MXPA02007519A - Composiciones farmaceuticas de toxina botulinica. - Google Patents

Abstract

Una composicion farmaceutica de toxina botulinica libre de albumina derivada de la sangre, que comprende una toxina botulinica, cloruro de sodio o agua y un polisacarido tal como el hidroxietil almidon y/o un aminoacido, siendo la composicion farmaceutica adecuada para la administracion terapeutica a un paciente humano. De manera alternativa, el polisacarido y el aminoacido pueden ser reemplazados por albumina recombinante.

Description

COMPOSICIONES FARMACEUTICAS DE TOXINA BOTULINICA ANTECEDENTES La presente invención se relaciona con composiciones farmacéuticas. En particular, la presente invención se relaciona con composiciones farmacéuticas que contiene una toxina botulinica y métodos para producir las composiciones farmacéuticas. Una composición farmacéutica es una composición que contiene uno o más ingredientes activos asi como uno o más excipientes, portadores, estabilizadores o agentes aditivos, la cual es adecuada para administrarse a un paciente humano para lograr un resultado de diagnóstico o efecto terapéutico deseado. Por estabilidad de almacenamiento y conveniencia de manejo, una composición farmacéutica puede ser formulada como un polvo liofilizado (es decir, secado por congelamiento) o secado al vacio, el cual puede ser reconstituido con solución salina o agua antes de la administración a un paciente. De manera alternativa, la composición farmacéutica puede ser formulada como una solución acuosa. Una composición farmacéutica puede contener un ingrediente .proteinaceo activo. Desafortunadamente, las proteínas pueden ser muy difíciles de estabilizar, dando como resultado la pérdida de proteína y/o pérdida de actividad de proteína durante la Ref: 140614 formulación, reconstitución (si se requiere) y almacenamiento antes del uso de una composición farmacéutica que contenga proteina. Los problemas de estabilidad pueden ocurrir debido a la naturalización, degradación, dimerización y/o polimerización de la proteina. Han sido utilizados varios excipientes, tales como albúmina y gelatina con diferentes grados de éxito para tratar de estabilizar un ingrediente proteico activo presente en una composición farmacéutica. Adicionalmente, han sido utilizados bioprotectores tales como alcoholes para reducir la desnaturalización de proteina bajo las condiciones de congelamiento de la liofilizacion .

Albúmina Las albúminas son proteínas pequeñas abundantes en el plasma. La seroalbúmina tiene un peso molecular de aproximadamente 69 kiloDaltons (kD) y ha sido utilizada como un ingrediente no activo en una composición farmacéutica donde puede servir como un portador aditivo y estabilizador de ciertos ingredientes proteicos activos presentes en una composición farmacéutica. La función de estabilización de la albúmina en una composición farmacéutica puede estar presente tanto durante la formulación de pasos múltiples de una composición farmacéutica como tras la reconstitución posterior de la recomposición farmacéutica formulada. De este modo, puede ser impartida estabilidad por la albúmina a un ingrediente proteinaceo activo en una composición farmacéutica, por ejemplo, (1) reduciendo la adhesión (comúnmente referida como "adherencia") del ingrediente proteico activo a superficies, tales como las superficies de material de vidrio de laboratorio, recipientes, al frasco en el cual la composición farmacéutica reconstituida y a la superficie interna de una jeringa utilizada para inyectar la composición farmacéutica. La adhesión de un ingrediente proteico activo a superficies puede conducir a la perdida del ingrediente activo y a la desnaturalización del ingrediente proteico activo retenido remanente, ambas cosas las cuales reducen la actividad total del ingrediente activo presente en la composición farmacéutica, y; (2) reduciendo la desnaturalización del ingrediente activo que pueda ocurrir tras la preparación de una solución de baja dilusión del ingrediente activo. Asi como es capaz de estabilizar un ingrediente proteico activo en una composición farmacéutica, la albúmina también tiene la ventaja de una inmunogenicidac generalmente despreciable cuando se inyecta a un paciente humano. Un compuesto con una inmunogenicidad apreciable puede hacer que la producción de anticuerpos contra este pueda conducir a una reacción anafiláctica y/o el desarrollo de resistencia al, fármaco, con la enfermedad o trastorno a ser tratado volviéndose por lo tanto potencialmente refractario a la composición farmacéutica que tiene un componente inmunoge'nico . Desafortunadamente, a pesar de su efecto estabilizante conocido existen desventajas significativas en el uso de la albúmina en una composición farmacéutica. Por ejemplo las albúminas son caras y cada vez más difíciles de obtener. Además, los productos de la sangre tales como la albúmina, cuando se administran a un paciente pueden someter al paciente a un riesgo potencial de recibir agentes patógenos o infecciosos portados por la sangre. De este modo, se sabe que existe la posibilidad de que la presencia de albúmina en una composición farmacéutica pueda dar como resultado la incorporación inadvertida de elementos infecciosos a la composición farmacéutica. Por ejemplo, se ha reportado que el uso de la albúmina puede transmitir priones para una composición farmacéutica. Un prión es una partícula proteinacéa infecciosa la cual se supone surge como un isoformo conformacional anormal de la misma secuencia de ácido nucleico que produce la proteína normal. Se tiene la hipótesis de que además la infectividad reside en una "reacción de reclutamiento" de la proteína isoforma de la normal al isoformo de la proteína del prion a un nivel postraslacional .. Aparentemente la proteína celular endógena normal es inducida a plegarse de manera anómala en una conformación priónica patógena. De manera significativa, han sido retirados de la distribución varios lotes de seroalbúmina humana tras la determinación de que un donador de sangre a un conjunto del cual la albúmina fue preparada fue diagnosticado con enfermedad de Creutzfeldt-Jacob . La enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (algunas veces caracterizada como enfermedad de Alzheimer de progreso rápido) es un trastorno neurodegenerativo raro de la encefalopatía espongiforme transmisible a los humanos donde el agente transmisible es aparentemente un isoformo anormal de una proteína priónica. Un individuo con la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob puede presentar un deterioro de una salud aparentemente perfecta a un mutismo acinético dentro de seis meses . Ha sido reportada la posibilidad de transmisión iatroge'nica de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob por transfusión de albúmina y se ha especulado que no es proporcionada suficiente protección contra la transmisión de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob por los métodos usuales de preparación de albúmina, métodos los cuales incluyen la eliminación de elementos celulares de la sangre y el calentamiento a 60 °C durante 10 horas. De este modo puede existir un riesgo potencial de adquirir una enfermedad mediada por un prion, tal como la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, de la administración de una composición farmacéutica que contenga concentrados de proteína plasmática humana, tales como la seroalbúmina . La gelatina ha sido utilizada en algunas composiciones farmacéuticas con ingredientes activos proteicos como un sustituto de la albúmina. De manera notable, la gelatina es una proteína derivada de animales y por lo tanto conlleva el mismo riesgo de actividad potencial que puede ser poseído por la albúmina. En consecuencia, es deseable encontrar un sustituto para la albúmina que no sea una fracción de sangre, y de manera preferible, el sustituto de la albúmina no sea gelatina y no sea derivado de ninguna fuente animal.

Toxina botulínica La bacteria anaerobia, gram positiva, Clostridium botulinum produce una neurotoxina polipeptídica potente, la cual causa una enfermedad neuroparalítica en humanos y animales conocida como botulismo. El Clostridium botulinum y sus esporas se encuentran comúnmente en el suelo y la bacteria puede crecer en recipientes de alimentos inapropiadamente esterilizados y sellados de latas vaciadas en casa, las cuales son la causa de muchos de los casos de botulismo. Los efectos del botulismo aparecen típicamente de las 18 a las 36 horas después de comer los alimentos infectados con un cultivo o esporas de Clostridium botulinum.

La toxina botulinica puede pasar aparentemente no atenuada a través del revestimiento del intestino y atacar las neuronas motoras periféricas. Los síntomas de intoxicación por toxina botulinica pueden progresar desde la dificultad para caminar, hinchamiento, y hablar hasta la parálisis de los músculos respiratorios y la muerte. La toxina botulinica tipo A es el agente biológico natural más letal conocido por el hombre. Aproximadamente 50 picogramos de toxina botulinica (complejo de neurotoxina purificado) tipo A es una DL50 en ratones. De manera interesante, sobre una base molar, la toxina botulinica tipo A es un 1.8 billones de veces más letal que la difteria, 600 millones de veces más letal que el cianuro de sodio, 30 millones de veces más letal que la cobrotoxina y 12 millones de veces más letal que el cólera. Singh, Aspectos Críticos de Toxinas Protéicas Bacterianas, páginas 63-84 (capítulo 4) de Toxinas Naturales II, editado por B. R. Singh et al., Plenum Press, New York (1976) (donde la DL50 establecida de la toxina botulinica tipo A de 0.3 ng igual a 1 U es corregida por el hecho de que aproximadamente 0.05 ng de BOTOX® es igual a una unidad) . Una unidad (U) de toxina botulinica, se define como la DL50 tras la inyección intraperitoneal en ratones Swiss Webster hembra con peso de 18-20 gramos cada uno. Han sido caracterizadas siete neurotoxinas botulínicas inmunológicamente distintas, siendo esos los serotipos de neurotoxina botulínica respectivos A, B, Ci, D, E, F y G, cada uno de los cuales es distinguido por neutralización por anticuerpos específicos del tipo. Los diferentes serotipos de la toxina botulínica varían en las especies animales que afectan y en la severidad y duración de la parálisis que evocan. Por ejemplo, se ha determinado que la toxina botulínica tipo A es 500 veces más potente, de acuerdo a lo medido por la velocidad de parálisis producida en la rata, que la toxina botulínica tipo B. Adicionalmente, se ha determinado que la toxina botulínica tipo B no es tóxica en primates a una dosis de 480 U/kg que es aproximadamente 12 veces la DL5o en primates para la toxina botulínica tipo A. Las toxinas botulínicas aparentemente se unen con alta afinidad a neuronas motoras colinérgicas, se translocan a la neurona y bloquean la liberación presináptica de acetilcolina . Las toxinas botulínicas han sido utilizadas en escenarios clínicos para el tratamiento de trastornos neuromusculares, caracterizados por músculos esqueléticos hiperactivos . La toxina botulínica tipo A fue aprobada por la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos en 1989 para el tratamiento del blefaroespasmo esencial, estrabismo y espasmo semifacial en pacientes de más doce años. Los efectos clínicos de la toxina botulínica tipo A intramusculares periféricos usualmente son observados dentro de una semana de inyección. La duración típica del alivio sintomático (es decir, parálisis del músculo flácido) de una sola inyección intramuscular de toxina botulínica tipo A puede ser de aproximadamente tres meses. Aunque todos los serotipos de toxinas botulínicas aparentemente inhiben la liberación del neurotransmisor acetilcolina en la unión neuromuscular, ellas parecen afectar diferentes proteínas neurosecretoras y/o escindir esas proteínas en diferentes sitios. La toxina botulínica A es una zinc endopeptidasa, la cual puede hidrolizar específicamente un enlace peptídico de la proteína intracelular, asociada con la vesícula, SNAP-25. La toxina botulínica tipo E también escinde la proteína de 25 kiloDalton (kD) asociada sinaptosomalmente (SNAP-25), pero hace blanco en diferentes secuencias de aminoácido dentro de esta proteína, en comparación con la toxina botulínica tipo A. Las toxinas botulínicas tipos B, D, F y G actúan sobre la proteína asociada con la vesícula (VAMP, también llamada sinaptobrevina) , con cada serotipo escindiendo la proteína en un sitio diferente. Finalmente, la toxina botulínica del tipo Ci ha mostrado escindir tanto la sintaxina como SNAP-25. Esas diferencias en el mecanismo de acción pueden afectar la potencia y/o duración relativa de la acción de los diferentes serotipos de toxina botulínica.

