ES2155819T5 - Inmunoglobulinas hibridas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de fabricación de un dímero de cadena pesada de inmunoglobulina, en el cual una secuencia aminoacídica de una pareja de unión al ligando que es una cadena única y es un receptor, una proteína transportadora, una hormona, un factor de crecimiento o una enzima y no es un receptor de localización de linfocitos, no es un miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulinas ni una proteína homóloga a éstos, ni tampoco un polipéptido de subunidades múltiples codificadas por genes discretos, se sustituye por las regiones variables de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, en donde dichas cadenas pesadas de inmunoglobulina retienen al menos bisagra y los dominios CH2 y CH3 de la región constante de cadena pesada.
Description
Inmunoglobulinas híbridas.
Esta invención hace referencia a receptores y
moléculas de unión al ligando nuevos y a composiciones y
procedimientos para mejorar la vida media en el plasma circulante de
las moléculas de unión al ligando. En particular, esta invención
hace referencia a las moléculas de inmunoglobulina híbridas.
Las inmunoglobulinas son moléculas que contienen
cadenas polipeptídicas que se mantienen unidas mediante enlaces
disulfuro, teniendo de forma característica dos cadenas ligeras y
dos cadenas pesadas. En cada cadena, un dominio (V) tiene una
secuencia aminoacídica variable que depende de la especificidad del
anticuerpo de la molécula. Y el otro dominio (C) tiene una
secuencia constante común entre las moléculas de la misma clase. La
secuencia de los dominios se numera a partir del extremo
aminoterminal.
La superfamilia de genes de inmunoglobulinas
consiste en moléculas con dominios de tipo inmunoglobulina. Los
miembros de esta familia incluyen los antígenos de
histocompatibilidad principal de clase I y clase II, las
inmunoglobulinas, las cadenas \alpha, \beta, \gamma y \delta
del receptor de células T, CD1, CD2, CD4, CD8, CD28, las cadenas
\gamma, \delta y \varepsilon de CD3, OX-2,
Thy-1, las moléculas de adhesión celular
intercelular o neural (I-CAM o
N-CAM), el antígeno-3 asociado a la
función linfocítica (LFA-3), la proteína
neurocitoplásmica (NCP-3), el receptor de
poli-Ig, la glicoproteína asociada a mielina (MAG),
el receptor de IgE de alta afinidad, la glicoproteína principal de
mielina periférica (Po), el receptor del factor de crecimiento
derivado de plaquetas, el receptor del factor-1
estimulador de colonias, el receptor Fc de macrófagos, los
receptores gamma Fc y el antígeno carcinoembrionario.
Es sabido que es posible sustituir diversos
dominios variables (incluyendo las regiones hipervariables) de una
inmunoglobulina por otra, y de una especie por otra. Ver, por
ejemplo, las patentes europeas EP 0 173494; EP 0 1 250 23; Munro,
Nature, 312: (13 de diciembre de 1984); Neuberger y col.,
Nature, 312: (13 de diciembre de 1984); Sharon y col.,
Nature, 309: (24 de mayo de 1984); Morrison y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984);
Morrison y col., Science, 229:1202-1207
(1985); y Boulianne y col., Nature,
312:643-646 (13 de diciembre de 1984).
Morrison y col., Science,
229:1202-1207 (1985) muestran la preparación de una
quimera de inmunoglobulinas que tiene una región variable de una
especie fusionada con una región constante de una inmunoglobulina de
otra especie. Esta referencia propone moléculas que tienen
secuencias de inmunoglobulina fusionadas con secuencias que no son
de inmunoglobulina (por ejemplo secuencias de enzimas de
restricción), sin embargo la referencia muestra sólo dominios
variables de inmunoglobulinas unidos a la secuencia que no es de
inmunoglobulina. Morrisson y col., patente europea EP 0 173 494
muestran una quimera similar. Mientras que el término
"receptor" es utilizado por los autores y la sección de
antecedentes hace referencia a "receptores como las
inmunoglobulinas, enzimas y proteínas de membrana", el término
"receptores de interés" incluye los receptores de células B y
células T, más particularmente, las inmunoglobulinas, como IgM,
IgG, IgA, IgD y IgE, así como los diversos "subtipos de los
grupos individuales" (página 3, líneas 10-13). La
descripción de esta referencia es específica de las quimeras de
inmunoglobulinas (ver por ejemplo la página 3, líneas
21-30).
También se han producido dominios semejantes a
los dominios variables de inmunoglobulina a partir de dos miembros
de la superfamilia de genes de inmunoglobulinas- -CD4 y del
receptor de células T- - para un dominio variable en una
inmunoglobulina; ver p.ej., Capon y col., Nature,
337:525-531, 1989, Traunecker y col., Nature,
339:68-70, 1989, Gascoigne y col., Proc. Natl.
Acad. Sci., 84:2936-2940, 1987, y la solicitud
de patente europea EPO 0 325 224 A2.
Se sabe que un gran número de sustancias
proteínicas funciona mediante su unión específica con moléculas
diana. Estas moléculas diana son generalmente, aunque no es
imprescindible, proteínas. Las sustancias que se unen a las
moléculas diana o a los ligandos están referidas aquí como parejas
de unión al ligando, e incluyen los receptores y proteínas
transportadoras, así como hormonas, proteínas de adhesión celular,
factores de adhesión específicos de tejido, moléculas de unión a
lectinas, factores de crecimiento, enzimas, sustancias nutrientes y
similares.
Los linfocitos son ejemplos de células que están
dirigidas a tejidos específicos. Los linfocitos son mediadores de
la inflamación de tejido normal así como de la lesión tisular
patológica como ocurre en la artritis reumatoide y otras
enfermedades autoinmunes. Los vertebrados han desarrollado un
mecanismo para la distribución de linfocitos con especificidades
antigénicas diversas por regiones espacialmente distintas del
organismo (Butcher, E.C., Curr. Top. Micro. Immunol., 128,
85 (1986); Gallatin, W.M., y col., Cell 44, 673 (1986); Woodruff,
J.J., y col., Ann. Rev. Immunol., 5, 201 (1987); Duijvestijn,
A., y col., Immunol. Today, 10, 23 (1989); Yednock, T.A., y
col., Adv. Immunol, (en publicación) (1989)).
Este mecanismo implica la recircularización
continua de los linfocitos entre la sangre y los órganos linfoides.
La migración de linfocitos entre la sangre, donde las células tienen
el mayor grado de movilidad, y los órganos linfoides, donde los
linfocitos hallan el antígeno secuestrado y procesado, se inicia
mediante una interacción adhesiva entre receptores de la superficie
de los linfocitos y los ligandos en las células endoteliales de
vénulas postcapilarmente especializadas, p.ej., vénulas endoteliales
altas (HEV) y vasos de tipo HEV inducidos en el sinovio inflamado
de forma crónica.
Las moléculas de adhesión de linfocitos se han
denominado específicamente receptores de localización, ya que
permiten a estas células localizarse en o situarse en determinados
órganos linfoides secundarios.
Se han identificado candidatos para el receptor
de localización de linfocitos en el ratón, la rata y en el hombre
(Gallatin, W. M., y col., Nature, 303, 30 (1983) Rasmussen,
R.A., y col., J. Immunol., 135, 19 (1985); Chin, Y. H., y
col., J. Immunol., 136, 2556 (1986); Jalkanen, S., y col.,
Eur. J. Immunol., 10, 1195 (1986)). La siguiente literatura
describe el trabajo realizado en esta área con la utilización de un
anticuerpo monoclonal, denominado Mel 14, dirigido contra una forma
murina de una proteína de superficie de linfocitos (Gallatin, w.
M., y col., supra; (Mountz, J.D., y col., J. Immunol.,
140, 2943 (1988); (Lewinsohn, D. M., y col., J. Immunol.,
138, 4313 (1987); Siegelman, M., y col., Science, 231, 823
(1986); St. John, T. y col., Science, 231, 845 (1986)).
Los experimentos de inmunoprecipitación han
mostrado que este anticuerpo reconoce una proteína de superficie
celular difusa de \sim90.000 daltons en los linfocitos (Gallatin,
W.M., y col., supra) y una proteína de \sim100.000 daltons
en neutrófilos (Lewinsohn, D.M., y col., supra).
Se describió por Siegelman y col. (Siegelman, M.
y col., Science, 231, 823 (1986)) una secuencia parcial - 13
residuos - de un receptor de localización de linfocitos, la cual se
identificó mediante secuenciación aminoacídica de marcaje
radiactivo de una glicoproteína definida por el anticuerpo Mel
14.
Las lectinas son proteínas con un dominio de
unión a carbohidratos que se han hallado en diversos animales,
incluyendo los humanos así como también el percebe y el moscón gris
de la carne. El concepto de lectinas con función en la adhesión
celular se ejemplifica por la interacción de ciertos virus y
bacterias con células huésped eucariotas (Paulson, J.C., The
Receptors vol. 2, P.M. Conn, Eds. (Academic Press, NY, 1985), pág.
131; Sahron, N., FEBS Lett., 217, 145 (1897)). En las
interacciones célula-célula de eucariotas, se han
deducido las funciones adhesivas de las lectinas endógenas en
diversos sistemas (Grable, L., y col., Cell, 17, 477 (1979);
Fenderson, B., y col., J. Exp. Med., 160, 1591 (1984);
Kunemund, V., J. Cell Biol., 106. 106, 213 (1988); Bischoff,
R., J. Cell. Biol., 102, 2273 (1986); Crocker, P.R., y col.,
J. Exp. Med., 164, 1862 (1986); incluyendo la fertilización
de invertebrados (Glabae, C. G., y col., J. Cell. Biol. 94,
123 (1982); DeAngelis, P., y col., J. Biol. Chem., 262,
13946 (1987)) y la de vertebrados (Bleil, J. D., y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 6778 (1988); Lopez, L. C., y col.,
J. Cell Biol., 101, 1501 (1985)). La utilización de
interacciones proteína-azúcar como medio de lograr
el
\hbox{reconocimiento celular específico es bien conocida.}
La literatura sugiere que una lectina puede
estar implicada en la interacción adhesiva entre linfocitos y sus
ligandos (Rosen, S.D., y col, Science, 228, 1005 (1985);
Rosen, S.D., y col., J. Immunol., (en publicación) (1989);
Stoolman, L. M., y col., J. Cell Biol., 96, 722 (1983);
Stoolman, L. M., y col., J. Cell Biol., 99, 1535 (1984);
Yednock, T. A., y col., J. Cell Biol., 104, 725 (1987);
Stoolman, L. M., y col., Blood, 70, 1842 (1987); una
aproximación relacionada por Brandley, B.K., y col., J. Cell
Biol., 105, 991 (1987); Yednock, T.A., y col., en preparación;
y Yednock, T.A., y col., J. Cell Biol., 104, 725 (1987)).
Se investigaron las características de una
glicoproteína de superficie que puede estar implicada en la
localización de linfocitos humanos con una serie de anticuerpos mono
y policlonales denominados genéricamente Hermes. Estos anticuerpos
reconocen una glicoproteína de superficie de \sim90.000 daltons
que se halló en un gran número de tipos celulares inmunes y no
inmunes, los cuales mediante experimentos de preaclaramiento de
anticuerpos se mostró que estaban relacionados con el antígeno de
Mel 14. (Jalkanen, S., y col., Ann. Rev. Med., 38,
467-476 (1987); Jalkanen, S., y col., Blood,
66 (3), 577-582 (1985); Jalkanen, S. y col., J.
Cell Biol 105, 983-990 (1987); Jalkanen, S., y
col., Eur. J. Immunol., 18, 1195-1202
(1986).
Se han hallado dominios de tipo factor de
crecimiento epitelial en una amplia gama de proteínas, incluyendo
factores de crecimiento, receptores de superficie celular, productos
de genes del desarrollo, proteínas de la matriz extracelular,
factores de coagulación, activadores del plasminógeno y el
complemento (Doolitle, R.F., y col., CSH Symp. 51, 447
(1986)).
Se ha caracterizado una glicoproteína de
superficie celular de linfocitos (referida anteriormente aquí como
la "LHR"), dicha proteína media la unión de linfocitos al
endotelio del tejido linfoide. Se han identificado y aislado clones
de cADN de tamaño completo, así como el ADN que codifica la LHR
humana y murina (HuLHR y MLHR, respectivamente), y además este ADN
se expresa por células huésped recombinantes. Las secuencias
nucleotídicas y aminoacídicas de la LHR humana (HuLHR) se muestran
en la Fig. 1. La secuencia nucleotídica y aminoacídica de la LHR
murina (MLHR) se muestra en la Fig. 2.
En la presente invención, se muestra que la LHR
es una glicoproteína que contiene los siguientes dominios
proteicos: una secuencia señal, un dominio de unión a carbohidratos,
un dominio semejante al factor de crecimiento epitelial (egf), por
lo menos una y preferentemente dos repeticiones del dominio de unión
al complemento, un dominio de unión transmembrana (TMD) y un
dominio intracelular o citoplasmático cargado.
Una estrategia exitosa en el desarrollo de
fármacos para el tratamiento de muchas anomalías en las
interacciones de la pareja de unión al ligando ha sido la
identificación de antagonistas que bloquean la unión o la
interacción entre el ligando y la pareja de unión. Una aproximación
ha sido la utilización de una pareja de unión exógena como un
antagonista competitivo para la pareja de unión nativa. Sin embargo,
muchas parejas de unión al ligando son proteínas de membrana
celular que están ancladas en la bicapa lipídica de las células. La
presencia de componentes de membrana es indeseable desde el punto de
vista de fabricación y purificación. Y ya que estas moléculas se
hallan normalmente presentes sólo en las superficies celulares,
sería deseable producirlas en una forma que sea más estable en la
circulación. Además, las parejas de unión al ligando truncadas o
solubles puede que no sean óptimamente eficaces como terapéuticos ya
que poseen una vida media plasmática in vivo relativamente
corta, puede que no atraviesen la placenta u otras barreras
biológicas, y ya que secuestran su sitio de reconocimiento del
ligando sin permitir la acción de una función efectora, pueden ser
inadecuadas para propósitos terapéuticos.
Según ello, es un objetivo de la presente
invención el producir parejas de unión al ligando fusionadas con
porciones que sirvan para prolongar la vida media plasmática in
vivo de la pareja de unión al ligando, es decir dominios de
inmunoglobulina, y facilitar su purificación por la proteína A. Es
otro objetivo el proporcionar nuevas moléculas de inmunoglobulina
híbridas que combinen características de adhesión y unión a la diana
de una pareja de unión al ligando con funciones efectoras de
inmunoglobulina como la unión al complemento, unión al receptor
celular y similar. Otro objetivo es proporcionar moléculas con
funciones nuevas tales como las descritas anteriormente para
utilización terapéutica, o para utilizar como reactivos diagnósticos
para el ensayo in vitro de las parejas de unión al ligando o
de sus dianas. Es otro objetivo el proporcionar moléculas
multifuncionales en las que diversas parejas de unión al ligando
(cada una de las cuales puede ser la misma o diferente) se
ensambla, por lo que las moléculas son capaces de unirse a y/o
activar más de un ligando.
En particular, es un objetivo el preparar
moléculas para dirigir parejas de unión al ligando como las
toxinas, parejas de superficie celular, enzimas, factores de
crecimiento, hormonas o moléculas efectoras como las porciones
semejantes a dominios constantes de un miembro de la superfamilia de
genes de inmunoglobulinas hacia las células que portan ligandos de
las parejas de unión al ligando, y para facilitar la purificación
de las parejas de unión al ligando.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar heteropolímeros híbridos de
inmunoglobulina-pareja de unión al ligando,
especialmente heterodímeros y heterotetrámeros, que se utilizan para
dirigir la unión de porciones terapéuticas a tejidos específicos y
ligandos.
Es otro objetivo de la presente invención el
proporcionar un procedimiento para la expresión de estas moléculas
en el cultivo de células recombinantes.
Los objetivos de esta invención se logran al
proporcionar un dímero de cadena pesada de inmunoglobulina de
acuerdo con la reivindicación 1.
Las nuevas composiciones que se proporcionan
aquí se purifican y formulan en vehículos aceptables
farmacológicamente para la administración a los pacientes que
necesitan una terapia antiviral, neuromoduladora o inmunomoduladora,
y para la utilización en la modulación de la adhesión celular. Esta
invención es particularmente útil para el tratamiento de pacientes
que tienen anomalías mediadas por receptor. Además, las
composiciones que se proporcionan aquí son intermediarios útiles en
la purificación de la pareja de unión al ligando a partir del
cultivo de células recombinantes, en donde los anticuerpos u otras
sustancias capaces de unirse al componente de proteína plasmática
estable se utilizan para absorber la fusión, o son útiles en los
ensayos diagnósticos para la pareja de unión al ligando en donde la
proteína plasmática estable sirve como un marcador indirecto.
La Figura 1 muestra la secuencia aminoacídica y
del ADN de la LHR humana (HuLHR).
La Figura 2 muestra la secuencia aminoacídica y
del ADN de la LHR murina (MLHR).
La Figura 3 muestra una comparación entre las
secuencias aminoacídicas de la HuLHR y MLHR.
Las Figuras 4A-4B muestran los
resultados del aislamiento y de la secuenciación del extremo
N-terminal de la MLHR. La Fig. 4A muestra los
resultados de la degradación de Edmann en fase gaseosa de una banda
de 90.000 daltons a partir de un gel de
poliacrilamida-SDS a partir de material purificado
por cromatografía de afinidad con el anticuerpo monoclonal Mel 14
de un extracto obtenido con detergente de bazos murinos. Los
residuos subrayados entre los aminoácidos 7 y 15 se eligieron para
producir la sonda oligonucleotídica que se muestra en la Fig. 4B.
La Fig. 4B muestra como sonda un oligonucleótido de
26-mer 32 veces redundante.
La Figura 5 muestra la expresión transitoria del
clon de cADN de MLHR. Los carriles A-F corresponden
a lo siguiente: A) Lisados de células 293 transfectadas con un
plásmido de expresión de MLHR e inmunoprecipitadas con el
anticuerpo monoclonal Mel 14. B) Sobrenadantes de las células 293
transfectadas con un plásmido de expresión de MLHR e
inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14. C) Lisados
de las células 293 transfectadas con un plásmido que expresa la
glicoproteína de la cubierta gp120 de VIH e inmunoprecipitadas con
el anticuerpo monoclonal Mel 14. D) Sobrenadantes de las células 293
transfectadas con el plásmido de expresión de la cubierta de VIH
inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14. E)
Sobrenadantes de las células 38C13 e inmunoprecipitadas con el
anticuerpo monoclonal Mel 14. F) Lisados de las células 38C13
marcadas en la superficie con I^{126} e inmunoprecipitadas con el
anticuerpo monoclonal Mel 14.
Las Figuras 6A-6C muestran las
secuencias proteínicas que son heterólogas pero funcionalmente
comparables con la MLHR.
Las líneas marcadas "MLHR" corresponden a
la MLHR de la Fig. 2.
La Fig. 6A compara los dominios de unión al
carbohidrato.
La Fig. 6B compara los dominios del factor de
crecimiento epitelial.
La Fig. 6C compara los dominios del factor de
unión al complemento.
La Figura 7 es un esquema de los dominios
proteínicos hallados en la LHR, incluyendo la secuencia señal, el
dominio de unión a carbohidratos, el dominio del factor de
crecimiento epitelial (egf), dos repeticiones en el dominio de
unión al complemento (flechas), el dominio de unión transmembrana
(TMD) y el dominio intracelular cargado.
La Figura 8 muestra la construcción de quimeras
de MLHR-IgG que contienen la lectina,
lectina-egf y
lectina-egf-motivos reguladores del
complemento.
La Figura 9 muestra la electroforesis en gel de
los productos de expresión y purificación de las quimeras de
MLHR-IgG.
La Figura 10 muestra el análisis de unión del
éster de polifosfomanano (PPME) de varias quimeras de
MLHR-IgG.
Las parejas de unión al ligando se definen aquí
como proteínas que se sabe se unen específicamente a las moléculas
de ligando dianas, y se hallan generalmente en su estado nativo como
polipéptidos secretados o unidos a membrana; las parejas de unión
al ligando unidas a membrana incluyen de forma característica una
región transmembrana hidrofóbica o un anclaje fosfolípidico. Las
parejas de unión al ligando incluyen los receptores y proteínas
transportadoras, así como hormonas, proteínas de adhesión celular
(proteínas que dirigen o inducen la adhesión de una célula a otra),
moléculas de unión a lectina, factores de crecimiento, enzimas y
similares. Los antígenos CD que no son miembros de la superfamilia
de genes de inmunoglobulinas, o por otra parte excluidos como se
indicó anteriormente, son parejas de unión al ligando adecuadas,
Knapp y col., Immunology Today, 10 (8):
253-258, 1989. El receptor de insulina puede ser
opcionalmente una pareja de unión al ligando. Las parejas de unión
al ligando incluyen no sólo la forma nativa de tamaño completo, sino
también secuencias truncadas u otras variantes de secuencia
aminoacídica que continúan siendo capaces de unirse al ligando
normal.
Como se utiliza aquí, el término "pareja de
unión al ligando" excluye específicamente los miembros
polimórficos y no polimórficos de la superfamilia de los genes de
inmunoglobulina, y las proteínas que son homólogas a éstos, como
los antígenos de histocompatibilidad principal de clase I y clase
II, las inmunoglobulinas, las cadenas \alpha, \beta, \gamma y
\delta del receptor de células T, CD1, CD2, CD4, CD8, CD28, las
cadenas \gamma, \delta y \varepsilon de CD3,
OX-2, Thy-1, las moléculas de
adhesión celular intercelular o neural (I-CAM o
N-CAM), el antígeno-3 asociado con
la función linfocítica (LFA-3), la proteína
neurocitoplasmática (NCP-3), el receptor
poli-Ig, la glicoproteína asociada a mielina (MAG),
el receptor de alta afinidad IgE, la glicoproteína principal de
mielina periférica (Po), el receptor del factor de crecimiento
derivado de plaquetas, el receptor del factor-1
estimulador de colonias, el receptor Fc de macrófagos, los
receptores gamma Fc y el antígeno carcinoembrionario. Homólogo a un
miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulina, únicamente
con el propósito de exclusión de esta superfamilia, quiere decir
tener la secuencia de un miembro de la superfamilia de genes de
inmunoglobulinas, o tener una secuencia de ello que tenga
sustancialmente la misma (o un elevado grado de) homología de
secuencia aminoacídica con un miembro conocido de la superfamilia,
como los ejemplos específicos proporcionados anteriormente tienen
en relación con la secuencia de un dominio variable o constante de
inmunoglobulina. Se ha de tener en cuenta que esto no excluye las
realizaciones en las que una fusión de una pareja de unión al
ligando se ensambla en un multímero con, además, un miembro o fusión
de un miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulinas.
También se excluyen de forma específica del
término "pareja de unión al ligando" los polipéptidos de
subunidades múltiples (cadenas) codificados por genes discretos
(genes que no codifican un polipéptido precursor de cadena sencilla
que conduce al polipéptido de subunidades múltiples), con al menos
una subunidad del polipéptido insertada de forma ordinaria en la
membrana de la célula, incluyendo los receptores celulares (p.ej.,
integrinas) para moléculas de la matriz extracelular, como se
ejemplifica en la PCT Pub. WO90/06953 publicada el 28 de junio,
1990. Se ha de tener en cuenta que esto no excluye las realizaciones
en las que una fusión de la pareja de unión al ligando se ensambla
en un multímero con, además, un polipéptido de subunidades múltiples
o fusión de un polipéptido de subunidades múltiples tal como se
define en este párrafo.
La pareja de unión no es una LHR. La LHR se
define como un polipéptido que tiene una actividad biológica
cualitativa común con la LHR de la Fig. 1 o Fig. 2, y que contiene
preferentemente un dominio con una homología superior al 70% en
relación con el dominio de unión al carbohidrato, el dominio del
factor de crecimiento epitelial, o el dominio de unión al
carbohidrato de la LHR de la Fig. 1 o Fig. 2.
La homología en relación con una LHR se define
aquí como el porcentaje de residuos en la secuencia de candidatos
que son idénticos con los residuos en el dominio de unión al
carbohidrato, el dominio del factor de crecimiento epitelial, o los
dominios de unión al complemento en la Fig. 1 o Fig. 2 después de
alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para
lograr el porcentaje máximo de homología.
Se incluyen dentro del ámbito de la LHR, tal
como se utiliza aquí este término, las LHRs que tienen secuencias
aminoacídicas de la HuLHR o MLHR como se indica en la Fig. 1 o 2,
derivados desglicosilados o no glicosilados de la LHR, variantes de
secuencia aminoacídica homóloga de la secuencia de la Fig. 1 o la
2, y variantes homólogas generadas in vitro y derivadas de la
LHR, que son capaces de presentar una actividad biológica común con
la LHR de la Fig. 1 o Fig. 2.
La actividad biológica de la LHR o del fragmento
de LHR se definen como 1) la reactividad inmunológica cruzada con
al menos un epitopo de la LHR, o 2) la posesión de al menos una
función adhesiva, reguladora o efectora cualitativamente común con
la LHR.
Un ejemplo de las actividades biológicas
cualitativas de la LHR es su unión a ligandos en células
endoteliales altamente especializadas de los tejidos linfoides.
También, se requiere frecuentemente para la unión al ligando un
catión divalente como el calcio.
Que reacciona de forma cruzada inmunológicamente
tal como se utiliza aquí quiere decir que el polipéptido candidato
es capaz de inhibir competitivamente la actividad biológica
cualitativa de la LHR que tiene esta actividad con antisueros
policlonales contra el análogo activo conocido. Tales antisueros se
preparan de manera convencional mediante inyección en cabras o
conejos, por ejemplo, de forma subcutánea con el análogo activo
conocido en adyuvante completo de Freund, seguido por la inyección
de refuerzo
\hbox{intraperitoneal o subcutánea en adyuvante incompleto de Freund.}
Estructuralmente, como se muestra en la Figura
3, la LHR incluye varios dominios que se identifican de la manera
siguiente (con \pm 10 residuos): una secuencia señal (residuos
20-32), que se continua por un dominio de unión al
carbohidrato (identificado en la Fig. 3 como un dominio de
"lectina") (residuos 39-155), un dominio del
factor de crecimiento epitelial (egf) (residuos
160-193), un dominio de unión al factor del
complemento (residuos 197-317), un dominio de unión
transmembrana (TMD) (residuos 333-355) y un dominio
citoplasmático (residuos 356-372). La unión para el
dominio extracelular de LHR se halla a, o en aproximadamente 30
residuos del extremo N-terminal del dominio
transmembrana, y se identifica fácilmente a partir del análisis de
la secuencia de LHR. Cualquiera de estos dominios se utiliza en la
práctica de la presente invención.
Las Figs. 6A-6C muestran varias
proteínas que tienen cierta homología con tres de estos dominios. La
Fig. 6A muestra los dominios de unión al carbohidrato, la Fig. 6B
muestra los dominios del factor de crecimiento epitelial la Fig. 6C
muestra cierta homología con los dominios de unión al
complemento.
En la Fig. 3 se muestra una comparación de las
secuencias aminoacídicas de HuLHR y MLHR, y se muestra un elevado
grado de homología en toda la secuencia global (83%). Los grados de
homología entre los diversos dominios hallados en la HuLHR
versus la MLHR son, sin embargo, variables. Por ejemplo, el
grado de conservación de secuencia entre la MLHR y la HuLHR en el
dominio de unión al carbohidrato y el dominio de egf es
aproximadamente de \sim83%, mientras que el grado de conservación
en la primera repetición de unión del complemento se halla en el
79% y sólo en el 63% en la segunda repetición, para una homología
global del dominio de unión al complemento del 71%. Además,
mientras que las dos repeticiones del dominio de unión al
complemento de MLHR son idénticas, las de HuLHR presentan
diferencias y difieren también con las repeticiones murinas. Es
interesante destacar que el grado de conservación entre los dos
receptores en la secuencia transmembrana y regiones de alrededor es
virtualmente idéntico, con sólo una sustitución hidrofóbica
conservada, probablemente dentro de la región de anclaje
transmembrana.
La glicoproteína de superficie, que es
reconocida por las series de anticuerpos mono y policlonales
denominados Hermes como se describió anteriormente está
específicamente excluida del ámbito de la presente invención.
Las inmunoglobulinas y ciertas variantes de lo
mismo son conocidas y muchas se preparan en cultivos de células
recombinantes. Ver por ejemplo, la patente americana U.S. 4.745.055;
la patente europea EP 256. 654; Faulkner y col., Nature,
298: 286 (1982); la patente europea EP 120.694; la patente europea
EP 125.023; Morrison, J. Immun., 123: 793 (1979); Kohler y
col., P.N.A.S. USA 77:2197 (1980); Raso y col., Cancer
Res., 41:2073 (1981); Morrison y col., Ann. Rev.
