JP2009521503A - インターロイキン−２２結合タンパク質に対する抗体と、代謝性疾患の処置のためのその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、インターロイキン−２２結合タンパク質（特に、ヒトインターロイキン−２２結合タンパク質（ＩＬ−２２ ＢＰ））に結合する抗体および抗原結合断片に関し、インターロイキン−２２が関係している生物学的応答の調節に関する。本発明はまた、インターロイキン−２２が関係している疾患を処置するために抗体および抗原結合断片を使用する方法にも関する。本明細書中に開示される抗体は、肥満、糖尿病、脂質異常症、および高インシュリン血症等を含む代謝性疾患の診断、予防、または処置に有用である。

Description

技術分野
本発明は、一般にサイトカインのインターロイキン−２２に関する。具体的には、本発明は、インターロイキン−２２結合タンパク質に結合し、これを中和する抗体および抗原結合断片に関する。

発明の背景
インターロイキン−２２（ＩＬ−２２）またはＩＬ−ＴＩＦ（インターロイキン−１０関連Ｔ細胞由来誘導因子）は、ＩＬ−１０に構造的に関係しているサイトカインであり、これは、マウスＴリンパ球の中でＩＬ−９によって誘導される遺伝子の産物として最初に同定された（Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ，Ｌ．ら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：１０１４４）。インビトロでは、ＩＬ−２２の発現は、ＩＬ−９、抗ＣＤ３ Ａｂｓ、またはコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）で刺激されたＴヘルパー細胞の中、およびＩＬ−９で刺激された肥満細胞の中で見られる。インビボでは、ＩＬ−２２の産生は、抗ＣＤ３およびリポ多糖（ＬＰＳ）が投与された脾臓細胞の中で明らかになっている。ＩＬ−２２の生物学的役割は、炎症プロセス、および多数の代謝性疾患（例えば、肥満、糖尿病、脂質異常症、および高インシュリン血症）に関与していると考えられている。

ＩＬ−２２は、その標的細胞上でその特異的受容体複合体を活性化させる。ＩＬ−２２受容体複合体は２つの鎖から構成されている。一方の鎖であるＩＬ−２２ＲＡは、ＩＬ−２２結合に特異的である。他方の鎖であるＩＬ−１０Ｒβは、ＩＬ−１０と共有されている。ＩＬ−１０ＲβはＣＲＦ２−４とも呼ばれ、ＩＬ−１０のシグナル伝達に必要である。ＩＬ−２２ＲＡはＣＲＦ２−９とも記載され、これは特許データベースにおいてＺＣＹＴＯＲ１１と呼ばれているオーファン受容体であり、Ｘｉｅら（２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３１３３５）によってＩＬ−２２Ｒと改名するよう提案された。ＩＬ−２２受容体の鎖はいずれも、クラスＩＩサイトカイン受容体ファミリーに属する。

ヒトにおいて、ＩＬ−２２についての遺伝的に異なる可溶性受容体が最近同定された。この可溶性受容体は４０ｋＤａの大きさであり、２１０アミノ酸（ａａ）の長さである。これは、可溶性ＩＬ−２２ Ｒ／ＣＲＦ２−１０と命名されており、ＩＬ−２２受容体−α２またはＩＬ−２２結合タンパク質（ＩＬ−２２ＢＰ）とも呼ばれている。２つの選択的スプライシング型が、標準的な２１０ａａの形態に加えて報告されている。１つのスプライシング型は短縮型であり、１３１ａａの長さを有する。第２のスプライシング型は２４２ａａの成熟分子である。長い形態は胎盤で見られ、ＩＬ−２２およびＩＬ−２０活性の両方を調節することができる。標準的な形態の２１０ａａのＩＬ−２２結合タンパク質は、ＩＬ−２２活性のアンタゴニストであることが示されている。ＩＬ−２２ＢＰは、ＩＬ−２２に結合して、ＩＬ−２２受容体サブユニットを発現するＢａＦ３細胞の中で明らかにされているＩＬ−２２の生体活性（Ｘｕら、ＰＮＡＳ、２００１、第９８巻：９５１１−９５１６）、ＩＬ−２２応答性のヒト肺ガンＡ５４９細胞の中でのＳＴＡＴ活性化、ＨｅｐＧ２細胞の中でのサイトカインのシグナリング−３（ＳＯＣＳ−３）の発現のサプレッサの誘導（Ｋｏｔｅｎｋｏら、ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００１ 第１６６巻：７０９６−７１０３）を中和することができる。

