CN100384993C

CN100384993C - 提高地衣芽孢杆菌zjuel31410弹性蛋白酶稳定性的方法

Info

Publication number: CN100384993C
Application number: CNB2005100613764A
Authority: CN
Inventors: 何国庆; 陈启和; 徐莹
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2005-11-02
Filing date: 2005-11-02
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2025-11-02
Also published as: CN1793352A

Abstract

本发明公开了一种提高地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶稳定性的方法：在保藏号为CGMCC 1397的地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶的粗酶液中添加牛血清白蛋白、明胶和水合氯化钙；牛血清白蛋白与粗酶液的重量体积比为1～3g/100ml，明胶与粗酶液的重量体积比为1～3g/100ml，水合氯化钙与粗酶液的投料比为1～3mmol/L。采用本发明的方法，能提高地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶的热稳定性和pH耐受性。

Description

提高地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶稳定性的方法

技术领域

本发明涉及一种提高、改进地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶稳定性的生物方法。

背景技术

弹性蛋白酶是一种以分解不溶性弹性蛋白为特征的广谱蛋白水解酶，具有极大的经济价值和应用价值。近年来，弹性蛋白酶主要用于医药、食品和日用化工等工业之中。弹性蛋白酶具有治疗高血脂、防止动脉硬化，改善脂质蛋白代谢等作用。

我国是蚕丝生产大国，蚕蛹是蚕丝工业的主要副产品，每生产1吨生丝即可得到约1吨的干蛹。由于干蛹具有丰富的营养成分，因此具有较高的保健价值，分离提取后可用于食品、医药等行业，具有极高的经济价值。

但是，有关蚕蛹的利用并不能很好的得到解决，多数处于初级加工，产品质量较次。而采用酶工程技术水解的蚕蛹，可以直接用于食品、化妆品的生产，将会产生明显的经济效益。

弹性蛋白酶与其它蛋白酶功能的显著区别是对弹性蛋白具有专一性，并且在多种底物共存时，优先水解弹性蛋白，真正起到使肉类嫩化又不改变风味和口味的功能，而不是单纯对食用蛋白加以非选择性部分消化，因此是理想的肉类嫩化剂。同时弹性蛋白酶还能降解许多动植物蛋白，特别是能处理一些难以处理食用的如韧带、大动脉血管、筋腱等蛋白副产品，因此可以用来进行农产品的深加工。

弹性蛋白酶还是良好的日用化工原料，主要用于保健化妆品的生产。添加了弹性蛋白酶的化妆品能改善皮肤的代谢功能，所以说弹性蛋白酶是一种新型的美容化妆品加工原料，具有良好的美容保健作用。

目前，我国弹性蛋白酶的主要来源是利用猪胰腺、脏提取。由于脏器资源的限制，因此弹性蛋白酶十分紧缺，供不应求，导致国内外产品价格昂贵，因此弹性蛋白酶的使用仅限于药品和极少量化妆品，在其它领域的应用举步不前，特别是弹性蛋白酶在肉类嫩化和老龄肉的改造上的应用研究严重不足，严重影响弹性蛋白酶的研究开发与应用。由此可见，利用微生物发酵法工业化、规模化地生产弹性蛋白酶有着广阔的应用发展前景。本申请人已经于2005年9月20日申请了《一种芽孢杆菌菌株及其用途》的发明专利，申请号为200510060829.1。其公开了一种芽孢杆菌菌株——地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的菌株，保藏菌株名称为：地衣芽孢杆菌ZJUEL31410，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2005年06月23日，保藏号：CGMCC 1397。

但是目前微生物源弹性蛋白酶普遍存在稳定性差的问题，尤其是在实际应用过程中，作用效率太低，无法达到很好的作用效果。已有研究者试图采用化学方法如海藻糖进行配基修饰来改造动物源弹性蛋白酶，并取得了一定效果，明显提高了弹性蛋白酶的热稳定性和对低pH的耐受性。但是考虑到弹性蛋白酶在医药和食品工业中的应用，安全性是化学修饰弹性蛋白酶面临的巨大难题。因为化学修饰过程中要使用溴氰酸，其是一种剧毒物质，有致癌作用；会给实际操作和产品的应用带来巨大的安全性问题。而采用新型的分子生物学手段对弹性蛋白酶进行分子改造仍然面临着许多技术和成本上的问题，难以得到规模化应用。因此开展经济、有效的弹性蛋白酶保护剂开发对于微生物源弹性蛋白酶的产业化应用有着重要的研究意义和市场价值。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种采用外源添加复合保护剂，以提高地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶的热稳定性和pH耐受性的方法。

