TWI282739B

TWI282739B - Pharmaceutical compositions of stabilized botulinum toxin

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Publication number: TWI282739B
Application number: TW090102480A
Authority: TW
Inventors: Terrence J Hunt
Original assignee: Allergan Inc
Priority date: 2000-02-08
Filing date: 2001-02-06
Publication date: 2007-06-21
Also published as: KR100753765B1; CN1258379C; CY1108007T1; KR20060090938A; EP1253932A2; CA2494241A1; TWI317283B; DE60125986T3; JP2003522154A; ES2275992T3; BR0108173A; KR100799400B1; CA2400318A1; US20020064536A1; TW200711657A; PT1398038E; KR20020084115A; KR20060028475A; MXPA02007519A; JP5080902B2

Description

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五、發明說明（1 ) 背景本發明係關於醫藥組成物。特定地説，本發明係關於含肉毒毒素的醫藥詛成物及關於製造此醫藥組成物的方法。醫藥組成物是含一或多種活性成分及一或多種賦形劑，載劑，安定劑或增量劑的調配物，適於給予病人以達所需診斷或治療效果。爲儲存安定及方便持拿，醫藥組成物可調配成凍晶（及凍乾）的或眞空乾燥的散，此散在使用於病人前可以生理鹽水或水重建。醫藥組成物可含似蛋白質的（pr〇teinace〇us) 活性成分。不幸的是，含蛋白質的醫藥組成物蛋白質很難以安定化，在調配、重組（如果需要）及儲存備用期常會失去蛋白質及/或失去蛋白質活性。因爲蛋白質的變性、降解、二聚作用，及/或聚合作用，常有安定性的問題出現。各種賦形劑，如白蛋白及明膠曾在不同程度上成功地用以安定醫藥組成物中的蛋白質活性成分。此外，也曾用低溫保護劑（cryoprotectants)如醇在凍晶的結冰條件下減少蛋白質變性。

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一 L· --------^---------線 β 白蛋白白蛋白是小而多的血漿蛋白質。人之血清白蛋白之分子量約爲69千道爾頓（kD)，於醫藥組成物中曾用作非活性成分，當作增量載劑及於醫藥組成物中當作某些蛋白質活性成分的安定劑。、白蛋白在|藥組成物中的安定功能可存在於醫藥組成物々夕步驟。周配過程中以及存在於後來已調配妤的醫藥組成 4- 本紙張尺度適”關家標準（CNS)A4規格（⑽X挪） 1282739 A7 五、發明說明（2 ) 物的重建中。所以，安定可由白田句蛋白傳給醫藥組成物中的蛋白質活性成分，此種傳盥是蕤，、疋精了，例如，（1)減少蛋白質活性成分對表面的黏連，例如眚如實驗室破璃器材、反應器的表面，減少對重建醫藥組成物所叮用的小瓶的黏連及對注射醫藥組成物注射筒内面的黏連。、蛋白質活性成分對表面的黏連會導致活性成分的損失及壤天及導致剩餘蛋白質活性成分的變性，此二者都是減少醫藥組成必貢头、、且成物中活性成分的總活性的，及，（2)減少活性成分的變性欠戌迫在製備活性成分的低稀釋溶液是會出現的。除了能安定醫藥組成物中的蛋白質活性成分外，白蛋白在注射於病人時也有可忽略不計的免疫原性的優點。且有可認知的免疫原性的化合物會導致對其產生抗體，這又會導致發生過敏反應及/或產生抗藥性曰土机朵f生，因而導致有免疫成分的醫藥組成物難以治療疾病。不幸的是’儘管白蛋白有安定化效果，但在醫藥組成物中使用白蛋白仍有明顯缺點。例如，白蛋白昂貴，獲得曰益困難。此外，血液產物，如白蛋白，在给予病人:會使病人接受到源自血液的病原或感染劑。是以現已知有這樣的可能，醫藥組成物中有白蛋白時會無意中給醫藥組成物㈣感染因素。例如，現已有報告稱使用白蛋白可能將朊病毒帶入醫藥組成物。朊病毒即是蛋白質樣感染微粒，理論上他能由同一製造正常蛋白質的核酸排序發展成不正常的構形。更有一種理論稱，在正常異構蛋白質轉化成朊蛋白質異構物的”志願反應”中，在後翻譯階段會殘存感染 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # 訂---------痒經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1282739 A7 _B7_____ 五、發明說明（3 ) 性。很明顯的，正常的内生性細胞蛋白質會被謗導錯疊成病原性朊病毒構形。値得注意的是，有數批人血清白蛋白已從市場上收回，只因有位向該批生產白蛋白所用的血的捐血者診斷出患有Creutzfeldt-Jacob病。

Creutzfeldt-Jacob病（有時類似進行快速的愛滋海默氏病）是一種稀有的可傳播的海綿樣腦病變的神經退化疾病，其傳播劑明顯是朊病毒蛋白質的不正常的異構物。患 Creutzfeldt-Jacob病的人可在六個月内由良好的健康退步到不能動的緘默病。已有報告謂Creutzfeldt-Jacob病的傳播是由白蛋白輸液所引起，並進一步稱對Creutzfeldt-Jacob病的有效防止不能靠一般的白蛋白製備方法，此法包括丟棄血細胞成分並於60 °C加熱10小時。所以仍有因給予含人血漿蛋白質濃縮物，如血清白蛋白，而傳染到以朊病毒傳介的疾病，如Creutzfeldt-Jacob病的危險0 於一些蛋白質活性成分醫藥組成物中曾使用明膠作爲白蛋白替代品。應注意到，明膠是動物蛋白質衍生物，所以也有人白蛋白所有的感染危險性。所以，需要找出一種白蛋白替代品，其不是血液的一部分，較佳是白蛋白替代品不是明膠，也不是衍生自動物蛋白質。肉毒毒素厭氣性革蘭陽性菌肉毒梭狀芽孢桿菌產生一種有效的多肽神經毒素，肉毒毒素，其能於人及動物引起神經痳痒疾病，稱作肉毒中毒。肉毒梭狀芽孢桿菌及其芽孢常見於土壤，此種細菌可生長於消毒不完全的及密封的食物容器本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） — ——Ί-------f------!訂一丨-------線· (請先閱讀背面之注咅3事項再填寫本頁) 1282739 A7 _B7____ 五、發明說明（4 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 内，這正是多數肉毒中毒的情形。肉毒中毒一般出現於食入肉毒梭狀芽孢桿菌或其芽孢感染的食物18至36小時以後。肉毒毒素明顯地能通過腸内皮並攻擊週邊運動神經元。肉毒毒素中毒症狀的進展可由走路困難，呑儀困難及講話困難至呼吸肌肉痳痒至死亡。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A型肉毒毒素是已知對人最危險的天然生物致死劑。對鼠而言，A型肉毒毒素（純化的神經毒素複合物）的LD50 爲約50皮克。令人感興趣的是，以莫耳爲基礎言，A型肉毒毒素較白喉的致死毒性大18億倍，較氰化鈉大6億倍，較眼睛蛇毒素大3千萬倍，較霍|L大一千武百萬倍。見 Singh，Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins，頁 63-84 (第 4 章）of Natural Toxins II，B.R. Singh et al 編著，Plenum Press，New York (1976)(其中所述A型肉毒毒素之LD50爲 0.3毫微克相當於1單位，現已校正爲0.05毫微克 BOTOX®相當於1單位）。—單位（U)肉毒毒素之定義爲以腹内注射給重18-20克的Swiss Webster雌鼠所產生的LD50 的量。現已區別出七種不同免疾性的肉毒神經毒素，分別爲肉毒神經毒素血清型（serotypes) A，B，Ci，D，E，F及G ，其各自可用型特異型抗體中和區別。此不同血清型的肉毒毒素隨作用於動物種類及其引起的痳痒嚴重性及期間而異。例如，現已測出，以在鼠產生的痳痒而言，A型肉毒毒素較B型肉毒毒素強500倍。此外，尚測出480 U/公斤劑量的B型肉毒毒素對靈掌類是無毒的，但這一劑量是A 型肉毒毒素對靈掌類動物LD50的12倍。肉毒毒素明顯地本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1282739