Immunol., 2:239 (1984); Morrison, Science, 229: 1202
(1985); Morrison y col., P.N.A.S. USA, 81:6851 (1984); la
patente europea EP 255.694; la patente europea EP 266.663; y la
patente internacional WO 88/03559. También son conocidas las
cadenas de inmunoglobulinas recombinadas. Ver por ejemplo, la
patente americana U.S. 4.444.878; la patente internacional WO
88/03565; y la patente europea EP 68.763 y las referencias allí
citadas.
Generalmente, la pareja de unión al ligando se
fusiona por su extremo C-terminal al extremo
N-terminal de la región constante de las cadenas
pesadas de inmunoglobulinas reteniendo por lo menos la bisagra, los
dominios CHA2 y CH3 de la región constante de cadena pesada en lugar
de la región(es) variable de las mismas.
Las regiones transmembrana o las secuencias de
reconocimiento del anclaje lipídico o fosfolipídico de las parejas
de unión al ligando que comprenden tales regiones o secuencias,
preferentemente, se inactivan o delecionan antes de la fusión.
De modo característico, tales fusiones retienen
por lo menos de forma funcionalmente activa la bisagra y los
dominios CH2 y CH3 de la región constante de una cadena pesada de
inmunoglobulina. Las fusiones también se realizan inmediatamente en
el extremo N-terminal de la cadena pesada de CH1 o
de la región correspondiente de la cadena ligera. Generalmente,
esto se logra construyendo la secuencia de ADN adecuada y
expresándola en un cultivo de células recombinantes. De modo
alternativo, sin embargo, los polipéptidos de la presente invención
se pueden sintetizar de acuerdo con procedimientos conocidos.
El sitio preciso en donde se realiza la fusión
no es crítico, aunque sí se conocen bien sitios específicos que
pueden seleccionarse con el fin de optimizar la actividad biológica,
secreción o las características de unión de la pareja de unión. El
sitio óptimo se determinará mediante experimentación de rutina.
Las inmunoglobulinas híbridas se ensamblan como
hetero- u homo-multímeros, y particularmente como
dímeros o tetrámeros. Generalmente, estas inmunoglobulinas
ensambladas tendrán unidades estructurales conocidas como las
representadas por los diagramas siguientes.
En el diagrama siguiente, "A" significa una
porción de una pareja de unión al ligando que contiene por lo menos
un sitio de unión al ligando capaz de unirse a su ligando; X es un
agente adicional, que puede ser otra pareja funcional de unión al
ligando (idéntica a A o diferente) y CH representa los dominios
constantes de cadena pesada de una inmunogobulina.
Se entenderá que estos diagramas son meramente
ilustrativos, y que las cadenas de los multímeros están unidas por
puentes disulfuro de la misma manera que las inmunoglobulinas
nativas. De acuerdo con la presente invención, las inmunoglobulinas
híbridas se secretan fácilmente a partir de células de mamífero
transformadas con el ácido nucleico adecuado. Las formas secretadas
incluyen aquellas en las que el epitopo de la pareja de unión está
presente en los dímeros de cadenas pesadas.
Las composiciones de la presente invención, en
la que se sustituye una porción activa biológicamente de una pareja
de unión al ligando por la región variable de una cadena de
inmunoglobulina se piensa que presentan mejor vida media plasmática
in vivo. Estas inmunoglobulinas híbridas se construyen de
forma similar a las construcciones donde un dominio semejante a la
inmunoglobulina se sustituye por el dominio variable de una
inmunoglobulina, ver p.ej. Capon y col., Nature
337:525-531, 1989, Traunecker y col., Nature,
339:68-70, 1989, Gascoigne y col., Proc. Natl.
Acad. Sci., 84:2936-2940, 1987, y la solicitud
europea de publicación de patente EPO 0 325 224 A2. Las
inmunoglobulinas híbridas de la presente invención también se
construyen de forma similar a los anticuerpos quiméricos en los que
un dominio variable de un anticuerpo de una especie se sustituye por
el dominio variable de otra especie. Ver, por ejemplo, la patente
europea EP 0 125 023; Munro, Nature, 312: (13 de diciembre
de 1984); Neuberger y col., Nature, 312: (13 de diciembre de
1984); Sharon y col., Nature, 309: (24 de mayo de 1984);
Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
81:6851-6855 (1984); Morrison y col., Science
229:1202-1207 (1985); y Boulianne y col.,
Nature, 312:643-646 (13 de diciembre de
1984). El ADN que codifica la pareja de unión se corta mediante una
enzima de restricción en o cerca del extremo 3' terminal del ADN
que codifica el dominio(s) de la pareja de unión deseado y en
un punto de o cerca del ADN que codifica el extremo
N-terminal del polipéptido maduro (si se contempla
la utilización de un péptido líder diferente), o en o cerca de la
región que codifica el extremo N-terminal de la
pareja de unión (si se utiliza un péptido señal nativo). Este
fragmento de ADN se inserta luego en el ADN que codifica una región
constante de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina y, si es
necesario, el fragmento se recorta mediante mutagénesis delecional.
Preferentemente, esto es una inmunoglobulina humana cuando la
variante se desea para terapia in vivo en
humanos.
humanos.
Los ADNs que codifican las regiones constantes
de las cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas son conocidos
o fácilmente disponibles a partir de librerías de cADN, o bien se
pueden sintetizar. Ver por ejemplo, Adams y col.,
Biochemistry, 19:2711-2719 (1980); Gough y
col., Biochemistry, 19: 2702-2710 (1980);
Dolby y col., P.N.A.S. USA 77:6027-6031
(1980); Rice y col., P.N.A.S. USA
79:7862-7865 (1982):Falner y col., Nature,
298:286-288 (1982); y Morrison y col., Ann. Rev.
Immunol., 2:239-256 (1984).En la presente
invención se proporcionan las secuencias de ADN que codifican la
LHR. Todas aquellas secuencias de ADN que codifican otras parejas
de unión deseadas que sean conocidas o fácilmente disponibles a
partir de librerías de cADN son adecuadas para la práctica de la
presente invención.
El ADN que codifica una fusión de la presente
invención se transfecta en una célula huésped para su expresión. Si
se desean multímeros, entonces se transforma la célula huésped con
el ADN que codifica cada cadena que formará parte del multímero,
seleccionándose de forma óptima la célula huésped capaz de ensamblar
las cadenas de los multímeros de la manera deseada.
En general, las fusiones se expresan
intracelularmente y se secretan bien, pero también se ha hallado de
forma corriente un importante grado de variación en el nivel de
secreción de diversas fusiones a partir de huéspedes
recombinantes.
La presente invención también contempla las
variantes de secuencia aminoacídica de la pareja de unión. Las
variantes de secuencia aminoacídica de la pareja de unión se
preparan teniendo presente diversos objetivos, que incluyen el
incremento de la afinidad de la pareja de unión por su ligando, la
facilitación de la estabilidad, la purificación y preparación de la
pareja de unión, la modificación de su vida media plasmática, el
mejorar la eficacia terapéutica y el disminuir la gravedad o la
ocurrencia de efectos secundarios durante la utilización
terapéutica de la pareja de unión. En la discusión posterior, se
proporcionan las variantes de secuencia aminoacídica de la LHR,
ejemplos de las variantes que pueden seleccionarse para las parejas
de unión al ligando de la invención.
Las variantes de secuencia aminoacídica de la
pareja de unión al ligando se hallan dentro de una o más de las
tres clases siguientes: variantes insercionales, sustitucionales o
delecionales. Estas variantes se preparan generalmente mediante
mutagénesis dirigida de nucleótidos en el ADN que codifica la pareja
de unión al ligando, por lo que gracias a ello se obtiene el ADN
que codifica la variante, y después se expresa el ADN en un cultivo
de células recombinantes. Sin embargo, los fragmentos que tienen más
de 100-150 residuos de aminoácidos se preparan de
forma conveniente mediante síntesis in vitro. La siguiente
discusión se aplica con igual efecto a cualquier pareja de unión al
ligando en la extensión aplicable a la estructura o función de
ésta.
Las variantes de secuencia aminoacídica de la
pareja de unión al ligando son variantes predeterminadas, que no se
hallan en la naturaleza o en los alelos que se producen de forma
natural. Las variantes exhiben de forma característica la misma
calidad biológica, por ejemplo, la actividad de unión al ligando que
el análogo natural. Sin embargo, las variantes y derivados que no
son capaces de unirse con sus ligandos son también útiles, (a) como
un reactivo en ensayos diagnósticos para la pareja de unión al
ligando, o anticuerpos contra la pareja de unión al ligando, (b)
insolubilizados de acuerdo con procedimientos conocidos, como
agentes para purificar anticuerpos anti-pareja de
unión al ligando a partir de antisueros o sobrenadantes de cultivos
de hibridomas, y (c) como inmunógenos para lograr anticuerpos
contra la pareja de unión al ligando o como componentes de equipos
de inmunoensayo (marcados, como un reactivo competitivo para la
pareja de unión al ligando nativa, o no marcados como un estándar
para el ensayo de la pareja de unión al ligando) siempre y cuando
por lo menos un epitopo de la pareja de unión al ligando permanezca
activo.
Mientras que se predetermina el sitio para la
introducción de una variación de secuencia, la mutación per
se no lo necesita. Por ejemplo, con el fin de realizar una
mutación en un sitio dado, se procede a realizar mutagénesis al
azar o de saturación (donde se inserten los 20 residuos posibles) en
el codón diana y se rastrea la combinación óptima de actividades
deseadas de las variantes expresadas. Dicho rastreo es bien conocido
por un experto en la materia.
Las inserciones aminoacídicas se hallarán
generalmente en el orden de 1 a 10 residuos de aminoácidos; las
sustituciones se introducen de forma característica para residuos
únicos; y las deleciones serán de aproximadamente 1 a 30 residuos.
Las deleciones o inserciones se realizan preferentemente en pares
adyacentes, es decir una deleción de 2 residuos o inserción de 2
residuos. Se hará bien evidente a partir de la siguiente discusión
que las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier
combinación de lo mismo se introducen o combinan para lograr una
construcción final.
Las variantes insercionales de secuencia
aminoacídica de la pareja de unión al ligando son aquellas en las
que se introducen uno o más residuos aminoacídicos extraños a la
pareja de unión al ligando en un sitio predeterminado en la pareja
de unión al ligando diana, desplazando dichos residuos a los
preexistentes.
Generalmente, las variantes insercionales son
fusiones de proteínas heterólogas o polipéptidos con el extremo
amino o carboxilo terminal de la pareja de unión al ligando. Tales
variantes se denominan fusiones de la pareja de unión al ligando y
un polipéptido que contiene una secuencia distinta a la que se halla
normalmente en la pareja de unión al ligando en la posición
insertada. Se incluyen aquí diversos grupos de fusiones.
Los polipéptidos nuevos de esta invención son
útiles en el diagnóstico o en la purificación de la pareja de unión
al ligando mediante técnicas de inmunoafinidad conocidas per
se. Alternativamente, en la purificación de la pareja de unión,
se utilizan los polipéptidos nuevos para adsorber la fusión de
mezclas impuras, después de lo cual se eluye la fusión y, si se
desea, se recupera la pareja de unión de la fusión, p.ej., mediante
corte enzimático.
Fusiones deseables de la pareja de unión, que
pueden ser o no activas inmunológicamente, incluyen las fusiones de
la secuencia de la pareja de unión madura con una secuencia señal
heteróloga a la pareja de unión.
Cuando se requiera, se utilizan fusiones de
secuencia señal con el fin de dirigir de forma más concisa la
secreción de la pareja de unión al ligando. La señal heteróloga
reemplaza la señal nativa de la pareja de unión al ligando, y
cuando la fusión resultante es reconocida, es decir es procesada y
cortada por la célula huésped, la pareja de unión al ligando se
secreta. Las señales se seleccionan en función de la célula huésped
elegida, y pueden incluir secuencias bacterianas, de levaduras, de
mamíferos y víricas. La secuencia señal de la LHR nativa o la señal
de la glicoproteína gD del virus herpes son adecuadas para utilizar
en sistemas de expresión de mamíferos.
Las variantes de sustitución son aquellas en las
que por lo menos se ha eliminado un residuo en la secuencia de la
Fig. 1 o 2 y en su lugar se ha insertado un residuo diferente. Tales
sustituciones se realizan generalmente de acuerdo con la siguiente
Tabla 1, cuando se desea modular de forma más fina las
características de la pareja de unión al ligando.
Se incluyen dentro del ámbito de la presente
invención las secuencias de nuevos aminoácidos, así como de
análogos alostéricos (aminoácidos u otros).
Se realizan cambios sustanciales en función o de
la identidad inmunológica mediante selección de sustituciones que
son menos conservadoras que las de la Tabla 1, es decir,
seleccionando los residuos que difieren más significativamente en
su efecto de mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto
polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo como una
conformación en hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de
la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena
lateral. Las sustituciones que en general se espera que produzcan
los mayores cambios en las propiedades serán aquellas en las que (a)
un residuo hidrofílico, p.ej., seril o treonil se sustituye por (o
mediante) un residuo hidrofóbico, p.ej. leucil, isoleucil,
fenilalanil, valil o alanil; (b) una cisteína o prolina se
sustituye por (o mediante) cualquier otro residuo; (c) un residuo
que tiene una cadena lateral electropositiva, p.ej., lisil, arginil,
o histidil, se sustituye por (o mediante) un residuo
electronegativo, p.ej., glutamil o aspartil; o (d) un residuo que
tiene una cadena lateral voluminosa, p.ej., fenilalanina, se
sustituye por (o mediante) uno que no tenga una cadena lateral,
p.ej., glicina.
Algunas deleciones, inserciones y sustituciones
no producirán cambios radicales en las características de la
molécula. Sin embargo, cuando el efecto exacto de la sustitución,
deleción, o inserción sea difícil de predecir con anterioridad a su
realización, por ejemplo cuando se modifica un dominio de unión al
carbohidrato o un epitopo inmune, un experto en la materia
entenderá que el efecto debe evaluarse mediante ensayos de rastreo
rutinario. Por ejemplo, una variante se realiza típicamente mediante
mutagénesis dirigida del ácido nucleico, expresión del ácido
nucleico variante en el cultivo de células recombinantes y,
opcionalmente, purificación a partir del cultivo celular por
ejemplo mediante adsorción por inmunoafinidad en una columna con
anticuerpos policlonales (con el fin de adsorber la variante por al
menos uno de los epitopos inmunes restantes). La actividad del
lisado celular de la variante purificada se rastrea entonces en un
ensayo de rastreo adecuado para las características deseadas. Por
ejemplo, un cambio en el carácter inmunológico, como la afinidad
para un anticuerpo dado, se cuantifica mediante un inmunoensayo de
tipo competitivo. Las modificaciones de tales propiedades proteicas
como la estabilidad redox o térmica, hidrofobicidad, susceptibilidad
a la degradación proteolítica, o la tendencia a la agregación con
transportadores o en multímeros se analiza mediante procedimientos
bien conocidos por un experto en la materia.
Otra clase de variantes son las variantes de
deleción. Las deleciones se caracterizan por la eliminación de uno
o más residuos aminoacídicos de la secuencia.
La inactivación del dominio transmembrana de la
pareja de unión al ligando, típicamente mediante deleción o
sustitución de los residuos de hidroxilación del dominio
transmembrana, facilitará la recuperación y la formulación al
reducir su afinidad celular o afinidad por lípidos de membranas y
mejorar así su solubilidad acuosa. Si se delecionan los dominios
transmembrana y citoplasmático, se evita la introducción de epitopos
potencialmente inmunogénicos, bien mediante la exposición de otros
polipéptidos intracelulares que pueden ser reconocidos por el
cuerpo como extraños, o mediante la inserción de polipéptidos
heterólogos que son potencialmente inmunogénicos. La inactivación
de la función de unión a membrana se logra mediante la deleción de
los suficientes residuos para producir un perfil de hidropatía
hidrofílico en este sitio, o mediante la sustitución con residuos
heterólogos que brinden el mismo resultado.
Una ventaja principal de la pareja de unión al
ligando inactivada a nivel transmembrana es que puede secretarse en
el medio de cultivo de huéspedes recombinantes. Esta variante es
soluble en los fluidos corporales tales como la sangre y no
presenta una afinidad apreciable por los lípidos de membrana, por lo
que se simplifica de forma considerable su recuperación a partir
del cultivo de células recombinantes.
En términos generales, todas las variantes no
poseerán un dominio transmembrana funcional y preferentemente no
tendrán una secuencia citoplasmática funcional.
Por ejemplo, el dominio transmembrana se puede
sustituir por cualquier secuencia aminoacídica, p.ej., una
secuencia aleatoria o predeterminada de unos 5 a 50 residuos de
serina, treonina, lisina, arginina, glutamina, ácido aspártico y
residuos hidrofílicos similares, que juntos presentan un perfil de
hidropatía hidrofílico. Estas variantes se secretan en el medio de
cultivo de huéspedes recombinantes.
Se incluyen dentro del ámbito de la presente
invención las modificaciones covalentes de las moléculas. Tales
modificaciones se introducen haciendo reaccionar los residuos
aminoacídicos diana de la proteína recuperada con un agente
derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas
laterales seleccionadas o con los residuos terminales, o
aprovechando los mecanismos de modificación
post-traduccional que funcionan en células huésped
recombinantes seleccionadas. Tales modificaciones se hallan dentro
de la práctica ordinaria de los procedimientos y se realizan sin
experimentación excesiva.
La derivatización con agentes bifuncionales es
útil en la preparación de agregados intermoleculares de la
inmunoglobulina híbrida con polipéptidos, así como para la unión de
la inmunoglobulina híbrida a una matriz o superficie soporte
insoluble en agua para utilizar en el ensayo, o para la purificación
por afinidad de sus ligandos. Además, un estudio de las uniones
intracatenarias proporcionará información directa sobre la
conformación estructural. Los agentes de unión incluyen el
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida,
por ejemplo los ésteres con el ácido
4-azidosalicílico, los imidoésteres
homobi-funcionales incluyendo los ésteres de
disuccinimidil como el 3,3'-ditiobis
(succinimidil-propionato), y las maleimidas
bifuncionales como el
bis-N-maleimido-1,8-octano.
Los agentes derivatizantes como el
metil-3-[(p-azido-fenil)ditio]
propiomidato rinden intermediarios fotoactivables que son capaces
de formar uniones en presencia de luz. Alternativamente, matrices
insolubles en agua y reactivas como los carbohidratos activados por
bromuro de cianógeno y los sistemas que reaccionan en presencia de
sustratos descritos en las patentes americanas U.S. 3.959.080;
3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; 4.055.635; y
4.330.440 se utilizan para la inmovilización y la unión de
proteínas.
Ciertas derivatizaciones
post-traduccionales son el resultado de la acción de
células huésped recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los
residuos de glutaminil y asparaginil son frecuentemente desamidados
post-traduccionalmente en los residuos glutamil y
aspartil correspondiente. Alternativamente, estos residuos se
desamidan en condiciones ligeramente acídicas. Cualquier forma de
estos residuos se halla dentro del ámbito de la presente
invención.
Otras modificaciones
post-traduccionales incluyen la hidroxilación de
residuos de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo
de residuos de seril o treonil, la metilación de los grupos
\alpha-amino de las cadenas laterales de lisina,
arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and
Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco
pág. 79-86 [1983], la acetilación de la amina del
extremo N-terminal, y en algunos casos, la
amidación del carboxilo del extremo C-terminal.
Otros derivados comprenden los polipéptidos
nuevos de la presente invención unidos covalentemente a un polímero
no proteico. El polímero no proteico es generalmente un polímero
sintético hidrofílico, es decir, un polímero que no se halla en la
naturaleza. Sin embargo, los polímeros que existen en la naturaleza
y que son producidos mediante procedimientos recombinantes o in
vitro son también útiles, como lo son los polímeros aislados de
la naturaleza. Se hallan dentro del ámbito de la presente invención
los polímeros de polivinil hidrofílicos, p.ej., el polivinilalcohol
y la polivinilpirrolidona. De especial utilidad son los ésteres de
polialquileno como el polietilén glicol, el polipropilén glicol, los
ésteres de polioxietileno o metoxi polietilén glicol; los
polioxialquilenos como el polioxietilén, el polioxipropilén y
copolímeros en bloque de polioxietilén y polioxipropilén
(Pluronics); los polimetacrilatos; los carbamatos; polisacáridos
ramificados o no que comprenden los monómeros de azúcares como la
D-manosa, la D- y L-galactosa, la
fucosa, la fructosa, la D-xilosa, la
L-arabinosa, el ácido
D-glucurónico, el ácido siálico, el ácido
D-galacturónico, el ácido
D-manurónico (p.ej., el ácido polimanurónico, o el
ácido algínico), la D-glucosamina, la
D-galactosamina, la D-glucosa y el
ácido D-neuramínico incluyendo los
homopolisacáridos y heteropolisacáridos como la lactosa, la
amilopectina, el almidón, el hidroexitil almidón, la amilosa, el
sulfato de dextrano, el dextrano, las dextrinas, el glucógeno, o la
subunidad de polisacáridos de mucopolisacáridos ácidos, p.ej., el
ácido hialurónico; polímeros de alcoholes de azúcar como el
polisorbitol y el polimanitol; y la heparina o el heparón.
Si el polisacárido es la glicosilación nativa o
la glicosilación que se espera de la expresión recombinante,
entonces el sitio de sustitución puede localizarse en un sitio
distinto al sitio de N- u O-glicosilación nativa,
en donde se haya introducido un sitio de N- u
O-glicosilación adicional o sustitutivo en la
molécula. Se pueden utilizar mezclas de tales polímeros, o el
polímero puede ser homogéneo. Antes de la unión, no es necesario
que el polímero sea soluble en agua, aunque es preferible, en
cambio, que el conjugado final sí lo sea. Además, el polímero no
debería ser altamente inmunogénico en la forma conjugada, ni debería
presentar viscosidad, lo que es incompatible con la infusión o
inyección intravenosa si se pretende administrar por dichas
vías.
De forma preferente, el polímero sólo contiene
un grupo reactivo. Esto ayuda a evitar la unión cruzada de
moléculas proteicas. Sin embargo, se halla dentro del ámbito de la
presente invención el optimizar las condiciones de reacción para
reducir la unión cruzada, o para purificar los productos de reacción
a través de filtración en gel o criba cromatográfica para recuperar
los derivados esencialmente homogéneos.
El peso molecular del polímero se hallará de
forma deseable en el margen de unos 100 a 500.000, y preferentemente
de unos 1.000 a 20.000. El peso molecular elegido dependerá de la
naturaleza del polímero y del grado de sustitución. En general,
cuanto mayor es la hidrofilicidad del polímero mayor es el grado de
sustitución y menor el peso molecular que se puede utilizar. Los
pesos moleculares óptimos se determinarán mediante experimentación
de rutina.
Generalmente, el polímero está unido
covalentemente a la inmunoglobulina híbrida mediante un agente de
unión multifuncional que reacciona con el polímero y con uno o más
residuos aminoacídicos o de azúcares del híbrido. Sin embargo, se
halla dentro del ámbito de la presente invención el unir de forma
directa el polímero haciendo reaccionar un polímero derivatizado
con el híbrido o vice versa.
El sitio de unión covalente en la
inmunoglobulina híbrida incluye los grupos amino y épsilon amino
del extremo N-terminal que se hallan en los residuos
de lisina, así como otros grupos amino, imino, carboxil, sulfidril,
hidroxil u otros grupos hidrofílicos. El polímero puede unirse de
forma covalente directamente al híbrido sin utilizar un agente de
unión multifuncional (generalmente bifuncional). La unión covalente
con los grupos amino se logra mediante reacciones químicas
conocidas basadas en cloruro cianúrico, diimidazol carbonil, grupos
reactivos de aldehídos (PEG alcóxido más dietil acetal de
bromoacetaldehído; PEG más DMSO y anhídrido acético, o PEG cloruro
más fenóxido de 4-hidroxibenzaldehído, ésteres
activos de succinimidil, PEG activado por ditiocarbonato, PEG
activado por 2,4,5-triclofenilcloroformato o
p-nitrofenilcloroformato). Los grupos carboxilo se
derivatizan mediante conjugación de PEG-amina
utilizando carbodiimida.
Los polímeros se conjugan con grupos de
oligosacáridos mediante oxidación utilizando reactivos químicos,
p.ej., metaperyodato, o enzimas, p.ej., glucosa o galactosa oxidasa,
(produciendo cualquiera de ellos el derivado aldehído del
carbohidrato), seguido de la reacción con hidrazida o polímeros
amino-derivatizados, de la misma manera que se
describe por Heitzmann y col., P.N.A.S.,
71:3537-3541 (1974) o Bayer y col., Methods in
Enzymology, 62:310 (1979), para el marcaje de los
oligosacáridos con biotina o avidina. Además, son también adecuados
otros procedimientos químicos o enzimáticos que se han utilizado
anteriormente para unir oligosacáridos y polímeros. Los
oligosacáridos sustituidos son particularmente ventajosos porque, en
general, hay menos sitios de sustitución que en los aminoácidos
para la derivatización, y por ello los productos de oligosacáridos
son más homogéneos. También, se modifica opcionalmente los
sustituyentes de oligosacáridos mediante digestión enzimática para
eliminar los azúcares, p.ej., mediante digestión por neuraminidasa,
antes de la derivatización del polímero.
El polímero llevará un grupo que reacciona
directamente con la cadena lateral del aminoácido, o el extremo N-
o C-terminal del polipéptido, o que reacciona con el
agente de unión multifuncional. En general, los polímeros que
llevan tales grupos reactivos son bien conocidos en la preparación
de proteínas inmovilizadas. Con el fin de emplear tales reacciones
químicas, se debería utilizar un polímero soluble en agua o
derivatizado de la misma forma que los polímeros insolubles
utilizados anteriormente para la inmovilización de proteínas. La
activación por bromuro de cianógeno es un procedimiento de
particular utilidad para utilizar en la unión de polisacáridos.
"Soluble en agua" en relación con el
polímero inicial quiere decir que el polímero o su intermediario
reactivo utilizado para la conjugación es suficientemente soluble en
agua como para participar en la reacción de derivatización.
"Soluble en agua" en relación con el
conjugado de polímeros quiere decir que el conjugado es soluble en
fluidos fisiológicos como la sangre.
El grado de sustitución de un tal polímero
variará dependiendo del número de sitios reactivos en la proteína,
si se utiliza toda la proteína o un fragmento de ella, si la
proteína es una fusión con una proteína heteróloga, del peso
molecular, de las características hidrofílicas y otras
características del polímero y de los sitios elegidos para la
derivatización de la proteína en particular. En general, el
conjugado contiene aproximadamente de 1 a 10 moléculas de polímero,
mientras que cualquier secuencia heteróloga puede sustituirse con
un número esencialmente ilimitado de moléculas de polímero siempre y
cuando la actividad deseada no se vea afectada negativamente de
forma significativa. El grado óptimo de unión se puede determinar
fácilmente con ayuda de una matriz experimental y haciendo variar
las condiciones de tiempo, temperatura y otras condiciones de la
reacción para cambiar el grado de sustitución, después de lo cual se
determina la capacidad de los conjugados para funcionar en la forma
deseada.
El polímero, p.ej. PEG, se une mediante muy
diversos procedimientos conocidos per se para lograr la
modificación covalente de proteínas con polímeros no proteicos como
el PEG. Sin embargo, algunos de estos procedimientos no son
adecuados para los actuales propósitos. La química del cloruro
cianúrico conduce a muchas reacciones secundarias, incluyendo la
unión de proteínas. Además, es muy probable que conduzca a la
inactivación de proteínas que contienen grupos sulfidrilo. La
química del carbonil diimidazol (Beauchamp y col., Anal.
Biochem., 131:25-33 [1983]) requiere un pH
elevado (>8,5), que puede inactivar proteínas. Además, ya que el
intermediario de "PEG activado" puede reaccionar con agua, se
necesita un gran exceso molar de "PEG activado" en relación a
la proteína. La elevada concentración de PEG que se necesita para la
química del carbonil diimidazol también conlleva a problemas con la
purificación, por lo que tanto la cromatografía de filtración en gel
como la cromatografía de interacción hidrofóbica se ven
negativamente afectadas. Además, la elevada concentración de "PEG
activado" puede precipitar la proteína, un problema que ya se
había observado anteriormente (Davis, patente americana U.S.
4.179.337). Por otra parte, la química del aldehído (Royer, patente
americana U.S. 4.002.531) es más eficiente ya que solamente
requiere un exceso molar de 40 veces de PEG y de 1-2
h de incubación. Sin embargo, el dióxido de manganeso sugerido por
Royer para la preparación del aldehído de PEG es problemático
"debido a la tendencia pronunciada del PEG de formar complejos con
agentes oxidantes con base de elementos metálicos" (Harris y
col., J. Polym. Sci., Polym. Chem. Ed.