El peso molecular de la molécula de la proteina de la toxina botulínica, para los siete serotipos de toxina botulínica conocidos, es de aproximadamente 150 kD. De manera interesante, las toxinas botulínicas son liberadas por bacterias Clostrídicas como complejos que comprenden la molécula de proteína de la toxina botulínica de 150 kD junto con proteínas no tóxicas asociadas. De este modo, el complejo de la toxina botulínica tipo A puede ser producido por bacterias Clostrídicas como formas de 900 kD, 500 kD y 300 kD. Las toxinas botulínicas tipos B y Cx son aparentemente producidas solo como un complejo de 500 kD. La toxina botulínica del tipo D es producida como complejo de 300 kD y 500 kD. Finalmente, las toxinas botulínicas tipos E y F son producidas solo como complejos de aproximadamente 300 kD. Se cree que los complejos (es decir, con un peso molecular mayor de aproximadamente 150 kD) contienen una proteína de hemaglutinina no tóxica y una proteína diferente a la hemaglutinina sin propiedades de toxina y no tóxica. Esas dos proteínas diferentes a una toxina (las cuales, junto con la molécula de la toxina botulínica pueden comprender el complejo de neurotoxinas relevantes) pueden actuar para proporcionar estabilidad contra la desnaturalización a la molécula de la toxina botulínica y protección contra los ácidos digestivos cuando la toxina sea ingerida. Adicionalmente, es posible que complejos de toxina botulínica más grandes (con un peso molecular mayor de aproximadamente 150 kD) puedan dar como resultado una velocidad de difusión más lenta de la toxina botulinica lejos de un sitio de inyección intramuscular de un complejo de toxina botulinica. Los complejos de toxina pueden ser disociados en proteina de toxina y proteínas de hemaglutinina tratando el complejo con células sanguíneas rojas a pH 7.3. La proteína de la toxina tiene una estabilidad notable tras la remoción de la proteína hemaglutinina. Todos los serotipos de la toxina botulinica producidos por bacterias Clostridium botulinum como proteínas de una sola cadena inactivas que deben ser escindidas o marcadas por proteasas para volverse neuroactivas . Las cepas bacterianas que producen los serotipos A y G de la toxina botulinica, poseen proteasas endógenas y los serotipos A y G pueden por lo tanto ser recuperados de cultivos bacterianos predominantemente en su forma activa. En contraste, los serotipos Ci, D y E de la toxina botulinica son sintetizados por cepas no proteoliticas, y por lo tanto están típicamente inactivos cuando son recuperados de cultivo. Los serotipos B y F son producidos por cepas proteoliticas y no proteoliticas y por lo tanto pueden ser recuperados en la forma activa o inactiva. Sin embargo, aunque las cepas proteoliticas que producen, por ejemplo, el serotipo de la toxina botulinica tipo B, únicamente escinden una porción de la toxina producida. La producción exacta de moléculas marcadas o no marcadas, depende de la longitud de incubación y la temperatura de cultivo. Por lo tanto, un cierto porcentaje de cualquier preparación de, por ejemplo, la toxina botulinica tipo B está probablemente inactiva, posiblemente contribuyendo a la potencia significativamente menor conocida de la toxina botulinica tipo B en comparación con la toxina botulinica tipo A. La presencia de moléculas de toxina botulinica inactivas en una preparación clínica contribuirá a la carga de proteína total de la preparación, la cual a sido ligada al incremento de la antigenicidad, sin contribuir a su eficacia clínica. Adicionalmente, se sabe que la toxina botulinica tipo B tiene, tras la inyección intramuscular, una duración más corta de actividad y también es menos potente que la toxina botulinica tipo A al mismo nivel de dosis. La toxina botulinica tipo A cristalina de alta calidad, puede ser producida a partir de la cepa Hall A de Clostridium botulinum con características de >3 X 107 U/mg, una A260/A278 de menos de 0.60 y un patrón distinto de bandas sobre la electroforesis en gel. El proceso de Shantz conocido, puede ser utilizado para obtener la toxina botulinica tipo A cristalina, como se expone en Shantz, E. J. et al., Propiedades y uso de la toxina Botulinica y Otras Neurotoxinas Microbianas en Medicina , Microbiol Rev. 56: 80- 99 (1992) . De manera general, el complejo de toxina botulinica tipo A puede ser aislado y purificado de una fermentación anaerobia, cultivando Clostridium botulinum tipo A en un medio adecuado. La toxina cruda puede ser cosechada por precipitación con ácido sulfúrico y concentrada por microfiltración. La purificación puede llevarse a cabo disolviendo el precipitado ácido en cloruro de calcio. La toxina puede entonces ser precipitada con etanol frío. El precipitado puede ser disuelto en amortiguador de fosfato de sodio y centrifugado. Tras el secado, puede entonces obtenerse complejo de toxina botulinica tipo A cristalina de aproximadamente 900 kD con una potencia especifica de 3 X 107 •DL50 U/mg o mayor. Este proceso conocido también puede ser utilizado, tras la separación de las proteínas diferentes a la toxina, para obtener toxinas botulínicas puras, tal como por ejemplo: toxina botulinica tipo A purificada con un peso molecular de aproximadamente 150 kD con una potencia específica de 1-2 X 108 DL50 U/mg o mayor; toxina botulinica tipo B purificada con un peso molecular de aproximadamente 156 kD con una potencia específica de 1-2 X 108 DL50 U/mg o mayor, y; toxina botulinica tipo F purificada con un peso molecular de aproximadamente 155 kD con una potencia específica de 1-2 X 107 DL50 U/mg o mayor. Ya preparadas y purificadas, pueden obtenerse toxinas botulínicas y complejos de toxina adecuados para preparar formulaciones farmacéuticas de List Biological Laboratories, Inc., Campbell, California; the Centre for Applied Microbiology and Research, Portón Down, U. K. ; Wako (Osaka, Japón) , así como de Sigma Chemicals de St Louis, 5 Missouri. La toxina botulínica pura es tan lábil que tiene una utilidad práctica limitada para preparar una composición ^ farmacéutica. Además, los complejos de toxina botulínica, tales como el complejo de toxina tipo A son también 10 extremadamente susceptibles a la desnaturalización debido a la desnaturalización superficial, calor y condiciones alcalinas. La toxina inactiva forma proteínas toxoides las ^ cuales pueden ser inmunogénicas . Los anticuerpos resultantes pueden hacer un paciente refractario a la inyección de 15 toxina. Como es general con las enzimas, las actividades biológicas de las enzimas botulínicas (las cuales son peptidasas intracelulares) dependen, al menos en parte, de su conformación tridimensional. De este modo, la toxina 20 botulínica tipo A es destoxificada por calor, varios hostigamientos superficiales químicos y secado superficial. Adicionalmente, se sabe que la dilución del complejo de toxina obtenido por el cultivo, fermentación y purificación conocidas a lo mucho, las concentraciones de toxina mucho más 25 bajas utilizadas para la formulación de composiciones farmacéuticas da como resultado una rápida destoxificación de la toxina a menos que esté presente un agente estabilizante adecuado. La dilución de la toxina de cantidades de miligramos a una solución que contenga nanogramos por mililitro representa dificultades significativas debido a la rápida pérdida de la toxicidad especifica tras mayor dilución. Puesto que la toxina puede ser utilizada meses o años después la composición farmacéutica que contiene toxina es formulada de modo que la toxina sea estabilizada con un agente estabilizante. El único agente estabilizante exitoso para este propósito ha sido las proteínas derivadas de animales albúmina y gelatina. Como se indicó, la presencia de proteínas derivadas de animales en la formulación final representa problemas potenciales dado que ciertos virus estables, priones u otros compuestos infecciosos o patógenos portados por los donadores pueden contaminar la toxina. Además, cualquiera de las condiciones de pH, temperatura e intervalo de concentración requeridas para liofilizar (secar por congelamiento) o secar al vacío una composición farmacéutica que contenga toxina botulínica en un formato de transporte y almacenamiento de toxina (lista para utilizarse o ser reconstituida por un médico) puede destoxificar la toxina. De este modo, las proteínas derivadas de animales o reunidas de donadores tales como la gelatina y la seroalbúmina han sido utilizadas con algún éxito para estabilizar la toxina botulinica. Una composición farmacéutica que contiene toxina botulinica comercialmente disponible se vende bajo la marca comercial de BOTOX® (disponible de Allergan, Inc., de Irvine, California) . El BOTOX® consiste de un complejo de toxina botulinica tipo A purificada, albúmina y cloruro de sodio empaquetados de forma estéril, secados al vacio. La toxina botulinica tipo A producida a partir de un cultivo de la cepa Hall de Clostridium botulinum crecida en un medio que contiene N-Z amina y extracto de levadura. El complejo de toxina botulinica compleja tipo A es purificada de la solución de cultivo por una serie de precipitaciones con ácido a un complejo cristalino que consiste de la proteina de la toxina de alto peso molecular activa y la proteina hemaglutinina asociada. El complejo cristalino es redisuelto en una solución que contiene solución salina y albúmina y filtrado de manera estéril (0.2 micrones) antes del secado al vacio. El BOTOX puede ser reconstituido con solución salina estéril, no preservada antes de la inyección intramuscular. Cada frasco de BOTOX contiene aproximadamente 100 unidades (U) de complejo de toxina botulinica tipo A de Clostridium, 0.5 miligramos de seroalbúmina humana y 0.9 miligramos de cloruro de sodio en forma estéril, secada al vacio, sin un preservativo . Para reconstituir el BOTOX® secado al vacio se utiliza una solución salina normal estéril sin preservativo; una Inyección de Cloruro de Sodio al 0.9%, extrayendo la cantidad apropiada de diluente en la jeringa del tamaño apropiado. Puesto que el BOTOX® se desnaturaliza burbujeando o por agitación violenta similar, el diluente es inyectado suavemente en el frasco. El BOTOX® deberá ser administrado dentro de cuatro horas después de la reconstitución. Durante este periodo de tiempo, el BOTOX® reconstituido es almacenado en un refrigerados (2° a 8°C) . El BOTOX® reconstituido es claro, incoloro y libre de materia particulada. El producto secado al vacio es almacenado en un congelador a o por debajo de -5°C. El BOTOX® es administrado dentro de cuatro horas después de que el frasco se ha removido del congelador y reconstituido. Durante esas cuatro horas, el BOTOX® puede ser almacenado en un refrigerador (2o a 8°C) . Se ha reportado que una alternativa adecuada a la albúmina como estabilizadora de la toxina botulinica puede ser otra proteina o alternativamente un compuesto de bajo peso molecular (no proteico). Carpender et al., Interacciones de Aditivos Estabilizantes con Proteínas Durante el Congelamiento-Descongelamiento y Liofilización, Simposium Internacional Sobre Liofilización y Formulación de Productos Biológicos, 24-26 Octubre 1990; Karger (1992), 225-239. Muchas sustancias comúnmente utilizadas como portadoras y agentes aditivos en composiciones farmacéuticas han probado ser inestables como reemplazos de albúmina en la composición farmacéutica que contiene neurotoxina. Por ejemplo, se ha encontrado que el disacárido celobiosa es inestable como estabilizador de toxina. De este modo, se sabe que el uso de la celobiosa como un excipiente en conjunto con la albúmina y el cloruro de sodio da como resultado un nivel mucho menor de toxicidad (10% de recuperación) después de la liofilización de la toxina botulinica tipo A cristalina con esos excipientes, en comparación con la toxicidad después de la liofilización con únicamente albúmina (>75% a >90% de recuperación). Goodnough et al., Estabilización de la Toxina Botulinica Tipo A Durante la Liofilización, App & Envir. Micro. 58(10) 3426-3428 (1992). Además, los sacáridos, incluyendo los polisacáridos son en general todos los candidatos para servir como estabilizadores de proteina. De este modo, se sabe que una composición farmacéutica que contiene un miembro proteico activo es inherentemente inestable si la formulación de proteina comprende un sacárido (tal como la glucosa o un polímero de glucosa) o carbohidratos debido a que se sabe que las proteínas y la glucosa interactúan juntas y experimentan la reacción bien descrita de Maillard, debido a la naturaleza reductora de la glucosa y polímeros de glucosa. Se ha dedicado mucho trabajo a muchos intentos no exitosos de prevenir esta reacción proteína-sacárido, por ejemplo, mediante la reducción de la humedad o uso de azúcar no reductores. De manera significativa, la vía degradativa de la reacción de Maillard puede dar como resultado una insuficiencia terapéutica debido al ingrediente proteico activo. Una formulación farmacéutica que comprende proteína y un sacárido reductor, carbohidrato o azúcar, tal como un polímero de glucosa, es por lo tanto inherentemente inestable y no puede ser almacenada durante un periodo de tiempo prolongado sin pérdida significativa de la actividad biológica deseada de la proteína del ingrediente activo. De manera notable, una de las razones por las que la seroalbúmina humana puede funcionar efectivamente como estabilizador de un ingrediente proteico activo en una composición farmacéutica se debe a que, la albúmina, siendo una proteína, no experimenta la reacción de Maillard con el ingrediente proteico activo en una composición farmacéutica. En consecuencia, se esperaría encontrar y buscar un sustituto para la albúmina entre otras proteínas. Encontrar un sustituto apropiado para la albúmina como estabilizador de la toxina botulínica presente en una composición farmacéutica es difícil y problemático debido a que se cree que la albúmina funciona en una composición farmacéutica más que como un mero agente aditivo. De este modo, la albúmina aparentemente puede interactuar con la toxina botulínica para incrementar una potencia de la neurotoxina. Por ejemplo, se sabe que la seroalbúmina bovina puede actuar más que como un nuevo excipiente estabilizante para la toxina botulínica del tipo A, puesto que la seroalbúmina bovina aparentemente también acelera la velocidad de catálisis de sustratos peptídicos sintéticos, sustratos los cuales se asemejan al sustrato intraneuronal SNAP-25 para la toxina botulínica del tipo A Schmidt, et al., Requerimientos de la Actividad Endoproteinasa del Sustrato de la Neurotoxina Botulínica del Tipo A y Activación por Seroalbúmina, J. de Protein Chemistry, 16(1), 19-26 (1997). De este modo, la albúmina puede tener un efecto potenciador, aparentemente afectando la cinética de la velocidad, tras la acción proteolítica intracelular de una toxina botulínica sobre el sustrato de la toxina. Este efecto potenciador puede deberse a la albúmina que ha acompañado a la toxina botulínica después de la endocitosis de la toxina en una neurona positiva o el efecto potenciador puede deberse a la presencia previa de albúmina citoplásmica dentro de la proteína de la neurona antes de la endocitosis de la toxina botulínica .