五、發明說明（5 ) 是對膽鹼能運動神經具高親和性，並轉移入神經元，阻斷乙醯膽驗的節前釋出。肉毒毒素曾在臨床上用以治療骨胳肌過動爲特徵的神經肌肉疾病。1989年美國藥物食品管理局批準a型肉毒毒素用於治療自發性瞼痙攣，斜視，及十二歲以上的病人的半邊臉痙攣。肌肉内注射A型肉毒毒素後一個星期一般即會見出臨床效果。一次肌肉内注射A型肉毒毒素後的症狀解除期（即輕度肌肉痳痒）一般約爲三個月。雖所有的肉母母素血清型明顯地抑制神經肌肉接頭處神經傳遞質乙醯膽鹼的釋出，但其作用是於不同位置影響不同的神經分泌蛋白質及/或裂解此等蛋白質。肉毒毒素A 型鋅内肽酶，此種酶能特異地水解細胞内與小泡心相連的蛋白質SNAP-25的肽鏈。E型肉毒毒素裂解25千道爾镇突觸小體相連的蛋白質（SNAp_25)，但比，是以此蛋白質内的不同胺基酸排序爲目標母及G型肉母母素係作用於小泡相連的蛋白質（VAMp ，也 %作小大觸泡蛋白），每一血清型於不同位置裂解蛋白貝取後Cl型肉毒毒素是裂解突觸溶合蛋白及SNAp_ 25。此種作用機制的不同可能會影響各種、主型的相對效果及/或作用期間。 ^ " 所有此七類已知肉毒毒素血清型的肉毒毒素蛋白質分子的分子量約M 15〇kD。令人感趣的是，肉毒毒毒梭狀^孢捍菌以複合物形式釋出，此種複合物含有150 kD肉母母素蛋白質分子及與其相連的非毒素蛋白質。是 1282739 A7

1282739 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7__ 五、發明說明（7 ) 何製劑中肉毒毒素B型毒素有一部分是非活性的，這可用以説明與A型肉毒毒素相比爲什麼B型肉毒毒素活性較低的原因。臨床製劑中非活性肉毒毒素分的存在可歸因於製劑中總蛋白質載荷，此與抗原性的增加相聯而與臨床效果無關。此外，現已知B型肉毒毒素作肌肉内注射時只有短暫活性，其效期及活性與相同劑量的A型肉毒毒素相比也較短而弱。高品質的A型肉毒毒素可用肉毒梭狀芽孢桿菌Hall A菌屬生產，其特點是23χ1〇7 U/毫克，A26q/A278小於0·60，於凝膠電泳上有不同形式的帶型（banding pattern)。可用已知的Shantz方法製得A型肉毒毒素晶體，如Shantz，E. J. et al， Properties and use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine，Microbiol Rev. 56:80-99 (1992)所述。一般而言，A型肉毒毒素複合物可藉於適宜的培養基内培養A型肉毒梭狀芽孢桿菌產生無氧發酵物，再由此分離並純化製得。可用硫酸沉澱出生毒素，再用超微過濾濃縮。純化可藉將酸性沉澱物溶於氯化鈣内進行。然後用冷乙醇沉澱出毒素。再將沉澱物溶於硫酸鋼緩衝液内並離心。乾燥後可製得約900 kD的A型肉毒毒素複合物結晶，比效 3xl07 LD5〇 U/毫克或更大。也可用此法非離非毒素蛋白質以製得純肉毒毒素，例如：純A型肉毒毒素，分子量約 150 kD，比效l-2xl08 LD50 U/毫克或更大；純B型肉毒毒素，分子約156 kD，比效l-2xl08 LD5〇 U/毫克或更大；及純F型肉毒毒素，分子量約155 kD，比效l-2xl07 LD50 U/ -ίο- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 -l^i ϋ· ϋ ϋ ϋ ϋ 、1 n ϋ I. ϋ n ϋ I » -νό 1282739 A7 B7 五、發明說明（ο 毫克或更大。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 製備醫藥調配物用的已製好的及已純化的肉毒毒素及毒素複合物可由 List Biological Laboratories，Inc.，Campbell， California; the Centre for Applied Microbiology and Research， Porton Down，U.K.; Wako (Osaka，Japan)及 Sigma Chemicals of St Louis，Missouri 購得0 純肉毒毒素十分不穩定，是以限制了其在製備醫藥組成物上的使用。此外，肉毒毒素複合物，如A型毒素複合物，也因素面變性、熱、及驗性條件的關係極易變性。非活化毒素形成產生免疫的類毒素蛋白質。生成的抗體會導致病人對毒素注射發生敏感。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製如同一般的酶一樣，肉毒毒素（其細胞内肽酶）的生物活性是依賴於，至少是部分依賴於，其三向構形。是以，A 型肉毒毒素可藉加熱，各種化學表面拉伸及表面乾燥去毒。此外，現已知，除非有安定劑的存在，以培養、發酵及純化所製得的毒素複合物可藉醫藥組成物調配所用的方法稀釋很多倍而快速失去其毒性。將毫克量的毒素稀釋成每毫升含數毫微克的溶液有明顯困難，其原因即在這樣的大幅度稀釋會迅即使其喪失特異毒性。因爲在毒素調配成含醫藥組成物後，經數月或數年此毒素才會被用到，所以毒素必須用安定劑安定。過去唯一能成功使用於此目的的安定劑是衍生自動物的白蛋白及明膠。如前所述，調配物中含衍生自動物的蛋白質會引起一些問題，由志願者帶進的一些安定的病毒、朊病毒或其他感染性或致病性化合物 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規袼（21〇 X 297公爱） 1282739 A7 B7__ 五、發明說明（9 ) 會污染毒素。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 此外，任何凍乾或眞空乾燥含肉毒毒素的醫藥組成物成可運輸及儲存的毒素調配物（醫生可立即使用或重建的形式）所需嚴格pH、溫度及濃度的變化，都會使毒素去毒。是以曾用衍生自動物的或志願者的蛋白質如明膠及血清白蛋白以安定肉毒毒素。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製商業上可購得的含肉毒毒素的醫藥組成物是以商品 BOTOX® (可從 Allergan，Inc.，of Irvine，California)出售。 BOTOX®含純化的A型肉毒毒素複合物，白蛋白及氯化鈉，以滅菌的眞空乾燥形式包裝。此A型肉毒毒素是用由含N-Z胺基酵母萃取物的介質培養出的肉毒梭狀芽孢桿菌 Hall菌屬製成。此A型肉毒毒素複合物是用培養物溶液經一系列酸沉澱純化成晶體複合物而成，内含活性高分子量毒素蛋白質及血凝素蛋白質。將此晶體複合物再溶於含生理鹽水及白蛋白的溶液内，滅菌濾、（0.2微米），然後眞空乾燥。BOTOX®可用滅菌的非防腐生理鹽水在作肌肉内注射前重建。每一小瓶BOTOX®含約100單位（U) A型肉毒梭狀芽孢桿菌毒素複合物，0.5毫克人血清白蛋白及0.9 毫克氯化鈉，爲滅菌的眞空乾燥形式，不含防腐劑。重建眞空乾燥不含防腐劑的BOTOX®滅菌生理鹽水時，是用適宜大小的注射筒抽取適量的0.9%氯化鈉注射液。因爲BOTOX®會因起泡或類似強裂振動而變性，所以必須輕輕注射稀釋劑劑入小瓶内。BOTOX® —旦重建後，必須於四小時使用。在此期間，須將重建BOTOX®儲於冰箱内 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1282739 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7__ 五、發明說明（1G) (2至8 °C )。重建的BOTOX㊣是澄清的無色的無微粒的物質。此眞空乾燥的產物須儲存於低於5 °C的冰箱内。小瓶從冰内取出並重建後，必須於四小時内使用BOTOX⑧。在此四小時間，重建的BOTOX⑧可儲於冰箱内（2至8 °C )。有報告稱作爲肉毒毒素安定劑的白蛋白可爲其他蛋白質或低分子量（非蛋白質）化合物代替。見Carpender et al.， Interactions of Stabilizing Additives with Proteins During Freeze-Thawing and Freeze-Drying， International Symposium on Biological Product freeze-Drying and Formulation, 24-26 October 1990; Karger (1992)，225-239。一般常於醫藥組成物内用作增量劑的多種物質已證明不適於作爲含神經毒素的醫藥組成物中的白蛋白替代品。例如，雙糖纖維二糖已發現不宜作爲毒素安定劑。是以，現已知，用纖維二糖作爲賦形劑與白蛋白及氯化鈉合用，在 A型肉毒毒素晶體與此等賦形劑凍乾後，與單獨使用白蛋白凍乾後相比（>75%至>9〇%恢復）會大幅降低素性（10%恢復）0 Goodnough et al·，Stabilization of Botulinum Toxin Type A During Lyophilization，App & Envir. Micro. 58 (10) 3426-3428 (1992) 〇此外，糖，包括多糖，一般也不是蛋白質安定劑的良好備用品。現已知，含蛋白質活性成分的醫藥組成物，如果蛋白質調配物含糖類（如葡萄糖或葡萄糖聚合物）或碳水化合物，本質上就是不安定的，因爲蛋白質與葡萄糖會交互作用，由於，例如，葡萄糖及葡萄糖聚合物的還原性質， -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1282739 A7 ____B7___ 五、發明說明（11 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 進行週知的Maillard反應。利用，例如，減少濕氣或使用非還原糖以防止此蛋白質·糖反應，多以失敗告終。很明顯的，Maillard反應的變性途徑可導致蛋白質活性成分失去其治療效果。所以，含蛋白質及還原糖，碳水化合物，及糖，如葡萄糖聚合物的醫藥調配物本質上即是不安定的，不能作長期儲存而不失去其蛋白質活性成分的生物活性0 値得注意的是，人血清白蛋白能於醫藥組成物中有效地用作蛋白質活性成分的安定劑的理由之一是因爲白蛋白是蛋白質不與醫藥組成物内的蛋白質活性成分行Maillard反應。所以可希望由其他蛋白質中尋找白蛋白替代品。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製尋找作爲醫藥組成物中肉毒毒素白蛋白安定劑的代替品的工作相當困難，因爲白蛋白在醫藥組成物中不僅具增量劑的作用。白蛋白明顯地可與肉毒毒素起交互作用，因而增強此神經毒素的效果。例如，現已知，牛血清白蛋白即不只是A型肉毒毒素的安定賦形劑，牛血清白蛋白也能加速合成肽基質的分解速度，此種基質類似A型肉毒毒素的 SNAP-25 神經元内基質。Schmidt，et al·，Endoproteinase Activity of Type A Botulinum Neurotoxin Substrate Requirements and Activation by Serum Albumin，J. of Protein Chemistry，16 (1)， 19_26 (1997)。是以，由於肉毒毒素對毒素基質的細胞内蛋白質分解作用上影響動力學速度的關係，白蛋白具有增強效果。此種增強效果可能原自白蛋白伴隨肉毒毒素進行胞呑作用（endocytosis)進入目標神經元内，或者此增強作用是 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1282739 ^------_ 本紙張尺麵財^鮮（CNS)A4祕⑽ A7 B7 五、發明說明（12 ) 毒素胞呑作用前在神經元蛋白質内即白的存在。忠牛血清白蛋白對A型肉毒毒素蛋白質分解活性的動力學速度刺激效果的發現，促使尋找含肉毒毒素醫藥調配物内的通宜的白蛋白替代品。具所需毒素安定特性的白蛋白替 :品：能：毒素分解基質的速度尚不爲人所知或無何影曰口馬至少以牛血清白蛋白言，此二種特性（毒素安定化及毒素基質分解效果)是明顯同—白蛋白賦形劑固有的。此一白蛋白的增強效果顯示白蛋白不僅在調配物内具賦形Μ作用，並因而使尋找一種適宜的白蛋白替代品困難。此外，肉毒毒素及其調配成適宜的醫藥組成物有許多特使尋找種含肉毒毒素的醫藥組成物的白蛋白替代品十分困難。此等特性的四種例如下。第―，肉毒毒素是加於醫藥組成物中的較大蛋白質(Α型肉毒毒素複合物的分子量是_kD)，所以本質上較脆及*安定的。毒素複合物的體積使其較小而簡單的蛋白質更脆及不安定，所以如欲維持調配物中毒素的安定性是較困難的。所以，白蛋白替代品必須能與毒素以不發生變性、不使破碎及不使毒素2子去毒、或引起毒素複合物中非毒素蛋白質分離的方弋人互反應。第二，作爲最具毒性的生物製品，在製造含母素的醫藥組成物的所有步驟中都需要極安全、準確及精確。疋以，較佳的可能的白蛋白替代品本身應是無毒的或難以處理的，以不使含肉毒毒素的醫藥組成物更具毒性。 15-