22:341-352 [1984]). La utilización de la oxidación
de moffatt, con DMSO y anhídrido acético, solventa este problema.
Además, el borohidrato de sodio sugerido por Royer debe utilizarse
a un pH alto y tiene una tendencia significativa para reducir
enlaces disulfuro. En cambio, es preferible el cianoborohidruro de
sodio, que es efectivo a un pH neutro y tiene una leve tendencia a
reducir los enlaces disulfuro.
Los conjugados de la presente invención se
separan de los materiales iniciales que no han reaccionado mediante
filtración en gel. De la misma manera, las especies heterólogas de
los conjugados se purifican una de otra.
El polímero también puede ser insoluble en agua,
como un gel hidrofílico o un artículo de determinada forma como un
tubo quirúrgico en la forma de un catéter o un conducto de
drenaje.
El ADN que codifica las parejas de unión al
ligando se sintetiza mediante procedimientos in vitro o se
obtiene fácilmente a partir de librerías de cADN. Los procedimientos
para la creación sintética del ADN, bien manualmente o con ayuda de
aparatos automáticos, son generalmente bien conocidos por un experto
en la materia, en particular a la luz de las enseñanzas aquí
contenidas. Como ejemplos del estado actual de las técnicas
relacionadas con la síntesis de polinucleótidos, ver Maniatis y
col., Molecular Cloning-A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory (1984), y Horvath y col., An Automated
ADN synthesizer Enmploying Deoxynucleoside
3'-Phosphoramidites, Methods in Enzymology
154:313-326, 1987.
Generalmente, se utilizan los procariotas para
el clonaje de secuencias de ADN en la construcción de vectores de
utilidad en la invención. Por ejemplo, la cepa 294 de E. coli
K12 (ATCC No. 31446) es de particular utilidad. Otras cepas
microbianas que pueden utilizarse incluyen E. coli B y E.
coli X1776 (ATCC No. 31537). Estos ejemplos son ilustrativos y
no limitantes. Alternativamente, son adecuados los procedimientos de
clonaje in vitro, p.ej. la reacción en cadena de la
polimerasa.
Los polipéptidos de esta invención se expresan
directamente en el cultivo de células recombinantes como un análogo
de metionil N-terminal, o como una fusión con un
polipéptido heterólogo al híbrido/porción, preferentemente con una
secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de corte
específico en el extremo N-terminal del
híbrido/porción.
Los nuevos polipéptidos se pueden expresar en
cualquier célula huésped, pero preferentemente se sintetizan en
huéspedes de mamífero. Sin embargo, también son útiles para la
expresión las células huésped de procariotas, hongos, levaduras,
insectos y similares. Ejemplos de procariotas son las cepas
adecuadas para el clonaje como E. coli W3110
(F-'\lambda-'prototrófico, ATCC No. 27325), otras
enterobacteriáceas como Serratia marcesans, bacilli y
diversas pseudomonas. Preferentemente, la célula huésped debería
secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas.
Los huéspedes de expresión se transforman de
forma típica con el ADN que codifica el híbrido que ha sido ligado
en un vector de expresión. Tales vectores contienen generalmente un
origen de replicación (aunque no es necesario si tiene lugar la
integración cromosómica). Los vectores de expresión también incluyen
secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar la selección
fenotípica en las células transformadas, como se discutirá más
adelante. Por ejemplo, E. coli se transforma de forma típica
utilizando un pBR322, un plásmido derivado de una especie E.
coli (Bolivar, y col., Gene 2: 95 (1977)]. El pBR322
contiene genes para la resistencia a ampicilina y tetraciclina y
por ello proporciona medios fáciles para la identificación de
células transformadas, tanto para clonar o expresar. Los vectores
de expresión también contendrán de forma óptima secuencias que son
de utilidad para el control de la transcripción y la traducción,
p.ej., secuencias promotoras y de Shine-Dalgarno
(para procariotas) o promotores e incrementadores (para células de
mamífero). Los promotores pueden ser, aunque no es obligatorio,
inducibles; sorprendentemente, incluso promotores constitutivos
poderosos como el promotor CMV de huéspedes de mamífero producen
LHR sin causar toxicidad en la célula huésped. Aunque es concebible
que los vectores de expresión no necesiten contener ningún elemento
control de expresión, orígenes de replicación o genes de selección,
su ausencia puede dificultar la identificación de los transformantes
híbridos y el lograr un alto nivel de expresión de la
inmunoglobulina híbrida.
Los promotores adecuados para utilizar con
huéspedes procariotas incluyen como ejemplo los sistemas del
promotor de la \beta-lactamasa y la lactosa (Chang
y col., Nature, 275:615 [1978]; y Goeddel y col., Nature,
281:544 [1979]), el sistema del promotor de la fosfatasa alcalina,
del triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057
[1980] y la solicitud de patente europea EPO Appln. Publ. No.
36.776) y los promotores híbridos como el promotor tac (H. de Boer
y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25
[1983]). Sin embargo, también son adecuados otros promotores
bacterianos funcionales. Sus secuencias nucleotídicas son
generalmente conocidas, por lo que se permite al trabajador experto
en la materia su ligación con el ADN codificante (Siebenlist y
col., Cell, 20:269 [1980]) mediante la utilización de
engarces o adaptadores para aportar cualquier diana de restricción
necesaria. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos
también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno
(S.D.) unida operativamente con el ADN codificante.
Además de los procariotas, también son adecuados
los microbios eucariotas como las levaduras o los hongos
filamentosos. Saccharomyces cerevisiae es el microorganismo
eucariota más comúnmente utilizado, aunque otras muchas cepas están
disponibles comercialmente. El plásmido YRp7 es un vector de
expresión satisfactorio en levaduras (Stinchcomb, y col.,
Nature, 282:39 [1979]; Kingsman y col., Gene, 7: 141
[1979]; Tschemper y col., Gene, 10: 157 [1980]). Este
plásmido ya contiene el gen trp1 que proporciona un marcador de
selección para una cepa mutante de levadura que carece de la
capacidad de crecer en ausencia de triptófano, por ejemplo la ATCC
No. 44076 o la PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12
[1977]). La presencia de la lesión trp1 como una característica del
genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un
entorno eficaz para la detección de la transformación mediante el
crecimiento en ausencia de triptófano.
Secuencias promotoras adecuadas para utilizar
con huéspedes de levadura incluyen los promotores de la
3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J.
Biol. Chem. 255:2073 [1980]) u otras enzimas glicolíticas (Hess
y col., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 [1968]; y Holland,
Biochemistry 17:4900 [1978]), como la enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores
inducibles que tienen la ventaja adicional de una transcripción
controlada mediante las condiciones de crecimiento, son las regiones
promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la
fosfatasa ácida, las enzimas degradadoras asociadas con el
metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa y las enzimas responsables de la utilización de
maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para
utilizar en la expresión de levaduras se describen con mayor
detalle en R. Hitzeman y col., patente europea EP 73.73.557A.
Las secuencias control de la expresión son bien
conocidas en eucariotas. En general, todos los genes eucariotas
tienen una región rica en A-T localizada a
aproximadamente 25 a 30 bases cadena arriba del sitio de inicio de
la transcripción. Otra secuencia que se halla a unas 70 a 80 bases
cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción de muchos
genes es la región CXCAAT donde X puede ser cualquier nucleótido. En
el extremo 3' de la mayoría de genes eucariotas se halla una
secuencia AATAAA que puede ser la señal de adición de la cola poliA
en el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias
se insertan en los vectores de expresión de mamíferos.
Se obtienen fácilmente promotores adecuados para
el control de la transcripción de vectores en células huésped de
mamífero a partir de diversas fuentes, por ejemplo, los genomas de
virus como el virus del polioma, SV40, adenovirus, MMV (inducible
por esteroides), retrovirus (p.ej., el LTR o el VIH), el virus de la
hepatitis B y más preferentemente el citomegalovirus, o a partir de
promotores heterólogos de mamífero, p.ej. el promotor de la beta
actina. Los promotores tardío y temprano de SV40 se obtienen de
forma conveniente de un fragmento de restricción de SV40 que
también contiene el origen de replicación viral de SV40. Fiers y
col., Nature, 273: 113 (1978). El promotor temprano
inmediato del citomegalovirus humano se obtiene de forma conveniente
como un fragmento de restricción HindIII. Greenaway, P.J. y
col., Gene 18:355-360 (1982).
La transcripción de un ADN que codifica para la
inmunoglobulina híbrida y/o porciones del híbrido por eucariotas
superiores se incrementa mediante la inserción de una secuencia
intensificadora en el vector. Las secuencias intensificadoras son
elementos de ADN que actúan en cis, generalmente de unas
10-300 pb, que actúan sobre un promotor para
incrementar su transcripción. Las secuencias intensificadoras tienen
una orientación y posición relativamente independiente, se han
hallado en 5' (Laimins, L. y col., PNAS 78:993 [1981] y en
3' (Lusky, M.L. y col., Mol. Cell. Biol. 3: 1108 [1983]) de
la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji, J.L. y
col., Cell 33:729 [1983]), así como también dentro de la
propia secuencia codificante (Osborne, T.F., y col., Mol. Cell.
Biol. 4:1293 [1984]). Se conocen actualmente muchas secuencias
intensificadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa,
albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Sin
embargo, se utilizará de forma característica una secuencia
intensificadora de un virus de células eucariotas. Ejemplos incluyen
la secuencia intensificadora de SV40 en el sitio tardío del origen
de replicación (pb 100-270), la secuencia
intensificadora del promotor temprano de citomegalovirus, la
secuencia intensificadora del polioma en el sitio tardío del origen
de replicación y las secuencias intensificadoras del adenovirus.
Los vectores de expresión que se utilizan en
células huésped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas,
animales, humanos o células nucleadas de otros organismos
multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para
la finalización de la transcripción, que puedan afectar la expresión
del mRNA. Estas regiones se transcriben como segmentos
poliadenilados en la porción no traducida del mRNA que codifica la
inmunoglobulina híbrida. Las regiones 3' no traducidas también
incluyen los sitios de finalización de la transcripción.
Los vectores de expresión pueden contener un gen
de selección, también denominado marcador seleccionable. Ejemplos
de marcadores seleccionables de células de mamífero son la
dihidrofolato reductasa (DHFR), la timidina quinasa (TK) o la
neomicina. Cuando tales marcadores seleccionables se transfieren con
éxito a la célula huésped de mamífero, ésta es capaz de sobrevivir
si se la coloca bajo presión selectiva. Existen dos categorías
distintas ampliamente utilizadas de regímenes de selección. La
primera categoría se basa en el metabolismo de las células y en la
utilización de una línea celular mutante que carece de la capacidad
de crecer de forma independiente de un medio suplementado. Dos
ejemplos son las células CHO DHFR- y las células de ratón LTK-.
Estas células carecen de la capacidad de crecer sin la adición de
nutrientes como timidina o hipoxantina. Debido a que estas células
carecen de ciertos genes necesarios para una vía de síntesis de
ácidos nucleicos completa, no pueden sobrevivir si no se les
proporciona el nucleótido carente en un medio suplementado. Una
alternativa al medio suplementado es introducir un gen DHFR o TK
intacto en las células carentes de los respectivos genes, alterando
así sus requerimientos de crecimiento. Las células individuales que
no fueron transformadas con el gen DHFR o el TK no serán entonces
capaces de sobrevivir en un medio no suplementado.
La segunda categoría de regímenes selectivos es
la selección dominante que hace referencia a un esquema de
selección utilizado con cualquier tipo de células y no requiere la
utilización de una línea celular mutante. Estos esquemas utilizan
típicamente un fármaco para parar el crecimiento de una célula
huésped. Aquellas células que se transformen con éxito con un gen
heterólogo expresan una proteína que les confiere resistencia al
fármaco y por lo tanto sobreviven al régimen de selección. Ejemplos
de tal selección dominante utilizan los fármacos neomicina
(Southern y col., J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982)),
ácido micofenólico (Mulligan y col., Science 209:1422
(1980)) o higromicina (Sudgen y col., Mol. Cell. Biol.
5:410-413 (1985)). Los tres ejemplos dados
anteriormente utilizan genes bacterianos bajo control eucariótico
para convertir la resistencia al fármaco G418 o neomicina
(geneticina), xgpt (ácido micofenólico) o higromicina,
respectivamente.
Células huésped eucariotas adecuadas para la
expresión de la inmunoglobulina híbrida incluyen la línea CV1 de
riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL
1651); la línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293
subclonadas para crecer en cultivo en suspensión, Graham, F.L. y
col., J. Gen. Virol., 36:59 [1977]); células de riñón de
bebé hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster
chino-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, PNAS (USA)
77:4216, [1980]); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, J.P.,
Biol. Reprod. 23:243-251 [1980]); células de
riñón de mono (CV1ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde
africano (VERO-76, ATCC CRL-1587);
células de carcinoma cervical (HELA, ATCC CCL2); células de riñón
canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL
3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75);
células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón
(MMT 060562, ATCC CCL51); y células TRI (Mather, J.P. y col.,
Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 [1982]).
La construcción de vectores adecuados que
contienen las secuencias codificantes y control deseadas emplea las
técnicas de ligación estándares. Los plásmidos aislados o los
fragmentos de ADN se cortan, se forman extremos compatibles y se
religan en la forma deseada para producir los plásmidos
requeridos.
En el análisis para confirmar la presencia de
secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de
ligación se utilizan para transformar la cepa 294 de E. coli
K12 (ATCC 31446) y se seleccionan los transformantes con éxito
mediante su resistencia a ampicilina o tetraciclina, según sea el
caso. Se preparan plásmidos a partir de los transformantes, y se
analizan mediante restricción y/o secuenciación por el procedimiento
de Messing y col., Nucleic Acids Res. 9:309 (1981) o
mediante el procedimiento de Maxam y col., Methods in
Enzymology 65:499 (1980).
Se transforman las células huésped con los
vectores de expresión de la presente invención y se cultivan en
medio nutritivo convencional modificado según se requiera para
inducir los promotores, seleccionar los transformantes o amplificar
los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de
cultivo, como la temperatura, el pH y similar, son las utilizadas
previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y
serán evidentes para cualquier experto en la materia.
Las células huésped referidas en esta
descripción abarcan las células en cultivo in vitro así como
las células dentro del animal huésped.
La "transformación" significa la
introducción de ADN en un organismo de modo que el ADN sea
replicable, bien como un elemento extracromosómico o mediante
integración cromosómica. Salvo que se indique lo contrario, el
procedimiento utilizado aquí para la transformación de las células
huésped es el procedimiento de Graham, F. y van der Eb, A.,
Virology 52:456-457 (1973). Sin embargo,
también se pueden utilizar otros procedimientos para la
introducción de ADN en las células como la inyección nuclear o la
fusión de protoplastos. Si se utilizan células procariotas o
células que contienen una importante pared celular, el procedimiento
preferido de transfección es el tratamiento con calcio utilizando
cloruro cálcico tal como se describe por Cohen, F.N. y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69:2110 (1972).
La "transfección" hace referencia a la
introducción de ADN en una célula huésped independientemente de que
se exprese cualquiera de las secuencias codificantes que contiene
dicho ADN. Numerosos procedimientos de transfección son conocidos
por cualquier experto en la materia, por ejemplo, CaPO_{4} y la
electroporación. La transformación de células huésped es el indicio
de una transfección con éxito.
El polipéptido nuevo se recupera y purifica a
partir de los cultivos de células recombinantes mediante
procedimientos conocidos, incluyendo la precipitación con sulfato de
amonio o etanol, extracción acídica, cromatografía de intercambio
aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía
de inmunoafinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía
de lectina. Otros procedimientos de purificación conocidos dentro
del ámbito de la presente invención utilizan carbohidratos, el
factor de crecimiento epitelial, o dominios del complemento
inmovilizados. Además, la HPLC de fase inversa y la cromatografía
que utiliza ligandos para la inmunoglobulina híbrida son útiles
para la purificación del híbrido. De preferencia, pueden estar
presentes concentraciones bajas de iones calcio (aproximadamente
1-5 mM) durante la purificación. La purificación se
realiza preferentemente en presencia de un inhibidor de proteasas
como el PMSF.
La selección de parejas de unión al ligando con
afinidad específica para determinados tejidos incrementa de forma
clara la capacidad de liberación de los agentes terapéuticos que son
estables, tienen vidas medias relativamente largas y son capaces de
recortarse de forma precisa sin experimentación excesiva.
El nuevo polipéptido se dispone en formulaciones
isotónicas estériles junto con los cofactores necesarios y se
administra de forma opcional mediante métodos estándares bien
conocidos en la materia. La formulación es preferentemente líquida,
y es generalmente una solución salina fisiológica que contiene
calcio 0,5-10 mM, tampón no fosfatado a pH
6,8-7,6, o puede ser un polvo liofilizado.
Es preferible que la ruta principal para la
administración terapéutica sea la liberación intravenosa, o la
liberación a través de catéter u otro conducto quirúrgico. Rutas
alternativas incluyen tabletas y similares, nebulizadores
disponibles comercialmente para formulaciones líquidas e inhalación
de receptores liofilizados o aerosolizados. Las formulaciones
líquidas se pueden utilizar después de la reconstitución de
formulaciones en polvo.
El nuevo polipéptido también puede administrarse
mediante microesferas, liposomas u otros sistemas de liberación de
micropartículas o formulaciones de liberación sostenida colocadas en
ciertos tejidos, incluyendo la sangre. Ejemplos adecuados de
transportadores de liberación sostenida incluyen las matrices de
polímeros semipermeables en la forma de artículos con formas
determinadas, p.ej., supositorios, o microcápsulas. Las matrices de
liberación sostenida implantables o microcapsulares incluyen los
poliláctidos (patente americana U.S. 3.773.919, patente europea EP
58.481), copolímeros del ácido L-glutámico y gamma
etil-L-glutamato (U. Sidman y col.,
1985, Biopolymers 22 (11):547-556),
poli(2-hidroexietil-metacrilato)
o etilén vinil acetato (R. Langer y col., 1981, J. Biomed.
Mater. Res. 15:167-227 y R. Langer, 1982,
Chem. Tech. 12:98-105). Los liposomas que
contienen la inmunoglobulina híbrida se preparan mediante
procedimientos bien conocidos: patente danesa DE 3.218.121A;
Epstein y col., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
82:3688-3692; Hwang y col., 1980, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 77:4030-4034; patentes europeas
EP 36676A, EP 88046A, EP 143949A, EP 142541A; solicitud de patente
japonesa 83-11808; patentes americanas U.S.
4.485.045 y 4.544.545; y UP 102.342A. Generalmente, los liposomas
son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente
200-800 Angstroms) en donde el contenido lipídico
es superior a 30 mol.% de colesterol, la proporción seleccionada se
ajusta a la tasa óptima de liberación sostenida del
polipéptido.
Las preparaciones polipeptídicas de liberación
sostenida se implantan o inyectan en la proximidad del sitio de
inflamación o terapia, por ejemplo adyacentes a las articulaciones
artríticas o a los nódulos linfáticos periféricos.
Las dosis de los nuevos polipéptidos
administrados dependerán de las propiedades del híbrido utilizado,
p.ej. su actividad de unión y la vida media plasmática in
vivo, la concentración del híbrido en la formulación, la ruta
de administración del híbrido, el sitio y la tasa de dosificación,
la tolerancia clínica del paciente implicado, la condición
patológica que lo afecta y similar, así como también dependerán de
la competencia del clínico.
Los polipéptidos de la presente invención,
pueden administrarse solos o junto con otros agentes farmacológicos
utilizados para tratar las condiciones citadas anteriormente, como
antibióticos, agentes antiinflamatorios y agentes antitumorales.
También puede ser útil administrar el polipéptido junto con otras
proteínas terapéuticas como el interferón gamma y otros
inmunomoduladores.
Con el fin de facilitar la comprensión de los
ejemplos siguientes se describirán algunos procedimientos y/o
términos utilizados corrientemente.
Los "plásmidos" se denominan mediante una p
en minúscula precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o
números. Los plásmidos iniciales de la presente invención están
disponibles comercialmente, disponibles al público sin
restricciones, o pueden construirse a partir de plásmidos
disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, los
plásmidos equivalentes a los descritos son conocidos en la materia y
serán evidentes para cualquier experto en la materia.
En particular, es preferible que estos plásmidos
tengan todas o alguna de las características siguientes: (1)
contener un número mínimo de secuencias del organismo huésped; (2)
ser estables en el huésped deseado; (3) ser capaces de estar
presente en un número elevado de copias en el huésped deseado; (4)
tener un promotor regulable; y (5) tener al menos una secuencia de
ADN que codifica una característica seleccionable presente en una
porción del plásmido separada del lugar donde se insertará la
secuencia de ADN nueva. La alteración de plásmidos para alcanzar
los criterios anteriores se realiza fácilmente por aquellos expertos
en la materia a la luz de la literatura disponible y de las
enseñanzas de la presente invención. Se sobreentenderá que pueden
existir en la actualidad vectores de clonaje adicionales, o se
descubrirán nuevos vectores que tengan las propiedades
anteriormente indicadas y sean por ello adecuados para utilizar en
la presente invención, por lo tanto dichos vectores se contemplan
también dentro
\hbox{del ámbito de la presente invención.}
La "digestión" de ADN hace referencia al
corte catalítico del ADN con una enzima de restricción que actúa
sólo en ciertas secuencias del ADN. Las diversas enzimas de
restricción utilizadas aquí están disponibles comercialmente y sus
condiciones de reacción y otros requisitos se utilizaron como es
conocido por cualquier experto en la materia. Con fines analíticos,
se utiliza generalmente 1 \mug de plásmido o fragmento de ADN con
aproximadamente 2 unidades de enzima en unos 20 \mul de solución
tamponada. Para el propósito de aislamiento de los fragmentos de
ADN para la construcción del plásmido, se digiere generalmente de 5
a 50 \mug de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un gran
volumen. Las cantidades de tampón y sustrato a utilizar para cada
enzima determinado se especifican por el fabricante. Los tiempos de
incubación son de aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero pueden variar
de acuerdo con las instrucciones suministradas. Después de la
digestión la reacción se migra directamente en una electroforesis
en gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.
La separación por tamaño de los fragmentos de
restricción se realiza utilizando un gel de poliacrilamida del 8
por ciento descrito por Goeddel, D. y col., Nucleic. Acids
Res., 8:4057 81980).
La "desfosforilación" hace referencia a la
eliminación de los fosfatos 5' mediante el tratamiento con
fosfatasa alcalina bacteriana (BAP). Este procedimiento evita que
los dos extremos digeridos por restricción de un fragmento de ADN
se "recircularicen" o formen un bucle cerrado que impida la
inserción de otro fragmento de ADN en el sitio de restricción. Los
procedimientos y reactivos para la desfosforilación son
convencionales. Maniatis, T. y col., Molecular Cloning pág.
113-134 (1982). Las reacciones que utilizan BAP se
llevan a cabo en Tris 50 mM a 68ºC para suprimir la actividad de
cualquier exonucleasa que esté presente en las preparaciones
enzimáticas. Las reacciones se llevan a cabo durante 1 hora. Después
de la reacción, el ADN se migra en una electroforesis en gel y se
purifica del gel.
Los "oligonucleótidos" hacen referencia a
un polidesoxinucleótido de cadena sencilla o a dos cadenas de
polidesoxinucleótidos complementarias que pueden sintetizarse
químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato
5' y por lo tanto no se ligarán con otro oligonucleótido sin la
adición de un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un
oligonucleótido sintético se ligará a un fragmento que no se ha
desfosforilado.
La "ligación" hace referencia a la
formación de enlaces fosfodiésteres entre fragmentos de ácido
nucleico de doble cadena (Maniatis, T. y col., Id. pág.
146). Salvo que se especifique lo contrario, la ligación se realiza
utilizando tampones y condiciones conocidas con 10 unidades de T4
ADN ligasa ("ligasa") por cada 0,5 \mug de cantidades
equimolares aproximadamente de los fragmentos de ADN a ligar.
El "relleno" o "formación de extremos
romos" hace referencia a procedimientos mediante los cuales el
extremo de cadena sencilla en un extremo protuberante de un ácido
nucleico digerido con una enzima de restricción se convierte en una
cadena doble. Esto elimina los extremos protuberantes y forma
extremos romos. Este proceso es una herramienta versátil para
convertir un extremo de corte de restricción que puede ser
protuberante con los extremos creados por sólo una o unas pocas
enzimas de restricción en un extremo compatible con cualquier
endonucleasa de restricción que produce extremos romos u otro
extremo protuberante rellenado. Típicamente, la formación de
extremos romos se logra mediante incubación de 2-15
\mug del ADN diana en tampón de MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 1
mM, NaCl 50 mM, Tris 10 mM (pH 7,5) a aproximadamente 37ºC en
presencia de 8 unidades de fragmento Klenow de la ADN polimerasa I
y 250 \muM de cada uno de los cuatro desoxinucleótidos trifosfato.
La incubación se finaliza generalmente al cabo de 30 min y se
realiza una extracción con fenol y cloroformo y una precipitación
con etanol.
Actualmente se piensa que la estructura
tridimensional de las composiciones de la presente invención es
importante para su funcionamiento tal como se ha descrito aquí. Por
ello, todos los análogos estructurales relacionados que mimeticen
la estructura activa de los formados por las composiciones
reivindicadas aquí se incluyen específicamente dentro del ámbito de
la presente invención.
Se entiende que la aplicación de las enseñanzas
de la presente invención a un problema o situación específico se
hallará dentro de las capacidades de cualquier experto en la materia
a la luz de las enseñanzas aquí contenidas. Procesos
representativos para el aislamiento, utilización y fabricación de
moléculas de inmunoglobulina-LHR híbridas aparecen
más adelante, y son ilustrativos de la invención aunque se refieren
al receptor de localización de linfocitos.
Todas las referencias, en estos ejemplos, al
anticuerpo monoclonal "Mel 14" o a "Mel 14" hacen
referencia a un anticuerpo monoclonal dirigido contra una forma
murina determinada de una proteína de superficie de linfocitos,
como se describe por Gallatin, y col., supra, Nature, 303:30
(1983).
La MLHR se aisló de bazos de ratón tratados con
detergente mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando el
anticuerpo monoclonal Mel 14.
En una preparación típica, se trocearon 300
bazos de ratones hembras ICR (16 semanas) y luego se homogeneizaron
con un molinillo de tejidos Potter-Elvehjem en 180
ml de TritonX-100 al 2% en
PBS-Dulbecco que contenía PMSF 1mM y aprotinina al
1%. La lisis se continuó durante 30 minutos en un agitador a 4ºC. El
lisado se centrifugó sucesivamente a 2.000 g durante 5 minutos y a
40.000 g durante 30 minutos.
El sobrenadante se filtró a través de un filtro
Nitex preaclarado mediante adsorción con suero de rata conjugado
con Sepharose 4B activada con bromuro de cianógeno (10 ml de gel
empaquetado). El suero de rata se diluyó a 1:10 para la
conjugación, la cual se llevó a cabo de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Se aplicó el flujo a una columna de 3
ml conjugada con anticuerpo MEL-14 a 0,5 mg por ml
de Sepharose 4B. Todos los tampones de la columna contenían azida
de sodio al 0,02%.
La columna se lavó con 25 ml de Triton
X-100 al 2% en PBS seguido por 25 ml de CHAPS 10 mM
en el mismo tampón. El antígeno se liberó mediante la adición de 10
ml de CHAPS 10 mM en glicina 100 mM, NaCl 200 mM, pH 3 y se
neutralizó recogiéndolo en 1 ml de Tris-HCl pH 7,6.
Después de lavar la columna con trietilamina 20 mM, NaCl 200 mM, pH
11 y reequilibrarse en CHAPS 10 mM en PBS, el antígeno neutralizado,
se diluyó en 100 ml del tampón de la columna, se reaplicó a la
columna y se repitieron las etapas de lavado y liberación.
La proteína purificada se concentró en un
Centricon 30 (Amicon, Inc.) y se analizó mediante
SDS-PAGE (acrilamida al 7,5%) con la utilización de
tinción de plata para su visualización. Una purificación típica
produjo de 30-40 \mug de antígeno por 300 ratones,
basándose en la comparación con los estándares de orosomucoides.
En resultados no mostrados, un gel de
poliacrilamida del material purificado mostró una banda difusa de
migración a aproximadamente 90.000 daltons y una proteína de peso
molecular superior a aproximadamente 180.000 daltons. El cociente
del componente de 90.000 daltons con relación al de 180.000 daltons
fue de 10:1 o superior en todas las amplias series de
preparaciones. El material se visualizó mediante tinción de plata
de un gel de poliacrilamida al 10%.