El descubrimiento de la presencia de un efecto simulador de la velocidad cinética por la seroalbúmina bovina tras la actividad proteolitica de la toxina botulinica tipo A vuelve la búsqueda de un sustituto adecuado para la albúmina en una formulación farmacéutica que contenga toxina botulinica especialmente problemática. De este modo, un sustituto de la albúmina con características de estabilización de la toxina deseables puede tener un efecto desconocido y posiblemente dañino sobre la velocidad de catálisis del sustrato por la toxina, puesto que al menos con respecto a la seroalbúmina bovina las dos características (estabilización de la toxina y potenciación de la catálisis del sustrato de la toxina) son aparentemente inherentes a la misma albúmina excipiente. Este efecto potenciador de la albúmina muestra que la albúmina no actúa como un mero excipiente en la formulación y por lo tanto hace la búsqueda de un sustituto adecuado para la albúmina más difícil. Adicionalmente existen muchas características únicas en la toxina botulinica y su formulación en una composición farmacéutica adecuada que restringe e impide y hace la búsqueda de un reemplazo para albúmina utilizada en las formulaciones farmacéuticas que contienen la toxina botulinica actual y problemática. Ejemplos de cuatro de esas característica únicas son las siguientes. Primera, la toxina botulinica es una proteína relativamente grande para incorporarse en la formulación farmacéutica (el peso molecular complejo de toxina botulinica tipo A es de 900 kD) y por lo tanto es inherentemente frágil y lábil. El tamaño del complejo de toxina la hace mucho más friable y lábil que proteínas menos complejas, más pequeñas, por lo que la composición de la formulación y las dificultades de manejo de la estabilidad de la toxina deben mantenerse. En consecuencia, un reemplazo de la albúmina debe ser capaz de interactuar con la toxina de tal manera que no desnaturalice, fragmente o destoxifique de otra forma la molécula de toxina o produzca la disociación de proteínas diferentes a la toxina presentes en el complejo de toxina. Segunda, como el producto biológico más letal conocido, es necesaria una seguridad, precisión y exactitud excepcional para todos los pasos de la formulación de una composición farmacéutica que contenga toxina botulinica. De este modo, un reemplazo de albúmina potencial preferido no deberá ser tóxico por sí mismo o difícil de manejar, de modo que no se exacerben los requerimientos de formulación de una composición farmacéutica que contiene toxina botulinica ya extremadamente estrictos. Tercera, desde que la toxina botulinica fue la primera toxina microbiana en ser aprobada para inyectarse para el tratamiento de enfermedades humanas, han sido desarrollados y aprobados protocolos específicos para el cultivo, producción a granel, formulación en un fármaco y uso de la toxina botulínica. Consideraciones importantes son la pureza de la toxina y dosis para la inyección. La producción por cultivo y la purificación debe llevarse a cabo de modo que la toxina no sea expuesta a ninguna sustancia que pueda contaminar el producto final, aún en cantidades de trazas y provocar reacciones indebidas en el paciente. Esas restricciones requieren cultivar el medio simplificado sin el uso de productos de carne de animal y purificación por procedimientos que no impliquen solventes o resinas sintéticas. La preparación de toxina utiliza enzimas, varios intercambiadores, tales como aquéllos presentes en columnas cromatográficas y solventes sintéticos pueden introducir contaminantes, y por lo tanto, están excluidos de los pasos de formulación preferidos. Además, la toxina botulínica tipo A se desnaturaliza fácilmente a temperaturas por encima de los 40 grados C, pierde toxicidad cuando se forman burbujas en la interfaz aire/líquido, y se desnaturaliza en presencia de nitrógeno o dióxido de carbono. Cuarta, existen dificultades particulares para estabilizar la toxina botulínica tipo A, debido a que la tipo A consiste de una molécula de toxina de aproximadamente 150 kD en asociación no covalente con proteínas diferentes a la toxina con un peso de aproximadamente 750 kD. Se cree que las proteínas diferentes a la toxina preservan o ayudan a estabilizar las estructuras secundaria y terciaria de las cuales depende la toxicidad. Los procedimientos o protocolos aplicables a la estabilización de sustancias no proteicas o proteínas relativamente más pequeñas no son aplicables a los problemas inherentes a la estabilización de complejos de toxina botulínica, tales como el complejo de toxina botulínica tipo A de 900 kD. De este modo, aunque de pH 3.5 a 6.8, la toxina del tipo A y las proteínas diferentes a la toxina están unidas entre sí de manera no covalente, bajo condiciones ligeramente alcalinas (pH> 7.1) la toxina muy lábil es liberada del complejo de toxina. Debido a su labilidad, la toxina pura no tiene o solo tiene utilidad limitada para administración médica. A la luz de la naturaleza única de la toxina botulínica y los requerimientos expuestos anteriormente, la probabilidad de encontrar un reemplazo de albúmina adecuado para la albúmina utilizada en las composiciones farmacéuticas que contienen toxina botulínica actuales, debe observarse de manera real que sea próxima a cero. Antes de la presente invención, únicamente las proteínas derivadas de animales como la albúmina y gelatina, habían sido reconocidas por tener utilidad como estabilizadores adecuados de la toxina botulínica presente en una formulación farmacéutica. De este modo, la albúmina, en sí, o con sustancias adicionales tales como el fosfato de sodio o citrato de sodio, es conocida por permitir una alta recuperación de la toxicidad de la toxina botulínica tipo A después de la liofilización . Desafortunadamente, como ya se expuso, la albúmina, como un producto obtenido de la sangre puede, al menos potencialmente, contener elementos infecciosos o que causen enfermedades cuando este presente en una composición farmacéutica. En realidad, cualquier producto o proteina animal, tal como la gelatina, también puede contener potencialmente pirógenos u otras sustancias que puedan producir reacciones adversas tras la inyección en un paciente . La solicitud de patente China CN 1215084A discute una toxina botulínica tipo A libre de albúmina formulada con gelatina, una proteína derivadas de animales. Esta formulación por lo tanto no elimina el riesgo de transmitir un elemento infeccioso o acompañante de proteína animal.

Hidroxietil Almidón Un polisacárido puede estar constituido de cientos o aún miles de unidades monosacáridas mantenidas juntas por enlaces glicosídicos (éter) . Dos polisacáridos importantes son la celulosa y el almidón. La celulosa es el material estructural principal en plantas, que da a las plantas su rigidez y forma. El almidón constituye el suministro de alimento de reserva de plantas y se encuentra principalmente en varias semillas y tubérculos.