_裂--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 131282739 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（第二’由於肉毒毒素是第一種被批准用作注射以治療人體疾病的生物毒素，必須發展出特定的准許的方案以培養、大量生產、並調配成醫藥以便使用肉毒毒素。重要的考慮是毒素純度及注射劑量。培養及純化生產必須能使毒素不曝露於任何可能污染終產物並使病人發生不必要反應的物質，即使極微量也不可以。這種限制需以簡化的介質培養，不使用動物肉製品，也需不用合成性溶劑或樹脂作純化。使用酶、各種交換劑，如色層分析柱所用者，及合成溶劑可能會引入污染物，所以都是調配步驟中所排除的此外’ A型肉毒毒素於40 °C以上極易變性，於空氣/ 液體界面發生氣泡時會失去毒性，並在有二氧化碳及氮的存在下發生變性。第四，使A型肉毒毒素安定化有特定困難，因爲a型含有約150 kD的毒素分子及非共價連接的重約75〇奶的非母素蛋白質。此非毒素蛋白質相信是維護或幫助第二及第三構造的安定化，此種構造與毒性有關。用於安定化非蛋白貝或較小蛋白質❾方法或方案不能用於肉毒毒素複合物’如A型900 kD肉毒毒素複合的問題。在pH爲3 $至 6·8時，A型毒素及非毒素蛋白質是以非共價方式連到一起，在輕度驗性條件下（pH>7l)，易於反應的毒素即由毒素複口物釋出。由於其不安定性，純毒素不能作醫藥使用或在限制下才能作醫藥使用。見於肉毒毒素的特性及前述需求，找出—種適宜的白蛋白m以代替白蛋白用於現在所用的含肉毒毒素的醫藥 -16- (210 X 297 公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

* ·ϋ ϋ ϋ n 一：口、I I .^1 I- ϋ ϋ I %_ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1282739 A7 ^^-*-----_____ 五、發明說明（14 ) 組成物，事實求是地説，這一可能近乎零。在本發明之前，只有衍生自動物的蛋白質白蛋白與明膠是已知的用於 ^肉母毒素的醫藥調配物中肉毒毒素的安定劑。現已知白蛋白本身或其與一或多種另外的物質如磷酸鈉或檸檬酸鈉，在凍乾後容許Α型肉毒毒素恢復其毒性。不幸的是，噙刼所述，白蛋白，作爲血液製品，出現於醫藥組成物時至少有可能帶有感染或致病因子。確是這樣，任何動物製品或蛋白質如明膠也可能含熱原或其他在注射給病人後產生不良反應的物質。中國專利申請案CN 1215084A號揭示一種無白蛋白的以明膠調配的A型肉毒毒素，此種明膠是衍生自動物的蛋白質。所以此種調配物不排除有衍生自動物蛋白質或伴有感染因子的危險的可能。羥基乙基澱粉多糖可由數百甚至數千個單糖單位以甞键（醚）相連構成。二種重要的多糖是纖維素及澱粉。纖維素是植物的主要構成物質，給予了植物剛性及形狀。澱粉構成植物的食物供應，且主要存於植物的種子及球根。误又私爲顆粒狀’顆粒的大小及形狀取決於殿粉來自的植物的特性。一般而言，約80%的澱粉是不溶於水的部分，稱作支鏈澱粉。支鏈澱粉是由右旋-葡萄糖（吡喃形葡萄糖）單位鏈構成，每一單位是以α苷鏈聯於下一葡萄糖單位的 C-4上。但纖維素内的：y：鍵和殿粉不一樣，是β鍵。用硫酸及醋酸酐處理纖維素即生成二糖纖維二糖。如前所述， -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） {：請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1282739 A7 __B7__ 五、發明說明（15 ) 用纖維二糖安定化肉毒毒素的企圖已失敗。用吡啶及伸乙基氯乙醇處理澱粉可製得的特殊澱粉衍生物是2-羥基乙基澱粉，也稱作異澱粉（hetastarch)。美國專利4,457,916號揭示非離子界面活性劑及羥基乙基澱粉混合物安定腫瘤壞死因子（TNF)水溶液。此外，已知有一種 6% 的 2-經基乙基澱粉（hetastarch)(可由 Du Pont Pharma， Wilmington, Delaware 以商品名 HESPAN® 購得，6% hetastarch於0.9%氯化納注射液内的溶液）。現已知白蛋白在以靜脈内給予病人後有增加血漿容積的作用。 HESPAN®也曾給予病人以達血清容積增加的效果，就此一意義而言，靜脈内HESPAN®可視作是靜脈内白蛋白的替代品。異澱粉是人造的衍生自蠟樣澱粉的類膠體，幾全由支鏈澱粉構成。異澱粉可藉由將羥基乙基醚基團引入澱粉的葡萄糖單位製得，然後可將所得物質水解生成其分子量適用作血漿溶積增加劑的產物。異澱粉以其莫耳取代及分子量爲特點。莫耳取代約爲0.75，其意是異澱粉醚化到平均異澱粉每100葡萄糖單位有75個羥基乙基取代基。異澱粉的重量平均分子量約爲670 kD ，其範圍爲450 kD至800 kD ，至少有80%的聚合物單位在20 kD至2,500 kD範圍内。羥基乙基基團主要是以醚鏈聯於葡萄糖單位的C-2 位，較少聯於C-3及C-6位。此等聚合物類似肝糖，而聚合的D-葡萄糖單位主要是以α-1，4鍵相聯，較少以α-l，6键相聯。分支的程度約爲1:20 ，意爲每20個葡萄糖單體單 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） •—.--------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1282739 A7

