of drug binding to serum albumin |
DK2298347T3 (en) | 2003-05-06 | 2016-01-11 | Biogen Hemophilia Inc | COAGULATION FACTOR CHEMICAL PROTEINS FOR TREATING A HEMOSTATIC DISORDER |
US7348004B2 (en) | 2003-05-06 | 2008-03-25 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
EP2286804A1 (en) | 2003-05-13 | 2011-02-23 | DePuy Spine, Inc. | A method of treating degenerative disc disease |
US7344716B2 (en) * | 2003-05-13 | 2008-03-18 | Depuy Spine, Inc. | Transdiscal administration of specific inhibitors of pro-inflammatory cytokines |
DK1622939T3 (da) * | 2003-05-13 | 2012-04-10 | Merck Serono Sa | Aktive varianter af det IL-18-bindende protein og medicinske anvendelser deraf |
US20040229878A1 (en) * | 2003-05-13 | 2004-11-18 | Depuy Spine, Inc. | Transdiscal administration of specific inhibitors of P38 kinase |
US7553827B2 (en) * | 2003-08-13 | 2009-06-30 | Depuy Spine, Inc. | Transdiscal administration of cycline compounds |
US8273347B2 (en) | 2003-05-13 | 2012-09-25 | Depuy Spine, Inc. | Autologous treatment of degenerated disc with cells |
US7429378B2 (en) * | 2003-05-13 | 2008-09-30 | Depuy Spine, Inc. | Transdiscal administration of high affinity anti-MMP inhibitors |
US7435808B2 (en) * | 2003-06-25 | 2008-10-14 | Bristol-Myers Squibb Company | Polynucleotides encoding novel adiponectin receptor variant, AdipoR2v2 |
PL1639011T3 (pl) * | 2003-06-30 | 2009-05-29 | Domantis Ltd | Pegilowane przeciwciała jednodomenowe (dAb) |
WO2005007121A2 (en) | 2003-07-18 | 2005-01-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Mutant interleukin-2(il-2) polypeptides |
US8361467B2 (en) * | 2003-07-30 | 2013-01-29 | Depuy Spine, Inc. | Trans-capsular administration of high specificity cytokine inhibitors into orthopedic joints |
US8007805B2 (en) * | 2003-08-08 | 2011-08-30 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens |
EP2520654B8 (en) | 2003-08-26 | 2017-04-19 | The Regents of the University of Colorado, a body corporate | Inhibitors of serine protease activity and their use in methods and compositions for treatment of bacterial infections |
US20050069521A1 (en) * | 2003-08-28 | 2005-03-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins |
UA89481C2 (uk) * | 2003-09-30 | 2010-02-10 | Центокор, Инк. | Еритропоетинові міметичні шарнірно-серцевинні міметитіла людини, композиції, способи та застосування |
US20070274988A1 (en) * | 2003-10-10 | 2007-11-29 | Five Prime Therapeautics, Inc. | Kiaa0779, Splice Variants Thereof, and Methods of Their Use |
WO2005037999A2 (en) * | 2003-10-14 | 2005-04-28 | Biogen Idec Ma Inc. | Treatment of cancer using antibodies to lrrc15 |
US8129506B2 (en) * | 2003-10-24 | 2012-03-06 | Genzyme Corporation | Modulation of the interaction of MUC1 with MUC1 ligands |
EP1697415A1 (en) | 2003-11-12 | 2006-09-06 | Biogen Idec MA Inc. | NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO |
BRPI0406605B8 (pt) * | 2003-11-13 | 2021-05-25 | Hanmi Holdings Co Ltd | conjugado de proteína, método para a preparação do mesmo e composição farmacêutica para intensificar a duração e estabilidade in vivo de um polipeptídeo fisiologicamente ativo |
US8110665B2 (en) | 2003-11-13 | 2012-02-07 | Hanmi Holdings Co., Ltd. | Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier |
US8895540B2 (en) | 2003-11-26 | 2014-11-25 | DePuy Synthes Products, LLC | Local intraosseous administration of bone forming agents and anti-resorptive agents, and devices therefor |
EP1699822B1 (en) | 2003-12-30 | 2008-04-23 | MERCK PATENT GmbH | Il-7 fusion proteins with antibody portions, their preparation and their use |
ES2387028T3 (es) * | 2003-12-31 | 2012-09-12 | Merck Patent Gmbh | Proteína de fusión de Fc-eritropoyetina con farmacocinética mejorada |
PL1706428T3 (pl) | 2004-01-22 | 2010-02-26 | Merck Patent Gmbh | Przeciwciała przeciwnowotworowe o zredukowanym wiązaniu dopełniacza |
MXPA06008918A (es) * | 2004-02-06 | 2007-03-07 | Astellas Llc | Metodos de tratamiento de trastornos de la piel. |
NZ549040A (en) | 2004-02-17 | 2009-07-31 | Schering Corp | Use for interleukin-33 (IL33) and the IL-33 receptor complex |
US20100028995A1 (en) * | 2004-02-23 | 2010-02-04 | Anaphore, Inc. | Tetranectin Trimerizing Polypeptides |
CA2563379A1 (en) * | 2004-03-31 | 2005-10-20 | Centocor, Inc. | Human glp-1 mimetibodies, compositions, methods and uses |
US20080020383A1 (en) * | 2004-05-04 | 2008-01-24 | Genaissance Pharmaceuticals, Inc. | Haplotype Markers And Methods Of Using The Same To Determine Response To Treatment |
EP1750747A1 (en) * | 2004-05-07 | 2007-02-14 | Astellas US LLC | Soluble lfa-3 polypeptide for treating viral disorders |
US20060063208A1 (en) * | 2004-08-02 | 2006-03-23 | Woolf Clifford J | DRG11-responsive (DRAGON) gene and uses thereof |
US7393662B2 (en) | 2004-09-03 | 2008-07-01 | Centocor, Inc. | Human EPO mimetic hinge core mimetibodies, compositions, methods and uses |
PL1804835T3 (pl) * | 2004-09-13 | 2010-11-30 | Genzyme Corp | Konstrukty multimeryczne |
EP1797127B1 (en) | 2004-09-24 | 2017-06-14 | Amgen Inc. | Modified fc molecules |
EP1802334B1 (en) | 2004-10-21 | 2012-08-29 | Genentech, Inc. | Method for treating intraocular neovascular diseases |
MX2007004770A (es) | 2004-10-22 | 2007-11-22 | Zymogenetics Inc | Anticuerpos anti-il-22ra y moleculas y metodos para usarlos en inflamacion. |
US20090311259A1 (en) * | 2004-11-17 | 2009-12-17 | Victoria Smith | Compositions and Methods for Treatment of Tumor of Hematopoietic Origin |
CN101072793B (zh) * | 2004-12-09 | 2012-06-20 | 默克专利有限公司 | 具有降低的免疫原性的il-7变体 |
CN100515491C (zh) * | 2005-01-04 | 2009-07-22 | 健能隆医药技术(上海)有限公司 | 白介素-22的医药用途 |
ES2408704T3 (es) | 2005-01-05 | 2013-06-21 | Biogen Idec Ma Inc. | Moléculas de unión a Cripto |