本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的：提供一种提高地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶稳定性的方法：在所述保藏号为CGMCC 1397的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJUEL31410弹性蛋白酶的粗酶液中添加牛血清白蛋白(PA)、明胶(PB)和水合氯化钙；牛血清白蛋白与粗酶液的重量体积比为1～3g/100ml(即每100ml的粗酶液加入1～3g的牛血清白蛋白)，明胶与粗酶液的重量体积比为1～3g/100ml(即每100ml的粗酶液加入1～3g的明胶)，水合氯化钙与粗酶液的投料比为1～3mmol/L(即每1L的粗酶液加入1～3mmol的水合氯化钙)。

作为本发明的提高地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶稳定性的方法的一种改进：牛血清白蛋白与粗酶液的重量体积比为2g/100ml，明胶与粗酶液的重量体积比为1.5g/100ml，水合氯化钙与粗酶液的投料比为1mmol/L。

上述添加过程中不需要搅拌，温度为室温即可。

本发明的提高地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶稳定性的方法，是在下述基础上获得的：首先筛选出能提高和延长地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶热稳定性的保护剂，并对得到的复合保护剂进行优化，最终获得了能极大改善和提高地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶稳定性的最佳保护剂配比。因此本发明的提高地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶稳定性的方法，安全、有效，而且所用的保护剂原料来源广，因此易于大规模使用。采用本发明的方法，使得地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶的耐热温度提高了10℃，而且能使该酶在pH 6～9的范围内都保持良好的稳定性，提高了弹性蛋白酶的最大作用效率，有利于扩大弹性蛋白酶的应用范围。采用本发明的方法保存的地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶，安全、经济，可作为食品级添加剂。

为了证明本发明的创造性，发明人作了如下的4组对比实验(注1、实验所使用的均为保藏号为CGMCC 1397的地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶，以下简称弹性蛋白酶；注2、以下各表中，4℃放置的未作热处理未加保护剂的酶活保留率均为100％；)：

实验一、对弹性蛋白酶酶活保留率的影响：

在相同的弹性蛋白酶的粗酶液中分别添加下列保护剂，保护剂的用量如表1所述，于50℃水浴保温60min后测定了酶活保留率。以4℃放置的未作热处理未加保护剂的酶活力作为100％，以未加保护剂在相同实验条件下处理为参照组，计算和比较酶活力保留率(％)。具体数值见表1。

表1不同保护剂的添加对弹性蛋白酶酶活保留率的影响

添加的保护剂类型	保护剂的用量	酶活保留率(％)
添加的保护剂类型	保护剂的用量	酶活保留率(％)	PA	0.1g/100ml	53.6
PA	2g/100ml	85.2	PA	0.1g/100ml	53.6

PB	0.05g/100ml	30.5
PB	0.05g/100ml	30.5	PB	1g/100ml	70.9
黄原胶	0.05g/100ml	43.2	PB	1g/100ml	70.9
黄原胶	0.05g/100ml	43.2	黄原胶	0.3g/100ml	61.4
海藻糖	0.05g/100ml	25.7	黄原胶	0.3g/100ml	61.4
海藻糖	0.05g/100ml	25.7	海藻糖	0.3g/100ml	26.6
甘油	10g/100ml	54.6	海藻糖	0.3g/100ml	26.6
甘油	10g/100ml	54.6	甘油	20g/100ml	57.4
甘露醇	0.2g/100ml	27.4	甘油	20g/100ml	57.4
甘露醇	0.2g/100ml	27.4	甘露醇	1g/100ml	39.7
水合氯化钙	0.04mmol/L	48.7	甘露醇	1g/100ml	39.7
水合氯化钙	0.04mmol/L	48.7	水合氯化钙	2mmol/L	70.0
山梨酸钾	0.1g/100ml	34.1	水合氯化钙	2mmol/L	70.0
山梨酸钾	0.1g/100ml	34.1	山梨酸钾	0.5g/100ml	51.0
氯化钠	0.4mmol/L	26.4	山梨酸钾	0.5g/100ml	51.0
氯化钠	0.4mmol/L	26.4	氯化钠	2mmol/L	27.9
抗坏血酸	0.04mmol/L	21.6	氯化钠	2mmol/L	27.9
抗坏血酸	0.04mmol/L	21.6	抗坏血酸	0.4mmol/L	21.0

