JP3821858B2 - 活性化した血小板に対する特異抗体、その製造、および診断および治療におけるその使用 - Google Patents
活性化した血小板に対する特異抗体、その製造、および診断および治療におけるその使用 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
本発明は、活性なヒト血小板に優先的に結合する単クローン性抗体および部分、単クローン性抗体ＭＡｂＢＷ２１２８の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、およびトロンボスポンジンと結合した抗原に関する。
ハイブリドーマ技術により、画定したまたは未画定の抗原上の任意の所望なエピトープに対し、選択的な単クローン性抗体（ＭＡｂｓ）を作成することが可能になっている。これに用いることができる免疫原は、高純度の画定された抗原或いは抗原混合物、細胞または組織であり、選択性の高いＭＡｂｓを見出すためには、好適な免疫原を見出すことも必要である。この技術を用いることにより、静脈注射の後に、例えば人体の腫瘍、炎症工程および血管閉塞に結合することができるＭＡｂｓを開発することが可能になってきている。ＭＡｂｓの対応する標的構造（腫瘍、炎症工程、血管閉塞）へのこの優先的な結合は、核医学診断において既に用いられている。標的構造を検出するための放射能標識したＭＡｂｓの注射を扱う具体的な核医学的方法は、イムノシンチグラフィである（Mach, J.P., Buchegger, F., Forni, M., Ritschard, J., Berche, C., Lumbraso, J.-O., Schreyer, M., Girardet, C., Accolla, R.C., Carrel, S., (1981), Immunology today, 2, 239-249 ）。現在のところ、血小板に選択的に結合し、他の正常なヒトの組織には本質的に結合しないＭＡｂｓは、これには利用されていない。しかしながら、血小板のα−顆粒タンパク質に向けられ且つ実際に活性化した血小板に優先的に結合するＭＡｂｓでも、他の組織上のエピトープへのはっきりした結合を示す。例えば、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）、すなわちα−顆粒パク質（Baenziger, N.L., Brodie, G.N., Majerus, P.W. (1971), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 68, 240-243; Ganguly, P. (1971), J. Biol. Chem., 246, 4286-4290 ）に向けられるＭＡｂｓは、皮膚および肺の腺上皮、真皮と表皮との間の結合部（Wight, T.N., Raugi, G.J., Mumby, S.M., Bornstein, D. (1985), J. Histochem. Cytochem., 33, 295-302 ）、軟骨（Miller, R.R., McDevitt, C.A. (1988), Biochem. Biophys. Res. Commun., 153, 708-714 ）、脱灰した骨（Robey, P.G., Young, M.F., Fisher, L.W., McClain, T.D. (1989), J. Cell. Biol., 108, 719-727）、臍動脈（Fauvel-Lafeve, F., Legrand, Y.J. (1988), Thromb. Res., 50, 305-316）、タイプII肺胞細胞（Sage, H., Farin, F.M., Striker, G.E., Fisher, A.B. (1983), Biochemistry, 22, 2148-2155）、巨核球（Bechstead, J.H., Stenberg, P.E., McEver, R.P., Shuman, M.A., Bainton, D.P. (1986), Blood, 67, 285-293 ）、および増殖する内皮細胞、平滑筋および線維芽細胞（Mumby, S.M., Abbott-Brown, D., Raugi, G.J. Bornstein, P. (1984), J. Cell. Physiol., 120, 280-288; Jaffe, E.A., Ruggiero, J.T., Leung, L.K., Doyle, M.J., McKeown-Lango, P.J., Mosher, D.F. (1983), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80, 998-1002）のエピトープと反応する。上記の正常な組織との交差反応性があるため、既知の抗−ＴＳＰＭＡｂｓでイン・ビボでの血管閉塞を検出しようとするときには偽陽性信号が観察されるのが普通である。
【０００２】
Jaffe ら（上記文献）の方法によってαＴＳＰＭＡｂｓを調製する際に、本発明者らは意外にも、活性化した血小板に対する特異的ＭＡｂ（ＭＡｂ ＢＷ ２１２８）は、Towbin T. およびGordon J. （(1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-434）によって記載されたウェスターンブロットにおいて、ＴＳＰ、フォン・ヴィレブランド因子またはｇｐ１４０のような既知のα−顆粒タンパク質とも前記のような細胞または組織とも反応しないことを見出した。ＭＡｂは、ＴＳＰと結合した抗原を免疫沈澱させ、等電点は実験誤差の限界内ではＴＳＰとは識別できないが、還元条件下では約１６０ｋＤａのＴＳＰよりも明らかに小さな分子量を有する。
【０００３】
等電点の決定における実験誤差の限界は、約±１０〜１５％であり、特に約±５〜１０％である。
【０００４】
それ故、本発明は下記のものに関する。
【０００５】
ハイブリドーマ２１２８（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２０２４）。
【０００６】
ハイブリドーマ２１２８（ＤＳＭ ＡＣＣ２０２４）に由来する単クローン性抗体（ＢＷ２１２８）。
【０００７】
ハイブリドーマ２１２８の単クローン性抗体によって認識されるエピトープに結合する単クローン性抗体またはその部分。
【０００８】
活性化したヒト血小板に優先的に結合し、ハイブリドーマ２１２８の単クローン性抗体によって認識されるエピトープに結合する生物学的特性を有する表１（第Ｉａ表）および／または表２（第Ｉｂ表）に示されるアミノ酸配列またはそれらの任意の対立形質変種（allelic variant ）または変異体（mutant）を含む単クローン性抗体またはその部分。
【０００９】
優先的結合とは、本発明の目的では、活性化した血小板上で見出されるＢＷ２１２８によって認識されるエピトープは活性化されていない血小板上で見出されるものの３〜１０００倍、特に１０〜１００倍であることを意味する。
【００１０】
本発明は、キメラ、ヒューマナイズド(humanized) 、二−またはオリゴ特異性抗体である単クローン性抗体またはその部分にも関する。特に、例えば図１（ａおよびｂ）に示されるように、ｍｒｕフラグメント、単一ドメインフラグメント、一本鎖フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメントまたは１または２以上のヒンジ領域を有するＦ（ａｂ′）２フラグメントがその中に含まれる。
【００１１】
ヒューマナイズド抗体が、特に好ましいその例である。
【００１２】
ｍｒｕ（最少認識単位）は、ＣＤＲ（相補性決定領域）から誘導され、特異的ＭＡｂによって認識されるエピトープに結合する特性を有するポリペプチドである。
【００１３】
本発明は、単クローン性抗体ＢＷ２１２８によって認識されるエピトープに結合する模倣（mimetic ）体にも関する。ＢＷ２１２８によって画定されたエピトープに結合する高い可能性を有する小さな有機化合物が模倣体として好適である。