WO2006081190A2 (en) | 2005-01-25 | 2006-08-03 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating cardiac conditions |
US20090155267A1 (en) * | 2005-02-09 | 2009-06-18 | Apollo Life Sciences Limited | Molecule and chimeric molecules thereof |
KR100754667B1 (ko) | 2005-04-08 | 2007-09-03 | 한미약품 주식회사 | 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Fc 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물 |
CA2605024C (en) * | 2005-04-15 | 2018-05-22 | Macrogenics, Inc. | Covalent diabodies and uses thereof |
US9963510B2 (en) * | 2005-04-15 | 2018-05-08 | Macrogenics, Inc. | Covalent diabodies and uses thereof |
US11254748B2 (en) | 2005-04-15 | 2022-02-22 | Macrogenics, Inc. | Covalent diabodies and uses thereof |
US9284375B2 (en) * | 2005-04-15 | 2016-03-15 | Macrogenics, Inc. | Covalent diabodies and uses thereof |
PE20061324A1 (es) | 2005-04-29 | 2007-01-15 | Centocor Inc | Anticuerpos anti-il-6, composiciones, metodos y usos |
CN101198624B (zh) | 2005-05-06 | 2012-10-10 | 津莫吉尼蒂克斯公司 | Il-31单克隆抗体及使用方法 |
EP2388274A1 (en) * | 2005-06-17 | 2011-11-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Methods of purifying anti A Beta antibodies |
TR201902033T4 (tr) | 2005-06-30 | 2019-03-21 | Janssen Biotech Inc | Anti-IL-23 antikorları, bileşimleri, yöntemleri ve kullanımları. |
EP2238986A3 (en) | 2005-07-08 | 2010-11-03 | Biogen Idec MA Inc. | Sp35 antibodies and uses thereof |
US8008453B2 (en) | 2005-08-12 | 2011-08-30 | Amgen Inc. | Modified Fc molecules |
EP1926747A1 (en) * | 2005-08-12 | 2008-06-04 | Schering Corporation | Mcp1 fusions |
CA2616479A1 (en) | 2005-09-01 | 2007-03-08 | Ares Trading S.A. | Treatment of optic neuritis |
US20070104689A1 (en) * | 2005-09-27 | 2007-05-10 | Merck Patent Gmbh | Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens |
US20090238822A1 (en) * | 2005-10-13 | 2009-09-24 | Virexx Medical Corp. | Chimeric Hepatitis C Virus Antigens For Eliciting an Immune Response |
TW200722436A (en) * | 2005-10-21 | 2007-06-16 | Hoffmann La Roche | A peptide-immunoglobulin-conjugate |
CA2628928A1 (en) * | 2005-11-10 | 2007-05-24 | Receptor Biologix, Inc. | Hepatocyte growth factor intron fusion proteins |
ES2433251T5 (es) | 2005-11-14 | 2020-03-13 | Teva Pharmaceuticals Int Gmbh | Anticuerpos antagonistas dirigidos contra un péptido relacionado con el gen de la calcitonina y procedimientos que utilizan los mismos |
EP1957536A2 (en) * | 2005-12-01 | 2008-08-20 | Domantis Limited | Noncompetitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1 |
US20070136826A1 (en) * | 2005-12-02 | 2007-06-14 | Biogen Idec Inc. | Anti-mouse CD20 antibodies and uses thereof |
US20070161546A1 (en) * | 2005-12-15 | 2007-07-12 | Colm King | Methods and compositions for treatment of cancer |
JP2009521503A (ja) * | 2005-12-22 | 2009-06-04 | ディー・エイチ・ワイ・アンド・カンパニー・リミテッド | インターロイキン−22結合タンパク質に対する抗体と、代謝性疾患の処置のためのその使用 |
MX2008008621A (es) | 2005-12-29 | 2008-11-27 | Centocor Inc | Anticuerpos anti-il-23 humanos, composiciones, metodos y usos. |
ATE555125T1 (de) * | 2005-12-30 | 2012-05-15 | Merck Patent Gmbh | Interleukin-12p40-varianten mit verbesserter stabilität |
EA016429B1 (ru) | 2005-12-30 | 2012-04-30 | Мерк Патент Гмбх | Антитела против cd19 с пониженной иммуногенностью |
EP1991581A2 (en) * | 2006-01-10 | 2008-11-19 | Zymogenetics, Inc. | Methods of treating pain and inflammation in neuronal tissue using il-31 antagonists |
US7625564B2 (en) | 2006-01-27 | 2009-12-01 | Novagen Holding Corporation | Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo |
AR059193A1 (es) | 2006-01-31 | 2008-03-12 | Bayer Schering Pharma Ag | Modulacion de la actividad de mdl-1 para el tratamiento de enfermedades inflamatorias |
GB0604187D0 (en) * | 2006-03-02 | 2006-04-12 | Fusion Antibodies Ltd | Peptide and uses thereof |
EP2007538A4 (en) * | 2006-03-31 | 2011-04-20 | Centocor Ortho Biotech Inc | BINDING PARTNER WITH MODIFIED IMMUNOGLOBULINDOMAS FOR EXTENDED SEMI-VALUE TIME |
WO2007135172A2 (en) | 2006-05-24 | 2007-11-29 | Laboratoires Serono S.A. | Cladribine regimen for treating multiple sclerosis |
AU2007257683A1 (en) * | 2006-06-12 | 2007-12-21 | Symphogen A/S | Pan-cell surface receptor- specific therapeutics |
WO2007149586A2 (en) * | 2006-06-22 | 2007-12-27 | Vaccinex, Inc. | Anti-c35 antibodies for treating cancer |
WO2008036449A2 (en) * | 2006-06-29 | 2008-03-27 | The Regents Of The University Of California | Chemical antibodies for immunotherapy and imaging |
US8637469B2 (en) | 2006-07-11 | 2014-01-28 | Roy C. Levitt | Rhinosinusitis prevention and therapy with proinflammatory cytokine inhibitors |
US20080014285A1 (en) * | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Di Mauro Thomas M | Method of treating neurodegenerative brain disease with a composite comprising superparamagnetic nanoparticles and a therapeutic compound |
DK2068889T3 (da) | 2006-08-10 | 2020-02-03 | Roy C Levitt | Anakinra til anvendelse i behandling af bronchiolitis obliterans syndrom |
WO2008020079A1 (en) | 2006-08-18 | 2008-02-21 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of deseases and disorders associated with il-6-mediated signalling |
US7833527B2 (en) * | 2006-10-02 | 2010-11-16 | Amgen Inc. | Methods of treating psoriasis using IL-17 Receptor A antibodies |
EP2067041A2 (en) | 2006-10-03 | 2009-06-10 | Biogen Idec MA, Inc. | Biomarkers and assays for the treatment of cancer |
JP5519287B2 (ja) | 2006-11-02 | 2014-06-11 | ダニエル・ジェイ・カポン | 可動部を備えたハイブリッド免疫グロブリン |
PE20081250A1 (es) * | 2006-11-28 | 2008-10-07 | Centelion | FUSIONES Fc CON RECEPTOR PARA FGF SOLUBLE MODIFICADAS, CON ACTIVIDAD BIOLOGICA MEJORADA |
