JPH06133768A - 活性化した血小板に対する特異抗体、その製造、および診断および治療におけるその使用 - Google Patents
活性化した血小板に対する特異抗体、その製造、および診断および治療におけるその使用Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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-
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 特に活性化した血小板が関与する疾患の検出
および治療に適した手段を提供する。 【構成】 活性なヒト血小板に優先的に結合する単クロ
ーン性抗体および部分、単クローン性抗体ＭＡｂＢＷ２
１２８の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列およびアミ
ノ酸配列、およびトロンボスポンジンと結合した抗原。
活性化した血小板が関与する疾患、例えば血栓症、具体
的には血栓分解治療における心筋梗塞または発作の場合
の血栓症、深静脈血栓症、肺塞栓症、血管損傷、アテロ
ーム性動脈硬化症性斑、化膿性感染症および腸虚血のイ
ン・ビボでの検出および治療に特に好適である。
および治療に適した手段を提供する。 【構成】 活性なヒト血小板に優先的に結合する単クロ
ーン性抗体および部分、単クローン性抗体ＭＡｂＢＷ２
１２８の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列およびアミ
ノ酸配列、およびトロンボスポンジンと結合した抗原。
活性化した血小板が関与する疾患、例えば血栓症、具体
的には血栓分解治療における心筋梗塞または発作の場合
の血栓症、深静脈血栓症、肺塞栓症、血管損傷、アテロ
ーム性動脈硬化症性斑、化膿性感染症および腸虚血のイ
ン・ビボでの検出および治療に特に好適である。
Description
【０００１】本発明は、活性なヒト血小板に優先的に結
合する単クローン性抗体および部分、単クローン性抗体
ＭＡｂＢＷ２１２８の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配
列およびアミノ酸配列、およびトロンボスポンジンと結
合した抗原に関する。ハイブリドーマ技術により、画定
したまたは未画定の抗原上の任意の所望なエピトープに
対し、選択的な単クローン性抗体（ＭＡｂｓ）を作成す
ることが可能になっている。これに用いることができる
免疫原は、高純度の画定された抗原或いは抗原混合物、
細胞または組織であり、選択性の高いＭＡｂｓを見出す
ためには、好適な免疫原を見出すことも必要である。こ
の技術を用いることにより、静脈注射の後に、例えば人
体の腫瘍、炎症工程および血管閉塞に結合することがで
きるＭＡｂｓを開発することが可能になってきている。
ＭＡｂｓの対応する標的構造（腫瘍、炎症工程、血管閉
塞）へのこの優先的な結合は、核医学診断において既に
用いられている。標的構造を検出するための放射能標識
したＭＡｂｓの注射を扱う具体的な核医学的方法は、イ
ムノシンチグラフィである（Mach, J.P.,Buchegger,
F., Forni, M., Ritschard, J., Berche, C., Lumbras
o, J.-O., Schreyer, M., Girardet, C., Accolla, R.
C., Carrel, S., (1981), Immunologytoday, 2, 239-24
9 ）。現在のところ、血小板に選択的に結合し、他の正
常なヒトの組織には本質的に結合しないＭＡｂｓは、こ
れには利用されていない。しかしながら、血小板のα−
顆粒タンパク質に向けられ且つ実際に活性化した血小板
に優先的に結合するＭＡｂｓでも、他の組織上のエピト
ープへのはっきりした結合を示す。例えば、トロンボス
ポンジン（ＴＳＰ）、すなわちα−顆粒パク質（Baenzi
ger, N.L., Brodie, G.N., Majerus, P.W. (1971), Pro
c. Nat. Acad. Sci. USA, 68, 240-243; Ganguly, P.
(1971), J. Biol. Chem., 246, 4286-4290）に向けられ
るＭＡｂｓは、皮膚および肺の腺上皮、真皮と表皮との
間の結合部（Wight, T.N., Raugi, G.J., Mumby, S.M.,
Bornstein, D. (1985), J. Histochem. Cytochem., 3
3, 295-302 ）、軟骨（Miller, R.R., McDevitt, C.A.
(1988), Biochem. Biophys. Res. Commun., 153, 708-7
14 ）、脱灰した骨（Robey, P.G., Young, M.F., Fishe
r, L.W., McClain, T.D. (1989), J. Cell. Biol., 10
8, 719-727）、臍動脈（Fauvel-Lafeve, F., Legrand,
Y.J. (1988), Thromb. Res., 50, 305-316）、タイプII
肺胞細胞（Sage, H., Farin, F.M., Striker, G.E., Fi
sher, A.B. (1983), Biochemistry, 22, 2148-2155）、
巨核球（Bechstead, J.H., Stenberg, P.E., McEver,
R.P., Shuman, M.A., Bainton, D.P. (1986), Blood, 6
7, 285-293 ）、および増殖する内皮細胞、平滑筋およ
び線維芽細胞（Mumby, S.M., Abbott-Brown, D., Raug
i, G.J. Bornstein, P. (1984), J. Cell. Physiol., 1
20, 280-288; Jaffe, E.A., Ruggiero, J.T., Leung,
L.K., Doyle, M.J., McKeown-Lango, P.J., Mosher, D.
F. (1983), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80, 998-100
2）のエピトープと反応する。上記の正常な組織との交
差反応性があるため、既知の抗−ＴＳＰＭＡｂｓでイン
・ビボでの血管閉塞を検出しようとするときには偽陽性
信号が観察されるのが普通である。
合する単クローン性抗体および部分、単クローン性抗体
ＭＡｂＢＷ２１２８の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配
列およびアミノ酸配列、およびトロンボスポンジンと結
合した抗原に関する。ハイブリドーマ技術により、画定
したまたは未画定の抗原上の任意の所望なエピトープに
対し、選択的な単クローン性抗体（ＭＡｂｓ）を作成す
ることが可能になっている。これに用いることができる
免疫原は、高純度の画定された抗原或いは抗原混合物、
細胞または組織であり、選択性の高いＭＡｂｓを見出す
ためには、好適な免疫原を見出すことも必要である。こ
の技術を用いることにより、静脈注射の後に、例えば人
体の腫瘍、炎症工程および血管閉塞に結合することがで
きるＭＡｂｓを開発することが可能になってきている。
ＭＡｂｓの対応する標的構造（腫瘍、炎症工程、血管閉
塞）へのこの優先的な結合は、核医学診断において既に
用いられている。標的構造を検出するための放射能標識
したＭＡｂｓの注射を扱う具体的な核医学的方法は、イ
ムノシンチグラフィである（Mach, J.P.,Buchegger,
F., Forni, M., Ritschard, J., Berche, C., Lumbras
o, J.-O., Schreyer, M., Girardet, C., Accolla, R.
C., Carrel, S., (1981), Immunologytoday, 2, 239-24
9 ）。現在のところ、血小板に選択的に結合し、他の正
常なヒトの組織には本質的に結合しないＭＡｂｓは、こ
れには利用されていない。しかしながら、血小板のα−
顆粒タンパク質に向けられ且つ実際に活性化した血小板
に優先的に結合するＭＡｂｓでも、他の組織上のエピト
ープへのはっきりした結合を示す。例えば、トロンボス
ポンジン（ＴＳＰ）、すなわちα−顆粒パク質（Baenzi
ger, N.L., Brodie, G.N., Majerus, P.W. (1971), Pro
c. Nat. Acad. Sci. USA, 68, 240-243; Ganguly, P.
(1971), J. Biol. Chem., 246, 4286-4290）に向けられ
るＭＡｂｓは、皮膚および肺の腺上皮、真皮と表皮との
間の結合部（Wight, T.N., Raugi, G.J., Mumby, S.M.,
Bornstein, D. (1985), J. Histochem. Cytochem., 3
3, 295-302 ）、軟骨（Miller, R.R., McDevitt, C.A.