【００１４】
本発明は、一般的には、単クローン性抗体ＢＷ２１２８によって認識されるエピトープに結合する生物学的特性を有する図１（ａ）および／または図１（ｂ）に示されるアミノ酸配列、またはそれらの任意の対立形質変種若しくは変異体を含むポリペプチドに関する。
【００１５】
本発明による単クローン性抗体またはその部分、或いは本発明による模倣体を、本発明による免疫グロブリン部分および免疫グロブリン類に属さない部分を含む融合タンパク質として用いるのが特に有用である。
【００１６】
免疫グロブリン類に属さないタンパク質は、特に線維素溶解タンパク質またはその部分、例えば線維素溶解タンパク質ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体またはその部分である。
【００１７】
これには、ベクター、特に発現ベクターＬ１およびＬ２、および好適な宿主細胞、特にＣＯＳ、ＣＨＯまたはＢＨＫ細胞、好ましくはＢＨＫ細胞が挙げられる。
【００１８】
本発明は、単クローン性抗体ＢＷ２１２８によって認識されるエピトープに結合する生物学的特性を有するポリペプチドをコードする１または２種類以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドにも関する。これらには、特に表１（第Ｉａ表）および表２（第Ｉｂ表）に示されるような核酸、その縮重コドンおよび周知のハイブリダイゼーション条件下で表１（第Ｉａ表）および表２（第Ｉｂ表）に示されるような核酸とハイブリダイズする核酸が挙げられる。好ましいハイブリダイゼーション条件は、Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1982), 分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory) ；Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989), 第２版、分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press) に説明されているような緊縮（stringent ）条件である。
【００１９】
本発明は、更に、本発明によるポリペプチドの製造法であって、本発明によるポリヌクレオチドにより原核または真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションし、宿主細胞が前記のポリペプチドを発現するようにすることを特徴とする方法にも関する。次に、このポリペプチドを、当業者に既知の方法によって培養物から単離することができる。
【００２０】
本発明は、更に、抗原または免疫学的に反応性のあるその部分であって、本発明による抗体の一つによって、特にＭＡｂＢＷ２１２８によって特異的に認識されるものにも関する。
【００２１】
遺伝子操作の一般的方法は当業者に知られており、特に断らないかぎり、例えば分子クローニング：実験室マニュアル、Sambrookら（上記）から引用することができる。
【００２２】
しかしながら、本発明によるポリペプチドは、当業者に既知のペプチド合成の方法によって化学的に調製することもできる。
【００２３】
ポリペプチドとは、本発明にとっては、空間配置および翻訳後の修飾、例えばグリコシル化またはホスホリル化を含むタンパク質またはアミノ酸の配列を意味する。
【００２４】
本発明は、活性化した血小板が関与する疾患、例えば血栓症、具体的には血栓分解治療における心筋梗塞または発作の場合の血栓症、深静脈血栓症、肺塞栓症、血管損傷、アテローム性動脈硬化症性斑、化膿性感染症および腸虚血のイン・ビボでの検出および治療に特に好適である。
【００２５】
ＭＡｂＢＷ２１２８は、次のようにして調製することができる。
【００２６】
ヒトＴＳＰは、Dixit, V.M., Harverstick, D.M., O´Rourke, K.M., Hennessy, S.W., Grant, G.A., Santoro, S.A., Frazier, W.A. (1985), Biochemistry, 24, 4270-4275 に記載の方法によって活性化したヒト血小板から単離し、既知の方法によってＢａｌｂ／ｃマウスを免疫するのに用いた（Bosslet, K., Lueben, G., Schwarz, A., Hundt, E., Harthus, H.P., Seiler, F.R., Muhrer, C., Kloeppel, G., Kayser, K., Sedlacek, H.H. (1985), Int. J. Cancer, 36, 75-84）。（このＴＳＰ調製物は、他の血小板タンパク質が混入することがある。）生成するハイブリドーマの上澄液を、間接ＡＰＡＡＰ法を用いて低温保存したヒト組織についての特異性について検討を行った（Cordell, J.L., Falini, B., Erber, W.N.ら、(1984), J. Histochem. Cytochem., 32, 219）。通常は、これらの上澄液は、活性化したヒト血小板、肝臓の管上皮、腎臓の血管、肺上皮、脾臓および骨髄（巨核球）と反応した。それ故、これらは文献既知のＴＳＰ特異性を示した。しかしながら、意外なことには、活性化したヒト血小板と特異的に反応するが前記の正常な組織とは反応しない上澄液も見出された。引用文献には活性化したヒト血小板に特異的なＭＡｂを示唆する証拠はないので、この結果は極めて驚くべきことであった。このＭＡｂを分泌するハイブリドーマ細胞を限定希釈法によって３回クローニングを行い、液体窒素で凍結した（ハイブリドーマ細胞２１２８）。特異性の詳細な免疫組織化学的分析を表３（第ＩＩ表）に示す。ＡＰＡＡＰ法（Cordell ら、上記）を用いて示された血小板に対するその高い特異性を上回って、ＭＡｂＢＷ２１２８は活性化されていない血小板とよりもトロンビンで活性化した血小板と１０倍以上強く反応する。血小板のホルムアルデヒド固定は、ＭＡｂの血小板への結合をごくわずか抑制するだけである。ＭＡｂを活性化されていないヒト血小板に加えると有意な活性化を生じるが、トロンビン０．５単位／mlを加えると活性化マーカー（ＰＦ４）が顕著に分泌されるようになる（表４（第ＩＩＩ表）。顆粒球上のエピトープに特異的なＭＡｂｓ（例えば、ＢＷ２５０）、またはマイコプラズマ上のエピトープに特異的なもの（例えば、ＢＷ２２７）およびＧＰＩａ／ＩＩａに特異的なもの（例えばＢＷ４）は、ＭＡｂＢＷ２１２８と同様に、休止している血小板の活性化に何んらの効果を示さない（K. Bossletら、(1988), 14, 523-528 ）。第ＩＩＩ表に記載した条件下で血小板をインキュベーションした後のＰＦ４の測定のためのＥＬＩＳＡ法は、Pelzer, H., Heimburger, N. (1986), J. Biomed. Mat. Res., 20, 1401-1409およびOsei-Bonsu, A., Cafourek, G., Reiter, S., Popovic, R., Sinzinger, H. (1987), Wiener klin. Wschr., 99, 595-600 に記載されている。これらの特性により、ＭＡｂＢＷ２１２８は、Dixit, V.M., Haverstick, D.M., O´Rourke, K.M., Hennessy, S.W., Grant, G.A., Santoro, S.A., Frazier, W.A. (1985), Biochemistry, 24, 4270-4275によって得られる抗−ＴＳＰＭＡｂｓ、およびHayward, C.P.M., Warkentin, T.E., Horsewood, P., Kelton, J.G. (1991), Blood, 77, 2556-2560によって記載されている抗−マルチメリンＭＡｂＪＳ−１と識別されるが、これらのＭＡｂｓは前記の生物学的特性に影響を与える。免疫沈澱とウェスターンブロットにより、ＭＡｂＢＷ２１２８によって認識される血小板抗原はｇｐ１４０、フォン・ビレブランド因子、フィブロネクチンおよびフィブリノーゲンと同一ではないことを示すことが可能であった。