CN103408661B (zh) | 2007-01-05 | 2016-04-06 | 苏黎世大学 | 提供疾患特异性结合分子和靶的方法 |
AU2008205244B2 (en) | 2007-01-09 | 2013-02-07 | Biogen Ma Inc. | Sp35 antibodies and uses thereof |
CA2678493A1 (en) | 2007-02-23 | 2008-08-28 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods to activate or block the hla-e/qa-1 restricted cd8+ t cell regulatory pathway to treat immunological disease |
US20100028951A1 (en) * | 2007-03-07 | 2010-02-04 | Stephen Hamilton | Production of glycoproteins with modified fucosylation |
CA2690825C (en) | 2007-05-11 | 2019-02-12 | Altor Bioscience Corporation | Fusion molecules and il-15 variants |
US7906149B2 (en) * | 2007-05-25 | 2011-03-15 | Boval Company, L.P. | Method for treating allergic dermatitis |
ES2456963T3 (es) * | 2007-06-04 | 2014-04-24 | Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences | Agentes para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y métodos para usar los mismos |
MX2009012968A (es) * | 2007-06-06 | 2010-04-01 | Domantis Ltd | Polipeptidos, dominios variables de anticuerpo y antagonistas. |
WO2009151717A2 (en) | 2008-04-02 | 2009-12-17 | Macrogenics, Inc. | Bcr-complex-specific antibodies and methods of using same |
US8067548B2 (en) * | 2007-07-26 | 2011-11-29 | Novagen Holding Corporation | Fusion proteins having mutated immunoglobulin hinge region |
GB0717337D0 (en) * | 2007-09-06 | 2007-10-17 | Ucb Pharma Sa | Method of treatment |
JP2011500005A (ja) | 2007-10-11 | 2011-01-06 | ユニバーシティー ヘルス ネットワーク | ヒト造血幹細胞の生着を増加させるためのSIRPα−CD47相互作用の調節およびそのための化合物 |
BRPI0818033A2 (pt) * | 2007-10-16 | 2015-03-24 | Symphogen As | Composições compreendendo multímeros otimizados de her1 e her3 e métodos para usos dos mesmos |
EP2612868B1 (en) * | 2007-11-01 | 2018-08-15 | Astellas Pharma Inc. | Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids |
WO2009061853A2 (en) * | 2007-11-05 | 2009-05-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Mutant interleukin-2 (il-2) polypeptides |
EP2217261B1 (en) | 2007-11-09 | 2015-10-07 | Genentech, Inc. | Activin receptor-like kinase-1 antagonist compositions and methods of use |
EP2222707B1 (en) | 2007-11-21 | 2016-01-06 | Oregon Health & Science University | Anti-factor xi monoclonal antibodies and methods of use thereof |
WO2009090493A2 (en) * | 2007-12-06 | 2009-07-23 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | Tlr4 decoy receptor protein |
EP2796466B1 (en) | 2007-12-07 | 2017-11-22 | ZymoGenetics, Inc. | Humanized antibody molecules specific for IL-31 |
US8986696B2 (en) * | 2007-12-21 | 2015-03-24 | Depuy Mitek, Inc. | Trans-capsular administration of p38 map kinase inhibitors into orthopedic joints |
US20090162351A1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-06-25 | Depuy Spine, Inc. | Transdiscal administration of inhibitors of p38 MAP kinase |
NZ587292A (en) | 2008-03-04 | 2012-09-28 | Pfizer Ltd | Use of anti-CGRP (calcitonin gene-related peptide) antagonists to treat chronic pain |
WO2009133208A1 (en) * | 2008-05-02 | 2009-11-05 | Novartis Ag | Improved fibronectin-based binding molecules and uses thereof |
RU2553517C2 (ru) | 2008-05-06 | 2015-06-20 | Дженентек, Инк. | Варианты crig с созревшей аффинностью |
ES2675730T3 (es) * | 2008-06-04 | 2018-07-12 | Macrogenics, Inc. | Anticuerpos con unión alterada a FcRn y métodos de uso de los mismos |
AU2009269099B2 (en) | 2008-07-09 | 2016-03-10 | Biogen Ma Inc. | Compositions comprising antibodies to LINGO or fragments thereof |
AR072596A1 (es) | 2008-07-23 | 2010-09-08 | Hanmi Pharmaceutical Co Ltd | Un complejo proteico que comprende una proteina dimerica y un polimero no peptidico |
US20100159485A1 (en) * | 2008-12-19 | 2010-06-24 | Centre For Dna Fingerprinting And Diagnostics | Detection of mycobacterium tuberculosis |
PL2949666T3 (pl) | 2008-12-19 | 2019-07-31 | Biogen International Neuroscience Gmbh | Ludzkie przeciwciała przeciwko alfa-synukleinie |
CN102341411A (zh) | 2008-12-31 | 2012-02-01 | 比奥根艾迪克Ma公司 | 抗-淋巴细胞毒素抗体 |
EP2411412B1 (en) | 2009-03-24 | 2015-05-27 | Teva Biopharmaceuticals USA, Inc. | Humanized antibodies against light and uses thereof |
KR101766927B1 (ko) | 2009-04-01 | 2017-08-09 | 제넨테크, 인크. | 인슐린 저항성 장애의 치료 |
US10618964B2 (en) | 2009-04-10 | 2020-04-14 | Ablynx N.V. | Nanobody against IL-6R |
US8748581B2 (en) | 2009-04-10 | 2014-06-10 | Ablynx N.V. | Anti-IL-6R polypeptides and pharmaceutical compositions thereof |
CA2759333A1 (en) | 2009-04-22 | 2010-10-28 | Merck Patent Gmbh | Antibody fusion proteins with modified fcrn binding sites |
KR101183262B1 (ko) | 2009-04-22 | 2012-09-14 | (주)알테오젠 | 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 단백질 또는 펩티드 융합체, 및 이를 이용하여 체내 반감기를 증가시키는 방법 |
MX2011011718A (es) | 2009-05-08 | 2012-01-27 | Vaccinex Inc | Anticuerpos anti-cd100 y metodos para su uso. |
EP2429574B1 (en) | 2009-05-15 | 2015-05-06 | University Health Network | Compositions and methods for treating hematologic cancers targeting the sirp - cd47 interaction |
US8685398B2 (en) | 2009-06-15 | 2014-04-01 | Biokine Therapeutics Ltd. | Chemokine binding polypeptides capable of inhibiting the course of autoimmunity, inflammation and cancer |
US20110039300A1 (en) | 2009-08-10 | 2011-02-17 | Robert Bayer | Antibodies with enhanced adcc functions |
US20110053223A1 (en) | 2009-08-14 | 2011-03-03 | Robert Bayer | Cell culture methods to make antibodies with enhanced adcc function |
WO2011024113A1 (en) | 2009-08-28 | 2011-03-03 | Rinat Neuroscience Corporation | Methods for treating visceral pain by administering antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide |
WO2011044368A1 (en) | 2009-10-07 | 2011-04-14 | Macrogenics, Inc. | Fc region-containing polypeptides that exhibit improved effector function due to alterations of the extent of fucosylation, and methods for their use |