(1988), Biochem. Biophys. Res. Commun., 153, 708-7
14 ）、脱灰した骨（Robey, P.G., Young, M.F., Fishe
r, L.W., McClain, T.D. (1989), J. Cell. Biol., 10
8, 719-727）、臍動脈（Fauvel-Lafeve, F., Legrand,
Y.J. (1988), Thromb. Res., 50, 305-316）、タイプII
肺胞細胞（Sage, H., Farin, F.M., Striker, G.E., Fi
sher, A.B. (1983), Biochemistry, 22, 2148-2155）、
巨核球（Bechstead, J.H., Stenberg, P.E., McEver,
R.P., Shuman, M.A., Bainton, D.P. (1986), Blood, 6
7, 285-293 ）、および増殖する内皮細胞、平滑筋およ
び線維芽細胞（Mumby, S.M., Abbott-Brown, D., Raug
i, G.J. Bornstein, P. (1984), J. Cell. Physiol., 1
20, 280-288; Jaffe, E.A., Ruggiero, J.T., Leung,
L.K., Doyle, M.J., McKeown-Lango, P.J., Mosher, D.
F. (1983), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80, 998-100
2）のエピトープと反応する。上記の正常な組織との交
差反応性があるため、既知の抗−ＴＳＰＭＡｂｓでイン
・ビボでの血管閉塞を検出しようとするときには偽陽性
信号が観察されるのが普通である。
【０００２】Jaffe ら（上記文献）の方法によってαＴ
ＳＰＭＡｂｓを調製する際に、本発明者らは意外にも、
活性化した血小板に対する特異的ＭＡｂ（ＭＡｂ ＢＷ
２１２８）は、Towbin T. およびGordon J. （(197
9), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-434）によ
って記載されたウェスターンブロットにおいて、ＴＳ
Ｐ、フォン・ヴィレブランド因子またはｇｐ１４０のよ
うな既知のα−顆粒タンパク質とも前記のような細胞ま
たは組織とも反応しないことを見出した。ＭＡｂは、Ｔ
ＳＰと結合した抗原を免疫沈澱させ、等電点は実験誤差
の限界内ではＴＳＰとは識別できないが、還元条件下で
は約１６０ｋＤａのＴＳＰよりも明らかに小さな分子量
を有する。
ＳＰＭＡｂｓを調製する際に、本発明者らは意外にも、
活性化した血小板に対する特異的ＭＡｂ（ＭＡｂ ＢＷ
２１２８）は、Towbin T. およびGordon J. （(197
9), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-434）によ
って記載されたウェスターンブロットにおいて、ＴＳ
Ｐ、フォン・ヴィレブランド因子またはｇｐ１４０のよ
うな既知のα−顆粒タンパク質とも前記のような細胞ま
たは組織とも反応しないことを見出した。ＭＡｂは、Ｔ
ＳＰと結合した抗原を免疫沈澱させ、等電点は実験誤差
の限界内ではＴＳＰとは識別できないが、還元条件下で
は約１６０ｋＤａのＴＳＰよりも明らかに小さな分子量
を有する。
【０００３】等電点の決定における実験誤差の限界は、
約±１０〜１５％であり、特に約±５〜１０％である。
約±１０〜１５％であり、特に約±５〜１０％である。
【０００４】それ故、本発明は下記のものに関する。
【０００５】ハイブリドーマ２１２８（寄託番号ＤＳＭ
ＡＣＣ２０２４）。
ＡＣＣ２０２４）。
【０００６】ハイブリドーマ２１２８（ＤＳＭ ＡＣＣ
２０２４）に由来する単クローン性抗体（ＢＷ２１２
８）。
２０２４）に由来する単クローン性抗体（ＢＷ２１２
８）。
【０００７】ハイブリドーマ２１２８の単クローン性抗
体によって認識されるエピトープに結合する単クローン
性抗体またはその部分。
体によって認識されるエピトープに結合する単クローン
性抗体またはその部分。
【０００８】活性化したヒト血小板に優先的に結合し、
ハイブリドーマ２１２８の単クローン性抗体によって認
識されるエピトープに結合する生物学的特性を有する表
１（第Ｉａ表）および／または表２（第Ｉｂ表）に示さ
れるアミノ酸配列またはそれらの任意の対立形質変種
（allelic variant ）または変異体（mutant）を含む単
クローン性抗体またはその部分。
ハイブリドーマ２１２８の単クローン性抗体によって認
識されるエピトープに結合する生物学的特性を有する表
１（第Ｉａ表）および／または表２（第Ｉｂ表）に示さ
れるアミノ酸配列またはそれらの任意の対立形質変種
（allelic variant ）または変異体（mutant）を含む単
クローン性抗体またはその部分。
【０００９】優先的結合とは、本発明の目的では、活性
化した血小板上で見出されるＢＷ２１２８によって認識
されるエピトープは活性化されていない血小板上で見出
されるものの３〜１０００倍、特に１０〜１００倍であ
ることを意味する。
化した血小板上で見出されるＢＷ２１２８によって認識
されるエピトープは活性化されていない血小板上で見出
されるものの３〜１０００倍、特に１０〜１００倍であ
ることを意味する。
【００１０】本発明は、キメラ、ヒューマナイズド(hum
anized) 、二−またはオリゴ特異性抗体である単クロー
ン性抗体またはその部分にも関する。特に、例えば図１
（ａおよびｂ）に示されるように、ｍｒｕフラグメン
ト、単一ドメインフラグメント、一本鎖フラグメント、
Ｆ（ａｂ）フラグメントまたは１または２以上のヒンジ
領域を有するＦ（ａｂ′）２フラグメントがその中に含
まれる。
anized) 、二−またはオリゴ特異性抗体である単クロー
ン性抗体またはその部分にも関する。特に、例えば図１
（ａおよびｂ）に示されるように、ｍｒｕフラグメン
ト、単一ドメインフラグメント、一本鎖フラグメント、
Ｆ（ａｂ）フラグメントまたは１または２以上のヒンジ
領域を有するＦ（ａｂ′）２フラグメントがその中に含
まれる。
【００１１】ヒューマナイズド抗体が、特に好ましいそ
の例である。
の例である。
【００１２】ｍｒｕ（最少認識単位）は、ＣＤＲ（相補
性決定領域）から誘導され、特異的ＭＡｂによって認識
されるエピトープに結合する特性を有するポリペプチド
である。
性決定領域）から誘導され、特異的ＭＡｂによって認識
されるエピトープに結合する特性を有するポリペプチド
である。
【００１３】本発明は、単クローン性抗体ＢＷ２１２８
によって認識されるエピトープに結合する模倣（mimeti
c ）体にも関する。ＢＷ２１２８によって画定されたエ
ピトープに結合する高い可能性を有する小さな有機化合
物が模倣体として好適である。
によって認識されるエピトープに結合する模倣（mimeti
c ）体にも関する。ＢＷ２１２８によって画定されたエ
ピトープに結合する高い可能性を有する小さな有機化合
物が模倣体として好適である。
【００１４】本発明は、一般的には、単クローン性抗体
ＢＷ２１２８によって認識されるエピトープに結合する
生物学的特性を有する図１（ａ）および／または図１
（ｂ）に示されるアミノ酸配列、またはそれらの任意の
対立形質変種若しくは変異体を含むポリペプチドに関す
る。
ＢＷ２１２８によって認識されるエピトープに結合する
生物学的特性を有する図１（ａ）および／または図１
（ｂ）に示されるアミノ酸配列、またはそれらの任意の
対立形質変種若しくは変異体を含むポリペプチドに関す
る。
【００１５】本発明による単クローン性抗体またはその
部分、或いは本発明による模倣体を、本発明による免疫
グロブリン部分および免疫グロブリン類に属さない部分
を含む融合タンパク質として用いるのが特に有用であ
る。
部分、或いは本発明による模倣体を、本発明による免疫
グロブリン部分および免疫グロブリン類に属さない部分
を含む融合タンパク質として用いるのが特に有用であ
る。
【００１６】免疫グロブリン類に属さないタンパク質
は、特に線維素溶解タンパク質またはその部分、例えば
線維素溶解タンパク質ストレプトキナーゼ、ウロキナー
ゼ、ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体またはその部分である。
は、特に線維素溶解タンパク質またはその部分、例えば
線維素溶解タンパク質ストレプトキナーゼ、ウロキナー
ゼ、ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体またはその部分である。
【００１７】これには、ベクター、特に発現ベクターＬ
１およびＬ２、および好適な宿主細胞、特にＣＯＳ、Ｃ
ＨＯまたはＢＨＫ細胞、好ましくはＢＨＫ細胞が挙げら
れる。
１およびＬ２、および好適な宿主細胞、特にＣＯＳ、Ｃ
ＨＯまたはＢＨＫ細胞、好ましくはＢＨＫ細胞が挙げら
れる。
【００１８】本発明は、単クローン性抗体ＢＷ２１２８
によって認識されるエピトープに結合する生物学的特性
を有するポリペプチドをコードする１または２種類以上
の核酸配列を含むポリヌクレオチドにも関する。これら
には、特に表１（第Ｉａ表）および表２（第Ｉｂ表）に
示されるような核酸、その縮重コドンおよび周知のハイ
ブリダイゼーション条件下で表１（第Ｉａ表）および表
２（第Ｉｂ表）に示されるような核酸とハイブリダイズ
する核酸が挙げられる。好ましいハイブリダイゼーショ