五、發明說明（16 ) 位有一個α-1，6分支。異澱粉是由9〇%以上的支鏈澱粉構經濟部智慧財產局員工消費合作社印製成。 HESPAN®所產生的血漿增容積約相當於白蛋白所增加者。小於50 kD的異澱粉分子很快由腎臟排出，單一劑量約500毫升的HESPAN(g)(約％克）在24小時内约有33〇/〇由腎臟排出。羥基乙基澱粉的羥基乙基基團並不於活體内分解’在排出前仍維持完整並聯於葡萄糖單位上。由於羥基乙基化防止較小羥基乙基澱粉聚合物的完全代謝，不產生大量的葡萄糖。纖維素也可轉化成羥基乙基纖維素。2_羥基乙基纖維素 (即纖維素的2-羥基乙基醚）的平均分子量約爲9〇 kD。不幸的疋’不像羥基乙基澱粉那樣，羥基乙基纖維素是高度活性的’所以不適於在醫藥調配物中用作蛋白質活性成分的安定劑。所以現在需要一種適宜的用於含神經毒素的醫藥組成物内的衍生自動物的蛋白質或志願者血漿白蛋白的替代品。概述本發明滿足此一需求並提供一種化合物替代醫藥組成物中的白蛋白，此種化合物能安定醫藥組成物中的肉毒毒素。此白蛋白替代化合物的特點是在注射於人類病人時具低，較佳是忽略的，免疫原性。此外，此較佳白蛋白替代品在注射醫藥組成物後能以快速度從體内清除。定義此處所用的字或詞具下述意義。 -19- 本紙張尺度適用中關家標準（CNS)A4規格（21Q x 297公釐)1 --— -«ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ n n ϋ .1- ϋ ϋ ϋ ϋ H ϋ ^1 ϋ — ϋ ^1 ϋ I n H (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1282739 A7 五、發明說明（ ’·約”-詞意爲，以此字修飾的 1兮该口办如參數，或詞包括所述该項目，參數，或詞的値的上、卜圍。胺基酸” 一詞包括聚胺基酸。姊，，多糖.匕詞意爲二個以上糖分子單體的聚合物，此等單體可相同或相異。 "醫藥組成物詞意爲—種調配物，其中活性成分爲神經毒素，如梭狀芽孢桿菌神經毒素。而"調配物"―詞意爲醫藥組成物中除了神經毒素活性成分外至少尚有一種另外的成分。所以，醫藥組成物是調配物，適於爲人類病人作診斷或治療給予（即肌肉内或皮下注射）。此醫藥組成物可以是：束乾的或眞空乾燥的形式；以康乾的或眞空乾燥的醫藥組成物用生理鹽水或水重建的溶液，或；作爲溶液時不需重建。神經毒素可以是A，B，C!，d，E，F，或G血清型肉毒毒素或破傷風毒素，所有這類毒素都是用梭狀芽孢样菌製成。 π治療調配物’’ 一詞意爲可用於治療並進而舒緩疾病，如以週邊肌肉過動（即抽搐）爲特徵的疾病的調配物。 ”安定化” 一詞意爲，當已於約-2。(：儲存六個月至四年的凍乾的或眞空乾燥的含肉毒毒素的醫藥組成物用生理鹽水或水重建時，或已於約2 °C至8 °C儲存六個月至四年的含肉毒毒素的醫藥組成物的水溶液，於此重建的或醫藥組成物的水溶液中的肉毒毒素的毒性大於此肉毒毒素在加於醫藥組成物前的生物活性肉毒毒素毒性的約20%至約 100% 〇 -20· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，裝---- 訂---------, 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1282739 A7 —__________B7__ 五、發明說明（18 ) 一 — 本發明的範圍内的醫藥組成物可含有神經毒素及多糖。此多糖安定化神經毒素。此處所揭示的醫藥組成物的阳在重建或注射時爲約5 i 7.3。多糖中雙糖單位的平均分子量較佳是約345 D至約2,000 D。於更佳具體實施例中，多糖中雙糖單位的平均分子量較佳是約35〇kD至約 l，000 kD ，最佳的具體實施例中爲約375 D至約7〇〇d 。此外，此多糖可含至少約70%的支鏈澱粉。此外，多糖本身的重量平均分子量爲約20 kD至約2,500 kD。較佳是實質上所有多糖的雙糖單位含醚键合的吡喃形葡萄糖分子。多糖中每10個吡喃形葡萄糖有平均約4至约 1〇個羥基是經由醚鏈以式（CH2)n_〇H化合物所取代，其中 η可以是1至1〇的整數。η更佳是i至3的整數。於特佳具體實施例中，多糖中每1〇個吡喃形葡萄糖有平均約6至約9個羥基是經由醚鏈以式（CH2)n_〇H化合物所取代，其中η可以是1至1〇的整數。於最佳具體實施例中’多糖中每10個吡喃形葡萄糖有平均約7至約8個經基是經由醚鏈以式（CH2)n_〇H化合物所取代，其中η可以是1至10的整數。本發明詳細具體實施例可以是適於注射給人類病人的醫藥組成物，其含有肉毒毒素及多糖。此多糖可有多個鍵聯的吨喃形葡萄糖單位，每一吡喃形葡萄糖單位有多個羥基’其中每10個ρ比喃形葡萄糖有平均約6至約9個藉基疋經由醚鏈以式（CH2)n_OH化合物所取代，其中η可以是1 至4的整數。此多糖可以是乙基酸經取代的多糖。 _ -21- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱）一""'" ''一""1 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) ϋ ml ϋ ϋ 0\. I ϋ ϋ ϋ I. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1282739 A7 B7 五、發明說明（ 19 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製此醫藥組成物適於注射給人類病人以達治療效果，而神經毒素可以是A, B，Cp D，E，F及G肉毒毒素血清型之一。於特佳具體實施例中，此醫藥組成物含肉毒毒素及羥基乙基澱粉。本發明另一具體實施例可包括醫藥組成物，其含肉毒毒素，多糖，及胺基酸或聚胺基酸。不論此醫藥組成物，除了含神經毒素活性成分外，只含一種多糖安定劑，只含一種胺基酸安定劑或多糖及胺基酸安定劑二者，此醫藥組成物在儲存於約及约_i5 °c 時，實質上維持其效果於六個月，一年，二年，三年及/ 或四年中不改變。此外，此醫藥組成物於重建時可有效或 %恢復率爲約20%至約1〇0%。或者是，此醫藥組成物於重建時之效果爲約10 U/毫克至約30 U/毫克，例如重建時效果爲約20 U/毫克。明顯的是，此醫藥組成物不含白蛋白。是以，此醫藥組成物可實質上無非毒素複合物蛋白質。値得注意的是，胺基酸的量可以是每1〇()單位肉毒毒素約0.5毫克至約1.5毫克。多糖可以是澱粉，如羥基乙基澱粉，當此醫藥組成物含約100單位肉毒毒素時，羥基乙基澱粉的量可以是約5〇〇微克至約700微克。較佳是，肉毒毒素是A型肉毒毒素，而胺基酸，如果有時，是選自包括賴胺酸，甘胺酸，組胺酸及精胺酸。本發明另-詳細的具體實施例可以是安定的、高效的' 無熱原的、眞空乾燥的A型肉毒毒素醫藥組成物，其含有 -22- ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱― (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