TW201117824A (en) | 2009-10-12 | 2011-06-01 | Amgen Inc | Use of IL-17 receptor a antigen binding proteins |
WO2011056502A1 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Genentech, Inc. | Bone morphogenetic protein receptor type ii compositions and methods of use |
WO2011056494A1 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Genentech, Inc. | Activin receptor-like kinase-1 antagonist and vegfr3 antagonist combinations |
WO2011056497A1 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Genentech, Inc. | Activin receptor type iib compositions and methods of use |
US20110165122A1 (en) * | 2009-11-10 | 2011-07-07 | The Regents Of The University Of California | Method for targeted and sustained antiviral therapy |
WO2011071957A1 (en) | 2009-12-07 | 2011-06-16 | Sea Lane Biotechnologies, Llc | Conjugates comprising an antibody surrogate scaffold with improved pharmacokinetic properties |
US20130052195A1 (en) | 2009-12-23 | 2013-02-28 | Emergent Product Development Seattle,LLC | Compositions Comprising TNF-alpha and IL-6 Antagonists and Methods of Use Thereof |
US8637637B2 (en) | 2010-01-12 | 2014-01-28 | Bill Nai-Chau Sun | Fc fusion proteins of human growth hormone |
MY182680A (en) | 2010-01-15 | 2021-01-29 | Amgen K A Inc | Antibody formulation and therapeutic regimens |
EP2536435B1 (en) | 2010-02-18 | 2017-11-15 | Janssen Biotech, Inc. | Monkey homolog of human interferon omega |
US8802091B2 (en) | 2010-03-04 | 2014-08-12 | Macrogenics, Inc. | Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof |
CA2791658C (en) | 2010-03-04 | 2019-10-01 | Macrogenics, Inc. | Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof |
WO2011109280A1 (en) | 2010-03-05 | 2011-09-09 | Lerner Research Institute | Methods and compositions to treat immune-mediated disorders |
US20150231215A1 (en) | 2012-06-22 | 2015-08-20 | Randolph J. Noelle | VISTA Antagonist and Methods of Use |
EP2552947A4 (en) | 2010-03-26 | 2013-11-13 | Dartmouth College | VISTA REGULATORY T CELL MEDIATOR PROTEIN, VISTA BINDING ACTIVE SUBSTANCES AND USE THEREOF |
US10745467B2 (en) | 2010-03-26 | 2020-08-18 | The Trustees Of Dartmouth College | VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders |
US20110243943A1 (en) * | 2010-04-02 | 2011-10-06 | Athena Discovery, Inc. | Treatment using relaxin-fusion proteins with extended in vivo half-lives |
JP5908888B2 (ja) | 2010-04-16 | 2016-04-26 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | 改変された植物のシステインプロテアーゼ及びその使用 |
US8524217B2 (en) | 2010-05-11 | 2013-09-03 | Merck Sharp & Dohme Corp. | MCP1-Ig fusion variants |
AU2011268146A1 (en) | 2010-06-17 | 2013-01-10 | Actogenix Nv | Compositions and methods for treating inflammatory conditions |
EP3508573A1 (en) | 2010-07-09 | 2019-07-10 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Systems for factor viii processing and methods thereof |
JP5964300B2 (ja) | 2010-08-02 | 2016-08-03 | マクロジェニクス,インコーポレーテッド | 共有結合型ダイアボディおよびその使用 |
EP2601214B1 (en) | 2010-08-06 | 2017-11-01 | Genzyme Corporation | Vegf antagonist compositions and uses thereof |
EP2611832B1 (en) | 2010-09-02 | 2017-11-29 | Vaccinex, Inc. | Anti-cxcl13 antibodies and methods of using the same |
US11053299B2 (en) | 2010-09-21 | 2021-07-06 | Immunity Bio, Inc. | Superkine |
KR20140020228A (ko) | 2010-09-21 | 2014-02-18 | 알토 바이오사이언스 코포레이션 | 다량체성 아이엘 15 용해성 융합 분자 및 그의 제조 및 사용 방법 |
EP2621950A4 (en) | 2010-09-27 | 2015-09-02 | Janssen Biotech Inc | ANTIBODIES FOR BINDING HUMAN COLLAGEN II |
SI2627672T1 (sl) | 2010-10-11 | 2018-10-30 | Biogen International Neuroscience Gmbh | Človeška protitelesa anti-tau |
KR101333958B1 (ko) * | 2010-10-20 | 2013-11-27 | 주식회사 한독 | 인간 인터루킨-1 수용체 길항제-하이브리드 Fc 융합단백질 |
AR083546A1 (es) | 2010-10-25 | 2013-03-06 | Genentech Inc | Tratamiento de inflamacion gastrointestinal, soriasis y asma |
EP2638068B1 (en) | 2010-11-08 | 2018-12-26 | Novartis AG | Cxcr2 binding polypeptides |
CN103380145B (zh) | 2010-12-17 | 2016-10-12 | 生物控股有限公司 | 人类抗-sod1抗体 |
AR086515A1 (es) | 2011-05-20 | 2013-12-18 | Alderbio Holdings Llc | Uso de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-cgrp o anti-cgrp-r para tratar o prevenir las formas cronicas y agudas de la diarrea |
CN107827982B (zh) | 2011-05-20 | 2021-07-06 | H.伦德贝克公司 | 抗cgrp抗体和抗体片段用于在有需要的受试者中预防或抑制畏光或厌光的用途 |
SI3495392T1 (sl) | 2011-05-20 | 2021-11-30 | H. Lundbeck A/S | Sestavki proti CGRP in uporaba le-teh |
JP6145088B2 (ja) | 2011-05-21 | 2017-06-07 | マクロジェニクス,インコーポレーテッド | 脱免疫化血清結合ドメイン及び血清半減期を延長するためのその使用 |
AU2012260601B2 (en) | 2011-05-25 | 2018-02-01 | Innate Pharma, S.A. | Anti-KIR antibodies for the treatment of inflammatory disorders |
SI2723379T1 (sl) | 2011-06-23 | 2019-03-29 | Biogen International Neuroscience Gmbh | Molekule, ki se vežejo ma anti alfa-sinuklein |
EP2723370A4 (en) | 2011-06-24 | 2015-06-03 | Univ Colorado Regents | COMPOSITIONS, PROCESS AND USE OF ALPHA-1-ANTITRYPHIN FUSION MOLECULES |
CA2840944A1 (en) * | 2011-07-08 | 2013-01-17 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Fusion proteins releasing relaxin and uses thereof |
US9738707B2 (en) | 2011-07-15 | 2017-08-22 | Biogen Ma Inc. | Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto |
US20140234330A1 (en) | 2011-07-22 | 2014-08-21 | Amgen Inc. | Il-17 receptor a is required for il-17c biology |
EP2747782B1 (en) * | 2011-09-23 | 2018-01-17 | Ablynx NV | Prolonged inhibition of interleukin-6 mediated signaling |
US11951157B2 (en) | 2011-10-11 | 2024-04-09 | Universitat Zurich | Methods of treating malignant tumour with IL-12 and anti-PD-1 antibody |