発明の要旨
本発明により、ヒトの生体活性に特異的に結合してこれをブロックする抗体、特に、単離されたヒト化抗体、または単離されたヒト抗体もしくはその生物学的に活性な部分が提供される（ＩＬ−２２ＢＰ）。

１つの態様においては、本発明の抗体はＩＬ−２２ＢＰに結合し、ヒトＩＬ−２２とＩＬ−２２ＢＰとの間での相互作用を調節する。そのような調節によって、ＩＬ−２２のＩＬ−２２ＢＰとの相互作用がブロックされ、それにより、ＩＬ−２２受容体複合体に結合することができる遊離のＩＬ−２２分子のレベルが高まり、ＩＬ−２２に対する標的組織または細胞の生物学的応答の増強がもたらされた。

１つの実施形態において、本発明の抗体はポリクローナルであり、ＩＬ−２２とＩＬ−２２ＢＰとの間での相互作用を特異的に阻害する。別の実施形態においては、本発明の抗体はモノクローナルであり、ＩＬ−２２とＩＬ−２２ＢＰとの間での相互作用を特異的に阻害する。

最も好ましい実施形態においては、本発明の抗体は単離された抗体またはその生物学的に活性な部分であり、これは、ＩＬ−２２結合タンパク質もしくは配列番号２、３、および４に示されるようなその変異体に結合して、その生体活性を中和することができる。

別の態様においては、本発明は、治療有効量の抗ＩＬ−２２結合タンパク質抗体を投与する工程を含む、代謝性疾患の処置方法である。

さらに別の態様においては、本発明は、単離され精製された抗体を含む薬学的組成物に関する。本発明はまた、単離され精製された抗体から本質的に構成されている薬学的組成物にも関する。

好ましい実施形態の詳細な説明
本明細書中および特許請求の範囲で使用される場合には、用語「ヒト化抗体」は、５０％を超えるヒトペプチド配列、好ましくは７０％を超える、最も好ましくは９０％を超えるヒトペプチド配列から構成されており、ヒトに治療有効量で注射されると最小の抗原性を生じるヒト抗体として定義される。本発明の好ましい実施形態は、特異的なペプチド結合ドメインとヒトＦｃ領域とを有しているヒト抗体およびペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）である。しかし、本発明には、ＩＬ−２２ＢＰに結合することができ、一方で、ＩＬ−２２ＢＰのＩＬ−２２との相互作用をブロックすることもできる任意のタンパク質が含まれ得る。そのようなタンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗原結合断片、またはヒトＦｃ領域を有している任意のペプチドなどであり得るが、これらに限定されない。

Ｆｃドメインを有しているランダムに作成されたペプチドは「ペプチボディ」として知られている。Ｆｅｉｇｅらに２００３年１２月９日に発行された米国特許第６，６６０，８４３号（その全体が引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。これらには、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸側鎖に対して、またはこれらの部位の２つ以上に対して連結した１つ以上のペプチドが含まれる。ペプチボディ技術により、１つ以上のリガンドまたは受容体、腫瘍ホーミングペプチド、膜輸送ペプチドなどをターゲッティングするペプチドが取り込まれている治療薬を設計することが可能である。ペプチボディ技術は、多数のそのような分子の設計において有用であることが証明されており、これには、直鎖ペプ
チドおよびジスルフィドによって拘束されているペプチド、「タンデムなペプチド多量体」（すなわち、Ｆｃドメインの一本鎖の上の２つ以上のペプチド）が含まれる。例えば、米国特許第６，６６０，８４３号；２００３年１０月１５日に公開された米国特許出願番号２００３／０１９５１５６（２００２年１１月２１日に公開されたＷＯ０２／０９２６２０に対応する）；２００３年９月１８日に公開された米国特許出願番号２００３／０１７６３５２（２００３年４月１７日に公開されたＷＯ０３／０３１５８９に対応する）；１９９９年１０月２２日に公開された米国整理番号０９／４２２，８３８（２０００年５月４日に公開されたＷＯ００／２４７７０に対応する）；２００３年１２月１１日に公開された米国特許出願番号２００３／０２２９０２３、２００３年７月１７日に公開されたＷＯ０３／０５７１３４；２００３年９月１８日に提出された米国特許出願番号１０／６６６，４８０（２００４年４月１日に公開されたＷＯ０４／０２６３２９に対応する）（これらのそれぞれが、全体において引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。