_ tit Γ · ϋ 1 1 I n I ^ ^ l -^1 mmMK i·— ·ϋ I 1282739 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ______B7 ' -----—__— 五、發明說明（20) A型肉毒毒素複合物’多糖，及胺基酸或聚胺基酸。此醫藥組成物可以是無白蛋白的，於_5。〇貨架壽命爲i年時其以生理鹽水或水重建時的效果約爲9〇%，重建後存於2 t 72小時後其效爲約80%。此外，此醫藥組成物於重建時的比毒性（specific toxicity)至少約18 υ /毫克。本發明也包括凍乾的或眞空乾燥的醫藥組成物，其主要含高分子量多糖及肉毒毒素，其中肉毒毒素是以高分子量多糖安定化。此高分子量多糖可選自包括羥基甲基澱粉，每基乙基殿粉’輕基丙基澱粉，藉基丁基澱粉，及邊基戊基殿粉，而肉毒毒素可選自包括A，B，Q，D，E， F及G肉毒毒素血清型。此醫藥組成物内多糖的量可以是約1χ1(Γ9莫耳多糖/單位肉毒毒素至約2χ10_12莫耳多糖/單位肉毒毒素。本發明還包括（a)製造醫藥組成物的方法，其包括製備肉毒毒素及由共價鍵合的單體構成的多糖的混合物的步驟，其中平均單體分子量爲約35〇D至約i，000 d ，及（b) 安定梭菌神經毒素使不變性或凝聚的方法，此法包括將梭菌神經毒素與含多糖的安定組成物接觸的步驟。後一方法中的接觸步驟可包括於水溶液或含梭菌神經毒素的凍乾的或眞空乾燥的散内加有效量的多糖的步驟。本發明另一方面是醫藥組成物，其含有肉毒毒素及重組的白蛋白。此組成物較佳也含乙醯基色胺酸鹽及其鹽及衍生物。本發明另一具體實施例是注射此醫藥組成物的裝置，其 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)

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包括雙室預裝針筒，此針筒的一室含肉毒毒素，針筒的另一室含稀釋劑或緩衝液。本發明另一具體實施例是使用此醫藥組成物的方法，此法包括局邵給予病人此醫藥組成物以達治療效果，其中此醫藥組成物含有肉毒毒素，多糖及胺基酸。很明顯，我的發明也包括醫藥組成物，其含有肉毒毒素及胺基酸。我的發明也包括安定的醫藥組成物，其主含肉毒毒素及胺基酸。此等醫藥組成物可以是無白蛋白的，無多糖的，於-5 °C時的1年或貨架壽命時其以生理鹽水或水重建時的效果約爲90%，重建後存於2 〇C 72小時後其效爲約80%。説明本發明是以這樣的發現爲基礎，安定的含神經毒素的無衍生自動物的蛋白質或血庫白蛋白的醫藥組成物可藉加多糖及/或胺基酸於醫藥組成物内製成。特定地説，本發明是以這樣的發現爲基礎，安定的含肉毒毒素的適於給予人類病人供治療用的醫藥組成物可藉以衍生自澱粉的高分子量多糖及/或特定易反應的胺基酸代替已知的含肉毒毒素的醫樂組成物中的血庫白蛋白製成。令人驚奇的是，我已發現適宜的白蛋白替代品是既不是另一種蛋白質也不是低分子量的非蛋白質化合物的化合物。是以，我已發現特定的高分子量的多糖於醫藥組成物中有神經毒素安定劑的作用。如下所述，胺基酸也可加於醫藥組成物中以增加醫藥組成物的安定性及儲存期限。 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -·裝--------訂---------. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1282739 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ____________B7__ 五、發明說明（22 ) ^ ^~ 本發明所用多糖可以如下方式給予醫藥組成物中的神經毒素活性成分，如肉毒毒素，以安定性··（1)減少肉毒毒素對各種表面，如實驗室破璃儀器，管子，重建醫藥組成物的小瓶，及用以注射醫藥組成物的注射筒的表面的黏連 (一般稱之爲”黏度，，）。肉毒毒素對各種表面的黏連可導致肉毒毒素的損失及存留肉毒毒素的變性，此二種情形都減少醫藥組成物中的肉毒毒素的毒性。（2)減少肉毒毒素的變性及/或減少肉毒毒素複合物中肉毒毒素與其他非毒素蛋白質的分離，此種變性及/或分離活性會因醫藥組成物中肉毒毒素的低稀釋而出現（即凍乾和眞空乾燥前），也會出現於重建的醫藥組成物。（3)減少醫藥組成物在製備、加工及重建中因pH及濃度的變化而致的肉毒毒素的損失 (即因變性或與複合物中非毒素蛋白質的分離所致的損失）。由夕糖所棱供的此三種肉毒毒素的安定化可保留肉毒毒素本來的毒性在醫藥組成物注射前不會有變化。用於此組成物的較佳的多糖包括於大多數葡萄糖單體上有一或多個取代基的葡萄糖單體（分子量180)，是以較佳的多糖之分子量約20kD至約8〇〇kD。令人驚奇的是，此種^糖把士足化醫藥組成物内的神經毒素成分。本發明不包括为子1少於約2〇 kD的雙糖寡糖。本發明也不包括環形聚合物如ί幕糊精。後二種化合物之被排除於本發明外是因爲較佳多糖的安定化特性具有較高的分子量（即分子量大於20 kD )，而不需有環糊精那樣在凍乾時生成凍乾腔的 ______ _25_ 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）"" '* (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) _裝訂--------- % 1282739 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張㈤用 x 297 公二6)_ A7 五、發明說明（2S) 特性，這是因爲環糊精泉乾腔較本發明較佳多糖安定化的神經毒素的體積小得多。此外，環_是低分子|化合物，只有6至8個葡萄糖單體。 '本發明也包括以多糖安定化含梭菌毒素的醫藥組成物的方法。安定化效果是藉將梭菌毒素與多糖接觸達成。本發明範圍内適宜的多糖的例包括特定的殿粉級殿粉衍生物。應注意的是，此多糖對梭菌毒素展現安定化效果。此外，多糖對梭菌毒素的安定化效果可藉加胺基酸而增強。令人意想不到的是，發明人已發現2_録乙基澱粉在安足化含肉毒毒素的醫藥組成物内的肉毒毒素上有獨特能力，由而提供了這樣-種醫藥組成物，其避免因人血或血庫或動物蛋白質如明膠所藏的傳播疾病的可能。是以，發明人發現特定的高分子量多糖，趣基乙基殿，，能在調配、乾燥、儲存及重建中钱化毒素。較佳疋局進步女疋化蛋白質活性成分，於含多糖的調配物中也加胺基酸。此醫藥組成物中的多糖較佳是以每單位肉毒毒素約工微 ^夕糖至每單位肉毒毒素約10微克多糖的量與梭菌神經毒素混合。更佳是，此醫藥組成物中的多糖是以每單位肉毒毒^素約4微克多糖至每單位肉毒毒素約8微克多糖的量與板囷神經毒素混合。於最佳具體實施例中，其中多糖是趕基乙基殿粉，此醫藥組成物中的趣基乙基殿粉較佳是以每單位肉毒毒素約5微克羥基乙基澱約7微克多糖的量與八型肉毒毒素複合物混合。2 = 26- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1282739 五、發明說明（24) 此醫藥组成物中的經基乙基澱粉較佳是以每單位肉毒毒素約6微克羥基乙基澱粉的量與A型肉毒毒素複合物混合。因爲每小瓶BOTOX®内含約1〇〇單位a型肉毒毒素複合物，及羥基乙基澱粉的平均分子量是約20 kD至約2,500 kD，羥基乙基澱粉的最佳濃度是約每單位肉毒毒素ΐχΐ〇_9 莫耳（M/U)至約每單位肉毒毒素2xl〇·12莫耳。於另一較佳具體實施例中，於100 U的Α型肉毒毒素複合物醫藥組成物的調配物中含約600微克羥基乙基澱粉及約1毫克胺基酸，如賴胺酸，甘胺酸，組胺酸或精胺酸。是以，發明人的發明包括使用多糖及胺基酸或聚胺基酸安定化醫藥組成物中的神經毒素活性成分。此外，發明人的發明也包括用足量的適宜的胺基酸安定化醫藥組成物中的蛋白質活性成分，不論調配物内是否含有夕糖。疋以，發明人驚奇地發現含神經毒素的醫藥組成物内加特定的胺基酸能延長此醫藥組成物的貨架壽命。是以’發明人的發明包括含神經毒素的醫藥組成物，此組成物含胺基酸，及此醫藥組成物的用途。不願受理論的限制’發明人可主張，由於神經毒素如肉毒毒素，因爲毒素衩泛物中有一硫化物键的關係而易於被氧化，加入可氧化的胺基酸會減少氧化劑，如過氧化物及游離基，與神經毒素的反應。是以，可氧化的神經毒素二硫化物鍵被氧化劑’如過氧化物及游離基，所氧化會因胺基酸的存在而降低’此種胺基酸有氧化槽（oxidative sink)的作用，即有氧化化合物的清除劑的作用。適宜的胺基酸是易於氧化的胺基 __ _27_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格⑵Q χ 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝

i Βϋ I I Im Mm— Hal ϋ in I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1282739 A7 _ B7 五、發明說明（25 ) 酸。較佳的胺基酸的例是曱硫胺酸，半胱胺酸，色胺酸及酪胺酸。特佳的胺基酸是甲硫胺酸。發明人的發明的較佳具體實施例中也包括單獨使用二或多個胺基酸或並用多糖安定化醫藥組成物内的蛋白只活性成分。是以，於含100U的A型肉毒毒素醫藥組成物内，可用於〇·5毫克賴胺酸及約0.5毫克甘胺酸，並可同時用或不用約500微克至約700微克異澱粉。是以如前所述，此發明包括含蛋白質的醫藥組成物，其含多糖。此多糖有安定化醫藥組成物内蛋白質活性成分的作用。本發明也包括含蛋白質的醫藥組成物，其含有多糖及胺基fei。令人奇的疋’發明人已發現，於也含碳水化合物的含神經毒素的醫藥組成物調配物内含特定胺基酸時，可延長此醫藥組成物的貨架壽命。是以，發明人的發明包括含神經毒素的醫藥組成物，此組成物含多糖及胺基酸二者’及此醫藥組成物的用途。此外，此發明還包括於無多糖的蛋白質活性成分醫藥組成物内使用胺基酸。現已知，含蛋白質的醫藥組成物，其也含糖，多糖及/ 或碳水化合物（以後通稱”反應性化合物，’），由於蛋白質及反應性化合物之一會行充分説明的Maillard反應的關係，本質上是不安定的。企圖以降低調配物内的水分或使用非還原糖以減少蛋白質·多糖的Maillard反應的許多研究都歸於失敗。發明人的發現是基於這樣的觀察事實，高濃度的高反應胺基酸鼓勵安定化多糖及加入的胺基酸間發生 Maillard反應。藉了提供大量的胺源與碳水化合物反應， -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

I n H ϋ ϋ .ϋ «-1— 1-· I % 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1282739 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（27 ) 酸’精胺酸，及組胺酸是較佳的胺基酸。此外也可用展現所需競爭抑制行爲的聚胺基酸，如聚賴胺酸。値得注意的疋’此等特定胺基酸及聚胺基酸也展現抗微生物性質，所以在醫藥組成物中還有減少細菌污染的作用。還原糖，如葡萄糖及葡萄糖聚合物，與蛋白質行 Maillard反應。甚至糖醇如甘露糖醇也起反應，雖則有時是經由污染物或降解產物起反應。所以多糖可安定化毒素一段時間，後來又起化學反應，這樣就減少了儲存安定性。很明顯，多糖的選擇是極重要的。發明人發現，藉基乙基澱粉介入Maillard反應的速度很缓慢。此外，發明人還發現，藉基乙基纖維素，雖則構造上很像羥基乙基澱粉，並不宜於用作安定劑，因爲發明人發現羥基乙基纖維素會很快與賴胺酸反應。這不僅意謂羥基乙基澱粉較其他糖（即多糖）安定劑有顯著優點，即使類似羥基乙基澱粉的賦形劑，如羥基乙基纖維素，也不宜用作醫藥組成物内蛋白質活性成分的安定劑。如前所述，羥基乙基澱粉至少在某種程度上介入 Maillard反應。是以，如前所述，單獨的多糖可能不足以對毒素提供適宜的安定化。是以，發明人發現，加胺基酸有作爲競爭性抑制者作用的優點。不願被理論所束縛，這一假設是，藉了提供較毒素爲高的濃度的胺源，可減少毒素發生Maillard反應的可能，從而就安定了毒素。雖則可用任何胺基酸，但賴胺酸易於反應，所以也是較佳的胺基酸。 30- 本紙張尺度適用，國冢標準（CNS)A4規格 ,—：--------裂--------訂--------- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 1282739 A7 B7 五、發明說明（28) 發明人的發明包括將鋅離子源加於含肉毒毒素的醫藥組成物内。金屬，特別是二價陽離子，據報告，由於各種低溫性質，包括生成的冰的晶格構造的關係，很大地影響凍乾調配物。外來金屬如銅及鐵會導致游離基氧化，一般是而避免的。更特地説，A型肉毒毒素的活性有賴於結合的鋅。多種賦形劑或賦形劑的反應產物會螯合金屬。這會形成不安足的冰及/或不活化的毒素。調製時藉了供應安瓿鋅即可確保所需二價陽離子，減少毒素使鋅損失並增強安定性。此可藉於肉毒毒素醫藥組成物中加ZnS〇4達成。現已知使用高產的甲基營養酵母表達菌屬巴斯德畢赤氏酵母生產重組人血清白蛋白（rHSA)。含肉毒毒素的醫藥調配物可製成含安定的rHSA的調配物。以基因改變的酵母主細胞表達的rHSA ’雖有相同的初級胺基酸排序，其他方面卻不同於血漿衍生的HSA 。是以，眞核酵母缺少哺乳動物細胞内所見的細胞内活動。此外，pHSA (衍生自血漿的人血清白蛋白）是製成非糖基化的形式並行細胞外非酶加葡萄糖。是以，pHSA及rHSA的碳水化合物部分並不相同。而且’現已知rHSA内的棕櫚酸及硬脂酸的量較pHSA的多。可期望此一不同形成rHSA及pHSA間的配位體結合’構形安定性及分子載荷的不同。所以令人驚奇地發現’ rHSA可用於安定化肉毒毒素，特別是在已知 pHSA動力學速度對肉毒毒素的影響後。rHSA的優點是其無來自血的病原體。是以，本發明另一方面包括於醫藥組成物中用rHSA代替來自血液的人血清白蛋白。較佳是 _ -31- 本紙張尺度過用中國國家標準(CNS)A4規格⑽x 297公髮） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 ^^ 1111111 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7

1282739 五、發明說明（Μ) 疋入乙酿基色胺酸鹽共同存在於含肉毒毒素的醫藥組成物中，如所述。商業上可購得的人血清白蛋白於60。(：加熱10小時才能除去人血庫中的可能有的感染劑。爲了要防止在此加工中的嚴重變性，加入二種安定劑：乙醯基色胺酸鈉及辛酸鈉。如是使用rHA ，則不需加此等成分，因爲並無此危險也不需加熱步驟。發明人已發現，rHA中加乙醯基色胺酸鈉較單獨使用辛酸鈉更能增強熱安定性，即使辛酸鈉的辰度加倍時仍如此。不願受任何理論的束縛，發明人相仏’這可能是因爲辛酸鈉只結合於一個位置上，而乙醯基色胺酸鈉則是結合於二個位置上。結合於第二位置似能增強對熱干擾的抗性。發明人並進一步假設，乙醯基色胺酸納的加入可能增強肉毒毒素調配物的安定性，這可能是因爲也於分子内維持對熱動力有益的構形，由於結合毒素，或由於防止人血清白蛋白本身變性的關係。本發明逼包括於稀釋劑内或調配物内加防腐劑以延長儲存期。較佳的防腐劑是防腐的含苄基醇的生理鹽水。液體調配物可能是較有益的。單一步驟成品（例如預裝的注射筒）或使用者感覺上是單一步驟成品的產物構形（例如义Α注射同）可提供減少重建步.驟的方便。；東乾是較複雜而筇貴的加工法。液體調配物常易於生產，也較廉優。另一方面，與凍乾調配物相比，液體調配物是動力系統，較易與賦形劑發生交互反應，反應較快，細菌較易生長，也易於氧化。可能需相容的防腐劑。因爲多種此類化合物 •32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1282739 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（30) 含或產生過氧化物，抗氧化劑如甲硫胺酸也可用作清除 W ’尤其疋在用界面活性劑減少吸附時。任何用於凍乾調配物的安足賦形劑（例如羥基乙基澱粉或胺基酸或賴胺酸）也可用於液體調配物以幫助減少吸附及安定毒素。類似用於胰島素的懸浮液也是良好備用物。此外，安定液體載體内的肉毒毒素可能需低pH載體，因爲據報告毒素在pH 7 以上時易於反應。此種酸性在注射時會產生剌痛感。這時可用雙套 >王射筒。在毒素維持於低pH儲存時，可加入供分散緩衝溶液使pH升至生理1)11以減少注射時的不適。另一種雙室注射筒包括稀釋液及凍乾物質，分別裝於不同室内，只在使用時混合。此方法提供液體調配物不需另外的來源及時間的優點。是以肉毒毒素可調配成低pH與緩衝溶液共同投藥以於給藥時提高pH至近生理pH。此種二室或雙套注射筒可於第一室（鄰近推進柱）内裝pH3至6 (如pH4〇h々液體肉毒毒素調配物。而第二室（鄰近針頭）内可裝適宜的較高 pH (如pH 7.0)緩衝溶液，如磷酸鹽緩衝的生理鹽水。或者是第一室内裝生理鹽水稀釋液，而於第二室内裝凍乾的神經毒素調配物。此二室可作這樣的聯接，即所緩衝成分與溶液於接近針頭處混合，以便投藥時的終溶液接近生理 pH 。適於此處使用的二室注射器可由