【００２７】
更に、ＴＳＰ上の３種類の独立の非交差反応性エピトープに選択的なＭＡｂｓ（ＭＡｂＢＷ２１２５／８，ＢＷ２１２６／３３２，ＢＷ２１２６／６６２；エピトープマッピングはHammarstroemら、Cancer Res., 49, 4852-4858, 1989にしたがって行った）を用いて、これらのＭＡｂが精製したＴＳＰに強力に結合するが、標準的な固相ＥＬＩＳＡ法並びに非還元条件下でのウェスターンブロット分析で明らかにされたようにＭＡｂＢＷ２１２８によって認識される血小板抗原には結合しないことを示すことができた。これらの実験は、ＭＡｂＢＷ２１２８によって画定される血小板抗原は、前記の抗ＴＳＰＭＡｂによって検出された３種類のエピトープをＴＳＰと共有しないことを示している。更に、２Ｄゲル電気泳動（O´Farrell, P.H. (1975), J. Biol. Chem., 250, 4007-4021）によって、還元条件下では分子量がＴＳＰより小さく且つ相対分子質量が約１５０，０００〜１７０，０００、好ましくは約１６０，０００であるが、ＴＳＰと同様な等電点を有しており、実験誤差の限界内では識別がつかず、好ましくは約５．５〜６．５の範囲にある（比較実験でのＴＳＰの分子量は１８０ｋＤａであり、等電点は５．５〜６．５であった）ことを示すことも可能であった。この新規な抗原はＴＳＰと結合しており、物理的および化学的結合の両方が可能であり、活性化した血小板上で優先的に発現されるので、一般的に血小板抗原と呼ばれる。この抗原は、好ましくは第ＩＩ表に詳細に示されている組織分布も示す。
【００２８】
この抗原は、例えば、好ましくはＭＡｂＢＷ２１２８の助けを借りて免疫アフィニティクロマトグラフィによって単離することができ、ＭＡｂＢＷ２１２８または免疫学的に反応性を有するその部分と同等な抗体を調製し、チェックし、模倣体を調製するのに特に好適である。
【００２９】
本発明による抗体は、ＭＡｂＢＷ２１２８のようなＩｇＧ１イソタイプであるときには、放射性同位元素、特にＴｃ−９９ｍで標識することができる（Schwarz, A., Steinstraesseer, A. (1987), J. Nucl. Med., 28, 721 ）。もう一つの可能性は、常磁性化合物での標識である。したがって、本発明による抗体および模倣体は、血管閉塞のイムノシンチグラフィによる可視化に特に好適である。
【００３０】
ハイブリドーマ２１２８は、ブダペスト条約により寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２０２４でＤＳＭ（ドイチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルテューレン・ゲーエムベーハー(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) ）（マチャーローダー・ヴェク１Ｂ、３３００、ブラウンシュバイク）に寄託した。また、ＭＡｂＢＷ２１２８の重鎖および軽鎖のＶ遺伝子を、Orlandi, R., Guessow, D., Jones, P.T., Winter, G. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86, 3833-3837 に記載の方法によって単離し、Ｖ遺伝子エキソンの本質的領域の核酸配列をSanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R., (1977), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467に記載の方法によって決定した（第Ｉａ，ｂ表）。クローニングしたＶ遺伝子をＢＨＫ細胞中のヒトの切り詰めたＩｇＧ３Ｆｃ部分（ＩｇＧ３Δ）およびヒトのＣカッパーを有するキメラＭＡｂｓＢＷＣｈｉ２１２８として発現させ、クローニングしたＶ遺伝子の同一性を確かめた（例Ａ〜Ｎ）。
【００３１】
発現したＢＷＣｈｉ２１２８ＭＡｂはマウスＭＡｂと同じ抗原結合特異性を示した。更に、例えばＣＤＲまたは部分或いは数種類の画定されたＣＤＲのポリペプチド合成の後にｍｒｕ（最少認識単位）を決定して、低い免疫原性の特異的ペプチドとして用いて、活性化した血小板のイン・ビボでの局在化を行うことも可能であった。更に、Saragovi, H.U., Fitzpatrick, D., Raktabutr, A., Nakanishi, H., Kahn, M., Greene, M.I. (1991), Science, 253,792-795に記載の方法による有機化学合成によって、ＭＡｂＢＷ２１２８によって画定されるエピトープに対する特異性と結合活性が高い模倣体を生成させることも可能である。ＭＡｂＢＷ２１２８のヒューマナイズドＶ領域は、組換えによって例えばストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよびｔＰＡ、特にｔＰＡ変異体のような線維素溶解タンパク質をコードするヌクレオチド配列に結合させることができる。好ましいｔＰＡ変異体は、例えばＥＰ−Ａ１−０３８７３８０号明細書に記載の方法で調製することができる。これらの構造は、ドイツ国特許出願第Ｐ４１０６３８９．９にヒューマナイズドαＣＥＡＭＡｂおよびヒトβ−グルクロニダーゼの例によって示されているように、ＤＮＡの水準で連結して、機能性融合タンパク質として発現することができる。一般的には、前記の融合タンパク質は、血管閉塞における活性化した血小板の特異的な高親和性結合領域と同じ分子における機能的に活性な領域とを合せ持つので、副作用の少ない効率的な線維素溶解剤である（Haber, E., Quertermous, Th., Matsueda, G.R., Runge, M.S., Bode, Ch. (1989), Jap. Circulation J., 54, 345-353）。
【００３２】
【実施例】
例Ａ
ヒトＩｇＧ３Ｃ遺伝子（ＤＥ３８２５６１５Ａ１号明細書、図２）を含むプラスミドクローン５４．１．２４をＰｓｔＩで開裂した。これから生成するベクターを、生成するＰｓｔＩインサートの最も大きいものに連結し、細菌中に形質転換した。ヒトＩｇＧ３Ｃ遺伝子を含みＨ１、Ｈ２およびＨ３エキソンを欠失しているプラスミドクローンＡ（図２）を、制限分析および核酸配列決定によって同定した。
【００３３】
例Ｂ
プラスミドクローンＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで開裂し、両端をクレノウポリメラーゼで充填し、ＩｇＧ３インサートを単離し、ＳｓｔＩで開裂してＴ４ポリメラーゼによってブラント末端を備えたｐＵＣ１９ベクターに連結した。ＨｉｎｄＩＩＩ開裂部位が５′末端に位置し且つＥｃｏＲＩ開裂部位がｐＵＣ１９ポリリンカーの３′末端に位置するようにＩｇＧ３遺伝子が配向しているプラスミドクローンＢを、制限マッピングおよび核酸配列分析によって同定した（図３）。
【００３４】
例Ｃ
プラスミドクローンＢをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、ＩｇＧ３インサートを単離して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで開裂したのと同様にＫＳ＋プラスミドベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋；ストラタジーン(Stratagene)、ラ・ジョラ、カリフォルニア州）に連結した。ＩｇＧ３遺伝子が５′および３′末端においてＢａｍＨＩ開裂部位を有するプラスミドクローンＣを単離した（図４）。
【００３５】
例Ｄ