La degradación de Edman de fase gaseosa de la
banda de 90.000 daltons dio como resultado la identificación de una
secuencia N-terminal única (Fig. 4A), incluyendo el
aminoácido del extremo más N-terminal. Se
identificaron 38 aminoácidos en el extremo
N-terminal, con cuatro huecos (X) en las posiciones
1, 19, 33 y 34. La asparagina (N) en la posición 22 se dedujo de la
ausencia de una señal aminoacídica en esta posición combinada con
los residuos siguientes de tirosina (Y) y treonina (T), lo que dio
como resultado una secuencia consenso de sitio de glicosilación
(NXT/S).
La secuencia de 13 residuos que se muestra en la
Fig. 4A en el extremo N-terminal de 38 residuos de
largo es la que se dedujo previamente por Siegelman y col.,
supra mediante secuenciación aminoacídica radioactiva, que
muestra un alto nivel de homología (11 de 13 residuos) con la
secuencia de la LHR determinada aquí.
No se obtuvo ninguna secuencia de ubquitina a
partir de las tres migraciones de secuencia que se realizaron con
dos preparaciones de MLHR por separado. Seguramente, esta
modificación estaba ausente en los esplenocitos de ratón, o el
extremo N-terminal de la ubiquitina se bloqueó
durante la degradación de Edman en la LHR de esta fuente.
La secuencia de aminoácidos de la Fig. 2 se
comparó con secuencias conocidas en la base de datos de proteínas
de Dayhoff, mediante la utilización del algoritmo de Lipman, D. y
col., Science 227:1435-1441 (1981).
Los residuos que están subrayados en la Fig. 4A
entre los aminoácidos 7 y 15 se eligieron para producir la sonda
oligonucleotídica que se muestra en la Fig. 4B. Una sonda
oligonucleotídica de 26-mer 32 veces redundante se
diseñó a partir de estos residuos y se sintetizó en un sintetizador
de oligonucleótidos Applied Biosystems. Todas las redundancias
posibles se incluyeron en esta sonda, con la excepción de la prolina
en posición 9, donde el codón CCC se eligió basándose en las reglas
de utilización de codones de mamíferos.
El rastreo de una librería de cADN de bazo
murina, obtenida a partir de bazos diseccionados de ratones con
esta sonda, dio como resultado el aislamiento de un sólo clon de
cADN que hibridaba. Se sembraron 600.000 calvas a 50.000 fagos por
placa (12 placas) de una librería de cADNs en lambda gt10 cebada con
oligo-dT, de 10 bazos murinos obtenida a partir de
mRNA aislados de esplenocitos murinos con 5 \mug/ml de
Concanavalina A durante 6 horas. Las placas se hibridaron con la
sonda oligonucleotídica de 26-mer 32 veces
redundante que se muestra en la Fig. 4B, en tampón de formamida al
20%, 5XSSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico
50 mM (pH 7,6), solución de Denhardts 5X, sulfato de dextrano al 10%
y 20 \mug/ml de esperma de salmón troceado y desnaturalizado a
42ºC durante toda la noche. Estos parámetros hacen referencia aquí a
"condiciones de estringencia". Los filtros se lavaron en
1XSSC, SDS al 0,1% a 42ºC durante 2X 30 min y se autoradiografiaron
a -70ºC durante toda la noche. Un clon positivo duplicado se rastreó
de nuevo, se aisló en inserto EcoRI y se insertó en los
vectores M13 o PUC 118/119 y se determinó la secuencia nucleotídica
a partir de moldes de cadena sencilla utilizando cebadores
específicos de la secuencia.
La Figura 2 muestra la secuencia de ADN completa
del inserto EcoRI de 2,2 Kb contenido en este bacteriófago.
El mayor marco de lectura abierto se inicia con un codon metionina
en la posición 106-108. Se halló una homología con
la caja Kozak alrededor de este codón metionina, lo que sugiere que
probablemente este codon funcione iniciando la traducción proteica.
Una secuencia proteica de 373 aminoácidos de aproximadamente 42.000
daltons de peso molecular está codificada en este marco de lectura
abierto. La proteína traducida muestra una secuencia desde el
residuo 40 al 76 que corresponde exactamente con la secuencia
aminoacídica del extremo N-terminal determinada a
partir de la MLHR aislada.
Este resultado sugiere que el extremo maduro
N-terminal de la MLHR se inicia con el residuo de
triptófano en la posición 39. Sin embargo, se cree que puede haber
ocurrido algún proceso proteolítico del extremo
N-terminal actual de la LHR durante el aislamiento
de la proteína.
Un perfil de hidrofobicidad de la proteína puso
de manifiesto un dominio hidrofóbico localizado en el extremo
N-terminal que podría funcionar como una secuencia
señal para la inserción en el lumen del retículo endoplasmático. La
secuencia deducida para las posiciones 39 a 333 es predominantemente
hidrofílica seguida por un dominio de 22 residuos hidrofóbico, que
es característico de un dominio de parada de transferencia o de
anclaje de membrana.
La región intracelular putativa en el extremo
C-terminal de la proteína es bastante corta, sólo 17
residuos de longitud. En el sitio inmediato al
C-terminal del dominio transmembrana existen
diversos aminoácidos básicos, un hecho típico de uniones entre
anclajes de membrana y dominios citoplasmáticos de receptores de
superficie celular, Yarden y col., Nature. Un sólo residuo de
serina, potencialmente un sitio para la fosforilación, está
presente dentro del dominio citoplasmático putativo.
La proteína contiene diez sitios de
N-glicosilación potenciales, estando todos ellos
dentro del dominio extracelular que sobresale. La ausencia de
asparagina en la posición 60 (residuo 22 de la proteína madura) en
el análisis de secuencia peptídica confirma la glicosilación en este
sitio y establece la orientación extracelular de esta región. La
región codificante contiene un total de 25 residuos de cisteína,
aunque 4 de estos residuos de cisteína están localizados en la
secuencia líder putativa.
Como se muestra en la Fig. 6, la comparación de
la secuencia aminoacídica de MLHR deducida con otras proteínas de
la base de datos de secuencia proteica de Dayhoff mediante la
utilización del programa fastp (Lipman, D., y Pearson, W.,
Science, 227:1435-1441, 1985) puso de
manifiesto diversas homologías de secuencia interesantes.
Las proteínas con los niveles de homología de
secuencia más elevados se muestran con cajas que rodean las
regiones de mayor homología de secuencia. Los números en el inicio
de las secuencias muestran la posición dentro de las proteínas
donde estas secuencias homólogas se localizan.
La Fig. 6A muestra que el motivo del extremo
N-terminal de la LHR (residuos 39 a 155) tiene
ciertas homologías de proteína de unión con carbohidratos, como se
indica (el porcentaje de homología de estas secuencias con la MLHR
se muestra entre paréntesis, y las referencias indicadas se
proporcionan después de los Ejemplos): Drickamer, los residuos
aminoacídicos hallados por Drickamer y col., (1); MuLHR, la
secuencia de MLHR; Hu.HepLec (27,8%), lectina hepática humana (2);
Barn. lec (25%), lectina de percebe (3); Ra.HepLec (23,5%), lectina
hepática de rata (4); Ch.Hepl.Lec (27,5%), lectina hepática de pollo
(5); Hu.IgERec (28,6%), receptor de IgE humano (6); RaHepLec2
(22,6%), lectina hepática de rata 2 (7); Ra.ASGRec (22,6%), receptor
de asialoglicoproteína de rata (8); RA.IRP (25,6%), proteína de
regeneración de islotes de rata (9); Ra.MBP (26,1%), proteína de
unión a manosa de rata (10); RA.MBDa (26,1%), precursor de la
proteína de unión a manosa de rata A (11); RA.KCBP (27%), proteína
de unión de células Kuppfer de rata (12); FlyLec (23,1%), lectina
del moscón gris de la carne (Sarcophaga) (13); y Rab.Surf (20,9%),
tensoactivo de pulmón de conejo (14).
Como se puede ver en la Fig. 6A se muestra que
el motivo localizado en el extremo N-terminal de la
LHR muestra un nivel elevado de homología con varias lectinas
animales dependientes de calcio, es decir, lectinas de tipo C (1).
Estas incluyen pero no se limitan a, diversas proteínas de unión de
azúcares hepáticos del pollo, rata y humanos, lectinas de unión a
manosa soluble, una lectina de células Kupffer, el receptor de
asialoglicoproteína, una proteína del core de proteoglicano del
cartílago, apoproteínas tensoactivas pulmonares y dos lectinas de
invertebrados del moscón gris de la carne y del percebe. A pesar del
adjetivo "invariante" para los aminoácidos reconocido
inicialmente por Drickamer y col., supra, como una
característica común de las lectinas animales de tipo C, éstas no
tienen todas una secuencia completamente conservada en el dominio
de unión al carbohidrato de la MLHR, aunque el grado de homología en
estos residuos y en otras posiciones es evidente. Las lectinas
conocidas pertenecientes a la familia de tipo C presentan un margen
de especificidades de unión a azúcares, incluyendo los
oligosacáridos con galactosa terminal,
N-acetilglucosamina y manosa (1).
El hecho de que existan muchos residuos que son
invariantes en todas estas proteínas de unión a carbohidratos,
sugiere de forma importante que esta región funciona como un dominio
de unión al carbohidrato en la MLHR y explica aparentemente la
capacidad observada de los linfocitos para unirse al endotelio
especializado del tejido linfoide, dependiendo su unión al azúcar
de la presencia de calcio. En algunas realizaciones, en la práctica
de la presente invención se utiliza el dominio de unión al
carbohidrato de la LHR sólo, sin ninguna región flanqueante.
El próximo motivo (residuos
160-193) que se halla casi inmediatamente después
del dominio de unión al carbohidrato muestra un elevado grado de
homología con la familia de factores de crecimiento epitelial
(egf). La Fig. 6B muestra las homologías con el factor de
crecimiento epitelial (egf): MLHR, secuencia de MLHR; Notch
(38,5%), locus notch de Drosophila melanogaster (15); S. purp
(31,7%), proteína semejante al egf de Strongylocentrotur
purpuratus (16); Pro.Z (34,1%), proteína Z bovina (17); Fact. X
(34,2%), factor de coagulación X (18); Fact. VII (27,3%), factor
VII de coagulación (19); Fact. IX (33,3%), factor IX de coagulación
(20); Lin-12 (32,1%), locus Lin-12
de Caenorhabditis elegans (21); Fact. XII (26%), factor de
coagulación XII (22); y Mu.egf (30%), egf murino (23).
Como se puede ver en la Fig. 6B, el mayor grado
de homología en esta región de la MLHR se halló con el locus
neurogénico de Drosophila, notch, aunque también
existe homología significativa con otros miembros de esta gran
familia. La localización variable de este dominio entre los miembros
de esta familia sugiere que esta región puede estar contenida
dentro de un segmento genómico que puede hallarse en proteínas
diferentes para funciones distintas.
Además de los 6 residuos de cisteína, por
término general todos los miembros de esta familia comparten tres
residuos de glicina. La conservación de los residuos de cisteína y
glicina es consistente con la posibilidad de un papel estructural
para esta región en la LHR. Se cree que este dominio puede colocar
el extremo N-terminal localizado en la región de
unión al carbohidrato en una orientación adecuada para la
interacción con el ligando. Además se cree que este dominio puede
servir para reforzar la interacción entre el linfocito y el
endotelio mediante la unión con un homólogo del receptor de egf
sobre una superficie endotelial.
El motivo de la proteína final en la región
extracelular de la MLHR está codificado por los aminoácidos 197 a
328. Esta región de la glicoproteína contiene dos repeticiones
directas de una secuencia de 62 residuos que contiene un motivo
aminoacídico con elevada homología con diversas proteínas de unión
del factor del complemento (Fig. 6C).
La Fig. 6C muestra las homologías de la proteína
de unión al complemento: MLHR, secuencia de MLHR; HuComH (31,9%),
precursor H de la proteína del complemento humana (24); MuComH
(28,9%), precursor H de la proteína del complemento murina (25);
HuBeta (25,6%), glicoproteína I beta-2 humana (26);
HuCR1 (29,9%), CR1 humana (27); EBV/3d (25,6%), receptor del virus
de Epstein-Barr humano/Cd3 (28); HuC2 (27,1%),
precursor del complemento humano (29); HuB (23,1%), factor B del
complemento humano (30); MuC4b (22%), precursor de unión de C4b
murino (31); HuC1s (29,2%), zimógeno C1s humano (32); HuC4b (26,1%),
proteína de unión a C4b humana (33); HuDAF (27,1%), factor de
deceleración humana (34); VacSecP (26,2%), péptido secretor del
virus vaccinia (35).
Estas proteínas, que codifican un amplio margen
de múltiplos de este dominio repetido, incluyen, entre otras, los
precursores del complemento H humano y murino, la glicoproteína beta
2 humana, el receptor del virus de Epstein Barr/Cd3, la proteína de
unión de C4b humana, el factor de deceleración y el polipéptido
secretor del virus vaccinia.
La Figura 7C muestra las homologías entre las
dos repeticiones directas halladas en la MLHR y en las halladas en
las proteínas incluidas en la familia de unión al complemento.
Muchos de los aminoácidos que están conservados en esta clase de
proteínas de unión al complemento, incluyendo diversos residuos de
cisteína conservados, también se hallan en las dos repeticiones en
esta región de la MLHR.
Es interesante remarcar, que las dos
repeticiones contenidas dentro de la MLHR no son sólo duplicaciones
exactas una de otra a nivel aminoacídico, sino que también muestran
homología exacta a nivel de secuencia nucleotídica (residuos
nucleotídicos 685-865 y 866-1056).
Aunque es posible que este resultado sea debido a un artefacto de
clonaje, se halló una región duplicada en varios otros clones
aislados separadamente de una librería de cADN producida a partir
de la línea celular que expresa la MLHR, 38C13 (disponible por la
Universidad de Stanford, Palo Alto, California, U.S.A.), así como en
una homóloga humana de la MLHR (que se discute más adelante).
Además, varios genes, principalmente el gen Lp(a), muestran
un elevado nivel de conservación de la secuencia de repetición
intragénica de este dominio. Estos resultados sugieren que la MLHR,
al igual que otros miembros de la familia de unión al complemento,
contiene múltiples repeticiones de este dominio de unión.
En conclusión, parece ser que la región
extracelular de la MLHR contiene tres motivos proteicos separados
que se han unido para brindar una nueva función o funciones. En la
Fig. 7 se muestra un resumen de los motivos proteicos dentro de
esta glicoproteína.
En general, el clonaje de HuLHR se realizó como
en el ejemplo descrito anteriormente. Se aisló el inserto
EcoR1 de 2,2 Kb del clon de cADN del antígeno de Mel 14
murino descrito anteriormente, se marcó mediante síntesis "random
primed" con la ADN polimerasa y trifosfatos marcados con P^{32}
a elevada actividad específica y se utilizó para rastrear los
600.000 clones de una librería de cADN en lambda gt10 cebada con
oligo dT y obtenida a partir del mRNA de linfocitos de sangre
periférica. Los filtros se hibridaron durante toda la noche a 42ºC
con formamida al 40%, 5XSSC (1XSSC es NaCl 30 mM, citrato trisódico
3 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), sulfato de dextrano al 10%,
solución de 5X Denhardt y 20 \mug/ml de ADN de esperma de salmón
troceado y desnaturalizado. Los filtros se lavaron 2X40 min en
0,2XSSC, sodio dodecil sulfato al 0,1% a 55ºC. Se repicaron 12
clones (aproximadamente 1 positivo por cada placa de 50.000 fagos),
y se aisló el inserto EcoR1 mayor (2,2 Kb) y se determinó la
secuencia del ADN mediante secuenciación con dideoxinucleótidos en
el bacteriófago m13 utilizando cebadores específicos de
secuencia.
Este clon de 2,2 Kb codificaba para un marco de
lectura abierto de 372 aminoácidos con un peso molecular de
aproximadamente 42.200 daltons que se iniciaba con una metionina
precedida por una homología con la caja Kozak. La proteína
codificada contenía 26 residuos de cisteína y 8 sitios de
N-glicosilación potenciales. Una región altamente
hidrofóbica en el extremo N-terminal de la proteína
(residuos 20-33) fue una secuencia señal potencial,
mientras que otra región altamente hidrofóbica localizada en el
extremo C-terminal de 22 aminoácidos de longitud
(residuos 335-357) fue una parada de transferencia
potencial o dominio de anclaje de membrana. Esta región hidrofóbica
en el extremo C-terminal estaba seguida por una
región cargada, presumiblemente citoplasmática.
La comparación de la secuencia nucleotídica de
este clon humano con la hallada previamente para la MLHR mostró un
elevado grado de homología de secuencia de ADN (83%). Los grados
relativos de conservación de secuencia aminoacídica entre la MLHR y
la HuLHR en cada uno de los dominios de la LHR son: 83% para el
dominio de unión al carbohidrato; 82% para el dominio semejante a
egf; 79% para la repetición 1 de unión del complemento; 63% para la
repetición 2 de unión del complemento; 71% para el dominio de unión
del complemento en general; y 96% para el dominio
transmembrana.
La comparación de la secuencia Hermes publicada,
Jalkanen, supra con la secuencia HuLHR de la Fig. 1 muestra
una falta de homología de secuencia.
Con el fin de comprobar de forma concluyente que
el clon de cADN murino aislado aquí codificaba para la MLHR, se
insertó el clon en un vector de expresión y se analizó en un ensayo
de transfección celular transitoria. La expresión de la HuLHR se
realizó de forma similar.
El fragmento EcoR1 que contenía el marco
de lectura abierto descrito anteriormente (fragmento EcoR1
de 2,2 Kb cuya secuencia se muestra en la Fig. 2) se aisló y se ligó
en el vector pRK5 que contiene un promotor de citomegalovirus
(Eaton, D., y col., Biochemistry
25:8343-8347, 1986; patente europea EP 307247
publicada el 15 de marzo de 1989). Se seleccionó un plásmido que
contenía el cADN insertado en la orientación correcta relativa al
promotor y se transfectó en las células renales embrionales humanas
293 utilizando el método de la precipitación con CaPO_{4}.
Al cabo de dos días las células se incubaron con
500 microcuries de cisteína S^{35} y metionina S^{35}. Se
prepararon los lisados y los sobrenadantes como se describió
previamente (Lasky, L., y col., Cell,
50:975-985, 1987) y se inmunoprecipitaron con el
anticuerpo monoclonal Mel 14 (purificado mediante cromatografía de
inmunoafinidad) utilizando un anticuerpo policlonal IgG
anti-rata en un sándwich entre el anticuerpo
monoclonal Mel 14 y la proteína A Sepharose.
Al mismo tiempo, el linfoma de células B, 38C13,
una línea celular que expresa la MLHR, se marcó metabólicamente con
metionina o cisteína, para el análisis de la MLHR del sobrenadante,
o se marcaron las glicoproteínas de superficie celular con
I^{125} y lactoperoxidasa para el análisis de la LHR asociada a
células, y se analizaron mediante inmunoprecipitación con el
anticuerpo Mel 14.
Los inmunoprecipitados resultantes se analizaron
en geles de poliacrilamida al 7,5% y SDS y se autoradiografiaron
durante toda la noche a -70ºC.
Los resultados de estos ensayos se muestran en
la Fig. 5. En dicha figura, los carriles A-F
corresponden a lo siguiente:
- A. Lisados de células 293 transfectadas con un
plásmido de expresión de MLHR, e imunoprecipitadas con el
anticuerpo monoclonal Mel 14.
- B. Sobrenadantes de células 293 transfectadas
con un plásmido de expresión de MHLR, e inmunoprecipitadas con el
anticuerpo monoclonal Mel 14.
- C. Lisados de células 293 transfectadas con un
plásmido que expresa la glicoproteína de cubierta gp120 de VIH e
imunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14.
- D. Sobrenadantes de células 293 transfectadas
con un plásmido de expresión de la cubierta de VIH e
inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14.
- E. Sobrenadantes de las células 38C13
inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14.
- F. Lisados de las células 38C13 marcadas en la
superficie con I^{125} e inmunoprecipitadas con el anticuerpo
monoclonal Mel 14.
Como se puede ver en la Fig. 5, las células
transfectadas con esta construcción producen dos proteínas
asociadas a células que reaccionan de forma específica con el
anticuerpo Mel 14. Las proteínas asociadas a células migraron a
aproximadamente 70.000 daltons y 85.000 daltons, lo que sugiere que
la proteína del core de 42.000 daltons se glicosila en las células
transfectadas. Tras el tratamiento con sialidasa, la banda mayor
sufrió un desplazamiento en su peso molecular (resultados no
mostrados), lo que sugiere que es una forma relativamente madura de
la glicoproteína, mientras que la banda de menor peso molecular fue
resistente a la enzima, lo que indicaba que podía ser una forma
precursora.
El análisis por FACS de las líneas celulares
transfectadas con el anticuerpo Mel 14 mostró que una porción de la
LHR expresada en dichas células se detectaba es la superficie
celular (resultados no mostrados).
Se observó que la glicoproteína de mayor peso
molecular producida en la línea celular transfectada era
ligeramente menor que la producida por el linfoma de células B de
localización en nódulo linfático periférico, 38C13 (Fig. 5, carril
F), un resultado que ya se había observado con otras líneas
celulares transfectadas y que puede ser debido a diferencias
celulares específicas en la glicosilación.
Es interesante remarcar que las células 38C13 y
las células humanas transfectadas secretan en el medio una forma de
MLHR de menor peso molecular (Fig. 5, carriles B y E). La naturaleza
de esta molécula secretada es incierta, aunque su peso molecular
reducido sugiere que puede ser un producto de hidrólisis de la forma
proteica de superficie celular que resulta de la proteolisis cerca
del anclaje de membrana.
En conclusión, estos resultados demuestran de
forma convincente que el clon de cADN que se había aislado codifica
la MLHR.
La Fig. 8 muestra la construcción de quimeras de
MLHR-IgG que contienen los motivos de lectina,
lectina-egf y
lectina-egf-motivos reguladores del
complemento. La parte superior de la figura muestra los dominios
proteicos del receptor de localización de linfocitos murinos (MLHR)
incluyendo la secuencia señal del extremo N-terminal
(SS), la lectina, el factor de crecimiento epitelial (egf) y los
dominios reguladores del complemento (CDB) así como también un
dominio de anclaje transmembrana (TMD) y una secuencia corta
citoplasmática. Las tres quimeras MLHR-IgG
truncadas que contienen la lectina (MLHR-L+IgG), la
lectina y el egf (MLHR-LE+IgG) y la lectina, egf y
dos motivos reguladores del complemento
(MLHR-LEC+IgG) también se muestran en la Fig. 8.
Todas estas proteínas truncadas están unidas a una región de cadena
pesada de gamma 1 humana justo cadena arriba del dominio bisagra
(H), de modo que tales quimeras contienen los dos residuos cisteína
(C) de la bisagra responsables de la dimerización de la
inmunoglobulina así como también de las regiones constantes CH2 y
CH3. Se utilizó una caja de región constante de cadena pesada de
IgG1 humana caracterizada previamente (Capone y col., supra,
1989). Los sitios de unión entre las secuencias de LHR e IgG humana
se eligieron de modo que la unión de las moléculas cerca de la
región bisagra diera como resultado moléculas quiméricas que se
sintetizaran y dimerizaran de forma eficiente en la ausencia de
producción de cadena ligera. Además, la utilización de la región
constante de IgG1 humana obvia cualquier dificultad debida a la
reactividad cruzada con IgGs murinas endógenas en los experimentos
inmunohistoquímicos descritos más adelante.
Como se puede ver a partir de la figura 9, estas
quimeras se sintetizaron y secretaron de forma eficiente en estos
ensayos de transfección transitoria. La reactividad de estas
quimeras con la proteína A sepharose en ausencia de anticuerpos
añadidos demuestra que los dominios de la región constante se
pliegan normalmente. La Figura 9 muestra que estas moléculas se
dimerizan en condiciones no reductoras, lo que demuestra que la
región bisagra es completamente funcional en estas quimeras. Por
último, la reactividad de la proteína A también permite la
purificación casi homogénea de estas quimeras en columnas de
proteína A sepharose. Los resultados presentes demuestran la
producción de entidades semejantes a anticuerpos, cuyo dominio
"variable", se puede decir, deriva de la MLHR mientras que el
dominio constante deriva de la cadena pesada de la IgG gamma 1
humana.
Se inició con un plásmido de expresión
MLHR-PRK5 descrito anteriormente (Eaton y col.,
1986; Lasky y col.,
\hbox{ Cell }50:975-985, 1987) y una copia de cADN de una cadena pesada de IgG humana (Capon y col., Nature 337:525-531, 1989). Un fragmento HindIII de 1.100 pb que codifica las regiones CH1-CH3 de la región constante de IgG1 humana se insertó en 3' del sitio poliA del cADN de MLHR. Este plásmido se convirtió en un molde de cadena sencilla utilizando un origen de replicación de m13 y el fago auxiliar K07, después de lo cual las regiones entre la bisagra y la lectina, egf y la segunda repetición de unión del complemento N-terminal a la región de anclaje transmembrana putativa, se eliminaron mediante formación y escisión de un bucle por mutagénesis in vitro utilizando oligonucleótidos de 48-mer (Zoller y Smith, 1982). Los mutantes resultantes se rastrearon con oligonucleótidos de 21 mer marcados con P^{32} abarcando las junturas de la deleción, y se secuenciaron
\hbox{los mutantes aislados mediante secuenciación de cadena doble.}
Se analizaron los mutantes correctos para
conocer su expresión mediante transfección en células 293 renales
humanas mediante la utilización de los procedimientos descritos
anteriormente. Se analizaron los sobrenadantes marcados con
metionina y cisteína marcados con S^{35} mediante
inmunoprecipitación con bolas de proteína A sepharose en ausencia
de anticuerpos añadidos. Las proteínas precipitadas se analizaron en
geles de poliacrilamida al 7,5% y SDS con o sin reducción por beta
mercaptoetanol. Los plásmidos que dieron como resultado quimeras
expresadas correctamente se introdujeron en células 293 mediante
transfección en presencia de plásmidos de selección que codificaban
para la resistencia a G418 así como la dihidrofolato reductasa. Los
clones se seleccionaron en G418 y los plásmidos incorporados se
amplificaron en presencia de metotrexato. Las líneas celulares
estables que expresaban niveles elevados de cada construcción se
crecieron a gran escala en frascos de cultivo T y los sobrenadantes
celulares se clarificaron mediante centrifugación y filtración. Los
sobrenadantes resultantes se concentraron mediante filtración en
Amicon y se pasaron por columnas de proteína A sepharose, se lavaron
con PBS y se eluyeron con ácido acético 0,1 M, NaCl 0,15 M (pH
3,5). El material eluido se neutralizó inmediatamente con Tris 3 M,
pH 9 y se cuantificó mediante electroforesis en gel con SDS así como
también en un ensayo
ELISA.
ELISA.
Los resultados de la electroforesis en gel
descritos en el párrafo anterior se muestran en la Fig. 9. Las
proteínas reducidas se muestran en los carriles A-F,
las proteínas no reducidas en los carriles G-I y
las proteínas purificadas en los carriles J-L. Los
pesos moleculares de marcadores se muestran en kilodaltons. Los
carriles se indentificaron de la forma siguiente: A.
MLHRLEC-IgG secretada, B.
MLHRLEC-IgG intracelular, C.
MLHRLE-IgG secretada, D. MLHRLE-IgG
intracelular, E. MLHRL-IgG secretada, F.
MLHRL-IgG intracelular, G.
MLHRLEC-IgG secretada, H. MLHRLE-IgG
secretada, I. MLHRL-IgG secretada, J.
MLHRLEC-IgG purificada, K.
MLHRLE-IgG purificada y L.
MLHRL-IgG purificada.
Las quimeras LHR-IgG aisladas se
cuantificaron utilizando un formato ELISA que consistía de pocillos
de microtitulación recubiertos con un anticuerpo monoclonal de ratón
específico anti-IgG 1 humana. Se incubaron las
muestras desconocidas y el estándar de inmunoadhesión
CD4-IgG1 humano altamente purificado con las placas
recubiertas de anticuerpo, después se lavaron las placas y el
material unido se hizo reaccionar con anticuerpo de cabra
anti-IgG1 humana conjugado a peroxidasa de rábano,
se prosiguió por diversos lavados y adición de sustrato. Este
ensayo cuantitativo permitió la cuantificación de cantidades del
orden de subnanogramos de las quimeras
LHR-IgG
aisladas.
aisladas.