El almidón se encuentra como gránulos cuyo tamaño y forma son características de la planta de la cual se obtiene el almidón. En general, aproximadamente 80% del almidón es una fracción insoluble en agua llamada amilopectina . La 5 amilopectina está constituida de cadenas de unidades de D- glucosa (como la glucopiranosa) , estando unida cada unidad por un enlace alfa glicosidico al C-4 de la siguiente unidad ^ de glucosa. Al igual que el almidón, la celulosa también está constituida de cadenas de unidades de D-glucosa, donde 10 cada unidad está unida por un enlace glicosidico al C-4 de la siguiente unidad. ? diferencia del almidón, los enlaces glicosídicos en la celulosa son enlaces beta. El tratamiento ) de la celulosa con ácido sulfúrico y anhídrido acético produce el disacárido celobiosa. Como se expuso 15 anteriormente, los intentos por estabilizar la toxina botulínica utilizando celobiosa han sido exitosos. Un derivado de almidón particular que puede ser obtenido tratando almidón con piridina y etilen clorhidrina, es el 2-hidroxietil almidón, también llamado hetaalmidón. La 20 Patente Estadounidense No. 4,457,916 describe una combinación de un tensoactivo no iónico e hidroxietil almidón para estabilizar soluciones acuosas de factor de la necrosis tumoral (TNF) . Adicionalmente, se conoce una solución acuosa al 6% de 2-hidroxietil almidón (hetaalmidón) (disponible de 25 Du Pont Pharma, ilmington, Delaware bajo el nombre comercial de HESPAN , hetaalmidón al 6% en inyección de cloruro de sodio al 0.9%). Se sabe que la albúmina actúa como un expansor del volumen del plasma tras la administración intravenosa a un paciente. El HESPAN® también ha sido administrado a pacientes para lograr un efecto de expansión del volumen del plasma y en ese sentido, el HESPAN® intravenoso, puede ser considerado un reemplazo para la albúmina intravenosa. El hetaalmidón es un coloide artificial derivado de un almidón ceroso compuesto casi totalmente de amilopectina . El hetaalmidón puede ser obtenido introduciendo grupos hidroxietil éter en unidades de glucosa del almidón, y el material resultante puede entonces ser hidrolizado para producir un producto con un peso molecular adecuado para utilizarse como un expansor del volumen del plasma. El hetaalmidón se caracteriza por su sustitución molar y también su peso molecular. La sustitución molar puede ser de aproximadamente 0.75, lo que significa que el hetaalmidón está eterificado en tal grado, que por cada 100 unidades de glucosa de hetaalmidón existen, en promedio, aproximadamente 75 grupos sustituyentes hidroxietilo . El peso molecular promedio en peso del hetaalmidón es de aproximadamente 670 kD con un intervalo de 450 kD a 800 kD, y con 80% de las unidades poliméricas cayendo dentro del intervalo de 20 kD a 2500 kD. Los grupos hidroxietilo están unidos por enlace éter, principalmente en C-2 de la unidad de glucosa y en un menor grado en C-3 y en C-6. El polímero se asemeja al glicógeno, y las unidades de D-glucosa polimerizadas están unidas · principalmente por enlaces a-1,4 con enlaces ramificantes a-1,6 ocasionales. El grado de ramificación es de aproximadamente 1:20, lo que significa que existe un promedio de aproximadamente una ramificación a-1,6 por cada 20 unidades de monómero de glucosa. El hetaalmidón está comprendido de más de 90% de amilopectina . La expansión del volumen del plasma producida por el HESPAN® puede aproximarse a la obtenida con la albúmina. Las moléculas de hetaalmidón por debajo del peso molecular de 50 kD son rápidamente eliminadas por excreción renal y una sola dosis de aproximadamente 500 mL de HESPAN® (aproximadamente 30 g) da como resultado la eliminación en la orina de aproximadamente 33% del HESPAN® administrado dentro de aproximadamente 24 horas. El grupo hidroxietilo del hidroxietil almidón no es escindido in vivo, sino que permanece intacto y unido a las unidades de glucosa cuando se excreta. Cantidades significativas de glucosa no son producidas como hidroxietilación, lo que previene el metabolismo completo de los polímeros de hidroxietil almidón más pequeños.

La celulosa puede de igual modo ser convertida a hidroxietil celulosa. El peso molecular promedio de la 2-hidroxietil celulosa (un 2-hidroxietil éter de celulosa) es de . aproximadamente 90 kD. Desafortunadamente, la hidroxietil celulosa, a diferencia del hidroxietil almidón, es altamente reactiva y por lo tanto no adecuada para utilizarse como estabilizador de un ingrediente proteico activo en una formulación farmacéutica. Lo que se necesita por lo tanto, es un reemplazo adecuado para la proteina derivada de animales o estabilizador de albúmina obtenido de un donador utilizado en composiciones farmacéuticas que contienen neurotoxina.

SUMARIO La presente invención satisface esta necesidad y proporciona un reemplazo para la albúmina presente en una composición farmacéutica por un compuesto el cual puede estabilizar la toxina botulinica presente en la composición farmacéutica. El compuesto de reemplazo de la albúmina tiene la característica de una inmunogenicidad baja, y de manera preferible despreciable, cuando se inyecta en un paciente humano. Adicionalmente, el reemplazador de la albúmina preferida tiene una velocidad de eliminación rápida del cuerpo después de la inyección de la composición farmacéutica .

Definiciones Como se utilizan aquí, las palabras o términos expuestos a continuación tienen las siguientes definiciones. La palabra "aproximadamente" significa que el elemento, parámetro ó término así calificado, abarca un intervalo de más o menos diez por ciento por encima y por debajo del valor del elemento, parámetro o término establecido . La frase "aminoácido" incluye poliaminoácidos . La palabra "polisacarido" significa un polímero de más de dos monómeros de molécula de sacárido, monómeros los cuales pueden ser idénticos o diferentes. La frase "composición farmacéutica" significa una formulación en la cual un ingrediente activo es una neurotoxína, tal como la neurotoxína Clostrídica. La palabra "formulación" significa que existe al menos un ingrediente adicional en la composición farmacéutica además del ingrediente activo de la neurotoxína. Una composición farmacéutica es por lo tanto una formulación la cual es adecuada para la administración terapéutica o para el diagnóstico (es decir, por inyección intramuscular o subcutánea) a un paciente humano. La composición farmacéutica puede estar: en una condición liofilizada o secada al vacío; una solución formada después de la .reconstitución de la composición farmacéutica liofilizada o secada al vacio con solución salina o agua, o; como una solución la cual no requiere reconstitución. El ingrediente activo de la neurotoxina puede ser uno de los xerotipos de la toxina botulinica A, B, Ci., D E, F o G o una toxina tetánica, todas las cuales son producidas por la bacteria Clostridica. La frase "formulación terapéutica" significa una formulación que puede ser utilizada para tratar y por lo tanto aliviar un trastorno o enfermedad, tal como un trastorno o enfermedad caracterizada por hiperactividad (es decir espasticidad) de un músculo periférico. Las palabras "estabilización", "estabiliza" o "estabilización" significan que tras la reconstitución con solución salina o agua de una composición farmacéutica que contiene toxina botulinica liofilizada o seca al vacio que ha sido almacenada en o por debajo de aproximadamente -2 grados centígrados durante entre seis meses y cuatro años o, de una composición farmacéutica que contiene toxina botulinica en solución acuosa que ha sido almacenada entre aproximadamente 2 grados y aproximadamente 8 grados C durante seis meses a cuatro años, la toxina botulinica presente en solución farmacéutica reconstituida o en solución acuosa tiene más de aproximadamente 20% y hasta aproximadamente 100% de la toxicidad que la toxina botulinica biológicamente activa tenía antes de ser incorporada a la composición farmacéutica.

Una composición farmacéutica dentro del alcance de la presente invención puede incluir una neurotoxina, y un polisaca'rido. El polisacarido estabiliza la neurotoxina. Las composiciones farmacéuticas descritas aquí pueden tener un pH de entre aproximadamente 5 y 7.3 cuando se reconstituyan o tras la inyección. El peso molecular promedio de una unidad disacárida del polisacarido esta preferiblemente entre aproximadamente 345 D y aproximadamente 2,000 D. En una modalidad más preferida, el peso molecular promedio de una unidad disacárida del polisacarido esta entre aproximadamente 350 kD y aproximadamente 1, 000 kD y en una modalidad más preferida entre aproximadamente 375 D y aproximadamente 700 D. Adicionalmente, el polisacarido puede comprender al menos aproximadamente 70% de amilopectina . Además, el peso molecular promedio en peso del polisacarido en si es de entre aproximadamente 20 kD y aproximadamente 2,500 kD. De manera preferible, sustancialmente todas las unidades disacaridas del polisacarido comprenden moléculas de glupiranosa ligadas por un enlace éter. Un promedio de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 10 de los grupos hidroxilo presentes en cada 10 de las glicopiranosas presentes en el polisacarido están sustituidos, a través de un enlace éter, con un compuesto de formula (CH2)n-OH, donde n puede ser un número entero de 1 a 10. De manera más preferible, n es un número entero de entre 1 y 3.

En una modalidad particularmente preferida, un promedio de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 9 de los grupos hidroxilo presentes en cada una de las 10 glucopironosas presentes en el ' polisacarido están sustituidos, a través de un enlace éter, con un compuesto de formula (CH2)n-OHp donde n puede ser un número entero de 1 a 10. Y en una modalidad más preferida, en promedio de 7 hasta aproximadamente 8 de los grupos hidroxilo presentes en cada una de las 10 glucopironosas presentes en los polisacáridos están sustituidos, a través de un enlace éter con un compuesto de la fórmula, (CH2)n-OH, donde n puede ser un número entero de 1 a 10. Una modalidad detallada de la presente invención puede ser una composición farmacéutica adecuada para inyectarse a un paciente humano, que incluye una toxina botulinica, y un polisacarido. El polisacarido puede comprender una propiedad de unidades de glicopironosa enlazadas, teniendo cada unidad de glicopironosa una pluralidad de grupos hidroxilo, donde un promedio de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 9 de grupos hidroxilos presentes en cada una de las 10 glucopironosas presentes en el polisacarido están sustituidos, a través de un enlace éter, con un compuesto de la fórmula (CH2)n-0H, donde n puede ser un número entero de 1 a . El polisacarido puede ser un polisacarido sustituido con etil éter.