プラスミドクローンＣをＢａｍＨＩで開裂し、ＩｇＧ３インサートを単離して、ＢａｍＨＩで開裂した場合と同様に発現ベクターｐＡＢＳｔｏｐ（Wirth ら、上記）に連結した。式に示される配向のＩｇＧ３Ｃ遺伝子を含む発現プラスミドＤを同定した。このクローニング段階では、ｐＡＢＳｔｏｐベクターはＳＶ４０停止および２つのＢａｍＨＩ開裂部位の間に位置したポリアデニル化信号を喪失する（図５）。
【００３６】
例Ｅ
発現プラスミドＤをＢａｍＨＩで部分開裂し、両端をクレノウポリメラーゼで充填して再連結した。ＩｇＧ３遺伝子からのＢａｍＨＩ開裂部位３′が破壊されている発現プラスミドＥを単離した（図６）。
【００３７】
例Ｆ
ヒトＣカッパー遺伝子（Hieter, P.A., Mainzel, J.V.,Jr., Leder, P. (1982), J. Biol. Chem., 257, 1516-1522 ）を、ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＢＲ３２２中にクローニングした。ｐＢＲ３２２ベクターをＥｃｏＲＩで開裂し、ＥｃｏＲＩ開裂部位を充填し、Ｃカッパーインサートを単離して、ＳｍａＩで開裂したｐＵＣ１９ベクターに連結した。Ｃカッパー遺伝子が、５′末端におけるＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ開裂部位および３′末端におけるＥｃｏＲＩ開裂部位を有しているプラスミドクローンＦを単離した（図７）。
【００３８】
例Ｇ
プラスミドクローンＦをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで開裂し、Ｃカッパーインサートを単離して、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで開裂したＫＳ＋中にクローニングした。Ｃカッパーインサートが５′および３′末端におけるＢａｍＨＩ開裂部位を有しているプラスミドクローンＧを単離した（図８）。
【００３９】
例Ｈ
プラスミドクローンＧをＢａｍＨＩで開裂し、Ｃカッパーインサートを単離して、ＢａｍＨＩで開裂したｐＡＢ停止ベクター中にクローニングした。ｐＡＢ停止ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ開裂部位が５′末端に位置するようにＣカッパー遺伝子が配向されているクローンＨを制限マッピングおよび核酸配列分析によって同定した（図９）。
【００４０】
例Ｉ
クローンＨをＢａｍＨＩで部分開裂し、制限末端を充填して、再連結した。Ｃカッパー遺伝子のＢａｍＨＩ開裂部位３′が破壊されているクローンＩを、制限マッピングによって同定した（図１０）。
【００４１】
例Ｋ
ＭＡｂＢＷ２１２８のＶＨおよびＶＫ遺伝子をOrlandi ら（上記）によって記載された方法により、ＰＣＲ法および特異的オリゴヌクレオチドを用いて増幅し、好適な制限開裂部位を有する関連のないＶＨおよびＶＫ遺伝子を含むＫＳ＋ベクター（Guessow, D. およびSeemann, G. (1992), 酵素学の方法(Methods in Enzymology) 、２０３巻、99〜121 頁）中にクローニングした。次いで、関連のないＶＨおよびＶＫ遺伝子がＭＡｂＢＷ２１２８のＶＨ（Ｋ１）およびＶＫ（Ｋ２）遺伝子によって置き換えられたクローンＫ１およびＫ２を単離した（図１１）
。
【００４２】
例Ｌ
ＭＡｂＢＷ２１２８のＶＨおよびＶＫ遺伝子の核酸配列を、Sangerの方法（PNAS, 74, 5463 (1977) ）によってクローンＫ１およびＫ２から決定した（第Ｉａ，ｂ表）。
【００４３】
例Ｍ
ＭＡｂＢＷ２１２８のＶＨおよびＶＫ遺伝子を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いてクローンＫ１およびＫ２から切断し、Ｖ遺伝子インサートを単離して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断した発現ベクターＤ（ＶＨ）およびＩ（ＶＫ）中にクローニングした。完全な免疫グロブリン重鎖遺伝子（Ｌ１）または軽鎖遺伝子（Ｌ２）を含む発現ベクターＬ１（図１２）およびＬ２（図１３）を単離した。
【００４４】
例Ｎ
発現ベクターＬ１およびＬ２を、ネオマイシン耐性を付与するベクターｐＲ１１Ｈ１４０（Hudziak, R.M., Laski, F.A., RajBhandary, U.L., Sharp, P.A., Capecchi, M.R. (1982), Cell, 31, 137-146）（図１４）およびジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子を有し、メトトレキセートに対する耐性を付与するベクターｐＳＶｄｈｆｒ（Lee, F., Mulligan, R., Berg, P., Ringold, G. (1981), Nature, 294, 228-232 ）（図１５）と共に、ＢＨＫ細胞（Zettlmeissl, G., Wirth, M., Hauser, H., Kuepper, H.A. (1988), Behring Inst. Mitt., 82, 26-34）中にトランスフェクションを行い、発現した抗体を抗原結合特性について検討して、ＭＡｂＢＷ２１２８のＶＨおよびＶＫ遺伝子の同一性を確かめた。
【００４５】
例Ｏ
本発明による抗体の特異性の免疫組織化学的分析を、ＡＰＡＡＰ法（Cordell ら、上記）によって行った。第ＩＩ表は、ＭＡｂＢＷ２１２８の特異性の免疫組織化学的分析の結果を示している。
【００４６】
例Ｐ
血小板の活性化は、H. Pelzer およびN. Heimburger （上記）によって記載されたＥＬＩＳＡにより活性化マーカーＰＦ４の定量によって測定することができる。第ＩＩＩ表は、血小板の活性化に対するＭＡｂＢＷ２１２８の効果を示している。
【表１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】種々の抗体を図式的に表現した説明図。
図１ａは抗体、組換え抗体、抗体フラグメントおよび遺伝子操作によって連結した抗体抱合体を図式的に表現したものである。
図１ｂは抗体抱合体を模式的に表現したものであり、二特異性抗体の各種の抗原結合特異性が、Ｖ領域を異なった陰影を付けることによって明らかになっている。オリゴ特異性高分子の場合には、それぞれの場合に、ＣH1ドメインはポリペプチドリンカーを介して次の、軽鎖が結合しているＶＨドメインに連結している。抗体／酵素抱合体の酵素は点で表わしている。
【図２】プラスミドクローンＡを示す説明図。
【図３】プラスミドクローンＢを示す説明図。
【図４】プラスミドクローンＣを示す説明図。
【図５】プラスミドクローンＤを示す説明図。
【図６】発現プラスミドＥを示す説明図。
【図７】プラスミドクローンＦを示す説明図。
【図８】プラスミドクローンＧを示す説明図。
【図９】クローンＨを示す説明図。
【図１０】クローンＩを示す説明図。
【図１１】クローンＫ１およびＫ２を示す説明図。
【図１２】発現ベクターＬ１を示す説明図。
【図１３】発現ベクターＬ１３を示す説明図。
【図１４】発現ベクターＬ１およびＬ２をベクターｐＲ１１Ｈ１４０と共にＢＨＫ細胞へトランスフェクションした後の遺伝子の分析を示す説明図。
【図１５】発現ベクターＬ１およびＬ２をベクターｐＳＶｄｈｆｒと共にＢＨＫ細胞へトランスフェクションした後の遺伝子の分析を示す説明図。
本発明は、活性なヒト血小板に優先的に結合する単クローン性抗体および部分、単クローン性抗体ＭＡｂＢＷ２１２８の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、およびトロンボスポンジンと結合した抗原に関する。