PL3351261T3 (pl) * | 2011-10-11 | 2021-12-06 | Universität Zürich | Lek złożony zawierający IL-12 i środek do blokowania cząsteczek hamujących komórki T w terapii nowotworów |
US8846034B2 (en) | 2011-10-24 | 2014-09-30 | Halozyme, Inc. | Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof |
KR102348985B1 (ko) | 2012-01-10 | 2022-01-12 | 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코포레이트 | 알파-1 안티트립신 융합 분자용 조성물, 방법 및 용도 |
US9890213B2 (en) | 2012-03-02 | 2018-02-13 | Vaccinex, Inc. | Methods for the treatment of B cell-mediated inflammatory diseases |
MX349035B (es) | 2012-05-17 | 2017-07-07 | Extend Biosciences Inc | Portadores para el suministro mejorado de farmaco. |
EP2852610B1 (en) | 2012-05-23 | 2018-07-11 | Glykos Finland Oy | Production of fucosylated glycoproteins |
AU2013277051B2 (en) | 2012-06-22 | 2018-06-07 | King's College London | Novel VISTA-Ig constructs and the use of VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders |
US9890215B2 (en) | 2012-06-22 | 2018-02-13 | King's College London | Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer |
CA2878404A1 (en) | 2012-07-10 | 2014-01-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Biomaterials for enhanced implant-host integration |
EP2879710B1 (en) | 2012-08-03 | 2019-11-13 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Medical uses of agents that modulate immune cell activation and corresponding screening methods |
MY181648A (en) | 2012-08-24 | 2020-12-30 | Univ California | Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis |
AU2013312211B2 (en) | 2012-09-07 | 2018-03-29 | King's College London | VISTA modulators for diagnosis and treatment of cancer |
US9278124B2 (en) | 2012-10-16 | 2016-03-08 | Halozyme, Inc. | Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods |
WO2014094122A1 (en) | 2012-12-17 | 2014-06-26 | Trillium Therapeutics Inc. | Treatment of cd47+ disease cells with sirp alpha-fc fusions |
PT2935326T (pt) | 2012-12-21 | 2020-09-14 | Biogen Ma Inc | Anticorpos anti-tau humanos |
US9771413B2 (en) | 2012-12-31 | 2017-09-26 | Neurimmune Holding Ag | Recombinant human antibodies for therapy and prevention of polyomavirus-related diseases |
US9487587B2 (en) | 2013-03-05 | 2016-11-08 | Macrogenics, Inc. | Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells of a companion animal that express an activating receptor and cells that express B7-H3 and uses thereof |
AU2013205589A1 (en) | 2013-03-08 | 2014-09-25 | Vaccinex, Inc. | Anti-CXCL13 antibodies and associated epitope sequences |
US9458246B2 (en) | 2013-03-13 | 2016-10-04 | Amgen Inc. | Proteins specific for BAFF and B7RP1 |
JOP20140087B1 (ar) | 2013-03-13 | 2021-08-17 | Amgen Inc | بروتينات مخصصة ل baff و b7rp1 وإستخداماتها |
WO2014159940A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Macrogenics, Inc. | Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells that express an activating receptor |
SG11201507429TA (en) | 2013-03-15 | 2015-10-29 | Genentech Inc | Il-22 polypeptides and il-22 fc fusion proteins and methods of use |
AU2014228938B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-05-02 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor IX polypeptide formulations |
ES2708565T3 (es) | 2013-03-15 | 2019-04-10 | Atyr Pharma Inc | Conjugados de Fc-histidil-ARNt sintetasa |
EP3816625A1 (en) | 2013-05-06 | 2021-05-05 | Scholar Rock, Inc. | Compositions and methods for growth factor modulation |
EP3293275B1 (en) | 2013-06-06 | 2021-08-04 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for identification, assessment prevention, and treatment of cancer using pd-l1 isoforms |
AR096891A1 (es) | 2013-07-12 | 2016-02-03 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo |
US11384149B2 (en) | 2013-08-09 | 2022-07-12 | Macrogenics, Inc. | Bi-specific monovalent Fc diabodies that are capable of binding CD32B and CD79b and uses thereof |
UA116479C2 (uk) | 2013-08-09 | 2018-03-26 | Макродженікс, Інк. | БІСПЕЦИФІЧНЕ МОНОВАЛЕНТНЕ Fc-ДІАТІЛО, ЯКЕ ОДНОЧАСНО ЗВ'ЯЗУЄ CD32B I CD79b, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ |
EP2840091A1 (en) | 2013-08-23 | 2015-02-25 | MacroGenics, Inc. | Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof |
EP2839842A1 (en) | 2013-08-23 | 2015-02-25 | MacroGenics, Inc. | Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof |
WO2015048312A1 (en) | 2013-09-26 | 2015-04-02 | Costim Pharmaceuticals Inc. | Methods for treating hematologic cancers |
EP3077048B1 (en) | 2013-12-07 | 2019-07-17 | Case Western Reserve University | Compositions and methods of treating thrombosis |
US11708411B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-07-25 | Wake Forest University Health Sciences | Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines |
WO2015097536A2 (en) | 2013-12-24 | 2015-07-02 | Janssen Pharmaceutical Nv | Anti-vista antibodies and fragments |
US11014987B2 (en) | 2013-12-24 | 2021-05-25 | Janssen Pharmaceutics Nv | Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same |
EP3096776B1 (en) * | 2014-01-22 | 2020-12-02 | Antagonis Biotherapeutics GmbH | Novel glycosaminoglycan-antagonising fusion proteins and methods of using same |
US10556945B2 (en) | 2014-03-21 | 2020-02-11 | Teva Pharmaceuticals International Gmbh | Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same |
UA123759C2 (uk) | 2014-03-21 | 2021-06-02 | Тева Фармасьютікалз Інтернешнл Гмбх | Застосування моноклонального антитіла, яке інгібує шлях пов'язаного з геном кальциноніну пептиду (cgrp), для лікування або зниження частоти випадків мігренозного головного болю у суб'єкта |
US20170174772A1 (en) | 2014-03-31 | 2017-06-22 | Kirin-Amgen, Inc. | Methods of treating nail and scalp psoriasis |