La composición farmacéutica es adecuada para administrarse a un paciente humano para lograr un efecto terapéutico o, la neurotoxina puede ser una de los serotipos de la . toxina botulinica A, B, Ci, D, E, F y G. En una modalidad preferida de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un toxina botulinica e hidroxietil almidón. Otra modalidad de la presente invención puede abarcar una composición farmacéutica la cual incluye una toxina botulinica, un polisacárido y un aminoácido o un poliaminoácido . Donde la composición farmacéutica comprende, además del ingrediente activo de la neurotoxina, únicamente un estabilizador de polisaca'rido, únicamente un estabilizador de aminoácido o ambos estabilizadores de polisacárido y aminoácido, la composición farmacéutica retiene sú potencia sustancialmente sin cambios en un periodo de seis meses, un año, dos años, tres años y/o cuatro años almacenada a una temperatura de entere aproximadamente -1CC y aproximadamente -15°C. Adicionalmente, las composiciones farmacéuticas indicadas pueden tener una potencia o % de recuperación entre aproximadamente el 20% y aproximadamente el 100% después de la reconstitución. De manera alternativa o adicional, la composición farmacéutica puede tener una potencia de entere aproximadamente 10 U/mg y aproximadamente 30U/mg tras la reconstitución, tal como una potencia de aproximadamente 20 U/mg tras la reconstitución. De manera significativa, la composición farmacéutica esta desprovista de cualquier albúmina. De este modo, la composición farmacéutica puede estar sustancialmente libre de proteínas complejas diferentes a la toxina. De manera notable, el aminoácido pude estar presente en una cantidad de entre aproximadamente 0.5 mg y aproximadamente 1.5 mg de aminoácido por 100 unidades de toxina botulínica. El polisacárido pude ser un almidón tal como un hidroxietil almidón el cual, cuando la composición farmacéutica comprende aproximadamente 100 unidades de la toxina botulínica, pueden existir entre aproximadamente 500µg y aproximadamente 700µg del hidroxietil almidón presente. De manera preferible, la toxina botulínica es la toxina botulínica tipo A, y el aminoácido, cuando esta presente, es seleccionado del grupo que consiste de lisina, glicina, histidina y arginina. Una modalidad detallada más de la presente invención puede ser una composición farmacéutica de toxinas botulínicas tipo A secadas al vacío, no pirogénica, de alta potencia, estable, que comprende un complejo de toxina botulínica tipo A, un polisacárido, y, un aminoácido o un poliaminoácido. La composición farmacéutica puede estar libre de albúmina, tener una vida de anaquel de 1 año a -5°C con una potencia de aproximadamente el 90% inmediatamente después de la reconstitución con solución salina y agua y una de aproximadamente el 80% 72 horas después de la reconstitución y almacenamiento a 2°C. Adicionalmente, la composición farmacéutica puede tener una toxicidad especifica de al menos aproximadamente 18 U/mg tras la reconstitución. La presente invención también abarca una composición farmacéutica lifilizada o secada al vacio que consiste esencialmente de un polisacárido de alto peso molecular y una toxina botulinica, donde la toxina botulinica es estabilizada por el polisacárido de alto peso molecular. El polisacárido de alto peso molecular puede ser seleccionado del grupo que consiste de hidroximetil almidón, hidroxietil almidón, hidroxipropil almidón, hidroxibutil almidón, e hidroxipentil almidón y la toxina botulinica puede ser seleccionada del grupo que consiste de toxina botulinica tipos A, B, Ci, D, E, F y G. El polisacárido puede estar presente en la composición farmacéutica en una cantidad entre aproximadamente 1 X 10"9 moles del polisacárido por unidad de una toxina botulinica de aproximadamente 2 X 10"12 moles de polisacárido por unida de toxina botulinica. La presente invención también incluye un método para producir una composición farmacéutica, que comprende el paso de preparar una mezcla de una toxina botulinica y un polisacárido comprendido de monómeros repetidos ligados covalentemente, donde el peso molecular monomérico promedio es de entre aproximadamente 350 D y aproximadamente 1,000 D, y (b) un método para estabilizar una neurotoxina clostridica contra la desnaturalización o agregación, el método comprende el paso de poner en contacto una neurotoxina clostridica con una composición estabilizadora que comprende un polisacárido. El paso de contacto en este último método puede comprender el paso de agregar a una solución acuosa o a un polvo liofilizado o secado al vacio que contenga una neurotoxina clostridica una cantidad efectiva del polisacárido. Un aspecto más de la presente invención es una composición farmacéutica, que comprende una toxina botulinica, y una albúmina producida de manera recombinante. Esta composición preferiblemente también incluye un acetiltriptofanato y sales y derivados del mismo. Una modalidad adicional de la presente invención es un dispositivo para inyectar una composición farmacéutica que comprende una jeringa prellenada de doble cámara, una cámara de tal jeringa contiene una toxina botulinica y la segunda cámara de la jeringa contiene un diluente o amortiguador. Una modalidad más de la presente invención es un método para utilizar una composición farmacéutica, el método comprende el paso de la administración local de la composición farmacéutica a un paciente para lograr un efecto terapéutico, donde la composición farmacéutica comprende una toxina botulinica, un polisacárido y un' aminoácido. De manera significativa, la invención también incluye una composición farmacéutica, que comprende una toxina botulinica, y un aminoácido. Mi invención también incluye una composición farmacéutica estable, que consiste esencialmente de una toxina botulinica, y un aminoácido. Esas composiciones farmacéuticas pueden estar libres de albúmina, libres de polisacárido, tienen una vida de anaquel de 1 año a -5°C con al menos aproximadamente 90% de la potencia tras la reconstitución con solución salina o agua y una potencia de aproximadamente el 80% 72 horas después de la reconstitución y almacenamiento a 2°C.

DESCRIPCION La presente invención se basa en el descubrimiento de que puede ser formulada una composición farmacéutica que contenga neurotoxina estable libre de cualquier proteina derivada de animales o albúmina reunidas de un donador incorporando un polisacárido y/o un aminoácido en la composición farmacéutica. En particular, la presente invención se basa en el descubrimiento de que una composición farmacéutica que contiene toxina botulinica estable adecuada para la administración a un paciente humano para un efecto terapéutico puede ser producida reemplazando la albúmina reunida de un donador presente en composiciones farmacéuticas que contienen toxinas botulinica conocidas con un polisacárido de alto peso molecular derivado de almidón y/o con ciertos aminoácidos reactivos. De manera sorprendente, he encontrado que un reemplazo adecuado para la albúmina es un compuesto el cual no es otra proteina, ni un compuesto no proteico, de bajo peso molecular. De este modo, he descubierto que los polisacáridos de alto peso molecular en particular pueden funcionar como estabilizadores de neurotoxina en una composición farmacéutica. Como se expone más adelante, también puede ser agcecpdb un aminoácido o caro a la composición farmacéutica para incrementar la estabilidad y vida útil tras el almacenamiento de la composición farmacéutica. . El polisacárido utilizado en la presente invención puede impartir estabilidad a un ingrediente activo de una neurotoxina, tal como una toxina botulinica, presente en la composición farmacéutica: (1) reduciendo la adhesión (comúnmente referida como "adherencia") de la toxina botulinica a superficies, tales como las superficies de material de vidrio de laboratorio, recipientes, frasco en el cual la composición farmacéutica reconstituida y la superficie interna de la jeringa utilizada para inyectar la composición farmacéutica. La adhesión de la toxina botulinica a superficies puede conducir a la pérdida de la toxina botulinica y a la desnaturalización de la toxina botulinica retenida, ambas de las cuales reducen la toxicidad de la toxina botulinica presente en la composición farmacéutica. (2). reduciendo la desnaturalización de la toxina botulinica y/o disociación de la toxina botulinica de otras proteínas diferentes a la toxina presentes en el complejo de la toxina botulinica, actividades de desnaturalización y/o disociación las cuales pueden ocurrir debido a la baja dilución de la toxina botulinica presente en la composición farmacéutica (es decir antes de la liofilización o secado al vacío) y en la composición farmacéutica reconstituida. (3) reduciendo la pérdida de toxina botulinica (es decir la desnaturalización o disociación de proteínas diferentes a la toxina en el complejo) durante el pH y concentración considerables que toman lugar durnate la preparación, procesamiento y reconstitución de la composición farmacéutica. Los tres tipos de estabilizaciones de la toxina botulinica proporcionados por el polisacárído conservan y preservan la toxina botulinica con su toxicidad nativa antes de la inyección de la composición farmacéutica. Lh p-fliparñHri pceferido para utilizarse en la composición de la presente comprende una pluralidad de monómeros de glucosa (peso molecular de 180) con uno o más sustituyentes sobre una mayoría de los monómeros de glucosa, de modo que el polisacárido preferido tenga un intervalo de peso molecular de entre 20 kD y aproximadamente 800 kD. De manera sorprendente, tal polisacárido puede estabilizar un componente de neurotoxina presente en una composición farmacéutica. La presente invención excluye de su alcance oligosacáridos disacáridos con un peso molecular promedio en peso menor de aproximadamente 20 kD. La presente invención también excluye de su alcance polímeros cíclicos tales como las ciclodextrinas . Las últimas dos clases de compuestos están excluidas del alcance de la presente invención debido a las características de estabilización deseadas del polisacárido preferido mientras que el requerimiento de un compuesto de peso molecular relativamente alto (es decir un peso molecular que exceda de 20 kD) no se requiere y en realidad puede · no hacer uso de la característica de la cavidad liofílica pequeña de las ciclodextrinas, debido a que la cavidad lipofílica de la ciclodextrina es mucho menor en tamaño que en tamaño de las neurotoxinas estabilizadas por los polisacáridos preferidos de la presente invención adicionalmente, las ciclodextrinas son compuestos de bajo peso molecular que comprenden únicamente de aproximadamente 6 a 8 monómeros de glucosa. La presente invención también abarca un método para estabilizar composiciones farmacéuticas las cuales contienen una toxina clostrídica con un polisacárido. El efecto estabilizador se logra poniendo una toxina clostrídica en contacto con el polisacárido . Los ejemplos de polisacáridos adecuados dentro del alcance de mi invención incluyen ciertos almidones y derivados de almidones. Como se hizo notar, el polisacárido exhibe un efecto estabilizador sobre la toxina clostrídica. Además,- el efecto del polisacárido para estabilizar una toxina clostrídica puede ser mejorado mediante la adición de un aminoácido. De manera inesperada, he descubierto que el 2-hidroxietil almidón demuestra una capacidad única para estabilizar la toxina botulínica presente en una composición farmacéutica que contiene toxina botulínica, proporcionando por lo tanto, una composición farmacéutica, la cual evita el potencial de albergar una enfermedad transmisible derivada de sangre humana o una fracción de sangre reunida de donadores o proteínas derivadas de animales similares a la gelatina. De este modo, he descubierto que el polisacárido de alto peso molecular particular, hidroxietil almidón, puede estabilizar la toxina durante la formulación, secado, almacenamiento y reconstitución. De manera preferible, para estabilizar aún más el ingrediente proteico activo, también se incluye un aminoácido en la formulación que contiene polisacárido.