La capacidad de diversas quimeras para reconocer
el carbohidrato de pared celular de levaduras, éster de
polifosfomanano o PPME se analizó mediante un formato ELISA tal como
se describió anteriormente (Imae y col., 1989). Brevemente, se
recubrieron pocillos de microtitulación con cantidades
aproximadamente equivalentes de quimeras purificadas, durante toda
la noche a 4ºC. Los sitios no específicos se bloquearon con BSA,
después de lo cual los antígenos unidos se hicieron reaccionar con
5 \mug por ml de una solución de PPME. El carbohidrato unido se
detectó con un anticuerpo policlonal dirigido contra éste y mediante
reactivos estándares de tinción inmunohistoquímica (Vector). La
inhibición con Mel 14 se realizó mediante preincubación de los
pocillos que contenían MLHRLEC-IgG con el
anticuerpo monoclonal antes de la adición de PPME, mientras que la
dependencia de calcio de la interacción receptor de
localización-carbohidrato se demostró mediante la
inclusión de EGTA 10 mM durante la reacción de unión. En los
ensayos para examinar la inhibición se añadieron diversos otros
aditivos antes de la incubación con PPME. Al cabo de 1 h a 22ºC, las
placas se lavaron e incubaron con un anticuerpo policlonal de
conejo dirigido contra el PPME durante 1 h a 22ºC. Las placas se
lavaron e incubaron con
Vector-ABC-AP durante 30 min, se
lavaron y revelaron. Los ensayos resultantes se cuantificaron en un
lector de placas. Los carbohidratos utilizados en los ensayos
inhibitorios se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis,
MO.).
Los resultados de la unión con PPME se muestran
en la Fig. 10. Los carriles contienen las siguientes quimeras
MLHR-IgG: A. unión de PPME con quimeras MLHRL-,
MLHRLE- y MLHRLEC-IgG. B. Inhibición de la unión de
MLHRLEC-IgG-PPME con el anticuerpo
monoclonal Mel 14 y EGTA. C. Inhibición de la unión de
MLHRLEC-IgG-PPME con otros
carbohidratos.
Trabajos anteriores habían demostrado que la LHR
era capaz de unirse a un manano, éster de fosfomanano o PPME de
pared celular de levadura (Yednock y col., J. Cell Biol.,
104:725-731, 1987), y por ello esta unión inhibía
la capacidad de los linfocitos de adherirse a vénulas endoteliales
altas de nódulos linfáticos periféricos, de acuerdo con la
suposición de que el dominio de lectina de LHR del nódulo linfático
periférico puede reconocer un carbohidrato en el endotelio del
nódulo linfático periférico. Además, se halló que el anticuerpo Mel
14 inhibía la unión de PPME con la superficie del linfocito
(Yednock y col., supra, 1987), lo que era consistente con la
noción de que este carbohidrato se unía dentro del dominio de
lectina de la LHR del nódulo linfático periférico.
Se halló que la quimera que se unía al PPME era
la que contenía la lectina, el egf y las estructuras de repetición
de unión del complemento duplicadas. Esta unión era inhibida por el
anticuerpo Mel 14, de acuerdo con los resultados que demostraban
que la quimera MLHRLEC-IgG era reconocida por este
anticuerpo (resultados no mostrados), y era comparable
cuantitativamente con la hallada previamente utilizando la MLHR
aislada a partir de células del bazo (Imai y col., enviado a
publicación, 1989), lo que sugiere que dicha unión representa la
misma interacción proteína-carbohidrato que se había
hallado con la LHR en la superficie de linfocitos (Yednock y col.,
supra, 1987). Además, se halló que la unión era dependiente
de calcio (Stoolman y Rosen, J.Cell. Biol.
96:722-729), lo que implicaba que el dominio de
lectina dependiente de calcio o de tipo C (Drickamer, J. Biol.
Chem, 263:9557-9560, 1988) era al menos
responsable de esta interacción, como se había mostrado para el
receptor asociado de linfocitos
(figura 9b).
(figura 9b).
Trabajos anteriores habían demostrado que
diversos carbohidratos además del PPME eran capaces de ser
reconocidos por la MLHR derivada del bazo (Yednock y col.,
supra; Imai y col., supra, 1989). Estos incluyen la
fucoidina, el sulfato de dextrano y las sulfatidas derivadas del
cerebro. Se examinó la capacidad de estos carbohidratos para
inhibir la interacción entre la quimera MLHRLEC-IgG
y el PPME con el fin de investigar la especificidad de esta
molécula versus la glicoproteína derivada del bazo descrita
anteriormente (Imai y col, supra, 1989). Como se puede ver
en la figura 9, la fucoidina, el sulfato de dextrano y la sulfatida
son capaces de inhibir la interacción entre el PPME y la
MLHRLEC-IgG, lo que implica que la especificidad del
carbohidrato de esta proteína derivada recombinante mimetiza la
anteriormente descrita para la proteína natural. La falta de
inhibición provocada por los otros dos carbohidratos cargados,
condroitín sulfato y heparina, sugiere que la inhibición es debida
al reconocimiento específico del carbohidrato y no a la
interferencia inespecífica debida a la naturaleza altamente cargada
de los
componentes.
componentes.
El ensayo bloqueante de células de
Stampfer-Woodruff (Stampfer y Woodruff, J. Exp.
Med. 144:828-833, 1976) se realizó con
secciones de cortes con criostato de nódulos linfáticos periféricos
de ratón, así como también con las placas de Peyer como se
describió anteriormente (Geoffrey Rosen, J. Cell Biol., en
publicación, 1989). Brevemente, las secciones de tejido congelado
se incubaron con linfocitos mesentéricos en presencia de quimeras
MLHR-IgG, MLHR derivadas de bazos aislados, o sólo
con tampón. Las quimeras MLHR-IgG se incluyeron en
concentraciones tan elevadas como 10 \mug por sección y se
preincubaron en secciones congeladas antes de la adición de 1 x
10^{7} células por ml. Los portaobjetos se lavaron, y se
cuantificó la unión de los linfocitos mediante morfometría digital
como el número de linfocitos unidos a HEV en estos órganos linfoides
por unidad de área.
En resultados no mostrados, se halló que la
quimera MLHRLEC-IgG inhibía la unión de linfocitos
con HEV del nódulo linfático periférico a un nivel de inhibición de
aproximadamente el 75% mientras que, en este ensayo, la MLHR
derivada del bazo bloqueaba a un nivel de aproximadamente el 50%.
Esta inhibición era dependiente de calcio y era bloqueada por la
inclusión del anticuerpo monoclonal Mel 14 (resultados no
mostrados).
Se utilizaron quimeras MLHR-IgG
aisladas para experimentos inmunohistoquímicos utilizando
procedimientos idénticos a los descritos para los anticuerpos
monoclonales. Secciones de 8-10 micras de tejido se
cortaron en un criostato y se fijaron con cacodilato 0,1 M,
paraformaldehído al 1% durante 30 minutos a 4ºC. Las secciones se
lavaron con PBS de Dulbecco y se tiñeron con cantidades variables de
la quimera MLHR-IgG en suero de ratón normal al 5%
a 4ºC durante 30 min. Luego, se lavaron las secciones y se incubaron
en una segunda etapa con un anticuerpo específico Fc
anti-humano de cabra biotinilado (Vector). La
peroxidasa endógena se eliminó mediante tratamiento de las
secciones con peróxido de hidrógeno-metanol después
de la adición del reactivo de la segunda etapa y antes de la
adición del complejo Vector ABC. Las secciones se lavaron e
incubaron con el sustrato (AEC) durante 5-10
minutos. Por último, las secciones se contrastaron con tinción de
hematoxilina acuosa (Biomedia) y se visualizaron con un Zeiss
Axiophot.
Estos análisis inmunohistoquímicos de las tres
quimeras MLHR-IgG utilizaron nódulos linfáticos
periféricos como fuente de tejido. La elección del nódulo linfático
periférico como fuente histológica fue dictada por la amplia
bibliografía al respecto que demostraba que los linfocitos se unen a
las HEV de este tejido linfoide de manera que la unión pueda ser
bloqueada por Mel-14, lo que implicaba que el mayor
nivel de ligando reconocido por la MLHR debería hallarse en este
tejido (Gallatin y col., Nature, 304:30-34,
1983). La quimera MLHRLEC-IgG fue capaz de teñir
las HEV del nódulo linfático periférico. La tinción se halló
exclusivamente sobre las células del endotelio altamente tabicado,
sin que se tiñeran otras regiones ad- o abluminales. Además esta
tinción podía bloquearse por el anticuerpo Mel 14 y era dependiente
de la presencia de calcio, lo que sugiere que la unión de
MLHRLEC-IgG con las HEV del nódulo linfático
periférico mimetiza la adhesión entre los linfocitos y las HEV. De
acuerdo con los resultados de unión con PPME, la tinción de HEV del
nódulo linfático periférico por MLHRLEC-IgG se
podía inhibir por la fucoidina y el sulfato de dextrano (figura 5),
mientras que el condroitín sulfato y los mananos sencillos eran
incapaces de inhibir la reacción de tinción (resultados no
mostrados), lo que implica de nuevo que la reacción de tinción era
debida al reconocimiento de un ligando del carbohidrato expresado
en las HEV del nódulo linfático periférico. Estos resultados ponen
de manifiesto que este tipo de reactivo inmunohistoquímico puede
utilizarse para analizar la distribución de la molécula(s)
endotelial capaz de interaccionar con la LHR del nódulo
linfático
periférico.
periférico.
Se halló, en los resultados de los ensayos
inmunohistoquímicos no mostrados, que la quimera
MLHRLEC-IgG es, sorprendentemente, capaz de
reconocer específicamente el endotelio de las placas de Peyer. La
quimera parece teñir el endotelio altamente tabicado de los vasos
de las placas de Peyer que contienen linfocitos. Esta tinción es
inhibida por el anticuerpo Mel 14 y también es dependiente de
calcio. Es interesante resaltar que la tinción de HEV de las placas
de Peyer de parece algo más débil en relación con la hallada para la
tinción de HEV del nódulo linfático periférico, lo que implica que
en este órgano linfoide se expresa un nivel inferior de
ligando(s) de MLHR. Estos resultados demuestran que, aunque
otros sistemas de adhesión puedan estar implicados en este órgano
(Holzman y col., Cell, 56:37-46, 1989), el
ligando(s) para la LHR del nódulo linfático periférico se
expresa y, por ello, está implicado en la unión de linfocitos con el
endotelio de este órgano linfoide.
1. Drickamer, K., J. Biol. Chem.,
263, 9557 (1988); Dricakmaer, K., Kidney Int.,
32, S167 (1987).
2. Spiess, M., y col., Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 82:6465 (1985).
3. Muramoto, K., y col., Biochem.
Biophys. Acta 874:285 (1986).
4. Leung, J., y col., J. Biol.
Chem. 260:12523 (1985); Holland, E., y col.,
Proc. Natl. ACad. Sci. USA, 81:7388 (1984).
5. Drickamer, K., J. Biol. Chem.
256:5827 (1981).
6. Kikutani, H., y col., Cell
47:657 (1986).
7. McPhaul, M., y col., Molec. Cell
Biol. 7:1841 (1987).
8. Halberg, D., y col., J. Biol.
Chem., 262:9828 (1987).
9. Terzaono, K., y col., J. Biol.
Chem., 263:2111 (1988).
10. Drickamer, K., J. Biol. Chem.,
262:2582 (1987).
11. Drickamer, K., J. Biol. Chem.,
261:6878 (1986).
12. Hoyle, G., y col., J. Biol.
Chem., 263:7487 (1988).
13. Takahashi, H., y col., J. Biol.
Chem., 260:12228 (1985).
14. Boggaram, V., y col., J. Biol.
Chem., 263:2939 (1988).
15. Kidd, S., y col., Mol. Cell
Biol. 6:3094 (1986).
16. Hursh, D., y col., Science,
237:1487 (1987).
17. Hojrup, P., y col., FEBS Lett.
184:333 (1985).
18. Fung, M., y col., Nucl.Acids.
Res. 12:4481 (1984).
19. Takeya, H., y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 76:4990 (1979).
20. McMullen, B., y col., Biochem.
Biophys. Res. Commun., 115: 8 (1983).
21. Greenwald, I., Cell, 43:583
(1985).
22. Cool, D., y col., Biol. Chem.,
260:13666 (1985).
23. Gray, A., y col., Nature,
303:722 (1983).
24. Schulz, T., y col., Eur. J.
Immunol., 16:1351 (1986).
25. Kristensen, T., y col., Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 83:3963 (1986).
26. Lozier, J., y col., Proc. Natl.
Acad. Sci., USA., 81:3640 (1984).
27. Bentley, D., Biochem. J.,
239:339 (1986).
28. Moore, M., y col., Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 84:9194 (1987).
29. Bentley, D., Proc. Natl. Acad.
Sci., USA 81:1212 (1984).
30. Mole, J., y col., J. Biol.
Chem., 263:549 (1988).
31. DiScipio, R., y col., J. Biol.
Chem., 263:549 (1984).
32. Kusomoto, H., y col., Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 85:7307 (1988).
33. Lintin, S., y col., FEBS
Lett., 204:77 (1986).
34. Caras, I., y col., Nature,
325:545 (1987).
35. Kotwat, G., y col., Nature,
335:176 (1988).
Claims (22)
1. Procedimiento de fabricación de un dímero de
cadena pesada de inmunoglobulina, en el cual una secuencia
aminoacídica de una pareja de unión al ligando que es una cadena
única y es un receptor, una proteína transportadora, una hormona,
un factor de crecimiento o una enzima y no es un receptor de
localización de linfocitos, no es un miembro de la superfamilia de
genes de inmunoglobulinas ni una proteína homóloga a éstos, ni
tampoco un polipéptido de subunidades múltiples codificadas por
genes discretos, se sustituye por las regiones variables de las
cadenas pesadas de inmunoglobulina, en donde dichas cadenas pesadas
de inmunoglobulina retienen al menos bisagra y los dominios CH2 y
CH3 de la región constante de cadena pesada.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde la pareja de unión al ligando es un
receptor.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde la pareja de unión al ligando es una
proteína transportadora.
4. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde la pareja de unión al ligando es una
hormona.
5. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde la pareja de unión al ligando es un
factor de crecimiento.
6. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde la pareja de unión al ligando es una
enzima.
7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en donde el dímero comprende una
secuencia de inmunoglobulina obtenida a partir de IgG1, IgG2, IgG3,
IgG4, IgA, IgE, IgD, o IgM.
8. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en donde el dímero comprende un dominio constante
de una cadena pesada de IgG.
9. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde el dímero se une a un
marcador detectable.
10. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde el dímero comprende una
secuencia de inmunoglobulina humana.
11. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde la mencionada pareja de
unión al ligando es humana.
12. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde la mencionada proteína de
la pareja de unión al ligando en la fusión es incapaz de anclarse en
la membrana celular.
13. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, en donde la mencionada pareja de unión
al ligando es una proteína de membrana celular.
14. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde una mencionada cadena de
inmunoglobulina procede de una especie distinta a la de la pareja de
unión.
15. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde las dos regiones variables se sustituyen
en el dímero por secuencias aminoacídicas de unión al ligando
distintas.
16. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde el dímero no está
asociado con glicosilación.
17. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde el dímero se acompaña de
un vehículo aceptable fisiológicamente.
18. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 17, en donde el vehículo es una solución acuosa
estéril.
19. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 17, en donde el vehículo es una formulación de
liberación sostenida.
20. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 17, en donde el vehículo es un liposoma.
21. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde las cadenas pesadas de
inmunoglobulina retienen toda la región constante de cadena
pesada.
22. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 20, en donde las cadenas pesadas de
inmunoglobulina retienen la región constante de cadena pesada
carente del dominio CH1.
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---|---|---|---|---|
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US5336603A (en) * | 1987-10-02 | 1994-08-09 | Genentech, Inc. | CD4 adheson variants |
US5567584A (en) * | 1988-01-22 | 1996-10-22 | Zymogenetics, Inc. | Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF |
US5750375A (en) * | 1988-01-22 | 1998-05-12 | Zymogenetics, Inc. | Methods of producing secreted receptor analogs and biologically active dimerized polypeptide fusions |
US6018026A (en) | 1988-01-22 | 2000-01-25 | Zymogenetics, Inc. | Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions |
US6685941B1 (en) | 1988-11-23 | 2004-02-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods of treating autoimmune disease via CTLA-4Ig |
US6406697B1 (en) | 1989-02-23 | 2002-06-18 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
US5225538A (en) * | 1989-02-23 | 1993-07-06 | Genentech, Inc. | Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins |
US5242687A (en) * | 1989-03-15 | 1993-09-07 | Tkb Associates Limited Partnership | Method of reducing cellular immune response involving T-cells using CD8-bearing antigen presenting cells |
US7264944B1 (en) | 1989-04-21 | 2007-09-04 | Amgen Inc. | TNF receptors, TNF binding proteins and DNAs coding for them |
DE59010941D1 (de) * | 1989-04-21 | 2005-03-24 | Amgen Inc | TNF-Rezeptor, TNF bindende Proteine und dafür kodierende DNAs |
US6143866A (en) * | 1989-07-18 | 2000-11-07 | Amgen, Inc. | Tumor necrosis factor (TNF) inhibitor and method for obtaining the same |
IL95031A (en) | 1989-07-18 | 2007-03-08 | Amgen Inc | A method of producing a recombinant human necrotic factor absorber |
US6267964B1 (en) * | 1989-08-01 | 2001-07-31 | Affibody Technology Sweden Ab | Stabilized protein or peptide conjugates able to bond albumin having extended biological half-lives |
US5395760A (en) * | 1989-09-05 | 1995-03-07 | Immunex Corporation | DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors |
NZ235148A (en) * | 1989-09-05 | 1991-12-23 | Immunex Corp | Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences |
US5605690A (en) * | 1989-09-05 | 1997-02-25 | Immunex Corporation | Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor |
US6541610B1 (en) | 1989-09-05 | 2003-04-01 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor |
US5945397A (en) * | 1989-09-05 | 1999-08-31 | Immunex Corporation | Purified p75 (type II) tumor necrosis factor receptor polypeptides |
DK0939121T4 (da) * | 1989-09-12 | 2008-02-04 | Ahp Mfg B V | TNF-bindende proteiner |
US5216132A (en) * | 1990-01-12 | 1993-06-01 | Protein Design Labs, Inc. | Soluble t-cell antigen receptor chimeric antigens |
US6552170B1 (en) * | 1990-04-06 | 2003-04-22 | Amgen Inc. | PEGylation reagents and compounds formed therewith |
GB9022543D0 (en) * | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Antibody production |
DE4037837A1 (de) * | 1990-11-28 | 1992-06-04 | Behringwerke Ag | Zellfreie rezeptorbindungsteste, ihre herstellung und verwendung |
US7070991B2 (en) * | 1991-02-08 | 2006-07-04 | Progenics Pharmaceuticals, Inc. | Cells expressing a CD4-IgG2 chimeric heterotetramer |
WO1992013947A1 (en) | 1991-02-08 | 1992-08-20 | Progenics Pharmaceuticals, Inc. | CD4-GAMMA2 AND CD4-IgG2 CHIMERAS |
CA2081028C (en) * | 1991-03-12 | 1999-12-14 | Barbara P. Wallner | Cd2 binding domain of lymphocyte function associated antigen 3 |
MX9203138A (es) * | 1991-03-12 | 1992-09-01 | Biogen Inc | Dominio de enlace cd2-de antigeno 3 (lfa-3) asociado con funcion linfositos. |
US6582959B2 (en) * | 1991-03-29 | 2003-06-24 | Genentech, Inc. | Antibodies to vascular endothelial cell growth factor |
US20030206899A1 (en) * | 1991-03-29 | 2003-11-06 | Genentech, Inc. | Vascular endothelial cell growth factor antagonists |
US5318890A (en) * | 1991-05-06 | 1994-06-07 | The Regents Of The University Of California | Assays for inhibitors of leukocyte adhesion |
US6797492B2 (en) | 1991-05-17 | 2004-09-28 | Merck & Co., Inc. | Method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains |
US5851795A (en) * | 1991-06-27 | 1998-12-22 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble CTLA4 molecules and uses thereof |
US5844095A (en) * | 1991-06-27 | 1998-12-01 | Bristol-Myers Squibb Company | CTLA4 Ig fusion proteins |
EP0533006A1 (en) * | 1991-09-18 | 1993-03-24 | F.Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft | Chimaeric interleukin 5-receptor/immunoglobulin polypeptides |
US6764681B2 (en) * | 1991-10-07 | 2004-07-20 | Biogen, Inc. | Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the CD2/LFA-3 interaction |
US5871734A (en) * | 1992-01-13 | 1999-02-16 | Biogen, Inc. | Treatment for asthma with VLA-4 blocking agents |
US6399368B1 (en) | 1992-01-17 | 2002-06-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Secretion of T cell receptor fragments from recombinant Escherichia coli cells |
FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
US5932214A (en) * | 1994-08-11 | 1999-08-03 | Biogen, Inc. | Treatment for inflammatory bowel disease with VLA-4 blockers |
WO1993019777A1 (en) * | 1992-03-30 | 1993-10-14 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor |
WO1993022332A2 (en) * | 1992-04-24 | 1993-11-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells |
US5540926A (en) * | 1992-09-04 | 1996-07-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble and its use in B cell stimulation |
WO1994005314A1 (en) * | 1992-09-08 | 1994-03-17 | Centocor, Inc. | Peptide inhibitors of leukocyte adhesion |
WO1994006476A1 (en) * | 1992-09-15 | 1994-03-31 | Immunex Corporation | Method of treating tnf-dependent inflammation using tumor necrosis factor antagonists |
CA2144081C (en) * | 1992-09-16 | 2004-11-30 | Filip Roos | Protection against liver damage by hgf |
WO1994006469A1 (en) * | 1992-09-18 | 1994-03-31 | La Jolla Institute For Allergy And Immunology | Hiv fusion polypeptide |
US6270766B1 (en) | 1992-10-08 | 2001-08-07 | The Kennedy Institute Of Rheumatology | Anti-TNF antibodies and methotrexate in the treatment of arthritis and crohn's disease |
US5474766A (en) * | 1992-12-18 | 1995-12-12 | Washington University | Methods and compositions for inhibition of hepatic clearance of tissue-type plasminogen activator |
US5710123A (en) * | 1992-12-18 | 1998-01-20 | Centocor, Inc. | Peptide inhibitors of selectin binding |
SG48892A1 (en) * | 1993-01-25 | 1998-05-18 | Dana Faber Cancer Inst Inc | Chimeric L- and P-selectin by exchange of domains-uses thereof |
US7537932B1 (en) | 1993-05-19 | 2009-05-26 | Schering Corporation | Antibodies that bind purified mammalian FLT3 ligands |
US20050129670A1 (en) * | 1993-07-26 | 2005-06-16 | Genetics Institute, Llc. | Tumor cells modified to express B7-2 with increased immunogenicity and uses therefor |
US5861310A (en) * | 1993-11-03 | 1999-01-19 | Dana-Farber Cancer Institute | Tumor cells modified to express B7-2 with increased immunogenicity and uses therefor |
US6084067A (en) * | 1993-07-26 | 2000-07-04 | Dana-Farber Cancer Institute | CTLA4/CD28 ligands and uses therefor |
US6130316A (en) * | 1993-07-26 | 2000-10-10 | Dana Farber Cancer Institute | Fusion proteins of novel CTLA4/CD28 ligands and uses therefore |
US6723705B1 (en) | 1993-08-19 | 2004-04-20 | Gentics Institute, Inc. | Tumor cells modified to express B7-2 with increased immunogenicity and uses therefor |
US6824779B1 (en) | 1993-07-26 | 2004-11-30 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for inhibiting the interaction of B7-2 with its natural ligand |
SE9302855D0 (sv) * | 1993-09-06 | 1993-09-06 | Martin Lindberg | Method and means for producing plasmaproteinase inhibitor binding proteins |
WO1995014787A1 (en) * | 1993-11-22 | 1995-06-01 | Centocor, Inc. | Peptide inhibitors of selecting binding |
DE69521789T2 (de) * | 1994-02-01 | 2002-04-25 | Us Health | Fusionierte proteine die antikörper-teile und nicht-antikörper-teile enthalten |
US7294331B2 (en) * | 1994-03-07 | 2007-11-13 | Immunex Corporation | Methods of using flt3-ligand in hematopoietic cell transplantation |
EP0749323B1 (en) * | 1994-03-08 | 2000-11-29 | Dana-Farber Cancer Institute | Methods for modulating t cell anergy |
US5877016A (en) | 1994-03-18 | 1999-03-02 | Genentech, Inc. | Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors |
IL113484A0 (en) * | 1994-04-28 | 1995-07-31 | Immunex Corp | Viral proteins pharmaceutical compositions containing them their preparation and use |
USRE38313E1 (en) | 1994-05-06 | 2003-11-11 | Institut Gustave Roussy | Soluble polypeptide fractions of the LAG-3 protein, production method, therapeutic composition, anti-idiotype antibodies |
US6001968A (en) | 1994-08-17 | 1999-12-14 | The Rockefeller University | OB polypeptides, modified forms and compositions |
US6471956B1 (en) | 1994-08-17 | 2002-10-29 | The Rockefeller University | Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto |
US6429290B1 (en) | 1994-08-17 | 2002-08-06 | The Rockefeller University | OB polypeptides, modified forms and derivatives |
US6048837A (en) * | 1994-08-17 | 2000-04-11 | The Rockefeller University | OB polypeptides as modulators of body weight |
US6309853B1 (en) | 1994-08-17 | 2001-10-30 | The Rockfeller University | Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
US6350730B1 (en) | 1994-08-17 | 2002-02-26 | The Rockefeller University | OB polypeptides and modified forms as modulators of body weight |
US6124448A (en) * | 1994-08-17 | 2000-09-26 | The Rockfeller University | Nucleic acid primers and probes for the mammalian OB gene |
US5541087A (en) * | 1994-09-14 | 1996-07-30 | Fuji Immunopharmaceuticals Corporation | Expression and export technology of proteins as immunofusins |
US5814464A (en) * | 1994-10-07 | 1998-09-29 | Regeneron Pharma | Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2 |
US6410008B1 (en) * | 1994-12-12 | 2002-06-25 | Beth Israel Hospital Association | Chimeric IL-10 proteins and uses thereof |
CA2205572A1 (en) * | 1994-12-12 | 1996-06-20 | Beth Israel Hospital Association | Chimeric cytokines and uses thereof |