以下の実施例では、本発明の抗体の産生が教示され、そのような抗体の有効性が明らかにされる。引用される全ての参考文献は、その全体が本明細書中に取り込まれる。

実施例
１．マウスＩＬ−２２結合タンパク質（ＩＬ−２２ＢＰ）遺伝子のクローニング
マウスＩＬ−２２結合タンパク質遺伝子（図１、ヌクレオチド配列、配列番号１）のクローニングには、Ｗｅｉｓｓ，Ｂ．ら，（Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ．５：３３０−３３６、２００４、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＪ５５５４８４）に記載されているものに類似するプロトコールを使用した。簡単に説明すると、マウスの脾臓から全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）を使用して抽出した。全長のマウスＩＬ−２２ＢＰ ｃＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキットを使用してクローニングした。ＰＣＲ増幅には、遺伝子特異的プライマー５’−ａｔｇ ａｔｇ ｃｃｔ ａａｇ ｃａｔ ｔｇｃ ｃｔｔ ｃ−３’（配列番号５）および５’−ｔｃａ ｇａｃ ｃｔｔ ｃａａ ｔｔｔ ｃａａ ｃａｇ ｃｔｃ−３’（配列番号６）を使用した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにクローニングし、配列分析によって確認した。

ｍＩＬ−２２ＢＰ ｃＤＮＡの２つのサブクローンを、鋳型として全長ｃＤＮＡを使用して作成した。第１のクローンであるｍＩＬ−２２ＢＰαにはアミノ酸３２から１３３が含まれており、推定のシグナル配列は含まれていなかった（図２）。第２のクローンであるｍＩＬ−２２ＢＰβには、アミノ酸１４０から２１０が含まれていた（図３）。全長のマウスＩＬ−２２ＢＰとサブクローンの配列比較を図４に示す。ｍＩＬ−２２ＢＰα配列を、ＰＣＲプライマー５’−ｃｇｇ ｇｇｔ ａｃｃ ａａｇ ｇｔｃ ｃｇａ ｔｔｔ
ｃａｇ ｔｃｃ ａ−３’（配列番号７）および５’−ｇｃｇ ｇｃｃ ｇｃｔ ｃａａ ｇｔｃ ａｃｇ ａｃｃ ｇｇａ ｇｇａ ｔｃ−３’（配列番号８）を使用してクローニングした。ｍＩＬ−２２ＢＰβ配列は、ＰＣＲプライマー５’−ｃｇｇ ｇｇｔ ａｃｃ ｔｃｔ ｔｔｇ ｃｇｇ ｇｔｇ ｃｔｔ ｃｔｃ−３’（配列番号９）および５’−ｇｃｇ ｇｃｃ ｇｃｔ ｃａｃ ａｔｔ ｔｃａ ｇｃｃ ａｃｔ ａｃｇ ｃａ−３’（配列番号１０）を使用してクローニングした。増幅させたＤＮＡ断片をｐＭＤ１８−Ｔ（Ｔａｋａｒａ）にクローニングし、プラスミドを調製した。ｍＩＬ−２２ＢＰαおよびｍＩＬ−２２ＢＰβを含むプラスミドをＮｏｔＩとＫｐｎＩとで消化し、発現ベクターｐＥＴ３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。ｍＩＬ−２２ＢＰαとｍＩＬ−ＢＰβの配列を、それぞれ配列番号１１および１３に示すように、ＤＮＡ配列分析によって確認した。
２．組み換え体ｍＩＬ−２２ＢＰαおよびｍＩＬ−２２ＢＰβタンパク質の発現
組み換え体ｍＩＬ−２２ＢＰαおよびｍＩＬ−２２ＢＰβの発現には、Ｗｅｉ Ｃｈｉ−Ｃｈｅｎら（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ 第４巻：ｐ２０４、２００３）に記載されている方法と類似する方法を使用した。簡単に説明すると、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（＋）株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を発現宿主として使用した。宿主細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で培養した。タンパク質の発現を、１ｍＭのイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトシドを用いて誘導した。細胞ペレットをホモジナイザーで破壊させ、ｍＩＬ−３２ＢＰαおよびｍＩＬ−２２ＢＰβ封入体を遠心分離によって得た。封入体を、５０ｍＭのＴｒｉｓｚＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、および０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のデオキシコール酸ナトリウム、ｐＨ８で洗浄した。封入体を４℃で一晩、１００ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、および８Ｍの尿素（Ｕｒｅａ）（ｐＨ８．０）中で可溶化させた。溶液を、１００，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収した。組み換え体ｍＩＬ−２２ＢＰタンパク質をＮｉ−ＮＴＡスピンキット（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＮｉ−ＮＴＡアガロースクロマトグラフィーを使用して精製した。精製したｍＩＬ−２２ＢＰタンパク質をエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理して、チオレドキシン融合タンパク質を除去した。ｍＩＬ−２２ＢＰα（配列番号１２）およびｍＩＬ−２２ＢＰβ（配列番号１４）タンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色分析に基づいて＞９０％と概算した。
３．抗ｍＩＬ−２２ＢＰ抗体の調製
ウサギを、ｍＩＬ−２２ＢＰに対するポリクローナル抗体を産生するために使用した。組み換え体ｍＩＬ−２２ＢＰαおよびｍＩＬ−２２ＢＰβタンパク質を、ウサギを免疫化するための割合（重量で１：１）で混合した。免疫化溶液には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９４に記載されているように、２．０ｍＬのＰＢＳと２．０ｍＬの完全なフロイントアジュバント（ＣＦＡ、Ｓｉｇｍａ）の中に１．５ｍｇのｍＩＬ−２２ＢＰαと１．５ｍｇのｍＩＬ−２２ＢＰβタンパク質との混合物を含めた。それぞれのウサギに２．０ｍＬの免疫化溶液を、ウサギの背中の４部位への皮下注射によって投与した。初回免疫の後、ウサギに、同じ量のタンパク質と不完全なフロイントアジュバント（ＩＦＡ、Ｓｉｇｍａ）を、３週目および６週目に再び皮下注射した。血清試料を６週目に採取し、抗体力価をＥＬＩＳＡによって決定した（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９４）。両方のウサギにおいて決定した抗体力価は、ｍＩＬ−２２ＢＰαおよびｍＩＬ−２２ＢＰβのいずれに対しても、１：１×１０^６より高かった。