El polisacárido en la composición farmacéutica es preferiblemente mezclado con la neurotoxina clostridica en una cantidad de aproximadamente 1 µg de polisacárido por unidad de toxina botulínica hasta aproximadamente 10 µg de polisacárido por unidad de toxina botulínica. De manera más preferible, el polisacárido en la composición farmacéutica es mezclado con la neurotoxina clostridica en una cantidad de aproximadamente 4 de polisacárido por unidad de toxina botulínica hasta aproximadamente 8 µg de polisacárido por unidad de toxina botulínica. En una modalidad más preferida, donde el polisacárido es un hidroxietil almidón, el hidroxietil almidón en la composición farmacéutica es preferiblemente mezclado con un complejo de toxina botulínica tipo A en una cantidad de aproximadamente 5 µg de hidroxietil almidón por unidad de toxina botulínica hasta aproximadamente 7 µg de hidroxietil almidón por unidad de toxina botulínica. De manera más preferible, el hidroxietil almidón en la composición farmacéutica se mezcla con un complejo de toxina botulínica tipo A en una cantidad de aproximadamente 6 µg de hidroxietil almidón por unidad de toxina botulínica. Puesto que el BOTOX® contiene aproximadamente 100 unidades de complejo de toxina botulínica tipo A por frasco, y se considera que el peso molecular promedio del hidroxietil almidón está de manera general entre aproximadamente 20 kD y aproximadamente 2500 kD, la concentración más preferida del hidroxietil almidón es entre aproximadamente 1 X 10"9 moles por unidad de toxina botulinica (M/U) hasta aproximadamente 2 X 10"12 moles por unidad de toxina botulinica. En otra modalidad preferida, para una composición farmacéutica de 100 U de complejo de toxina botulinica tipo A, se incluyen aproximadamente 600 µ? del hidroxietil almidón y aproximadamente 1 irig de un aminoácido, tal como la lisina, glicina, histidina o arginina en la formulación. De este modo, la invención abarca tanto un polisacárido como un aminoácido o un poliaminoácido para estabilizar el ingrediente activo de la neurotoxina en la composición farmacéutica . Adicionalmente, la invención también abarca el uso de un aminoácido adecuado en una cantidad suficiente para estabilizar el ingrediente proteico activo en una composición farmacéutica, ya sea en presencia de o la exclusión de cualquier polisacárido que este presente en la formulación. De este modo, he descubierto de manera sorprendente, que la inclusión de ciertos aminoácidos en una formulación de composición farmacéutica que contiene neurotoxina puede extender la vida de anaquel útil de tal composición farmacéutica. De este modo, mi invención abarca una composición farmacéutica que contiene neurotoxina que incluye un aminoácido y el uso de tal composición farmacéutica. Sin desear unirse a ninguna teoría, puede postular que, puesto que una neurotoxina, tal como la toxina botulínica, es susceptible a la oxidación, debido a la presencia de enlaces disulfuro en el complejo de toxina, la inclusión de un aminoácido oxidable puede actuar reduciendo la probabilidad de que los oxidantes, tales como los peróxidos y radicales libres, reaccionen con la neurotoxina. De este modo, la probabilidad de que el enlace disulfuro de la neurotoxina oxidable sea oxidado por un oxidante, tal como peróxidos y radicales libres, puede reducirse tras la inclusión de un aminoácido que pueda actuar como un disipador oxidativo, es decir, como un depurador para compuestos oxidantes. Un aminoácido adecuado es un aminoácido el cual sea objeto de la oxidación. Los ejemplos de aminoácidos preferidos son la metionina, cisteína, triptófano y tirosina. Un aminoácido particularmente preferido es la metionina. Una modalidad preferida de mi invención puede incluir el uso de dos o más aminoácidos solos o en combinación con un polisacárido para estabilizar el ingrediente proteico activo de una composición farmacéutica. De este modo, para una composición farmacéutica que contiene 100 U de toxina botulínica tipo A, pueden utilizarse aproximadamente 0.5 mg de lisina y aproximadamente 0.5 mg de glicina, con o sin entre aproximadamente 500 y aproximadamente 700 g de hetaalmidón. De este modo, como se expuso anteriormente, mi invención abarca, una composición farmacéutica que contiene una proteina la cual incluye un polisacárido. El polisacárido actúa para estabilizar el ingrediente proteico activo en la composición farmacéutica. Adicionalmente, la invención también incluye una composición farmacéutica que contiene una proteina la cual incluye un polisacárido y un aminoácido. De manera sorprendente, he descubierto que la inclusión de ciertos aminoácidos en una formulación de compuestos farmacéuticos que contienen una neurotoxina que incluye un carbohidrato puede extender la vida de anaquel útil de tal composición farmacéutica. De este modo, la invención abarca una composición farmacéutica que contiene neurotoxina que incluye un polisacárido y un aminoácido y el uso de tal composición farmacéutica. Además, la invención también abarca el uso de un aminoácido sin que esté presente ningún polisacárido en la composición farmacéutica del ingrediente proteico activo. Es sabe que las composiciones farmacéuticas que contienen proteina también contienen azúcar, polisacáridos y/o carbohidratos (referidos aquí posteriormente como "compuestos reactivos") son inherentemente inestables debido al hecho de que una proteína y uno de los tres compuestos reactivos indicados pueden experimentar la reacción de Maillard bien descrita. Se ha llevado a cabo una investigación exhaustiva, y la medida infrustífera, para tratar de reducir la incidencia o prevalescencia de esta reacción de Maillard de proteína-polisacárido (por ejemplo), mediante la reducción de la humedad o mediante el uso de azúcares no reductores en la formulación. Mi descubrimiento se basa en la observación de que la inclusión de una alta concentración de un aminoácido altamente reactivo hace que la reacción de Maillard tome lugar entre el polisacárido estabilizante y el aminoácido agregado. Proporcionando una fuente de amina abundante para que el carbohidrato reaccione, la probabilidad de que el fármaco proteico (es decir el ingrediente activo de la toxina botulínica) se involucre en la reacción de Millard se reduce, reduciendo por lo tanto esta vía de degradación del ingrediente proteico activo y su forma en la cual estabiliza el ingrediente proteico activo en la composición farmacéutica. De manera preferible, puede ser utilizado cualquier compuesto que contenga una amina primaria o secundaria para este propósito. Más preferidos son los aminoácidos, tales como la lisina, glicina, arginina. Los poliaminoácidos , tales como la polilisina también son adecuados. Los aminoácidos catiónicos tales como la lisina pueden experimentar la tracción iónica, unión de proteínas ácidas (por ejemplo, toxinas botulínicas) y protección de la proteína activa del contacto con azúcares. La polilisina, además de ser más grande y por lo tanto tener mayor probabilidad de actuar como protección, proporciona la ventaja adicional de ser antibacteriana . Otro aspecto de mi invención es la prerreacción de los componentes de azúcar y aminoácidos para acortar el potencial de la reacción de Maillard antes de agregar el componente proteico activo (toxina botulínica) a los ingredientes de formulación de azúcar y aminoácido, limitando por lo tanto de manera sustancial la exposición de la proteína activa a reacciones de Maillard. De este modo, mi invención abarca una composición farmacéutica que contiene y usa aminoácidos y poliaminoácidos tales como los inhibidores de la reacción de Millard en formulaciones de fármacos proteicos (es decir toxinas botulínicas) que contienen almidones, azúcares y/o polisacáridos . La invención incorpora formulaciones de proteínas activas (por ejemplo, toxina botulínica) en combinación con almidón estabilizador, azúcar o polisacárido o combinación de esos y un aminoácido tal como la lisina. De manera significativa, he descubierto que el hidroxietil almidón no experimenta una tasa o nivel más atenuado de reacciones de Maillard con una proteina, tal como la toxina botulinica, cuando el hidroxietil almidón es comparado con otros polisacáridos o carbohidratos. Adicionalmente, he descubierto que la inclusión de un aminoácido mejora el efecto de preservación del hidroxietil almidón, posiblemente por actuar como inhibidor competitivo, es decir por competir con la toxina por los azúcares reactivos en la reacción de Millard. Para este propósito, los aminoácidos tales como la lisina, glicina, arginina e histidina son los aminoácidos preferidos. Los poliaminoácidos, tales como la polilisina, que exhiben el comportamiento de inhibición competitiva deseada también pueden ser utilizados. De manera notable, el aminoácido y poliaminoácidos especificados también pueden exhibir propiedades antimicrobianas, proporcionando por lo tanto el beneficio adicional de reducir la contaminación bacteriana en la composición farmacéutica. Los azúcares reductores, tales como la glucosa y polímeros de glucosa, experimentan reacción de Millard con proteína. Aún los alcoholes azucarados tales como el mannitol pueden reaccionar, aunque algunas veces a través de contaminantes o productos de degradación. Por lo tanto un polisacárido puede estabilizar la toxina por un periodo de tiempo únicamente para que reaccione químicamente más tarde, produciendo por lo tanto una estabilidad de almacenamiento reducida. Es obvio que la elección del polisacárido es critica. He descubierto que la velocidad de participación del hidroxietil almidón en la reacción de Millard es muy lenta. Adicionalmente, he encontrado que la hidroxietil celulosa, aunque es estructuralmente muy similar al hidroxietil almidón es inestable para utilizarse como estabilizador, puesto que he encontrado que la hidroxietil celulosa puede reaccionar rápidamente en un sistema modelo con lisina. Esto no solo significa que el hidroxietil almidón tiene una ventaja obvia sobre otros estabilizadores de azúcar (por ejemplo polisacáridos) , sino que aún a excipientes similares al hidroxietil almidón, tales como la hidroxietil celulosa, pueden no ser adecuados para utilizarse como estabilizadores de un ingrediente proteico activo de una formulación farmacéutica . Como se hizo notar, el hidroxietil almidón puede participar en al menos algún grado, en reacciones de Maillard. De este modo, y como se expuso anteriormente, un polisacárido puede o no ser suficiente para proporcionar la estabilización óptima de la toxina. De este modo, descubrí las ventajas de la inclusión de un aminoácido que actúa como un inhibidor competitivo. Sin desear unirse a ninguna teoría, la hipótesis es que proporcionar otra fuente de amina, en altas concentraciones en comparación con la toxina, la probabilidad de que la reacción de Maillard ocurra con la toxina se reduce, estabilizando por lo tanto la toxina. Puede ser utilizado cualquier aminoácido, sin embargo la lisina es altamente reactiva y es un aminoácido preferido. Mi invención también abarca la adición de una fuente de ion de zinc a una formulación farmacéutica que contiene toxina botulinica. Se reportó que metales, especialmente los cationes divalentes, tienen mucha influencia sobre el éxito de una formulación sacada por congelamiento debido a las diferentes criopropiedades incluyen la estructura de la malla de los hielos formados. Los metales extraños tales como las especies de cobre y hierro producen en si oxidaciones de radicales y de manera general deben ser editados. De manera más específica la toxina Botulinica del Tipo A depende del zinc unido para su actividad. Muchos de los productos de reacción o excipientes crearán metales. Esto podría conducir a la formación de hielos inestables y/o toxina inactivada. Suministrando una amplia cantidad de zinc en la formulación se asegura la presencia de los cationes divalentes deseados, la probabilidad de pérdida de zinc por la toxina se reduce, y mejora la estabilidad. Esto puede lograrse mediante la adición de ZnS04 a una composición farmacéutica de toxina botulinica . Se sabe como efectuar la producción de seroalbúmina humana recombinante (rHSA) utilizando una cepa de expresión de levadura metilotrófica Pichia pastoris con alta productividad. Las formulaciones farmacéuticas que contiene toxina botulinica pueden ser preparadas conteniendo rHSA estabilizadora. La rHSA expresada por células huésped en levadura genéticamente alteradas, aunque tienen la misma secuencia de aminoácidos primaria, difieren en otros aspectos de la HSA derivada del plasma. De este modo, aunque son eucarióticas, la levadura, carecen de muchos procesos intracelulares encontrados en los mamíferos. Adicionalmente, la pHSA ( seroalbúmina humana derivada del plasma) es producida en forma no glicosilada y experimenta la adición no enzimática, extracelular de glucosa. En consecuencia, las porciones carbohidratadas de la pHSA y la rHSA difieren. Además, se sabe que las cantidades de ácido palmitico y ácido esteárico presentes en la rHSA son mucho menores que aquellas en la pHSA. Puede esperarse que esas diferencias tengan como resultado diferencias en, ínter alia, del ligando, estabilidad conformacional y carga molecular entre la rHSA y pHSA. Por lo tanto fue sorprendente descubrir que la rHSA puede ser utilizada para estabilizar la toxina botulinica, particularmente a la luz del efecto de la velocidad cinética conocida de la pHSA de la toxina botulinica. Una ventaja de la rHSA es que está libre de patógenos en la sangre. De este modo, otro aspecto de la invención abarca el reemplazo de seroalbúmina humana derivada de la sangre en una composición farmacéutica rHSA. De manera preferible, la rHSA está presente en la formulación farmacéutica que contiene toxina botulinica con la acetiltriptofanato, como se expone más adelante . La seroalbúmina humana comercialmente disponible es calentada a 60 °C durante 10 horas como un requerimiento para eliminar agentes potencialmente infecciosos derivados de sangre humana reunida. Para prevenir la desnaturalización seria durante este proceso se agregan dos estabilizadores: acetiltriptofanato de sodio y caprilato de sodio. Con una rHA no existe la necesidad de agregar esos ingredientes puesto que no existe riesgo de enfermedad y no requiere el paso de calentamiento. He descubierto que la adición de acetiltriptofanato de sodio a la rHA mejora la estabilidad térmica más allá de lo mostrado por el uso de caprilato de sodio solo, cuando la concentración de caprilato de sodio se duplique. Sin desear unirse a ninguna teoría, creo que se debe a que la unión .del caprilato a un solo sitio mientras que el acetil triptofanato de sodio se une a dos sitios. La unión a este segunda sitio parece mejorar la resistencia a la perturbación térmica. Puede formular además que la adición de acetiltriptofanato de sodio puede de alguna manera mejorar 'la estabilidad de formulaciones de la toxina botulinica, posiblemente manteniendo una conformación termodinámicamente favorable en la molécula, uniendo la toxina, y previniendo la desnaturalización de la serolbúmina humana en si. Mi invención también abarca la adición de un preservativo, ya sea en el diluente o formulación en si, para permitir un almacenamiento prolongado. Un preservativo preferido es la solución salina preservada que contiene alcohol bencílico. Una formulación liquida puede ser ventajosa. Una presentación en un solo paso (por ejemplo, una jeringa prellenada) o una configuración de producto que el usuario perciba como una presentación de un solo paso (por ejemplo, una jeringa de doble cámara) proporcionaría conveniencia eliminando el paso de reconstitución. El secado por congelamiento es un proceso complicado, caro y difícil. Las formulaciones líquidas con frecuencia son más fáciles y baratas de producir. Por otro lado las formulaciones líquidas son sistemas dinámicos y por lo tanto más susceptibles a la interacción del excipiente, reacciones más rápidas, crecimiento bacteriano y oxidación de las formulaciones secadas por congelamiento o liofilización. Puede ser necesario un preservativo compatible. También pueden ser útiles antioxidantes tales como la metionina como depuradores especialmente y se utilizan tensoactivos para reducir la absorción puesto que muchos de esos compuestos contiene o producen peróxidos. Cualquiera de los excipientes estabilizadores que pueden ser utilizados en una formulación secada por congelamiento (por ejemplo hidroxietil almidón o un aminoácido tal como la lisina) pueden ser adaptados para ser utilizados en una formulación liquida para ayudar a reducir la absorción y estabilizar la toxina. Suspensiones similares a aquellas reveladas para la insulina también son buenas candidatas. Adicionalmente, la estabilización de la toxina botulinica en un vehículo liquido puede requerir un vehículo de pH bajo puesto que se reporta que la toxina es lados por encima de un pH de 7. Esta acidez podría producir quemaduras y urticaria tras la inyección. Podría ser empleada una jeringa binaria. La inclusión de un amortiguador codisperso, es suficiente para elevar el pH al pH fisiológico, aliviaría la incomodidad de la inyección de un pH bajo manteniendo a la vez la toxina a un pH bajo durante el almacenamiento. Otra opción de jeringa de doble cámara incluiría diluente y material lipofilizado agregado en una cámara secadora, únicamente mezclables en uso. Esta opción proporciona la ventaja de una formulación líquida sin recursos y tiempo adicionales. De este modo, la toxina botulinica puede ser preparada a un pH para ser codispensada con un amortiguador que lee el pH en o cerca del pH fisiológico al momento de la administración. Al jeringa de dos cámaras o binaria puede tener en al primera cámara (cerca del émbolo) una formulación liquida de una toxina botulinica con un pH de 3 a 6 (es decir a pH 4.0). La segunda cámara (cercana a la punta de la aguja) puede contener un amortiguador adecuado, tal como solución salina amortiguada con fosfato a un pH mayor (es decir pH 7.0). De manera alternativa, al primera cámara puede contener un diluente salino y la segunda cámara puede contener una formulación de neurotoxinas secadas por congelamiento ° liofil izada . -^as dos cámara pueden ser unidas de tal manera y los componentes amortiguadores seleccionados de tal manera que las soluciones se mezclen muy cerca de la aguja, liberando por lo tanto la solución final a un pH fisiológico. Las jeringas de dos cámaras adecuadas para utilizarse como jeringas prellenadas para los propósitos descritos aquí pueden obtenerse de Vetter Pherma-Fertigung de Yardley, Pennsylvania . Existen ventajas distintas para formular toxina botulinica a un pH bajo. La toxina tiene un punto isoeléctrico (pl) bajo y formular proteina cerca de su pl se una forma conocida de estabilizar a la proteina. Adicionalmente, la toxina es utilizada a una concentración muy baja haciendo de la adsorción superficial un problema. El uso de una solución de pH bajo puede suprimir la ionización de la toxina en sitios que probablemente interactúan con la superficie. Los materiales de la jeringa y el embolo son materiales que reducen la adsorción superficial por la toxina. Los materiales adecuados son el polipropileno.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Composiciones Farmacéuticas de Toxina Botulinica Como se expuso anteriormente, el complejo de toxinas botulinicas tipo A puede ser obtenido de un cultivo de cepas Hall de Clostridium botulinum crecido en un medio que contiene N-Z amina y extracto de levadura. El complejo de toxina botulinica tipo A es purificada de la solución de cultivo de la serie de precipitaciones ácidas hasta un complejo cristalino que consiste de la proteina de toxina de peso molecular alto activa y una proteina de hemaglutina asociada. El complejo cristalino es entonces redisuleto en una solución que contiene solución salina y albúmina y filtrado de manera estéril (0.2 micrones) antes de secar al vacio. El BOTOX®, se reconstituye entonces con soluciones salinas no preservadas, estériles, antes de la inyección intramuscular. Cada frasco de BOTOX® contiene aproximadamente 100 unidades (U) de complejo de toxina tipo A de Clostridium botulinum, 0.5 miligramos de seroalbúmina humana y 0.9 miligramos de cloruro de sodio en forma secada al vacio, sin un preservativo. De manera alternativa, la seroalbúmina humana puede ser reemplazada por una albúmina producida de manera recombinante .