US6808709B1 (en) * | 1994-12-30 | 2004-10-26 | The Regents Of The University Of California | Immunoglobulins containing protection proteins and their use |
US6086875A (en) * | 1995-01-17 | 2000-07-11 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of immunogens |
US6485726B1 (en) * | 1995-01-17 | 2002-11-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
US6030613A (en) * | 1995-01-17 | 2000-02-29 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
US6455685B1 (en) | 1995-03-03 | 2002-09-24 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the treatment and diagnosis of immune disorders |
US20030069196A1 (en) * | 1995-03-03 | 2003-04-10 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the treatment and diagnosis of immune disorders |
US6066322A (en) | 1995-03-03 | 2000-05-23 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods for the treatment of immune disorders |
US6211142B1 (en) * | 1995-03-10 | 2001-04-03 | Genentech, Inc. | Compositions comprising gas6 polypeptides and articles of manufacture comprising the same |
US6680057B1 (en) * | 1995-03-23 | 2004-01-20 | Immunex Corporation | Methods of treating autoimmune disease by administering interleukin-17 receptor |
JP4373495B2 (ja) * | 1995-03-23 | 2009-11-25 | イミュネックス・コーポレーション | Il−17受容体 |
IL117645A (en) * | 1995-03-30 | 2005-08-31 | Genentech Inc | Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration |
US20060193862A1 (en) * | 1995-03-30 | 2006-08-31 | Genentech, Inc. | Vascular endothelial cell growth factor antagonists |
US7153508B2 (en) * | 1995-06-07 | 2006-12-26 | Biogen Idec Inc. | Treatment of B cell lymphoma using anti-CD80 antibodies that do not inhibit the binding of CD80 to CTLA-4 |
US6113898A (en) * | 1995-06-07 | 2000-09-05 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies |
US7175847B1 (en) * | 1995-06-07 | 2007-02-13 | Biogen Idec Inc. | Treating intestinal inflammation with anti-CD80 antibodies that do not inhibit CD80 binding to CTLA-4 |
US7150992B1 (en) | 1995-10-04 | 2006-12-19 | Innunex Corporation | Methods of preparing dendritic cells with flt3-ligand and antigen |
US7361330B2 (en) * | 1995-10-04 | 2008-04-22 | Immunex Corporation | Methods of using flt3-ligand in the treatment of fibrosarcoma |
US20020034517A1 (en) * | 1995-10-04 | 2002-03-21 | Kenneth Brasel | Dendritic cell stimulatory factor |
US6936439B2 (en) * | 1995-11-22 | 2005-08-30 | Amgen Inc. | OB fusion protein compositions and methods |
US20030040467A1 (en) * | 1998-06-15 | 2003-02-27 | Mary Ann Pelleymounter | Ig/ob fusions and uses thereof. |
US20030026779A1 (en) * | 1999-10-15 | 2003-02-06 | Liming Yu | Treatment of tumors and viral infections with a hybrid conjugate of interferon and an immunoglobulin Fc |
GB9526733D0 (en) * | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
EP1619250B1 (en) | 1996-01-08 | 2009-11-25 | Genentech, Inc. | OB receptor variant and ligands |
US6750334B1 (en) * | 1996-02-02 | 2004-06-15 | Repligen Corporation | CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor |
US5917026A (en) * | 1996-02-05 | 1999-06-29 | Loewenadler; Bjoern | Fusion proteins of immunopotentiating activity |
NZ503548A (en) | 1996-02-09 | 2001-09-28 | Amgen Inc | A fusion protein comprising an IL-1ra receptor antagonist with a constant domain of human immunoglobulin at the carboxy terminus |
EA002474B1 (ru) * | 1996-02-20 | 2002-06-27 | Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. | Гибридный белок, образующий гетеродимеры, способ его получения и использования |
US6194177B1 (en) * | 1996-02-20 | 2001-02-27 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | DNA encoding a hybrid heterodimeric protein |
GB9604518D0 (en) * | 1996-03-02 | 1996-05-01 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
JPH11507843A (ja) * | 1996-03-28 | 1999-07-13 | ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー | タンパク質の可溶性二価および多価ヘテロ二量体類縁体 |
US6458354B1 (en) | 1996-03-28 | 2002-10-01 | The Johns Hopkins University | Molecular complexes which modify immune responses |
US7026116B1 (en) * | 1996-04-04 | 2006-04-11 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Polymorphisms in the region of the human hemochromatosis gene |
US6140305A (en) * | 1996-04-04 | 2000-10-31 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Hereditary hemochromatosis gene products |
US7063965B2 (en) * | 1996-04-05 | 2006-06-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid encoding TIE-2 ligand |
US6060054A (en) * | 1996-04-10 | 2000-05-09 | National Jewish Medical And Research Center | Product for T lymphocyte immunosuppression |
US6117977A (en) * | 1996-04-24 | 2000-09-12 | Genentech, Inc. | Type C lectins |
US6451308B1 (en) * | 1996-04-26 | 2002-09-17 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Antagonists of interleukin-15 |
WO1997041232A1 (en) * | 1996-04-26 | 1997-11-06 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Antagonists of interleukin-15 |
DE69733773T2 (de) | 1996-05-02 | 2006-04-20 | Mochida Pharmaceutical Co. Ltd. | Fas ANTIGEN-DERIVATE |
US6100071A (en) | 1996-05-07 | 2000-08-08 | Genentech, Inc. | Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production |
US6849399B1 (en) | 1996-05-23 | 2005-02-01 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for diagnosis and treatment of iron misregulation diseases |
TW555765B (en) * | 1996-07-09 | 2003-10-01 | Amgen Inc | Low molecular weight soluble tumor necrosis factor type-I and type-II proteins |
NZ333325A (en) * | 1996-07-12 | 2000-06-23 | Genentech Inc | Recombinant chimeric heteromultimer adhesins comprising extracellular domains of ErbB receptors |
AU727606B2 (en) * | 1996-07-12 | 2000-12-14 | Genentech Inc. | Gamma-heregulin |
US5851984A (en) * | 1996-08-16 | 1998-12-22 | Genentech, Inc. | Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides |
US6159462A (en) * | 1996-08-16 | 2000-12-12 | Genentech, Inc. | Uses of Wnt polypeptides |
EP2002846B1 (en) | 1996-12-06 | 2017-01-25 | Amgen Inc. | Combination therapy using an IL-1 inhibitor for treating IL-1 mediated diseases |
DE69724451T2 (de) | 1996-12-06 | 2004-03-18 | Amgen Inc., Thousand Oaks | Kombinationtherapie mit einem tnf-bindendem protein zür behandlung von durch tnf verursachten erkrangungen |
AU737910B2 (en) * | 1997-01-31 | 2001-09-06 | Regents Of The University Of California, The | Chimeric antibody fusion proteins for the recruitment and stimulation of an antitumor immune response |
US6268411B1 (en) | 1997-09-11 | 2001-07-31 | The Johns Hopkins University | Use of multivalent chimeric peptide-loaded, MHC/ig molecules to detect, activate or suppress antigen-specific T cell-dependent immune responses |
US7435793B2 (en) * | 1998-05-15 | 2008-10-14 | Genentech, Inc. | Peptides that induce chondrocyte redifferentiation |
US20020137890A1 (en) * | 1997-03-31 | 2002-09-26 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
DE69842225D1 (de) | 1997-04-16 | 2011-05-26 | Millennium Pharm Inc | Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper, der selektiv an ein cysteinreiches sekretiertes Protein (CRSP) bindet |
US6190909B1 (en) * | 1997-04-17 | 2001-02-20 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | TH2-specific gene |
EP0980432A1 (en) * | 1997-05-01 | 2000-02-23 | Amgen, Inc. | Chimeric opg polypeptides |
US7951917B1 (en) | 1997-05-02 | 2011-05-31 | Genentech, Inc. | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
US20030207346A1 (en) * | 1997-05-02 | 2003-11-06 | William R. Arathoon | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
AU751659B2 (en) | 1997-05-02 | 2002-08-22 | Genentech Inc. | A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
US20020062010A1 (en) * | 1997-05-02 | 2002-05-23 | Genentech, Inc. | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
ATE462717T1 (de) | 1997-06-13 | 2010-04-15 | Bio Rad Laboratories | Verfahren und zusammensetzungen für die diagnose und die behandlung von krankheiten, die mit eisenüberschuss oder eisenmangel assoziiert sind |
US20030083461A1 (en) * | 1997-06-16 | 2003-05-01 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US20040191256A1 (en) * | 1997-06-24 | 2004-09-30 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for galactosylated glycoproteins |
KR100220645B1 (ko) * | 1997-07-04 | 1999-09-15 | 구광시 | 벤젠유도체의 제조방법 |
US6187564B1 (en) | 1997-07-10 | 2001-02-13 | Beth Israel Deaconess Medical Center | DNA encoding erythropoietin multimers having modified 5′ and 3′ sequences and its use to prepare EPO therapeutics |
US6165476A (en) * | 1997-07-10 | 2000-12-26 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker |
US6242570B1 (en) | 1997-07-10 | 2001-06-05 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Production and use of recombinant protein multimers with increased biological activity |
US20030073169A1 (en) * | 1997-09-18 | 2003-04-17 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US6391311B1 (en) * | 1998-03-17 | 2002-05-21 | Genentech, Inc. | Polypeptides having homology to vascular endothelial cell growth factor and bone morphogenetic protein 1 |
WO1999020758A1 (en) * | 1997-10-21 | 1999-04-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor-like proteins tr11, tr11sv1, and tr11sv2 |
US6503184B1 (en) | 1997-10-21 | 2003-01-07 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor-like proteins TR11, TR11SV1 and TR11SV2 |
US6689607B2 (en) | 1997-10-21 | 2004-02-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor, necrosis factor receptor-like proteins TR11, TR11SV1 and TR11SV2 |
US20040136986A1 (en) * | 1997-10-31 | 2004-07-15 | Genentech, Inc. | Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms |
US6576743B1 (en) * | 1997-11-26 | 2003-06-10 | Zymogenetics, Inc. | Mammalian cytokine-like polypeptide-10 |
WO1999029732A2 (en) | 1997-12-08 | 1999-06-17 | Lexigen Pharmaceuticals Corporation | Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation |
US6207413B1 (en) * | 1998-01-22 | 2001-03-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acids encoding novel orphan cytokine receptors |
US20030105294A1 (en) * | 1998-02-25 | 2003-06-05 | Stephen Gillies | Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins |
US7198789B2 (en) * | 1998-03-17 | 2007-04-03 | Genetics Institute, Llc | Methods and compositions for modulating interleukin-21 receptor activity |
US6057128A (en) | 1998-03-17 | 2000-05-02 | Genetics Institute, Inc. | MU-1, member of the cytokine receptor family |
US7189400B2 (en) * | 1998-03-17 | 2007-03-13 | Genetics Institute, Llc | Methods of treatment with antagonists of MU-1 |
US7371836B2 (en) * | 1998-03-27 | 2008-05-13 | Genentech, Inc. | PRO526 nucleic acids |
US7723488B2 (en) * | 1998-03-27 | 2010-05-25 | Genentech, Inc. | Monoclonal antibodies to secreted and transmembrane polypeptides |
DE69931908T2 (de) * | 1998-04-15 | 2007-01-11 | Lexigen Pharmaceuticals Corp., Lexington | Steigerung der antikörper-zytokin-fusionsproteinmediierten immunantwort durch mitverabreichung mit einem angiogeneseinhibitor |
US7256039B2 (en) * | 1998-05-15 | 2007-08-14 | Genentech, Inc. | PRO4405 nucleic acids |
JP3577586B2 (ja) * | 1998-05-15 | 2004-10-13 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | Il−17相同的ポリペプチドとその治療用途 |
CA2328498A1 (en) | 1998-06-12 | 1999-12-16 | Genentech, Inc. | Monoclonal antibodies, cross-reactive antibodies and method for producing the same____________________________________ |
DE69933216T2 (de) * | 1998-06-15 | 2007-09-20 | GTC Biotherapeutics, Inc., Framingham | Erythropoietin-analog-menschliches serum-albumin fusionsprotein |
US20050181482A1 (en) * | 2004-02-12 | 2005-08-18 | Meade Harry M. | Method for the production of an erythropoietin analog-human IgG fusion proteins in transgenic mammal milk |
US20070003545A9 (en) * | 1999-06-02 | 2007-01-04 | Eaton Dan L | Interleukin-8 homologous polypeptides and therapeutic uses thereof |
US7291712B2 (en) * | 1998-06-25 | 2007-11-06 | Genentech, Inc. | Interleukin-8 homologous polypeptides and therapeutic uses thereof |
US20020099197A1 (en) * | 1998-07-21 | 2002-07-25 | Rory A.J. Curtis | Novel potassium channel molecules and uses therefor |
US20030166132A1 (en) * | 1998-08-26 | 2003-09-04 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
ES2252999T3 (es) * | 1998-08-31 | 2006-05-16 | Biogen Idec Ma Inc. | Modulacion de celulas t efectoras y de memoria con un ligando de cd2. |
AU762616B2 (en) | 1998-10-16 | 2003-07-03 | Biogen Ma Inc. | Polymer conjugates of interferon beta-1a and uses |
PL200586B1 (pl) * | 1998-10-16 | 2009-01-30 | Biogen Idec Inc | Polipeptydy zawierające mutanty interferonu-beta-1a, kodujące je cząsteczki kwasów nukleinowych, komórki gospodarza transformowane tymi cząsteczkami, sposób wytwarzania polipeptydów, zawierające je kompozycje farmaceutyczne i zastosowania polipeptydów |
US6660843B1 (en) * | 1998-10-23 | 2003-12-09 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
MEP42108A (en) | 1998-10-23 | 2011-02-10 | Kiren Amgen Inc | Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to mp1 receptor and having thrombopoietic activity |
US7488590B2 (en) * | 1998-10-23 | 2009-02-10 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
WO2000027885A1 (fr) * | 1998-11-05 | 2000-05-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Nouveau popypeptide chimerique |
CA2350771A1 (en) * | 1998-11-10 | 2000-05-18 | Human Genome Sciences, Inc. | Chemokine .beta.-7 |
US7294482B2 (en) * | 1998-11-19 | 2007-11-13 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | EGF-like nucleic acids |
US7238790B2 (en) * | 1999-01-12 | 2007-07-03 | Genentech, Inc. | PRO1313 polypeptides |
AU3224700A (en) * | 1999-02-08 | 2000-08-25 | Chiron Corporation | Fibroblast growth factor receptor-immunoglobulin fusion |
AU764382B2 (en) | 1999-03-19 | 2003-08-14 | Genentech Inc. | Treatment of LFA-1 associated disorders with increasing doses of LFA-1 antagonist |
US7011833B1 (en) * | 1999-05-06 | 2006-03-14 | Genetics Institute, Inc. | Enhancing immune responses with B7-1 or B7-2 in the absence of a crosslinking agent |
US20050079577A1 (en) * | 1999-05-14 | 2005-04-14 | Ashkenazi Avi J. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
DK1187852T3 (da) * | 1999-05-19 | 2007-11-26 | Merck Patent Gmbh | Ekspression og eksport af interferon-alpha-proteiner som Fc-fusionsproteiner |
CA2375700A1 (en) * | 1999-06-01 | 2000-12-07 | Biogen, Inc. | Polymer conjugates of hedgehog proteins and uses |
WO2000073498A1 (en) * | 1999-06-02 | 2000-12-07 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the treatment and diagnosis of immune disorders |
US6924359B1 (en) * | 1999-07-01 | 2005-08-02 | Yale University | Neovascular-targeted immunoconjugates |
CA2373735A1 (en) * | 1999-07-02 | 2001-01-11 | Genentech, Inc. | Fviia antagonists |
JP4387625B2 (ja) | 1999-07-02 | 2009-12-16 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | Her2に結合する化合物 |
US7011967B1 (en) * | 1999-07-12 | 2006-03-14 | Merck Patent Gmbh | Seripancrin |
US7067110B1 (en) | 1999-07-21 | 2006-06-27 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
SK782002A3 (en) * | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
WO2001007084A1 (en) * | 1999-07-23 | 2001-02-01 | Regents Of The University Of California | Anti-growth factor receptor avidin fusion proteins as universal vectors for drug delivery |
JP2003512303A (ja) * | 1999-08-06 | 2003-04-02 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 因子viiaのペプチドアンタゴニスト |
MXPA02001417A (es) * | 1999-08-09 | 2002-08-12 | Lexigen Pharm Corp | Complejos multiples de citosina-anticuerpo. |
PT1210428E (pt) | 1999-08-23 | 2015-07-21 | Genetics Inst Llc | Pd-1, um recetor para b7-4 e suas utilizações |
US20030166858A1 (en) * | 1999-09-16 | 2003-09-04 | Samuel Davis | TIE-2 ligands, methods of making and uses thereof |
US6323334B1 (en) * | 1999-09-24 | 2001-11-27 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid molecules encoding a 103 gene product and uses therefor |
IL149202A0 (en) * | 1999-11-05 | 2002-11-10 | Biogen Inc | Hedgehog fusion proteins and uses |
US20050202538A1 (en) * | 1999-11-12 | 2005-09-15 | Merck Patent Gmbh | Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics |
JP2003514552A (ja) | 1999-11-12 | 2003-04-22 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | 改善された性質を有するエリトロポエチンの形態 |
US7122632B2 (en) * | 1999-12-23 | 2006-10-17 | Zymogenetics, Inc. | Soluble Interleukin-20 receptor |
US6610286B2 (en) * | 1999-12-23 | 2003-08-26 | Zymogenetics, Inc. | Method for treating inflammation using soluble receptors to interleukin-20 |
US7307153B2 (en) * | 1999-12-23 | 2007-12-11 | Genentech, Inc. | Antibodies that bind PRO9912 |
US7164001B2 (en) * | 2000-01-20 | 2007-01-16 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immune related diseases |
EP1252192B1 (en) | 2000-02-11 | 2006-08-16 | MERCK PATENT GmbH | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
KR20020086540A (ko) * | 2000-02-21 | 2002-11-18 | 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이. | Il-18 저해물질의 용도 |
US7572631B2 (en) * | 2000-02-24 | 2009-08-11 | Invitrogen Corporation | Activation and expansion of T cells |
US7541184B2 (en) * | 2000-02-24 | 2009-06-02 | Invitrogen Corporation | Activation and expansion of cells |
US20060073547A1 (en) * | 2000-03-01 | 2006-04-06 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US6984519B2 (en) | 2000-03-01 | 2006-01-10 | Genetech, Inc. | Nucleic acids encoding peptides that induce chondrocyte redifferentiation |
US20060002943A1 (en) * | 2000-03-02 | 2006-01-05 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin |
US20020064820A1 (en) * | 2000-03-13 | 2002-05-30 | Jean-Michel Dayer | Apo-A-I regulation of T-cell signaling |
US7514239B2 (en) * | 2000-03-28 | 2009-04-07 | Amgen Inc. | Nucleic acid molecules encoding beta-like glycoprotein hormone polypeptides and heterodimers thereof |
JP2003530108A (ja) * | 2000-04-10 | 2003-10-14 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | クリプティック様分泌型タンパク質 |
CA2405709A1 (en) * | 2000-04-12 | 2001-10-25 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US6946134B1 (en) | 2000-04-12 | 2005-09-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US20050100991A1 (en) * | 2001-04-12 | 2005-05-12 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
AU5914201A (en) * | 2000-04-25 | 2001-11-07 | Idec Pharma Corp | Intrathecal administration of rituximab for treatment of central nervous system lymphomas |
US6756480B2 (en) | 2000-04-27 | 2004-06-29 | Amgen Inc. | Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein |
AU2001257445B2 (en) * | 2000-04-28 | 2006-11-02 | Planet Biotechnology, Inc. | Immunoadhesin for the prevention of rhinovirus infection |
US20060015969A1 (en) * | 2000-04-28 | 2006-01-19 | Planet Biotechnology, Inc. | Novel immunoadhesins for treating and prventing toxicity and pathogen-mediated diseases |
AU2001259432B2 (en) * | 2000-05-03 | 2005-04-21 | Amgen Inc. | Modified peptides, comprising an FC domain, as therapeutic agents |
US20020102232A1 (en) * | 2000-05-11 | 2002-08-01 | Chang Tse W. | Compositions and methods for induction of active autoimmunity |
BR0110779A (pt) * | 2000-05-12 | 2005-01-11 | Beth Israel Hospital | Composições e métodos para adquirir supressão imunológica |
EP1714661A3 (en) | 2000-05-19 | 2012-03-14 | The Center for Blood Research, INC. | Methods for diagnosing and treating hemostatic disorders by modulating p-selectin activity |
US20040034193A1 (en) * | 2001-06-13 | 2004-02-19 | Samy Ashkar | Biosynthetic oncolytic molecules and uses therefor |
US20050048614A1 (en) * | 2000-06-13 | 2005-03-03 | Children's Medical Center Corporation | Biosynthetic oncolytic molecules and uses therefor |
DK1325115T3 (en) * | 2000-06-26 | 2016-11-21 | Zymogenetics Inc | CYTOKINRECEPTOR ZCYTOR17 |
US20030096339A1 (en) * | 2000-06-26 | 2003-05-22 | Sprecher Cindy A. | Cytokine receptor zcytor17 |
CA2414331C (en) | 2000-06-28 | 2011-11-29 | Genetics Institute, Llc. | Pd-l2 molecules: novel pd-1 ligands and uses therefor |
RU2272644C2 (ru) * | 2000-06-29 | 2006-03-27 | Мерк Патент Гмбх | Усиление иммунной реакции, медиатором которой является слитый протеин антитело-цитокин, при помощи комбинированного лечения агентами, увеличивающими поглощение иммуноцитокина |
UA81743C2 (uk) | 2000-08-07 | 2008-02-11 | Центокор, Инк. | МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО ЛЮДИНИ, ЩО СПЕЦИФІЧНО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З ФАКТОРОМ НЕКРОЗУ ПУХЛИН АЛЬФА (ФНПα), ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЩО ЙОГО МІСТИТЬ, ТА СПОСІБ ЛІКУВАННЯ РЕВМАТОЇДНОГО АРТРИТУ |
US7288390B2 (en) | 2000-08-07 | 2007-10-30 | Centocor, Inc. | Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses |
US6902734B2 (en) | 2000-08-07 | 2005-06-07 | Centocor, Inc. | Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof |
JP5015404B2 (ja) * | 2000-08-08 | 2012-08-29 | ザイモジェネティクス, インコーポレイテッド | 可溶性zcytor11サイトカイン受容体 |
US20030215916A1 (en) * | 2000-08-18 | 2003-11-20 | Feder John N. | Novel imidazoline receptor homologs |
CA2417432C (en) | 2000-09-01 | 2010-11-02 | The Center For Blood Research, Inc. | Modified polypeptides stabilized in a desired conformation and methods for producing same |
US20020119148A1 (en) | 2000-09-01 | 2002-08-29 | Gerritsen Mary E. | ErbB4 antagonists |
JP2004525076A (ja) * | 2000-09-14 | 2004-08-19 | ベス・イスラエル・ディーコニス・メディカル・センター・インコーポレーテッド | Il−2およびil−15媒介t細胞応答の調節 |
DE60135158D1 (de) | 2000-09-26 | 2008-09-11 | Genentech Inc | Antagonisten des ige-rezeptors |
AU2001294913A1 (en) * | 2000-09-29 | 2002-04-08 | Bristol-Myers Squibb Company | Identification and cloning of a full-length human cink-related gene, mist (mast cell immunoreceptor signal transducer) |
US20030211549A1 (en) * | 2000-10-06 | 2003-11-13 | Murphy Andrew J. | Functional proteins and therapeutic and diagnostic methods for use thereof |
EP1364019A2 (en) * | 2000-11-07 | 2003-11-26 | Board of Regents, The University of Texas System | Methods and compositions relating to muscle specific sarcomeric calcineurin-binding proteins (calsarcins) |
AU2002216481B2 (en) * | 2000-12-04 | 2008-05-01 | Auckland Uniservices Limited | Immunomodulatory constructs and their uses |
EP1642910B1 (en) * | 2000-12-05 | 2012-02-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Rationally designed antibodies |
US20040253242A1 (en) * | 2000-12-05 | 2004-12-16 | Bowdish Katherine S. | Rationally designed antibodies |
US7396917B2 (en) * | 2000-12-05 | 2008-07-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Rationally designed antibodies |
EP1430121A4 (en) * | 2001-02-16 | 2004-09-22 | Bristol Myers Squibb Co | A NEW GLYCINE RECEPTOR ALPHA UNIT EXPRESSED IN THE GASTRIDGE TRACT, HGRA4, CODING POLYNUCLEOTIDES AND SPLICE VERSION THEREOF |
DK1366067T3 (da) * | 2001-03-07 | 2012-10-22 | Merck Patent Gmbh | Ekspressionsteknologi for proteiner indeholdende en hybrid isotype-antistof-enhed |
US8163289B2 (en) | 2001-03-09 | 2012-04-24 | Iterative Therapeutics, Inc. | Methods and compositions involving polymeric immunoglobulin fusion proteins |
CA2437958C (en) | 2001-03-09 | 2018-10-30 | University Of Chicago | Polymeric immunoglobulin fusion proteins that target low-affinity fc.gamma.receptors |
US6992174B2 (en) * | 2001-03-30 | 2006-01-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
CA2442066C (en) | 2001-04-02 | 2005-11-01 | Wyeth | Pd-1, a receptor for b7-4, and uses therefor |
US20060084794A1 (en) * | 2001-04-12 | 2006-04-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US7507413B2 (en) | 2001-04-12 | 2009-03-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US20050054051A1 (en) * | 2001-04-12 | 2005-03-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US20050244931A1 (en) * | 2001-04-12 | 2005-11-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
ITRE20010042A1 (it) * | 2001-04-24 | 2002-10-24 | Corghi Spa | Dispositivo sollevatore per macchine smontagomme |
US20050089932A1 (en) * | 2001-04-26 | 2005-04-28 | Avidia Research Institute | Novel proteins with targeted binding |
US7265208B2 (en) * | 2001-05-01 | 2007-09-04 | The Regents Of The University Of California | Fusion molecules and treatment of IgE-mediated allergic diseases |
BR0209177A (pt) * | 2001-05-03 | 2004-10-05 | Merck Patent Gmbh | Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo |
CA2446189C (en) | 2001-05-11 | 2011-10-18 | Amgen, Inc. | Peptides and related molecules that bind to tall-1 |
US20100056762A1 (en) | 2001-05-11 | 2010-03-04 | Old Lloyd J | Specific binding proteins and uses thereof |
JP2004537991A (ja) * | 2001-06-15 | 2004-12-24 | タノックス インコーポレーテッド | アレルギー及び喘息治療用Fcε融合タンパク質 |
US20060073141A1 (en) * | 2001-06-28 | 2006-04-06 | Domantis Limited | Compositions and methods for treating inflammatory disorders |
WO2004003019A2 (en) * | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Domantis Limited | Immunoglobin single variant antigen-binding domains and dual-specific constructs |
AU2002320352A1 (en) * | 2001-07-24 | 2003-02-17 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods for treating or preventing sclerotic disorders using cd2-binding agents |
JP2005507870A (ja) * | 2001-08-13 | 2005-03-24 | ユニバーシティ・オブ・サザン・カリフォルニア | 低毒性のインターロイキン−2突然変異体 |
US6900292B2 (en) * | 2001-08-17 | 2005-05-31 | Lee-Hwei K. Sun | Fc fusion proteins of human erythropoietin with increased biological activities |
NZ543755A (en) | 2001-08-29 | 2008-04-30 | Genentech Inc | Bv8 nucleic acids and polypeptides with mitogenic activity |
AU2002323501C1 (en) * | 2001-08-30 | 2010-04-29 | Biorexis Technology, Inc | Modified transferrin fusion proteins |