AU2015274504B2 (en) | 2014-06-11 | 2021-02-04 | Kathy A. Green | Use of VISTA agonists and antagonists to suppress or enhance humoral immunity |
US9925247B2 (en) | 2014-06-30 | 2018-03-27 | Altor Bioscience Corporation | IL-15-based molecules and methods of use thereof |
CA2954974A1 (en) | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Glykos Finland Oy | Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi |
EP3177638B1 (en) | 2014-08-04 | 2019-11-27 | Case Western Reserve University | Targeting peptides and methods of use |
US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
EP3201227A4 (en) | 2014-09-29 | 2018-04-18 | Duke University | Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm |
AU2015326911B2 (en) | 2014-09-30 | 2021-07-08 | Neurimmune Holding Ag | Human-derived anti-dipeptide repeats (DPRs) antibody |
AU2015334984A1 (en) | 2014-10-21 | 2017-04-13 | Ablynx Nv | Treatment of IL-6R related diseases |
US9789197B2 (en) | 2014-10-22 | 2017-10-17 | Extend Biosciences, Inc. | RNAi vitamin D conjugates |
WO2016065052A1 (en) | 2014-10-22 | 2016-04-28 | Extend Biosciences, Inc. | Insulin vitamin d conjugates |
US9585934B2 (en) | 2014-10-22 | 2017-03-07 | Extend Biosciences, Inc. | Therapeutic vitamin D conjugates |
AU2015357463B2 (en) | 2014-12-05 | 2021-10-07 | Immunext, Inc. | Identification of VSIG8 as the putative vista receptor and its use thereof to produce vista/VSIG8 modulators |
AU2015360903B2 (en) | 2014-12-08 | 2021-03-25 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for upregulating immune responses using combinations of anti-RGMB and anti-PD-1 agents |
JP2018506275A (ja) | 2015-01-28 | 2018-03-08 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 多発性硬化症の遺伝子発現マーカー及び治療 |
US11820807B2 (en) | 2015-06-12 | 2023-11-21 | Ubi Pharma Inc | Immunoglobulin fusion proteins and uses thereof |
BR112017027870A2 (pt) | 2015-06-24 | 2018-08-28 | Janssen Pharmaceutica Nv | anticorpos e fragmentos anti-vista |
RU2740672C2 (ru) | 2015-08-07 | 2021-01-19 | ЭйЭлЭкс Онколоджи Инк. | Конструкции, имеющие sirp-альфа домен или его вариант |
JP7020687B2 (ja) | 2015-09-15 | 2022-02-16 | ボード オブ リージェンツ,ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム | T細胞受容体(tcr)結合抗体及びその使用 |
US11338065B2 (en) | 2015-10-08 | 2022-05-24 | Massachusetts Institute Of Technology | In situ expansion of engineered devices for regeneration |
US11207393B2 (en) | 2015-10-16 | 2021-12-28 | President And Fellows Of Harvard College | Regulatory T cell PD-1 modulation for regulating T cell effector immune responses |
MX2020011500A (es) | 2015-12-17 | 2020-12-07 | Alonbio Ltd | Moléculas pequeñas para inhibir la actividad de quimiocinas, la actividad de una cinasa y/o el crecimiento de células cancerosas. |
WO2017103931A1 (en) | 2015-12-17 | 2017-06-22 | Biokine Therapeutics Ltd. | Small molecules against cancer |
EP3397274A1 (en) | 2015-12-31 | 2018-11-07 | The Regents of the University of Colorado, a body corporate | Methods and uses for alpha-1 antitrypsin or recombinant forms thereof, on steroid-refractory graft versus host disease involving gastrointestinal complications |
US10899836B2 (en) | 2016-02-12 | 2021-01-26 | Janssen Pharmaceutica Nv | Method of identifying anti-VISTA antibodies |
RU2756109C2 (ru) | 2016-03-10 | 2021-09-28 | Виела Байо, Инк. | Связывающие ilt7 молекулы и способы их применения |
SG11201808979UA (en) | 2016-04-15 | 2018-11-29 | Macrogenics Inc | Novel b7-h3 binding molecules, antibody drug conjugates thereof and methods of use thereof |
CA3020848A1 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Anti-human vista antibodies and use thereof |
WO2017205726A1 (en) | 2016-05-27 | 2017-11-30 | Altor Bioscience Corporation | Construction and characterization of multimeric il-15-based molecules with cd3 binding domains |
JP2018035137A (ja) | 2016-07-13 | 2018-03-08 | マブイミューン ダイアグノスティックス エイジーMabimmune Diagnostics Ag | 新規な抗線維芽細胞活性化タンパク質(fap)結合薬剤およびその使用 |
US10392434B2 (en) | 2016-09-23 | 2019-08-27 | Teva Pharmaceuticals International Gmbh | Treating refractory migraine |
SG11201903306SA (en) | 2016-10-21 | 2019-05-30 | Altor Bioscience Corp | Multimeric il-15-based molecules |
US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
CN110234351A (zh) | 2017-01-30 | 2019-09-13 | 詹森生物科技公司 | 用于治疗活动性银屑病关节炎的抗tnf抗体、组合物和方法 |
US11649288B2 (en) | 2017-02-07 | 2023-05-16 | Seattle Children's Hospital | Phospholipid ether (PLE) CAR T cell tumor targeting (CTCT) agents |
CN110418652A (zh) | 2017-02-07 | 2019-11-05 | 詹森生物科技公司 | 用于治疗活动性强直性脊柱炎的抗tnf抗体、组合物和方法 |
WO2018160622A1 (en) | 2017-02-28 | 2018-09-07 | Endocyte, Inc. | Compositions and methods for car t cell therapy |
AU2018229278A1 (en) | 2017-02-28 | 2019-10-17 | Sanofi | Therapeutic RNA |
CN110785435B (zh) | 2017-03-06 | 2024-01-23 | 艾尔特生物科技公司 | 与il-12和il-18的基于il-15的融合物 |
US20190048055A1 (en) | 2017-03-31 | 2019-02-14 | Altor Bioscience Corporation | Alt-803 in combination with anti-cd38 antibody for cancer therapies |
WO2018195338A1 (en) | 2017-04-20 | 2018-10-25 | Atyr Pharma, Inc. | Compositions and methods for treating lung inflammation |
AU2018261947A1 (en) | 2017-05-05 | 2019-11-07 | Vaccinex, Inc. | Human anti-semaphorin 4D antibody |
AU2018323455B2 (en) | 2017-08-28 | 2022-02-03 | Altor Bioscience Llc | IL-15-based fusions to IL-7 and IL-21 |
US11311576B2 (en) | 2018-01-22 | 2022-04-26 | Seattle Children's Hospital | Methods of use for CAR T cells |
CR20200327A (es) | 2018-01-26 | 2020-11-05 | Genentech Inc | Proteínas de fusión fc il-22 y métodos de uso |
CA3088763A1 (en) | 2018-01-26 | 2019-08-01 | Genentech, Inc. | Compositions and methods of use |
AU2019226085A1 (en) | 2018-02-21 | 2020-09-17 | Genentech, Inc. | Dosing for treatment with IL-22 Fc fusion proteins |