Ejemplo 2 Composición Farmacéutica de la Toxina Botulinica que Contiene 2-Hidxoxietil Almidón Se prepararon soluciones farmacéuticas de complejo de neurotoxina purificado de toxina botulinica tipo A de la misma manera expuesta en el ejemplo 1 anteriormente, excepto que de los 0.5 miligramos de albúmina fueron reemplazados por 500µ? o 600µ? de hetaalmidón. Se determinó que se mantuvo toda la potencia para la preparación de las formulaciones que contenían hetaalmidón. De este modo, con ambas formulaciones que contienen hetaalmidón, la potencia de la composición que contiene hetaalmidón, libre de albúmina, de acuerdo a lo medido al momento de la reconstitución de lo utilizado, 100 U (± 20 U) de complejo de toxina botulinica tipo A, fue de 96 a 128 unidades. Tres composiciones farmacéuticas de hetaalmidón, complejo de toxina botulinica tipo A tuvieron mediciones de potencia, al momento de la reconstitución, de, respectivamente, 105,111 y 128 unidades. La potencia se midió utilizando la administración estándar a ensayos de potencia de toxinas de ratones.

Ejemplo 3 Composición Farmacéutica de Toxina Botulinica que Contiene Glicina Se prepararon formulaciones farmacéuticas de complejo de neurotoxina purificada de toxina botulinica tipo A de la misma manera que se expuso en el Ejemplo 1 anteriormente, excepto que los 0.5 miligramos de albúmina fueron reemplazados por 500 µ? o 600 µ? de hetaalmidón. Además, se agregó 1 mg de glicina a la formulación. Una composición farmacéutica, liofilizada, de hetaalmidón más glicina, libre de albúmina, 100 U de complejo de toxina botulinica tipo A fue entonces almacenada durante siete meses a -5°C. Al final de este periodo de siete meses, se determinó la potencia de esta formulación de toxina con hetaalmidón más glicina, utilizando el ensayo de administración en ratón, la cual no cambio esencialmente (es decir, que la potencia difirió en menos del 5% de la potencia original) .

Ejemplo 4 Composición Farmacéutica de Toxina Botulinica que Contiene Lisina Se prepararon formulaciones farmacéuticas de complejo de neurotoxina purificada de 100 U de toxina botulínica tipo A de la misma manera que se expuso en el Ejemplo 1 anteriormente, excepto que los 0.5 miligramos de albúmina fueron reemplazados por 600 µg de hetaalmidón. Además, se agregó 1 mg de lisina a la formulación. Una composición farmacéutica, liofilizada, de hetaalmidón más lisina, libre de albúmina, 100 U de complejo de toxina botulínica tipo A fue entonces almacenada durante un año a -5°C. Al final de este periodo de un año, se determinó la potencia de esta formulación de hetaalmidón más lisina y toxina, utilizando el ensayo de administración en ratón, la cual no cambio esencialmente (es decir, que la potencia difiere en menos del 5% de la potencia original) .

Ejemplo 5 Composición Farmacéutica de Toxina Botulínica que Contiene Histidina Se prepararon formulaciones farmacéuticas de complejo de neurotoxina purificada de 100 U de toxina botulínica tipo A de la misma manera que se expuso en el Ejemplo 1 anteriormente, excepto que los 0.5 miligramos de albúmina fueron reemplazados por 600 µg de hetaalmidón. Además, se agregó 1 mg de histidina a la formulación. Una composición farmacéutica, liofilizada, de hetaalmidón más histidina, libre de albúmina, 100 U de complejo de toxina botulínica tipo A fue entonces almacenada durante un año a -5°C. Al final de este periodo de un año, se determinó la potencia de esta formulación de hetaalmidón más histidina y toxina, utilizando el ensayo de administración en ratón, la cual no cambio esencialmente (es decir, que la potencia difiere en menos del 5% de la potencia original) .

Ejemplo 6 Composición Farmacéutica de Toxina Botulínica que Contiene Arginina Se prepararon formulaciones farmacéuticas de complejo de neurotoxina purificada de 100 U de toxina botulínica tipo A de la misma manera que se expuso en el Ejemplo 1 anteriormente, excepto que los 0.5 miligramos de albúmina fueron reemplazados por 600 µ? de hetaalmidón. Además, se agregó 1 mg de arginina a la formulación. Una composición farmacéutica, liofilizada, de hetaalmidón más arginina, libre de albúmina, 100 U de complejo de toxina botulínica tipo A fue entonces almacenada durante un año a -5°C. Al final de este periodo de un año, se determinó la potencia de esta formulación de hetaalmidón más arginina y toxina, utilizando el ensayo de administración en ratón, la cual no cambio esencialmente (es decir, que la potencia difiere en menos del 5% de la potencia original) .