ン条件は、Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis,
T. (1982), 分子クローニング：実験室マニュアル(Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual)、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbo
r Laboratory) ；Sambrook, J., Fritsch, E.F., Mania
tis, T. (1989), 第２版、分子クローニング：実験室マ
ニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレ
ス(Cold Spring Harbor Laboratory Press) に説明され
ているような緊縮（stringent ）条件である。
によって認識されるエピトープに結合する生物学的特性
を有するポリペプチドをコードする１または２種類以上
の核酸配列を含むポリヌクレオチドにも関する。これら
には、特に表１（第Ｉａ表）および表２（第Ｉｂ表）に
示されるような核酸、その縮重コドンおよび周知のハイ
ブリダイゼーション条件下で表１（第Ｉａ表）および表
２（第Ｉｂ表）に示されるような核酸とハイブリダイズ
する核酸が挙げられる。好ましいハイブリダイゼーショ
ン条件は、Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis,
T. (1982), 分子クローニング：実験室マニュアル(Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual)、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbo
r Laboratory) ；Sambrook, J., Fritsch, E.F., Mania
tis, T. (1989), 第２版、分子クローニング：実験室マ
ニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレ
ス(Cold Spring Harbor Laboratory Press) に説明され
ているような緊縮（stringent ）条件である。
【００１９】本発明は、更に、本発明によるポリペプチ
ドの製造法であって、本発明によるポリヌクレオチドに
より原核または真核宿主細胞を形質転換またはトランス
フェクションし、宿主細胞が前記のポリペプチドを発現
するようにすることを特徴とする方法にも関する。次
に、このポリペプチドを、当業者に既知の方法によって
培養物から単離することができる。
ドの製造法であって、本発明によるポリヌクレオチドに
より原核または真核宿主細胞を形質転換またはトランス
フェクションし、宿主細胞が前記のポリペプチドを発現
するようにすることを特徴とする方法にも関する。次
に、このポリペプチドを、当業者に既知の方法によって
培養物から単離することができる。
【００２０】本発明は、更に、抗原または免疫学的に反
応性のあるその部分であって、本発明による抗体の一つ
によって、特にＭＡｂＢＷ２１２８によって特異的に認
識されるものにも関する。
応性のあるその部分であって、本発明による抗体の一つ
によって、特にＭＡｂＢＷ２１２８によって特異的に認
識されるものにも関する。
【００２１】遺伝子操作の一般的方法は当業者に知られ
ており、特に断らないかぎり、例えば分子クローニン
グ：実験室マニュアル、Sambrookら（上記）から引用す
ることができる。
ており、特に断らないかぎり、例えば分子クローニン
グ：実験室マニュアル、Sambrookら（上記）から引用す
ることができる。
【００２２】しかしながら、本発明によるポリペプチド
は、当業者に既知のペプチド合成の方法によって化学的
に調製することもできる。
は、当業者に既知のペプチド合成の方法によって化学的
に調製することもできる。
【００２３】ポリペプチドとは、本発明にとっては、空
間配置および翻訳後の修飾、例えばグリコシル化または
ホスホリル化を含むタンパク質またはアミノ酸の配列を
意味する。
間配置および翻訳後の修飾、例えばグリコシル化または
ホスホリル化を含むタンパク質またはアミノ酸の配列を
意味する。
【００２４】本発明は、活性化した血小板が関与する疾
患、例えば血栓症、具体的には血栓分解治療における心
筋梗塞または発作の場合の血栓症、深静脈血栓症、肺塞
栓症、血管損傷、アテローム性動脈硬化症性斑、化膿性
感染症および腸虚血のイン・ビボでの検出および治療に
特に好適である。
患、例えば血栓症、具体的には血栓分解治療における心
筋梗塞または発作の場合の血栓症、深静脈血栓症、肺塞
栓症、血管損傷、アテローム性動脈硬化症性斑、化膿性
感染症および腸虚血のイン・ビボでの検出および治療に
特に好適である。
【００２５】ＭＡｂＢＷ２１２８は、次のようにして調
製することができる。
製することができる。
【００２６】ヒトＴＳＰは、Dixit, V.M., Harverstic
k, D.M., O'Rourke, K.M., Hennessy, S.W., Grant, G.
A., Santoro, S.A., Frazier, W.A. (1985), Biochemis
try,24, 4270-4275 に記載の方法によって活性化したヒ
ト血小板から単離し、既知の方法によってＢａｌｂ／ｃ
マウスを免疫するのに用いた（Bosslet, K., Lueben,
G., Schwarz, A., Hundt, E., Harthus, H.P., Seiler,
F.R., Muhrer, C., Kloeppel, G., Kayser, K., Sedla
cek, H.H. (1985), Int. J. Cancer, 36, 75-84）。
（このＴＳＰ調製物は、他の血小板タンパク質が混入す
ることがある。）生成するハイブリドーマの上澄液を、
間接ＡＰＡＡＰ法を用いて低温保存したヒト組織につい
ての特異性について検討を行った（Cordell, J.L., Fal
ini, B., Erber, W.N.ら、(1984), J. Histochem. Cyto
chem., 32, 219）。通常は、これらの上澄液は、活性化
したヒト血小板、肝臓の管上皮、腎臓の血管、肺上皮、
脾臓および骨髄（巨核球）と反応した。それ故、これら
は文献既知のＴＳＰ特異性を示した。しかしながら、意
外なことには、活性化したヒト血小板と特異的に反応す
るが前記の正常な組織とは反応しない上澄液も見出され
た。引用文献には活性化したヒト血小板に特異的なＭＡ
ｂを示唆する証拠はないので、この結果は極めて驚くべ
きことであった。このＭＡｂを分泌するハイブリドーマ
細胞を限定希釈法によって３回クローニングを行い、液
体窒素で凍結した（ハイブリドーマ細胞２１２８）。特
異性の詳細な免疫組織化学的分析を表３（第ＩＩ表）に
示す。ＡＰＡＡＰ法（Cordell ら、上記）を用いて示さ
れた血小板に対するその高い特異性を上回って、ＭＡｂ
ＢＷ２１２８は活性化されていない血小板とよりもトロ
ンビンで活性化した血小板と１０倍以上強く反応する。
血小板のホルムアルデヒド固定は、ＭＡｂの血小板への
結合をごくわずか抑制するだけである。ＭＡｂを活性化
されていないヒト血小板に加えると有意な活性化を生じ
るが、トロンビン０．５単位／mlを加えると活性化マー
カー（ＰＦ４）が顕著に分泌されるようになる（表４
（第ＩＩＩ表）。顆粒球上のエピトープに特異的なＭＡ
ｂｓ（例えば、ＢＷ２５０）、またはマイコプラズマ上
のエピトープに特異的なもの（例えば、ＢＷ２２７）お
よびＧＰＩａ／ＩＩａに特異的なもの（例えばＢＷ４）
は、ＭＡｂＢＷ２１２８と同様に、休止している血小板
の活性化に何んらの効果を示さない（K. Bossletら、(1
988), 14, 523-528 ）。第ＩＩＩ表に記載した条件下で
血小板をインキュベーションした後のＰＦ４の測定のた
めのＥＬＩＳＡ法は、Pelzer, H., Heimburger, N. (19
86), J. Biomed. Mat. Res., 20, 1401-1409およびOsei
-Bonsu, A., Cafourek, G., Reiter, S., Popovic, R.,
Sinzinger, H. (1987), Wiener klin. Wschr., 99, 59
5-600 に記載されている。これらの特性により、ＭＡｂ
ＢＷ２１２８は、Dixit, V.M., Haverstick, D.M., O'R
ourke, K.M., Hennessy, S.W., Grant, G.A., Santoro,
S.A., Frazier, W.A. (1985), Biochemistry, 24, 427
0-4275によって得られる抗−ＴＳＰＭＡｂｓ、およびHa
yward, C.P.M., Warkentin, T.E., Horsewood, P., Kel
ton, J.G. (1991), Blood, 77, 2556-2560によって記載
されている抗−マルチメリンＭＡｂＪＳ−１と識別され
るが、これらのＭＡｂｓは前記の生物学的特性に影響を
与える。免疫沈澱とウェスターンブロットにより、ＭＡ
ｂＢＷ２１２８によって認識される血小板抗原はｇｐ１
４０、フォン・ビレブランド因子、フィブロネクチンお
よびフィブリノーゲンと同一ではないことを示すことが
可能であった。
k, D.M., O'Rourke, K.M., Hennessy, S.W., Grant, G.