４．プロテインＡで精製した抗ＩＬ−２２ＢＰ抗体
通常のウサギおよび免疫化したウサギに由来する抗体血清免疫グロブリン（ＩｇＧ）を、プロテインＡセファロースカラムを使用して精製した（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９４）。精製したＩｇＧをＰＢＳに溶解させ、４℃で維持した。図５は、免疫化を行っていない通常のウサギから精製したＩｇＧ（ＮＲ−Ｉｇ）、およびｍＩＬ−２２ＢＰで免疫化したウサギから精製したＩｇＧ（ＢＰＲ−Ｉｇ）を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。プロテインＡカラムクロマトグラフィーの純度は、９５％より高いと試算した。
５．抗ＩＬ−２２ＢＰ抗体はインビボでＩＬ−２２の生体活性をブロックする
雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（１６週例、体重１９から２４グラム）を、マウスＩＬ−２２結合タンパク質に対するプロテインＡで精製したウサギポリクローナル抗体の、０．２ｍＬのＰＢＳ中で１匹の動物あたり０．１ｍｇまたは１．０ｍｇの用量で、１回の（皮下）注射で処置した。対照マウスには、抗原で免疫化されていないウサギから単離した精製した免疫グロブリン（ＩｇＧ）を投与した。対照グループには、同じ用量のＩｇＧ、すなわち、０．２ｍＬのＰＢＳ中で１匹の動物あたり０．１ｍｇまたは１．０ｍｇを投与した。血清を注射後７日目に処置したマウスから回収し、−２０℃で保存した。トリグリセリド（ＴＧ）の血清レベルを、自動血液化学分析器（Ｓｙｎｃｈｒｏｎ Ｌｘｉ ７２５、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を使用して測定した。