ハイブリドーマ技術により、画定したまたは未画定の抗原上の任意の所望なエピトープに対し、選択的な単クローン性抗体（ＭＡｂｓ）を作成することが可能になっている。これに用いることができる免疫原は、高純度の画定された抗原或いは抗原混合物、細胞または組織であり、選択性の高いＭＡｂｓを見出すためには、好適な免疫原を見出すことも必要である。この技術を用いることにより、静脈注射の後に、例えば人体の腫瘍、炎症工程および血管閉塞に結合することができるＭＡｂｓを開発することが可能になってきている。ＭＡｂｓの対応する標的構造（腫瘍、炎症工程、血管閉塞）へのこの優先的な結合は、核医学診断において既に用いられている。標的構造を検出するための放射能標識したＭＡｂｓの注射を扱う具体的な核医学的方法は、イムノシンチグラフィである（Mach, J.P., Buchegger, F., Forni, M., Ritschard, J., Berche, C., Lumbraso, J.-O., Schreyer, M., Girardet, C., Accolla, R.C., Carrel, S., (1981), Immunology today, 2, 239-249 ）。現在のところ、血小板に選択的に結合し、他の正常なヒトの組織には本質的に結合しないＭＡｂｓは、これには利用されていない。しかしながら、血小板のα−顆粒タンパク質に向けられ且つ実際に活性化した血小板に優先的に結合するＭＡｂｓでも、他の組織上のエピトープへのはっきりした結合を示す。例えば、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）、すなわちα−顆粒パク質（Baenziger, N.L., Brodie, G.N., Majerus, P.W. (1971), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 68, 240-243; Ganguly, P. (1971), J. Biol. Chem., 246, 4286-4290 ）に向けられるＭＡｂｓは、皮膚および肺の腺上皮、真皮と表皮との間の結合部（Wight, T.N., Raugi, G.J., Mumby, S.M., Bornstein, D. (1985), J. Histochem. Cytochem., 33, 295-302 ）、軟骨（Miller, R.R., McDevitt, C.A. (1988), Biochem. Biophys. Res. Commun., 153, 708-714 ）、脱灰した骨（Robey, P.G., Young, M.F., Fisher, L.W., McClain, T.D. (1989), J. Cell. Biol., 108, 719-727）、臍動脈（Fauvel-Lafeve, F., Legrand, Y.J. (1988), Thromb. Res., 50, 305-316）、タイプII肺胞細胞（Sage, H., Farin, F.M., Striker, G.E., Fisher, A.B. (1983), Biochemistry, 22, 2148-2155）、巨核球（Bechstead, J.H., Stenberg, P.E., McEver, R.P., Shuman, M.A., Bainton, D.P. (1986), Blood, 67, 285-293 ）、および増殖する内皮細胞、平滑筋および線維芽細胞（Mumby, S.M., Abbott-Brown, D., Raugi, G.J. Bornstein, P. (1984), J. Cell. Physiol., 120, 280-288; Jaffe, E.A., Ruggiero, J.T., Leung, L.K., Doyle, M.J., McKeown-Lango, P.J., Mosher, D.F. (1983), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80, 998-1002）のエピトープと反応する。上記の正常な組織との交差反応性があるため、既知の抗−ＴＳＰＭＡｂｓでイン・ビボでの血管閉塞を検出しようとするときには偽陽性信号が観察されるのが普通である。
【０００２】
Jaffe ら（上記文献）の方法によってαＴＳＰＭＡｂｓを調製する際に、本発明者らは意外にも、活性化した血小板に対する特異的ＭＡｂ（ＭＡｂ ＢＷ ２１２８）は、Towbin T. およびGordon J. （(1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-434）によって記載されたウェスターンブロットにおいて、ＴＳＰ、フォン・ヴィレブランド因子またはｇｐ１４０のような既知のα−顆粒タンパク質とも前記のような細胞または組織とも反応しないことを見出した。ＭＡｂは、ＴＳＰと結合した抗原を免疫沈澱させ、等電点は実験誤差の限界内ではＴＳＰとは識別できないが、還元条件下では約１６０ｋＤａのＴＳＰよりも明らかに小さな分子量を有する。
【０００３】
等電点の決定における実験誤差の限界は、約±１０〜１５％であり、特に約±５〜１０％である。
【０００４】
それ故、本発明は下記のものに関する。
【０００５】
ハイブリドーマ２１２８（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２０２４）。
【０００６】
ハイブリドーマ２１２８（ＤＳＭ ＡＣＣ２０２４）に由来する単クローン性抗体（ＢＷ２１２８）。
【０００７】
ハイブリドーマ２１２８の単クローン性抗体によって認識されるエピトープに結合する単クローン性抗体またはその部分。
【０００８】
活性化したヒト血小板に優先的に結合し、ハイブリドーマ２１２８の単クローン性抗体によって認識されるエピトープに結合する生物学的特性を有する表１（第Ｉａ表）および／または表２（第Ｉｂ表）に示されるアミノ酸配列またはそれらの任意の対立形質変種（allelic variant ）または変異体（mutant）を含む単クローン性抗体またはその部分。
【０００９】
優先的結合とは、本発明の目的では、活性化した血小板上で見出されるＢＷ２１２８によって認識されるエピトープは活性化されていない血小板上で見出されるものの３〜１０００倍、特に１０〜１００倍であることを意味する。
【００１０】
本発明は、キメラ、ヒューマナイズド(humanized) 、二−またはオリゴ特異性抗体である単クローン性抗体またはその部分にも関する。特に、例えば図１（ａおよびｂ）に示されるように、ｍｒｕフラグメント、単一ドメインフラグメント、一本鎖フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメントまたは１または２以上のヒンジ領域を有するＦ（ａｂ′）２フラグメントがその中に含まれる。
【００１１】
ヒューマナイズド抗体が、特に好ましいその例である。
【００１２】
ｍｒｕ（最少認識単位）は、ＣＤＲ（相補性決定領域）から誘導され、特異的ＭＡｂによって認識されるエピトープに結合する特性を有するポリペプチドである。
【００１３】
本発明は、単クローン性抗体ＢＷ２１２８によって認識されるエピトープに結合する模倣（mimetic ）体にも関する。ＢＷ２１２８によって画定されたエピトープに結合する高い可能性を有する小さな有機化合物が模倣体として好適である。
【００１４】
本発明は、一般的には、単クローン性抗体ＢＷ２１２８によって認識されるエピトープに結合する生物学的特性を有する図１（ａ）および／または図１（ｂ）に示されるアミノ酸配列、またはそれらの任意の対立形質変種若しくは変異体を含むポリペプチドに関する。
【００１５】
本発明による単クローン性抗体またはその部分、或いは本発明による模倣体を、本発明による免疫グロブリン部分および免疫グロブリン類に属さない部分を含む融合タンパク質として用いるのが特に有用である。
【００１６】
免疫グロブリン類に属さないタンパク質は、特に線維素溶解タンパク質またはその部分、例えば線維素溶解タンパク質ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体またはその部分である。
【００１７】
これには、ベクター、特に発現ベクターＬ１およびＬ２、および好適な宿主細胞、特にＣＯＳ、ＣＨＯまたはＢＨＫ細胞、好ましくはＢＨＫ細胞が挙げられる。