A., Santoro, S.A., Frazier, W.A. (1985), Biochemis
try,24, 4270-4275 に記載の方法によって活性化したヒ
ト血小板から単離し、既知の方法によってＢａｌｂ／ｃ
マウスを免疫するのに用いた（Bosslet, K., Lueben,
G., Schwarz, A., Hundt, E., Harthus, H.P., Seiler,
F.R., Muhrer, C., Kloeppel, G., Kayser, K., Sedla
cek, H.H. (1985), Int. J. Cancer, 36, 75-84）。
（このＴＳＰ調製物は、他の血小板タンパク質が混入す
ることがある。）生成するハイブリドーマの上澄液を、
間接ＡＰＡＡＰ法を用いて低温保存したヒト組織につい
ての特異性について検討を行った（Cordell, J.L., Fal
ini, B., Erber, W.N.ら、(1984), J. Histochem. Cyto
chem., 32, 219）。通常は、これらの上澄液は、活性化
したヒト血小板、肝臓の管上皮、腎臓の血管、肺上皮、
脾臓および骨髄（巨核球）と反応した。それ故、これら
は文献既知のＴＳＰ特異性を示した。しかしながら、意
外なことには、活性化したヒト血小板と特異的に反応す
るが前記の正常な組織とは反応しない上澄液も見出され
た。引用文献には活性化したヒト血小板に特異的なＭＡ
ｂを示唆する証拠はないので、この結果は極めて驚くべ
きことであった。このＭＡｂを分泌するハイブリドーマ
細胞を限定希釈法によって３回クローニングを行い、液
体窒素で凍結した（ハイブリドーマ細胞２１２８）。特
異性の詳細な免疫組織化学的分析を表３（第ＩＩ表）に
示す。ＡＰＡＡＰ法（Cordell ら、上記）を用いて示さ
れた血小板に対するその高い特異性を上回って、ＭＡｂ
ＢＷ２１２８は活性化されていない血小板とよりもトロ
ンビンで活性化した血小板と１０倍以上強く反応する。
血小板のホルムアルデヒド固定は、ＭＡｂの血小板への
結合をごくわずか抑制するだけである。ＭＡｂを活性化
されていないヒト血小板に加えると有意な活性化を生じ
るが、トロンビン０．５単位／mlを加えると活性化マー
カー（ＰＦ４）が顕著に分泌されるようになる（表４
（第ＩＩＩ表）。顆粒球上のエピトープに特異的なＭＡ
ｂｓ（例えば、ＢＷ２５０）、またはマイコプラズマ上
のエピトープに特異的なもの（例えば、ＢＷ２２７）お
よびＧＰＩａ／ＩＩａに特異的なもの（例えばＢＷ４）
は、ＭＡｂＢＷ２１２８と同様に、休止している血小板
の活性化に何んらの効果を示さない（K. Bossletら、(1
988), 14, 523-528 ）。第ＩＩＩ表に記載した条件下で
血小板をインキュベーションした後のＰＦ４の測定のた
めのＥＬＩＳＡ法は、Pelzer, H., Heimburger, N. (19
86), J. Biomed. Mat. Res., 20, 1401-1409およびOsei
-Bonsu, A., Cafourek, G., Reiter, S., Popovic, R.,
Sinzinger, H. (1987), Wiener klin. Wschr., 99, 59
5-600 に記載されている。これらの特性により、ＭＡｂ
ＢＷ２１２８は、Dixit, V.M., Haverstick, D.M., O'R
ourke, K.M., Hennessy, S.W., Grant, G.A., Santoro,
S.A., Frazier, W.A. (1985), Biochemistry, 24, 427
0-4275によって得られる抗−ＴＳＰＭＡｂｓ、およびHa
yward, C.P.M., Warkentin, T.E., Horsewood, P., Kel
ton, J.G. (1991), Blood, 77, 2556-2560によって記載
されている抗−マルチメリンＭＡｂＪＳ−１と識別され
るが、これらのＭＡｂｓは前記の生物学的特性に影響を
与える。免疫沈澱とウェスターンブロットにより、ＭＡ
ｂＢＷ２１２８によって認識される血小板抗原はｇｐ１
４０、フォン・ビレブランド因子、フィブロネクチンお
よびフィブリノーゲンと同一ではないことを示すことが
可能であった。
【００２７】更に、ＴＳＰ上の３種類の独立の非交差反
応性エピトープに選択的なＭＡｂｓ（ＭＡｂＢＷ２１２
５／８，ＢＷ２１２６／３３２，ＢＷ２１２６／６６
２；エピトープマッピングはHammarstroemら、Cancer R
es., 49, 4852-4858, 1989にしたがって行った）を用い
て、これらのＭＡｂが精製したＴＳＰに強力に結合する
が、標準的な固相ＥＬＩＳＡ法並びに非還元条件下での
ウェスターンブロット分析で明らかにされたようにＭＡ
ｂＢＷ２１２８によって認識される血小板抗原には結合
しないことを示すことができた。これらの実験は、ＭＡ
ｂＢＷ２１２８によって画定される血小板抗原は、前記
の抗ＴＳＰＭＡｂによって検出された３種類のエピトー
プをＴＳＰと共有しないことを示している。更に、２Ｄ
ゲル電気泳動（O'Farrell, P.H. (1975), J. Biol. Che
m., 250, 4007-4021）によって、還元条件下では分子量
がＴＳＰより小さく且つ相対分子質量が約１５０，００
０〜１７０，０００、好ましくは約１６０，０００であ
るが、ＴＳＰと同様な等電点を有しており、実験誤差の
限界内では識別がつかず、好ましくは約５．５〜６．５
の範囲にある（比較実験でのＴＳＰの分子量は１８０ｋ
Ｄａであり、等電点は５．５〜６．５であった）ことを
示すことも可能であった。この新規な抗原はＴＳＰと結
合しており、物理的および化学的結合の両方が可能であ
り、活性化した血小板上で優先的に発現されるので、一
般的に血小板抗原と呼ばれる。この抗原は、好ましくは
第ＩＩ表に詳細に示されている組織分布も示す。
応性エピトープに選択的なＭＡｂｓ（ＭＡｂＢＷ２１２
５／８，ＢＷ２１２６／３３２，ＢＷ２１２６／６６
２；エピトープマッピングはHammarstroemら、Cancer R
es., 49, 4852-4858, 1989にしたがって行った）を用い
て、これらのＭＡｂが精製したＴＳＰに強力に結合する
が、標準的な固相ＥＬＩＳＡ法並びに非還元条件下での
ウェスターンブロット分析で明らかにされたようにＭＡ
ｂＢＷ２１２８によって認識される血小板抗原には結合
しないことを示すことができた。これらの実験は、ＭＡ
ｂＢＷ２１２８によって画定される血小板抗原は、前記
の抗ＴＳＰＭＡｂによって検出された３種類のエピトー
プをＴＳＰと共有しないことを示している。更に、２Ｄ
ゲル電気泳動（O'Farrell, P.H. (1975), J. Biol. Che
m., 250, 4007-4021）によって、還元条件下では分子量
がＴＳＰより小さく且つ相対分子質量が約１５０，００
０〜１７０，０００、好ましくは約１６０，０００であ
るが、ＴＳＰと同様な等電点を有しており、実験誤差の
限界内では識別がつかず、好ましくは約５．５〜６．５
の範囲にある（比較実験でのＴＳＰの分子量は１８０ｋ
Ｄａであり、等電点は５．５〜６．５であった）ことを
示すことも可能であった。この新規な抗原はＴＳＰと結
合しており、物理的および化学的結合の両方が可能であ