US6797493B2 (en) | 2001-10-01 | 2004-09-28 | Lee-Hwei K. Sun | Fc fusion proteins of human granulocyte colony-stimulating factor with increased biological activities |
WO2003030821A2 (en) * | 2001-10-05 | 2003-04-17 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US7138370B2 (en) | 2001-10-11 | 2006-11-21 | Amgen Inc. | Specific binding agents of human angiopoietin-2 |
US7205275B2 (en) * | 2001-10-11 | 2007-04-17 | Amgen Inc. | Methods of treatment using specific binding agents of human angiopoietin-2 |
DE60224822T2 (de) * | 2001-10-19 | 2009-01-22 | Zymogenetics, Inc., Seattle | Dimerisierter wachstumsfaktor sowie materialien und verfahren zu seiner herstellung |
WO2003040311A2 (en) * | 2001-10-25 | 2003-05-15 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Efficient inhibition of hiv-1 viral entry through a novel fusion protein including of cd4 |
US20070118934A1 (en) * | 2001-10-26 | 2007-05-24 | Planet Biotechnology, Inc. | Chimeric toxin receptor proteins and chimeric toxin receptor proteins for treatment and prevention of anthrax |
PT1454138E (pt) * | 2001-12-04 | 2012-03-28 | Merck Patent Gmbh | Imunocitoquinas com seletividade modulada |
ES2337989T3 (es) * | 2001-12-18 | 2010-05-03 | Endocube Sas | Nuevas proteinas asociadas a la muerte de la familia thap y rutas par4 relacionadas implicadas en el control de la apoptosis. |
US7858297B2 (en) * | 2001-12-18 | 2010-12-28 | Centre National De La Recherche Scientifique Cnrs | Chemokine-binding protein and methods of use |
AU2002364587A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-07-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
CA2471363C (en) * | 2001-12-21 | 2014-02-11 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
KR101271635B1 (ko) * | 2001-12-21 | 2013-06-12 | 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 | 알부민 융합 단백질 |
EP1961811B1 (en) | 2002-01-18 | 2010-08-25 | ZymoGenetics, Inc. | Cytokine ligand for the treatment of asthma and airway hyper-responsiveness |
GEP20074024B (en) | 2002-01-18 | 2007-01-10 | Biogen Idec Inc | Polyalkylene glycol comprising a radical for conjugation of biologically active compound |
US7164002B2 (en) | 2002-02-06 | 2007-01-16 | Genentech, Inc. | FVIIa antagonists |
US20030211470A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-11-13 | Olson William C. | CD4-IgG2-based salvage therapy of HIV-1 infection |
MXPA04009874A (es) * | 2002-04-10 | 2005-10-19 | Applied Research Systems | Antagonistas novedosos de proteinas mcp. |
US20040016010A1 (en) * | 2002-04-17 | 2004-01-22 | Marion Kasaian | IL-21 receptor knockout animal and methods of use thereof |
WO2003100056A1 (fr) | 2002-05-29 | 2003-12-04 | Yamasa Corporation | Nouvelle enzyme polyphosphate :amp phosphotransferase |
DE60334453D1 (de) * | 2002-05-30 | 2010-11-18 | Macrogenics Inc | Cd16a bindungsproteine und verwendung zur behandlung von immunkrankheiten |
NZ519371A (en) * | 2002-06-04 | 2004-11-26 | Auckland Uniservices Ltd | Immunomodulatory constructs and their uses |
EP1369128A1 (en) * | 2002-06-07 | 2003-12-10 | Procorde GmbH | Inhibitors of glycoprotein VI and their therapeutic use |
US20090130021A1 (en) * | 2002-06-07 | 2009-05-21 | Gotz Munch | Methods, products and uses involving platelets and/or the vasculature |
US20070071744A1 (en) * | 2002-06-07 | 2007-03-29 | Gotz Munch | Agents which bind to epitopes of glycoprotein VI |
US7531178B2 (en) * | 2002-06-07 | 2009-05-12 | Trigen Gmbh | Immunoadhesin comprising a glycoprotein VI domain |
US8029803B2 (en) | 2002-06-20 | 2011-10-04 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for eliciting an immune response |
US8025873B2 (en) * | 2002-06-20 | 2011-09-27 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for eliciting an immune response |
US20070104710A1 (en) * | 2002-06-28 | 2007-05-10 | Domants Limited | Ligand that has binding specificity for IL-4 and/or IL-13 |
AU2003280130B2 (en) | 2002-06-28 | 2009-06-11 | Centocor, Inc. | Mammalian CH1 deleted mimetibodies, compositions, methods and uses |
CN1241946C (zh) * | 2002-07-01 | 2006-02-15 | 美国福源集团 | 对多种细胞具刺激增生作用的人血清白蛋白重组融合蛋白 |
JP5068931B2 (ja) * | 2002-07-12 | 2012-11-07 | ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー | 独自のクローン形質のリンパ球受容体に結合する試薬および方法 |
WO2004007682A2 (en) * | 2002-07-15 | 2004-01-22 | Wyeth | Methods and compositions for modulating t helper (th) cell development and function |
US20040110681A1 (en) * | 2002-08-08 | 2004-06-10 | Xiao-Min Fan | Method to identify targeting molecules |
US20040136992A1 (en) | 2002-08-28 | 2004-07-15 | Burton Paul B. J. | Compositions and method for treating cardiovascular disease |
DE10251463A1 (de) * | 2002-11-05 | 2004-05-19 | BSH Bosch und Siemens Hausgeräte GmbH | Elektrisch angetriebene Pumpe |
US20050054054A1 (en) * | 2002-11-12 | 2005-03-10 | Foss Francine M. | Interleukin-7 molecules with altered biological properties |
CA2510180C (en) * | 2002-12-17 | 2012-09-11 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Humanized antibody (h14.18) of the mouse 14.18 antibody binding to gd2 and its fusion with il-2 |
JP2006523090A (ja) * | 2002-12-27 | 2006-10-12 | ドマンティス リミテッド | リガンドに、そしてリガンド受容体に特異的な二重特異性単一ドメイン抗体 |
GB0230203D0 (en) * | 2002-12-27 | 2003-02-05 | Domantis Ltd | Fc fusion |
US20110223168A1 (en) * | 2002-12-27 | 2011-09-15 | Greg Winter | Ligand that has binding specificity for il-4 and/or il-13 |
EP1596804A4 (en) * | 2003-01-13 | 2008-02-06 | Macrogenics Inc | SOLUBLE FCyR FUSION PROTEINS AND METHODS OF USE |
CA2513213C (en) | 2003-01-22 | 2013-07-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US20060234340A1 (en) * | 2003-02-06 | 2006-10-19 | Novozymes A/S | Human heavy chain antibody expression in flamentous fungi |
US20050096264A1 (en) * | 2003-02-25 | 2005-05-05 | Macdonald Lynn | Methods for treating obesity and related conditions with glycoprotein hormone beta family hormones |
EP1615659B1 (en) | 2003-03-12 | 2014-04-16 | Genentech, Inc. | Use of bv8 and/or eg-vegf to promote hematopoiesis |
US20050142139A1 (en) * | 2003-03-21 | 2005-06-30 | Norbert Schulke | CD4-IgG2 formulations |
EA009026B1 (ru) * | 2003-03-24 | 2007-10-26 | Займоджинетикс, Инк. | Антитела против il-22ra, их партнеры по связыванию и способы их применения при воспалениях |
SI1606318T1 (sl) * | 2003-03-26 | 2009-12-31 | Apogenix Gmbh | Izboljšani Fc fuzijski proteini |
TWI353991B (en) * | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
CA2522690A1 (en) * | 2003-05-06 | 2004-11-25 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | Inhibition of drug binding to serum albumin |
DK2298347T3 (en) | 2003-05-06 | 2016-01-11 | Biogen Hemophilia Inc | COAGULATION FACTOR CHEMICAL PROTEINS FOR TREATING A HEMOSTATIC DISORDER |
US7348004B2 (en) | 2003-05-06 | 2008-03-25 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
EP2286804A1 (en) | 2003-05-13 | 2011-02-23 | DePuy Spine, Inc. | A method of treating degenerative disc disease |
US7344716B2 (en) * | 2003-05-13 | 2008-03-18 | Depuy Spine, Inc. | Transdiscal administration of specific inhibitors of pro-inflammatory cytokines |
DK1622939T3 (da) * | 2003-05-13 | 2012-04-10 | Merck Serono Sa | Aktive varianter af det IL-18-bindende protein og medicinske anvendelser deraf |
US20040229878A1 (en) * | 2003-05-13 | 2004-11-18 | Depuy Spine, Inc. | Transdiscal administration of specific inhibitors of P38 kinase |
US7553827B2 (en) * | 2003-08-13 | 2009-06-30 | Depuy Spine, Inc. | Transdiscal administration of cycline compounds |
US8273347B2 (en) | 2003-05-13 | 2012-09-25 | Depuy Spine, Inc. | Autologous treatment of degenerated disc with cells |
US7429378B2 (en) * | 2003-05-13 | 2008-09-30 | Depuy Spine, Inc. | Transdiscal administration of high affinity anti-MMP inhibitors |
US7435808B2 (en) * | 2003-06-25 | 2008-10-14 | Bristol-Myers Squibb Company | Polynucleotides encoding novel adiponectin receptor variant, AdipoR2v2 |
PL1639011T3 (pl) * | 2003-06-30 | 2009-05-29 | Domantis Ltd | Pegilowane przeciwciała jednodomenowe (dAb) |
WO2005007121A2 (en) | 2003-07-18 | 2005-01-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Mutant interleukin-2(il-2) polypeptides |
US8361467B2 (en) * | 2003-07-30 | 2013-01-29 | Depuy Spine, Inc. | Trans-capsular administration of high specificity cytokine inhibitors into orthopedic joints |
US8007805B2 (en) * | 2003-08-08 | 2011-08-30 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens |
EP2520654B8 (en) | 2003-08-26 | 2017-04-19 | The Regents of the University of Colorado, a body corporate | Inhibitors of serine protease activity and their use in methods and compositions for treatment of bacterial infections |
US20050069521A1 (en) * | 2003-08-28 | 2005-03-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins |
UA89481C2 (uk) * | 2003-09-30 | 2010-02-10 | Центокор, Инк. | Еритропоетинові міметичні шарнірно-серцевинні міметитіла людини, композиції, способи та застосування |
US20070274988A1 (en) * | 2003-10-10 | 2007-11-29 | Five Prime Therapeautics, Inc. | Kiaa0779, Splice Variants Thereof, and Methods of Their Use |
WO2005037999A2 (en) * | 2003-10-14 | 2005-04-28 | Biogen Idec Ma Inc. | Treatment of cancer using antibodies to lrrc15 |
US8129506B2 (en) * | 2003-10-24 | 2012-03-06 | Genzyme Corporation | Modulation of the interaction of MUC1 with MUC1 ligands |
EP1697415A1 (en) | 2003-11-12 | 2006-09-06 | Biogen Idec MA Inc. | NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO |
BRPI0406605B8 (pt) * | 2003-11-13 | 2021-05-25 | Hanmi Holdings Co Ltd | conjugado de proteína, método para a preparação do mesmo e composição farmacêutica para intensificar a duração e estabilidade in vivo de um polipeptídeo fisiologicamente ativo |
US8110665B2 (en) | 2003-11-13 | 2012-02-07 | Hanmi Holdings Co., Ltd. | Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier |
US8895540B2 (en) | 2003-11-26 | 2014-11-25 | DePuy Synthes Products, LLC | Local intraosseous administration of bone forming agents and anti-resorptive agents, and devices therefor |
EP1699822B1 (en) | 2003-12-30 | 2008-04-23 | MERCK PATENT GmbH | Il-7 fusion proteins with antibody portions, their preparation and their use |
ES2387028T3 (es) * | 2003-12-31 | 2012-09-12 | Merck Patent Gmbh | Proteína de fusión de Fc-eritropoyetina con farmacocinética mejorada |
PL1706428T3 (pl) | 2004-01-22 | 2010-02-26 | Merck Patent Gmbh | Przeciwciała przeciwnowotworowe o zredukowanym wiązaniu dopełniacza |
MXPA06008918A (es) * | 2004-02-06 | 2007-03-07 | Astellas Llc | Metodos de tratamiento de trastornos de la piel. |
NZ549040A (en) | 2004-02-17 | 2009-07-31 | Schering Corp | Use for interleukin-33 (IL33) and the IL-33 receptor complex |
US20100028995A1 (en) * | 2004-02-23 | 2010-02-04 | Anaphore, Inc. | Tetranectin Trimerizing Polypeptides |
CA2563379A1 (en) * | 2004-03-31 | 2005-10-20 | Centocor, Inc. | Human glp-1 mimetibodies, compositions, methods and uses |
US20080020383A1 (en) * | 2004-05-04 | 2008-01-24 | Genaissance Pharmaceuticals, Inc. | Haplotype Markers And Methods Of Using The Same To Determine Response To Treatment |
EP1750747A1 (en) * | 2004-05-07 | 2007-02-14 | Astellas US LLC | Soluble lfa-3 polypeptide for treating viral disorders |
US20060063208A1 (en) * | 2004-08-02 | 2006-03-23 | Woolf Clifford J | DRG11-responsive (DRAGON) gene and uses thereof |
US7393662B2 (en) | 2004-09-03 | 2008-07-01 | Centocor, Inc. | Human EPO mimetic hinge core mimetibodies, compositions, methods and uses |
PL1804835T3 (pl) * | 2004-09-13 | 2010-11-30 | Genzyme Corp | Konstrukty multimeryczne |
EP1797127B1 (en) | 2004-09-24 | 2017-06-14 | Amgen Inc. | Modified fc molecules |
EP1802334B1 (en) | 2004-10-21 | 2012-08-29 | Genentech, Inc. | Method for treating intraocular neovascular diseases |
MX2007004770A (es) | 2004-10-22 | 2007-11-22 | Zymogenetics Inc | Anticuerpos anti-il-22ra y moleculas y metodos para usarlos en inflamacion. |
US20090311259A1 (en) * | 2004-11-17 | 2009-12-17 | Victoria Smith | Compositions and Methods for Treatment of Tumor of Hematopoietic Origin |
CN101072793B (zh) * | 2004-12-09 | 2012-06-20 | 默克专利有限公司 | 具有降低的免疫原性的il-7变体 |
CN100515491C (zh) * | 2005-01-04 | 2009-07-22 | 健能隆医药技术(上海)有限公司 | 白介素-22的医药用途 |
ES2408704T3 (es) | 2005-01-05 | 2013-06-21 | Biogen Idec Ma Inc. | Moléculas de unión a Cripto |
WO2006081190A2 (en) | 2005-01-25 | 2006-08-03 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating cardiac conditions |
US20090155267A1 (en) * | 2005-02-09 | 2009-06-18 | Apollo Life Sciences Limited | Molecule and chimeric molecules thereof |
KR100754667B1 (ko) | 2005-04-08 | 2007-09-03 | 한미약품 주식회사 | 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Fc 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물 |
CA2605024C (en) * | 2005-04-15 | 2018-05-22 | Macrogenics, Inc. | Covalent diabodies and uses thereof |
US9963510B2 (en) * | 2005-04-15 | 2018-05-08 | Macrogenics, Inc. | Covalent diabodies and uses thereof |
US11254748B2 (en) | 2005-04-15 | 2022-02-22 | Macrogenics, Inc. | Covalent diabodies and uses thereof |
US9284375B2 (en) * | 2005-04-15 | 2016-03-15 | Macrogenics, Inc. | Covalent diabodies and uses thereof |
PE20061324A1 (es) | 2005-04-29 | 2007-01-15 | Centocor Inc | Anticuerpos anti-il-6, composiciones, metodos y usos |
CN101198624B (zh) | 2005-05-06 | 2012-10-10 | 津莫吉尼蒂克斯公司 | Il-31单克隆抗体及使用方法 |
EP2388274A1 (en) * | 2005-06-17 | 2011-11-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Methods of purifying anti A Beta antibodies |
TR201902033T4 (tr) | 2005-06-30 | 2019-03-21 | Janssen Biotech Inc | Anti-IL-23 antikorları, bileşimleri, yöntemleri ve kullanımları. |
EP2238986A3 (en) | 2005-07-08 | 2010-11-03 | Biogen Idec MA Inc. | Sp35 antibodies and uses thereof |
US8008453B2 (en) | 2005-08-12 | 2011-08-30 | Amgen Inc. | Modified Fc molecules |
EP1926747A1 (en) * | 2005-08-12 | 2008-06-04 | Schering Corporation | Mcp1 fusions |
CA2616479A1 (en) | 2005-09-01 | 2007-03-08 | Ares Trading S.A. | Treatment of optic neuritis |
US20070104689A1 (en) * | 2005-09-27 | 2007-05-10 | Merck Patent Gmbh | Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens |
US20090238822A1 (en) * | 2005-10-13 | 2009-09-24 | Virexx Medical Corp. | Chimeric Hepatitis C Virus Antigens For Eliciting an Immune Response |
TW200722436A (en) * | 2005-10-21 | 2007-06-16 | Hoffmann La Roche | A peptide-immunoglobulin-conjugate |
CA2628928A1 (en) * | 2005-11-10 | 2007-05-24 | Receptor Biologix, Inc. | Hepatocyte growth factor intron fusion proteins |
ES2433251T5 (es) | 2005-11-14 | 2020-03-13 | Teva Pharmaceuticals Int Gmbh | Anticuerpos antagonistas dirigidos contra un péptido relacionado con el gen de la calcitonina y procedimientos que utilizan los mismos |
EP1957536A2 (en) * | 2005-12-01 | 2008-08-20 | Domantis Limited | Noncompetitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1 |
US20070136826A1 (en) * | 2005-12-02 | 2007-06-14 | Biogen Idec Inc. | Anti-mouse CD20 antibodies and uses thereof |
US20070161546A1 (en) * | 2005-12-15 | 2007-07-12 | Colm King | Methods and compositions for treatment of cancer |
JP2009521503A (ja) * | 2005-12-22 | 2009-06-04 | ディー・エイチ・ワイ・アンド・カンパニー・リミテッド | インターロイキン−22結合タンパク質に対する抗体と、代謝性疾患の処置のためのその使用 |
MX2008008621A (es) | 2005-12-29 | 2008-11-27 | Centocor Inc | Anticuerpos anti-il-23 humanos, composiciones, metodos y usos. |
ATE555125T1 (de) * | 2005-12-30 | 2012-05-15 | Merck Patent Gmbh | Interleukin-12p40-varianten mit verbesserter stabilität |
EA016429B1 (ru) | 2005-12-30 | 2012-04-30 | Мерк Патент Гмбх | Антитела против cd19 с пониженной иммуногенностью |
EP1991581A2 (en) * | 2006-01-10 | 2008-11-19 | Zymogenetics, Inc. | Methods of treating pain and inflammation in neuronal tissue using il-31 antagonists |
US7625564B2 (en) | 2006-01-27 | 2009-12-01 | Novagen Holding Corporation | Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo |
AR059193A1 (es) | 2006-01-31 | 2008-03-12 | Bayer Schering Pharma Ag | Modulacion de la actividad de mdl-1 para el tratamiento de enfermedades inflamatorias |
GB0604187D0 (en) * | 2006-03-02 | 2006-04-12 | Fusion Antibodies Ltd | Peptide and uses thereof |
EP2007538A4 (en) * | 2006-03-31 | 2011-04-20 | Centocor Ortho Biotech Inc | BINDING PARTNER WITH MODIFIED IMMUNOGLOBULINDOMAS FOR EXTENDED SEMI-VALUE TIME |
WO2007135172A2 (en) | 2006-05-24 | 2007-11-29 | Laboratoires Serono S.A. | Cladribine regimen for treating multiple sclerosis |
AU2007257683A1 (en) * | 2006-06-12 | 2007-12-21 | Symphogen A/S | Pan-cell surface receptor- specific therapeutics |
WO2007149586A2 (en) * | 2006-06-22 | 2007-12-27 | Vaccinex, Inc. | Anti-c35 antibodies for treating cancer |
WO2008036449A2 (en) * | 2006-06-29 | 2008-03-27 | The Regents Of The University Of California | Chemical antibodies for immunotherapy and imaging |
US8637469B2 (en) | 2006-07-11 | 2014-01-28 | Roy C. Levitt | Rhinosinusitis prevention and therapy with proinflammatory cytokine inhibitors |
US20080014285A1 (en) * | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Di Mauro Thomas M | Method of treating neurodegenerative brain disease with a composite comprising superparamagnetic nanoparticles and a therapeutic compound |
DK2068889T3 (da) | 2006-08-10 | 2020-02-03 | Roy C Levitt | Anakinra til anvendelse i behandling af bronchiolitis obliterans syndrom |
WO2008020079A1 (en) | 2006-08-18 | 2008-02-21 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of deseases and disorders associated with il-6-mediated signalling |
US7833527B2 (en) * | 2006-10-02 | 2010-11-16 | Amgen Inc. | Methods of treating psoriasis using IL-17 Receptor A antibodies |
EP2067041A2 (en) | 2006-10-03 | 2009-06-10 | Biogen Idec MA, Inc. | Biomarkers and assays for the treatment of cancer |
JP5519287B2 (ja) | 2006-11-02 | 2014-06-11 | ダニエル・ジェイ・カポン | 可動部を備えたハイブリッド免疫グロブリン |
PE20081250A1 (es) * | 2006-11-28 | 2008-10-07 | Centelion | FUSIONES Fc CON RECEPTOR PARA FGF SOLUBLE MODIFICADAS, CON ACTIVIDAD BIOLOGICA MEJORADA |
CN103408661B (zh) | 2007-01-05 | 2016-04-06 | 苏黎世大学 | 提供疾患特异性结合分子和靶的方法 |
AU2008205244B2 (en) | 2007-01-09 | 2013-02-07 | Biogen Ma Inc. | Sp35 antibodies and uses thereof |
CA2678493A1 (en) | 2007-02-23 | 2008-08-28 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods to activate or block the hla-e/qa-1 restricted cd8+ t cell regulatory pathway to treat immunological disease |
US20100028951A1 (en) * | 2007-03-07 | 2010-02-04 | Stephen Hamilton | Production of glycoproteins with modified fucosylation |
CA2690825C (en) | 2007-05-11 | 2019-02-12 | Altor Bioscience Corporation | Fusion molecules and il-15 variants |
US7906149B2 (en) * | 2007-05-25 | 2011-03-15 | Boval Company, L.P. | Method for treating allergic dermatitis |
ES2456963T3 (es) * | 2007-06-04 | 2014-04-24 | Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences | Agentes para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y métodos para usar los mismos |
MX2009012968A (es) * | 2007-06-06 | 2010-04-01 | Domantis Ltd | Polipeptidos, dominios variables de anticuerpo y antagonistas. |
WO2009151717A2 (en) | 2008-04-02 | 2009-12-17 | Macrogenics, Inc. | Bcr-complex-specific antibodies and methods of using same |
US8067548B2 (en) * | 2007-07-26 | 2011-11-29 | Novagen Holding Corporation | Fusion proteins having mutated immunoglobulin hinge region |
GB0717337D0 (en) * | 2007-09-06 | 2007-10-17 | Ucb Pharma Sa | Method of treatment |
JP2011500005A (ja) | 2007-10-11 | 2011-01-06 | ユニバーシティー ヘルス ネットワーク | ヒト造血幹細胞の生着を増加させるためのSIRPα−CD47相互作用の調節およびそのための化合物 |
BRPI0818033A2 (pt) * | 2007-10-16 | 2015-03-24 | Symphogen As | Composições compreendendo multímeros otimizados de her1 e her3 e métodos para usos dos mesmos |
EP2612868B1 (en) * | 2007-11-01 | 2018-08-15 | Astellas Pharma Inc. | Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids |
WO2009061853A2 (en) * | 2007-11-05 | 2009-05-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Mutant interleukin-2 (il-2) polypeptides |
EP2217261B1 (en) | 2007-11-09 | 2015-10-07 | Genentech, Inc. | Activin receptor-like kinase-1 antagonist compositions and methods of use |
EP2222707B1 (en) | 2007-11-21 | 2016-01-06 | Oregon Health & Science University | Anti-factor xi monoclonal antibodies and methods of use thereof |
WO2009090493A2 (en) * | 2007-12-06 | 2009-07-23 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | Tlr4 decoy receptor protein |
EP2796466B1 (en) | 2007-12-07 | 2017-11-22 | ZymoGenetics, Inc. | Humanized antibody molecules specific for IL-31 |
US8986696B2 (en) * | 2007-12-21 | 2015-03-24 | Depuy Mitek, Inc. | Trans-capsular administration of p38 map kinase inhibitors into orthopedic joints |
US20090162351A1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-06-25 | Depuy Spine, Inc. | Transdiscal administration of inhibitors of p38 MAP kinase |
NZ587292A (en) | 2008-03-04 | 2012-09-28 | Pfizer Ltd | Use of anti-CGRP (calcitonin gene-related peptide) antagonists to treat chronic pain |
WO2009133208A1 (en) * | 2008-05-02 | 2009-11-05 | Novartis Ag | Improved fibronectin-based binding molecules and uses thereof |
RU2553517C2 (ru) | 2008-05-06 | 2015-06-20 | Дженентек, Инк. | Варианты crig с созревшей аффинностью |
ES2675730T3 (es) * | 2008-06-04 | 2018-07-12 | Macrogenics, Inc. | Anticuerpos con unión alterada a FcRn y métodos de uso de los mismos |
AU2009269099B2 (en) | 2008-07-09 | 2016-03-10 | Biogen Ma Inc. | Compositions comprising antibodies to LINGO or fragments thereof |
AR072596A1 (es) | 2008-07-23 | 2010-09-08 | Hanmi Pharmaceutical Co Ltd | Un complejo proteico que comprende una proteina dimerica y un polimero no peptidico |
US20100159485A1 (en) * | 2008-12-19 | 2010-06-24 | Centre For Dna Fingerprinting And Diagnostics | Detection of mycobacterium tuberculosis |
PL2949666T3 (pl) | 2008-12-19 | 2019-07-31 | Biogen International Neuroscience Gmbh | Ludzkie przeciwciała przeciwko alfa-synukleinie |
CN102341411A (zh) | 2008-12-31 | 2012-02-01 | 比奥根艾迪克Ma公司 | 抗-淋巴细胞毒素抗体 |
EP2411412B1 (en) | 2009-03-24 | 2015-05-27 | Teva Biopharmaceuticals USA, Inc. | Humanized antibodies against light and uses thereof |
KR101766927B1 (ko) | 2009-04-01 | 2017-08-09 | 제넨테크, 인크. | 인슐린 저항성 장애의 치료 |
US10618964B2 (en) | 2009-04-10 | 2020-04-14 | Ablynx N.V. | Nanobody against IL-6R |
US8748581B2 (en) | 2009-04-10 | 2014-06-10 | Ablynx N.V. | Anti-IL-6R polypeptides and pharmaceutical compositions thereof |
CA2759333A1 (en) | 2009-04-22 | 2010-10-28 | Merck Patent Gmbh | Antibody fusion proteins with modified fcrn binding sites |
KR101183262B1 (ko) | 2009-04-22 | 2012-09-14 | (주)알테오젠 | 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 단백질 또는 펩티드 융합체, 및 이를 이용하여 체내 반감기를 증가시키는 방법 |
MX2011011718A (es) | 2009-05-08 | 2012-01-27 | Vaccinex Inc | Anticuerpos anti-cd100 y metodos para su uso. |
EP2429574B1 (en) | 2009-05-15 | 2015-05-06 | University Health Network | Compositions and methods for treating hematologic cancers targeting the sirp - cd47 interaction |
US8685398B2 (en) | 2009-06-15 | 2014-04-01 | Biokine Therapeutics Ltd. | Chemokine binding polypeptides capable of inhibiting the course of autoimmunity, inflammation and cancer |
US20110039300A1 (en) | 2009-08-10 | 2011-02-17 | Robert Bayer | Antibodies with enhanced adcc functions |
US20110053223A1 (en) | 2009-08-14 | 2011-03-03 | Robert Bayer | Cell culture methods to make antibodies with enhanced adcc function |
WO2011024113A1 (en) | 2009-08-28 | 2011-03-03 | Rinat Neuroscience Corporation | Methods for treating visceral pain by administering antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide |
WO2011044368A1 (en) | 2009-10-07 | 2011-04-14 | Macrogenics, Inc. | Fc region-containing polypeptides that exhibit improved effector function due to alterations of the extent of fucosylation, and methods for their use |
TW201117824A (en) | 2009-10-12 | 2011-06-01 | Amgen Inc | Use of IL-17 receptor a antigen binding proteins |
WO2011056502A1 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Genentech, Inc. | Bone morphogenetic protein receptor type ii compositions and methods of use |
WO2011056494A1 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Genentech, Inc. | Activin receptor-like kinase-1 antagonist and vegfr3 antagonist combinations |
WO2011056497A1 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Genentech, Inc. | Activin receptor type iib compositions and methods of use |
US20110165122A1 (en) * | 2009-11-10 | 2011-07-07 | The Regents Of The University Of California | Method for targeted and sustained antiviral therapy |
WO2011071957A1 (en) | 2009-12-07 | 2011-06-16 | Sea Lane Biotechnologies, Llc | Conjugates comprising an antibody surrogate scaffold with improved pharmacokinetic properties |
US20130052195A1 (en) | 2009-12-23 | 2013-02-28 | Emergent Product Development Seattle,LLC | Compositions Comprising TNF-alpha and IL-6 Antagonists and Methods of Use Thereof |
US8637637B2 (en) | 2010-01-12 | 2014-01-28 | Bill Nai-Chau Sun | Fc fusion proteins of human growth hormone |
MY182680A (en) | 2010-01-15 | 2021-01-29 | Amgen K A Inc | Antibody formulation and therapeutic regimens |
EP2536435B1 (en) | 2010-02-18 | 2017-11-15 | Janssen Biotech, Inc. | Monkey homolog of human interferon omega |
US8802091B2 (en) | 2010-03-04 | 2014-08-12 | Macrogenics, Inc. | Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof |
CA2791658C (en) | 2010-03-04 | 2019-10-01 | Macrogenics, Inc. | Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof |
WO2011109280A1 (en) | 2010-03-05 | 2011-09-09 | Lerner Research Institute | Methods and compositions to treat immune-mediated disorders |
US20150231215A1 (en) | 2012-06-22 | 2015-08-20 | Randolph J. Noelle | VISTA Antagonist and Methods of Use |
EP2552947A4 (en) | 2010-03-26 | 2013-11-13 | Dartmouth College | VISTA REGULATORY T CELL MEDIATOR PROTEIN, VISTA BINDING ACTIVE SUBSTANCES AND USE THEREOF |