【００１８】
本発明は、単クローン性抗体ＢＷ２１２８によって認識されるエピトープに結合する生物学的特性を有するポリペプチドをコードする１または２種類以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドにも関する。これらには、特に表１（第Ｉａ表）および表２（第Ｉｂ表）に示されるような核酸、その縮重コドンおよび周知のハイブリダイゼーション条件下で表１（第Ｉａ表）および表２（第Ｉｂ表）に示されるような核酸とハイブリダイズする核酸が挙げられる。好ましいハイブリダイゼーション条件は、Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1982), 分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory) ；Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989), 第２版、分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press) に説明されているような緊縮（stringent ）条件である。
【００１９】
本発明は、更に、本発明によるポリペプチドの製造法であって、本発明によるポリヌクレオチドにより原核または真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションし、宿主細胞が前記のポリペプチドを発現するようにすることを特徴とする方法にも関する。次に、このポリペプチドを、当業者に既知の方法によって培養物から単離することができる。
【００２０】
本発明は、更に、抗原または免疫学的に反応性のあるその部分であって、本発明による抗体の一つによって、特にＭＡｂＢＷ２１２８によって特異的に認識されるものにも関する。
【００２１】
遺伝子操作の一般的方法は当業者に知られており、特に断らないかぎり、例えば分子クローニング：実験室マニュアル、Sambrookら（上記）から引用することができる。
【００２２】
しかしながら、本発明によるポリペプチドは、当業者に既知のペプチド合成の方法によって化学的に調製することもできる。
【００２３】
ポリペプチドとは、本発明にとっては、空間配置および翻訳後の修飾、例えばグリコシル化またはホスホリル化を含むタンパク質またはアミノ酸の配列を意味する。
【００２４】
本発明は、活性化した血小板が関与する疾患、例えば血栓症、具体的には血栓分解治療における心筋梗塞または発作の場合の血栓症、深静脈血栓症、肺塞栓症、血管損傷、アテローム性動脈硬化症性斑、化膿性感染症および腸虚血のイン・ビボでの検出および治療に特に好適である。
【００２５】
ＭＡｂＢＷ２１２８は、次のようにして調製することができる。
【００２６】
ヒトＴＳＰは、Dixit, V.M., Harverstick, D.M., O´Rourke, K.M., Hennessy, S.W., Grant, G.A., Santoro, S.A., Frazier, W.A. (1985), Biochemistry, 24, 4270-4275 に記載の方法によって活性化したヒト血小板から単離し、既知の方法によってＢａｌｂ／ｃマウスを免疫するのに用いた（Bosslet, K., Lueben, G., Schwarz, A., Hundt, E., Harthus, H.P., Seiler, F.R., Muhrer, C., Kloeppel, G., Kayser, K., Sedlacek, H.H. (1985), Int. J. Cancer, 36, 75-84）。（このＴＳＰ調製物は、他の血小板タンパク質が混入することがある。）生成するハイブリドーマの上澄液を、間接ＡＰＡＡＰ法を用いて低温保存したヒト組織についての特異性について検討を行った（Cordell, J.L., Falini, B., Erber, W.N.ら、(1984), J. Histochem. Cytochem., 32, 219）。通常は、これらの上澄液は、活性化したヒト血小板、肝臓の管上皮、腎臓の血管、肺上皮、脾臓および骨髄（巨核球）と反応した。それ故、これらは文献既知のＴＳＰ特異性を示した。しかしながら、意外なことには、活性化したヒト血小板と特異的に反応するが前記の正常な組織とは反応しない上澄液も見出された。引用文献には活性化したヒト血小板に特異的なＭＡｂを示唆する証拠はないので、この結果は極めて驚くべきことであった。このＭＡｂを分泌するハイブリドーマ細胞を限定希釈法によって３回クローニングを行い、液体窒素で凍結した（ハイブリドーマ細胞２１２８）。特異性の詳細な免疫組織化学的分析を表３（第ＩＩ表）に示す。ＡＰＡＡＰ法（Cordell ら、上記）を用いて示された血小板に対するその高い特異性を上回って、ＭＡｂＢＷ２１２８は活性化されていない血小板とよりもトロンビンで活性化した血小板と１０倍以上強く反応する。血小板のホルムアルデヒド固定は、ＭＡｂの血小板への結合をごくわずか抑制するだけである。ＭＡｂを活性化されていないヒト血小板に加えると有意な活性化を生じるが、トロンビン０．５単位／mlを加えると活性化マーカー（ＰＦ４）が顕著に分泌されるようになる（表４（第ＩＩＩ表）。顆粒球上のエピトープに特異的なＭＡｂｓ（例えば、ＢＷ２５０）、またはマイコプラズマ上のエピトープに特異的なもの（例えば、ＢＷ２２７）およびＧＰＩａ／ＩＩａに特異的なもの（例えばＢＷ４）は、ＭＡｂＢＷ２１２８と同様に、休止している血小板の活性化に何んらの効果を示さない（K. Bossletら、(1988), 14, 523-528 ）。第ＩＩＩ表に記載した条件下で血小板をインキュベーションした後のＰＦ４の測定のためのＥＬＩＳＡ法は、Pelzer, H., Heimburger, N. (1986), J. Biomed. Mat. Res., 20, 1401-1409およびOsei-Bonsu, A., Cafourek, G., Reiter, S., Popovic, R., Sinzinger, H. (1987), Wiener klin. Wschr., 99, 595-600 に記載されている。これらの特性により、ＭＡｂＢＷ２１２８は、Dixit, V.M., Haverstick, D.M., O´Rourke, K.M., Hennessy, S.W., Grant, G.A., Santoro, S.A., Frazier, W.A. (1985), Biochemistry, 24, 4270-4275によって得られる抗−ＴＳＰＭＡｂｓ、およびHayward, C.P.M., Warkentin, T.E., Horsewood, P., Kelton, J.G. (1991), Blood, 77, 2556-2560によって記載されている抗−マルチメリンＭＡｂＪＳ−１と識別されるが、これらのＭＡｂｓは前記の生物学的特性に影響を与える。免疫沈澱とウェスターンブロットにより、ＭＡｂＢＷ２１２８によって認識される血小板抗原はｇｐ１４０、フォン・ビレブランド因子、フィブロネクチンおよびフィブリノーゲンと同一ではないことを示すことが可能であった。
【００２７】