り、活性化した血小板上で優先的に発現されるので、一
般的に血小板抗原と呼ばれる。この抗原は、好ましくは
第ＩＩ表に詳細に示されている組織分布も示す。
【００２８】この抗原は、例えば、好ましくはＭＡｂＢ
Ｗ２１２８の助けを借りて免疫アフィニティクロマトグ
ラフィによって単離することができ、ＭＡｂＢＷ２１２
８または免疫学的に反応性を有するその部分と同等な抗
体を調製し、チェックし、模倣体を調製するのに特に好
適である。
Ｗ２１２８の助けを借りて免疫アフィニティクロマトグ
ラフィによって単離することができ、ＭＡｂＢＷ２１２
８または免疫学的に反応性を有するその部分と同等な抗
体を調製し、チェックし、模倣体を調製するのに特に好
適である。
【００２９】本発明による抗体は、ＭＡｂＢＷ２１２８
のようなＩｇＧ１イソタイプであるときには、放射性同
位元素、特にＴｃ−９９ｍで標識することができる（Sc
hwarz, A., Steinstraesseer, A. (1987), J. Nucl. Me
d., 28, 721 ）。もう一つの可能性は、常磁性化合物で
の標識である。したがって、本発明による抗体および模
倣体は、血管閉塞のイムノシンチグラフィによる可視化
に特に好適である。
のようなＩｇＧ１イソタイプであるときには、放射性同
位元素、特にＴｃ−９９ｍで標識することができる（Sc
hwarz, A., Steinstraesseer, A. (1987), J. Nucl. Me
d., 28, 721 ）。もう一つの可能性は、常磁性化合物で
の標識である。したがって、本発明による抗体および模
倣体は、血管閉塞のイムノシンチグラフィによる可視化
に特に好適である。
【００３０】ハイブリドーマ２１２８は、ブダペスト条
約により寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２０２４でＤＳＭ（ド
イチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・
ウント・ツェルクルテューレン・ゲーエムベーハー(Deu
tsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulture
n GmbH) ）（マチャーローダー・ヴェク１Ｂ、３３０
０、ブラウンシュバイク）に寄託した。また、ＭＡｂＢ
Ｗ２１２８の重鎖および軽鎖のＶ遺伝子を、Orlandi,
R., Guessow, D., Jones, P.T., Winter, G. (1989) Pr
oc. Nat. Acad. Sci. USA, 86, 3833-3837 に記載の方
法によって単離し、Ｖ遺伝子エキソンの本質的領域の核
酸配列をSanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R., (1
977), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467に記
載の方法によって決定した（第Ｉａ，ｂ表）。クローニ
ングしたＶ遺伝子をＢＨＫ細胞中のヒトの切り詰めたＩ
ｇＧ３Ｆｃ部分（ＩｇＧ３Δ）およびヒトのＣカッパー
を有するキメラＭＡｂｓＢＷＣｈｉ２１２８として発現
させ、クローニングしたＶ遺伝子の同一性を確かめた
（例Ａ〜Ｎ）。
約により寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２０２４でＤＳＭ（ド
イチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・
ウント・ツェルクルテューレン・ゲーエムベーハー(Deu
tsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulture
n GmbH) ）（マチャーローダー・ヴェク１Ｂ、３３０
０、ブラウンシュバイク）に寄託した。また、ＭＡｂＢ
Ｗ２１２８の重鎖および軽鎖のＶ遺伝子を、Orlandi,
R., Guessow, D., Jones, P.T., Winter, G. (1989) Pr
oc. Nat. Acad. Sci. USA, 86, 3833-3837 に記載の方
法によって単離し、Ｖ遺伝子エキソンの本質的領域の核
酸配列をSanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R., (1
977), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467に記
載の方法によって決定した（第Ｉａ，ｂ表）。クローニ
ングしたＶ遺伝子をＢＨＫ細胞中のヒトの切り詰めたＩ
ｇＧ３Ｆｃ部分（ＩｇＧ３Δ）およびヒトのＣカッパー
を有するキメラＭＡｂｓＢＷＣｈｉ２１２８として発現
させ、クローニングしたＶ遺伝子の同一性を確かめた
（例Ａ〜Ｎ）。
【００３１】発現したＢＷＣｈｉ２１２８ＭＡｂはマウ
スＭＡｂと同じ抗原結合特異性を示した。更に、例えば
ＣＤＲまたは部分或いは数種類の画定されたＣＤＲのポ
リペプチド合成の後にｍｒｕ（最少認識単位）を決定し
て、低い免疫原性の特異的ペプチドとして用いて、活性
化した血小板のイン・ビボでの局在化を行うことも可能
であった。更に、Saragovi, H.U., Fitzpatrick, D., R
aktabutr, A., Nakanishi, H., Kahn, M., Greene, M.
I. (1991), Science, 253,792-795に記載の方法による
有機化学合成によって、ＭＡｂＢＷ２１２８によって画
定されるエピトープに対する特異性と結合活性が高い模
倣体を生成させることも可能である。ＭＡｂＢＷ２１２
８のヒューマナイズドＶ領域は、組換えによって例えば
ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよびｔＰＡ、特に
ｔＰＡ変異体のような線維素溶解タンパク質をコードす
るヌクレオチド配列に結合させることができる。好まし
いｔＰＡ変異体は、例えばＥＰ−Ａ１−０３８７３８０
号明細書に記載の方法で調製することができる。これら
の構造は、ドイツ国特許出願第Ｐ４１０６３８９．９に
ヒューマナイズドαＣＥＡＭＡｂおよびヒトβ−グルク
ロニダーゼの例によって示されているように、ＤＮＡの
水準で連結して、機能性融合タンパク質として発現する
ことができる。一般的には、前記の融合タンパク質は、
血管閉塞における活性化した血小板の特異的な高親和性
結合領域と同じ分子における機能的に活性な領域とを合
せ持つので、副作用の少ない効率的な線維素溶解剤であ
る（Haber, E., Quertermous, Th., Matsueda, G.R., R
unge, M.S., Bode, Ch. (1989),Jap. Circulation J.,
54, 345-353）。
スＭＡｂと同じ抗原結合特異性を示した。更に、例えば
ＣＤＲまたは部分或いは数種類の画定されたＣＤＲのポ
リペプチド合成の後にｍｒｕ（最少認識単位）を決定し
て、低い免疫原性の特異的ペプチドとして用いて、活性
化した血小板のイン・ビボでの局在化を行うことも可能
であった。更に、Saragovi, H.U., Fitzpatrick, D., R
aktabutr, A., Nakanishi, H., Kahn, M., Greene, M.