CN111867612A (zh) | 2018-03-26 | 2020-10-30 | 阿尔托生物科学有限责任公司 | 抗PDL1、IL-15和TGF-β受体组合分子 |
CN112041333A (zh) | 2018-04-26 | 2020-12-04 | 古德T细胞有限公司 | 新型融合蛋白和用于预防或治疗癌症的包含该融合蛋白的药物组合物 |
US20210196787A1 (en) * | 2018-06-28 | 2021-07-01 | National University Corporation Okayama University | Agent for enhancing phagocytosis ability of neutrophils |
US20210347849A1 (en) * | 2018-07-24 | 2021-11-11 | Good T Cells, Inc. | Composition for Preventing or Treating Immune-Related Diseases |
CN110964116A (zh) | 2018-09-26 | 2020-04-07 | 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 | GLP1-Fc融合蛋白及其缀合物 |
AU2020206241A1 (en) | 2019-01-08 | 2021-08-26 | H. Lundbeck A/S | Acute treatment and rapid treatment of headache using anti-CGRP antibodies |
JP2022518208A (ja) | 2019-01-15 | 2022-03-14 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | 若年性特発性関節炎の治療のための抗tnf抗体、組成物、及び方法 |
WO2020152544A1 (en) | 2019-01-23 | 2020-07-30 | Janssen Biotech, Inc. | Anti-tnf antibody compositions for use in methods for the treatment of psoriatic arthritis |
CN113795513A (zh) | 2019-02-13 | 2021-12-14 | 布里格姆妇女医院 | 抗外周淋巴结地址素抗体及其用途 |
MA55283A (fr) | 2019-03-14 | 2022-01-19 | Janssen Biotech Inc | Procédés de production de compositions d'anticorps anti-tnf |
KR20210142002A (ko) | 2019-03-14 | 2021-11-23 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 항-tnf 항체 조성물을 생성하기 위한 제조 방법 |
CA3133388A1 (en) | 2019-03-14 | 2020-09-17 | Janssen Biotech, Inc. | Methods for producing anti-tnf antibody compositions |
CA3090315C (en) | 2019-05-15 | 2023-09-19 | Biokine Therapeutics Ltd. | 8-phenoxy-quinolinone derivatives for treating cancer, inhibiting chemokine activity and/or inducing cell death |
US11780911B2 (en) | 2019-05-23 | 2023-10-10 | Janssen Biotech, Inc. | Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to IL-23 and TNF alpha |
WO2020243338A1 (en) | 2019-05-31 | 2020-12-03 | ALX Oncology Inc. | Methods of treating cancer with sirp alpha fc fusion in combination with an immune checkpoint inhibitor |
CN113939531A (zh) | 2019-06-03 | 2022-01-14 | 詹森生物科技公司 | 用于治疗银屑病关节炎的抗tnf抗体组合物和方法 |
MX2021014882A (es) | 2019-06-03 | 2022-03-25 | Janssen Biotech Inc | Anticuerpos anti-tnf, composiciones y métodos para el tratamiento de la espondilitis anquilosante activa. |
WO2021028752A1 (en) | 2019-08-15 | 2021-02-18 | Janssen Biotech, Inc. | Anti-tfn antibodies for treating type i diabetes |
WO2021178843A1 (en) | 2020-03-05 | 2021-09-10 | DiaMedica USA Inc. | Ulinastatin polypeptides |
WO2021207662A1 (en) | 2020-04-10 | 2021-10-14 | Genentech, Inc. | Use of il-22fc for the treatment or prevention of pneumonia, acute respiratory distress syndrome, or cytokine release syndrome |
WO2021230233A1 (ja) * | 2020-05-14 | 2021-11-18 | 学校法人日本医科大学 | 感染症の治療又は予防剤 |
WO2022261183A2 (en) | 2021-06-08 | 2022-12-15 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for treating and/or identifying an agent for treating intestinal cancers |
CN117957251A (zh) | 2021-07-09 | 2024-04-30 | 詹森生物科技公司 | 用于制备抗tnf抗体组合物的制造方法 |
WO2023281462A1 (en) | 2021-07-09 | 2023-01-12 | Janssen Biotech, Inc. | Manufacturing methods for producing anti-tnf antibody compositions |
WO2023097119A2 (en) | 2021-11-29 | 2023-06-01 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods and compositions to modulate riok2 |
WO2023168426A1 (en) | 2022-03-03 | 2023-09-07 | Enosi Therapeutics Corporation | Compositions and cells containing mixtures of oligo-trap fusion proteins (ofps) and uses thereof |
WO2023173084A1 (en) | 2022-03-11 | 2023-09-14 | University Of Rochester | Cyclopeptibodies and uses thereof |
US11780910B1 (en) | 2022-05-02 | 2023-10-10 | Novo Nordisk A/S | Anti-ANGPTL3 antibodies suitable for high concentration compositions and subcutaneous administration |
Family Cites Families (60)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
US3691016A (en) | 1970-04-17 | 1972-09-12 | Monsanto Co | Process for the preparation of insoluble enzymes |
DE2247163A1 (de) | 1972-09-26 | 1974-03-28 | Merck Patent Gmbh | Traegermatrix zur fixierung biologisch wirksamer stoffe und verfahren zu ihrer herstellung |
CA1023287A (en) | 1972-12-08 | 1977-12-27 | Boehringer Mannheim G.M.B.H. | Process for the preparation of carrier-bound proteins |
GB1479268A (en) | 1973-07-05 | 1977-07-13 | Beecham Group Ltd | Pharmaceutical compositions |
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
US4002531A (en) | 1976-01-22 | 1977-01-11 | Pierce Chemical Company | Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby |
US4195128A (en) | 1976-05-03 | 1980-03-25 | Bayer Aktiengesellschaft | Polymeric carrier bound ligands |
US4330440A (en) | 1977-02-08 | 1982-05-18 | Development Finance Corporation Of New Zealand | Activated matrix and method of activation |
CA1093991A (en) | 1977-02-17 | 1981-01-20 | Hideo Hirohara | Enzyme immobilization with pullulan gel |
US4229537A (en) | 1978-02-09 | 1980-10-21 | New York University | Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands |
US4263428A (en) | 1978-03-24 | 1981-04-21 | The Regents Of The University Of California | Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same |
ZA811368B (en) | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
EP0052322B1 (de) | 1980-11-10 | 1985-03-27 | Gersonde, Klaus, Prof. Dr. | Verfahren zur Herstellung von Lipid-Vesikeln durch Ultraschallbehandlung, Anwendung des Verfahrens und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens |
IE52535B1 (en) | 1981-02-16 | 1987-12-09 | Ici Plc | Continuous release pharmaceutical compositions |
US4474893A (en) | 1981-07-01 | 1984-10-02 | The University of Texas System Cancer Center | Recombinant monoclonal antibodies |