US10745467B2 (en) | 2010-03-26 | 2020-08-18 | The Trustees Of Dartmouth College | VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders |
US20110243943A1 (en) * | 2010-04-02 | 2011-10-06 | Athena Discovery, Inc. | Treatment using relaxin-fusion proteins with extended in vivo half-lives |
JP5908888B2 (ja) | 2010-04-16 | 2016-04-26 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | 改変された植物のシステインプロテアーゼ及びその使用 |
US8524217B2 (en) | 2010-05-11 | 2013-09-03 | Merck Sharp & Dohme Corp. | MCP1-Ig fusion variants |
AU2011268146A1 (en) | 2010-06-17 | 2013-01-10 | Actogenix Nv | Compositions and methods for treating inflammatory conditions |
EP3508573A1 (en) | 2010-07-09 | 2019-07-10 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Systems for factor viii processing and methods thereof |
JP5964300B2 (ja) | 2010-08-02 | 2016-08-03 | マクロジェニクス,インコーポレーテッド | 共有結合型ダイアボディおよびその使用 |
EP2601214B1 (en) | 2010-08-06 | 2017-11-01 | Genzyme Corporation | Vegf antagonist compositions and uses thereof |
EP2611832B1 (en) | 2010-09-02 | 2017-11-29 | Vaccinex, Inc. | Anti-cxcl13 antibodies and methods of using the same |
US11053299B2 (en) | 2010-09-21 | 2021-07-06 | Immunity Bio, Inc. | Superkine |
KR20140020228A (ko) | 2010-09-21 | 2014-02-18 | 알토 바이오사이언스 코포레이션 | 다량체성 아이엘 15 용해성 융합 분자 및 그의 제조 및 사용 방법 |
EP2621950A4 (en) | 2010-09-27 | 2015-09-02 | Janssen Biotech Inc | ANTIBODIES FOR BINDING HUMAN COLLAGEN II |
SI2627672T1 (sl) | 2010-10-11 | 2018-10-30 | Biogen International Neuroscience Gmbh | Človeška protitelesa anti-tau |
KR101333958B1 (ko) * | 2010-10-20 | 2013-11-27 | 주식회사 한독 | 인간 인터루킨-1 수용체 길항제-하이브리드 Fc 융합단백질 |
AR083546A1 (es) | 2010-10-25 | 2013-03-06 | Genentech Inc | Tratamiento de inflamacion gastrointestinal, soriasis y asma |
EP2638068B1 (en) | 2010-11-08 | 2018-12-26 | Novartis AG | Cxcr2 binding polypeptides |
CN103380145B (zh) | 2010-12-17 | 2016-10-12 | 生物控股有限公司 | 人类抗-sod1抗体 |
AR086515A1 (es) | 2011-05-20 | 2013-12-18 | Alderbio Holdings Llc | Uso de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-cgrp o anti-cgrp-r para tratar o prevenir las formas cronicas y agudas de la diarrea |
CN107827982B (zh) | 2011-05-20 | 2021-07-06 | H.伦德贝克公司 | 抗cgrp抗体和抗体片段用于在有需要的受试者中预防或抑制畏光或厌光的用途 |
SI3495392T1 (sl) | 2011-05-20 | 2021-11-30 | H. Lundbeck A/S | Sestavki proti CGRP in uporaba le-teh |
JP6145088B2 (ja) | 2011-05-21 | 2017-06-07 | マクロジェニクス,インコーポレーテッド | 脱免疫化血清結合ドメイン及び血清半減期を延長するためのその使用 |
AU2012260601B2 (en) | 2011-05-25 | 2018-02-01 | Innate Pharma, S.A. | Anti-KIR antibodies for the treatment of inflammatory disorders |
SI2723379T1 (sl) | 2011-06-23 | 2019-03-29 | Biogen International Neuroscience Gmbh | Molekule, ki se vežejo ma anti alfa-sinuklein |
EP2723370A4 (en) | 2011-06-24 | 2015-06-03 | Univ Colorado Regents | COMPOSITIONS, PROCESS AND USE OF ALPHA-1-ANTITRYPHIN FUSION MOLECULES |
CA2840944A1 (en) * | 2011-07-08 | 2013-01-17 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Fusion proteins releasing relaxin and uses thereof |
US9738707B2 (en) | 2011-07-15 | 2017-08-22 | Biogen Ma Inc. | Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto |
US20140234330A1 (en) | 2011-07-22 | 2014-08-21 | Amgen Inc. | Il-17 receptor a is required for il-17c biology |
EP2747782B1 (en) * | 2011-09-23 | 2018-01-17 | Ablynx NV | Prolonged inhibition of interleukin-6 mediated signaling |
US11951157B2 (en) | 2011-10-11 | 2024-04-09 | Universitat Zurich | Methods of treating malignant tumour with IL-12 and anti-PD-1 antibody |
PL3351261T3 (pl) * | 2011-10-11 | 2021-12-06 | Universität Zürich | Lek złożony zawierający IL-12 i środek do blokowania cząsteczek hamujących komórki T w terapii nowotworów |
US8846034B2 (en) | 2011-10-24 | 2014-09-30 | Halozyme, Inc. | Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof |
KR102348985B1 (ko) | 2012-01-10 | 2022-01-12 | 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코포레이트 | 알파-1 안티트립신 융합 분자용 조성물, 방법 및 용도 |
US9890213B2 (en) | 2012-03-02 | 2018-02-13 | Vaccinex, Inc. | Methods for the treatment of B cell-mediated inflammatory diseases |
MX349035B (es) | 2012-05-17 | 2017-07-07 | Extend Biosciences Inc | Portadores para el suministro mejorado de farmaco. |
EP2852610B1 (en) | 2012-05-23 | 2018-07-11 | Glykos Finland Oy | Production of fucosylated glycoproteins |
AU2013277051B2 (en) | 2012-06-22 | 2018-06-07 | King's College London | Novel VISTA-Ig constructs and the use of VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders |
US9890215B2 (en) | 2012-06-22 | 2018-02-13 | King's College London | Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer |
CA2878404A1 (en) | 2012-07-10 | 2014-01-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Biomaterials for enhanced implant-host integration |
EP2879710B1 (en) | 2012-08-03 | 2019-11-13 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Medical uses of agents that modulate immune cell activation and corresponding screening methods |
MY181648A (en) | 2012-08-24 | 2020-12-30 | Univ California | Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis |
AU2013312211B2 (en) | 2012-09-07 | 2018-03-29 | King's College London | VISTA modulators for diagnosis and treatment of cancer |
US9278124B2 (en) | 2012-10-16 | 2016-03-08 | Halozyme, Inc. | Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods |
WO2014094122A1 (en) | 2012-12-17 | 2014-06-26 | Trillium Therapeutics Inc. | Treatment of cd47+ disease cells with sirp alpha-fc fusions |
PT2935326T (pt) | 2012-12-21 | 2020-09-14 | Biogen Ma Inc | Anticorpos anti-tau humanos |
US9771413B2 (en) | 2012-12-31 | 2017-09-26 | Neurimmune Holding Ag | Recombinant human antibodies for therapy and prevention of polyomavirus-related diseases |
US9487587B2 (en) | 2013-03-05 | 2016-11-08 | Macrogenics, Inc. | Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells of a companion animal that express an activating receptor and cells that express B7-H3 and uses thereof |
AU2013205589A1 (en) | 2013-03-08 | 2014-09-25 | Vaccinex, Inc. | Anti-CXCL13 antibodies and associated epitope sequences |
US9458246B2 (en) | 2013-03-13 | 2016-10-04 | Amgen Inc. | Proteins specific for BAFF and B7RP1 |
JOP20140087B1 (ar) | 2013-03-13 | 2021-08-17 | Amgen Inc | بروتينات مخصصة ل baff و b7rp1 وإستخداماتها |
WO2014159940A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Macrogenics, Inc. | Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells that express an activating receptor |
SG11201507429TA (en) | 2013-03-15 | 2015-10-29 | Genentech Inc | Il-22 polypeptides and il-22 fc fusion proteins and methods of use |
AU2014228938B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-05-02 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor IX polypeptide formulations |
ES2708565T3 (es) | 2013-03-15 | 2019-04-10 | Atyr Pharma Inc | Conjugados de Fc-histidil-ARNt sintetasa |
EP3816625A1 (en) | 2013-05-06 | 2021-05-05 | Scholar Rock, Inc. | Compositions and methods for growth factor modulation |
EP3293275B1 (en) | 2013-06-06 | 2021-08-04 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for identification, assessment prevention, and treatment of cancer using pd-l1 isoforms |
AR096891A1 (es) | 2013-07-12 | 2016-02-03 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo |
US11384149B2 (en) | 2013-08-09 | 2022-07-12 | Macrogenics, Inc. | Bi-specific monovalent Fc diabodies that are capable of binding CD32B and CD79b and uses thereof |
UA116479C2 (uk) | 2013-08-09 | 2018-03-26 | Макродженікс, Інк. | БІСПЕЦИФІЧНЕ МОНОВАЛЕНТНЕ Fc-ДІАТІЛО, ЯКЕ ОДНОЧАСНО ЗВ'ЯЗУЄ CD32B I CD79b, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ |
EP2840091A1 (en) | 2013-08-23 | 2015-02-25 | MacroGenics, Inc. | Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof |
EP2839842A1 (en) | 2013-08-23 | 2015-02-25 | MacroGenics, Inc. | Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof |
WO2015048312A1 (en) | 2013-09-26 | 2015-04-02 | Costim Pharmaceuticals Inc. | Methods for treating hematologic cancers |
EP3077048B1 (en) | 2013-12-07 | 2019-07-17 | Case Western Reserve University | Compositions and methods of treating thrombosis |
US11708411B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-07-25 | Wake Forest University Health Sciences | Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines |
WO2015097536A2 (en) | 2013-12-24 | 2015-07-02 | Janssen Pharmaceutical Nv | Anti-vista antibodies and fragments |
US11014987B2 (en) | 2013-12-24 | 2021-05-25 | Janssen Pharmaceutics Nv | Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same |
EP3096776B1 (en) * | 2014-01-22 | 2020-12-02 | Antagonis Biotherapeutics GmbH | Novel glycosaminoglycan-antagonising fusion proteins and methods of using same |
US10556945B2 (en) | 2014-03-21 | 2020-02-11 | Teva Pharmaceuticals International Gmbh | Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same |
UA123759C2 (uk) | 2014-03-21 | 2021-06-02 | Тева Фармасьютікалз Інтернешнл Гмбх | Застосування моноклонального антитіла, яке інгібує шлях пов'язаного з геном кальциноніну пептиду (cgrp), для лікування або зниження частоти випадків мігренозного головного болю у суб'єкта |
US20170174772A1 (en) | 2014-03-31 | 2017-06-22 | Kirin-Amgen, Inc. | Methods of treating nail and scalp psoriasis |
AU2015274504B2 (en) | 2014-06-11 | 2021-02-04 | Kathy A. Green | Use of VISTA agonists and antagonists to suppress or enhance humoral immunity |
US9925247B2 (en) | 2014-06-30 | 2018-03-27 | Altor Bioscience Corporation | IL-15-based molecules and methods of use thereof |
CA2954974A1 (en) | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Glykos Finland Oy | Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi |
EP3177638B1 (en) | 2014-08-04 | 2019-11-27 | Case Western Reserve University | Targeting peptides and methods of use |
US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
EP3201227A4 (en) | 2014-09-29 | 2018-04-18 | Duke University | Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm |
AU2015326911B2 (en) | 2014-09-30 | 2021-07-08 | Neurimmune Holding Ag | Human-derived anti-dipeptide repeats (DPRs) antibody |
AU2015334984A1 (en) | 2014-10-21 | 2017-04-13 | Ablynx Nv | Treatment of IL-6R related diseases |
US9789197B2 (en) | 2014-10-22 | 2017-10-17 | Extend Biosciences, Inc. | RNAi vitamin D conjugates |
WO2016065052A1 (en) | 2014-10-22 | 2016-04-28 | Extend Biosciences, Inc. | Insulin vitamin d conjugates |
US9585934B2 (en) | 2014-10-22 | 2017-03-07 | Extend Biosciences, Inc. | Therapeutic vitamin D conjugates |
AU2015357463B2 (en) | 2014-12-05 | 2021-10-07 | Immunext, Inc. | Identification of VSIG8 as the putative vista receptor and its use thereof to produce vista/VSIG8 modulators |
AU2015360903B2 (en) | 2014-12-08 | 2021-03-25 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for upregulating immune responses using combinations of anti-RGMB and anti-PD-1 agents |
JP2018506275A (ja) | 2015-01-28 | 2018-03-08 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 多発性硬化症の遺伝子発現マーカー及び治療 |
US11820807B2 (en) | 2015-06-12 | 2023-11-21 | Ubi Pharma Inc | Immunoglobulin fusion proteins and uses thereof |
BR112017027870A2 (pt) | 2015-06-24 | 2018-08-28 | Janssen Pharmaceutica Nv | anticorpos e fragmentos anti-vista |
RU2740672C2 (ru) | 2015-08-07 | 2021-01-19 | ЭйЭлЭкс Онколоджи Инк. | Конструкции, имеющие sirp-альфа домен или его вариант |
JP7020687B2 (ja) | 2015-09-15 | 2022-02-16 | ボード オブ リージェンツ,ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム | T細胞受容体(tcr)結合抗体及びその使用 |
US11338065B2 (en) | 2015-10-08 | 2022-05-24 | Massachusetts Institute Of Technology | In situ expansion of engineered devices for regeneration |
US11207393B2 (en) | 2015-10-16 | 2021-12-28 | President And Fellows Of Harvard College | Regulatory T cell PD-1 modulation for regulating T cell effector immune responses |
MX2020011500A (es) | 2015-12-17 | 2020-12-07 | Alonbio Ltd | Moléculas pequeñas para inhibir la actividad de quimiocinas, la actividad de una cinasa y/o el crecimiento de células cancerosas. |
WO2017103931A1 (en) | 2015-12-17 | 2017-06-22 | Biokine Therapeutics Ltd. | Small molecules against cancer |
EP3397274A1 (en) | 2015-12-31 | 2018-11-07 | The Regents of the University of Colorado, a body corporate | Methods and uses for alpha-1 antitrypsin or recombinant forms thereof, on steroid-refractory graft versus host disease involving gastrointestinal complications |
US10899836B2 (en) | 2016-02-12 | 2021-01-26 | Janssen Pharmaceutica Nv | Method of identifying anti-VISTA antibodies |
RU2756109C2 (ru) | 2016-03-10 | 2021-09-28 | Виела Байо, Инк. | Связывающие ilt7 молекулы и способы их применения |
SG11201808979UA (en) | 2016-04-15 | 2018-11-29 | Macrogenics Inc | Novel b7-h3 binding molecules, antibody drug conjugates thereof and methods of use thereof |
CA3020848A1 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Anti-human vista antibodies and use thereof |
WO2017205726A1 (en) | 2016-05-27 | 2017-11-30 | Altor Bioscience Corporation | Construction and characterization of multimeric il-15-based molecules with cd3 binding domains |
JP2018035137A (ja) | 2016-07-13 | 2018-03-08 | マブイミューン ダイアグノスティックス エイジーMabimmune Diagnostics Ag | 新規な抗線維芽細胞活性化タンパク質(fap)結合薬剤およびその使用 |
US10392434B2 (en) | 2016-09-23 | 2019-08-27 | Teva Pharmaceuticals International Gmbh | Treating refractory migraine |
SG11201903306SA (en) | 2016-10-21 | 2019-05-30 | Altor Bioscience Corp | Multimeric il-15-based molecules |
US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
CN110234351A (zh) | 2017-01-30 | 2019-09-13 | 詹森生物科技公司 | 用于治疗活动性银屑病关节炎的抗tnf抗体、组合物和方法 |
US11649288B2 (en) | 2017-02-07 | 2023-05-16 | Seattle Children's Hospital | Phospholipid ether (PLE) CAR T cell tumor targeting (CTCT) agents |
CN110418652A (zh) | 2017-02-07 | 2019-11-05 | 詹森生物科技公司 | 用于治疗活动性强直性脊柱炎的抗tnf抗体、组合物和方法 |
WO2018160622A1 (en) | 2017-02-28 | 2018-09-07 | Endocyte, Inc. | Compositions and methods for car t cell therapy |
AU2018229278A1 (en) | 2017-02-28 | 2019-10-17 | Sanofi | Therapeutic RNA |
CN110785435B (zh) | 2017-03-06 | 2024-01-23 | 艾尔特生物科技公司 | 与il-12和il-18的基于il-15的融合物 |
US20190048055A1 (en) | 2017-03-31 | 2019-02-14 | Altor Bioscience Corporation | Alt-803 in combination with anti-cd38 antibody for cancer therapies |
WO2018195338A1 (en) | 2017-04-20 | 2018-10-25 | Atyr Pharma, Inc. | Compositions and methods for treating lung inflammation |
AU2018261947A1 (en) | 2017-05-05 | 2019-11-07 | Vaccinex, Inc. | Human anti-semaphorin 4D antibody |
AU2018323455B2 (en) | 2017-08-28 | 2022-02-03 | Altor Bioscience Llc | IL-15-based fusions to IL-7 and IL-21 |
US11311576B2 (en) | 2018-01-22 | 2022-04-26 | Seattle Children's Hospital | Methods of use for CAR T cells |
CR20200327A (es) | 2018-01-26 | 2020-11-05 | Genentech Inc | Proteínas de fusión fc il-22 y métodos de uso |
CA3088763A1 (en) | 2018-01-26 | 2019-08-01 | Genentech, Inc. | Compositions and methods of use |
AU2019226085A1 (en) | 2018-02-21 | 2020-09-17 | Genentech, Inc. | Dosing for treatment with IL-22 Fc fusion proteins |
CN111867612A (zh) | 2018-03-26 | 2020-10-30 | 阿尔托生物科学有限责任公司 | 抗PDL1、IL-15和TGF-β受体组合分子 |
CN112041333A (zh) | 2018-04-26 | 2020-12-04 | 古德T细胞有限公司 | 新型融合蛋白和用于预防或治疗癌症的包含该融合蛋白的药物组合物 |
US20210196787A1 (en) * | 2018-06-28 | 2021-07-01 | National University Corporation Okayama University | Agent for enhancing phagocytosis ability of neutrophils |
US20210347849A1 (en) * | 2018-07-24 | 2021-11-11 | Good T Cells, Inc. | Composition for Preventing or Treating Immune-Related Diseases |
CN110964116A (zh) | 2018-09-26 | 2020-04-07 | 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 | GLP1-Fc融合蛋白及其缀合物 |
AU2020206241A1 (en) | 2019-01-08 | 2021-08-26 | H. Lundbeck A/S | Acute treatment and rapid treatment of headache using anti-CGRP antibodies |
JP2022518208A (ja) | 2019-01-15 | 2022-03-14 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | 若年性特発性関節炎の治療のための抗tnf抗体、組成物、及び方法 |
WO2020152544A1 (en) | 2019-01-23 | 2020-07-30 | Janssen Biotech, Inc. | Anti-tnf antibody compositions for use in methods for the treatment of psoriatic arthritis |
CN113795513A (zh) | 2019-02-13 | 2021-12-14 | 布里格姆妇女医院 | 抗外周淋巴结地址素抗体及其用途 |
MA55283A (fr) | 2019-03-14 | 2022-01-19 | Janssen Biotech Inc | Procédés de production de compositions d'anticorps anti-tnf |
KR20210142002A (ko) | 2019-03-14 | 2021-11-23 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 항-tnf 항체 조성물을 생성하기 위한 제조 방법 |
CA3133388A1 (en) | 2019-03-14 | 2020-09-17 | Janssen Biotech, Inc. | Methods for producing anti-tnf antibody compositions |
CA3090315C (en) | 2019-05-15 | 2023-09-19 | Biokine Therapeutics Ltd. | 8-phenoxy-quinolinone derivatives for treating cancer, inhibiting chemokine activity and/or inducing cell death |
US11780911B2 (en) | 2019-05-23 | 2023-10-10 | Janssen Biotech, Inc. | Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to IL-23 and TNF alpha |
WO2020243338A1 (en) | 2019-05-31 | 2020-12-03 | ALX Oncology Inc. | Methods of treating cancer with sirp alpha fc fusion in combination with an immune checkpoint inhibitor |
CN113939531A (zh) | 2019-06-03 | 2022-01-14 | 詹森生物科技公司 | 用于治疗银屑病关节炎的抗tnf抗体组合物和方法 |
MX2021014882A (es) | 2019-06-03 | 2022-03-25 | Janssen Biotech Inc | Anticuerpos anti-tnf, composiciones y métodos para el tratamiento de la espondilitis anquilosante activa. |
WO2021028752A1 (en) | 2019-08-15 | 2021-02-18 | Janssen Biotech, Inc. | Anti-tfn antibodies for treating type i diabetes |
WO2021178843A1 (en) | 2020-03-05 | 2021-09-10 | DiaMedica USA Inc. | Ulinastatin polypeptides |
WO2021207662A1 (en) | 2020-04-10 | 2021-10-14 | Genentech, Inc. | Use of il-22fc for the treatment or prevention of pneumonia, acute respiratory distress syndrome, or cytokine release syndrome |
WO2021230233A1 (ja) * | 2020-05-14 | 2021-11-18 | 学校法人日本医科大学 | 感染症の治療又は予防剤 |
WO2022261183A2 (en) | 2021-06-08 | 2022-12-15 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for treating and/or identifying an agent for treating intestinal cancers |
CN117957251A (zh) | 2021-07-09 | 2024-04-30 | 詹森生物科技公司 | 用于制备抗tnf抗体组合物的制造方法 |
WO2023281462A1 (en) | 2021-07-09 | 2023-01-12 | Janssen Biotech, Inc. | Manufacturing methods for producing anti-tnf antibody compositions |
WO2023097119A2 (en) | 2021-11-29 | 2023-06-01 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods and compositions to modulate riok2 |
WO2023168426A1 (en) | 2022-03-03 | 2023-09-07 | Enosi Therapeutics Corporation | Compositions and cells containing mixtures of oligo-trap fusion proteins (ofps) and uses thereof |
WO2023173084A1 (en) | 2022-03-11 | 2023-09-14 | University Of Rochester | Cyclopeptibodies and uses thereof |
US11780910B1 (en) | 2022-05-02 | 2023-10-10 | Novo Nordisk A/S | Anti-ANGPTL3 antibodies suitable for high concentration compositions and subcutaneous administration |
Family Cites Families (60)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
US3691016A (en) | 1970-04-17 | 1972-09-12 | Monsanto Co | Process for the preparation of insoluble enzymes |
DE2247163A1 (de) | 1972-09-26 | 1974-03-28 | Merck Patent Gmbh | Traegermatrix zur fixierung biologisch wirksamer stoffe und verfahren zu ihrer herstellung |
CA1023287A (en) | 1972-12-08 | 1977-12-27 | Boehringer Mannheim G.M.B.H. | Process for the preparation of carrier-bound proteins |
GB1479268A (en) | 1973-07-05 | 1977-07-13 | Beecham Group Ltd | Pharmaceutical compositions |
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
US4002531A (en) | 1976-01-22 | 1977-01-11 | Pierce Chemical Company | Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby |
US4195128A (en) | 1976-05-03 | 1980-03-25 | Bayer Aktiengesellschaft | Polymeric carrier bound ligands |
US4330440A (en) | 1977-02-08 | 1982-05-18 | Development Finance Corporation Of New Zealand | Activated matrix and method of activation |
CA1093991A (en) | 1977-02-17 | 1981-01-20 | Hideo Hirohara | Enzyme immobilization with pullulan gel |
US4229537A (en) | 1978-02-09 | 1980-10-21 | New York University | Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands |
US4263428A (en) | 1978-03-24 | 1981-04-21 | The Regents Of The University Of California | Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same |
ZA811368B (en) | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
EP0052322B1 (de) | 1980-11-10 | 1985-03-27 | Gersonde, Klaus, Prof. Dr. | Verfahren zur Herstellung von Lipid-Vesikeln durch Ultraschallbehandlung, Anwendung des Verfahrens und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens |
IE52535B1 (en) | 1981-02-16 | 1987-12-09 | Ici Plc | Continuous release pharmaceutical compositions |
US4474893A (en) | 1981-07-01 | 1984-10-02 | The University of Texas System Cancer Center | Recombinant monoclonal antibodies |
US4485045A (en) | 1981-07-06 | 1984-11-27 | Research Corporation | Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes |
JPS5811808A (ja) | 1981-07-16 | 1983-01-22 | Niles Parts Co Ltd | 方位検出表示回路 |
NZ201705A (en) | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
US4444878A (en) | 1981-12-21 | 1984-04-24 | Boston Biomedical Research Institute, Inc. | Bispecific antibody determinants |
DE3374837D1 (en) | 1982-02-17 | 1988-01-21 | Ciba Geigy Ag | Lipids in the aqueous phase |
DE3218121A1 (de) | 1982-05-14 | 1983-11-17 | Leskovar, Peter, Dr.-Ing., 8000 München | Arzneimittel zur tumorbehandlung |
JPS59125144A (ja) | 1982-12-30 | 1984-07-19 | ソニー株式会社 | デイジタル信号伝送方法 |
GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
DE3483115D1 (de) | 1983-04-20 | 1990-10-11 | Youri Agabekov | Elektrische einspeisungsschiene. |
DE3464682D1 (en) | 1983-05-09 | 1987-08-13 | Gen Electric Co Plc | Cathode ray tube display device |
US4615885A (en) | 1983-11-01 | 1986-10-07 | Terumo Kabushiki Kaisha | Pharmaceutical composition containing urokinase |
EP0173494A3 (en) * | 1984-08-27 | 1987-11-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chimeric receptors by dna splicing and expression |
US4745055A (en) | 1985-05-07 | 1988-05-17 | California Biotechnology Inc. | Fused protein for enzyme immunoassay system |
DE3523701A1 (de) * | 1985-07-03 | 1987-01-08 | Bayer Ag | Verfahren zur herstellung von proteinen und polypeptiden |
DE3712985A1 (de) * | 1987-04-16 | 1988-11-03 | Hoechst Ag | Bifunktionelle proteine |
EP0256654B1 (en) | 1986-07-07 | 1996-09-18 | Centocor, Inc. | Chimeric murine/human immunoglobulin specific for tumour-associated 17-1A Antigen |
NO873164L (no) | 1986-07-30 | 1988-02-01 | Teijin Ltd | Muse-humane kimaere antistoffer. |
GB8623843D0 (en) | 1986-10-03 | 1987-10-21 | Airtech Ltd | Detection of unsafe voltages on mobile equipment |
GB8626412D0 (en) | 1986-11-05 | 1986-12-03 | Clark M R | Antibodies |
CA1339445C (en) * | 1986-11-12 | 1997-09-09 | The General Hospital Corporation | Recombinant hybrid immunoglobulin molecules and method of use |
EP0294703B1 (en) * | 1987-06-10 | 1995-05-10 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Bifunctional antibody constructs and method for selectively destroying cell populations |
IL87737A (en) | 1987-09-11 | 1993-08-18 | Genentech Inc | Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells |
SE459586B (sv) * | 1987-09-14 | 1989-07-17 | Mta Szegedi Biolog Koezponti | Strukturgen som kodar foer autentiskt humant serum albumin och foerfarande foer dess framstaellning |
CA1338518C (en) * | 1987-09-23 | 1996-08-13 | Joyce M. Zarling | Antibody heteroconjugates for the killing of hiv-infected cells |
PT88641B (pt) * | 1987-10-02 | 1993-04-30 | Genentech Inc | Metodo para a preparacao de uma variante de adesao |
GB8725529D0 (en) * | 1987-10-30 | 1987-12-02 | Delta Biotechnology Ltd | Polypeptides |
US4978745A (en) * | 1987-11-23 | 1990-12-18 | Centocor, Inc. | Immunoreactive heterochain antibodies |
EP0325224B1 (en) * | 1988-01-22 | 1996-07-31 | ZymoGenetics, Inc. | Methods of producing secreted receptor analogs |
PT89484B (pt) * | 1988-01-22 | 1994-03-31 | Gen Hospital Corp | Genes clonados codificadores de proteinas de fusao ig-cd4 e sua utilizacao |
GB8801756D0 (en) | 1988-01-27 | 1988-02-24 | Shell Int Research | Copolymer composition |
SE8802176D0 (sv) * | 1988-06-10 | 1988-06-10 | Kabigen Ab | Fusion protein and its use |
EP0355068A3 (en) * | 1988-08-19 | 1991-09-04 | The General Hospital Corporation | Recombinant hybrid immunoglobulin molecules and their use |
AU634186B2 (en) * | 1988-11-11 | 1993-02-18 | Medical Research Council | Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors |
EP1201756A3 (en) | 1988-12-22 | 2002-10-30 | Genentech, Inc. | Method for preparing water soluble polypeptides |
CA2010321C (en) * | 1989-02-21 | 2004-04-06 | Thomas F. Tedder | Lymphocyte-associated cell surface protein |
DK0745852T3 (da) * | 1989-03-16 | 2002-10-14 | Blood Res Center | Anvendelse af funktionelle derivater af intercellulær adhæsion-molekylet ICAM-1 i antiviral terapi |
EP0394827A1 (en) * | 1989-04-26 | 1990-10-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Chimaeric CD4-immunoglobulin polypeptides |
ATE92107T1 (de) * | 1989-04-29 | 1993-08-15 | Delta Biotechnology Ltd | N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen. |
IE901736L (en) * | 1989-05-17 | 1990-11-17 | Fuller H B Licensing Financ | Polypeptide-antibody conjugate for inhibiting cell adhesion |
WO1991000360A1 (en) * | 1989-06-29 | 1991-01-10 | Medarex, Inc. | Bispecific reagents for aids therapy |
FR2650598B1 (fr) * | 1989-08-03 | 1994-06-03 | Rhone Poulenc Sante | Derives de l'albumine a fonction therapeutique |
CA2065010A1 (en) * | 1989-08-23 | 1991-02-24 | Brian Seed | Non-human primate cd4 polypeptides, fusions thereof, dna encoding, and uses thereof |
WO1991004329A1 (en) * | 1989-09-20 | 1991-04-04 | Abbott Laboratories | Method of producing fusion proteins |
-
1989
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