I. (1991), Science, 253,792-795に記載の方法による
有機化学合成によって、ＭＡｂＢＷ２１２８によって画
定されるエピトープに対する特異性と結合活性が高い模
倣体を生成させることも可能である。ＭＡｂＢＷ２１２
８のヒューマナイズドＶ領域は、組換えによって例えば
ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよびｔＰＡ、特に
ｔＰＡ変異体のような線維素溶解タンパク質をコードす
るヌクレオチド配列に結合させることができる。好まし
いｔＰＡ変異体は、例えばＥＰ−Ａ１−０３８７３８０
号明細書に記載の方法で調製することができる。これら
の構造は、ドイツ国特許出願第Ｐ４１０６３８９．９に
ヒューマナイズドαＣＥＡＭＡｂおよびヒトβ−グルク
ロニダーゼの例によって示されているように、ＤＮＡの
水準で連結して、機能性融合タンパク質として発現する
ことができる。一般的には、前記の融合タンパク質は、
血管閉塞における活性化した血小板の特異的な高親和性
結合領域と同じ分子における機能的に活性な領域とを合
せ持つので、副作用の少ない効率的な線維素溶解剤であ
る（Haber, E., Quertermous, Th., Matsueda, G.R., R
unge, M.S., Bode, Ch. (1989),Jap. Circulation J.,
54, 345-353）。
【００３２】
例Ａ ヒトＩｇＧ３Ｃ遺伝子（ＤＥ３８２５６１５Ａ１号明細
書、図２）を含むプラスミドクローン５４．１．２４を
ＰｓｔＩで開裂した。これから生成するベクターを、生
成するＰｓｔＩインサートの最も大きいものに連結し、
細菌中に形質転換した。ヒトＩｇＧ３Ｃ遺伝子を含みＨ
１、Ｈ２およびＨ３エキソンを欠失しているプラスミド
クローンＡ（図２）を、制限分析および核酸配列決定に
よって同定した。
書、図２）を含むプラスミドクローン５４．１．２４を
ＰｓｔＩで開裂した。これから生成するベクターを、生
成するＰｓｔＩインサートの最も大きいものに連結し、
細菌中に形質転換した。ヒトＩｇＧ３Ｃ遺伝子を含みＨ
１、Ｈ２およびＨ３エキソンを欠失しているプラスミド
クローンＡ（図２）を、制限分析および核酸配列決定に
よって同定した。
【００３３】例Ｂ プラスミドクローンＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲ
Ｉで開裂し、両端をクレノウポリメラーゼで充填し、Ｉ
ｇＧ３インサートを単離し、ＳｓｔＩで開裂してＴ４ポ
リメラーゼによってブラント末端を備えたｐＵＣ１９ベ
クターに連結した。ＨｉｎｄＩＩＩ開裂部位が５′末端
に位置し且つＥｃｏＲＩ開裂部位がｐＵＣ１９ポリリン
カーの３′末端に位置するようにＩｇＧ３遺伝子が配向
しているプラスミドクローンＢを、制限マッピングおよ
び核酸配列分析によって同定した（図３）。
Ｉで開裂し、両端をクレノウポリメラーゼで充填し、Ｉ
ｇＧ３インサートを単離し、ＳｓｔＩで開裂してＴ４ポ
リメラーゼによってブラント末端を備えたｐＵＣ１９ベ
クターに連結した。ＨｉｎｄＩＩＩ開裂部位が５′末端
に位置し且つＥｃｏＲＩ開裂部位がｐＵＣ１９ポリリン
カーの３′末端に位置するようにＩｇＧ３遺伝子が配向
しているプラスミドクローンＢを、制限マッピングおよ
び核酸配列分析によって同定した（図３）。
【００３４】例Ｃ プラスミドクローンＢをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉで開裂し、ＩｇＧ３インサートを単離して、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで開裂したのと同様にＫＳ＋プ
ラスミドベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ
＋；ストラタジーン(Stratagene)、ラ・ジョラ、カリフ
ォルニア州）に連結した。ＩｇＧ３遺伝子が５′および
３′末端においてＢａｍＨＩ開裂部位を有するプラスミ
ドクローンＣを単離した（図４）。
Ｉで開裂し、ＩｇＧ３インサートを単離して、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで開裂したのと同様にＫＳ＋プ
ラスミドベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ
＋；ストラタジーン(Stratagene)、ラ・ジョラ、カリフ
ォルニア州）に連結した。ＩｇＧ３遺伝子が５′および
３′末端においてＢａｍＨＩ開裂部位を有するプラスミ
ドクローンＣを単離した（図４）。
【００３５】例Ｄ プラスミドクローンＣをＢａｍＨＩで開裂し、ＩｇＧ３
インサートを単離して、ＢａｍＨＩで開裂した場合と同
様に発現ベクターｐＡＢＳｔｏｐ（Wirth ら、上記）に
連結した。式に示される配向のＩｇＧ３Ｃ遺伝子を含む
発現プラスミドＤを同定した。このクローニング段階で
は、ｐＡＢＳｔｏｐベクターはＳＶ４０停止および２つ
のＢａｍＨＩ開裂部位の間に位置したポリアデニル化信
号を喪失する（図５）。
インサートを単離して、ＢａｍＨＩで開裂した場合と同
様に発現ベクターｐＡＢＳｔｏｐ（Wirth ら、上記）に
連結した。式に示される配向のＩｇＧ３Ｃ遺伝子を含む
発現プラスミドＤを同定した。このクローニング段階で
は、ｐＡＢＳｔｏｐベクターはＳＶ４０停止および２つ
のＢａｍＨＩ開裂部位の間に位置したポリアデニル化信
号を喪失する（図５）。
【００３６】例Ｅ 発現プラスミドＤをＢａｍＨＩで部分開裂し、両端をク
レノウポリメラーゼで充填して再連結した。ＩｇＧ３遺
伝子からのＢａｍＨＩ開裂部位３′が破壊されている発
現プラスミドＥを単離した（図６）。
レノウポリメラーゼで充填して再連結した。ＩｇＧ３遺
伝子からのＢａｍＨＩ開裂部位３′が破壊されている発
現プラスミドＥを単離した（図６）。
【００３７】例Ｆ ヒトＣカッパー遺伝子（Hieter, P.A., Mainzel, J.V.,
Jr., Leder, P. (1982), J. Biol. Chem., 257, 1516-1
522 ）を、ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＢＲ３２２
中にクローニングした。ｐＢＲ３２２ベクターをＥｃｏ
ＲＩで開裂し、ＥｃｏＲＩ開裂部位を充填し、Ｃカッパ
ーインサートを単離して、ＳｍａＩで開裂したｐＵＣ１
９ベクターに連結した。Ｃカッパー遺伝子が、５′末端
におけるＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ開裂部位およ
び３′末端におけるＥｃｏＲＩ開裂部位を有しているプ
ラスミドクローンＦを単離した（図７）。
Jr., Leder, P. (1982), J. Biol. Chem., 257, 1516-1
522 ）を、ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＢＲ３２２
中にクローニングした。ｐＢＲ３２２ベクターをＥｃｏ
ＲＩで開裂し、ＥｃｏＲＩ開裂部位を充填し、Ｃカッパ
ーインサートを単離して、ＳｍａＩで開裂したｐＵＣ１
９ベクターに連結した。Ｃカッパー遺伝子が、５′末端
におけるＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ開裂部位およ
び３′末端におけるＥｃｏＲＩ開裂部位を有しているプ
ラスミドクローンＦを単離した（図７）。
【００３８】例Ｇ プラスミドクローンＦをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲ
Ｉで開裂し、Ｃカッパーインサートを単離して、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで開裂したＫＳ＋中にクローニン
グした。Ｃカッパーインサートが５′および３′末端に
おけるＢａｍＨＩ開裂部位を有しているプラスミドクロ
ーンＧを単離した（図８）。
Ｉで開裂し、Ｃカッパーインサートを単離して、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで開裂したＫＳ＋中にクローニン
グした。Ｃカッパーインサートが５′および３′末端に
おけるＢａｍＨＩ開裂部位を有しているプラスミドクロ
ーンＧを単離した（図８）。
【００３９】例Ｈ プラスミドクローンＧをＢａｍＨＩで開裂し、Ｃカッパ
ーインサートを単離して、ＢａｍＨＩで開裂したｐＡＢ
停止ベクター中にクローニングした。ｐＡＢ停止ベクタ
ーのＨｉｎｄＩＩＩ開裂部位が５′末端に位置するよう
にＣカッパー遺伝子が配向されているクローンＨを制限
マッピングおよび核酸配列分析によって同定した（図
９）。
ーインサートを単離して、ＢａｍＨＩで開裂したｐＡＢ
停止ベクター中にクローニングした。ｐＡＢ停止ベクタ
ーのＨｉｎｄＩＩＩ開裂部位が５′末端に位置するよう
にＣカッパー遺伝子が配向されているクローンＨを制限
マッピングおよび核酸配列分析によって同定した（図
９）。
【００４０】例Ｉ クローンＨをＢａｍＨＩで部分開裂し、制限末端を充填
して、再連結した。Ｃカッパー遺伝子のＢａｍＨＩ開裂
部位３′が破壊されているクローンＩを、制限マッピン
グによって同定した（図１０）。
して、再連結した。Ｃカッパー遺伝子のＢａｍＨＩ開裂
部位３′が破壊されているクローンＩを、制限マッピン