結果：ＴＧの血清レベルを表２に示す。精製した対照ＩｇＧで処置したマウスは、正常な血清ＴＧレベルを有していた。組み換え体ｍＩＬ−２２ＢＰαとｍＩＬ−２２ＢＰβとで免疫化したウサギから精製したＩｇＧで処置したマウスは、有意に低い血清ＴＧレベルを生じた（ｐ＝０．０４９およびｐ＝０．０１８）。この結果は、中和抗体を使用したインビボでのＩＬ−２２結合タンパク質のブロックによって、血清ＴＧレベルを有意に低下させることができたことを示している（図６）。

このように、本発明の好ましい実施形態を完全に記載する。記載は特定の実施形態に関するが、本発明がこれらの具体的な詳細の変形を用いて行われる場合があることは、当業者に明らかであろう。したがって、本発明は、本明細書中に示される実施例に限定される
ようには解釈されるべきではない。

例えば、当業者には、本発明が、配列番号２、３、および４に示される他のＩＬ−２２結合タンパク質およびその変異体に結合し、その生体活性を中和することにおいて使用され得ることが明らかであろう。

図１は、全長のマウスＩＬ−２２ＢＰ配列である。 図２は、マウスＩＬ−２２ＢＰα配列である。 図３は、マウスＩＬ−２２ＢＰβ配列である。 図４は、全長のｍＩＬ−２２ＢＰ、ｍＩＬ−２２ＢＰα、およびｍＩＬ−２２ＢＰβの配列アラインメントである。 図５は、プロテインＡで精製された抗ＩＬ−２２ＢＰ抗体である。 図６は、インビボでのＩＬ−２２ＢＰに応答した血清トリグリセリド（ＴＧ）レベルの低下を示すグラフである。

Claims (17)

1. ヒトインターロイキン−２２結合タンパク質およびその誘導体に特異的に結合する、単離され精製された抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）。
2. 前記抗体がＩＬ−２２に対するＩＬ−２２結合タンパク質の結合を特異的に阻害する、請求項１に記載の単離され精製された抗体。
3. 前記抗体が、肥満、糖尿病、脂質異常症、および高インシュリン血症からなる群より選択される代謝性疾患の診断、予防、または処置のために使用される、請求項２に記載の単離され精製された抗体。
4. 前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗原結合断片、Ｆｃ領域を有している任意のペプチド、またはそれらの任意の誘導体である、請求項３に記載の単離され精製された抗体。
5. 前記抗体がヒト化されている、請求項４に記載の単離され精製された抗体。
6. 前記抗体がトランスジェニック技術または遺伝子ターゲッティング技術によってマウスの中で作製された完全なヒト抗体である、請求項４に記載の単離され精製された抗体。
7. 前記抗体が、５０％を超えるヒトペプチド配列から構成されている、請求項５に記載の単離され精製された抗体。
8. ヒトインターロイキン−２２結合タンパク質およびその誘導体に特異的に結合する、単離され精製された抗体を含む薬学的組成物。
9. 前記抗体がＩＬ−２２に対するＩＬ−２２結合タンパク質の結合を特異的に阻害する、請求項８に記載の薬学的組成物。
10. 前記抗体が、肥満、糖尿病、脂質異常症、および高インシュリン血症からなる群より選択される代謝性疾患の診断、予防、または処置のために使用される、請求項９に記載の薬学的組成物。
11. 前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗原結合断片、Ｆｃ領域を有している任意のペプチド、またはそれらの任意の誘導体である、請求項１０に記載の薬学的組成物。
12. 前記抗体がヒト化されている、請求項１１に記載の薬学的組成物。
13. 前記抗体がトランスジェニック技術または遺伝子ターゲッティング技術によってマウスの中で作製された完全なヒト抗体である、請求項１１に記載の薬学的組成物。
14. 前記抗体が、５０％を超えるヒトペプチド配列から構成されている、請求項１２に記載の薬学的組成物。
15. 単離され精製された抗体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を製造する方法であって、前記抗体が、ヒトインターロイキン−２２結合タンパク質およびその誘導体に特異的に結合する、方法。
16. 薬学的有効量の単離され精製された抗体を投与する工程を含む、ヒトの処置の方法であって、前記抗体が、ヒトインターロイキン−２２結合タンパク質およびその誘導体に特異的に結合する、方法。
17. 前記抗体が、肥満、糖尿病、脂質異常症、および高インシュリン血症からなる群より選択される代謝性疾患の処置のために使用される、請求項１６に記載のヒトの処置の方法。