更に、ＴＳＰ上の３種類の独立の非交差反応性エピトープに選択的なＭＡｂｓ（ＭＡｂＢＷ２１２５／８，ＢＷ２１２６／３３２，ＢＷ２１２６／６６２；エピトープマッピングはHammarstroemら、Cancer Res., 49, 4852-4858, 1989にしたがって行った）を用いて、これらのＭＡｂが精製したＴＳＰに強力に結合するが、標準的な固相ＥＬＩＳＡ法並びに非還元条件下でのウェスターンブロット分析で明らかにされたようにＭＡｂＢＷ２１２８によって認識される血小板抗原には結合しないことを示すことができた。これらの実験は、ＭＡｂＢＷ２１２８によって画定される血小板抗原は、前記の抗ＴＳＰＭＡｂによって検出された３種類のエピトープをＴＳＰと共有しないことを示している。更に、２Ｄゲル電気泳動（O´Farrell, P.H. (1975), J. Biol. Chem., 250, 4007-4021）によって、還元条件下では分子量がＴＳＰより小さく且つ相対分子質量が約１５０，０００〜１７０，０００、好ましくは約１６０，０００であるが、ＴＳＰと同様な等電点を有しており、実験誤差の限界内では識別がつかず、好ましくは約５．５〜６．５の範囲にある（比較実験でのＴＳＰの分子量は１８０ｋＤａであり、等電点は５．５〜６．５であった）ことを示すことも可能であった。この新規な抗原はＴＳＰと結合しており、物理的および化学的結合の両方が可能であり、活性化した血小板上で優先的に発現されるので、一般的に血小板抗原と呼ばれる。この抗原は、好ましくは第ＩＩ表に詳細に示されている組織分布も示す。
【００２８】
この抗原は、例えば、好ましくはＭＡｂＢＷ２１２８の助けを借りて免疫アフィニティクロマトグラフィによって単離することができ、ＭＡｂＢＷ２１２８または免疫学的に反応性を有するその部分と同等な抗体を調製し、チェックし、模倣体を調製するのに特に好適である。
【００２９】
本発明による抗体は、ＭＡｂＢＷ２１２８のようなＩｇＧ１イソタイプであるときには、放射性同位元素、特にＴｃ−９９ｍで標識することができる（Schwarz, A., Steinstraesseer, A. (1987), J. Nucl. Med., 28, 721 ）。もう一つの可能性は、常磁性化合物での標識である。したがって、本発明による抗体および模倣体は、血管閉塞のイムノシンチグラフィによる可視化に特に好適である。
【００３０】
ハイブリドーマ２１２８は、ブダペスト条約により寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２０２４でＤＳＭ（ドイチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルテューレン・ゲーエムベーハー(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) ）（マチャーローダー・ヴェク１Ｂ、３３００、ブラウンシュバイク）に寄託した。また、ＭＡｂＢＷ２１２８の重鎖および軽鎖のＶ遺伝子を、Orlandi, R., Guessow, D., Jones, P.T., Winter, G. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86, 3833-3837 に記載の方法によって単離し、Ｖ遺伝子エキソンの本質的領域の核酸配列をSanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R., (1977), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467に記載の方法によって決定した（第Ｉａ，ｂ表）。クローニングしたＶ遺伝子をＢＨＫ細胞中のヒトの切り詰めたＩｇＧ３Ｆｃ部分（ＩｇＧ３Δ）およびヒトのＣカッパーを有するキメラＭＡｂｓＢＷＣｈｉ２１２８として発現させ、クローニングしたＶ遺伝子の同一性を確かめた（例Ａ〜Ｎ）。
【００３１】
発現したＢＷＣｈｉ２１２８ＭＡｂはマウスＭＡｂと同じ抗原結合特異性を示した。更に、例えばＣＤＲまたは部分或いは数種類の画定されたＣＤＲのポリペプチド合成の後にｍｒｕ（最少認識単位）を決定して、低い免疫原性の特異的ペプチドとして用いて、活性化した血小板のイン・ビボでの局在化を行うことも可能であった。更に、Saragovi, H.U., Fitzpatrick, D., Raktabutr, A., Nakanishi, H., Kahn, M., Greene, M.I. (1991), Science, 253,792-795に記載の方法による有機化学合成によって、ＭＡｂＢＷ２１２８によって画定されるエピトープに対する特異性と結合活性が高い模倣体を生成させることも可能である。ＭＡｂＢＷ２１２８のヒューマナイズドＶ領域は、組換えによって例えばストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよびｔＰＡ、特にｔＰＡ変異体のような線維素溶解タンパク質をコードするヌクレオチド配列に結合させることができる。好ましいｔＰＡ変異体は、例えばＥＰ−Ａ１−０３８７３８０号明細書に記載の方法で調製することができる。これらの構造は、ドイツ国特許出願第Ｐ４１０６３８９．９にヒューマナイズドαＣＥＡＭＡｂおよびヒトβ−グルクロニダーゼの例によって示されているように、ＤＮＡの水準で連結して、機能性融合タンパク質として発現することができる。一般的には、前記の融合タンパク質は、血管閉塞における活性化した血小板の特異的な高親和性結合領域と同じ分子における機能的に活性な領域とを合せ持つので、副作用の少ない効率的な線維素溶解剤である（Haber, E., Quertermous, Th., Matsueda, G.R., Runge, M.S., Bode, Ch. (1989), Jap. Circulation J., 54, 345-353）。
【００３２】
【実施例】
例Ａ
ヒトＩｇＧ３Ｃ遺伝子（ＤＥ３８２５６１５Ａ１号明細書、図２）を含むプラスミドクローン５４．１．２４をＰｓｔＩで開裂した。これから生成するベクターを、生成するＰｓｔＩインサートの最も大きいものに連結し、細菌中に形質転換した。ヒトＩｇＧ３Ｃ遺伝子を含みＨ１、Ｈ２およびＨ３エキソンを欠失しているプラスミドクローンＡ（図２）を、制限分析および核酸配列決定によって同定した。
【００３３】
例Ｂ
プラスミドクローンＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで開裂し、両端をクレノウポリメラーゼで充填し、ＩｇＧ３インサートを単離し、ＳｓｔＩで開裂してＴ４ポリメラーゼによってブラント末端を備えたｐＵＣ１９ベクターに連結した。ＨｉｎｄＩＩＩ開裂部位が５′末端に位置し且つＥｃｏＲＩ開裂部位がｐＵＣ１９ポリリンカーの３′末端に位置するようにＩｇＧ３遺伝子が配向しているプラスミドクローンＢを、制限マッピングおよび核酸配列分析によって同定した（図３）。
【００３４】
例Ｃ
プラスミドクローンＢをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、ＩｇＧ３インサートを単離して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで開裂したのと同様にＫＳ＋プラスミドベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋；ストラタジーン(Stratagene)、ラ・ジョラ、カリフォルニア州）に連結した。ＩｇＧ３遺伝子が５′および３′末端においてＢａｍＨＩ開裂部位を有するプラスミドクローンＣを単離した（図４）。
【００３５】
例Ｄ
プラスミドクローンＣをＢａｍＨＩで開裂し、ＩｇＧ３インサートを単離して、ＢａｍＨＩで開裂した場合と同様に発現ベクターｐＡＢＳｔｏｐ（Wirth ら、上記）に連結した。式に示される配向のＩｇＧ３Ｃ遺伝子を含む発現プラスミドＤを同定した。このクローニング段階では、ｐＡＢＳｔｏｐベクターはＳＶ４０停止および２つのＢａｍＨＩ開裂部位の間に位置したポリアデニル化信号を喪失する（図５）。
【００３６】
例Ｅ
発現プラスミドＤをＢａｍＨＩで部分開裂し、両端をクレノウポリメラーゼで充填して再連結した。ＩｇＧ３遺伝子からのＢａｍＨＩ開裂部位３′が破壊されている発現プラスミドＥを単離した（図６）。
【００３７】
例Ｆ
ヒトＣカッパー遺伝子（Hieter, P.A., Mainzel, J.V.,Jr., Leder, P. (1982), J. Biol. Chem., 257, 1516-1522 ）を、ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＢＲ３２２中にクローニングした。ｐＢＲ３２２ベクターをＥｃｏＲＩで開裂し、ＥｃｏＲＩ開裂部位を充填し、Ｃカッパーインサートを単離して、ＳｍａＩで開裂したｐＵＣ１９ベクターに連結した。Ｃカッパー遺伝子が、５′末端におけるＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ開裂部位および３′末端におけるＥｃｏＲＩ開裂部位を有しているプラスミドクローンＦを単離した（図７）。