グによって同定した（図１０）。
【００４１】例Ｋ ＭＡｂＢＷ２１２８のＶＨおよびＶＫ遺伝子をOrlandi
ら（上記）によって記載された方法により、ＰＣＲ法お
よび特異的オリゴヌクレオチドを用いて増幅し、好適な
制限開裂部位を有する関連のないＶＨおよびＶＫ遺伝子
を含むＫＳ＋ベクター（Guessow, D. およびSeemann,
G. (1992), 酵素学の方法(Methods in Enzymology) 、
２０３巻、99〜121 頁）中にクローニングした。次い
で、関連のないＶＨおよびＶＫ遺伝子がＭＡｂＢＷ２１
２８のＶＨ（Ｋ１）およびＶＫ（Ｋ２）遺伝子によって
置き換えられたクローンＫ１およびＫ２を単離した（図
１１）。
ら（上記）によって記載された方法により、ＰＣＲ法お
よび特異的オリゴヌクレオチドを用いて増幅し、好適な
制限開裂部位を有する関連のないＶＨおよびＶＫ遺伝子
を含むＫＳ＋ベクター（Guessow, D. およびSeemann,
G. (1992), 酵素学の方法(Methods in Enzymology) 、
２０３巻、99〜121 頁）中にクローニングした。次い
で、関連のないＶＨおよびＶＫ遺伝子がＭＡｂＢＷ２１
２８のＶＨ（Ｋ１）およびＶＫ（Ｋ２）遺伝子によって
置き換えられたクローンＫ１およびＫ２を単離した（図
１１）。
【００４２】例Ｌ ＭＡｂＢＷ２１２８のＶＨおよびＶＫ遺伝子の核酸配列
を、Sangerの方法（PNAS, 74, 5463 (1977) ）によって
クローンＫ１およびＫ２から決定した（第Ｉａ，ｂ
表）。
を、Sangerの方法（PNAS, 74, 5463 (1977) ）によって
クローンＫ１およびＫ２から決定した（第Ｉａ，ｂ
表）。
【００４３】例Ｍ ＭＡｂＢＷ２１２８のＶＨおよびＶＫ遺伝子を制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いてクローンＫ１
およびＫ２から切断し、Ｖ遺伝子インサートを単離し
て、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断した発現ベ
クターＤ（ＶＨ）およびＩ（ＶＫ）中にクローニングし
た。完全な免疫グロブリン重鎖遺伝子（Ｌ１）または軽
鎖遺伝子（Ｌ２）を含む発現ベクターＬ１（図１２）お
よびＬ２（図１３）を単離した。
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いてクローンＫ１
およびＫ２から切断し、Ｖ遺伝子インサートを単離し
て、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断した発現ベ
クターＤ（ＶＨ）およびＩ（ＶＫ）中にクローニングし
た。完全な免疫グロブリン重鎖遺伝子（Ｌ１）または軽
鎖遺伝子（Ｌ２）を含む発現ベクターＬ１（図１２）お
よびＬ２（図１３）を単離した。
【００４４】例Ｎ 発現ベクターＬ１およびＬ２を、ネオマイシン耐性を付
与するベクターｐＲ１１Ｈ１４０（Hudziak, R.M., Las
ki, F.A., RajBhandary, U.L., Sharp, P.A.,Capecchi,
M.R. (1982), Cell, 31, 137-146）（図１４）および
ジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子を有し、メトト
レキセートに対する耐性を付与するベクターｐＳＶｄｈ
ｆｒ（Lee, F., Mulligan, R., Berg, P., Ringold, G.
(1981),Nature, 294, 228-232 ）（図１５）と共に、
ＢＨＫ細胞（Zettlmeissl, G., Wirth, M., Hauser,
H., Kuepper, H.A. (1988), Behring Inst. Mitt., 82,
26-34）中にトランスフェクションを行い、発現した抗
体を抗原結合特性について検討して、ＭＡｂＢＷ２１２
８のＶＨおよびＶＫ遺伝子の同一性を確かめた。
与するベクターｐＲ１１Ｈ１４０（Hudziak, R.M., Las
ki, F.A., RajBhandary, U.L., Sharp, P.A.,Capecchi,
M.R. (1982), Cell, 31, 137-146）（図１４）および
ジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子を有し、メトト
レキセートに対する耐性を付与するベクターｐＳＶｄｈ
ｆｒ（Lee, F., Mulligan, R., Berg, P., Ringold, G.
(1981),Nature, 294, 228-232 ）（図１５）と共に、
ＢＨＫ細胞（Zettlmeissl, G., Wirth, M., Hauser,
H., Kuepper, H.A. (1988), Behring Inst. Mitt., 82,
26-34）中にトランスフェクションを行い、発現した抗
体を抗原結合特性について検討して、ＭＡｂＢＷ２１２
８のＶＨおよびＶＫ遺伝子の同一性を確かめた。
【００４５】例Ｏ 本発明による抗体の特異性の免疫組織化学的分析を、Ａ
ＰＡＡＰ法（Cordellら、上記）によって行った。第Ｉ
Ｉ表は、ＭＡｂＢＷ２１２８の特異性の免疫組織化学的
分析の結果を示している。
ＰＡＡＰ法（Cordellら、上記）によって行った。第Ｉ
Ｉ表は、ＭＡｂＢＷ２１２８の特異性の免疫組織化学的
分析の結果を示している。
【００４６】例Ｐ 血小板の活性化は、H. Pelzer およびN. Heimburger
（上記）によって記載されたＥＬＩＳＡにより活性化マ
ーカーＰＦ４の定量によって測定することができる。第
ＩＩＩ表は、血小板の活性化に対するＭＡｂＢＷ２１２
８の効果を示している。
（上記）によって記載されたＥＬＩＳＡにより活性化マ
ーカーＰＦ４の定量によって測定することができる。第
ＩＩＩ表は、血小板の活性化に対するＭＡｂＢＷ２１２
８の効果を示している。
【表１】
【表２】 表３（第ＩＩ表） ＭＡｂの特異性の免疫組織化学的分析 組織 試験回数 反応の種類 陽性 陰性 血小板ペレット 12 +++ 顆粒球ペレット 10 - 単／リンパ球ペレット 10 +/++正常組織 リンパ節 2 - Bgfas - 心臓 2 - Bgfas - 心膜 4 eThrom +/++ Bgfas - 神経 1 - Nervenfas - 扁桃 1 - Fas - 脾臓 4 Throm ++/+++ Gef -, Fas - 胃粘膜 1 - Gef -, Fas - 腸粘膜 1 ewThrom + Gef -, Fas - 筋肉 5 eSark, Fib + 被殻 1 - Fas - 肝臓 5 eThrom ++ G -, Gef -, Fas - 肺 4 ewThrom + Gef -, Pneumo - 骨髄 4 ewThrom + Megakaryo.- 腎臓 3 ewThrom + Gef -, Kan -ヒト癌 胃癌 2 ewThrom + Gef -, Bgfas - 膵臓癌 2 ewThrom + Gef - 気管支癌−腺 1 - Gef - −小細胞 1 - Gef - −扁平細胞 1 - Gef - 乳癌 2 - Gef - 神経膠芽腫 2 ewThrom + Gef - 黒色腫 2 ewThrom + Gef - 結腸癌 1 - Gef -, Bgfas - 直腸癌 1 - Gef - キー： ewThrom 少数の血小板 eThrom 多少の血小板 G 管 Gef 血管 Kan 細管 Bgfas 結合組織線維 Fas 線維 Pneumo 肺細胞、タイプII Sark サルコレマ Fib 原線維 Megakaryo 巨核球 表４（第ＩＩＩ表） 血小板の活性化に対するＭＡｂＢＷ２１２８の効果 血小板の調製： ３７℃で３０分間２０μｇでインキュベーションした後のμｇ ／mlでのＰＦ４の放出 MAbBW2128 MAbBW250 MAbBW4 BW227 トロンビン（0.5 U/ml） 血小板濃度の 45 60 132 94 2000 高い血漿 洗浄した血小 110 178 181 142 1900 板 トロンビンで 1800 1600 1500 1400 活性化した 血小板
【図１】種々の抗体を図式的に表現した説明図。図１ａ
は抗体、組換え抗体、抗体フラグメントおよび遺伝子操
作によって連結した抗体抱合体を図式的に表現したもの
である。図１ｂは抗体抱合体を模式的に表現したもので
あり、二特異性抗体の各種の抗原結合特異性が、Ｖ領域
を異なった陰影を付けることによって明らかになってい
る。オリゴ特異性高分子の場合には、それぞれの場合
に、ＣH1ドメインはポリペプチドリンカーを介して次
の、軽鎖が結合しているＶＨドメインに連結している。
抗体／酵素抱合体の酵素は点で表わしている。
は抗体、組換え抗体、抗体フラグメントおよび遺伝子操
作によって連結した抗体抱合体を図式的に表現したもの
である。図１ｂは抗体抱合体を模式的に表現したもので
あり、二特異性抗体の各種の抗原結合特異性が、Ｖ領域
を異なった陰影を付けることによって明らかになってい
る。オリゴ特異性高分子の場合には、それぞれの場合
に、ＣH1ドメインはポリペプチドリンカーを介して次
の、軽鎖が結合しているＶＨドメインに連結している。
抗体／酵素抱合体の酵素は点で表わしている。
【図２】プラスミドクローンＡを示す説明図。
【図３】プラスミドクローンＢを示す説明図。