Fertigung of Yardley，Pennsylvania 購得。調配肉毒毒素成低pH還有另外的優點。毒素有低等電點（pi)，調配蛋白質近其pi是已知的安定蛋白質的方法。 33 - ‘紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 2W公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -^1 ϋ n Hi ϋ 一-°J. I I— n ϋ . 1282739 A7 B7 31 五、發明說明（此外，母素疋以很低濃度使又從用，界面吸附是一問題。使用低pH溶液可抑制毒音户 '、{的離子化不易於界面起交互作 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 用。注射筒及推進柱材料匕竹疋把減少毒素吸附於界面的材料。適宜的材料是聚丙埽。實例1 成物如則所逑’ A型肉毒毒素複合物可由於含N_Z胺及酵母萃取物的基貝内培養肉毒梭狀芽孢样菌服1菌株製得。此 A型肉母#素腹合物是藉一系列酸沉殿將培養物純化成含活丨生间刀子里母素蛋白質的結晶複合物及與其相聯的血凝素蛋白貝然後將此結晶複合物溶於含生理鹽水及白蛋白的溶液内，再過濾（〇·2微米），眞空乾燥。然後將 BOTOX®«滅菌的無防腐劑的生理鹽水重建，再作肌肉内注射。每一小瓶BOTOX®含約1〇()單位（u) A型肉毒梭狀芽孢样菌毒素複合物，〇·5毫克人血清白蛋白及〇·9毫克氯化鈉，爲滅菌的眞空乾燥的形式，無防腐劑。或者，此人血清白蛋白可用重組白蛋白代替。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製實例2 盒乙基澱粉的肉喜毒素醫藥組成物以實例1所述方式製成A型肉毒毒素純化的神經毒素複合物醫藥組成物，只是用500微克或600微克異澱粉代替〇·5 φ克白蛋白。已測出含異澱粉的調配物仍有充分有效性。是以’此二種含異澱粉的調配物，無白蛋白的含異澱 -34· 本紙張尺度顧T _國豕標準（CNS)A4規格⑵G χ 297公餐） 1282739 A7 B7 32 五、發明說明（ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 粉的組成物的效價，於凍乾的組成物重建時所測出者， 100U (+2〇 U) A型肉毒毒素複合物，爲96至128單位。於重建時測定了三種異澱粉，A型肉毒毒素複合物醫藥組成物的效價分別爲1〇5，111及128單位。效價是以標準給予鼠的肉毒效價測定法測定。實例3 含甘胺酸的肉毒毒素醫藥組成物以實例1所述方式製成A型肉毒毒素純化的神經毒素複合物醫藥組成物，只是用500微克或600微克異澱粉代替〇·5毫克白蛋白。此外，調配物内加1毫克甘胺酸。然後將凍乾的，異澱粉加甘胺酸的，無白蛋白的，100 U的A 型肉毒毒素複合物醫藥組成物於-5 °C儲存七個月。於七個月結束時’用鼠給予測定法測定此異澱粉加甘胺酸毒素調配物的效價，發現其基本上無改變（即只有效價較原效價少5%的差別）。實例4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製含甘胺酸的肉毒毒素醫笔成物以實例1所述方式製成100U的A型肉毒毒素純化的神經毒素複合物醫藥組成物，只是用600微克異澱粉代替〇.5毫克白蛋白。此外，調配物内加1亳克甘胺酸。然後將凍乾的，異澱粉加甘胺酸的，無白蛋白的，1〇〇 u的A 型肉毒毒素複合物醫藥組成物於-5。(：儲存一年。於一年結束時’用鼠給予測定法測定此異澱粉加甘胺酸毒素調配物的效價，發現其基本上無改變（即只有效價較原效價少5% -35· 1282739 A7 B7 33 五、發明說明（）的差別）。實例5 含組胺酸的肉毒毒素醫藥組成物以實例1所述方式製成100 U的A型肉毒毒素純化的神經毒素複合物醫藥组成物，只是用600微克異殿粉代替 0.5毫克白蛋白。此外，調配物内加1毫克組胺酸。然後將凍乾的，異澱粉加組胺酸的，無白蛋白的，100 U的A 型肉毒毒素複合物醫藥組成物於-5 °C儲存一年。於一年結束時，用鼠給予測定法測定此異澱粉加組胺酸毒素調配物的效價，發現其基本上無改變（即只有效價較原效價少5% 的差別）。實例6 含精胺酸的肉毒毒素醫藥組成物以實例1所述方式製成100 U的A型肉毒毒素純化的神經毒素複合物醫藥組成物，只是用600微克異澱粉代替 0.5毫克白蛋白。此外，調配物内加1亳克精胺酸。然後將束乾的，異澱粉加精胺酸的，無白蛋白的，1〇〇 U的A 型肉毒毒素複合物醫藥組成物於-5 °C儲存一年。於一年結束時，用鼠給予測定法測定此異澱粉加精胺酸毒素調配物的效價，發現其基本上無改變（即只有效價較原效價少5% 的差別）。實例7 含胺基酸的肉毒毒素醫藥組成物以實例1所述方式製成A型肉毒毒素純化的神經毒素複 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1282739 A7 --—_____^_· _ 五、發明說明（34 ) 合物醫藥調配物，只是用i毫克胺基酸，如賴胺酸，甘胺酸，組胺酸或精胺酸代替〇5毫克白蛋白。然後將凍乾 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 的’供多糖的’無白蛋白加甘胺酸的，無白蛋白的，1〇〇 U的A型肉毒毒素複合物醫藥組成物於_5儲存至少一年’於一年結束時，其效價基本無改變（即只有效價較原效價少5%的差別）。實例8 鱼ϋ素醫藥組成物之用途 #斷出一 48歲男人患痙攣性肌肉疾病，如頸部肌肉張力Ρ早礙。給病人肌肉内注射約i 〇_3 U /公斤至約3 5 υ /公斤的A型肉毒毒素醫藥組成物，内含6〇〇微克異澱粉及i毫克胺基fe，如賴胺酸。於1·7天内瘦攣肌肉症狀減輕，且此症狀的減輕持續至少約2個月至約6個月。根據本發明所揭示的醫藥組成物有許多優點，包括： 1.此醫藥組成物可製成無血液產物，如白蛋白，所以無任何血液產物感染因子，如朊病毒。 2·與現在能講得的醫藥組成物相比，此醫藥組成物之安定性及毒性效價高％恢復性可相比或超過。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製雖則本發明在較佳方法及其他具體實施例方面作了詳細敘述’但在本發明範圍内還可作修改及變化。例如，多種安定化多糖及胺基酸屬於本發明範圍。因之’本發明精神及範圍並不限於前述較佳具體實施例的説明。 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

申請曰期〇[ 〇 ^ X- [? 案號 090102480 類別 (以上各欄由本局填註） 1282739

_ # liJ 穴「年i月〜日’ A4 - '^一 C4 中文說明書替換頁（95年3月）：

發薪還專利説明書一、發1名稱中文具安定化的肉毒毒素之醫藥組成物新型石啊英文 ”PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS OF STABILIZED BOTULINUM TOXIN” 姓名泰勒斯J.杭特 TERRENCE J· HUNT 國籍本紙張尺度適用中國國家標準((；；]^8) A4規格(21〇 x 297公釐)

二、霖S 人住、居所姓名 (名稱）國籍美國美國加州艾納翰山莊市東拉普馬街5815號美商歐樂根公司 ALLERGAN, INC. 美國美國加州歐文鎮杜邦道2525號訂三、申請人住、居所 (事務所) s表名-