【００３８】
例Ｇ
プラスミドクローンＦをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで開裂し、Ｃカッパーインサートを単離して、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで開裂したＫＳ＋中にクローニングした。Ｃカッパーインサートが５′および３′末端におけるＢａｍＨＩ開裂部位を有しているプラスミドクローンＧを単離した（図８）。
【００３９】
例Ｈ
プラスミドクローンＧをＢａｍＨＩで開裂し、Ｃカッパーインサートを単離して、ＢａｍＨＩで開裂したｐＡＢ停止ベクター中にクローニングした。ｐＡＢ停止ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ開裂部位が５′末端に位置するようにＣカッパー遺伝子が配向されているクローンＨを制限マッピングおよび核酸配列分析によって同定した（図９）。
【００４０】
例Ｉ
クローンＨをＢａｍＨＩで部分開裂し、制限末端を充填して、再連結した。Ｃカッパー遺伝子のＢａｍＨＩ開裂部位３′が破壊されているクローンＩを、制限マッピングによって同定した（図１０）。
【００４１】
例Ｋ
ＭＡｂＢＷ２１２８のＶＨおよびＶＫ遺伝子をOrlandi ら（上記）によって記載された方法により、ＰＣＲ法および特異的オリゴヌクレオチドを用いて増幅し、好適な制限開裂部位を有する関連のないＶＨおよびＶＫ遺伝子を含むＫＳ＋ベクター（Guessow, D. およびSeemann, G. (1992), 酵素学の方法(Methods in Enzymology) 、２０３巻、99〜121 頁）中にクローニングした。次いで、関連のないＶＨおよびＶＫ遺伝子がＭＡｂＢＷ２１２８のＶＨ（Ｋ１）およびＶＫ（Ｋ２）遺伝子によって置き換えられたクローンＫ１およびＫ２を単離した（図１１）
。
【００４２】
例Ｌ
ＭＡｂＢＷ２１２８のＶＨおよびＶＫ遺伝子の核酸配列を、Sangerの方法（PNAS, 74, 5463 (1977) ）によってクローンＫ１およびＫ２から決定した（第Ｉａ，ｂ表）。
【００４３】
例Ｍ
ＭＡｂＢＷ２１２８のＶＨおよびＶＫ遺伝子を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いてクローンＫ１およびＫ２から切断し、Ｖ遺伝子インサートを単離して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断した発現ベクターＤ（ＶＨ）およびＩ（ＶＫ）中にクローニングした。完全な免疫グロブリン重鎖遺伝子（Ｌ１）または軽鎖遺伝子（Ｌ２）を含む発現ベクターＬ１（図１２）およびＬ２（図１３）を単離した。
【００４４】
例Ｎ
発現ベクターＬ１およびＬ２を、ネオマイシン耐性を付与するベクターｐＲ１１Ｈ１４０（Hudziak, R.M., Laski, F.A., RajBhandary, U.L., Sharp, P.A., Capecchi, M.R. (1982), Cell, 31, 137-146）（図１４）およびジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子を有し、メトトレキセートに対する耐性を付与するベクターｐＳＶｄｈｆｒ（Lee, F., Mulligan, R., Berg, P., Ringold, G. (1981), Nature, 294, 228-232 ）（図１５）と共に、ＢＨＫ細胞（Zettlmeissl, G., Wirth, M., Hauser, H., Kuepper, H.A. (1988), Behring Inst. Mitt., 82, 26-34）中にトランスフェクションを行い、発現した抗体を抗原結合特性について検討して、ＭＡｂＢＷ２１２８のＶＨおよびＶＫ遺伝子の同一性を確かめた。
【００４５】
例Ｏ
本発明による抗体の特異性の免疫組織化学的分析を、ＡＰＡＡＰ法（Cordell ら、上記）によって行った。第ＩＩ表は、ＭＡｂＢＷ２１２８の特異性の免疫組織化学的分析の結果を示している。
【００４６】
例Ｐ
血小板の活性化は、H. Pelzer およびN. Heimburger （上記）によって記載されたＥＬＩＳＡにより活性化マーカーＰＦ４の定量によって測定することができる。第ＩＩＩ表は、血小板の活性化に対するＭＡｂＢＷ２１２８の効果を示している。
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】種々の抗体を図式的に表現した説明図。
図１ａは抗体、組換え抗体、抗体フラグメントおよび遺伝子操作によって連結した抗体抱合体を図式的に表現したものである。
図１ｂは抗体抱合体を模式的に表現したものであり、二特異性抗体の各種の抗原結合特異性が、Ｖ領域を異なった陰影を付けることによって明らかになっている。オリゴ特異性高分子の場合には、それぞれの場合に、ＣH1ドメインはポリペプチドリンカーを介して次の、軽鎖が結合しているＶＨドメインに連結している。抗体／酵素抱合体の酵素は点で表わしている。
【図２】プラスミドクローンＡを示す説明図。
【図３】プラスミドクローンＢを示す説明図。
【図４】プラスミドクローンＣを示す説明図。
【図５】プラスミドクローンＤを示す説明図。
【図６】発現プラスミドＥを示す説明図。
【図７】プラスミドクローンＦを示す説明図。
【図８】プラスミドクローンＧを示す説明図。
【図９】クローンＨを示す説明図。
【図１０】クローンＩを示す説明図。
【図１１】クローンＫ１およびＫ２を示す説明図。
【図１２】発現ベクターＬ１を示す説明図。
【図１３】発現ベクターＬ１３を示す説明図。
【図１４】発現ベクターＬ１およびＬ２をベクターｐＲ１１Ｈ１４０と共にＢＨＫ細胞へトランスフェクションした後の遺伝子の分析を示す説明図。
【図１５】発現ベクターＬ１およびＬ２をベクターｐＳＶｄｈｆｒと共にＢＨＫ細胞へトランスフェクションした後の遺伝子の分析を示す説明図。
Claims (9)
- 寄託番号がＤＳＭ ＡＣＣ２０２４であって活性化ヒト血小板に特異性を有する単クローン性抗体を産生する、ハイブリドーマ２１２８。
- ハイブリドーマ２１２８（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２０２４）によって産生される、活性化ヒト血小板に特異性を有する単クローン性抗体。
- 請求項２に記載の単クローン性抗体によって認識されるエピトープに結合する単クローン性抗体、または上記エピトープに結合するその部分。
- 抗体がキメラ、ヒューマナイズド、二−またはオリゴ特異性抗体である、請求項３に記載の単クローン性抗体または上記エピトープに結合するその部分。
- 標識されている、請求項２〜４のいずれか１項に記載の単クローン性抗体。
- Ｔｃ−９９ｍで標識されている、請求項５に記載の単クローン性抗体。
- 請求項２に記載の単クローン性抗体またはその部分と、線維素溶解タンパク質から構成される融合タンパク質であって、線維素溶解タンパク質がストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ｔＰＡまたはｔＰＡ変異体である、融合タンパク質。
- 請求項２〜６のいずれか１項に記載の単クローン性抗体、または請求項７に記載の融合タンパク質を含む、検出試薬。
- 請求項２〜６のいずれか１項に記載の単クローン性抗体、または請求項７に記載の融合タンパク質の、活性化したヒト血小板を検出するための診断用助剤の製造への使用方法。
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