Ejemplo 7 Composición Farmacéutica de Toxina Botulxnica que Contiene un Aminoácido Se prepararon formulaciones farmacéuticas de complejo de neurotoxina purificada de toxina botulinica tipo A de la misma manera que se expuso en el Ejemplo 1 anteriormente, excepto que los 0.5 miligramos de albúmina pueden ser reemplazados por aproximadamente 1 mg de un aminoácido tal como la lisina, glicina, histidina, o arginina. Una composición farmacéutica, liofilizada, libre de polisacárido, libre de albúmina más glicina, libre de albúmina, 100 ü de complejo de toxina botulinica tipo A, pueden ser almacenada durante al menos un año a -5°C, y al final de este periodo puede tener una potencia la cual no cambia esencialmente (es decir, que la potencia puede diferir en menos del 5% de la potencia original) .

Ejemplo 8 Uso de una Composición Farmacéutica de Toxina Botulinica Un hombre de 48 años de edad fue diagnosticado con una condición espástica muscular, tal como distonia cervical. Se inyectaron intramuscularmente en el paciente entre aproximadamente 10"3 U/kg y aproximadamente 35 U/kg de una composición farmacéutica de toxina botulinica tipo A que contenia 600 µg de hetaalmidón y 1 mg de un aminoácido tal como la lisina. Dentro de 1-7 días, los síntomas de la condición espástica muscular se aliviaron, y el alivio de los síntomas persistió durante al menos aproximadamente 2 meses hasta aproximadamente 6 meses. Una composición farmacéutica de acuerdo a la invención descrita aquí tiene muchas ventajas, incluyendo las siguientes : 1. La composición farmacéutica puede ser preparada libre de cualquier producto de sangre, tal como la albúmina, y por lo tanto libre de cualquier elemento infeccioso de productos de la sangre tales como un prión. 2. La composición farmacéutica tiene estabilidad y un alto porcentaje de recuperación de potencia de la toxina en comparación con o superior a la lograda por las composiciones farmacéuticas actualmente disponibles. Aunque la presente invención ha sido descrita con detalle con respecto a ciertas modalidades preferidas, son posibles otras modalidades, versiones y modificaciones dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, una amplia variedad de polisacáridos estabilizadores y aminoácidos están dentro del alcance de la presente invención .

En consecuencia, el espíritu y alcance de las siguientes reivindicaciones no deberá limitarse a las descripciones de las modalidades preferidas expuestas anteriormente . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una composición farmacéutica, caracterizada porque que comprende: (a) una neurotoxina, y; (b) un polisacárido, donde el polisacárido estabiliza la neurotoxina. 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el peso molecular promedio de la unidad disacarida del polisacarido es de entre aproximadamente 350 D y aproximadamente 2,000 D. 3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el peso molecular promedio de la unidad disacarida del polisacarido es de entre aproximadamente 375 D y aproximadamente 700 D. 4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polisacarido comprende al menos aproximadamente 70% de amilopectina. 5. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el peso molecular promedio en peso del polisacárido es de aproximadamente 20 kD y aproximadamente 2,500 kD. 6. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque sustancialmente todas las unidades . disacaridas del polisacarido comprenden moléculas de glucopiranosa ligadas por enlaces éter. 7. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque un promedio de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 10 de los grupos hidroxilo presentes en cada una de las 10 glucopiranosas presentes en el polisacarido están sustituidos, a través de un enlace éter, con un compuesto de la formula (CH2)n~OH, donde n puede ser un número entero de 1 a 10. 8. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque n es un número entero de entre 1 y 3. 9. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque un promedio de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 9 de los grupos hidroxilo presentes en cada una de las 10 glucopiranosas presentes en el polisacarido están sustituidos, a través de un enlace éter, con un compuesto de la formula (CH2)n_OH, donde n puede ser un número entero de 1 a 10. 10. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque un promedio de aproximadamente 7 hasta aproximadamente 8 de los grupos hidroxilo presentes en cada una de las 10 glucopiranosas presentes en el polisacárido están sustituidos, a través de un enlace éter, con un compuesto de la formula (CH2)n-OH, donde n puede ser un número entero de 1 a 10. 11. Una composición farmacéutica adecuada para inyectarse en un paciente humano, caracterizada porque comprende : (a) una toxina botulinica, y; (b) un polisacá ido que comprende una pluralidad de unidades de glucopiranosa ligadas, cada unidad de glucopiranosa tiene una pluralidad de grupos hidroxilos, donde un promedio de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 9 de los grupos hidroxilo presentes en cada una de las 10 glucopiranosas presentes en el polisacárido están sustituidos, a través de un' enlace éter, con un compuesto de la fórmula (CH2)n-OH, donde n puede ser un número entero de 1 a 4. 12. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el peso molecular promedio de una unidad disacárida del polisacárido es de entre aproximadamente 345 D y aproximadamente 1,000 D. 13. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el polisacárido es un polisacárido sustituido con etil éter. 14. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la composición farmacéutica es adecuada para administrarse a un paciente humano para lograr un efecto terapéutico. 15. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la toxina botulinica es seleccionada del grupo que consiste de toxinas botulinicas de los tipos A, B, Ci, D, E, F y G. 16. Un composición farmacéutica caracterizada porque comprende: (a) una toxina botulinica, y; (b) un hidroxietil almidón, donde la composición farmacéutica es adecuada para administrarse a un paciente humano para lograr un efecto terapéutico. 17. Un composición farmacéutica, caracterizada porque comprende: (a) una toxina botulinica; (b) un polisacarido, y; (c) un aminoácido o un poliaminoácido . 18. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la composición farmacéutica retiene su potencia sustancialmente sin cambios durante un año cuando se almacena a una temperatura de entre aproximadamente -1°C y aproximadamente -15°C. 19. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la composición farmacéutica retiene su potencia sustancialmente sin cambio durante dos años cuando se almacena a una temperatura de entre aproximadamente -1°C y aproximadamente -15 °C. 20. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la composición farmacéutica retiene su potencia sustancialmente sin cambio durante tres años cuando se almacena a una temperatura de entre aproximadamente -1°C y aproximadamente -15°C. 21. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la composición farmacéutica retiene su potencia sustancialmente sin cambio durante cuatro años cuando se almacena a una temperatura de entre aproximadamente -1°C y aproximadamente -15 °C. 22. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la composición farmacéutica tiene una potencia o % de recuperación de entre aproximadamente el 20% y aproximadamente el 100% tras la reconstitución . 23. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la composición farmacéutica tiene una potencia de entre aproximadamente 10 U/mg y aproximadamente 30 U/mg tras la reconstitución. 24. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la composición farmacéutica tiene una potencia de aproximadamente 20 U/mg tras la reconstitución. 25. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la composición farmacéutica está desprovista de cualquier albúmina. 26. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la composición farmacéutica está sustancialmente libre de cualquier proteina compleja diferente a la toxina. 27. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el polisacárido es un almidón. 28. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el almidón es un hidroxietil almidón. 29. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque la composición farmacéutica comprende aproximadamente 100 unidades de la toxina botulinica, y entre aproximadamente 500 µ? y aproximadamente 700 µq del hidroxietil almidón. 30. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque comprende además entre aproximadamente 0.5 mg y aproximadamente 1.5 mg del aminoácido . 31. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque toxina botullnica es toxina botullnica tipo A. 32. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el aminoácido se selecciona del grupo que consiste de lisina, glicina, histidina y arginina. 33. Una composición farmacéutica de toxina botulinica tipo A estable, de alta potencia, no pirogénica, secada al vacio, caracterizada porque comprende: (a) un complejo de toxina botulinica tipo A; (b) un polisacárido, y; (c) un aminoácido o un poliaminoácido donde la formulación está libre de albúmina, tiene una vida de anaquel de 1 año a -5°C con aproximadamente 90% de potencia inmediatamente después de la reconstitución con solución salina o agua, y aproximadamente una potencia del 80%, 72 horas después de la reconstitución y almacenamiento a 2°C. 34. La formulación de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la formulación tiene una toxicidad especifica de al menos aproximadamente 18 U/mg tras la reconstitución. 35. Una composición farmacéutica liofilizada o secada al vacio, caracterizada porque consiste esencialmente de un polisacárido de alto peso molecular y una toxina botulinica, donde la toxina botulinica es estabilizada por el polisacárido de alto peso molecular. 36. La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el polisacárido de alto peso molecular es seleccionado del grupo que consiste de hidroximetil almidón, hidroxietil almidón, hidroxipropil almidón, hidroxibutil almidón e hidroxipentil almidón. 3 . La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la toxina botulinica es seleccionada del grupo que consiste de toxinas botulinicas de los tipos A, B, Q, D, E, F y G. 38. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un polisacárido y un aminoácido mezclado con una toxina botulinica, donde la cantidad del polisacárido es de entre aproximadamente 1 X 10"9 moles del polisacárido por unidad de toxina botulinica hasta aproximadamente 2 X 10~12 moles del polisacárido por unidad de la toxina botulinica. 39. Un método para producir una composición farmacéutica, caracterizado porque comprende el paso de preparar una mezcla de una toxina botulinica y un polisacárido comprendido de monómeros repetidos ligados covalentemente, donde el peso molecular promedio del monómero es de entre aproximadamente 350 D y aproximadamente 1000 D. 40. Un método para estabilizar una neurotoxina clostrídica contra la desnaturalización o agregación, el método se caracteriza porque comprende el paso de poner en contacto una neurotoxina clostrídica con una composición estabilizante que comprende un polisacárido . 41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el paso de contacto comprende el paso de agregar a una solución acuosa o un polvo liofilizado o secado al vacío que contiene una neurotoxina clostrídica una cantidad efectiva del polisacárido. 42. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición farmacéutica tiene un pH de entre aproximadamente 5 y 7.3 cuando se reconstituye o tras la inyección. 43. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende: (a) una toxina botulínica, y; (b) una albúmina producida de manera recombinante . 44. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque comprende además un acetiltrifosfanato y sales y derivados del mismo. 45. Un dispositivo para inyectar una composición farmacéutica, caracterizado porque comprende una jeringa prellenada de doble cámara, una cámara de tal jeringa contiene una toxina botulínica y la segunda cámara de la jeringa contiene un diluente o amortiguador. 46. Un método para utilizar una composición farmacéutica, el método se caracteriza porque comprende el paso de administración local de la composición farmacéutica a un paciente para lograr un efecto terapéutico, donde la composición farmacéutica comprende una toxina botulínica, un polisacárido y un aminoácido. 47. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende: (a) una toxina botulínica, y; (c) un aminoácido. 48. Una composición farmacéutica estable, caracterizada porque consiste esencialmente de: (a) una toxina botulínica, y; (b) un aminoácido. 49. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque la composición está libre de albúmina, libre de polisacárido, tiene 1 año de vida de anaquel a -5°C con una potencia de al menos aproximadamente el 90% tras la reconstitución con solución salina o agua y una potencia de aproximadamente el 80% 72 horas después de la reconstitución y almacenamiento a 2°C.