未加保护剂(参照组)

0

47.0

而在相同的实验条件下，采用本发明的方法酶活保留率最高能达到98.8％。因此以上实验表明，本发明能使PA、PB和水合氯化钙发挥协同作用，进一步提高酶的热稳定性。

实验二、对弹性蛋白酶热稳定性的影响：

设定了在粗酶液中未加任何保护剂的为参照组，将本发明与参照组在不同的温度下热处理不同的时间后所得的酶活保留率作了对比，具体结果见表2所示。

表2保护剂的添加对弹性蛋白酶热稳定性的影响

实验表明，在相同的热处理时间下，最后获得的酶活保留率基本相等的前提下，地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶的耐热温度提高了10℃。

实验三、对弹性蛋白酶pH稳定性的影响：

同理，设定了在粗酶液中未加任何保护剂的为参照组，将本发明与参照组在不同pH下所得的酶活保留率作了对比，具体结果见表3所示。

表3保护剂添加对弹性蛋白酶pH稳定性的影响及其比较

本实验证明，在相同的pH值下，本发明的酶活保留率要显著高于参照组。本发明使地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶在pH 6～9范围内都保持良好的稳定性，有利于扩大此弹性蛋白酶的应用范围。

实验四、运用加速试验估算了弹性蛋白酶的贮存寿命，即在25℃、20℃、4℃和0℃时，活性损失50％需要的时间分别为：

参照组为：36、91、2000和4000天；

本发明为：140、330、6500和16000天。

发明人还对本发明所用的保藏号为CGMCC 1397的地衣芽孢杆菌ZJUEL31410的安全性进行了研究：该菌株发酵生产的产物及其菌液经过浙江省疾病预防控制中心检测为经小鼠口服急性无毒，半致死剂量为10g/kg以上，从而证明在食品上应用是安全的。

具体实施方式

提高地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶稳定性的方法：在保藏号为CGMCC 1397的地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶的粗酶液中添加牛血清白蛋白(PA)、明胶(PB)和水合氯化钙(CaCl₂.2H₂O)；PA、PB、CaCl₂.2H₂O与粗酶液的投料比分别如表1中的实施例1～实施例10所示，未加保护剂的为参照组；于50℃水浴保温60min后测定了酶活保留率，具体数值见表4。

表4

	PA(g/100ml)	PB(g/100ml)	CaCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O(mmol/L)	酶活保留率(％)
	PA(g/100ml)	PB(g/100ml)	CaCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O(mmol/L)	酶活保留率(％)	实施例1	1	1	1	71.3
实施例2	1	3	1.5	85.1	实施例1	1	1	1	71.3
实施例2	1	3	1.5	85.1	实施例3	1	1.5	3	86.6
实施例4	1.5	1	1.5	82.7	实施例3	1	1.5	3	86.6
实施例4	1.5	1	1.5	82.7	实施例5	1.5	1	2	88.1
实施例6	1.5	1.5	1	83.6	实施例5	1.5	1	2	88.1
实施例6	1.5	1.5	1	83.6	实施例7	3	1	2	90.1
实施例8	3	1	1	89.1	实施例7	3	1	2	90.1
实施例8	3	1	1	89.1	实施例9	3	1.5	1.5	91.3
实施例10	2	1.5	1	98.8	实施例9	3	1.5	1.5	91.3
实施例10	2	1.5	1	98.8	参照组	0	0	0	35.0

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种提高地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶稳定性的方法，其特征是：在所述保藏号为CGMCC 1397的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJUEL31410弹性蛋白酶的粗酶液中添加牛血清白蛋白、明胶和水合氯化钙；所述牛血清白蛋白与粗酶液的重量体积比为1～3g/100ml，明胶与粗酶液的重量体积比为1～3g/100ml，水合氯化钙与粗酶液的投料比为1～3mmol/L。

2.根据权利要求1所述的提高地衣芽孢杆菌ZJUEL31410弹性蛋白酶稳定性的方法，其特征是：所述牛血清白蛋白与粗酶液的重量体积比为2g/100ml，所述明胶与粗酶液的重量体积比为1.5g/100ml，水合氯化钙与粗酶液的投料比为1mmol/L。