馬丁阿福耶特 MARTIN A. VOET 1282739 f f。,02480號專利申請案 A7 “P V f Ια

-史文說‘明書替拖頁(95年3 q) B7 I 五、發明說^ ")----—.丨，'一 .|—' \ 26 ’ 即可減少蛋白質藥物(即肉毒毒素活性成分)介入驗㈣反！’從而減少了蛋白質活性成分的降解途徑，因而安定醫樂組成物内的蛋白質活性成分。較佳是’為達成此目的，可用任何含初級或二級胺的化合物。最佳是胺基酸，如賴胺酸，甘胺酸，精胺酸。聚胺酸，如聚賴胺酸，也是適宜的。陽離子胺基酸如賴胺酸，會發生離子吸引，結合酸性蛋白質（例如肉毒毒素）而撞住活性蛋白質不與糖接觸。聚賴胺酸除了因為較大可有盾的作用外，有抗菌的優點。本發明另一方面，是預先以糖與胺基酸成分反應，以在加活性蛋白質成分（肉毒毒素）至糖與胺基酸調配物成分内前消耗掉Maillani反應的可能，|而基本上限制了活性蛋白夤曝露於Maillard反應。疋以本舍明醫藥組成物含有胺基酸及聚胺基酸，並用此胺基酸及聚胺基酸在含澱粉，糖及/或多糖的蛋白質（即肉毒毒素）藥物調配内作為Maillard反應抑制劑。本發明以活性蛋白質（例如肉毒毒素）與安定化澱粉、糖、或多糖或其與胺基酸如賴胺酸的混合物製成調配物。值得注意的是，發明人發現，與其他多糖或碳水化合物相較’羥基乙基殿粉與蛋白質，如肉毒毒素，不行Maillard反應或以較弱或較低之速率反應。此外，發明人還發現，加了胺基酸會增強羥基乙基澱粉的防腐效果，這可能是因為其具競爭抑制者的作用，即由於其與易反應的糖與毒素對Maillard 反應有競爭性的關係。就此目的言，胺基酸如賴胺酸，甘胺本紙張尺度適用中國國 i標準(CNS) A4規格(210X297公笼了

Claims

1282$她〇248〇號專利申請案 A8 中文申請專利範圍替換本⑻年^月）g 肛年\'心日

申請專利範圍種適於注射入人類病人的醫藥組成物，其含有· (a)肉毒毒素，及； (b)多糖，其含有多個每一吡喃形葡萄糖單位有 10個p比喃形葡萄糖之平均式（CH2)n-〇H化合物取代，數0 鍵合的吡喃形葡萄糖單位，多個羥基，其中多糖内的每 6至9個羥基是經由醚鍵以其中11可以是1至4的整 2·根據申請專利範圍第丨項之醫藥組成物，其中多糖是乙基醚取代的多糖。 3·根據申請專利範圍第丨項之醫藥組成物，其中此醫藥組成物適於給予人類病人以達治療效果。 4. 根據申請專利範圍第丨項之醫藥組成物，其中肉毒毒素是選自包括A，B，C1，D，E，F及G型肉毒毒素。 5. 種具女定化的肉毒毒素之醫藥組成物，其含有： (a) 肉毒毒素，及 (b) 沒基乙基殿粉，其中此醫藥組成物適於給予人類病人以達治療效果。 6. 種具女定化的肉毒毒素之醫藥組成物，其含有： (a) 肉毒毒素； (b) 多糖，及 (c) 胺基酸或聚胺基酸，其中該多糖含有多個鍵合的吡喃形葡萄糖單位，每一峨喃形葡萄糖單位有多個羥基，其中多糖内的每i 〇 68937-951222.DOC , -1 - 本紙張尺度適财® s家標準(CNS) A4規格(㈣X29姆) 1282739 六、申請專利範圍 8 8 8 8 A BCD 個外形葡萄糖之平均6至9個羥基是經由醚鍵以式 (CHA-OH化合物取代，其中η可以是1至4的整數。 7·根據申請專利範圍第6項之醫藥組成物，其中此醫藥組成物當儲存於-1它至-15 °C溫度時，其效價實質上維持一年不變。 8·根據申請專利範圍第6項之醫藥組成物，其中此醫藥組成物於重建時之效價或恢復％為20%至1〇〇 %。 9·根據申請專利範圍第6項之醫藥組成物，其中此醫藥組成物於重建時之效價介於10 U /毫克及30 U /毫克。 10·根據申請專利範圍第6項之醫藥組成物，其中此醫藥組成物無白蛋白。 11. 根據申請專利範圍第6項之醫藥組成物，其中此醫藥組成物貫質上無非毒素複合物蛋白質。 12. 根據申請專利範圍第6項之醫藥組成物，其中多糠是澱粉。 13. 根據申請專利範圍第1 2項之醫藥組成物，其中澱粉是羥基乙基澱粉。 14·根據申請專利範圍第6項之醫藥組成物，其中此醫藥組成物含100單位肉毒毒素，及5〇〇微克至7〇〇毫克經基乙基殿粉。 15·根據申請專利範圍第i 4項之醫藥組成物，其尚含〇·5 毫克至1.5毫克胺基酸。 16.根據申請專利範圍第6項之醫藥組成物，其中肉毒毒素是Α型肉毒毒素。 68937-951222.DOC ABC D

1282739 六、申請專利範園 17·根據申請專利範圍第6項之醫藥組成物，其中胺基酸是選自包括賴胺酸，甘胺酸，組胺酸及精胺酸。 18· —種安定的、兩效價的、非熱原的、真空乾燥的a型肉毒毒素醫藥組成物，其含有： (a) A型肉毒毒素複合物； (b) 多糖，及； (c) 胺基酸或聚胺基酸，其中此調配物無白蛋白，於-5 °C —年貨架壽命在以生理鹽水或水重建當時有9〇%效價，重建後存於2 72 小時後有80%效價，且其中該多糖含有多個鍵备的吡喃形葡萄糖單位，每一吡喃形葡萄糖單位有多個經基，其中多糖内的每1〇個吡喃形葡萄糖之平均6至9 個羥基是經由醚鍵以式（CH2)n-OH化合物取代，其中n 可以是1至4的整數。 19. 根據申請專利範圍第1 8項之醫藥調配物，其中此調配物之比毒性於重建時至少為18 U/毫克。 20. —種凍乾的或真空乾燥的醫藥組成物，其主要含有高分子量多糖及肉毒毒素，其中肉毒毒素是以高分子量多糖安定化’且其中該多糖含有多個鍵合的Ϊ7比喃形葡萄糖單位，每一吡喃形葡萄糖單位有多個羥基，其中多糖内的每10個吡喃形葡萄糖之平均6至9個經基是經由醚鍵以式（CHA-OH化合物取代，其中η可以是1 至4的整數。 21·根據申請專利範圍第2 0項醫藥之組成物，其中高分子 68937-951222.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

$多糖是選自包括羥基曱基澱粉，羥基乙基澱物、基丙基澱粉，羥基丁基澱粉，羥基戊基澱粉 22·^據申請專利範圍帛2〇項之醫藥組成物，其中肉毒毒素是适自包括 A，b，C〗，D，E，F&GM_.|。 23. —種具安定化的肉毒毒素之醫藥組成物，其含有多糖及與肉毒毒素相混合的胺基酸，其中多糖的量是每單位肉毒毒素ixur9莫耳多糖至每單位肉毒毒素2χ1〇莫耳多煻，且其中該多糖含有多個鍵合的吡喃形葡糖早位，每一吡喃形葡萄糖單位有多個羥基，其中糖内的每10個吡喃形葡萄糖之平均6至9個羥基是由醚鍵以式（CH2)n-〇H化合物取代，其中η可以是1 4的整數。 24· —種製造醫藥組成物的方法，其包括製備肉毒毒素與多糖的混合物的步驟，其中多糖是由共價鍵合的重·複單體構成’其中平均單體分子量350 D至l，〇〇〇D，其中。亥夕糖含有多個鍵合的吡喃形葡萄糖單位，每咐南形葡萄糖單位有多個經基，其中多糖内的每1〇吡喃形葡萄糖之平均6至9個羥基是經由醚鍵以 (CHA-OH化合物取代，其中^可以是1至4的整數 25·根據申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中此醫組成物在重建或注射時的pH為5至7.3。 26_ —種具安疋化的肉毒毒素之醫藥組成物，其含有： (a)肉毒毒素，及，· (c) 胺基酸。 -12 萄多經至且個式藥 ItL申。f專利範圍第26項之醫藥組成物，其中此組成 ί紙張尺度適用f國國家標準(CNS)T^^297公爱) ABCD 1282739 κ、申請專利範圍物無白蛋白，無多糖，於-5 °C —年貨架壽命時以生理鹽水或水重建時之效價至少90%，而於重建後儲存於 2 °C 72小時後其效價80%，且其中該多糖含有多個鍵合的吡喃形葡萄糖單位，每一吡喃形葡萄糖單位有多個羥基，其中多糖内的每10個吡喃形葡萄糖之平均6 至9個羥基是經由醚鍵以式（CH2)n_〇H化合物取代，其中η可以是1至4的整數。 28· —種用於注射根據申請專利範圍第1、5、6、i 8、 2 0、2 3和2 6項中任一項之醫藥組成物之裝置，其包括雙室預裝的注射筒，此筒之一室含肉毒毒素而此筒之第二室含稀釋劑或緩衝溶液。 68937-951222.DOC