US4485045A (en) | 1981-07-06 | 1984-11-27 | Research Corporation | Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes |
JPS5811808A (ja) | 1981-07-16 | 1983-01-22 | Niles Parts Co Ltd | 方位検出表示回路 |
NZ201705A (en) | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
US4444878A (en) | 1981-12-21 | 1984-04-24 | Boston Biomedical Research Institute, Inc. | Bispecific antibody determinants |
DE3374837D1 (en) | 1982-02-17 | 1988-01-21 | Ciba Geigy Ag | Lipids in the aqueous phase |
DE3218121A1 (de) | 1982-05-14 | 1983-11-17 | Leskovar, Peter, Dr.-Ing., 8000 München | Arzneimittel zur tumorbehandlung |
JPS59125144A (ja) | 1982-12-30 | 1984-07-19 | ソニー株式会社 | デイジタル信号伝送方法 |
GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
DE3483115D1 (de) | 1983-04-20 | 1990-10-11 | Youri Agabekov | Elektrische einspeisungsschiene. |
DE3464682D1 (en) | 1983-05-09 | 1987-08-13 | Gen Electric Co Plc | Cathode ray tube display device |
US4615885A (en) | 1983-11-01 | 1986-10-07 | Terumo Kabushiki Kaisha | Pharmaceutical composition containing urokinase |
EP0173494A3 (en) * | 1984-08-27 | 1987-11-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chimeric receptors by dna splicing and expression |
US4745055A (en) | 1985-05-07 | 1988-05-17 | California Biotechnology Inc. | Fused protein for enzyme immunoassay system |
DE3523701A1 (de) * | 1985-07-03 | 1987-01-08 | Bayer Ag | Verfahren zur herstellung von proteinen und polypeptiden |
DE3712985A1 (de) * | 1987-04-16 | 1988-11-03 | Hoechst Ag | Bifunktionelle proteine |
EP0256654B1 (en) | 1986-07-07 | 1996-09-18 | Centocor, Inc. | Chimeric murine/human immunoglobulin specific for tumour-associated 17-1A Antigen |
NO873164L (no) | 1986-07-30 | 1988-02-01 | Teijin Ltd | Muse-humane kimaere antistoffer. |
GB8623843D0 (en) | 1986-10-03 | 1987-10-21 | Airtech Ltd | Detection of unsafe voltages on mobile equipment |
GB8626412D0 (en) | 1986-11-05 | 1986-12-03 | Clark M R | Antibodies |
CA1339445C (en) * | 1986-11-12 | 1997-09-09 | The General Hospital Corporation | Recombinant hybrid immunoglobulin molecules and method of use |
EP0294703B1 (en) * | 1987-06-10 | 1995-05-10 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Bifunctional antibody constructs and method for selectively destroying cell populations |
IL87737A (en) | 1987-09-11 | 1993-08-18 | Genentech Inc | Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells |
SE459586B (sv) * | 1987-09-14 | 1989-07-17 | Mta Szegedi Biolog Koezponti | Strukturgen som kodar foer autentiskt humant serum albumin och foerfarande foer dess framstaellning |
CA1338518C (en) * | 1987-09-23 | 1996-08-13 | Joyce M. Zarling | Antibody heteroconjugates for the killing of hiv-infected cells |
PT88641B (pt) * | 1987-10-02 | 1993-04-30 | Genentech Inc | Metodo para a preparacao de uma variante de adesao |
GB8725529D0 (en) * | 1987-10-30 | 1987-12-02 | Delta Biotechnology Ltd | Polypeptides |
US4978745A (en) * | 1987-11-23 | 1990-12-18 | Centocor, Inc. | Immunoreactive heterochain antibodies |
EP0325224B1 (en) * | 1988-01-22 | 1996-07-31 | ZymoGenetics, Inc. | Methods of producing secreted receptor analogs |
PT89484B (pt) * | 1988-01-22 | 1994-03-31 | Gen Hospital Corp | Genes clonados codificadores de proteinas de fusao ig-cd4 e sua utilizacao |
GB8801756D0 (en) | 1988-01-27 | 1988-02-24 | Shell Int Research | Copolymer composition |
SE8802176D0 (sv) * | 1988-06-10 | 1988-06-10 | Kabigen Ab | Fusion protein and its use |
EP0355068A3 (en) * | 1988-08-19 | 1991-09-04 | The General Hospital Corporation | Recombinant hybrid immunoglobulin molecules and their use |
AU634186B2 (en) * | 1988-11-11 | 1993-02-18 | Medical Research Council | Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors |
EP1201756A3 (en) | 1988-12-22 | 2002-10-30 | Genentech, Inc. | Method for preparing water soluble polypeptides |
CA2010321C (en) * | 1989-02-21 | 2004-04-06 | Thomas F. Tedder | Lymphocyte-associated cell surface protein |
DK0745852T3 (da) * | 1989-03-16 | 2002-10-14 | Blood Res Center | Anvendelse af funktionelle derivater af intercellulær adhæsion-molekylet ICAM-1 i antiviral terapi |
EP0394827A1 (en) * | 1989-04-26 | 1990-10-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Chimaeric CD4-immunoglobulin polypeptides |
ATE92107T1 (de) * | 1989-04-29 | 1993-08-15 | Delta Biotechnology Ltd | N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen. |
IE901736L (en) * | 1989-05-17 | 1990-11-17 | Fuller H B Licensing Financ | Polypeptide-antibody conjugate for inhibiting cell adhesion |
WO1991000360A1 (en) * | 1989-06-29 | 1991-01-10 | Medarex, Inc. | Bispecific reagents for aids therapy |
FR2650598B1 (fr) * | 1989-08-03 | 1994-06-03 | Rhone Poulenc Sante | Derives de l'albumine a fonction therapeutique |
CA2065010A1 (en) * | 1989-08-23 | 1991-02-24 | Brian Seed | Non-human primate cd4 polypeptides, fusions thereof, dna encoding, and uses thereof |
WO1991004329A1 (en) * | 1989-09-20 | 1991-04-04 | Abbott Laboratories | Method of producing fusion proteins |
-
1989
- 1989-11-22 US US07/440,625 patent/US5116964A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-11-21 JP JP3501520A patent/JPH05503009A/ja not_active Withdrawn
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- 1990-11-21 AT AT91901202T patent/ATE199261T1/de not_active IP Right Cessation
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-
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-
2001
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-
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-
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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