【図４】プラスミドクローンＣを示す説明図。
【図５】プラスミドクローンＤを示す説明図。
【図６】発現プラスミドＥを示す説明図。
【図７】プラスミドクローンＦを示す説明図。
【図８】プラスミドクローンＧを示す説明図。
【図９】クローンＨを示す説明図。
【図１０】クローンＩを示す説明図。
【図１１】クローンＫ１およびＫ２を示す説明図。
【図１２】発現ベクターＬ１を示す説明図。
【図１３】発現ベクターＬ１３を示す説明図。
【図１４】発現ベクターＬ１およびＬ２をベクターｐＲ
１１Ｈ１４０と共にＢＨＫ細胞へトランスフェクション
した後の遺伝子の分析を示す説明図。
１１Ｈ１４０と共にＢＨＫ細胞へトランスフェクション
した後の遺伝子の分析を示す説明図。
【図１５】発現ベクターＬ１およびＬ２をベクターｐＳ
Ｖｄｈｆｒと共にＢＨＫ細胞へトランスフェクションし
た後の遺伝子の分析を示す説明図。
Ｖｄｈｆｒと共にＢＨＫ細胞へトランスフェクションし
た後の遺伝子の分析を示す説明図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 13/00 15/12 8517−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/13 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ 21/08 ＺＮＡ 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｌ 8310−2Ｊ (72)発明者 ベアーテ、ケーレル ドイツ連邦共和国ミュンスター、シェッピ ンゲンウェーク、70
Claims (29)
- 【請求項１】寄託番号がＤＳＭ ＡＣＣ２０２４であ
る、ハイブリドーマ２１２８。 - 【請求項２】ハイブリドーマ２１２８（寄託番号ＤＳＭ
ＡＣＣ２０２４）に由来する単クローン性抗体。 - 【請求項３】請求項２に記載の単クローン性抗体によっ
て認識されるエピトープに結合する単クローン性抗体ま
たはその部分。 - 【請求項４】活性化したヒト血小板に優先的に結合し、
且つ請求項２に記載の単クローン性抗体によって認識さ
れるエピトープに結合する生物学的特性を有する、表１
および／または表２に示されるアミノ酸配列またはそれ
らの任意の対立形質変種または変異体を含む、単クロー
ン性抗体またはその部分。 - 【請求項５】抗体がキメラ、ヒューマナイズド、二−ま
たはオリゴ特異性抗体である、請求項３または４に記載
の単クローン性抗体またはその部分。 - 【請求項６】抗体がｍｒｕフラグメント、単一ドメイン
フラグメント、一本鎖フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグ
メントまたは１または２以上のヒンジ領域を有するＦ
（ａｂ′）２フラグメントである、請求項３〜５のいず
れか１項に記載の単クローン性抗体。 - 【請求項７】キメラ抗体がＢＷ Ｃｈｉ ２１２８であ
る、請求項５に記載の単クローン性抗体。 - 【請求項８】好ましくはＴｃ−９９ｍで標識されてい
る、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単クローン性
抗体。 - 【請求項９】請求項２〜４のいずれか１項に記載の単ク
ローン性抗体によって認識されるエピトープに結合する
ことを特徴とする、模倣体。 - 【請求項１０】請求項２〜７のいずれか１項に記載の単
クローン性抗体またはその部分または請求項９に記載の
模倣体、および免疫グロブリン類に属さないタンパク質
またはその機能性部分から構成される融合タンパク質。 - 【請求項１１】免疫グロブリン類に属さないタンパク質
が線維素溶解タンパク質またはその機能性部分である、
請求項10に記載の融合タンパク質。 - 【請求項１２】線維素溶解タンパク質がストレプトキナ
ーゼ、ウロキナーゼ、ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体またはその
機能性部分である、請求項11に記載の融合タンパク質。 - 【請求項１３】請求項２に記載の単クローン性抗体によ
って認識されるエピトープに結合する生物学的特性を有
する表１および／または表２に示されるアミノ酸配列ま
たはそれらの任意の対立形質変種または変異体を含むポ
リペプチド。 - 【請求項１４】請求項２に記載の単クローン性抗体によ
って認識されるエピトープに結合する生物学的特性を有
するポリペプチドをコードする１または２以上の核酸配
列を含むポリヌクレオチド。 - 【請求項１５】請求項１４に記載のポリヌクレオチドを
含むベクター。 - 【請求項１６】請求項１４に記載のポリヌクレオチドを
含む発現ベクター。 - 【請求項１７】ベクターＬ１またはベクターＬ２であ
る、請求項１６に記載の発現ベクター。 - 【請求項１８】請求項１４に記載の組換えポリヌクレオ
チドまたは請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のベ
クターを含む原核または真核宿主細胞。 - 【請求項１９】宿主細胞がＣＯＳ、ＣＨＯまたはＢＨ
Ｋ、好ましくはＢＨＫ細胞である、請求項１８に記載の
真核宿主細胞。 - 【請求項２０】請求項１４に記載のポリヌクレオチドに
よる原核または真核宿主細胞の形質転換またはトランス
フェクションにより宿主細胞が前記のポリペプチドを発
現するようにする、請求項１３に記載のポリペプチドの
製造法。 - 【請求項２１】請求項１８に記載の原核または真核宿主
細胞、好ましくは真核宿主細胞を培養し、前記のポリペ
プチドを単離することを特徴とする、請求項１３に記載
のポリペプチドの製造法。 - 【請求項２２】請求項２〜８のいずれか１項に記載の単
クローン性抗体、請求項９に記載の模倣体、請求項１０
〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請
求項１３に記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。 - 【請求項２３】請求項２〜８のいずれか１項に記載の単
クローン性抗体、請求項９に記載の模倣体、請求項１０
〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請
求項１３に記載のポリペプチドを含む、診断用助剤。 - 【請求項２４】請求項２〜８のいずれか１項に記載の単
クローン性抗体、請求項９に記載の模倣体、請求項１０
〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請
求項１３に記載のポリペプチドの、活性化したヒト血小
板を検出するための診断用助剤の製造への使用。 - 【請求項２５】請求項２〜４のいずれか１項に記載の抗
体によって認識される抗原またはその免疫学的に反応性
を有する部分。 - 【請求項２６】還元条件下の相対分子質量が約１５０，
０００〜１７０，０００である、請求項２５に記載の抗
原。 - 【請求項２７】実験誤差の限界内でＴＳＰとは識別がつ
かない等電点を有する、請求項２５または２６に記載の
抗原。 - 【請求項２８】表３に示される組織分布を示す、請求項
２５〜２７のいずれか１項に記載の抗原。 - 【請求項２９】活性化した血小板の細胞表面上およびフ
ォン・ビレブランド因子、フィブロネクチンまたはフィ
ブリノーゲンとは血清学的に異なる活性化されていない
血小板の顆粒中に見出される抗原。
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|---|---|---|---|
| DE4203545A DE4203545A1 (de) | 1992-02-07 | 1992-02-07 | Spezifische antikoerper gegen aktivierte plaettchen, ihre herstellung und ihre verwendung in diagnose und therapie |
| DE4203545.7 | 1992-02-07 |
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|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0554670B1 (ja) |
| JP (1) | JP3821858B2 (ja) |
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| US7538195B2 (en) * | 2002-06-14 | 2009-05-26 | Immunogen Inc. | Anti-IGF-I receptor antibody |
| US7655411B2 (en) * | 2002-08-23 | 2010-02-02 | W2 Holdings, Inc. | Thrombospondin fragments and binding agents in the detection, diagnosis and evaluation of cancer |
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|---|---|---|---|---|
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